JP2006025724A

JP2006025724A - 核酸の分離精製方法

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Publication number: JP2006025724A
Application number: JP2004211106A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiko Makino; 快彦牧野
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 2004-07-20
Filing date: 2004-07-20
Publication date: 2006-02-02

Abstract

【課題】核酸を含む検体より、核酸吸着性担体を用いて、簡便迅速に核酸を抽出する方法を提供する。
【解決手段】（Ａ）少なくとも１個の開口を有するデバイス内にファイバーから構成される核酸吸着性担体を収容し、核酸を含む試料溶液を該担体に接触させ、該担体に核酸を吸着させる工程、
（Ｂ）洗浄液により、核酸が吸着した状態で、核酸吸着性担体を洗浄する工程、
（Ｃ）回収液により核酸吸着性担体から核酸を脱着させ、核酸を精製する工程、
を含むことを特徴とする核酸の分離精製方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、核酸を分離精製する方法に関する。詳しくは、本発明は、デバイス内に核酸吸着性担体を収容した核酸分離精製デバイスを用いて、核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製する方法に関する。

核酸は、様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸の形態で用いることが要求される。

診断分野においても、核酸は種々の形態で種々の目的に用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現におよぶ種々の目的により、興味ある核酸の位置確認、同定および単離において日常的に用いられている。

多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要する。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損失に結びつきやすい。血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料から核酸を精製する場合には、コンタミネーションおよび疑陽性の結果が生じるという危険性も加わる。

広く知られた分離精製方法の一つに、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の固相に吸着させ、これに引き続いて洗浄、脱着等の操作を行い分離精製する方法がある（例えば、特許文献１参照）。この方法は、分離性能として優れているが、簡便性、迅速性、自動化適性において充分といえず、またこの方法に用いられる器具及び装置は、自動化および小型化に不向きであり、さらに器具および装置、特に吸着媒体を同一性能で工業的に大量生産することが困難であり、かつ取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点がある。

また、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、固相に核酸を吸着させる溶液及び固相から核酸を脱着させる溶液をそれぞれ用いて、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相に核酸を吸着及び脱着させることによって、核酸を分離精製する方法が提案されている（特許文献２参照）が、更なる改良が望まれる。

その他に、従来から知られている核酸分離精製法としては、遠心法によるもの、磁気ビーズを用いるものなどがある。また、これらを利用した核酸分離精製装置が提案されている。しかしながら、遠心法によるものや磁気ビーズを用いるものは、収率や純度の点で未だ十分ではなく、多孔性膜を用いることで、収率や純度の向上が図られている。例えば、多孔性膜を用いた核酸分離精製装置としては、多孔性膜を収容した多孔性膜チューブをラックに多数セットし、これに核酸を含む試料溶液を分注し、上記ラックの底部の周囲をシール材を介してエアチャンバーで密閉して内部を減圧し、全多孔性膜チューブを同時に排出側より吸引し試料液を通過させて核酸を多孔性膜に吸着し、その後、洗浄液および回収液を分注して、再び減圧吸引して洗浄・脱着するようにした自動装置が提案されている（例えば、特許文献３参照）。
特公平７？５１０６５号公報特開２００３？１２８６９１号公報特許第２８３２５８６号公報

従って、本発明の目的は、核酸を含む試料溶液から、核酸吸着性担体を用いて、簡便迅速に核酸を分離精製する方法を提供することである。また、該抽出方法のための装置および試薬キットを提供することである。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、デバイス内にファイバーから構成される核酸吸着性担体を収容し、該担体に、核酸を吸着、洗浄及び脱着させる各工程を含む核酸の分離精製方法によって、簡便迅速に核酸を分離精製することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。即ち、本発明は以下の構成により前記目的を達成したものである。

（１）（Ａ）少なくとも１個の開口を有するデバイス内にファイバーから構成される核酸吸着性担体を収容し、核酸を含む試料溶液を該担体に接触させ、該担体に核酸を吸着させる工程、
（Ｂ）洗浄液により、核酸が吸着した状態で、核酸吸着性担体を洗浄する工程、
（Ｃ）回収液により核酸吸着性担体から核酸を脱着させ、核酸を精製する工程、
を含むことを特徴とする核酸の分離精製方法。
（２）前記ファイバーが、中空糸であることを特徴とする前記（１）に記載の核酸分離精製方法。
（３）前記ファイバーから構成される核酸吸着性担体が、ファイバーの束であることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の核酸分離精製方法。
（４）前記ファイバーから構成される核酸吸着性担体が、布帛であることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の核酸分離精製方法。

