KR102514955B1 - Pcr 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 pcr 검사시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PCR(Polymerase Chain Reaction) 검사 등과 같이 세균이나 바이러스 등의 DNA를 증폭하여 각종 질병이나 질환의 감염 여부를 검사하기 위한 검사시스템 및 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, PCR 검사를 위한 미세유체 용액의 펌핑, 부피정량 및 혼합 과정이 복잡한 외부 제어기와 내부 밸브에 의해 제어됨으로 인해 전체적인 구성이 복잡해지고 고가의 부품이 사용되어 비용이 증가하게 되는 문제가 있었던 종래기술의 미세유체 제어용 칩 및 이를 이용하는 검사시스템들의 문제점을 해결하기 위해, 수직으로 이동가능한 상판과 회전 가능한 하판을 통하여 유체가 표면장력과 중력만으로 자동으로 완전히 이송되고, 온도조절을 위한 열전히터(THU) 및 광검출을 위한 광전자 증배관(PMT)을 구비하여 검체의 준비로부터 실시간 역전사 PCR(rRT-PCR) 까지의 과정이 단일의 칩을 통해 자동으로 수행되도록 구성됨으로써, 간단한 구성으로 신속하고 정확한 검사가 가능한 동시에, 전체적인 검사시스템의 구성을 간소화하고 비용을 절감할 수 있도록 구성되는 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템 및 방법이 제공된다.

Description

PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템{Fluid control chip for PCR inspection and system for PCR inspection using thereof}
본 발명은 감염병과 같은 질병의 감염 여부를 검사하기 위한 장치 및 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는, 예를 들면, 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction ; PCR) 검사 등과 같이, 세균이나 바이러스 등의 DNA를 증폭하여 특정 표적 유전물질을 검출하는 것에 의해 각종 질병이나 질환의 감염 여부를 검사하기 위한 PCR 검사시스템 및 방법에 있어서, 유전자의 추출, 증폭, 검지에 이르는 일련의 과정 및 각각의 과정을 제어하기 위한 구성들이 매우 복잡함으로 인해 전체적인 시스템의 구성 및 비용이 증가하게 되는 문제가 있었던 종래기술의 PCR 검사시스템 및 방법들의 문제점을 해결하기 위해, 단일의 칩을 통해 검사대상이 포함된 미세유체의 준비와 온도제어 및 검출을 모두 수행할 수 있도록 구성되어 기존에 비해 간단한 구성 및 저렴한 비용으로 정확한 검사가 가능한 동시에, 전체적인 검사시스템의 구성을 간소화할 수 있도록 구성되는 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 상기한 바와 같이 PCR 검사를 위한 미세유체 용액의 펌핑, 부피정량 및 혼합 과정이 여러 가지 복잡한 외부 제어기와 내부 밸브 등에 의해 제어됨으로 인해 전체적인 구성이 복잡해지고 고가의 부품이 사용되어 비용이 증가하게 되는 문제가 있었던 종래기술의 미세유체 제어용 칩들의 문제점을 해결하기 위해, 수직으로 이동가능한 상판과 회전 가능한 하판을 통하여 상부챔버에서 하부챔버로 유체가 표면장력과 중력만으로 자동적으로 완전히 이송되고, 온도조절을 위한 열전히터(Thermoelectric Heater Unit ; THU) 및 광검출을 위한 광전자 증배관(photomultiplier tube ; PMT)이 단일의 칩에 집적화된 구조로 형성되어, 검체의 준비로부터 실시간 역전사 PCR(real-time reverse transcription polymerase chain reaction ; rRT-PCR) 까지의 과정이 단일의 칩을 통해 자동으로 수행되도록 구성됨으로써, 간단한 구성으로 신속하고 정확한 검사가 가능한 동시에, 전체적인 검사시스템의 구성을 간소화하고 비용을 절감할 수 있도록 구성되는 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템에 관한 것이다.
최근, 전세계적으로 코로나 19(COVID-19)와 같은 전염병이 대유행하면서, 보다 간단한 구성 및 방법으로 이러한 감염병이나 각종 질병을 신속하고 정확하게 검사할 수 있도록 하기 위한 검사장치 및 방법에 대한 요구가 높아지고 있다.
