JP5022794B2 - 核酸抽出方法及び核酸抽出装置 - Google Patents
核酸抽出方法及び核酸抽出装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5022794B2 JP5022794B2 JP2007176325A JP2007176325A JP5022794B2 JP 5022794 B2 JP5022794 B2 JP 5022794B2 JP 2007176325 A JP2007176325 A JP 2007176325A JP 2007176325 A JP2007176325 A JP 2007176325A JP 5022794 B2 JP5022794 B2 JP 5022794B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- extraction column
- extraction
- remains
- eluate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims description 249
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 193
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 193
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 193
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 173
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 68
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 49
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 37
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 31
- 238000007599 discharging Methods 0.000 claims description 26
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 18
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 description 35
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SMEGJBVQLJJKKX-HOTMZDKISA-N [(2R,3S,4S,5R,6R)-5-acetyloxy-3,4,6-trihydroxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H]([C@H]([C@@H](O1)O)OC(=O)C)O)O SMEGJBVQLJJKKX-HOTMZDKISA-N 0.000 description 3
- 229940081735 acetylcellulose Drugs 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- DTPCFIHYWYONMD-UHFFFAOYSA-N decaethylene glycol Polymers OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO DTPCFIHYWYONMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- ZPIRTVJRHUMMOI-UHFFFAOYSA-N octoxybenzene Chemical compound CCCCCCCCOC1=CC=CC=C1 ZPIRTVJRHUMMOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000003566 sealing material Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- LZCLXQDLBQLTDK-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-hydroxypropanoate Chemical compound CCOC(=O)C(C)O LZCLXQDLBQLTDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 2
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000009172 bursting Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- SBZXBUIDTXKZTM-UHFFFAOYSA-N diglyme Chemical compound COCCOCCOC SBZXBUIDTXKZTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940116333 ethyl lactate Drugs 0.000 description 1
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000001293 nucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01F—MEASURING VOLUME, VOLUME FLOW, MASS FLOW OR LIQUID LEVEL; METERING BY VOLUME
- G01F23/00—Indicating or measuring liquid level or level of fluent solid material, e.g. indicating in terms of volume or indicating by means of an alarm
- G01F23/22—Indicating or measuring liquid level or level of fluent solid material, e.g. indicating in terms of volume or indicating by means of an alarm by measuring physical variables, other than linear dimensions, pressure or weight, dependent on the level to be measured, e.g. by difference of heat transfer of steam or water
- G01F23/28—Indicating or measuring liquid level or level of fluent solid material, e.g. indicating in terms of volume or indicating by means of an alarm by measuring physical variables, other than linear dimensions, pressure or weight, dependent on the level to be measured, e.g. by difference of heat transfer of steam or water by measuring the variations of parameters of electromagnetic or acoustic waves applied directly to the liquid or fluent solid material
