JP2003128691A - 核酸の分離精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 検体中の核酸を固相表面に吸着させた後、洗
浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する方法に使用す
る、分離性能に優れ、洗浄効率が良く、加工が容易であ
り、実質的に同一の分離性能を有する物を大量に生産可
能である固相を使用した核酸の分離精製方法、及びその
方法を実施するのに適した核酸分離精製ユニットを提供
する。 【解決手段】 表面に水酸基を有する有機高分子から成
る固相に核酸を吸着及び脱着させる工程を含む核酸の分
離精製方法、及び少なくとも２個の開口を有する容器内
に表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相を収容
した核酸分離精製ユニット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を分離精製す
る方法、核酸分離精製ユニット、及びこれらを用いた核
酸の分析方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】核酸は、様々な分野で種々の形態で使用
されている。例えば、組換え核酸技術の領域において
は、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核
酸の形状で用いることを要求する。

【０００３】診断分野においても、核酸は種々の方法で
用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原
体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に
核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食
品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は
遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現にお
よぶ種々の理由により、興味ある核酸の位置確認、同定
および単離において日常的に用いられている。

【０００４】多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手
できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要す
る。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損
失に結びつきやすい。血清、尿およびバクテリアのカル
チャーから得られた試料の核酸の精製においては、コン
タミネーションおよび疑陽性の結果が生じるという危険
性も加わる。

【０００５】広く知られた精製方法の一つに、核酸を二
酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の表面
に吸着させ、引き続く洗浄、脱着等の操作によって精製
する方法がある（例えば、特公平７−５１０６５号公
報）。この方法は、分離性能としては優れているが、同
一性能の吸着媒体の工業的大量生産が困難であり、かつ
取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点
がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、検体
中の核酸を固相表面に吸着させた後、洗浄等を経て脱着
させて核酸を分離精製する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、分離性能に優れ、洗浄効率が良
く、加工が容易であり、実質的に同一の分離性能を有す
るものを大量に生産可能である固相を使用した核酸の分
離精製方法、及びその方法を実施するのに適した核酸分
離精製ユニットを提供することである。本発明のさらに
別の目的は、上記した核酸の分離精製方法を利用した核
酸の分析方法を提供することである。本発明のさらに別
の目的は、特殊な技術、複雑な操作、および特殊な装置
を必要とせずに、簡便かつ迅速に小型の装置を用いて実
施することのできる核酸断片の分析方法、即ち、省スペ
ースで自動化が可能な核酸断片の分析方法を提供するこ
とである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、核酸を固相に吸着及
び脱着させる過程を含む核酸の分離精製方法において、
前記固相として表面に水酸基を有する有機高分子を使用
し、二個の開口を有する容器内に上記固相を収容した核
酸分離精製ユニットを使用することによって、核酸を含
む試料溶液から純度の高い核酸を分離することができる
ことを見出した。さらに、上記方法で分離した核酸を用
いたポリメラーゼ伸長反応の際に生成するピロ燐酸を、
乾式分析素子を用いて検出することによって、特殊な装
置を必要とせずに、簡便性、迅速性に優れた核酸の分析
を行えることを見出した。本発明はこれらの知見に基づ
いて完成したものである。

【０００８】即ち、本発明によれば、表面に水酸基を有
する有機高分子から成る固相に核酸を吸着及び脱着させ
る工程を含む、核酸の分離精製方法が提供される。本発
明の別の側面によれば、少なくとも２個の開口を有する
容器内に表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相
を収容した核酸分離精製ユニットが提供される。

【０００９】本発明のさらに別の側面によれば、ビーズ
にアセチルセルロースをコーティングした後表面鹸化す
る、アセチルセルロースに水酸基を導入する方法が提供
される。本発明のさらに別の側面によれば、表面鹸化に
より水酸基が導入されたアセチルセルロース膜を表面に
有するビーズが提供される。本発明のさらに別の側面に
よれば、（１）上記した本発明の方法によりターゲット
核酸断片を含む核酸断片を分離精製する工程；（２）前
記ターゲット核酸断片、前記ターゲット核酸断片の一部
と相補的な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一
種のデオキシヌクレオシド３リン酸、及び少なくとも一
種のポリメラーゼを反応させ、前記ターゲット核酸断片
を鋳型にした前記プライマーの３’末端を起点とするポ
リメラーゼ伸長反応を行う工程；及び、（３）ポリメラ
ーゼ伸長反応の進行の有無を検出するか、又はポリメラ
ーゼ伸長反応産物と他の核酸とのハイブリダイゼーショ
ンの有無を検出する工程：を含む、核酸の分析方法が提
供される。

【００１０】本発明のさらに別の側面によれば、（１）
上記した本発明の核酸分離精製ユニットを含む核酸の抽
出・精製を行うための手段、（２）ポリメラーゼ伸長反
応を行うための反応手段、および（３）ポリメラーゼ伸
長反応の進行の有無を検出するか、又はポリメラーゼ伸
長反応産物と他の核酸とのハイブリダイゼーションの有
無を検出するための手段、を含む本発明の核酸の析方法
を行うための分析装置が提供される。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。（１）本発明の核酸の分離精製方法 本発明の核酸の分離精製方法は、表面に水酸基を有する
有機高分子から成る固相に核酸を吸着及び脱着させる工
程を含むことを特徴とする。本発明において「核酸」は
一本鎖、二本鎖のいずれでもよく、また、分子量の制限
も無い。

【００１２】表面に水酸基を有する有機高分子として
は、アセチルセルロースの表面鹸化物が好ましい。アセ
チルセルロースしては、モノアセチルセルロース、ジア
セチルセルロース、トリアセチルセルロースの何れでも
よいが、特にはトリアセチルセルロースが好ましい。本
発明では、表面鹸化したアセチルセルロースを固相とし
て使用することが好ましい。ここで表面鹸化とは、鹸化
処理液（例えば、ＮａＯＨ）が接触する表面だけが鹸化
されることを言う。本発明では、固相の構造体はアセチ
ルセルロースのままで、固相の表面だけが鹸化されてい
ることが好ましい。これにより、表面鹸化処理の程度
（表面鹸化度）で固相表面の水酸基の量（密度）をコン
トロールすることができる。

【００１３】表面に水酸基を有する有機高分子の表面積
を大きくするためには、表面に水酸基を有する有機高分
子を膜化することが好ましい。また、アセチルセルロー
スは多孔膜でも非孔性膜でもよいが、膜を多孔性とする
ことが更に好ましい。固相が多孔性膜の場合、膜の構造
体はアセチルセルロースのままで、構造体の表面だけを
鹸化することが好ましい。これにより、表面鹸化処理の
程度（表面鹸化度）×孔径により空間的な水酸基の量
（密度）をコントロールすることができる。また、膜の
構造体はアセチルセルロースから構成されているため、
堅固な固相を得ることができる。ここで、アセチルセル
ロースを表面鹸化して表面ににのみ水酸基を導入すると
いうことは、構造体はアセチルセルロースのままで、表
面をセルロース化するということを意味する。なお、セ
ルロースを原材料として用いると、液体にできないた
め、工業的に多孔膜や平膜を製造することはできない。

【００１４】例えば、トリアセチルセルロースの膜は、
商品名ＴＡＣベースとして富士写真フイルムから市販さ
れており、トリアセチルセルロースの多孔膜としては、
ミクロフィルターＦＭ５００（富士写真フイルム（株）
製）がある。また、例えばポリエチレン製のビーズの表
面にトリアセチルセルロースの膜を形成し、これを表面
鹸化して表面に水酸基を持たせることも好ましい。この
場合、トリアセチルセルロースはビーズにコーティング
されることになる。ビーズの素材は、核酸を汚染等しな
ければよく、ポリエチレンには限定されない。

【００１５】核酸の分離効率を挙げるためには、水酸基
の数が多い方が好ましい。例えば、トリアセチルセルロ
ースなどのアセチルセルロースの場合には、表面鹸化率
が約５％以上であることが好ましく、１０％以上である
ことが更に好ましい。アセチルセルロースを表面鹸化す
るには、水酸化ナトリウム水溶液中に、表面鹸化したい
対象を浸漬する。表面鹸化率を変えるには、水酸化ナト
リウムの濃度を変えればよい。表面鹸化率は、ＮＭＲに
より、残存アセチル基を定量して定められる。

【００１６】本発明の核酸の分離精製方法では、好まし
くは、少なくとも２個の開口を有する容器内に表面に水
酸基を有する有機高分子から成る固相を収容した核酸分
離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行うこと
ができる。

【００１７】さらに好ましくは、(ａ) 表面に水酸基を
有する有機高分子から成る固相、(ｂ) 前記固相を収容
する、少なくとも２個の開口を有する容器、及び(ｃ)
前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置を含む
核酸分離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行
うことができる。

【００１８】この場合の本発明の核酸の分離精製方法の
第一の実施態様は、以下の工程を含むことができる。 (ａ) 核酸分離精製ユニットの一の開口を核酸を含む試
料溶液中に挿入する工程、(ｂ) 核酸分離精製ユニット
の他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内
を減圧状態にして核酸を含む試料溶液を吸引し、表面に
水酸基を有する有機高分子から成る固相に接触させる工
程、(ｃ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合され
た圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、吸引
された核酸を含む試料溶液を容器外に排出する工程、
(ｄ) 核酸分離精製ユニットの一の開口を核酸洗浄バッ
ファ溶液中に挿入する工程、(ｅ) 核酸分離精製ユニッ
トの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器
内を減圧状態にして核酸洗浄バッファ溶液を吸引し、表
面に水酸基を有する有機高分子から成る固相に接触させ
る工程、(ｆ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合
された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、
吸引された核酸洗浄バッファ溶液を容器外に排出する工
程、(ｇ) 核酸分離精製ユニットの一の開口を、表面に
水酸基を有する有機高分子から成る固相に吸着された核
酸を脱着せしめうる液中に挿入する工程、(ｈ) 核酸分
離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置
を用いて容器内を減圧状態にして、表面に水酸基を有す
る有機高分子から成る固相に吸着された核酸を脱着せし
めうる液を吸引し、固相に接触させる工程、及び(ｉ)
核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発
生装置を用いて容器内を加圧状態にし、表面に水酸基を
有する有機高分子から成る固相に吸着された核酸を脱着
せしめうる液を容器外に排出する工程。

【００１９】本発明の核酸の分離精製方法の第二の実施
態様は、以下の工程を含むことができる。 (ａ) 検体を用いて核酸を含む試料溶液を調製し、核酸
分離精製ユニットの一の開口に上記の核酸を含む試料溶
液を注入する工程、(ｂ) 核酸分離精製ユニットの上記
一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を
加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、他の開
口より排出することによって、表面に水酸基を有する有
機高分子から成る固相に接触させる工程、(ｃ) 核酸分
離精製ユニットの上記一の開口に核酸洗浄バッファを注
入する工程、(ｄ) 核酸分離精製ユニットの上記一の開
口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状
態にし、注入した核酸洗浄バッファを上記他の開口より
排出することによって、表面に水酸基を有する有機高分
子から成る固相に接触させる工程、(ｅ) 核酸分離精製
ユニットの上記一の開口に表面に水酸基を有する有機高
分子から成る固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液
を注入する工程、(ｆ) 核酸分離精製ユニットの上記一
の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加
圧状態にし、注入した核酸を脱着せしめうる液を上記他
の開口より排出させることによって、表面に水酸基を有
する有機高分子から成る固相に吸着された核酸を脱着さ
せ、容器外に排出する工程。

【００２０】表面に水酸基を有する有機高分子を用いた
核酸の分離精製方法についてさらに具体的に説明する。
本発明では、好ましくは、核酸を含む試料溶液を表面に
水酸基を有する有機高分子から成る固相に接触させるこ
とにより試料溶液中の核酸を固相に吸着させ、次いで、
固相に吸着させた核酸を、以下に説明する好適な溶液を
用いて固相から脱着させる。さらに好ましくは、核酸を
含む試料溶液は、細胞又はウイルスを含む検体を細胞膜
及び核膜を溶解する溶液で処理することにより核酸を液
中に分散させた溶液に水溶性有機溶媒を添加した溶液で
ある。