또한, 이와 같이 감염병의 감염 여부에 대한 검사방법으로는, 크게 나누어, 항체(antibody) 검출법과 핵산(nucleic acid) 검출법의 두 가지로 분류될 수 있으며, 먼저, 항체 검출법은, 면역형광 항체검사(immunofluorescent antibody tests) 및 혈청 분석(serological assays)을 포함하고, 샘플 준비에서 검출까지 처리과정이 비교적 간단하고 빠르나, 일반적으로 바이러스 감염 초기에는 실제 질병이 있는 경우를 양성으로 판정하는 민감도(sensitivity)와 실제 질병이 없는 경우를 음성으로 판정하는 특이도(specificity)가 낮은 단점이 있다.
이에 반해, 핵산 검출법은, 항체 검출법에 비해 충분히 높은 민감도와 특이도를 가지는 장점으로 인해, 예를 들면, 코로나 19(COVID-19)와 같이, 인플루엔자 및 바이러스 감염에 의한 호흡기 바이러스 질환을 검출하기 위한 방법으로 현재 널리 적용되고 있다.
특히, 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time reverse transcription polymerase chain reaction ; rRT-PCR) 검사는 계절성 인플루엔자와 유행성 바이러스를 구별할 수 있을 만큼 높은 민감도와 특이도로 RNA 바이러스를 정량적으로 검출할 수 있으나, 이러한 rRT-PCR 검사에는 정확한 열순환(thermal cycling)이 요구되고, rRT-PCR의 바이러스 유전자 증폭단계 전에 비인두(nasopharyngeal swab) 검체(specimens)로부터 바이러스 RNA 분리단계가 선행되어야 한다.
아울러, 이러한 처리과정은 일반적으로 일련의 유체처리 및 온도제어를 포함하는 장치간 동작(inter-device operation)이 요구되므로, 전체적인 처리과정이 길어지는 데 더하여, 작업자 상호작용(operator interaction)으로 인한 샘플 오염 및 작업자간 변동성(inter-operator variability)으로 인한 오류 등과 같은 생물학적 안정성(biosafety) 문제가 발생할 수 있다.
이와 같은 장치간 동작 문제를 처리하기 위한 방법으로, 종래, 사람의 개입 없이 바이러스 샘플을 자동화된 방식으로 처리할 수 있는 미세유체 플랫폼을 사용하는 방안이 제시되었며, 이러한 미세유체 기술은 자동 동작, 높은 정확도, 적은 양의 시약(reagent) 요구 및 짧은 분석시간 등의 장점을 가지는 것으로, 생체유체(biofluids)와 생체입자(bioparticles)를 효과적으로 조작하기 위해 밸브, 펌프, 믹서, 미세입자 컨트롤러(microbead controller) 및 반응챔버를 포함하는 다양한 미세유체 구성요소(microfluidic components)가 제시된 바 있다.
즉, 상기한 바와 같이 감염병과 같은 질병의 감염 여부를 검사하기 위한 검사장치 및 방법에 적용되는 미세유체 플랫폼에 대한 종래기술의 예로는, 예를 들면, 한국 등록특허공보 제10-1888376호에 제시된 바와 같은 "감염성 질병 진단용 유전자칩"이 있다.
더 상세하게는, 상기한 한국 등록특허공보 제10-1888376호는, 플라스틱 필름을 포함하는 하부 필름; 플라스틱 필름을 포함하는 상부 필름; 하부 필름과 상부 필름 사이에 게재되고 내부에 바이오 샘플로부터 핵산을 분리시키는 전처리챔버와, 분리된 핵산을 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 증폭시키고 판독하는 증폭 및 진단챔버와, 바이오 샘플을 이송시키되 복수의 단절 구간이 존재하는 채널이 형성된 플라스틱 필름을 포함하는 중간필름; 및 채널의 단절구간 상부에 각각 배치되어 단절구간 상부에 유로를 형성시키고 바이오 샘플을 전진 방향으로 이송시키거나 또는 전진 방향으로의 이송을 차단하는 밸브부재를 포함하여, 단일의 칩 내에 바이오 샘플로부터 핵산을 분리시키는 전처리챔버와 분리된 핵산을 PCR을 통해 증폭시키고 판독할 수 있도록 하는 증폭 및 진단챔버를 형성하는 것에 의해 단일의 칩에서 감염성 질병 진단을 위한 시료전처리, 핵산증폭 및 판독을 모두 수행 가능하도록 구성되는 감염성 질병 진단용 유전자칩을 제시하고 있다.