- G01F23/284—Electromagnetic waves
- G01F23/292—Light, e.g. infrared or ultraviolet
- G01F23/2921—Light, e.g. infrared or ultraviolet for discrete levels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
- G01N35/1009—Characterised by arrangements for controlling the aspiration or dispense of liquids
- G01N2035/1025—Fluid level sensing
Description
本発明は、核酸を含有する試料から核酸を抽出するための核酸抽出方法及び核酸抽出装置に関する。
遺伝情報を担う物質である核酸の分析は、学術研究や医療等の多岐の分野で実施されている。核酸の分析方法としては、主に、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）等の核酸増幅技術を利用されることが多い。ここで、ＰＣＲとは核酸を塩基配列特異的に増幅する方法であり、極微量の目的遺伝子の検出や定量が可能である。
ＰＣＲ等の核酸分析においては生物試料等から抽出した核酸を用いるが、この核酸抽出では分析反応に対する阻害物質、例えば、分析結果に擬陽性をもたらすような外部環境に由来する核酸等を含むコンタミネーション物質の影響を排除する必要がある。
生物試料等から核酸を抽出する方法としては、フェノールやクロロホルム等の毒劇物を使用し、エタノール沈殿等の操作を行う従来方法があるが、近年では、カオトロピック物質の存在下でシリカ含有核酸結合性固相等に核酸が結合する性質を利用する方法や、特許文献１に記載されるようなカオトロピック物質と水溶性有機溶媒の存在下でアセチルセルロース等の有機高分子に核酸が結合する性質を利用する方法がより一般的となっている。
特許文献１に記載される方法は、アセチルセルロース等の有機高分子を核酸結合用の部材として備える抽出カートリッジに核酸を含有する溶液を投入し、加圧によって核酸結合用部材を通して溶液を排出し、核酸を核酸結合用部材に結合させる方法である。
この際、溶液全量が排出された直後の抽出カラム内部の圧力変化を解析し、圧力開放弁を作動させて抽出カラム内部の加圧エアーを放出することにより、残留加圧エアーによるミスト状の排出液飛散を抑止してコンタミネーション発生リスクを軽減させている。
しかしながら、上述の特許文献１に記載される方法のように、溶液全量が排出された直後の抽出カラム内部の圧力変化を検出する場合は、溶液全量が排出される直後に発生するミスト状や液滴状の排出液の飛散を完全に抑止することはできない。
特に、生体試料や界面活性剤等を含むような溶液の場合は、溶液の粘性が大きいため、大きい圧力を印加して溶液を通液させる必要があり、溶液全量排出後の残圧も大きい。また、溶液全量が排出される際に気泡が生成されることもあり、この気泡生成過程においては抽出カラム内部の圧力変化を検出し難い。
従って、残圧により気泡が破裂してミスト状や液滴状の排出液が飛散し、或いは、残圧により成長した気泡が抽出カラムの排出口周辺に付着し、コンタミネーション発生の原因となり得る。
本発明の目的は、飛散による排出液の抽出カラム排出口周辺への付着等を防止可能な核酸抽出方法及び核酸抽出装置の実現に関する。
上記課題を解決するため、本発明は次のように構成される。
核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出方法において、抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引し、上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出し、核酸を上記核酸結合性固相に結合し、上記抽出カラム内に洗浄液を吸引し、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出し、上記核酸結合性固相から非特異的な結合物を除去し、上記抽出カラム内に溶出液を吸引し、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出し、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させる。
また、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出装置において、核酸結合性固相を有する抽出カラムと、上記抽出カラムに溶液を吸引させ、吐出させる吸引吐出手段と、上記抽出カラム内の一定量の溶液が残留しているか否かを検出する残量検出手段と、上記吸引吐出手段の動作を制御し、上記残量検出手段からの検出信号に基づいて、上記吸引吐出手段の吐出動作を停止させる制御手段とを備える。そして、上記制御手段は上記吸引吐出手段の動作を制御して、上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引させ、上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出させ、上記抽出カラム内に洗浄液を吸引させ、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出させ、上記抽出カラム内に溶出液を吸引させ、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出させ、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させる。
溶液全量が排出される直後に発生するミスト状や液滴状の排出液の飛散、或いは、気泡破裂による排出液の飛散による抽出カラム排出口周辺への付着等を防止可能な核酸抽出方法及び核酸抽出装置を実現することができる。
以下、本発明の実施形態について添付図面を参照して説明する。
図１は、本発明の一実施形態である核酸抽出方法の概略動作フローチャートである。この核酸抽出方法は、核酸結合工程（Ａ）と、第１洗浄工程（Ｂ）と、第２洗浄工程（Ｃ）と、核酸溶出工程（Ｄ）とを備えている。
核酸結合工程（Ａ）では、核酸含有試料に結合試薬を添加した混合液を抽出カラムに投入し、抽出カラム内部を加圧して混合液を核酸結合性固相内部を通して排出し、抽出カラム内部の残留液量が所定量となったことを検知し、加圧を解除する（ステップ１００〜１０５）。
第１洗浄工程（Ｂ）では、第1洗浄液を抽出カラムに投入し、抽出カラム内部を加圧して、洗浄液を核酸結合性固相内部に通して排出し、抽出カラム内部の残留液量が所定量となったことを検知し、加圧を解除する（ステップ１０６〜１１０）。
第２洗浄工程（Ｃ）では、第２洗浄液を抽出カラムに投入し、抽出カラム内部を加圧して洗浄液を核酸結合性固相内部に通して排出し、抽出カラム内部の残留液量が所定量となったことを検知、加圧を解除し、残留液を除去する（ステップ１１１〜１１６）。
第１洗浄工程（Ｂ）及び第２洗浄工程（Ｃ）は、核酸結合性固相に目的とする核酸のみ残し、他の核酸は除去する工程である。
核酸溶出工程（Ｄ）では、溶出液を抽出カラムに投入し、抽出カラム内部を加圧して洗浄液を核酸結合性固相内部に通して排出し、抽出カラム内部の残留液量が所定量となったことを検知し、加圧を解除し、核酸結合性固相の目的核酸を排出して核酸溶液を得る（ステップ１１７〜１２２）。
核酸含有試料としては、例えば、全血、血漿、血清、尿、唾液、喀痰、精液等の体液、動植物の組織や細胞、微生物、細菌、ウイルス等、及びそれらの懸濁物、或いは溶解物が使用できる。