【００２１】本発明において使用できる核酸を含む試料
溶液に制限はないが、例えば診断分野においては、検体
として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾
液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（ま
たはその一部）など、あるいはそれらの溶解物およびホ
モジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象と
なる。

【００２２】最初にこれらの検体を、細胞膜を溶解して
核酸を可溶化する試薬を含む水溶液で処理する。これに
より細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に
分散する。細胞膜の溶解および核酸の可溶化のために
は、例えば、対象となる試料が全血の場合、赤血球の
除去、各種タンパク質の除去、及び白血球の溶解及
び核膜の溶解が必要となる。赤血球の除去および各
種タンパク質の除去は、固相への非特異吸着および多孔
膜の目目詰まりを防ぐために、白血球の溶解及び核膜
の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるために
それぞれ必要となる。特に、白血球の溶解及び核膜の
溶解は重要な工程であり、本発明の方法では、この工程
で核酸を可溶化することが必要である。本明細書中以下
に記載の実施例では、塩酸グアニジン、Ｔｒｉｔｏｎ−
Ｘ１００、プロテアーゼＫ（ＳＩＧＭＡ製）を添加した
状態で６０℃で１０分インキュベートすることによって
上記の、及びを同時に達成している。

【００２３】本発明で用いる核酸可溶化試薬としては、
グアニジン塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を
含む溶液が挙げられる。グアニジン塩としては、塩酸グ
アニジンが好ましいが、他のグアニジン塩（イソチオシ
アン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン）を使用す
ることもできる。グアニジン塩の溶液中の濃度は、０.
５Ｍ以上６Ｍ以下 好ましくは １Ｍ以上５Ｍ以下であ
る。

【００２４】界面活性剤としてはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１０
０を使用することができるが、この他にも、ＳＤＳ、コ
ール酸ナトリウム又はサルコシンナトリウム等の陰イオ
ン性界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ２０又はメガファック等の
ノニオン性界面活性剤、その他各種両性界面活性剤を使
用することもできる。本発明では、ポリオキシエチレン
オキチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）
等のノニオン性界面活性剤を使用することが好ましい。
界面活性剤の溶液中の濃度は、通常０．０５重量％〜１
０重量％ 特に好ましくは０．１重量％〜５重量％であ
る。

【００２５】タンパク質分解酵素としては、プロテアー
ゼＫを使用することはできるが、他のプロテアーゼでも
同様の効果を得ることができる。プロテアーゼは酵素で
あるため加温するのが好ましく、３７℃〜７０℃で使用
することが好ましく、特に５０℃〜６５℃で使用するこ
とが好ましい。

【００２６】このように核酸が分散した水溶液中に、水
溶性有機溶媒を添加して、表面に水酸基を有する有機高
分子と接触させる。この操作により、試料溶液中の核酸
が表面に水酸基を有する有機高分子に吸着される。本明
細書中上記した操作で可溶化された核酸を、表面に水酸
基を有する有機高分子から成る固相に吸着させるために
は、可溶化した核酸混合液に水溶性有機溶媒を混合する
ことと、得られた核酸混合液中に塩が存在することが必
要である。

【００２７】即ち、核酸の周りに存在する水分子の水和
構造を破壊することにより、核酸は不安定な状態で可溶
化することになる。この状態の核酸を、表面に水酸基を
有する有機高分子から成る固相と接触させると、核酸表
面上の極性基と固相表面の極性基間で相互作用し、核酸
は固相表面上に吸着するものと考えられる。本発明の方
法では、可溶化した核酸混合液に水溶性有機溶媒を混合
することと、得られた核酸混合液中に塩が存在すること
によって、核酸を不安定な状態にさせることができる。

【００２８】ここで用いる水溶性有機溶媒としては、エ
タノール、イソプロパノール又はプロパノールなどが挙
げられ、中でもエタノールが好ましい。水溶性有機溶媒
の濃度は、好ましくは５重量％〜９０重量％であり、さ
らに好ましくは２０重量％〜６０重量％である。エタノ
ールの添加濃度は、擬集物を生じない程度でできるだけ
高くすることが特に好ましい。

【００２９】得られた核酸混合液中に存在する塩として
は、各種カオトロピック物質（グアニジウム塩、ヨウ化
ナトリウム、過塩素酸ナトリウム）や塩化ナトリウム、
塩化カリウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、臭
化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム等が好
ましい。特にグアニジウム塩は、細胞膜の溶解および核
酸の可溶化の効果を併有するので特に好ましい。

【００３０】次いで、この核酸が吸着した表面に水酸基
を有する有機高分子を核酸洗浄バッファ溶液に接触させ
る。この溶液は核酸と一緒に表面に水酸基を有する有機
高分子に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を
有する。従って、表面に水酸基を有する有機高分子から
核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成を有する
必要がある。核酸洗浄バッファ溶液は主剤と緩衝剤、及
び必要に応じて界面活性剤を含む水溶液からなる。主剤
としてはメタノール、エタノール、イソプロパノール、
ｎ−イソプロパノール、ブタノール、アセトン等の約１
０〜１００重量％（好ましくは約２０〜１００重量％、
さらに好ましくは約４０〜８０重量％）の水溶液が、緩
衝剤及び界面活性剤としては、既述の緩衝剤及び界面活
性剤が挙げられる。これらの内では、エタノール、Ｔｒ
ｉｓ及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む溶液が好まし
い。Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の好ましい濃
度は、それぞれ１０〜１００ｍＭ、及び０．１〜１０重
量％である。

【００３１】次に、表面に水酸基を有する有機高分子に
吸着した核酸を脱着せしめうる溶液に、上記洗浄後の表
面に水酸基を有する有機高分子を接触させる。この溶液
には目的とする核酸が含まれているので、これを回収
し、後に続く操作、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反
応）による核酸の増幅に提供する。核酸を脱着せしめう
る溶液としては、塩濃度が低いことが好ましく、特に好
ましくは０．５Ｍ以下の塩濃度の溶液を使用する。この
溶液としては、精製蒸留水、ＴＥバッファ等が使用でき
る。

【００３２】（２）本発明の核酸分離精製ユニット 本発明の核酸分離精製ユニットは、少なくとも２個の開
口を有する容器内に表面に水酸基を有する有機高分子か
ら成る固相を収容した核酸分離精製ユニットである。容
器の材料に特別な限定はなく、表面に水酸基を有する有
機高分子が収容でき、かつ少なくとも２個の開口を設け
ることができればよいが、製造の容易性からプラスチッ
クが好ましい。例えば、ポリスチレン、ポリメタアクリ
ル酸エステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエ
ステル、ナイロン、ポリカーボネート等の透明あるいは
不透明の樹脂を用いるのが好ましい。

【００３３】容器の概念図を図１に示す。基本的には、
固相の収容部を持ち、収容部に固相を収容でき、固相が
試料液等の吸引及び排出時に収容部の外へは出ることが
なく、開口に圧力差発生装置、例えば注射器を接合でき
ればよい。このためには、容器が当初は二つの部分に分
かれており、固相を収容した後で一体化できることが好
ましい。また、固相が収容部から外へでることをさける
為には、固相の上下にＤＮＡを汚染しない材料で作成さ
れたメッシュを置くことができる。

【００３４】上記容器に収容される表面に水酸基を有す
る有機高分子の形状にも特別な限定は無く、円形、正方
形、長方形、楕円、膜の場合には筒状、巻物状、あるい
は表面に水酸基を有する有機高分子をコーティングした
ビーズ等、任意の形状で良いが、製造適性の点からは、
円、正方形、円筒状、巻物状等の対称性の高い形状及び
ビーズが好ましい。

【００３５】上記容器の一の開口を核酸を含む試料溶液
中に挿入し、他の一の開口から吸引して表面に水酸基を
有する有機高分子に試料溶液を接触させ、これを排出
し、次いで核酸洗浄バッファ溶液を吸引・排出し、次い
で、表面に水酸基を有する有機高分子に吸着した核酸を
脱着せしめうる溶液を吸引・排出して、この排出液を回
収することにより、目的とする核酸を得ることができ
る。

【００３６】表面に水酸基を有する有機高分子を、核酸
を含む試料溶液、核酸洗浄バッファ溶液、及び表面に水
酸基を有する有機高分子に吸着した核酸を脱着せしめう
る溶液中に順次浸漬しても目的とする核酸を得ることが
できる。

【００３７】本発明の核酸分離精製ユニットは、(ａ)
表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相、(ｂ)
前記固相を収容する、少なくとも２個の開口を有する容
器、及び(ｃ) 前記容器の一の開口に結合された圧力差
発生装置、を含むものであることが好ましい。以下、こ
の核酸分離精製ユニットについて説明する。

【００３８】容器は、通常、表面に水酸基を有する有機
高分子から成る固相を収容する本体と、蓋体に分けた態
様で作製され、いずれにも少なくとも１個の開口が設け
られている。一方は核酸を含有する試料溶液、核酸洗浄
バッファ溶液及び固相に吸着された核酸を脱着せしめう
る液（以下、「試料溶液等」と記す。）の入口及び出口
として使用され、他方は容器内を減圧又は加圧状態にせ
しめうる圧力差発生装置に接続される。本体の形状に特
に限定はないが、製造が容易で、試料溶液等が固相の全
面に拡散し易くするには、断面を円形にすることが好ま
しい。断面を四角形にすることも、固相の裁断屑を発生
させないために好ましい。

【００３９】上記蓋は、圧力差発生装置によって容器内
部を減圧及び加圧状態にできるように本体に接合されて
いる必要があるが、この状態が達成できれば、接合方法
は任意に選択できる。例えば、接着剤の使用、ねじ込
み、はめ込み、ネジ止め、超音波加熱による融着等が挙
げられる。

【００４０】容器の内容積は処理すべき試料溶液の量の
みによって決められるが、通常、収容される固相の体積
で表す。即ち、厚さが約１ｍｍ以下（例えば、５０〜５
００μｍ程度）で、直径が約２ｍｍ〜２０ｍｍの固相を
１枚〜６枚程度収容する大きさとすることが好ましい。

【００４１】固相の端面は、試料溶液等が通過しない程
度に、容器の内壁面に密着させることが好ましい。

【００４２】試料溶液等の入り口に使用される開口に対
向する固相の下は、容器の内壁に密着させずに空間を設
け、試料溶液等が固相の全面にできるだけ均等に拡散す
る構造にする。

【００４３】他の一の開口、即ち圧力差発生装置に結合
される開口に対向する固相の上には、ほぼ中央に穴を穿
った部材を設けることが好ましい。この部材は、固相を
押さえると共に、試料溶液等を効率よく排出する効果を
有するものであり、液が中央の穴に集まる様に、漏斗状
あるいはお椀状等の斜面を有する形状にすることが好ま
しい。この穴の大きさ、斜面の角度、部材の厚さは、処
理する試料溶液等の量や固相を収容する容器の大きさ等
を考慮して、当業者が適宜定めることができる。この部
材と当該開口の間には、オーバーフローした試料溶液等
を溜めて、圧力差発生装置内に吸引されることを防ぐた
めの空間を設けることが好ましい。この空間の大きさも
当業者が適宜選択することができる。なお、核酸を効率
良く集めるためには、固相の全体が浸る以上の量の核酸
を含む試料溶液を吸引することが好ましい。

【００４４】また、吸引している開口の真下の部分にの
み試料溶液等が集中することを防いで、試料溶液等が固
相内を比較的均一に通過できるようにするため、固相と
この部材の間にも空間を設けることが好ましい。このた
めには、当該部材から固相に向けて複数の突起物を設け
ることが好ましい。突起物の大きさや数は当業者が適宜
選択することができるが、空間を保持しながら固相の開
口面積をできる限り大きく保つことが好ましい。

【００４５】なお、容器に３以上の開口を設けた場合に
は、減圧及び加圧操作に伴う液の吸引及び排出を可能に
すべく、余分の開口を一時的に封鎖する必要があること
はいうまでもない。