상기한 바와 같이, 종래, 감염병과 같은 질병의 감염 여부를 검사하기 위한 검사장치 및 방법에 대하여 여러 가지 기술내용들이 제시된 바 있으나, 상기한 바와 같은 종래기술의 내용들은 다음과 같은 문제점이 있는 것이었다.
더 상세하게는, 상기한 바와 같이 바이러스 탐지를 위한 샘플의 준비에서 검출에 이르기까지 필요한 모든 단계를 구현하기 위하여는 생체유체와 생체입자를 효과적으로 조작하기 위한 밸브, 펌프, 믹서, 미세입자 컨트롤러 및 반응챔버 등을 포함하는 다양한 미세유체 구성요소를 통합하여 일체화된 미세유체 제어 플랫폼으로 구현하는 것이 요구된다.
그러나 상기한 바와 같은 종래기술의 미세유체 제어장치들은, 그 처리과정이 복잡하여 전체적인 장치의 구성이 복잡해지는 데 더하여, 그러한 복잡한 처리과정을 높은 정밀도 및 정확도로 수행하기 위해서는 상대적으로 고가의 부품들이 사용되어야 함으로 인해 전체적인 비용 또한 증가하게 되는 문제가 있었다.
아울러, 상기한 바와 같은 종래기술의 미세유체 제어장치들은, 바이러스 탐지를 위한 샘플의 준비에서 검출까지의 전체적인 처리과정이 자동화되지 못함으로 인해, 처리과정중 작업자의 개입에 의한 인적오류나 오차가 발생할 위험성도 있는 것이었다.
따라서 상기한 바와 같이, 전체적인 구성이 복잡하여 비용이 증가하고 자동화가 이루어지지 못함으로 인해 오류나 오차 발생의 위험성이 있는 한계가 있었던 종래기술의 PCR 검사용 미세유체 제어장치 및 방법들의 문제점을 해결하기 위해서는, 미세유체를 제어하기 위한 펌프나 밸브 등의 복잡하고 고가의 구성이 필요 없이 미세유체의 혼합 및 운반부터 검출까지의 처리과정이 단일의 플랫폼을 통해 자동으로 이루어질 수 있도록 함으로써 기존에 비해 보다 간단한 구성 및 저렴한 비용으로 신속하고 정확한 검사가 가능도록 구성되는 새로운 구성의 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템 및 방법을 제시하는 것이 바람직하나, 아직까지 그러한 요구를 모두 만족시키는 장치나 방법은 제공되지 못하고 있는 실정이다.
한국 등록특허공보 제10-1888376호 (2018.08.08.)
본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자 하는 것으로, 따라서 본 발명의 목적은, 감염병과 같은 질병의 감염 여부를 검사하기 위해 세균이나 바이러스 등의 DNA를 증폭하여 특정 표적 유전물질을 검출하는 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction ; PCR) 검사시 유전자의 추출, 증폭, 검지에 이르는 일련의 과정 및 각각의 과정을 제어하기 위한 구성들이 매우 복잡함으로 인해 전체적인 시스템의 구성 및 비용이 증가하게 되는 문제가 있었던 종래기술의 PCR 검사시스템 및 방법들의 문제점을 해결하기 위해, 단일의 칩을 통해 검사대상이 포함된 미세유체의 준비와 온도제어 및 검출을 모두 수행할 수 있도록 구성되어 기존에 비해 간단한 구성으로 신속하고 정확한 검사가 가능한 동시에, 전체적인 검사시스템의 구성을 간소화하고 비용을 절감할 수 있도록 구성되는 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템을 제공하고자 하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, 상기한 바와 같이 PCR 검사를 위한 미세유체 용액의 펌핑, 부피정량 및 혼합 과정이 여러 가지 복잡한 외부 제어기와 내부 밸브 등에 의해 제어됨으로 인해 전체적인 구성이 복잡해지고 고가의 부품이 사용되어 비용이 증가하게 되는 문제가 있었던 종래기술의 미세유체 제어용 칩들의 문제점을 해결하기 위해, 수직으로 이동가능한 상판과 회전 가능한 하판을 통하여 상부챔버에서 하부챔버로 유체가 