また、結合試薬としては、核酸含有試料中の核酸を遊離化し、且つ核酸と核酸結合性固相の結合を促進し得るものであり、各種のカオトロピック塩が使用できる。カオトロピック塩としては、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム等を使用できる。
また、核酸の遊離化を促進する為に界面活性剤やタンパク質分解酵素等が使用できる。界面活性剤としては非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート等が使用できる。
また、核酸含有試料に内在、或いは外部環境に由来する核酸分解酵素を不活性化する為に、２−メルカプトエタノールやジチオトレイトール等の還元剤やエチレンジアミン四酢酸塩等の金属キレート剤が使用できる。
また、核酸の遊離化を促進するために、加温、攪拌、ホモジナイズ、超音波等の処理を併用することができる。また、核酸と核酸結合性固相の結合を促進する為に有機溶媒を使用できる。有機溶媒としては水溶性有機溶媒が好ましく、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、ジエチレングリコールジメチルエーテル、乳酸エチル等が使用できる。
図２は、本発明の一実施形態において使用する核酸結合性固相を備える抽出カラム３５の説明図である。
図２において、抽出カラム３５は、溶液を投入する開口部２１、加圧機構を接続する接続部２２、及び溶液を排出する為の開口部２３が形成された配管部２６を備え、配管部２６の内部に、保持部材２５により固定された核酸結合性固相２４が配置されている。
核酸結合性固相２４としては、例えば、ガラス、シリカ、ケイソウ土等、或いは、アセチルセルロース等を含有する固相であり、連続する複数の通液孔を有して通液可能であり、通液の際に溶液との十分な接触効率を得られるように、微細且つ緊密なフィルター状の構造であるものが使用できる。
保持部材２５は、核酸結合性固相２４の形状や設置位置を維持することができ、且つ、連続する複数の通液孔を有し通液可能である部材が使用でき、例えばプリプロピレン粒子の焼結体等が使用できる。
図３は、溶液を投入した抽出カラム３５の内部を加圧し、溶液を核酸結合性固相２４内部に通して排出する為の加圧機構の説明図である。
図３において、加圧機構は、抽出カラム３５内部を加圧する為のシリンジ３１と、プランジャ３２と、このプランジャ３２を上下駆動するためのプランジャ駆動用モータ３３と、シリンジ３１及びプランジャ３２を上下駆動させるためのシリンジ駆動用モータ３４と、シリンジ３１と抽出カラム３５とのシール部材３６と、抽出カラム保持スタンド３７と、廃液受容器３８と、廃液受容器保持スタンド３９とを備える。
上記加圧機構においては、プランジャ３２とシリンジ３１とを上方へ移動させ、抽出カラム３５と廃液受容器３８を各保持スタンドに設置する。そして、抽出カラム３５内部に所定の溶液を投入し、シリンジ３１を下方へ移動させ、シール部材３６を介してシリンジ３１と抽出カラム３５を密着させる。さらに、プランジャ３２を下方へ移動させ、抽出カラム３５内部を加圧し、抽出カラム３５内部の溶液を核酸結合性固相２４内部に通して廃液受容器３８に排出する。
抽出カラム３５の核酸結合性固相２４の通液孔は、微細且つ緊密な構造であり、試料と結合液の混合液のような粘性の大きい溶液に対しては通液抵抗が大きく、通液処理を効率的に行う為には大きな圧力をかける必要がある。
しかし、大きな加圧力の負荷により溶液を通液させた場合は、溶液全量を排出する直後の残圧が大きく、ミスト状や液滴状の排出液の飛散、或いは気泡破裂による排出液の飛散、或いは気泡の抽出カラム排出口２３周辺への付着、等が発生し得る。
従って、所定量の残留液量を検知して、溶液全量を排出する直前に加圧を解除して、溶液排出を停止させることにより、上記コンタミネーションの発生リスクを排除することが必要となる。
溶液の排出過程において、抽出カラム３５内部の残留液量が所定量となったことを検知する方法としては、溶液に対して非接触による方法が好ましく、光センサ、圧力センサ、画像センサ、或いは、超音波センサ等の各種センサを利用する方法がある。
光センサを利用する方法としては、抽出カラム外側の、検知すべき液面位置に光センサの光源部と受光部とを設置し、検知すべき液面位置を液面が通過することにより変化する光学的特性を測定して液面を検知する方法がある。液面の通過に伴う光学特性の変化とは溶液と空気の屈折率差異に基づくものである。
例えば、液面が液面センサの上部にあって抽出カラム３５内部に溶液が在る場合は、抽出カラム３５の屈折率と溶液の屈折率とが小さい為、ある入射角にて入射した光は抽出カラム３５と溶液を透過する。一方、液面が液面センサの下部にあって抽出カラム３５内部に溶液が無い場合は、抽出カラム３５の屈折率と空気の屈折率が大きい為、上記の入射角にて入射した光は抽出カラム３５内面にて全反射、或いは抽出カラム３５内部に溶液が在る場合の透過光と異なる光線路で抽出カラムと溶液を透過する。
図４は、光センサ４１を用いて液面検知する場合の加圧ユニットの説明図である。図４において、光センサ４１を用いた加圧ユニットは、液面検知のための光センサ４１の光源部と全反射光を受光するための受光部とを抽出カラム３５の側面において残留液量約１０ｕｌの液面を検知し得る位置に設置する。
なお、光センサ４１の光源部は入射光が抽出カラム３５と、この抽出カラム３５内部の空気との界面において全反射し、且つ、抽出カラム３５と抽出カラム３５内部の溶液との界面において溶液へ入射するように配置する。光センサ４１の受光部は、上記の全反射光を受光し得るように配置され、核酸結合性固相２４の上部に固定する。液面検知センサは制御部４０を介してシリンジ駆動用モータ３４に連絡されており、液面が所定位置に到達するとシリンジ３１が上方に駆動される。
次に、光センサ４１を用いた加圧ユニットの動作プロトコルを説明する。
まず、加圧ユニットに抽出カラム３５と廃液受容器３８を設置する。そして、２００ｕｌ試料と８００ｕｌ結合液の混合液を抽出カラムに投入し、加圧ユニットを起動する。シリンジ３１が下方へ駆動され、シール材３６を介して抽出カラム３５に密着させられる。そして、プランジャ３２が下方へ駆動され、シリンジ初期容積５ｍｌの空気相が１ｍｌに圧縮される（加圧動作）。以上の動作は、図１のステップ１００〜１０３の動作に対応する。
続いて、抽出カラム３５内部の混合液の残留量が所定量（例えば、１０ｕｌ）となったか否かが検知され、なっていなければ加圧動作が継続される（ステップ１０４）。残留量が１０ｕｌとなると、シリンジ３１が上方へ駆動され、抽出カラム３５との接続が解除されて、プランジャ３２が上方へ駆動される（ステップ１０５）。
次に、１２００ｕｌの第１洗浄液を抽出カラム３５に投入する（ステップ１０６、１０７）。シリンジ３１が下方へ駆動され、シール材３６を介して抽出カラム３５に密着させられる。プランジャ３２が下方へ駆動され、シリンジ初期容積５ｍｌの空気相が１ｍｌに圧縮される（ステップ１０８）。抽出カラム３５内部の洗浄液の残留量が所定量（例えば、１０ｕｌ）となったか否かが検知され、なっていなければ加圧動作が継続される（ステップ１０９）。残留量が１０ｕｌとなると、シリンジ３１が上方へ駆動され、抽出カラム３５との接続が解除されて、プランジャ３２が上方へ駆動される（ステップ１１０）。
次に、１２００ｕｌの第２洗浄液を抽出カラム３５に投入する（ステップ１１１、１１２）。シリンジ３１が下方へ駆動され、シール材３６を介して抽出カラム３５に密着させられる。プランジャ３２が下方へ駆動され、シリンジ初期容積５ｍｌの空気相が１ｍｌに圧縮される（ステップ１１３）。抽出カラム３５内部の洗浄液の残留量が所定量（例えば、１０ｕｌ）となったか否かが検知され、なっていなければ加圧動作が継続される（ステップ１１４）。残留量が１０ｕｌとなると、シリンジ３１が上方へ駆動され、抽出カラム３５との接続が解除されて、プランジャ３２が上方へ駆動される（ステップ１１５）。
再度、ステップ１１１〜１１５が実行される。そして、抽出カラム３５を取り外し、抽出カラム３５を６５℃で５分間加温して、残留洗浄液を揮発させて除去する（ステップ１１６）。