【００４６】圧力差発生装置は、まず固相を収容した容
器内を減圧にして核酸を含む試料溶液を吸引する。圧力
差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリ
スタポンプのような吸引及び加圧が可能なポンプ等が挙
げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操
作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作
が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力
差発生装置は、前記容器の一の開口に着脱可能に結合さ
れている。

【００４７】次に、上記した核酸分離精製ユニットを使
用した、核酸の精製方法について説明する。先ず、核酸
を含む試料溶液中に、上記の核酸分離精製ユニットの一
の開口を挿入する。次いで他の一の開口に接続された圧
力差発生装置を用いて精製ユニットの内部を減圧にして
試料溶液を容器内に吸入する。この操作により、試料溶
液が固相と接触して試料溶液中にある核酸が固相に吸着
する。この際に、固相のほぼ全体と接触する量の試料溶
液を吸引することが好ましいが、圧力差発生装置内に吸
引すると装置を汚染するので、適量に調整する。

【００４８】適量の試料溶液を吸引後、圧力差発生装置
を用いてユニットの容器内を加圧して、吸引した液を排
出する。この操作までに間隔を開ける必要はなく、吸引
後直ちに排出してもよい。

【００４９】次に、上記と同様の減圧−加圧操作で核酸
洗浄バッファ溶液を容器内に吸引し、これから排出して
容器内部を洗浄する。この溶液は容器内に残留する試料
溶液を洗い流すと共に、核酸と一緒に固相に吸着した試
料溶液中の不純物も洗い流す機能を有する。従って、固
相から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成を
有する必要がある。核酸洗浄バッファ溶液は主剤と緩衝
剤、及び必要に応じて界面活性剤を含む水溶液からな
り、主剤としてはメチルアルコール、エチルアルコー
ル、ブチルアルコール、アセトン等の約１０〜９０％
（好ましくは約５０〜９０％）の水溶液が、緩衝剤及び
界面活性剤としては、既述の緩衝剤及び界面活性剤が挙
げられる。これらの内では、エチルアルコール、Ｔｒｉ
ｓ及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む溶液が好ましい。
Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の好ましい濃度
は、それぞれ１０〜１００ｍＭ、及び０．１〜１０％で
ある。

【００５０】次に、固相に吸着した核酸を脱着せしめう
る溶液を、上記と同様の減圧−加圧操作によって容器内
部に導入し、容器から排出する。この排出液には目的と
する核酸が含まれているので、これを回収し、後に続く
操作、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による核
酸の増幅に提供することができる。

【００５１】図２は、本発明の核酸分離精製ユニットの
一例の断面図である。但し圧力差発生装置は図示してい
ない。固相を収容する容器１は、本体１０と蓋２０から
成り、透明なポリスチレンで形成されている。本体１０
は固相３０として表面鹸化したトリアセチルセルロース
の膜を収容している。また、試料溶液等を吸引する開口
１０１を有する。開口から続いている底面１０２は漏斗
状に形成され、固相３０との間に空間１２１が設けられ
ている。固相３０を支えて空間１２１を保つために、底
面１０２と一体となった枠１０３が設けられている。

【００５２】本体は、内径が２０．１ｍｍ、深さが５．
９ｍｍ、底面１０２から開口１０１までの長さは約７０
ｍｍである。また、内蔵されている固相３０の直径は２
０．０ｍｍ、一枚の厚さは約５０〜５００μｍであり、
厚さの一例としては１００μｍである。

【００５３】図２において、固相の上部には漏斗状の押
さえ部材１３が設けられている。押さえ部材１３の中央
には穴１３１があり、かつ下方に一群の突起１３２が設
けられ、固相３０との間に空間１２２が設けられてい
る。固相３０と本体１０の壁１０４の間から試料溶液等
が漏れにくい様に、壁１０４の上部の直径は固相の直径
より大きく作成され、段差１０５の上に押さえ部材１３
の端が乗っている。

【００５４】蓋２０は本体１０と超音波加熱により接合
されている。蓋２０のほぼ中央部には、圧力差発生装置
を結合する開口２１が設けられている。蓋２０と押さえ
部材１３の間には、穴１３１から流出する試料溶液等を
保持する空間１２３が設けられている。空間１２３の容
積は約０．１ｍｌである。

【００５５】（３）本発明の核酸の分析方法 本発明の核酸の分析方法は、（１）上記した本発明の方
法によりターゲット核酸断片を含む核酸断片を分離精製
する工程；（２）前記ターゲット核酸断片、前記ターゲ
ット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライ
マー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン
酸、及び少なくとも一種のポリメラーゼを反応させ、前
記ターゲット核酸断片を鋳型にした前記プライマーの
３’末端を起点とするポリメラーゼ伸長反応を行う工
程；及び、（３）ポリメラーゼ伸長反応の進行の有無を
検出するか、又はポリメラーゼ伸長反応産物と他の核酸
とのハイブリダイゼーションの有無を検出する工程：を
含むことを特徴とするものである。

【００５６】本発明の好ましい態様によれば、ポリメラ
ーゼ伸長反応に伴って生成するピロ燐酸を検出すること
によりポリメラーゼ伸長反応の進行の有無を検出する。
さらに好ましい態様は、ピロ燐酸の分析を比色法を用い
て行う方法であり、より好ましくは、ピロ燐酸の検出を
乾式分析素子を用いて行う方法である。本発明による核
酸の分析方法では、ターゲット核酸断片の存在または存
在量を検出したり、あるいはターゲット核酸断片の塩基
配列を検出することができる。なお、ここで言う存在量
の検出とは、ターゲット核酸断片の定量を含む概念であ
る。ターゲット核酸断片の塩基配列の検出の具体例とし
ては、ターゲット核酸断片の変異または多型の検出など
が挙げられる。図３に、本発明の実施形態を説明する概
念図を示す。

【００５７】本発明に係るターゲット核酸断片の分析方
法の第一の好ましい形態を以下に列記する。 (イ) ピロ燐酸の検出を、キサントシンまたはイノシ
ン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及
び発色剤を含有する試薬層を備えることを特徴とするピ
ロ燐酸定量用乾式分析素子を用いて行う。 (ロ) ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメ
ラーゼ、及び逆転写酵素（リバーストランスクリプター
ゼ）からなるグループから選択されるポリメラーゼを用
いる。

【００５８】さらに、本発明の別の態様では、ポリメラ
ーゼ伸長反応の進行の有無の検出を前記ポリメラーゼ伸
長反応に伴って生成するピロ燐酸を検出することにより
行う際に、ピロ燐酸の検出を、ピロ燐酸を酵素的に無機
燐に変換した後、次いでキサントシンまたはイノシン、
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ及び発色剤を含有する試薬層
を備える無機燐定量用乾式分析素子を用いて行うことが
できる。この場合の好ましい形態を以下に列記する。 (イ) ピロ燐酸を変換する酵素として、ピロホスファタ
ーゼを用いる。 (ロ) ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメ
ラーゼ、及び逆転写酵素（リバーストランスクリプター
ゼ）からなるグループから選択されるポリメラーゼを用
いる。

【００５９】以下、本発明の核酸の分析方法について更
に詳細に説明する。 (Ａ)ターゲット核酸断片：本発明において分析の対象と
なるターゲット核酸断片とは、少なくとも一部の塩基配
列が既知であるポリヌクレオチドであり、動物、微生
物、細菌、植物などすべての生物から単離されるゲノミ
ックＤＮＡ断片が対象となり得る。またウイルスから単
離可能なＲＮＡ断片またはＤＮＡ断片、およびｍＲＮＡ
を鋳型として合成されたｃＤＮＡ断片も対象とすること
が可能である。ターゲット核酸断片はできる限り精製さ
れ、核酸断片以外の余分な成分が取り除かれていること
が望ましい。例えば、動物（例えば人間）の血液から単
離したゲノミックＤＮＡ断片を対象とする場合または血
液中に存在する感染細菌やウイルスの核酸（ＤＮＡまた
はＲＮＡ）断片を対象とする場合、単離の過程で破壊さ
れた白血球細胞膜、赤血球中から溶出したヘモグロビ
ン、および血液中存在するその他の一般化学物質は、十
分に取り除いておく必要がある。特にヘモグロンビン
は、続いておこなうポリメラーゼ伸長反応を阻害する。
また血液中に一般生化学物質として存在するピロ燐酸や
燐酸は、ポリメラーゼ伸長反応により生成するピロ燐酸
の正確な検出の妨害要因になる。

【００６０】(Ｂ）ターゲット核酸断片と相補的なプラ
イマー：本発明において使用するターゲット核酸断片と
相補的なプライマーは、ターゲット核酸断片の塩基配列
が既知である目的の部位に対して相補的な塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドである。このターゲット核酸断
片と相補的なプライマーがターゲット核酸断片の目的の
部位にハイブリダイゼーションすることで、プライマー
の３’末端を起点に、ターゲット核酸を鋳型としポリメ
ラーゼ伸長反応が進行する。即ち、本発明においてはプ
ライマーがターゲット核酸断片の目的の部位を認識して
特異的にハイブリダイゼーションするか否かがポイント
となる。本発明で使用するプライマーの好ましい塩基数
は５〜６０塩基である。特に好ましくは１５〜４０塩基
である。プライマーの塩基数は少なすぎると、ターゲッ
ト核酸断片の目的の部位との特異的性が低下するだけで
なく、ターゲット核酸断片とのハイブリッド自体が安定
に形成できない。また、プライマーの塩基数は多すぎる
と、プライマー間またはプライマー内で塩基間の水素結
合により２本鎖を形成してしまい、やはり特異性が低下
する。

【００６１】本発明の方法を用いてターゲット核酸断片
の存在を検出する場合、ターゲット核酸断片の異なる部
位に対して、それぞれの部位に相補的なプライマーを複
数使用することも可能である。このようにターゲット核
酸断片を複数の部位で認識することで、ターゲット核酸
断片の存在の検出において、特異性が向上する。また、
ターゲット核酸断片の一部を増幅（例えばＰＣＲ法）す
る場合には、その増幅法に応じて複数のプライマーを設
計することも可能である。本発明の方法を用いてターゲ
ット核酸断片の塩基配列を検出する場合、特に変異また
は多型の有無を検出する場合は、目的の変異または多型
の部分を含むように、変異または多型に対応する塩基の
種類でプライマーを設計する。そうすることで、ターゲ
ット核酸断片の変異または多型の有無により、ターゲッ
ト核酸断片へのプライマーのハイブリダイゼーションの
有無に差異が生じ、結果的にポリメラーゼ伸長反応の差
異として検出することが可能になる。また、変異または
多型に対応する部分をプライマーの３'末端付近に設定
することでポリメラーゼの反応部位の認識に差異が生
じ、結果的にポリメラーゼ伸長反応の差異として検出す
ることも可能である。

【００６２】(Ｃ) ポリメラーゼ：本発明において使用
するポリメラーゼは、ターゲット核酸がＤＮＡの場合
は、ターゲット核酸断片の一本鎖に変性された部分にプ
ライマーがハイブリダイゼーションすることで形成され
た２本鎖の部分を起点として、５’→３’の方向に、デ
オキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）を材料とし
て、ターゲット核酸断片を鋳型にして相補的な伸長反応
を触媒するＤＮＡポリメーラーゼである。具体的に使用
されるＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｂｓｔ
ＤＮＡポリメラーゼ等がある。ＤＮＡポリメラーゼは目
的に応じて選択または組み合わせることが可能である。
例えば、ターゲット核酸断片の一部を増幅（例えばＰＣ
Ｒ法）する場合には、耐熱性に優れたＴａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼを用いることが有効である。また、「ＢＩＯ
ＩＮＤＵＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２，２００
１」に記載されている増幅法（ＬＡＭＰ法：Ｌｏｏｐ−
ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ）を用いてターゲット核酸
断片の一部を増幅する場合には、５’→３’方向へのヌ
クレアーゼ活性がなく、かつ鋳型上の２本鎖ＤＮＡを１
本鎖ＤＮＡとして遊離させながら伸長反応を触媒する鎖
置換型のＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂｓｔ ＤＮＡポ
リメラーゼを使用することが有効である。その他、目的
に応じて、３’→５’方向へのヘキソキナーゼ活性を持
つ、ＤＮＡポリメラーゼα、Ｔ４ ＤＮＡポリメラー
ゼ、及びＴ７ＤＮＡポリメラーゼを併用することも可能
である。