표면장력과 중력만으로 자동적으로 완전히 이송되고, 온도조절을 위한 열전히터(Thermoelectric Heater Unit ; THU) 및 광검출을 위한 광전자 증배관(photomultiplier tube ; PMT)이 단일의 칩에 집적화된 구조로 형성되어 검체의 준비로부터 실시간 역전사 PCR(real-time reverse transcription polymerase chain reaction ; rRT-PCR) 까지의 과정이 단일의 칩을 통해 자동으로 수행되도록 구성됨으로써, 간단한 구성으로 신속하고 정확한 검사가 가능한 동시에, 전체적인 검사시스템의 구성을 간소화하고 비용을 절감할 수 있도록 구성되는 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템을 제공하고자 하는 것이다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명에 따르면, PCR 검사용 유체제어칩에 있어서, 수직방향으로 이동 가능하도록 이루어지는 상판; 상기 상판의 하부에 미리 정해진 일정 간격을 두고 이격되어 배치되고 회전 가능하도록 이루어지는 하판; 유체를 수용하기 위해 상기 상판에 형성되는 복수의 상부챔버; 유체가 수용되고 상기 상기 상판의 하강에 의해 상기 상부챔버가 내측으로 삽입될 수 있도록 각각의 상기 상부챔버에 대응하여 상기 하판에 형성되는 복수의 하부챔버; 상기 하판을 회전 가능하게 지지하는 회전축; 상기 하판 및 상기 회전축 사이의 간격을 유지하기 위해 상기 하판과 상기 회전축 사이에 배치되는 스프링을 포함하여 이루어지는 간격유지부; 각각의 상기 상부챔버 및 상기 하부챔버에 수용된 유체의 온도조절을 위한 온도조절부; 광검출을 위한 빛을 조사하는 광원부; 상기 광원부로부터 조사된 광을 검출하기 위한 광검출부; 상기 상부챔버에 수용된 유체 내의 자성물질을 수집하기 위해 상기 상판의 상부에 형성되는 마그네틱 로드(magnetic rod); 단부에 영구자석을 삽입할 수 있도록 속이 빈 돔(dome)이 형성되어 상기 마그네틱 로드의 하부에 배치되는 팁; 상기 상판과 상기 하판 및 상기 마그네틱 로드의 이동을 위한 동력을 전달하는 구동부; 및 상기 유체제어칩의 전체적인 동작을 제어하는 제어부를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 검사용 유체제어칩이 제공된다.
여기서, 상기 상부챔버 및 상기 하부챔버는, 상기 상판 및 상기 하판에 각각의 상기 상부챔버 및 상기 하부챔버가 수용되는 수용홈을 각각 형성하고, 상기 수용홈에 상기 상부챔버 및 상기 하부챔버가 각각 결합되도록 구성됨으로써, 각각의 상기 상부챔버 및 상기 하부챔버가 상기 상판 및 상기 하판으로부터 분리, 결합이 가능하도록 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 유체제어칩은, 각각의 상기 수용홈 주변을 덮도록 형성되는 보강재를 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
아울러, 상기 상부챔버는 상하 양단이 개방된 중공형 실린더의 형태로 형성되고, 상기 하부챔버는 상단만 개방된 형태로 형성되며, 미리 정해진 비율에 따라 상기 상부챔버와 상기 하부챔버의 직경을 형성하는 것에 의해, 상기 상판의 상하이동과 표면장력에 의해 유체가 상기 상부챔버로부터 상기 하부챔버로 남김없이 완전하게 이동될 수 있도록 구성되는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 상부챔버 및 상기 하부챔버는, 상기 상부챔버의 내경을 DT라 하고, 상기 하부챔버의 내경을 DB라 할 때, 상기 상부챔버와 상기 하부챔버의 직경비율 DT/(DB - DT)가 1.9 이상으로 형성되도록 구성되는 것을 특징으로 한다.