次に、廃液受容器３８を取り外して廃棄し、精製液受容器を設置し、抽出カラム３５を再度設置する。そして、１１０ｕｌ溶出液を抽出カラム３５に投入する（ステップ１１７、１１８）。
そして、プランジャ３２が下方へ駆動され、シリンジ３１の初期容積２ｍｌの空気相が１ｍｌに圧縮される（ステップ１１９）。抽出カラム３５内部の洗浄液の残留量が所定量（例えば、１０ｕｌ）となったか否かが検知され、なっていなければ加圧動作が継続される（ステップ１２０）。残留量が１０ｕｌとなると、シリンジ３１が上方へ駆動され、抽出カラム３５との接続が解除されて、プランジャ３２が上方へ駆動される（ステップ１２１）。そして、精製液受容器に約１００ｕｌの溶出液が得られる（ステップ１２２）。
なお、上述した溶液の排出過程において、抽出カラム３５内部の残留液量が所定量となったことを検知して加圧を解除する方法としては、以下の方法がある。
つまり、光センサ４１とシリンジ上下駆動用モータ３４とを連絡する制御部４０によってシリンジ３１を上方に移動させて抽出カラム３５との接続を断って抽出カラム３５内部の圧力を解除する方法がある。
また、光センサ４１とプランジャ上下駆動用モータ３３とを連絡する制御部４０によってプランジャ３２を上方に移動させて抽出カラム３５内部の圧力を解除する方法もある。
また、シリンジ３１内部と連絡した電磁弁を設置して、その電磁弁を開放する方法等がある。或いは、抽出カラム３５内部の残留液量が所定量となる前に加圧を段階的に低減し、所定量となったところで加圧を完全に解除することもできる。
残留液量が所定量となる前に加圧を段階的に低減し、所定量となった際に加圧を完全に解除する方法としては、残留液量が所定量となる液面、及びその上部の液面を検知し得る少なくとも１箇所以上に設置した光センサ４１により液面の降下を段階的に検知して、プランジャ３２を上方に移動させて抽出カラム３５内部の圧力を段階的に低減し、残留液量が所定量となったところで抽出カラム３５内部の圧力を完全に解除する方法がある。
なお、第１洗浄液としては、核酸と核酸結合性固相の結合を維持して、タンパク質等の非特異的な結合物を除去し得るものであり、結合液において用いることができるカオトロピック塩、界面活性剤、還元剤、金属キレート剤、有機溶媒等を含む溶液が使用できる。
また、第２洗浄液としては、核酸と核酸結合性固相との結合を維持して、第１洗浄液で除去しきれなかった非特異的な結合物と第１洗浄液の残留成分を除去し、且つ、次工程の溶出液に持ち越されて後段の分析反応を阻害しない水準まで除去可能なものであり、エタノールやアセトン等の揮発性を有する有機溶媒等を含有する溶液が使用できる。第２洗浄液の残液を除去する方法としては、抽出カラム３５を加温して残留洗浄液を揮発させる方法が使用できる。
また、溶出液としては、核酸を核酸結合性固相から溶離し、且つ、後段の分析反応を阻害する成分を含有しないものであり、核酸分解酵素を含有しない純水、或いは低塩濃度緩衝液等が使用できる。なお、核酸の溶離を促進する為に溶出液を加温することができる。
次に、抽出カラム３５内部の残留液量が所定量となったことを検知する方法として、圧力センサを利用する方法を説明する。
この方法は、シリンジ３１内部と接続した圧力センサにより、シリンジ３１及び抽出カラム３５内部の圧力を測定して残留液量を算出する方法である。加圧時のシリンジ３１、及び抽出カラム３５内部の圧力は、プランジャ３２の初期位置と移動量、及び溶液の初期容量と残留液量に従って決定される。例えば、プランジャ３２の初期位置と溶液の初期容量を一定量とした場合、残留溶液量は、抽出カラム３５内部の圧力とプランジャ駆動用モータ３３の駆動量に従うプランジャ移動量から算出できる。
図５は、圧力センサを用いて液面検知する場合の加圧ユニットの説明図である。図５において、加圧ユニットは、上述の図３に示す加圧機構において、残留液量検知のための圧力センサ５１を設置したものを使用する。
圧力センサ５１は、シリンジ３１の内部との連絡通路を介してシリンジ下部側面と接続される。圧力値、プランジャ３２の初期位置、及びプランジャ３２の移動量から残留液量が算出される。なお、圧力センサ５１は制御部４０を介してプランジャ駆動用モータ３３とシリンジ駆動用モータ３４に連絡されており、残残留液量が約１０ｕｌに対応する圧力値に達するとシリンジ３１が上方に駆動される。
なお、上述した溶液の排出過程において、抽出カラム３５内部の残留液量が所定量となったことを検知して加圧を解除する方法としては、光センサを用いる場合において説明した方法の他に、次のものがある。
つまり、圧力センサ５１により抽出カラム３５内部の圧力を測定して残留液量を算出し、残留液量が所定量に達する前に、プランジャ３２を上方に移動させて抽出カラム３５内部の圧力を段階的に低減し、残留液量が所定量となったところで抽出カラム内部の圧力を完全に解除する方法、或いは、画像センサにより残留液量を検知し、残留液量が所定量に達する前に、プランジャを上方に移動させて抽出カラム３５内部の圧力を段階的に低減し、残留液量が所定量となったところで抽出カラム３５内部の圧力を完全に解除する方法がある。
また、加圧センサ５１を用いた加圧ユニットの動作プロトコルについては、光センサ４１を用いた加圧ユニットの動作プロトコルにおいて、加圧動作の停止判断が、液面を検知するか、圧力を検知するかの点のみ相違し、他の動作は互いに同様となるので、詳細な説明は省略する。
なお、図１に示したステップ１２２以降の処理である抽出後の核酸を対象とする後段の分析反応としては、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）、 ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）等の核酸増幅、逆転写反応、核酸伸長反応、制限酵素等の酵素反応、或いは電気泳動等の核酸分析が適用できる。
次に、本発明の一実施形態において行なった検証実験にて使用した試料、試薬、装置及び方法ついて説明する。
試料は、ＨＢＶ陽性血清からの精製ＤＮＡを陰性血清に添加した擬似陽性検体（１０３ｃｏｐｙ／２００μｌ）を使用した。
試薬は、結合試薬、６Ｍ グアニジン塩酸塩、１００ｍＭ ＭＥＳ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、２０％（ｖ／ｖ）ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルを使用した。
第１洗浄液は、２．５Ｍ グアニジンチオシアン酸塩、１００ｍＭ ＭＥＳ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、１％（ｖ／ｖ） ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルを使用した。
第２洗浄液は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、８０％（ｖ／ｖ） ＥｔＯＨを使用した。
溶出液は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）を使用した。
抽出カラムは、図２に示す抽出カラム３５において、抽出カラム３５の内部容量を２ｍｌ、抽出カラム３５の材質をポリプロピレン、核酸含有核酸結合性固相を平均粒子保持径０．７μｍのガラス繊維濾紙、保持部材を平均粒子保持径約１００μｍのポリプロピレン粒子焼結体としたものを使用した。
核酸分析方法は、ＰＣＲを使用した。ＨＢＶ 由来ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとするＰＣＲは、（J.Clin.Microbiol.,29(9),1804-1811(1991)）の報告に基づいて下記条件においてＰＣＲを実施した。
Ｐｒｉｍｅｒ １： ５’ＧＣＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＡＧＴ ＴＡＣ ＴＣＴ ＣＧＴ ＴＴＴ ＴＧＣ ３’