【００６３】また、ＲＮＡウイルスのゲノミック核酸ま
たはｍＲＮＡがターゲット核酸断片である場合には、逆
転写活性を有するリバーストランスクリプターゼを使用
することが可能である。さらにリバーストランスクリプ
ターゼとＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを併用することも
可能である。

【００６４】(Ｄ) ポリメラーゼ伸長反応：本発明にお
いて対象となるポリメラーゼ伸長反応には、前記（Ａ）
に記載されているようなターゲット核酸断片の１本鎖に
変性された部分の一部に特異的にハイブリダイゼーショ
ンした、前記（Ｂ）に記載されているようなターゲット
核酸断片と相補的なプライマーの３’末端を起点とし
て、デオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）を材料
として、前記（Ｃ）に記載されているようなポリメラー
ゼを触媒として、ターゲット核酸断片を鋳型にして進行
する相補的な核酸の伸長反応の全てが含まれる。この相
補的な核酸の伸長反応とは、少なくとも２回（２塩基
分）、連続しての伸長反応が起こることをさしている。

【００６５】以下に、例として代表的なポリメラーゼ伸
長反応、およびポリメラーゼ伸長反応を伴うターゲット
核酸断片の目的部位の増幅反応の例を示す。ターゲット
核酸断片を鋳型にして、５’→３’の方向へのポリメラ
ーゼ伸長反応を一度だけ行う場合が最も単純である。こ
のポリメラーゼ伸長反応は等温の条件で実施することが
できる。この場合には、ポリメラーゼ伸長反応の結果と
して生成するピロ燐酸の量は、最初のターゲット核酸断
片の量に比例する。即ち定量的にターゲット核酸断片の
存在を検出するのに適した方法である。

【００６６】ターゲット核酸の量が少ない場合は、ポリ
メラーゼ伸長反応を利用した何らかの手段でターゲット
核酸の目的部分を増幅することが好ましい。ターゲット
核酸の増幅には、これまで開発、発明されてきた各種の
方法を使用することができる。ターゲット核酸の増幅法
で最も一般的で普及している方法はＰＣＲ（ポリメラー
ゼチェーンリアクション）法である。ＰＣＲ法では、反
応液の温度の上げ下げを周期的にコントロールすること
により、変性（核酸断片を２本鎖から１本鎖に変性する
工程）→アニーリング（１本鎖に変性した核酸断片にプ
ライマーをハイブイリダイズさせる工程）→ポリメラー
ゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）伸長反応→ディネイチ
ャーの周期的な工程を繰り返すことで、ターゲット核酸
断片の目的部分を増幅する方法である。最終的に、ター
ゲット核酸断片の目的部位は初期量の１００万倍にも増
幅し得る。そのためＰＣＲ法の増幅過程でのポリメラー
ゼ伸長反応で生成するピロ燐酸の蓄積量も多くなり、検
出が容易になる。

【００６７】特開平５−１３０８７０号公報に記載され
ている、エクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッ
セイ法もポリメラーゼ伸長反応を利用した、ターゲット
核酸断片の目的部位の増幅法の一つである。この方法は
ターゲット核酸断片の目的部位に特異的にハイブリダイ
ゼーションしたプライマーを起点とした、ポリメラーゼ
伸長反応とともに、５’→３’エクソヌクレアーゼを作
用させて、プライマーを逆方向から分解する方法であ
る。分解したプライマーの代わりに新たなプライマーが
ハイブリダイゼーションし、再度ＤＮＡポリメラーゼに
よる伸長反応が進行する。このポリメラーゼによる伸長
反応と、この先に伸長した鎖を外すエクソヌクレーアゼ
による分解反応が順次、周期的に繰り返される。ここ
で、ポリメラーゼによる伸長反応とエクソヌクレーアゼ
による分解反応は等温条件で実施することが可能であ
る。このサイクリングアッセイ法においても繰り返され
るポリメラーゼ伸長反応で生成するピロ燐酸の蓄積量も
多くなり、検出が容易になる。

【００６８】近年開発されたターゲット核酸断片の目的
部位の増幅法として、前記ＬＡＭＰ法がある。この方法
は、ターゲット核酸断片の少なくとも６個所の特定部位
を相補的に認識する少なくとも４種のプライマーと、
５’→３’方向へのヌクレアーゼ活性がなく、かつ鋳型
上の２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡとして遊離させながら
伸長反応を触媒する鎖置換型のＢｓｔ ＤＮＡポリメラ
ーゼを使用することで、等温条件でターゲット核酸断片
の目的部位を、特別な構造として増幅する方法である。
このＬＡＭＰ法の増幅効率は高く、ポリメラーゼ伸長反
応で生成するピロ燐酸の蓄積量も非常に多くなり、検出
が容易になる。

【００６９】ターゲット核酸断片がＲＮＡ断片の場合
は、逆転写活性を有するリバーストランスクリプターゼ
を使用し、ＲＮＡ鎖を鋳型にして伸長反応を行うことが
可能である。さらにリバーストランスクリプターゼとＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼを併用し、ＲＴ（リバースト
ランスクリプション）反応に引き続いてＰＣＲ反応を行
う、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いることができる。このＲＴ反
応またはＲＴ−ＰＣＲ反応で生成するピロ燐酸を検出す
ることで、ターゲット核酸断片のＲＮＡ断片の存在を検
出することができる。この方法は、ＲＮＡウイルスの存
在を検出する場合に有効である。

【００７０】(Ｅ) ピロ燐酸（ＰＰｉ）の検出：従来か
らピロ燐酸（ＰＰｉ）の検出法としては、式１に示され
た方法が知られている。この方法では、ピロ燐酸（ＰＰ
ｉ）をスルフリラーゼによりアデノシン３燐酸（ＡＴ
Ｐ）に変換し、アデノシン３燐酸がルシフェラーゼによ
りルシフェリンに作用して生じる発光を検出する。その
ため、この方法でピロ燐酸（ＰＰｉ）を検出するには発
光を測定できる装置が必要である。

【００７１】

【化１】

【００７２】本発明に適したピロ燐酸の検出方法は式２
または式３に示した方法である。式２または式３に示し
た方法は、ピロ燐酸（ＰＰｉ）をピロホスファターゼで
無機燐（Ｐｉ）に変換し、プリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼ（ＰＮＰ）により無機燐（Ｐｉ）をキサントシン
またはイノシンと反応させ、生じたキサンチンまたはヒ
ポキサンチンをキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）によ
り酸化して尿酸を生成させ、この酸化過程で生じる過酸
化水素（Ｈ₂Ｏ₂）を用いてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
により発色剤（色素前駆体）を発色させ、これを比色す
るものである。これら式２または式３に示した方法では
結果を比色で検出できるため、目視または簡単な比色測
定装置を用いてピロ燐酸（ＰＰｉ）の検出が可能であ
る。

【００７３】

【化２】

【００７４】

【化３】

【００７５】ピロホスファターゼ（ＥＣ３，６，１，
１）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ，ＥＣ
２．４．２．１）、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ，
ＥＣ１．２．３．２）及びペルオキシダーゼ（ＰＯＤ，
ＥＣ１．１１．１．７）は市販のものを使用することが
できる。発色剤（すなわち色素前駆体）は、過酸化水素
とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により色素を生成させる
ものであればよく、例えば、ロイコ色素の酸化によって
色素を生成する組成物（例、米国特許４，０８９，７４
７等に記載のトリアリールイミダゾールロイコ色素、特
開昭５９−１９３３５２号公報（ＥＰ ０１２２６４１
Ａ）等に記載のジアリールイミダゾーロイコ色素）；酸
化されたときに他の化合物とカップリングにより色素を
生成する化合物を含む組成物（例えば４−アミノアンチ
ピリン類とフェノール類又はナフトール類）などを使用
することができる。

【００７６】(Ｆ) 乾式分析素子：本発明において使用
することのできる乾式分析素子とは、一層または複数層
の機能層からなる分析素子であって、その少なくとも一
層（または複数の層に渡って）に検出試薬を含有させ、
層内での反応により生じた生成色素を、分析素子の外か
ら反射光あるいは透過光により比色定量するものであ
る。

【００７７】このような乾式分析素子を用いて定量分析
するには、液体試料を展開層の表面に一定量点着する。
展開層で展開された液体試料は試薬層に達し、ここで試
薬と反応し、発色する。点着後、乾式分析素子を適当な
時間、一定温度に保って（インクベーション）発色反応
を充分に進行させた後、例えば透明支持体側から照明光
を試薬層に照射し、特定波長域で反射光量を測定して反
射光学濃度を求め、予め求めておいた検量線に基づいて
定量分析を行う。

【００７８】乾式分析素子においては、検出を行うまで
は乾燥状態で貯蔵・保管されるため、試薬を用時調製す
る必要がなく、また一般に乾燥状態の方が試薬の安定性
が高いことから、試薬溶液を用時調製しなければならな
いいわゆる湿式法より簡便性、迅速性に優れている。ま
た、微量の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行うこ
とができる検査方法としても優れている。

【００７９】(Ｇ) ピロ燐酸定量用乾式分析素子：本発
明で使用することのできるピロ燐酸定量用乾式分析素子
は、公知の多種の乾式分析素子と同様の層構成とするこ
とができる。乾式分析素子は、前記（Ｅ）項（ピロ燐酸
（ＰＰｉ）の検出）における、式２または式３の反応を
行うための試薬の他、支持体、展開層、検出層、光遮蔽
層、接着層、吸水層、下塗り層その他の層を含む多重層
としてもよい。このような乾式分析素子として、例えば
特開昭４９−５３８８８号公報（対応米国特許３，９９
２，１５８）、特開昭５１−４０１９１号公報（対応米
国特許４，０４２，３３５）、及び特開昭５５−１６４
３５６号公報（対応米国特許４，２９２，２７２）、特
開昭６１−４９５９号公報（対応ＥＰＣ公開特許０１６
６３６５Ａ）の各明細書に開示されたものがある。

【００８０】本発明で用いることができる乾式分析素子
としては、ピロ燐酸を無機燐に変換する試薬、および無
機燐の量に応じた発色反応を行う試薬群を含有する試薬
層を備えるピロ燐酸定量用乾式分析素子が挙げられる。
このピロ燐酸定量用乾式分析素子においては、ピロホス
ファターゼを用いて酵素的にピロ燐酸（ＰＰｉ）を無機
燐（Ｐｉ）に変換するまでは本明細書中上記した通り行
うことができ、それ以降は、生化学検査分野で既知の以
下に述べる「無機燐の定量法」（及びそれらに用いられ
る各反応の組み合わせ）を用いることにより、無機燐
（Ｐｉ）の量に応じた発色反応を行うことができる。

【００８１】なお、「無機燐」を表記する場合、燐酸
（燐酸イオン）として、「Ｐｉ」と表記する場合と「Ｈ
ＰＯ₄ ^2-、Ｈ₂ＰＯ₄ ^1-」と表記する両方の場合がある。
以下に示す反応の例では、「Ｐｉ」として表記するが、同
じ反応式に対して「ＨＰＯ₄ ^2-」と表記する場合もあ
る。

【００８２】無機燐の定量法としては酵素法と燐モリブ
テン酸塩法が知られている。以下、無機燐の定量法とし
ての酵素法と燐モリブテン酸塩法について説明する。

【００８３】Ａ．酵素法 Ｐｉを定量検出するための一連の反応における最後の
「呈色反応」に用いる酵素に応じて、ペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）を用いる方法とグルコース−６−燐酸デヒド
ロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）を用いる方法がある。以下、
これらの方法の具体例を説明する。