（５）前記ファイバーから構成される核酸吸着性担体が、不織布であることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の核酸分離精製方法。に記載の核酸分離精製方法。
（６）前記ファイバーが、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する性質を表面に有する前記（１）〜（５）の何れかに記載の核酸分離精製方法。
（７）前記試料溶液が、検体を核酸可溶化試薬で処理して得られた溶液に水溶性有機溶媒を添加した溶液であることを特徴とする前記（１）〜（６）の何れかに記載の核酸分離精製方法。
（８）核酸可溶化試薬が、カオトロピック塩、界面活性剤、タンパク質分解酵素、消泡剤及び核酸安定化剤の少なくともいずれかを含む溶液であることを特徴とする前記（１）〜（７）の何れかに記載の核酸分離精製方法。
（９）洗浄液が、メタノール、エタノール、プロパノールもしくはその異性体、またはブタノールもしくはその異性体の少なくともいずれかを２０〜１００質量％含む溶液である、前記（１）〜（８）の何れかに記載の核酸分離精製方法。
（１０）回収液が、イオン強度が０．５Ｍ以下の溶液であることを特徴とする前記（１）〜（９）の何れかに記載の核酸分離精製方法。

（１１）前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うための装置。
（１２）前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うための試薬キット。

本発明の核酸分離精製方法は、
（Ａ）少なくとも１個の開口を有するデバイス内にファイバーから構成される核酸吸着性担体を収容し、核酸を含む試料溶液を該担体に接触させ、該担体に核酸を吸着させる工程、（以下「吸着工程」とも称する。）
（Ｂ）洗浄液により、核酸が吸着した状態で、核酸吸着性担体を洗浄する工程、（以下「洗浄工程」とも称する。）
（Ｃ）回収液により核酸吸着性担体から核酸を脱着させ、核酸を精製する工程、（以下「脱着工程」または「回収工程」とも称する。）
を少なくとも含むものである。

まず、本発明の核酸分離精製方法において使用されるデバイスについて説明する。

［デバイス］
本発明におけるデバイスとは、少なくとも１個の開口を有するものであり、形態としては、カートリッジやカラム、マイクロチップ等、いずれでもよく、核酸吸着性担体を収容することが可能なもの全てを意味する。

デバイスは、ファイバーから構成される核酸吸着性担体を収容する以外、その他の部材を収容していないことが好ましい。上記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックを使用することができる。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。また、上記の容器は透明であっても、着色してあっても良い。また、デバイスは、二個の開口を有することが好ましい。

次に本発明の核酸分離精製方法において使用される核酸吸着性担体について説明する。

［核酸吸着性担体］
本発明における核酸吸着性担体は、ファイバーから構成され、少なくとも１個の開口を有するデバイス内に収容可能なものである。ここでいうファイバーとは、形状が繊維状のものを言い、担体として使用できるものであれば、長さや太さに関しては限定なく用いることができる。
又、ファイバーとして中空糸を用いてもよい。中空糸を用いる場合、流路は、クロスフロー型に設定するのが好ましい。例えば、「日本膜学会編膜学実験シリーズ第III巻人工膜編」（共立出版社）１００〜１０３項の記載が挙げられる。
「ファイバーから構成される核酸吸着性担体」は、核酸吸着性担体が、ファイバーから構成され、デバイス内に収容可能であれば、いずれの形態でもよい。すなわち、核酸吸着性担体として、ファイバーそのものを使用しても良いし、ファイバーで構成された布帛であってもよい。布帛としては、織物や編物などが挙げられる。
核酸吸着性担体は、以下に記載する核酸吸着性担体としての性能を損なわない範囲で、ファイバー以外の物質を含むこともできる。

そして該ファイバーは、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する性質を表面に有することが好ましい。これは、担体の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と該担体が引き合うようになると推定される。核酸吸着性担体がファイバーから構成されること、さらには該ファイバーがイオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する性質を表面に有することにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができ、好ましい。より好ましくは、核酸吸着性担体は、親水基を有するファイバーから構成されることであり、環境の極性を変化させることで、核酸と担体表面の親水基同士が引きあるようになると推定される。親水基を持つことにより、表面積が大きい状態で、核酸との相互作用を持つことが可能となり、分離性能が格段に優れたものとなる。

親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。

ここで、表面に親水基を有するファイバーとは、ファイバーを形成する材料自体が親水基を有するファイバー、またはファイバーを形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入したファイバーを意味する。ファイバーを形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、ファイバーを形成する材料自体が親水基を有する有機材料であるファイバー、親水基を持たない有機材料のファイバーを処理して親水基を導入したファイバー、親水基を持たない有機材料のファイバーに対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入したファイバー、ファイバーを形成する材料自体が親水基を有する無機材料であるファイバー、親水基を持たない無機材料のファイバーを処理して親水基を導入したファイバー、親水基を持たない無機材料のファイバーに対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入したファイバーなどを使用することができるが、加工の容易性から、ファイバーを形成する材料は有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。

親水基を有する材料としては、水酸基を有する有機材料のファイバーを挙げることができる。水酸基を有する有機材料のファイバーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などで、形成されたファイバーを挙げることができるが、特に糖構造を有する有機材料のファイバーを好ましく使用することができる。