Ｐｒｉｍｅｒ ２： ５’ＧＣＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＣＴＡ ＡＣＡ ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＴＴ ＴＣＣ ＧＧ ３’
温度条件：９４℃（５ｍｉｎ）→９４℃（１ｍｉｎ）→５５℃（１ｍｉｎ）→７２℃（１ｍｉｎ）→７２℃（１０ｍｉｎ）、ただし、（９４℃（１ｍｉｎ）→５５℃（１ｍｉｎ）→７２℃（１ｍｉｎ））は、３０サイクル行なった。
Ｐｒｉｍｅｒ ２： ５’ＧＣＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＣＴＡ ＡＣＡ ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＴＴ ＴＣＣ ＧＧ ３’
温度条件：９４℃（５ｍｉｎ）→９４℃（１ｍｉｎ）→５５℃（１ｍｉｎ）→７２℃（１ｍｉｎ）→７２℃（１０ｍｉｎ）、ただし、（９４℃（１ｍｉｎ）→５５℃（１ｍｉｎ）→７２℃（１ｍｉｎ））は、３０サイクル行なった。
ＬＡＭＰ：ＨＢＶ 由来ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとするＬＡＭＰは、（Nucleic Acid Research,28(12),e63(2000)）の報告に基づいて下記条件においてＬＡＭＰを実施した。
Ｐｒｉｍｅｒ ＦＩＰ：５’ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＣＴ ＡＴＧ ＣＣＴ ＣＡＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＴＧＡ ＣＡＡ ＡＣＧ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＴＡ ＣＣＴ Ｔ ３’
Ｐｒｉｍｅｒ ＢＩＰ：５’ＧＡＴ ＡＡＡ ＡＣＧ ＣＣＧ ＣＡＧ ＡＣＡ ＣＡＴ ＣＣＴ ＴＣＣ ＡＡＣ ＣＴＣ ＴＴＧ ＴＣＣ ＴＣＣ ＡＡ ３’
Ｐｒｉｍｅｒ Ｆ３：５’ＧＧＴ ＧＧＴ ＴＧＡ ＴＧＴ ＴＣＣ ＴＧＧ Ａ ３’
Ｐｒｉｍｅｒ Ｂ３：５’ＣＡＡ ＡＡＴ ＴＣＧ ＣＡＧ ＴＣＣ ＣＣＡ ＡＣ ３’
温度条件：９５℃（５ｍｉｎ）→Ｏｎ ｉｃｅ（３ｍｉｎ）→Ｂｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添加→６５℃（１ｈ）→８０℃（１０ｍｉｎ）
増幅産物の確認：０．８％アガロースゲルを支持体とする電気泳動を実施し、２本鎖ＤＮＡに特異的に結合する蛍光色素で染色し、紫外線照射下において確認した。
Ｐｒｉｍｅｒ ＢＩＰ：５’ＧＡＴ ＡＡＡ ＡＣＧ ＣＣＧ ＣＡＧ ＡＣＡ ＣＡＴ ＣＣＴ ＴＣＣ ＡＡＣ ＣＴＣ ＴＴＧ ＴＣＣ ＴＣＣ ＡＡ ３’
Ｐｒｉｍｅｒ Ｆ３：５’ＧＧＴ ＧＧＴ ＴＧＡ ＴＧＴ ＴＣＣ ＴＧＧ Ａ ３’
Ｐｒｉｍｅｒ Ｂ３：５’ＣＡＡ ＡＡＴ ＴＣＧ ＣＡＧ ＴＣＣ ＣＣＡ ＡＣ ３’
温度条件：９５℃（５ｍｉｎ）→Ｏｎ ｉｃｅ（３ｍｉｎ）→Ｂｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添加→６５℃（１ｈ）→８０℃（１０ｍｉｎ）
増幅産物の確認：０．８％アガロースゲルを支持体とする電気泳動を実施し、２本鎖ＤＮＡに特異的に結合する蛍光色素で染色し、紫外線照射下において確認した。
実験と結果：上述の試料から、各種試薬、加圧ユニットＡ（光センサによる液量検知）及びその動作プロトコルを用いてＤＮＡ抽出を実施して得た溶出液１０ｕｌを用いてＰＣＲを実施し、また、同様に加圧ユニットＢ（圧力センサによる液量検知）及びその動作プロトコルを用いてＤＮＡ抽出を実施して得た溶出液１０ｕｌを用いてＬＡＭＰを実施し、各々の増幅産物を確認した。
この結果、双方とも良好な増幅産物が得られたことから正常な核酸抽出が行われ、後段の分析反応への適性を有することが実証された。そして、加圧による溶液排出工程においては、溶液全量が排出される前に加圧が解除され、溶液全量が排出される直後に発生するミスト状や液滴状の排出液の飛散、或いは、気泡破裂による排出液の飛散、或いは、気泡の抽出カラム排出口周辺への付着は発生しないことが確認された。
したがって、本発明によれば、飛散による排出液の抽出カラム排出口周辺への付着等を防止可能な核酸抽出方法及び核酸抽出装置の実現することができる。
なお、光センサを用いて、液面検知する場合、光センサを鉛直方向に２つ配置し、上方に配置された光センサが液面を検知してから、下方に配置された光センサが液面を検知するまでの時間と距離とにより、液面の降下速度を算出し、所定の液量となる時刻を予測して、加圧解除を行なうように制御することもできる。シリンジ３６又はプランジャ３２は、移動停止指令を受けてから、実際に動作停止するまでにタイムラグがあると考えられるが、液面の降下速度を算出し、所定の液量となる時刻を予測して制御するようにすれば、上記タイムラグを考慮して、シリンジ３６又はプランジャ３２の動作停止を行なうことができる。
また、光センサに代えて超音波センサを用いて、液面検知することができるが、超音波センサを用いる場合は、超音波発生素子と超音波検出素子とを互いに対向して、抽出カラムに配置し、超音波発生素子と超音波検出素子との間に溶液が存在するか否かにより、超音波検出素子の検出レベルが異なることを利用して液面の位置を検知することができる。
また、画像センサを用いて、液面検知を行なうことができるが、画像センサにより得られた画像を画像処理することにより液面を検知することができる。この画像処理は、制御部４０により行なうことができる。
２１・・・溶液投入開口部、２２・・・加圧機構接続部、２３・・・溶液排出開口部、２４・・・核酸結合性固相、２５・・・保持部材、３１・・・シリンジ、３２・・・プランジャ、３３・・プランジャ駆動用モータ、３４・・・シリンジ駆動用モータ、３５・・・抽出カラム、３６・・・シール部材、３７・・・抽出カラム保持スタンド、３８・・・廃液受容器、３９・・・廃液受容器保持スタンド、４０・・・制御部、４１・・・光センサ、５１・・・圧力センサ
Claims (8)
- 核酸結合性固相を有する抽出カラムを用いて、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出方法において、
上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引し、上記抽出カラム内の液面を光センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出し、核酸を上記核酸結合性固相に結合し、
上記抽出カラム内に洗浄液を吸引し、上記抽出カラム内の液面を上記光センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記洗浄液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出し、上記核酸結合性固相から非特異的な結合物を除去し、
上記抽出カラム内に溶出液を吸引し、上記抽出カラム内の液面を上記光センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記溶出液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出し、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させることを特徴とする核酸抽出方法。 - 核酸結合性固相を有する抽出カラムを用いて、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出方法において、
上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引し、上記抽出カラム内の液面を超音波センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出し、核酸を上記核酸結合性固相に結合し、