【００８４】（１）ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用い
る方法の例 （１−１）無機燐（Ｐｉ）を、プリンヌクレオシドホス
ホリラーゼ（ＰＮＰ）により、イノシンと反応させ、生
じたヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ
Ｄ）により酸化して尿酸を生成する。この酸化過程で生
じる過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）を用いて、ペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）により、４−アミノアンチピリン（４−Ａ
Ａ）とフェノールとを酸化縮合させてキノンイミン色素
を形成し、これを比色する。

【００８５】（１−２）無機燐（Ｐｉ）、コカルボキシ
ラーゼ（ＴＰＰ）、フラビンアデニンジヌクレオチド
（ＦＡＤ）、Ｍｇ²⁺の存在下で、ピルビン酸をピルビン
酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）により酸化してアセチル酢酸
を生成する。この酸化過程で生じる過酸化水素（Ｈ
₂Ｏ₂）を用いて、上記（１−１）の場合と同様に、ペル
オキシダーゼ（ＰＯＤ）により、４−アミノアンチピリ
ン（４−ＡＡ）とフェノールとを酸化縮合させてキノン
イミン色素を形成し、これを比色する。

【００８６】なお、上記の（１−１）および（１−２）
における最後の呈色反応は、過酸化水素の検出試薬とし
て既知の「Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬」を使用して行うことが
できる。この反応で、フェノールは「水素供与体」とし
て働く。「水素供与体」として用いるフェノールは古典
的で、現在は改良された様々な「水素供与体」が使用さ
れている。このような水素供与体の具体例としては、Ｎ
−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニリジン、Ｎ−
エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ
−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−
スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エ
チル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−ｍ−アニリジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，
５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、
及びＮ−スルホプロピルアニリンなどが挙げられる。

【００８７】（２）グルコース−６−燐酸デヒドロゲナ
ーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）を用いる方法 （２−１）無機燐（Ｐｉ）とグリコーゲンとをホスホリ
ラーゼを用いて反応させ、グルコース−１−燐酸（Ｇ−
１−Ｐ）を生成させる。生じたグルコース−１−燐酸を
ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）により、グルコース−
６−燐酸（Ｇ−６−Ｐ）にする。グルコース−６−燐酸
とニコチアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）との
存在下、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６
ＰＤＨ）により、ＮＡＤを還元してＮＡＤＨにし、これ
を比色する。

【００８８】（２−２）無機燐（Ｐｉ）とマルトースと
をマルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を用いて反応さ
せ、グルコース−１−燐酸（Ｇ−１−Ｐ）を反応させ
る。以下、上記（２−１）と同様に、生じたグルコース
−１−燐酸をホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）により、
グルコース−６−燐酸（Ｇ−６−Ｐ）にする。グルコー
ス−６−燐酸とニコチアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤ）との存在下、グルコース−６−燐酸デヒドロ
ゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）により、ＮＡＤを還元してＮＡ
ＤＨにし、これを比色する。

【００８９】Ｂ．燐モリブテン酸塩法 酸性下で無機燐（燐酸塩）と水溶性モリブテン酸イオン
とを錯化させた「燐モリブテン酸塩（Ｈ₃［ＰＯ₄Ｍｏ₁₂
Ｏ₃₆］）を直接定量する「直接法」と、上記直接法の反
応に続いて、還元剤により、Ｍｏ（IV）からＭｏ（II
I）として、モリブテン青（Ｍｏ（III））を定量する
「還元法」とがある。水溶性モリブテン酸イオンの例と
しては、モリブテン酸アルミニウム、モリブテン酸カド
ミウム、モリブテン酸カルシウム、モリブテン酸バリウ
ム、モリブテン酸リチウム、モリブテン酸カリウム、モ
リブテン酸ナトリウム、モリブテン酸アンモニウムなど
が挙げられる。還元法で使用される代表的な還元剤の例
としては、１，２，４アミノナフトールスルホン酸、硫
酸第一鉄アンモニウム、塩化第一鉄、塩化第一スズ−ヒ
ドラジン、硫酸−ｐ−メチルアミノフェノール、Ｎ，Ｎ
−ジメチル−フェニレンジアミン、アスコルピン酸、マ
ラカイトグリーンなどが挙げられる。

【００９０】光透過性水不透過性支持体を用いる場合の
乾式分析素子は、実用的に次のような構成を取り得る。
ただし、本発明の内容はこれに限定されない。 (１) 支持体上に試薬層を有するもの。 (２) 支持体上に検出層、試薬層をこの順に有するも
の。 (３) 支持体上に検出層、光反射層、試薬層をこの順に
有するもの。 (４) 支持体上に第２試薬層、光反射層、第１試薬層を
この順に有するもの。 (５) 支持体上に検出層、第２試薬層、光反射層、第１
試薬層をこの順に有するもの。

【００９１】上記（１）ないし（３）において試薬層は
異なる複数の層から成ってもよい。例えば第１試薬層に
は、式２または式３に示すピロホスファターゼ反応に必
要な酵素ピロホスファターゼ、ＰＮＰ反応に必要な基質
キサントシンまたは基質イノシンと酵素ＰＮＰを、第２
試薬層には、式２または式３に示すＸＯＤ反応に必要な
酵素ＸＯＤを、そして第３試薬層には、式２または式３
に示すＰＯＤ反応に必要な酵素ＰＯＤと発色色素（色素
前駆体）を、それぞれ含有させてもよい。あるいは試薬
層を２層として、第１試薬層ではピロホスファターゼ反
応とＰＮＰ反応を、第２試薬層ではＸＯＤ反応とＰＯＤ
反応を進行させてもよい。又は、第１試薬層ではピロホ
スファターゼ反応とＰＮＰ反応とＸＯＤ反応を、第２試
薬層でＰＯＤ反応を進行させてもよい。

【００９２】なお支持体と試薬層又は検出層との間には
吸水層を設けてもよい。また各層の間には濾過層を設け
てもよい。また試薬層の上には展開層を設けてもよく、
その間に接着層を設けてもよい。

【００９３】支持体は光不透過性（不透明）、光半透過
性（半透明）、光透過性（透明）のいずれのものも用い
ることができるが、一般的には光透過性で水不透過性の
支持体が好ましい。光透過性水不透過性支持体の材料と
して好ましいものはポリエチレンテレフタレート、ポリ
スチレンである。親水性層を強固に接着させるため通
常、下塗り層を設けるか、親水化処理を施す。

【００９４】試薬層として多孔性層を用いる場合、その
多孔性媒体は繊維質であってもよいし、非繊維質であっ
てもよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、
織物布地（例えば平織り布地）、編物布地（例えばトリ
コット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることがで
きる。非繊維質材料としては特開昭４９−５３８８８号
公報等に記載の酢酸セルロースなどからなるメンブラン
フイルター、特開昭４９−５３８８８号公報、特開昭５
５−９０８５９号公報（対応米国特許４，２５８，００
１）特開昭５８−７０１６３号公報（対応米国特許４，
４８６，５３７）等に記載の無機物又は有機物微粒子か
らなる連続空隙含有粒状構造物層等のいずれでもよい。
特開昭６１−４９５９号公報（対応欧州公開ＥＰ ０１
６６３６５Ａ）、特開昭６２−１１６２５８号公報、特
開昭６２−１３８７５６号公報（対応欧州公開ＥＰ ０
２２６４６５Ａ）、特開昭６２−１３８７５７号公報
（対応欧州公開ＥＰ ０２２６４６５Ａ）、特開昭６２
−１３８７５８号公報（対応欧州公開ＥＰ ０２２６４
６５Ａ）等に記載の部分接着された複数の多孔性層の積
層物も好適である。

【００９５】多孔性層は、供給される液体の量にほぼ比
例した面積に液体を展開する、いわゆる計量作用を有す
る展開層であってもよい。展開層としては、これらのう
ち織物布地、編物布地などが好ましい。織物布地などは
特開昭５７−６６３５９号公報に記載されたようなグロ
ー放電処理をしてもよい。展開層には、展開面積、展開
速度等を調節するため特開昭６０−２２２７７０号公報
（対応：ＥＰ ０１６２３０１Ａ）、特開昭６３−２１
９３９７号公報（対応西独特許公開ＤＥ ３７１７９１
３Ａ）、特開昭６３−１１２９９９号公報（対応：ＤＥ
３７１７９１３Ａ）、特開昭６２−１８２６５２号公
報（対応：ＤＥ ３７１７９１３Ａ）に記載したような
親水性高分子あるいは界面活性剤を含有させてもよい。

【００９６】例えば紙、布、高分子からなる多孔質膜等
に本発明の試薬を予め含浸又は塗布した後、支持体上に
設けた他の水浸透性層、例えば検出層の上に、特開昭５
５−１６４５３５６号公報のような方法で接着させるの
も有用な方法である。

【００９７】こうして作られる試薬層の厚さは特に制限
されないが、塗布層として設ける場合には、１μｍ〜５
０μｍ程度、好ましくは２μｍ〜３０μｍの範囲が適当
である。ラミネートによる積層など、塗布以外の方法に
よる場合、厚さは数十μmから数百μmの範囲で大きく変
化し得る。

【００９８】親水性ポリマーバインダーからなる水浸透
性層で試薬層を構成する場合、使用できる親水性ポリマ
ーとしては、例えば、以下のものがある。ゼラチン及び
これらの誘導体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロー
ス誘導体（例えばヒドロキシエチルセルロース）、アガ
ロース、アルギン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合
体やメタアクリルアミド共重合体（例えば、アクリルア
ミド又はメタアクリルアミドと各種ビニル性モニマーと
の共重合体）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、
ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリア
クリル酸ナトリウム、アクリル酸と各種ビニル性モノマ
ーとの共重合体などである。

【００９９】親水性ポリマーバインダーで構成される試
薬層は、特公昭５３−２１６７７号公報（対応米国特許
３，９９２，１５８）、特開昭５５−１６４３５６号公
報（対応米国特許４，２９２，２７２）、特開昭５４−
１０１３９８号公報（対応米国特許４，１３２，５２
８）等の明細書に記載の方法に従って本発明の試薬組成
物と親水性ポリマーを含む水溶液又は水分散液を支持体
又は検出層等の他の層の上に塗布し乾燥することにより
設けることができる。親水性ポリマーをバインダーとす
る試薬層の乾燥時の厚さは約２μｍ〜約５０μｍ、好ま
しくは約４μｍ〜約３０μｍの範囲、被覆量では約２ｇ
／ｍ²〜約５０ｇ／ｍ²、好ましくは約４ｇ／ｍ²〜約３
０ｇ／ｍ²の範囲である。

【０１００】試薬層には式２または式３の試薬組成物の
他に、塗布特性、拡散性化合物の拡散性、反応性、保存
性等の諸性能の向上を目的として、酵素の活性化剤、補
酵素、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤組成物、微粉末、酸化防
止剤、その他、有機物あるいは無機物からなる各種添加
剤を加える事ができる。試薬層に含有させることができ
る緩衝剤はの例としては、日本化学学会編「化学便覧
基礎」（丸善(株)、１９６６年発行）１３１２−１３２
０頁、Ｒ．Ｍ．Ｃ．Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ編、「Ｄａ
ｔａ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ」第２版（Ｏｘｆｏｒｄ ａｔ ｔｈｅ Ｃｌａｒｅｎ
ｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９６９年発行）４７６−５０８
頁、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」５，４６７−４７７
頁（１９６６年）、「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ」１０４，３００−３１０頁（１９８
０年）に記載のｐＨ緩衝剤系がある。ｐＨ緩衝剤系の具
体例として硼酸塩を含む緩衝剤；クエン酸又はクエン酸
塩を含む緩衝剤；グリシンを含む緩衝剤；ビシン（Ｂｉ
ｃｉｎｅ）を含む緩衝剤；ＨＥＰＥＳを含む緩衝剤；Ｍ
ＥＳを含む緩衝剤などのグッド緩衝剤等がある。なお燐
酸塩を含む緩衝剤は、ピロ燐酸検出用乾式分析素子に使
用することはできない。