더욱이, 상기 온도조절부는, 상기 상판의 일측에 배치되는 리드히터(Lid Heater); 및 상기 하판의 상기 리드히터에 대응되는 위치의 하부에 미리 정해진 일정 간격으로 이격되어 배치되며, 상기 하부챔버가 내측에 수용되도록 속이 빈 원통형 실린더의 형태로 형성되고, 측면에는 상기 광원부로부터 조사된 광이 입사될 수 있도록 관통공이 형성되며, 하부에는 히트싱크가 구비되는 열전히터(Thermoelectric Heater Unit ; THU)를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 온도조절부는, 상기 열전히터(THU)와 상기 히트싱크 및 상기 리드히터의 온도를 각각 측정하고 모니터링하기 위한 복수의 온도센서를 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
아울러, 상기 광원부는, LED를 포함하는 광원과 여기필터(excitation filter) 및 집광렌즈(lens)가 원통형의 케이스 내에 각각 구비되어 일체로 형성되고, 상기 열전히터(THU)의 측면에 배치되어 상기 열전히터(THU)의 내측에 수용된 상기 하부챔버 내의 유체에 검출을 위한 광을 조사하도록 구성되는 것을 특징으로 한다.
더욱이, 상기 광검출부는, 상기 광원부로부터 조사되어 상기 열전히터(THU)의 내측에 수용된 상기 하부챔버 내의 유체를 통과한 광을 검출하기 위해 상기 리드히터의 상단에 각각 배치되는 방출필터(emission filter) 및 광전자 증배관(photomultiplier tube ; PMT)을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 구동부는, 상기 상판의 상부에 연결되는 지지축을 통하여 상기 상판의 상하운동을 위한 동력을 전달하는 제 1 스텝모터; 상기 회전축에 연결되어 상기 하판의 회전운동을 위한 동력을 전달하는 제 2 스텝모터; 및 상기 마그네틱 로드의 상하이동을 위한 동력을 전달하는 제 3 스텝모터를 포함하여 구성됨으로써, 상기 상판과 상기 마그네틱 로드의 수직운동 및 상기 하판의 회전운동이 각각 독립적으로 제어되도록 구성되는 것을 특징으로 한다.
아울러, 상기 PCR 검사용 유체제어칩은, 상기 상부챔버 및 상기 하부챔버에 유체를 각각 주입하고, 상기 상판의 상하이동 및 상기 하판의 회전동작에 의해 상기 상부챔버와 상기 하부챔버를 정렬시킨 다음, 상기 상부챔버와 상기 하부챔버가 접촉되도록 상기 상판을 하강시켜 상기 상부챔버의 유체를 상기 하부챔버에 전달하고, 상기 상판의 상하이동을 반복하여 각각의 유체를 혼합하며, 그 후, 상기 상판을 더욱 하강시켜 혼합유체가 수용된 상기 하부챔버가 상기 열전히터에 삽입되도록 하여 온도제어 및 광검출이 수행되고, 다시 상기 상판을 상승시키면 상기 스프링에 의해 상기 하판이 원위치로 복귀되도록 구성됨으로써, 바이러스 샘플에서 RNA를 분리하는 검체 준비과정부터 실시간 역전사 PCR(real-time reverse transcription polymerase chain reaction ; rRT-PCR) 까지의 처리과정이 단일의 칩을 통해 자동으로 수행될 수 있도록 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따르면, PCR 검사시스템에 있어서, PCR(Polymerase Chain Reaction) 검사를 위한 처리가 수행되는 검진부; 및 상기 검진부의 검진결과에 근거하여 질병의 유무를 판단하는 처리가 수행되는 분석부를 포함하여 구성되고, 상기 검진부는, 상기에 기재된 PCR 검사용 유체제어칩을 이용하여 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 검사시스템이 제공된다.