上記抽出カラム内に洗浄液を吸引し、上記抽出カラム内の液面を上記超音波センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記洗浄液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出し、上記核酸結合性固相から非特異的な結合物を除去し、
上記抽出カラム内に溶出液を吸引し、上記抽出カラム内の液面を上記超音波センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記溶出液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出し、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させることを特徴とする核酸抽出方法。 - 核酸結合性固相を有する抽出カラムを用いて、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出方法において、
上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引し、上記抽出カラム内の液面を画像センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出し、核酸を上記核酸結合性固相に結合し、
上記抽出カラム内に洗浄液を吸引し、上記抽出カラム内の液面を上記画像センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記洗浄液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出し、上記核酸結合性固相から非特異的な結合物を除去し、
上記抽出カラム内に溶出液を吸引し、上記抽出カラム内の液面を上記画像センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記溶出液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出し、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させることを特徴とする核酸抽出方法。 - 請求項１、２、３のうちのいずれか一項記載の核酸抽出方法において、上記洗浄液は、第１洗浄液と第２洗浄液からなり、第１洗浄液で上記核酸結合性固相から除去できなかった非特異的な結合物を、第２洗浄液で除去することを特徴とする核酸抽出方法。
- 核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出装置において、
核酸結合性固相を有する抽出カラムと、
上記抽出カラムに溶液を吸引させ、吐出させる吸引吐出手段と、
上記抽出カラム内の液面を検出することにより、上記抽出カラム内の一定量の溶液が残留しているか否かを検出する光センサと、
上記吸引吐出手段の動作を制御し、上記残量検出手段からの検出信号に基づいて、上記吸引吐出手段の吐出動作を停止させる制御手段と、
を備え、上記制御手段は上記吸引吐出手段の動作を制御して、
上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記光センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出させ、
上記抽出カラム内に洗浄液を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記光センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記洗浄液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出させ、
上記抽出カラム内に溶出液を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記光センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記溶出液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出させ、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させることを特徴とする核酸抽出装置。 - 核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出装置において、
核酸結合性固相を有する抽出カラムと、
上記抽出カラムに溶液を吸引させ、吐出させる吸引吐出手段と、
上記抽出カラム内の液面を検出することにより、上記抽出カラム内の一定量の溶液が残留しているか否かを検出する超音波センサと、
上記吸引吐出手段の動作を制御し、上記残量検出手段からの検出信号に基づいて、上記吸引吐出手段の吐出動作を停止させる制御手段と、
を備え、上記制御手段は上記吸引吐出手段の動作を制御して、
上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記超音波センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出させ、
上記抽出カラム内に洗浄液を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記超音波センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記洗浄液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出させ、
上記抽出カラム内に溶出液を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記超音波センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記溶出液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出させ、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させることを特徴とする核酸抽出装置。 - 核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出装置において、
核酸結合性固相を有する抽出カラムと、
上記抽出カラムに溶液を吸引させ、吐出させる吸引吐出手段と、
上記抽出カラム内の液面を検出することにより、上記抽出カラム内の一定量の溶液が残留しているか否かを検出する画像センサと、
上記吸引吐出手段の動作を制御し、上記残量検出手段からの検出信号に基づいて、上記吸引吐出手段の吐出動作を停止させる制御手段と、
を備え、上記制御手段は上記吸引吐出手段の動作を制御して、
上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記画像センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出させ、
上記抽出カラム内に洗浄液を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記画像センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記洗浄液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出させ、