水酸基を有する有機材料として、好ましくは、セルロース誘導体のエステル化合物とセルロースの混合物から成る有機高分子を使用することができる。エステル価の異なるセルロース誘導体の混合物として、トリエステルセルロースとジエステルセルロースの混合物、トリエステルセルロースとモノエステルセルロースの混合物、トリエステルセルロースとジエステルセルロースとモノエステルセルロースの混合物、ジエステルセルロースとモノエステルセルロースの混合物を好ましく使用することができる。

更に好ましい、水酸基を有する有機材料としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチル価の異なるアセチルセルロース及び、その鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースの鹸化物とは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理したものであり、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物も好ましく使用することができる。より好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物を使用することである。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９であることが好ましい。更に好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の混合比は、９０：１０〜５０：５０であることである。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率を上げるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。鹸化処理により得られる有機材料の鹸化率（表面鹸化率）は、５％以上１００％以下であることが好ましく、１０％以上１００％以下であることが更に好ましい。また、水酸基を有する有機材料の表面積を大きくするために、アセチルセルロースのファイバーを鹸化処理することが好ましい。

ここで、鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることをいう。これにより、鹸化処理液に接触したアセチルセルロースの部分が、再生セルロースとなり水酸基が導入される。こうして作成された再生セルロースは、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。又、鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。

親水基を持たない有機材料のファイバーに親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖をファイバーに結合することができる。
有機材料のファイバーにグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、ファイバーとグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、ファイバーを起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。

まず、ファイバーとグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖にファイバーと反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、ファイバーの官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。ファイバーと反応する官能基としては、ファイバーの官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。
ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。

ファイバー体を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖とする方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で基材表面上に活性種を与え、ファイバーと接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によってファイバーと結合させる方法を指す。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。

親水基を持たない有機材料のファイバーに親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができるが、糖構造を有するポリマーが好ましい。

また、ファイバーに、セルロース誘導体または、セルロース誘導体の混合物をコーティングした後に、コーティングしたセルロース誘導体または、セルロース誘導体の混合物を鹸化処理することもできる。鹸化の方法は、前述と同様アルカリ性の水溶液に接触させることで、実現できる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには、鹸化率が１０％以上１００％以下であることが好ましい。

親水基を有する無機材料である核酸吸着性ファイバーとしては、シリカ化合物を含有するファイバーを挙げることができる。シリカ化合物を含有するファイバーとしては、ガラスファイバー、シリカファイバーを挙げることができる。

親水基を持たない無機材料のファイバーに親水基を導入する方法としては、ファイバーと親水基を持つグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、ファイバーを起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
ファイバーと親水基を持つグラフトポリマー鎖とを化学結合させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、ファイバーを起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。

親水基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、上記親水基を持たない有機材料のファイバーに親水基を導入する方法において、記載した親水基を有するグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。

親水基を持たない無機材料のファイバーに親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる。

また、親水基を持たない無機材料のファイバーに、セルロース誘導体または、セルロース誘導体の混合物をコーティングした後に、コ−ティングしたセルロース誘導体または、セルロース誘導体の混合物を鹸化処理することもできる。鹸化の方法は、前述と同様アルカリ性の水溶液に接触させることで、実現できる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには、鹸化率が１０％以上以上１００％以下であることが好ましい。

親水基を持たない無機材料のファイバーとしては、アルミニウム等の金属、ガラス、セラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、カーボンを加工して作製したファイバーを挙げることができる。

核酸吸着性担体は、ファイバーから構成されたシート状であることが好ましい。シート状であることで、デバイスに簡便に収納することができ、工業的に安価なコストで製造することができ、好ましい。又、ファイバーから構成されたシート状であることで、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液が容易に通過することができ、核酸を核酸吸着性担体に吸着することができ、結果として、抽出効率を上げることができ、好ましい。「ファイバーから構成されたシート状である」とは、例えば、布帛、不織布等の形状であることが挙げられるが、これに限定されない。

上記布帛又は不織布は、溶液が内部を通過可能であり、厚さが１０μｍ〜８００μｍであることが好ましい。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜５００μｍである。上記の範囲内であれば、洗浄がし易く、好ましい。

核酸吸着性担体が、ファイバーから構成された布帛である場合、布帛は織物でも、編物であってもよい。布帛は、比表面積が大きく、回収効率に優れ、好ましい。又、布帛は、一般的に空隙率が大きく、液通過性に優れ、目詰まりなどのトラブルが少なく、抽出時間の短縮にも寄与し、好ましい。

核酸吸着性担体が、不織布であることも好ましい。不織布は織り機や編み機を使用することなく製造されるので、非常に安価で供給でき、好ましい。更に、布としての物性を有しており、目詰まりしにくいため、好ましい。核酸の分離精製において、好ましい材料である。