【０１０１】本発明で使用することのできる、ピロ燐酸
定量用乾式分析素子は前述の諸特許明細書に記載の公知
の方法により調製することができる。ピロ燐酸定量用乾
式分析素子は一辺約５ｍｍから約３０ｍｍの正方形また
はほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭５７−
２８３３３１号公報（対応米国特許４，１６９，７５
１）、実開昭５６−１４２４５４号公報（対応米国特許
４，３８７，９９０）、特開昭５７−６３４５２号公
報、実開昭５８−３２３５０号公報、特表昭５８−５０
１１４４号公報（対応国際公:ＷＯ０８３／００３９
１）等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドと
して用いることが製造，包装，輸送，保存，測定操作等
の観点で好ましい。使用目的によっては、長いテープ状
でカセットまたはマガジンに収めて用いたり、又は小片
を開口のある容器内に収めて用いたり、又は小片を開口
カードに貼付または収めて用いたり、あるいは裁断した
小片をそのまま用いることなどもできる。

【０１０２】本発明で使用することのできるピロ燐酸定
量用乾式分析素子は前述の諸特許明細書等に記載の操作
と同様の操作により液体試料中の被検物であるピロ燐酸
の定量検出ができる。例えば約２μＬ〜約３０μＬ、好
ましくは４μＬ〜１５μＬの範囲の水性液体試料液を試
薬層に点着する。点着した分析素子を約２０℃〜約４５
℃の範囲の一定温度で、好ましくは約３０℃〜約４０℃
の範囲内の一定温度で１〜１０分間インキュベーション
する。分析素子内の発色又は変色を光透過性支持体側か
ら反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法
の原理により検体中のピロ燐酸の量を求めることができ
る。点着する液体試料の量、インキュベーション時間及
び温度を一定にすることにより定量分析を高精度に実施
できる。

【０１０３】測定操作は特開昭６０−１２５５４３号公
報、特開昭６０−２２０８６２号公報、特開昭６１−２
９４３６７号公報、特開昭５８−１６１８６７号公報
（対応米国特許４，４２４，１９１）などに記載の化学
分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を
実施できる。なお、目的や必要精度によっては目視によ
り発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行っても
よい。

【０１０４】本発明で使用することのできる、ピロ燐酸
定量乾式分析素子においては、分析を行うまでは乾燥状
態で貯蔵・保管されるため、試薬を用時調製する必要が
なく、また一般に乾燥状態の方が試薬の安定性が高いこ
とから、試薬溶液を用時調製しなければならないいわゆ
る湿式法より簡便性、迅速性に優れている。また、微量
の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行うことができ
る検査方法としても優れている。

【０１０５】本発明の第二の形態において使用すること
のできる無機燐定量用乾式分析素子は、前記のピロ燐酸
定量乾式分析素子における試薬層からピロホスファター
ゼを除くことで調製することができる。また、特開平７
−１９７号公報に記載の乾式分析素子を使用することも
可能である。無機燐定量用乾式分析素子は、試薬層にピ
ロホスファターゼを含有しない以外は、その層構成、製
造方法、使用方法において、前記ピロ燐酸定量乾式分析
素子と同様である。

【０１０６】(Ｈ) キット：本発明のターゲット核酸の
分析は、分析するターゲット核酸断片の一部と相補的な
少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種のデオキ
シヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）、少なくとも一種
のポリメラーゼ、及びピロ燐酸定量用乾式分析素子の各
要素を含むキットを用いて実施することができる。

【０１０７】キットの形態は、少なくとも一部の塩基配
列が既知であるターゲット核酸断片を含む液体を供給す
ることのできる開口部、ターゲット核酸断片の一部と相
補的な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種の
デオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）、及び少な
くとも一種のポリメラーゼを保持することのできる少な
くとも一つの反応セル部、ピロ燐酸定量用乾式分析素子
を保持することのできる検出部、及びそれら前記開口
部、反応セル部、検出部の間を連結し、液体を移動させ
ることのできる細管または溝を備えているカートリジで
あってもよい。

【０１０８】このようなカートリッジとしては、米国特
許５，９１９，７１１に記載されているカートリッジ等
を利用することが可能である。図４には、本発明におけ
るカートリッジ形態のキットの一例を示した。キット１
０において、開口部３１からターゲット核酸を含有する
試料液を供給することができる。開口部３１は細管４１
によって、反応セル３２と連結されている。反応セル３
２には、予めターゲット核酸断片の一部と相補的な少な
くとも一種のプライマー８１、少なくとも一種のデオキ
シヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）８２、及び少なく
とも一種のポリメラーゼ８３が保持されている。さら
に、反応セル３２は細管４２によって検出部３３と連結
されている。検出部３３には予め乾式分析素子５１が保
持されている。反応セル３２でポリメラーゼ伸長反応が
進行した試料液は、細管４２を移動して、検出部３３の
ピロ燐酸定量用乾式分析素子５１上に供給され、ポリメ
ラーゼ伸長反応により生成したピロ燐酸を検出する。上
記キット１０において、開口部３１と反応セル３２の
間、及び反応セル３２と検出部３３の間の液体の移動
は、遠心力、電気泳動または電気浸透などを用いること
が可能である。また、反応セル３２、細管４１及び４
２、検出部３３は、基体２１と蓋２２によって密封され
ていることが望ましい。

【０１０９】図４に示したようなカートリッジ形態のキ
ット１０を使用する場合、図５に示したように、反応セ
ル３２および検出部３３の温度コントロール部６１及び
６２と、ピロ燐酸定量用乾式分析素子５１内の発色また
は色変化を反射光により検出することのできる検出部７
１及び７２を備えている装置を合わせて使用することが
望ましい。

【０１１０】本発明で使用することのできるカートリッ
ジ形態のキットは、図４に示されているものに限らな
い。ポリメラーゼ伸長反応に必要な試薬はそれぞれ別の
スペースに保持されていても良い。その場合は、反応時
にそれぞれの試薬が反応セルに移動してくるようにすれ
ば良い。また、反応セルは複数であっても良い。

【０１１１】ポリメラーゼ伸長反応で生成したピロ燐酸
の検出を、ピロ燐酸を酵素的に無機燐に変換した後に無
機燐定量用乾式分析素子を用いて行う場合には、第一の
反応セルには、予めターゲット核酸断片の一部と相補的
な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種のデオ
キシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）、及び少なくと
も一種のポリメラーゼを保持しておき、第一の反応セル
においてポリメラーゼ伸長反応を行い、次いで、第一の
反応セルと細管で連結されていて、予めピロホスファタ
ーゼが保持されている第二の反応セルに第一の反応セル
での反応液を移動させ、第一の反応セルにおけるポリメ
ラーゼ伸長反応で生成したピロ燐酸を第二反応セルにお
いて無機燐に変換し、次いで第二の反応セルでの反応液
を、第二の反応セルに細管で連結されていて、予め無機
燐定量用乾式分析素子が保持されている検出部に移動さ
せ、無機燐を検出することも可能である。

【０１１２】また、１つのカートリッジ上に「開口部−
細管−反応セル−細管−検出部」の組を平行に並べて、
または同心円の半径方向に並べて、複数組設置すること
も可能である。この場合、例えば反応セルに保持するタ
ーゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプ
ライマーの塩基配列を、ターゲットとする核酸の種類に
応じて変更することで、同時に複数種のターゲット核酸
を検出することが可能なキットを提供できる。

【０１１３】（４）本発明の分析装置 さらに本発明は、上記した核酸の分析方法を行うための
分析装置を提供する。該分析装置は、（１）本明細書中
上記した核酸分離精製ユニットを含む核酸の抽出・精製
を行うための手段と、（２）ポリメラーゼ伸長反応を行
うための反応手段と、（３）ポリメラーゼ伸長反応の進
行の有無を検出するか、又はポリメラーゼ伸長反応産物
と他の核酸とのハイブリダイゼーションの有無を検出す
るための手段とから構成される。

【０１１４】核酸の抽出・精製を行うための手段は、本
明細書中上記した核酸分離精製ユニットから構成され、
その他に、検体の液体をセットするスペース、核酸分離
精製ユニットをセットするスペース、検体を一定温度
（例えば、３７℃）にインキュベートする手段、検体液
又は処理液を吸引および排出するための手段などを備え
ることができる。

【０１１５】ポリメラーゼ伸長反応を行うための反応手
段としては、ＰＣＲなどの核酸合成反応を行うことがで
きる手段であり、一般的には、反応を行うための反応容
器と、反応に必要な試薬を該反応容器中に添加する分注
手段とから構成される。それ以外に、反応容器内の温度
を調節するための温度調節手段（サーマルサイクラー又
はインキュベーターなど）を備えることができる。分注
手段により、核酸分離精製ユニットにより精製されたタ
ーゲット核酸断片を含む核酸断片、前記ターゲット核酸
断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少
なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸、及び少
なくとも一種のポリメラーゼは反応容器中に添加され、
前記ターゲット核酸断片を鋳型にした前記プライマーの
３’末端を起点とするポリメラーゼ伸長反応が行われ
る。

【０１１６】ポリメラーゼ伸長反応の進行の有無を検出
する手段としては、本明細書中上記したようなピロ燐酸
定量用乾式分析素子または無機燐定量用乾式分析素子を
使用することができる。その他、上記の乾式分析素子を
一定温度にインキュベートする手段、及び乾式分析素子
の発色を測定する反射測光装置を備えることができる。
また、ポリメラーゼ伸長反応産物と他の核酸とのハイブ
リダイゼーションの有無を検出するための手段として
は、ハイブリダイゼーションの有無の検出に用いられる
通常の手段を使用することができる。本発明の分析装置
（特に、ピロ燐酸定量用分析素子を用いる場合）は、分
離精製された核酸水溶液（の一部）をそのまま用いて次
工程のポリメラーゼ伸長反応を実施でき、またポリメラ
ーゼ伸長反応後の反応溶液（の一部）をそのまま用い
て、次工程のピロ燐酸定量用分析素子による検出を実施
できる（即ち、ポリメラーゼ伸長反応後の反応溶液をそ
のまま、ピロ燐酸定量用分析素子に点着できる）という
特徴を有することから、システムの自動化に非常に好適
である。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【０１１７】

【実施例】実施例１ （１）核酸分離精製ユニット用容器の作成 内径７ｍｍ、厚さ２ｍｍの核酸吸着用の固相を収容する
部分を持つ、核酸分離精製ユニット用容器を、ハイイン
パクトポリスチレンで作成した。 （２）核酸精製用固相及び核酸分離精製ユニットの作成 表１に示した核酸精製用固相及び比較用固相を作成し
た。表面鹸化するためには、０．０２Ｎ〜２Ｎの水酸化
ナトリウム水溶液中に表面鹸化したい対象を２０分間浸
漬した。水酸化ナトリウムの濃度に応じて、表面鹸化率
が変わる。これらの固相を表１に示した量だけ、核酸分
離精製ユニット用容器の固相収容部に収容して、核酸分
離精製ユニットを作成した。

【０１１８】

【表１】

【０１１９】（３）核酸吸着バッファ溶液及び洗浄バッ
ファ溶液の調製 表２に示す処方の核酸吸着バッファ溶液及び洗浄バッフ
ァ溶液を調製した。

【０１２０】

【表２】

【０１２１】（４）核酸精製操作 ヒト全血２００μｌを真空採血管を用いて採血した。こ
れに、表２に示した処方の核酸吸着バッファ溶液２００
μｌとプロテアーゼＫ２０μｌ添加して、６０℃で１０
分間インキュベートした。インキュベート後、エタノー
ル２００μｌを添加して攪拌した。攪拌後、上記の様に
処理した全血試料中に、（１）で作成した核酸分離精製
ユニットの一の開口に接続した使い捨てのピペットチッ
プの先端を挿入し、核酸分離精製ユニットの他の一の開
口に接続した注射器を用いて、液を吸入し次いで排出し
た。