上記抽出カラム内に溶出液を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記画像センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記溶出液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出させ、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させることを特徴とする核酸抽出装置。 - 請求項５、６、７のうちのいずれか一項記載の核酸抽出装置において、上記洗浄液は、第１洗浄液と第２洗浄液からなり、上記制御手段は、第１洗浄液で上記核酸結合性固相から除去できなかった非特異的な結合物を、第２洗浄液で除去させることを特徴とする核酸抽出装置。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007176325A JP5022794B2 (ja) | 2007-07-04 | 2007-07-04 | 核酸抽出方法及び核酸抽出装置 |
| US12/216,411 US20090099350A1 (en) | 2007-07-04 | 2008-07-03 | Instrument and method for nucleic acid isolation |
| EP08012041A EP2011872A1 (en) | 2007-07-04 | 2008-07-03 | Instrument and method for nucleic acid isolation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007176325A JP5022794B2 (ja) | 2007-07-04 | 2007-07-04 | 核酸抽出方法及び核酸抽出装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009011225A JP2009011225A (ja) | 2009-01-22 |
| JP5022794B2 true JP5022794B2 (ja) | 2012-09-12 |
Family
ID=39876531
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007176325A Expired - Fee Related JP5022794B2 (ja) | 2007-07-04 | 2007-07-04 | 核酸抽出方法及び核酸抽出装置 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20090099350A1 (ja) |
| EP (1) | EP2011872A1 (ja) |
| JP (1) | JP5022794B2 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0603869D0 (en) * | 2006-02-28 | 2006-04-05 | Loach Andrew R | Cable recoil system for an exercise machine |
| US20120121464A1 (en) * | 2009-01-29 | 2012-05-17 | Hitachi High-Technologies Corporation | Apparatus for pretreating biological samples, and mass spectrometer equipped with same |
| KR101626846B1 (ko) * | 2009-12-22 | 2016-06-02 | 삼성전자주식회사 | 핵산 분리 방법 및 장치 |
| JP2012154917A (ja) * | 2011-01-05 | 2012-08-16 | Hitachi High-Technologies Corp | 固相抽出の異常判定方法、及び固相抽出装置 |
| US8865456B2 (en) * | 2011-04-28 | 2014-10-21 | Arkray, Inc. | Nucleic acid collection device and nucleic acid collection amount estimation method |
| WO2016035140A1 (ja) * | 2014-09-02 | 2016-03-10 | 株式会社島津製作所 | 前処理装置及びこれを備えた分析システム |
| EP3226004B1 (de) | 2016-03-30 | 2019-10-02 | CTC Analytics AG | Verfahren zum betreiben einer dosiervorrichtung |
| JP2020510420A (ja) * | 2017-02-27 | 2020-04-09 | ミダイアグノスティクス・エヌブイｍｉＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＮＶ | 核酸を精製し増幅するためのシステムおよび方法 |
| CN110272808B (zh) | 2018-03-13 | 2020-10-16 | 武汉医蒂生物科技有限公司 | 一种核酸提取系统 |
| WO2020046323A1 (en) | 2018-08-30 | 2020-03-05 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Syringe bodies |
| CN111239065A (zh) * | 2020-02-25 | 2020-06-05 | 山东大学 | 一种中药提取在线检测系统及方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11266864A (ja) * | 1998-03-19 | 1999-10-05 | Hitachi Ltd | 核酸の精製方法および精製用装置 |
| AUPP499098A0 (en) * | 1998-08-03 | 1998-08-27 | Brestovac, Brian | Air pressure device for extraction of DNA and/or RNA through a separation column |
| US6492162B1 (en) * | 1998-10-27 | 2002-12-10 | Hitachi, Ltd. | Apparatus for the recovery of nucleic acids |
| JP3752417B2 (ja) * | 2000-09-07 | 2006-03-08 | 株式会社日立製作所 | 核酸の精製方法および精製装置 |
| JP3580801B2 (ja) * | 2001-08-01 | 2004-10-27 | 富士写真フイルム株式会社 | 核酸の分離精製方法 |
| DE60220932T2 (de) * | 2001-10-19 | 2008-03-06 | MonoGen, Inc., Vernon Hills | Apparat und methode zum mischen von proben in gefässen |
| US7354510B2 (en) * | 2003-08-19 | 2008-04-08 | Fujifilm Corporation | Extracting apparatus |
| JP2005110670A (ja) * | 2003-09-19 | 2005-04-28 | Fuji Photo Film Co Ltd | 抽出装置 |
| US20050161377A1 (en) * | 2004-01-23 | 2005-07-28 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Extraction system |
| JP2005204578A (ja) * | 2004-01-23 | 2005-08-04 | Fuji Photo Film Co Ltd | 抽出装置 |