また、布帛または不織布は、１枚のみデバイスに収容してもよいが、複数枚を使用することもできる。複数枚のシートは、同一のものであっても、異なるものであって良い。布帛と不織布を重ねてもよい。

［核酸の分離精製方法］
以下に本発明の核酸の分離精製方法において、ファイバーから構成される核酸吸着性担体を使用する方法について、説明する。
核酸吸着性担体としてファイバーそのもの（ファイバーは前述のとおり中空糸であってもよい）を用いる場合には、デバイスとしてカラムを用いることが好ましい。カラムとしては少なくとも二個の開口を持つことがより好ましい。カラム内に少なくとも１本以上のファイバーを収容する。この場合、上記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、該カラムを通過させる。好ましくは、上記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の各工程において、少なくとも二個の開口を有するカラムの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カラムの上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、圧力差により該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させる。核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液はカラム内の上記ファイバーと接触する。以上の構成により、装置をコンパクトに自動化することができ、好ましい。カラムに収容するファイバーの直径φは、０．１〜１０００μｍであることが好ましい。本数は１本以上であればよい。ファイバーの本数が複数以上であること、すわなち、核酸吸着性担体がファイバーの束から構成されることがより好ましい。ファイバーが複数本以上であるとき、ファイバーは同じでも異なるものを用いてもよい。ファイバーがカラム内の流路の断面積の５０〜９９％を占めることが好ましい。ファイバーの直径が上記の範囲であると、また断面積の占有率が上記の範囲であると、核酸の回収効率を上げることができ、好ましい。ファイバーの直径、断面積の占有率が上記の範囲内であれば、カラム内の流路が詰まることがなく、好ましい。

核酸吸着性担体として、布帛（織物・編物）又は不織布を用いる場合、布帛と不織布は、以下に述べる工程において同様に扱うことができる。
上記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の各工程において、布帛又は不織布を、デバイス内に収容し、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、該布帛又は不織布を通過させる。より好ましくは、デバイスが二個の開口を持つことである。上記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の各工程において、好ましくは、少なくとも二個の開口を有するデバイスの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、デバイスの上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、圧力差により該注入した各液を布帛又は不織布を通過させ、他の開口より排出させるものである。核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液はデバイス内の布帛又は不織布を通過させる（つまり、ファイバーと接触させる）ことにより、核酸の洗浄効率や回収効率が極めて高くなり、デバイスをコンパクトに小型化することもでき、自動化適性にも優れ、好ましい。

更に、好ましくは、以下の工程で核酸を分離精製することができる。すなわち、（ａ）少なくとも２個の開口を有するデバイス内にファイバーから構成される布帛又は不織布を収容し、核酸を含む試料溶液を、該デバイスの一の開口に注入する工程、
（ｂ）上記デバイスの上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、圧力差により、注入した核酸を含む試料溶液を、上記布帛又は不織布を通過させ、該デバイスの他の開口より排出することによって、上記ファイバーに核酸を吸着させる工程、
（ｃ）上記デバイスの上記一の開口から圧力差発生装置を外し、上記デバイスの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、
（ｄ）上記デバイスの上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、圧力差により、注入した洗浄液を、上記布帛又は不織布を通過させ、他の開口より排出することによって、上記ファイバーを、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、
（ｅ）上記デバイスの上記一の開口から圧力差発生装置を外し、上記デバイスの上記一の開口に回収液を注入する工程、
（ｆ）上記デバイスの上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、圧力差により、注入した回収液を、上記布帛又は不織布を通過させ、他の開口より排出することによって、上記ファイバーから核酸を脱着させ、上記デバイス外に排出する工程を挙げることができる。

核酸を含む試料溶液を上記布帛又は不織布を通過させる場合の流速は、膜の面積ｃｍ²あたり、２〜１５００μＬ／ｓｅｃである事が好ましい。この範囲であれば、十分な分離精製効果が得られ、操作性よく、核酸分離精製できるため、好ましい。さらに、上記流速は、膜の面積ｃｍ²あたり、５〜７００μＬ／ｓｅｃである事が好ましい。

また、上記工程において、圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリスタポンプのような加圧が可能なポンプ等、或いは、エバポレーター等の減圧可能なものが挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。より好ましくは、圧力差発生装置は、デバイスの一の開口に着脱可能に結合されていることである。

上記のいずれの方法を用いても、最初の核酸を含む試料溶液を注入開始してからデバイス外に核酸を得るまでの工程を２０分以内、好適な状況では２分以内で終了することが可能である。

また、上記のどの方法を用いても、１ｋｂｐから３００ｋｂｐ、特に２０ｋｂｐから３００ｋｂｐと広範囲に及ぶ分子量の核酸を回収することができる。すなわち、従来行なわれているガラスフィルターを用いたスピンカラム法に比べて、長鎖の核酸を回収できる。