아울러, 본 발명에 따르면, 상기에 기재된 PCR 검사용 유체제어칩을 이용한 PCR 검사방법에 있어서, 상기 유체제어칩의 상판 및 하판에 상부챔버 및 하부챔버를 각각 삽입하고, 바이러스 샘플, 용해액(lysis buffer), 자기비드(magnetic beads), 세척액(wash buffer) 및 용출액(elution buffer)을 포함하는 PCR 검사를 위한 유체들을 각각의 챔버에 피펫팅(pipetting)하는 처리가 수행되는 준비단계; 미리 정해진 시간 동안 상기 상판의 상하 이동을 반복하여 바이러스 샘플이 수용된 제 1 상부챔버를 용해액이 수용된 제 1 하부챔버와 접촉시키고 상기 바이러스 샘플을 용해시키는 처리가 수행되는 용해단계; 상기 상판의 상하 이동과 상기 하판의 회전에 의해 각각의 챔버를 정렬시킨 후, 상기 상판을 하강시켜 용해된 상기 바이러스 샘플이 수용된 상기 제 1 하부챔버와 자기비드가 수용된 제 2 상부챔버를 미리 정해진 시간 동안 접촉시키는 것에 의해 용해된 상기 바이러스 샘플에 존재하는 바이러스 RNA와 상기 자기비드를 결합시키켜 RNA-비드 복합체를 형성하는 처리가 수행되는 결합단계; 상기 유체제어칩의 팁을 상기 RNA-비드 복합체가 수용된 상기 제 1 하부챔버와 미리 정해진 시간 동안 접촉시키는 것에 의해 상기 팁에 상기 RNA-비드 복합체를 수집하는 처리가 수행되는 수집단계; 상기 RNA-비드 복합체가 수집된 상기 팁을 세척액이 수용된 제 2 하부챔버로 이동시켜 상기 팁에 수집된 상기 RNA-비드 복합체를 세척하고, RNA의 순도를 높이기 위해 미리 정해진 설정에 따라 서로 다른 챔버에서 세척과정을 반복하는 처리가 수행되는 세척단계; RNA의 용출을 위해 상기 팁을 용출액이 수용된 제 3 하부챔버로 이동시키고, 상기 하판을 회전시켜 상기 제 3 하부챔버를 상기 유체제어칩의 리드히터 및 열전히터(THU)와 정렬시킨 다음, 상기 상판을 하강시켜 상기 제 3 하부챔버를 상기 열전히터(THU)와 접촉시킨 후 미리 정해진 시간 동안 미리 정해진 온도로 유지하여 상기 바이러스 RNA를 용출시키는 처리가 수행되는 용출단계; 상기 바이러스 RNA가 용출된 상기 제 3 하부챔버를 PCR 검사용 시약이 수용된 제 3 상부챔버와 접촉시켜 상기 제 3 하부챔버에 상기 시약을 혼합하는 처리가 수행되는 시약혼합단계; 및 상기 하판을 회전시켜 시약이 혼합된 상기 제 3 하부챔버를 상기 리드히터 및 상기 열전히터(THU)와 각각 정렬시키고, 상기 상판을 하강시켜 상기 제 3 하부챔버를 상기 열전히터(THU)와 밀착되도록 하고 미리 정해진 시간 동안 미리 정해진 온도로 유지하여 상보적(complementary) DNA(cDNA)를 합성한 후, 미리 정해진 시간, 온도 및 열주기(thermal cycle)로 초기 DNA 변성(denaturation)을 가지는 DNA 증폭을 행하는 실시간 역전사 PCR(rRT-PCR) 처리가 수행되는 PCR 수행단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 검사방법이 제공된다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 수직으로 이동가능한 상판과 회전 가능한 하판을 통하여 상부챔버에서 하부챔버로 유체가 표면장력과 중력만으로 자동적으로 완전히 이송되고, 온도조절을 위한 열전히터(THU) 및 광검출을 위한 광전자 증배관(PMT)이 단일의 칩에 집적화된 구조로 형성되어 검체의 준비로부터 실시간 역전사 PCR(rRT-PCR) 까지의 과정이 단일의 칩을 통해 자동으로 수행되는 것에 의해 간단한 구성으로 신속하고 정확한 검사가 가능한 동시에, 전체적인 검사시스템의 구성을 간소화하고 비용을 절감할 수 있도록 구성되는 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템이 제공됨으로써, PCR 검사를 위한 미세유체 용액의 펌핑, 부피정량 및 혼합 과정이 여러 가지 복잡한 외부 제어기와 내부 밸브 등에 의해 제어됨으로 인해 전체적인 구성이 복잡해지고 고가의 부품이 사용되어 비용이 증가하게 되는 문제가 있었던 종래기술의 미세유체 제어용 칩들의 문제점을 해결할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기한 바와 같이 단일의 칩을 통해 검사대상이 포함된 미세유체의 준비와 온도제어 및 검출을 모두 수행할 수 있으므로 기존에 비해 간단한 구성으로 신속하고 정확한 검사가 가능한 동시에, 전체적인 검사시스템의 구성을 간소화하고 비용을 절감할 수 있도록 구성되는 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템이 제공됨으로써, 감염병과 같은 질병의 감염 여부를 검사하기 위해 세균이나 바이러스 등의 DNA를 증폭하여 특정 표적 유전물질을 검출하는 중합효소 연쇄반응(PCR) 검사시 유전자의 추출, 증폭, 검지에 이르는 일련의 과정 및 각각의 과정을 제어하기 위한 구성들이 매우 복잡함으로 인해 전체적인 시스템의 구성 및 비용이 증가하게 되는 문제가 있었던 종래기술의 PCR 검사시스템 및 방법들의 문제점을 해결할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩의 전체적인 구성을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 2는 도 1에 나타낸 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩의 동작을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩의 상부챔버와 하부챔버의 구체적인 구성을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩의 온도조절부, 광원부 및 광검출부의 구체적인 구성을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩의 온도조절부, 광원부 및 광검출부의 구체적인 구성을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩을 이용하여 검체의 준비와 PCR 검사가 수행되는 일련의 처리과정을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩의 실제 성능을 검증하기 위한 실험에 적용된 프라이머 DNA 및 프로브 DNA의 구체적인 구성을 표로 정리하여 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩의 상부챔버에서 하부챔버로 유체가 이송되는 과정을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 9는 상부챔버에서 하부챔버로의 완전한 액체 이송을 위한 챔버 직경의 결정과정을 설명하기 위한 개념도이다.