【０１２２】排出後直ちに、核酸洗浄バッファ溶液１ｍ
ｌ中にピペットチップの先端を挿入し、液を吸引し次い
で排出して、核酸分離精製ユニットの内部を洗浄した。
洗浄後、２００μｌの精製蒸留水中にピペットチップの
先端を挿入し、蒸留水を吸引し次いで排出して、この排
出液を回収した。

【０１２３】（５）核酸の回収量の定量及び純度の決定 上記回収した排出液の吸光度を測定して、核酸の回収量
及び純度を定量した。回収量は波長２６０ｎｍの光吸収
測定により定量され、また、核酸の純度は２６０ｎｍ及
び２８０ｎｍでの光吸収の比率により決定され、この比
率が１．８以上であれば純度は良好であると判断され
る。結果を表３に示す。この結果から、表面鹸化率が５
％以上のときにＤＮＡの回収量が良好であり、かつ純度
も高いことが判る。

【０１２４】

【表３】

【０１２５】実施例２：表面鹸化率１００％のトリアセ
チルセルロース多孔膜を用いた全血試料からの核酸の精
製 核酸吸着固相として表面鹸化率１００％のトリアセチル
セルロース多孔膜（富士写真フイルム製）（実施例１の
固相Ｅ）を使用して、実施例１と同様にして、全血試料
から核酸を精製した。精製前の全血試料（５倍希釈して
ＯＤを測定）および精製後ＯＤを測定した。結果を図６
に示す。図６の結果から、本発明の分離精製方法により
核酸以外の成分が完全に除去されていることが分かる。

【０１２６】実施例３：核酸の増幅 実施例２にて精製された核酸を使用し、ポリメラーゼ連
鎖反応による核酸の増幅を実施した。ポジティブコント
ロールとして、クロンテック社製のHuman DNAを使用し
た。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の反応液は、精製
水（３６．５μｌ）、１０×ＰＣＲバッファー（５μ
ｌ）、２．５ｍＭのｄＮＴＰ（４μｌ）、Ｔａｑ ＦＰ
（０．５μｌ）、プライマー（２μｌ）、サンプル（核
酸）２μｌ。ＰＣＲは、９４℃で３０秒の変性、６５℃
で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１分の伸長反応
を１サイクルとし、これを３０サイクル繰り返した。以
下のプライマーを使用した。

【０１２７】１）ｐ５３エクソン６ フォワード：ＧＣＧＣＴＧＣＴＣＡ ＧＡＴＡＧＣＧＡ
ＴＧ リバース ：ＧＧＡＧＧＧＣＣＡＣ ＴＧＡＣＡＡＣＣ
Ａ

【０１２８】２）ｐ５３エクソン１０ フォワード：ＧＡＴＣＣＧＴＣＡＴ ＡＡＡＧＴＣＡＡ
ＡＣ（配列番号１） リバース ：ＧＧＡＴＧＡＧＡＡＴ ＧＧＡＡＴＣＣＴ
ＡＴ（配列番号２）

【０１２９】３）ＡＢＯ型遺伝子エクソン６ フォワード：ＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡ ＴＧＴＧＧＧＴＧ
ＧＣ ＡＣＣＣＴＧＣＣＡ（配列番号３） リバース ：ＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡ ＣＴＣＧＣＣＡＣ
ＴＧ ＣＣＴＧＧＧＴＣＴＣ（配列番号４）

【０１３０】４）ＡＢＯ型遺伝子エクソン７ フォワード：ＧＴＧＧＣＴＴＴＣＣ ＴＧＡＡＧＣＴＧ
ＴＴ Ｃ（配列番号５） リバース ：ＧＡＴＧＣＣＧＴＴＧ ＧＣＣＴＧＧＴＣ
ＧＡ Ｃ（配列番号６）

【０１３１】ＰＣＲの反応産物を電気泳動した結果を図
７に示す。インビトロジェンの１００ｂｐのマーカーを
使用した。図７の結果から、本発明の方法で分離精製し
た核酸を使用したＰＣＲにより所望の核酸を増幅できる
ことが確認できた。

【０１３２】実施例４：核酸抽出−増幅（ＰＣＲ）−検
出（ピロ燐酸定量用乾式分析素子）によるヒト全血中の
緑膿菌の検出 (緑膿菌性敗血症の検査をモデルにした
実験) (１) 緑膿菌を添加したヒト全血の調製 ＬＢ培地(Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ ｍｅｄｉｕｍ)
で一晩培養した緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｅｍｏｎａｓ Ｓｙ
ｒｉｎｇａｅ）の培養液を元に、ＰＢＳによる希釈で濃
度を変化させた溶液を、ＥＤＴＡ採血したヒト全血に添
加することで、１ｍＬ当りそれぞれ、０、５×１０⁵、
５×１０⁶、２．５×１０⁶、５×１０⁷、１×１０⁸ の
菌体個数を含む６水準のヒト全血を調製した。ここで、
菌体個数は分光光度計を用いて見積もった値である。

【０１３３】（２）ピロ燐酸定量用乾式分析素子の作製 ゼラチン下塗層が設けられている厚さ１８０μmの無色
透明ポリエチレンテレフタレ−ト（ＰＥＴ）平滑フイル
ムシ−ト（支持体）上に表４記載の組成（ａ）の水溶液
を、以下の被覆率となるように塗布し、乾燥して試薬層
を設けた。

【０１３４】

【表４】

【０１３５】この試薬層の上に下記の表５記載の組成
（ｂ）の接着層水溶液を以下の被覆率となるように塗布
し、乾燥して接着層を設けた。

【０１３６】

【表５】

【０１３７】次いで接着層の上に３０ｇ／ｍ²の割合で
水を全面に供給してゼラチン層を膨潤させ、その上に純
ポリエステル製のブロ−ド織物布地をほぼ一様に軽く圧
力をかけてラミネ−トして多孔性展開層を設けた。

【０１３８】次にこの展開層の上から下記の表６記載の
組成（ｃ）の水溶液を以下の被覆率となるようにほぼ均
一塗布し、乾燥させ、１３ｍｍ×１４ｍｍに裁断し、プ
ラスチック製マウント材内に収めることで、ピロ燐酸定
量用乾式分析素子を作成した。

【０１３９】

【表６】

【０１４０】(３）ヒト全血からの核酸の抽出、精製 上記（１）で調製した緑膿菌を添加し調製した６水準の
ヒト全血を試料とし、そのそれぞれから、実施例２に記
載の方法と同様の方法で核酸を抽出・精製することで、
核酸水溶液を得た。６水準のヒト全血から得られた核酸
量（分光光度計を用いて見積もった量）は２０〜３０ｎ
ｇ／μｌであった。得られた核酸水溶液はヒトのゲノム
核酸と添加した緑膿菌のゲノム核酸の混合水溶液であ
り、大部分はヒトのゲノム核酸が占めている。

【０１４１】(４)ＰＣＲ増幅 上記（３）で、６水準のヒト全血試料から抽出・精製し
て得た核酸水溶液をそのまま用いて、以下の条件でＰＣ
Ｒ増幅を行った。

【０１４２】＜プライマ−＞緑膿菌のゲノム核酸に特異
的(ｉｃｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ(Ｉ
ｎａｋ)Ｎ末)な配列を持つ以下のプライマ−セットを使
用した。 プライマ−(upper)；５'-ＧＣＧＡＴＧＣＴＧＴＡＡＴ
ＧＡＣＴＣＴＣＧＡＣＡＡＧＣ-３'（配列番号７） プライマ−(lower)；５'-ＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡＴＴＣ
ＴＧＣＧＧＣＧＴＣＧＴＣ-３'（配列番号８）

【０１４３】以下に示す反応液の組成で、［変性：９４
℃・１分、アニ−リング：５５℃・１分、ポリメラ−ゼ
伸長反応：７２℃・１分］を３０サイクル繰り返するこ
とでＰＣＲ増幅を実施した。

【０１４４】 ＜反応液の組成＞ １０×ＰＣＲバッファ− ５μＬ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ４μＬ ２０μＭ プライマ−(ｕｐｐｅｒ) １μＬ ２０μＭ プライマ−(ｌｏｗｅｒ) １μＬ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ０．２５μＬ （３）で得た核酸試料液 ５μＬ 精製水 ３３．７５μＬ

【０１４５】(５)ピロ燐酸定量用分析素子を用いた検出 前記（４）におけるＰＣＲ増幅反応後の溶液をそのま
ま、上記（２）で製作したピロ燐酸定量用乾式分析素子
上に各々２０μＬ点着し、ピロ燐酸定量用乾式分析素子
を３７℃にて５分間インキュベ−ション後、波長６５０
ｎｍにて支持体側から測定して得られた反射光学濃度
（ＯＤ_R）を図８および図９に示した。

【０１４６】実施例４の結果より、緑膿菌を含むヒト全
血より、本発明の核酸の分離精製方法に従って得たター
ゲット核酸断片を含む核酸試料液を、緑膿菌のゲノム核
酸に特異的な配列を持つプライマーセットを使用しＰＣ
Ｒを行い、そのＰＣＲ増幅反応後の溶液をそのまま用い
て、生成したピロ燐酸を、ピロ燐酸定量用乾式分析素子
を用いて反射光学濃度（ＯＤ_R）として測定すること
で、ヒト全血中に存在する緑膿菌の量に応じた反射光学
濃度（ＯＤ_R）が得られることがわかる。

【０１４７】

【発明の効果】分離性能に優れ、洗浄効率が良く、加工
が容易であり、実質的に同一の分離性能を有する物を大
量に生産可能である固相を用いた、本発明の核酸の分離
精製方法により、核酸を含む試料溶液から純度の高い核
酸を分離することができる。更に本発明の核酸分離精製
ユニットを使用すれば、操作が容易となる。

【０１４８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Fuji Photo Film Co.Ltd., <120> A method for the separation and purification of nucleic acid and a n unit for the purification of nucleic acid <130> A21274A <160> 8

【０１４９】 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 1 gatccgtcat aaagtcaaac 20

【０１５０】 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 2 ggatgagaat ggaatcctat 20

【０１５１】 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 3 cacctgcaga tgtgggtggc accctgcca 29

【０１５２】 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 4 gtggaattca ctcgccactg cctgggtctc 30

【０１５３】 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 5 gtggctttcc tgaagctgtt c 21

【０１５４】 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 6 gatgccgttg gcctggtcga c 21

【０１５５】 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 7 gcgatgctgt aatgactctc gacaagc 27

【０１５６】 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 8 ggtctgcaaa ttctgcggcg tcgtc 25

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の核酸分離精製ユニットの概念
図である。

【図２】図２は、本発明の核酸分離精製ユニットの一例
である。但し、開口２１に結合されるべき圧力差発生装
置は図示していない。図２において、１は容器、１０は
本体、１０１は開口、１０２は底面、１０３は枠、１０
４は壁、１０５は段差、１２１は空間、１２２は空間、
１２３は空間、１３は押さえ部材、１３１は穴、１３２
は突起、２０は蓋、２１は開口、３０は固相を示す。

【図３】図３は、本発明の核酸の分析を説明する概念図
である。

【図４】図４は、本発明で使用できるカートリッジ形態
でのキットの例を示す斜視図である。図４において、１
０はキット、２１は基体、２２は蓋、３１は開口部、３
２は反応セル、３３は検出部、４１及び４２は細管、５
１は乾式分析素子、８１はプライマー、８２はデオキシ
ヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）、８３はポリメラー
ゼを示す。

【図５】図５は、本発明のカートリッジ形態でのキット
を使用する場合のシステム構成を示す斜視図である。図
５において、１０はキット、３２は反応セル、３３は検
出部、６１は温度コントロール部、６２は温度コントロ
ール部、７１は検出部、７２は検出部を示す。