また、紫外可視分光光度計での測定値（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）が、ＤＮＡの場合は１．６〜２．０、ＲＮＡの場合は１．８〜２．２となる純度を持つ核酸を回収することができ、不純物混入量の少ない高純度の核酸を定常的に得ることができる。さらには、紫外可視分光光度計での測定値（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）がＤＮＡの場合は１．８付近、ＲＮＡの場合は２．０付近となる純度を持つ核酸を回収することができる。

［検体］
本発明において使用できる検体は、核酸を含むものであれば特に制限はなく、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルスなど、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料が対象となる。

核酸を含む検体は、単一の核酸を含む検体でもよいし、異なる複数種類の核酸を含む検体でもよい。回収する核酸の種類は、ＤＮＡやＲＮＡ等、特に制限されない。検体の数は一つでも複数（複数の容器を用いて複数の検体の並列処理）であってもよい。回収する核酸の長さも特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸を使用することができる。取扱い上の観点からは、回収する核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度である。本発明の核酸分離精製方法は、従来の簡易的な核酸分離精製方法より比較的長い核酸を迅速に取り出すことができ、好ましくは２０〜３００ｋｂｐ、より好ましくは５０〜２００ｋｂｐ、更に好ましくは７０〜１４０ｋｂｐの核酸を回収することに用いることができる。

回収される核酸は１本鎖でもよく、２本鎖でも良い。

［試料溶液］
最初に検体を、細胞膜および核膜等を溶解して核酸を可溶化する試薬を含む溶液（核酸可溶化試薬）で処理する。これにより細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が溶液内に分散し、核酸を含む試料溶液を得る。

例えば、対象となる検体が全血の場合には、Ａ．赤血球の除去、Ｂ．各種タンパク質の除去、及びＣ．白血球の溶解及び核膜の溶解を行うことが好ましい。Ａ．赤血球の除去およびＢ．各種タンパク質の除去は、ファイバーへの非特異吸着および布帛又は不織布の目詰まりを防ぎ、Ｃ．白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させる。

本発明の方法においては、以下に挙げる工程により、細胞膜および核膜を溶解し、検体から核酸を含む試料溶液を得ることが好ましい。
（Ｉ）検体（細胞又はウイルスを含む）を容器に注入する工程、
（ＩＩ）上記容器に、核酸可溶化試薬（カオトロピック塩、界面活性剤、タンパク質分解酵素、消泡剤および核酸安定化剤等の少なくともいずれかを含む溶液）を添加し、検体を混合する工程、
（ＩＩＩ）上記で得られた混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程。

検体は、ホモジナイズ処理することが好ましい。このことにより自動化処理適正が向上することができる。ホモジナイズ処理としては、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる処理、高速攪拌処理、微細空隙から押し出す処理、ガラスビーズを用いる処理等で行うことができる。
検体を注入する容器としては、何れのものでもよい。

｛核酸可溶化試薬｝
核酸可溶化試薬としては、カオトロピック塩、界面活性剤、タンパク質分解酵素、消泡剤および核酸安定化剤の少なくともいずれかを含む溶液が挙げられる。

（カオトロピック塩）
上記カオトロピック塩としては、グアニジン塩（塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン等）、尿素、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム等を使用することができる。中でも塩酸グアニジンが好ましい。これらの塩は単独でも複数組み合わせて用いてもよい。上記、核酸可溶化試薬中の、カオトロピック塩濃度は、０．５Ｍ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５Ｍ〜４Ｍ、さらに好ましくは、１Ｍ〜３Ｍである。
カオトロピック塩の代わりに、カオトロピック物質として、尿素を用いることもできる。

（界面活性剤）
前記界面活性剤としては、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。
本発明においてはノニオン界面活性剤およびカチオン活性剤を好ましく用いることができる。
ノニオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドが挙げられ、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤の中でも、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコールがさらに好ましい。

カチオン界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドが挙げられる。これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。界面活性剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。

（タンパク質分解酵素）
タンパク質分解酵素としては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼが挙げられ、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、タンパク質分解酵素は、複数種以上のタンパク質分解酵素の混合物も好ましく用いることができる。
核酸可溶化試薬は、核酸の回収量及び回収効率の向上、必要な核酸を含む検体の微量化及び迅速化の観点から、タンパク質分解酵素を含むことが好ましい。
セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫなどを好ましく用いることができる。システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。
タンパク質分解酵素の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、添加時の全容積１ｍｌあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵで用いることができる。

また、タンパク質分解酵素は、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、安定化剤を含んだタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。安定化剤としては、金属イオンを好ましく用いることができる。具体的には、マグネシウムイオンが好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤を含ませることにより、核酸の回収に必要なタンパク質分解酵素の微量化が可能となり、核酸の回収に必要なコストを低減することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、反応系全量に対して好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは１０〜１００ｍＭで含有することが好ましい。

タンパク質分解酵素は、予めカオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とともに混合されて１つの試薬として核酸の回収に供されても良い。
また、タンパク質分解酵素は、カオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とは個別の２つ以上の試薬として供されても良い。後者の場合、タンパク質分解酵素を含む試薬を先に検体と混合した後に、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬と混合される。また、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬を先に混合した後に、タンパク分解酵素を混合してもよい。
また、タンパク質分解酵素を検体または、検体とカオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬との混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。

（消泡剤）
消泡剤としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルエキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、リン酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。好ましくは、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤である。また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤が好ましい。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤を組み合わせて使用することである。また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤を使用することも好ましい。
消泡剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましい。

（核酸安定化剤）
核酸安定化剤としては、ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有するものが挙げられる。検体によっては、核酸を分解するヌクレアーゼ等が含まれていることがあり、核酸をホモジナイズすると、このヌクレアーゼが核酸に作用し、収量が激減することがある。前記核酸安定化剤は、検体中の核酸を安定に存在させることができ、好ましい。
前記核酸可溶化試薬は、核酸安定化剤を含むことが好ましい。より好ましくは、カオトロピック塩、界面活性剤、タンパク質分解酵素、消泡剤のいずれか１つ以上と共存させる。これにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、検体の微量化及び迅速化が可能となり、好ましい。

ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤としては、一般的に還元剤として使用される化合物を好ましく用いることができる。還元剤としては、水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物等が挙げられる。メルカプト化合物としては、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が挙げられる。核酸安定化剤は、核酸可溶化試薬における濃度は、０．１〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．５〜１５質量％で用いることができる。

（水溶性有機溶媒）
核酸可溶化試薬は水溶性有機溶媒を含んでいても良い。この水溶性有機溶媒は、核酸可溶化試薬に含まれる各種試薬の溶解性を上げることを目的としており、水溶性有機溶媒としては、アセトン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。中でもアルコールが好ましい。アルコールとしては、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。中でもメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体がより好ましい。これらの水溶性有機溶媒は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸可溶化試薬における濃度は１〜２０質量％であることが好ましい。

上記の核酸可溶化試薬溶液は、好ましくはｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ７〜８である。

｛混合｝
ホモジナイズした検体と、カオトロピック塩、界面活性剤、タンパク質分解酵素、消泡剤及び核酸安定化剤の少なくともいずれかを含む核酸可溶化試薬とを混合する方法は、特に限定されない。混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができ、好ましい。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合してもよく、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができる。

｛水溶性有機溶媒の添加｝
次に、ホモジナイズした検体と核酸可溶化試薬を混合して得られた混合液に、水溶性有機溶媒を添加することが好ましい。混合液に添加する水溶性有機溶媒としては、アルコールが挙げられる。アルコールとしては、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでもよく、メタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体が好ましい。これら水溶性有機溶媒の核酸を含む試料溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。

［洗浄液および洗浄工程］
以下、（Ｂ）洗浄工程および洗浄液について説明する。洗浄を行うことにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む検体の量を微量とすることができる。また、洗浄や回収操作を自動化することによって、操作が簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、１回の洗浄で済ませてもよく、より工程を迅速化することができ好ましい。また複数回洗浄を繰り返すことにより、得られる核酸を高純度とすることができ好ましい。

洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。また洗浄工程において、洗浄工程と同時にデバイスに器械的な振動や超音波による攪拌を与えることもできる。

洗浄工程において、洗浄液は、水溶性有機溶媒及び水溶性塩の少なくともいずれかを含んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、核酸吸着性多孔性膜に核酸と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、核酸吸着性多孔性膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であることが必要である。この目的には、アルコール等の水溶性有機溶媒が核酸に難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱着させるのに適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不純物および不要成分の選択的除去作用の効率が向上する。

洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、アルコール、アセトンなどを用いることができ、アルコールが好ましい。アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール又はその異性体（イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール）、ブタノール又はその異性体が好ましい。これらのアルコールは複数種類を使用してもよい。中でもエタノールを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、２０〜１００質量％であることが好ましく、４０〜８０質量％であることがより好ましい。

洗浄液に含まれる水溶性塩としては、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物が好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍＭ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１Ｍ／Ｌ以下であることが好ましく、０．１Ｍ／Ｌ以下であることがより好ましい。さらに好ましくは、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、とりわけ、塩化ナトリウムが２０ｍＭ／Ｌ以上含まれていることが好ましい。

洗浄液は、カオトロッピック物質を含んでいないことが好ましい。それによって、洗浄工程に引き続く回収工程にカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＰＣＲ反応等の酵素反応を阻害するので、後の酵素反応等を考慮すると洗浄液にカオトロッピク物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性で有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。ここで、カオトロピック物質とは、前記した尿素、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。

従来、核酸分離精製における洗浄工程の際、洗浄液のデバイスに対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液がデバイス中に残留することになり、洗浄工程に続く回収工程へ洗浄液が混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、デバイスの内部には、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次の工程に影響を及ぼさないように、洗浄残液が残留しないことは重要である。

したがって、洗浄工程における洗浄液が次工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のデバイス内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力は３５ｍＪ／ｍ²未満が好ましい。表面張力が低いと、洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。

しかし、洗浄効率を上げる為に、水の割合を増やすことができるが、この場合、洗浄液の表面張力は上昇し、残留する液量が増える。洗浄液の表面張力が３５ｍＪ／ｍ²以上の場合は、デバイスの撥水性を高めることで、残留する液量を抑えることができる。デバイスの撥水性を高めることで、液滴を形成させ、その液滴が流れ出ることによって残留する液量を抑制できる。撥水性を高める方法としては、デバイス表面にシリコン等の撥水剤をコートするか、デバイス成型時にシリコン等の撥水剤を練り込む等の手段があるが、これに限らない。

従来、核酸分離精製方法において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となっている。洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、デバイスの形状によっては（例えばデバイスとしてマイクロチップを用いる場合）、デバイスに洗浄液と回収液を供給する際、液を供給するための流路を独立に設ける等の工夫することによって抑止することができる。

［回収液および回収工程］
以下、（Ｃ）回収工程、回収液、回収容器について説明する。
回収工程において、回収液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性担体を収容したデバイスへ供給される。回収液は、核酸分離精製デバイスの一の開口から供給され、圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて、核酸吸着性担体に接触させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製デバイスの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。

回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファー等が使用できる。回収液のｐＨは、ｐＨ２〜１１であることが好ましい。さらには、ｐＨ５〜９であることが好ましい。また特にイオン強度は吸着核酸の溶出に効果を及ぼす。回収液は、イオン強度が２９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、さらには、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、特に０．５ｍｏｌ／Ｌ以下の溶液であることが好ましい。こうすることで、核酸の回収率が向上し、より多くの核酸を回収できることができる。さらに、回収した核酸をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に供する場合、ＰＣＲ反応において用いる緩衝溶液(例えば、ＫＣｌ５０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ₂ １．５ｍｍｏｌ／Ｌを最終濃度とする水溶液)を用いることもできる。回収液にＰＣＲ法に適したバッファー液を用いることで、その後にＰＣＲ工程へ簡便、迅速に移行することができる。

回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１００〜９９：１００であり、更に好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１０〜９：１０である。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。

また別の方法としては、回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液よりも多い条件で核酸の脱着を行うことにより、核酸を含む回収液の濃度を調節して得ることができ、次工程を行う場合（例えばＰＣＲなど）に適した濃度の核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、 (回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなり、好ましい。更に、十分量の回収液を使用することにより、担体からの核酸回収率の増加を図ることができ、好ましい。

また、目的に応じて回収液の温度を変えることで簡便に核酸を回収することができる。例えば、回収液の温度を０〜１０℃にして担体からの核酸の脱着を行うことで、酵素による分解を防止するための何らかの試薬や特別な操作を加えることなく核酸分解酵素の働きを抑制して核酸の分解を防ぎ、簡便に、効率よく核酸溶液を得ることができ、好ましい。

また、回収液の温度を１０〜３５℃とした場合、一般的な室温で核酸の回収を実施することが出来、複雑な工程を必要とせずに核酸を脱着させて分離精製することができ、好ましい。

また別の方法としては、回収液の温度を高温、例えば３５〜７０℃することで、担体からの核酸の脱着を煩雑な操作を経ず簡便に高い回収率で実施することができ、好ましい。

回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等には複数回にわたり回収液を注入してもよい。

また、回収工程において、核酸の回収液に、回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などが挙げられる。核酸分解酵素の阻害剤としてはＥＤＴＡなどが挙げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。

また、回収工程で用いられる回収容器は特に限定されないが、２６０ｎｍの吸収が無い素材で作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収した核酸溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。２６０ｎｍに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。

前記の、核酸分離精製方法、すなわち、（Ａ）〜（Ｃ）の工程は、装置を用いて実施することができる。

前記の、核酸分離精製方法を行うための試薬、すなわち、（Ａ）〜（Ｃ）の工程に用いる試薬をキットとすることができる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

[実施例１]
（１）核酸分離精製用デバイスの作成
（１）−１＜ファイバーを用いたデバイス＞
図１（ａ）に示すように、内径７ｍｍで、円筒状で、ファイバーを収容できる核酸分離精製用カラム（デバイス）１１をハイインパクトポリスチレン３で作成した。このカラムには、核酸吸着性ファイバーとして、セルロースファイバー４を収容し、開口部１から開口部２へ向かって液を流せるような構造にした。なお、図１（ｂ）は、図１（ａ）のＡ−Ａ断面のセルロースファイバー４の充填状態を模式的に示す断面図である。

（１）−２＜布（織物・編物）／不織布の場合＞
図２に示すように、内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔膜を収容する部分を持つ核酸分離精製用容器（デバイス）１１をハイインパクトポリスチレン３で作成した。上記の核酸吸着性シートとして綿織物５を、デバイス１１の核酸吸着性担体を収容する部分に収容し、核酸分離精製デバイスとした。

（２）核酸可溶化試薬及び洗浄液の調製
表１に示す処方の核酸可溶化試薬溶液、及び洗浄液を調製した。

（３）ＤＮＡ分離精製操作
人全血検体２００μｌに、上記（２）で作製した核酸可溶化試薬２００μlと、プロテアーゼ（ＳＩＧＭＡ社製、"Ｐｒｏｔｅａｓｅ" ＴｙｐｅＸＸＩＶＢａｃｔｅｒｉａｌ）溶液２０μlを添加して、６０℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、エタノール２００μｌを加え攪拌することで、核酸を含む試料溶液を作製した。該核酸を含む試料溶液を、上記（１）−１および（１）−２で作製した、核酸吸着性担体を備えた、核酸分離精製デバイス１１の一の開口１に注入し、続いて上記一の開口１に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製デバイス内を加圧状態にし、注入した該核酸を含む試料溶液を、上記核酸吸着性デバイス１１を通過させることで、上記核酸吸着性ファイバー４又は綿織物５に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口２より排出した。続いて、上記核酸分離精製デバイス１１の上記一の開口１に、上記（２）で作製した洗浄液を注入し、上記核酸分離精製デバイス１１の上記一の開口１に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製デバイス内を加圧状態にし、注入した洗浄液を通過させ、他の開口２より排出した。この操作を３回繰り返した。続いて、上記核酸分離精製デバイス１１の上記一の開口１に回収液を注入し、上記核酸分離精製デバイス１１の上記一の開口１に圧力発生装置を結合して、核酸分離精製デバイス１１内を加圧状態にし、注入した回収液を、他の開口２より排出し、この液を回収した。このときの回収液のイオン強度は（１）−１の核酸分離精製デバイスを用いたときは、１０ｍＭであり、（１）−２の核酸分離精製デバイスを用いたときも、１０ｍＭであった。

（４）ＤＮＡの回収の確認
（１）〜（３）における本発明の方法に従って、核酸を含む試料溶液から精製した核酸の電気泳動の結果を図３に示す。
以上の結果より、いずれの方法においても、核酸の分離精製が可能であることがわかった。

核酸吸着性ファイバーとして、セルロースファイバーを収容した核酸分離精製用デバイスの構造説明図であって、（ａ）は全体の斜視図、（ｂ）はＡ−Ａ断面図である。核酸吸着性シートとして、綿織物を収容した核酸分離精製用デバイスの構造説明用の斜視図である。本発明の実施例１で、核酸を含む試料溶液から精製した核酸、及び比較対照の電気泳動図である。

符号の説明

１開口部
２開口部
３ポリスチレン製容器（カラム、デバイス）
４セルロースファイバー
５綿織物
１１核酸分離精製用デバイス

Claims

（Ａ）少なくとも１個の開口を有するデバイス内にファイバーから構成される核酸吸着性担体を収容し、核酸を含む試料溶液を該担体に接触させ、該担体に核酸を吸着させる工程、
（Ｂ）洗浄液により、核酸が吸着した状態で、核酸吸着性担体を洗浄する工程、
（Ｃ）回収液により核酸吸着性担体から核酸を脱着させ、核酸を精製する工程、
を含むことを特徴とする核酸の分離精製方法。
上記ファイバーが、中空糸である請求項１に記載の核酸分離精製方法。
上記ファイバーから構成される核酸吸着性担体が、ファイバーの束である請求項１又は２に記載の核酸分離精製方法。
上記ファイバーから構成される核酸吸着性担体が、布帛である請求項１又は２に記載の核酸分離精製方法。
上記ファイバーから構成される核酸吸着性担体が、不織布である請求項１又は２に記載の核酸分離精製方法。
上記ファイバーが、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する性質を表面に有する請求項１〜５の何れかに記載の核酸分離精製方法。
上記試料溶液が、検体を核酸可溶化試薬で処理して得られた溶液に水溶性有機溶媒を添加した溶液である請求項１〜６の何れかに記載の核酸分離精製方法。
核酸可溶化試薬が、カオトロピック塩、界面活性剤、タンパク質分解酵素、消泡剤及び核酸安定化剤の少なくともいずれかを含む溶液である請求項１〜７の何れかに記載の核酸分離精製方法。
洗浄液が、メタノール、エタノール、プロパノールもしくはその異性体、またはブタノールもしくはその異性体の少なくともいずれかを２０〜１００質量％含む溶液である請求項１〜８の何れかに記載の核酸分離精製方法。
回収液が、イオン強度が０．５Ｍ以下の溶液である請求項１〜９の何れかに記載の核酸分離精製方法。
請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うための装置。
請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うための試薬キット。