도 10은 상부챔버의 삽입깊이에 따른 하부챔버에서의 압력의 변화를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 열순환 동안 챔버 내부의 온도변화에 대한 분석결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 분석시간의 최적화를 위해 각각의 파라미터를 변경하여 PCR을 수행한 실험결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따른 유체제어 칩을 이용한 바이러스 검출결과와 기존의 방식으로 수행된 결과를 각각 비교하여 나타낸 도면이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여, 본 발명에 따른 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템의 구체적인 실시예에 대하여 설명한다.
여기서, 이하에 설명하는 내용은 본 발명을 실시하기 위한 하나의 실시예일 뿐이며, 본 발명은 이하에 설명하는 실시예의 내용으로만 한정되는 것은 아니라는 사실에 유념해야 한다.
또한, 이하의 본 발명의 실시예에 대한 설명에 있어서, 종래기술의 내용과 동일 또는 유사하거나 당업자의 수준에서 용이하게 이해하고 실시할 수 있다고 판단되는 부분에 대하여는, 설명을 간략히 하기 위해 그 상세한 설명을 생략하였음에 유념해야 한다.
즉, 본 발명은, 후술하는 바와 같이, 감염병과 같은 질병의 감염 여부를 검사하기 위해 세균이나 바이러스 등의 DNA를 증폭하여 특정 표적 유전물질을 검출하는 중합효소 연쇄반응(PCR) 검사시 유전자의 추출, 증폭, 검지에 이르는 일련의 과정 및 각각의 과정을 제어하기 위한 구성들이 매우 복잡함으로 인해 전체적인 시스템의 구성 및 비용이 증가하게 되는 문제가 있었던 종래기술의 PCR 검사시스템 및 방법들의 문제점을 해결하기 위해, 단일의 칩을 통해 검사대상이 포함된 미세유체의 준비와 온도제어 및 검출을 모두 수행할 수 있도록 구성되어 기존에 비해 간단한 구성으로 신속하고 정확한 검사가 가능한 동시에, 전체적인 검사시스템의 구성을 간소화하고 비용을 절감할 수 있도록 구성되는 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템에 관한 것이다.
아울러, 본 발명은, 후술하는 바와 같이, PCR 검사를 위한 미세유체 용액의 펌핑, 부피정량 및 혼합 과정이 여러 가지 복잡한 외부 제어기와 내부 밸브 등에 의해 제어됨으로 인해 전체적인 구성이 복잡해지고 고가의 부품이 사용되어 비용이 증가하게 되는 문제가 있었던 종래기술의 미세유체 제어용 칩들의 문제점을 해결하기 위해, 수직으로 이동가능한 상판과 회전 가능한 하판을 통하여 상부챔버에서 하부챔버로 유체가 표면장력과 중력만으로 자동적으로 완전히 이송되고, 온도조절을 위한 열전히터(THU) 및 광검출을 위한 광전자 증배관(PMT)이 단일의 칩에 집적화된 구조로 형성되어 검체의 준비로부터 실시간 역전사 PCR(rRT-PCR) 까지의 과정이 단일의 칩을 통해 자동으로 수행되도록 구성됨으로써, 간단한 구성으로 신속하고 정확한 검사가 가능한 동시에, 전체적인 검사시스템의 구성을 간소화하고 비용을 절감할 수 있도록 구성되는 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템에 관한 것이다.