| JP4399304B2 (ja) * | 2004-03-29 | 2010-01-13 | 富士フイルム株式会社 | 自動核酸分離精製方法およびその装置 |
| ATE541037T1 (de) * | 2004-08-25 | 2012-01-15 | Fujifilm Corp | Verfahren zur trennung und reinigung von nukleinsäure |
| JP4936901B2 (ja) * | 2005-01-07 | 2012-05-23 | ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 | 担体封入チップ、担体処理装置、および担体処理方法 |
| JP4340298B2 (ja) * | 2007-03-01 | 2009-10-07 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸回収方法及び核酸回収装置 |
-
2007
- 2007-07-04 JP JP2007176325A patent/JP5022794B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-07-03 EP EP08012041A patent/EP2011872A1/en not_active Withdrawn
- 2008-07-03 US US12/216,411 patent/US20090099350A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2009011225A (ja) | 2009-01-22 |
| EP2011872A1 (en) | 2009-01-07 |
| US20090099350A1 (en) | 2009-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5022794B2 (ja) | 核酸抽出方法及び核酸抽出装置 | |
| JP5011012B2 (ja) | 核酸抽出装置 | |
| CA2748364C (en) | Method for pretreating specimen and method for assaying biological substance | |
| KR100505380B1 (ko) | 핵산의 회수기구 및 방법 | |
| US8753868B2 (en) | Method and system for selective isolation of target biological molecules in a general purpose system | |
| EP2777811A1 (en) | Nucleic acid amplification reaction device and nucleic acid amplification method | |
| WO1996029602A1 (fr) | Procede et dispositif pour le traitement de liquides a l'aide d'un distributeur | |
| EP2778687A1 (en) | Cartridge for nucleic acid amplification reaction | |
| WO1997031105A1 (fr) | Procede de traitement de biopolymeres, de micro-organismes ou de matieres a l'aide de plusieurs types de particules magnetiques | |
| EP1767623A1 (en) | Container for nucleic acid extraction, method of cleaning solid matrix and relevant cleaning mechanism, and method of purifying nucleic acid | |
| Ouyang et al. | Pressure-modulated selective electrokinetic trapping for direct enrichment, purification, and detection of nucleic acids in human serum | |
| JP2012135306A (ja) | 対照核酸用一般マトリックス | |
| JP2001074756A (ja) | 検体の前処理装置 | |
| US20230227888A1 (en) | Point of need diagnostic device and methods of use thereof | |
| JP2007306867A (ja) | 核酸抽出装置及び核酸抽出方法 | |
| CA3217441A1 (en) | Analyte detection cartridge and methods of use thereof | |
| Bruckner-Lea et al. | Renewable microcolumns for automated DNA purification and flow-through amplification: from sediment samples through polymerase chain reaction | |
| CA2981940A1 (en) | Improved detection of methylated dna | |
| WO2008075501A1 (ja) | 回転式抽出容器、それを用いた細胞種の同定方法、遺伝子検出方法、及び自動核酸抽出装置 | |
| JP2010158190A (ja) | 核酸回収方法及び核酸回収装置 | |
| US8808643B1 (en) | Fluidics platform and method for sample preparation and analysis | |
| US20060234243A1 (en) | Sample preparing unit | |
| US20110091873A1 (en) | Integrated sample preparation and amplification for nucleic acid detection from biological samples | |
| Mamaev et al. | Method for automated extraction and purification of nucleic acids and its implementation in microfluidic system | |
| EP2379698B1 (en) | Apparatus and method for handling fluids for analysis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091228 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120306 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120425 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120522 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120618 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150622 Year of fee payment: 3 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |