JP2005272397A - 核酸の分離精製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(1)核酸を含む試料溶液を、溶液が通過可能な核酸吸着性多孔膜に通過させて、核酸を吸着させる工程、(2)洗浄液を該核酸吸着性多孔膜に通過させて、核酸が吸着した状態で、該多孔膜を洗浄する工程、及び(3)回収液を該核酸吸着性多孔膜に通過させて、該多孔膜内から核酸を脱着させる工程を含む核酸の分離精製方法であって、該核酸吸着性多孔膜が、該膜に対し水3μLを滴下して膜と接触後17m秒後の表面接触角が60°以下である多孔膜であることを特徴とする核酸の分離精製方法。
【選択図】 なし
Description
(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、
(b)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜内に核酸を吸着させる工程、
(c)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、
(d)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、
(e)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、
(f)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、 核酸吸着性多孔膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程
を挙げることができる。
(a)細胞又はウイルスを含む検体を容器に注入する工程、
(b)上記容器に、カオトロピック塩、界面活性剤および核酸安定化剤を含む前処理液を添加し、検体を混合する工程、
(c)上記で得られた混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程
を含むことを特徴とする。
本発明においてはノニオン界面活性剤をこのましく用いることができる。ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドを用いることができるが、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤を用いることができる、さらに好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤は、POEデシルエーテル、POEラウリルエーテル、POEトリデシルエーテル、POEアルキレンデシルエーテル、POEソルビタンモノラウレ−ト、POEソルビタンモノオレエ−ト、POEソルビタンモノステアレ−ト、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、POEアルキルアミン、POEアセチレングリコ−ルから選択されるポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。
セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼKなどを好ましく用いることができる。システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。
タンパク質分解酵素は、添加時の反応系全容積1mlあたり好ましくは0.001IU〜10IU、より好ましくは0.01IU〜1IUの濃度で用いることができる。
また、タンパク質分解酵素は、カオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とは個別の2つ以上の試薬として供されても良い。後者の場合、タンパク質分解酵素を含む試薬を先に検体と混合した後に、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬と混合される。また、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬を先に混合した後に、タンパク分解酵素を混合してもよい。
また、タンパク質分解酵素を検体または、検体とカオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬との混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。
上記の方法で核酸を含む試料溶液を得る場合、核酸可溶化試薬およびタンパク質分解酵素の保存安定性が良く、核酸収量を変えずに操作を簡便にすることができる。
本発明の核酸吸着性多孔膜は、溶液が内部を通過可能なものである。ここで「溶液が内部を通過可能」とは、膜の一方の面が接する空間と膜の他方の面が接する空間の間に圧力差を生じさせた場合に、高圧の空間側から低圧の空間側へと、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。または、膜に遠心力を掛けた場合に、遠心力の方向に、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。
また、鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。
有機材料の多孔膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする2つの方法がある。
ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、2つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、2−ヒドロキシエチルアクリレート、2−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。
多孔膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
洗浄工程における洗浄液の液量は、2μl/mm2以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上する。しかし、200μl/mm2以下とすることで、操作性を保ち、試料の流出を抑止することができ、好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は10mM/L以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、1M/L以下であることが好ましく、0.1M/L以下であることがより好ましい。更に好ましくは、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、特に、塩化ナトリウムが20mM/L以上含まれていることが好ましい。
回収工程において、回収液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔膜を装着した核酸分離精製カートリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口(核酸を含む試料溶液を注入した開口)から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置(例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど)を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が回収効率が優れてより好ましい。
アセチル化の異なるアセチルセルロースの混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比が6:4の多孔膜に対し、アルカリの濃度を変える(0〜1.0Nアルカリ水溶液による鹸化処理)ことで、鹸化の程度を変えた多孔膜(膜径=7mm、膜厚=70μm、平均孔径=2.5μm)を作成する。
アセチルセルロース以外の多孔膜として、再生セルロースとポリエチレンの素材を用いた。
上記表面処理の程度を変えた膜について、下記の条件にてその接触角測定を行う。
作成した多孔膜と、その接触角を表1に示す。
接触角の測定は、多孔膜を装置の水平なステージに載せ、固液界面解析装置(協和界面科学社製)を用い、精製水3μLを滴下して、液滴が接触した17m秒後の接触角を測定した。
内径7mm、核酸吸着性多孔膜を収容する部分を持つ核酸分離精製カートリッジ用容器をハイインパクトポリスチレンで作成する。上記、鹸化の程度を変えた多孔膜を、核酸分離精製カートリッジ用容器の核酸吸着性多孔膜を収容する部分に収容し、核酸分離精製カートリッジとする。
表2及び表3に示す処方の核酸可溶化試薬溶液及び洗浄液を調製する。
人全血検体200μlに、実施例1で作製した核酸可溶化試薬200μlと、プロテアーゼ(SIGMA社製、"Protease“ Type XXIV Bacterial)溶液20μlを添加して、60℃で10分間インキュベートする。インキュベート後、エタノール200μlを加え攪拌することで、核酸を含む試料溶液を作製する。該核酸を含む試料溶液を、上記(1)で作製した、アセチル化の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化物の核酸吸着性多孔膜を備えた、核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した該核酸を含む試料溶液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させることで、上記核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出する。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、実施例1で作製した洗浄液を注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出する。この操作を3回繰り返す。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合して、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収する。
回収液を用いてUV測定を行い、260nmの吸光度(OD)から回収液中に含まれるDNAの量を求める。
表4に、実施例1で測定した値を示す。
一方、表面接触角が、60°より大きい膜を用いると、その場合のDNA収量は激減してしまうことがわかる。
Claims (13)
- (1)核酸を含む試料溶液を、溶液が通過な核酸吸着性多孔膜に通過させて、核酸を吸着させる工程、(2)洗浄液を該核酸吸着性多孔膜に通過させて、核酸が吸着した状態で、該多孔膜を洗浄する工程、及び(3)回収液を該核酸吸着性多孔膜に通過させて、該多孔膜内から核酸を脱着させる工程を含む核酸の分離精製方法であって、該核酸吸着性多孔膜が、該膜に対し水3μLを滴下して膜と接触後17m秒後の表面接触角が60°以下である多孔膜であることを特徴とする核酸の分離精製方法。
- 上記多孔膜の表面接触角が50°以下であることを特徴とする請求項1に記載の核酸の分離精製方法。
- 上記核酸吸着性多孔膜が、イオン結合が関与しない弱い相互作用で核酸が吸着する、有機高分子からなる多孔膜である、請求項1又は2に記載の核酸の分離精製方法。
- 上記核酸吸着性多孔膜が、水酸基を有する有機高分子からなる多孔膜である、請求項1〜3の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
- 上記核酸吸着性多孔膜が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の多孔膜を鹸化処理したものである、請求項1〜4の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
- 上記核酸吸着性多孔膜が、表裏非対称性の多孔膜である、請求項1〜5の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
- 核酸を含む試料溶液が、細胞又はウイルスを含む検体を核酸可溶化試薬で処理して得られた溶液に水溶性有機溶媒を添加した溶液である、請求項1〜6の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
- 核酸可溶化試薬が、カオトロピック塩、界面活性剤、タンパク質分解酵素、消泡剤及び還元剤のうちの少なくとも1種を含む溶液である、請求項7に記載の核酸の分離精製方法。
- 水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ならびにブタノール及びその異性体から選択される少なくとも1種のアルコールである、請求項7または8に記載の核酸の分離精製方法。
- 洗浄液が、メタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ならびにブタノール及びその異性体から選択される少なくとも1種の溶媒を20〜100質量%含む溶液である、請求項1〜9の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
- 回収液が、塩濃度が0.5M以下の溶液である、請求項1〜10の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の核酸の分離精方法を行うための装置。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の核酸の分離精製方法を行うための試薬キット。
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