【図６】図６は、表面鹸化率１００％のトリアセチルセ
ルロース多孔膜を用いた全血試料からの核酸の精製の結
果を示す図である。

【図７】図７は、本発明の方法に従って分離精製した核
酸を用いたＰＣＲ反応産物を電気泳動した結果を示す。

【図８】図８は、添加した緑膿菌個数と反射光学濃度
（ＯＤ_R）の関係を示す。

【図９】図９は、添加した緑膿菌個数と反射光学濃度
（ＯＤ_R）の関係を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/26 ４Ｃ０５７ Ｃ１２Ｑ 1/26 1/28 1/28 1/48 Ｚ 1/48 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ａ Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｚ 30/26 Ａ 30/26 30/48 Ｔ 30/48 30/88 Ｅ 30/88 33/52 Ａ 33/52 Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 牧野 快彦 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 BA13 BB02 BB03 BB20 BB29 BB51 CA25 CA26 CB01 CB03 CB04 CB07 CB14 CB21 DA12 DA13 DA14 FA18 FA29 FB01 FB02 FB06 FB11 FB17 GC10 GC11 2G054 AA06 AA07 AA08 BB04 BB13 CA20 CA22 CE02 EA04 EA05 EB02 GA03 GB01 GB04 GE06 4B024 AA11 CA01 CA05 HA14 4B029 AA07 BB20 CC11 FA01 FA15 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QQ89 QR02 QR03 QR06 QR08 QR32 QR62 QR84 QS25 QS34 QX01 QX02 4C057 AA10 BB02 BB05 DD01 MM02 MM04 MM08

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 表面に水酸基を有する有機高分子から成
   る固相に核酸を吸着及び脱着させる工程を含む、核酸の
   分離精製方法。
2. 【請求項２】 表面に水酸基を有する有機高分子がアセ
   チルセルロースの表面鹸化物である、請求項１に記載の
   核酸の分離精製方法。
3. 【請求項３】 表面に水酸基を有する有機高分子がトリ
   アセチルセルロースの表面鹸化物である、請求項１また
   は２に記載の核酸の分離精製方法。
4. 【請求項４】 アセチルセルロースの表面鹸化率が５％
   以上である、請求項２または３に記載の核酸の分離精製
   方法。
5. 【請求項５】 アセチルセルロースの表面鹸化率が１０
   ％以上である、請求項２または３に記載の核酸の分離精
   製方法。
6. 【請求項６】 アセチルセルロースが多孔膜である、請
   求項２から５の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
7. 【請求項７】 アセチルセルロースが非孔性膜である、
   請求項２から５の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
8. 【請求項８】 アセチルセルロースがビーズにコーティ
   ングされている、請求項２から７の何れかに記載の核酸
   の分離精製方法。
9. 【請求項９】 表面に水酸基を有する有機高分子から成
   る固相に、試料溶液中の核酸を吸着及び脱着させる、請
   求項１から８の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
10. 【請求項１０】 試料溶液が、細胞又はウイルスを含む
    検体を核酸可溶化試薬で処理して得られた溶液に水溶性
    有機溶媒を添加した溶液である、請求項９に記載の核酸
    の分離精製方法。
11. 【請求項１１】 核酸可溶化試薬が、グアニジン塩、界
    面活性剤およびタンパク質分解酵素である、請求項１０
    に記載の核酸の分離精製方法。
12. 【請求項１２】 表面に水酸基を有する有機高分子から
    成る固相に核酸を吸着させた後、核酸洗浄バッファを用
    いて固相を洗浄し、次いで固相に吸着した核酸を脱着せ
    しめうる液を用いて固相に吸着した核酸を脱着させる工
    程を含む、請求項１から１１の何れかに記載の核酸の分
    離精製方法。
13. 【請求項１３】 核酸洗浄バッファが、メタノール、エ
    タノール、イソプロパノール又はｎ−プロパノールを２
    ０〜１００重量％含む溶液である、請求項１２に記載の
    核酸の分離精製方法。
14. 【請求項１４】 固相に吸着した核酸を脱着せしめうる
    液が、塩濃度が０．５Ｍ以下の溶液である、請求項１２
    または１３に記載の核酸の分離精製方法。
15. 【請求項１５】 少なくとも２個の開口を有する容器内
    に表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相を収容
    した核酸分離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着
    を行う、請求項１から１４の何れかに記載の核酸の分離
    精製方法。
16. 【請求項１６】 (ａ) 表面に水酸基を有する有機高分
    子から成る固相、(ｂ) 前記固相を収容する、少なくと
    も２個の開口を有する容器、及び(ｃ) 前記容器の一の
    開口に結合された圧力差発生装置を含む核酸分離精製ユ
    ニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行う、請求項１か
    ら１５の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
17. 【請求項１７】 以下の工程を含む、請求項１６に記載
    の核酸の分離精製方法。 (ａ) 検体を用いて核酸を含む試料溶液を調製し、核酸
    分離精製ユニットの一の開口を上記の核酸を含む試料溶
    液中に挿入する工程、 (ｂ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧
    力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして核酸を含
    む試料溶液を吸引し、表面に水酸基を有する有機高分子
    から成る固相に接触させる工程、 (ｃ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧
    力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、吸引され
    た核酸を含む試料溶液を容器外に排出する工程、 (ｄ) 核酸分離精製ユニットの一の開口を核酸洗浄バッ
    ファ中に挿入する工程、 (ｅ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧
    力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして核酸洗浄
    バッファを吸引し、表面に水酸基を有する有機高分子か
    ら成る固相に接触させる工程、 (ｆ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧
    力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、吸引され
    た核酸洗浄バッファを容器外に排出する工程、 (ｇ) 核酸分離精製ユニットの一の開口を、表面に水酸
    基を有する有機高分子から成る固相に吸着された核酸を
    脱着せしめうる液中に挿入する工程、 (ｈ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧
    力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして、表面に
    水酸基を有する有機高分子から成る固相に吸着された核
    酸を脱着せしめうる液を吸引し、固相に接触させる工
    程、及び (ｉ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧
    力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、表面に水
    酸基を有する有機高分子から成る固相に吸着された核酸
    を脱着せしめうる液を容器外に排出する工程。
18. 【請求項１８】 以下の工程を含む、請求項１６に記載
    の核酸の分離精製方法。 (ａ) 検体を用いて核酸を含む試料溶液を調製し、核酸
    分離精製ユニットの一の開口に上記の核酸を含む試料溶
    液を注入する工程、 (ｂ) 核酸分離精製ユニットの上記一の開口に結合され
    た圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入
    した核酸を含む試料溶液を、他の開口より排出すること
    によって、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固
    相に接触させる工程、 (ｃ) 核酸分離精製ユニットの上記一の開口に核酸洗浄
    バッファを注入する工程、 (ｄ) 核酸分離精製ユニットの上記一の開口に結合され
    た圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入
    した核酸洗浄バッファを上記他の開口より排出すること
    によって、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固
    相に接触させる工程、 (ｅ) 核酸分離精製ユニットの上記一の開口に表面に水
    酸基を有する有機高分子から成る固相に吸着された核酸
    を脱着せしめうる液を注入する工程、 (ｆ) 核酸分離精製ユニットの上記一の開口に結合され
    た圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入
    した核酸を脱着せしめうる液を上記他の開口より排出さ
    せることによって、表面に水酸基を有する有機高分子か
    ら成る固相に吸着された核酸を脱着させ、容器外に排出
    する工程。
19. 【請求項１９】 少なくとも２個の開口を有する容器内
    に表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相を収容
    した核酸分離精製ユニット。
20. 【請求項２０】 (ａ) 表面に水酸基を有する有機高分
    子から成る固相、 (ｂ) 前記固相を収容する、少なくとも２個の開口を有
    する容器、及び (ｃ) 前記容器の一の開口に結合された、圧力差発生装
    置、を含む核酸分離精製ユニット。
21. 【請求項２１】 前記圧力差発生装置が、前記容器の一
    の開口に着脱可能に結合されている、請求項２０に記載
    の核酸分離精製ユニット。
22. 【請求項２２】 前記圧力差発生装置が注射器である請
    求項２０に記載の核酸分離精製ユニット。
23. 【請求項２３】 前記圧力差発生装置がピペッタである
    請求項２０に記載の核酸分離精製ユニット。
24. 【請求項２４】 前記圧力差発生装置がポンプである請
    求項２０に記載の核酸分離精製ユニット。
25. 【請求項２５】 ビーズにアセチルセルロースをコーテ
    ィングした後表面鹸化する、アセチルセルロースに水酸
    基を導入する方法。
26. 【請求項２６】 表面鹸化により水酸基が導入されたア
    セチルセルロース膜を表面に有するビーズ。
27. 【請求項２７】 （１）請求項１から１８の何れかに記
    載の方法によりターゲット核酸断片を含む核酸断片を分
    離精製する工程； （２）前記ターゲット核酸断片、前記ターゲット核酸断
    片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少な
    くとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸、及び少な
    くとも一種のポリメラーゼを反応させ、前記ターゲット
    核酸断片を鋳型にした前記プライマーの３’末端を起点
    とするポリメラーゼ伸長反応を行う工程；及び、 （３）ポリメラーゼ伸長反応の進行の有無を検出する
    か、又はポリメラーゼ伸長反応産物と他の核酸とのハイ
    ブリダイゼーションの有無を検出する工程：を含む、核
    酸の分析方法。
28. 【請求項２８】 ポリメラーゼ伸長反応に伴って生成す
    るピロ燐酸を検出することによりポリメラーゼ伸長反応
    の進行の有無を検出する、請求項２７に記載の核酸の分
    析方法。
29. 【請求項２９】 比色法を用いてピロ燐酸の検出を行
    う、請求項２８に記載の核酸の分析方法。
30. 【請求項３０】 乾式分析素子を用いてピロ燐酸の検出
    を行う、請求項２８または２９に記載の核酸の分析方
    法。
31. 【請求項３１】 乾式分析素子が、ピロ燐酸を無機燐に
    変換する試薬、および無機燐の量に応じた発色反応を行
    う試薬群を含有する試薬層を備えるピロ燐酸定量用乾式
    分析素子である、請求項３０に記載の核酸の分析方法。
32. 【請求項３２】 乾式分析素子が、キサントシンまたは
    イノシン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレオシドホ
    スホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダ
    ーゼ及び発色剤を含有する試薬層を備えるピロ燐酸定量
    用乾式分析素子である、請求項３１に記載の核酸の分析
    方法。
33. 【請求項３３】 ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ
    Ｉ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｂｓｔ Ｄ
    ＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素（リバーストランス
    クリプターゼ）からなるグループから選択される、請求
    項２７から３２のいずれかに記載の核酸の分析方法。
34. 【請求項３４】 ピロ燐酸の検出を、ピロ燐酸を酵素的
    に無機燐に変換した後、次いでキサントシンまたはイノ
    シン、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチン
    オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び発色剤を含有する
    試薬層を備える無機燐定量用乾式分析素子を用いて行
    う、請求項２８又は２９に記載の核酸の分析方法。
35. 【請求項３５】 ピロ燐酸を無機燐に変換する酵素が、
    ピロホスファターゼである、請求項３４に記載の核酸の
    分析方法。
36. 【請求項３６】 ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ
    Ｉ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｂｓｔ Ｄ
    ＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素（リバーストランス
    クリプターゼ）からなるグループから選択される、請求
    項３４又は３５に記載の核酸の分析方法。
37. 【請求項３７】 核酸の分析が、ターゲット核酸断片の
    存在または存在量の検出あるいはターゲット核酸断片の
    塩基配列の検出である、請求項２７から３６の何れかに
    記載の核酸の分析方法。
38. 【請求項３８】 ターゲット核酸断片の塩基配列の検出
    が、ターゲット核酸断片の変異または多型の検出であ
    る、請求項３７に記載の核酸の分析方法。
39. 【請求項３９】 （１）請求項１２から１７の何れかに
    記載の核酸分離精製ユニットを含む核酸の抽出・精製を
    行うための手段、（２）ポリメラーゼ伸長反応を行うた
    めの反応手段、および（３）ポリメラーゼ伸長反応の進
    行の有無を検出するか、又はポリメラーゼ伸長反応産物
    と他の核酸とのハイブリダイゼーションの有無を検出す
    るための手段、を含む請求項２７から３８の何れかに記
    載の核酸の分析方法を行うための分析装置。