계속해서, 도면을 참조하여, 본 발명에 따른 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템의 구체적인 내용에 대하여 설명한다.
먼저, 도 1을 참조하면, 도 1은 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)의 전체적인 구성을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)은, 크게 나누어, 수직방향으로 이동 가능하도록 이루어지는 상판(11)과, 회전 가능하도록 이루어지고 상판(11)의 하부에 일정 간격을 두고 이격되어 배치되는 하판(12)과, 바이러스 샘플(T1)이나 마그네틱 비드(magnetic beads)(T2) 및 PCR 시약(rRT-PCT reagents)(T3) 등의 유체를 수용하기 위해 상판(11)에 일정 간격으로 형성되는 복수의 상부챔버(13)와, 용해(B1), 세척(B2-B4) 및 용출(B5) 등을 위해 각각의 상부챔버(13)가 삽입될 수 있도록 각각의 상부챔버(13)에 대응하여 하판(12)에 형성되는 복수의 하부챔버(14)와, 하판(12)을 회전 가능하게 지지하는 회전축(15)과, 유체의 온도조절을 위해 상판(11)에 배치되는 리드히터(Lid Heater)(16) 및 하판(12)의 하부에 일정 간격으로 이격되어 배치되고 하부챔버(14)가 내측에 수용되도록 이루어지는 열전히터(Thermoelectric Heater Unit ; THU)(17)를 포함하여 이루어지는 온도조절부와, 열전히터(THU)(17)의 일측에 배치되어 열전히터(THU)(17)의 내측에 수용된 하부챔버(14)에 광검출을 위한 빛을 조사하기 위한 LED(18) 및 필터(19)를 포함하여 이루어지는 광원부와, 광원부로부터 조사되어 열전히터(THU)(17)의 내측에 수용된 하부챔버(14) 내의 유체를 통과한 광을 검출하기 위해 상판(11)의 일측에 배치되는 광전자 증배관(photomultiplier tube ; PMT)(20)을 포함하여 이루어지는 광검출부를 포함하여 구성될 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)은, 도 1에 나타낸 바와 같이, 자성체를 이용하여 상부챔버(13)에 수용된 유체 내의 자성물질을 수집하여 제거하기 위해 상판(11)의 상부에 형성되는 마그네틱 로드(magnetic rod)(21)와 마그네틱 로드(21)의 하부에 영구자석을 삽입할 수 있도록 속이 빈 돔(dome)이 단부에 형성된 팁(22)을 포함하여, 마그네틱 로드(21)의 상하운동에 의해 팁(22) 내부에 수용된 영구자석이 수직으로 이동하여 자력을 조정하고 하부챔버(14) 내에 수용된 유체에 함유된 자성물질을 흡착하여 제거하도록 구성될 수 있다.
아울러, 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)은, 도 1에 나타낸 바와 같이, 하판(12)과 온도조절부에 구비된 열전히터(THU)(17) 사이의 간격을 유지하기 위해, 회전축(15)에 형성된 지지대(24)와 하판(12) 사이에 배치되는 스프링(23)과 같은 탄성부재를 포함하여 이루어지는 간격유지부를 포함하여, 상판(11)의 하강에 의해 하판(12)이 하강하여 하부챔버(14)가 열전히터(17)에 삽입되고 상판(11)이 상승하면 다시 원위치로 복귀하도록 구성될 수 있다.
즉, 도 2를 참조하면, 도 2는 도 1에 나타낸 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)의 동작을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 상하이동 가능한 상판(11)과 회전 가능한 하판(12)의 동작에 의해 상부챔버(13)와 하부챔버(14)를 정렬시킨 다음 상판(11)을 하강시켜 상부챔버(13)의 유체를 하부챔버(14)에 전달하여 혼합하며, 그 후, 상판(11)을 더욱 하강시키면 하부챔버(14)가 열전히터(17)에 삽입되어 광검출이 수행되고, 다시 상판(11)을 상승시키면 스프링(23)에 의해 하판(12)이 원위치로 돌아가게 된다.
여기서, 상부챔버(13)(T1 ~ T3)는 상하 양단이 개방된 실린더(중공형 실린더)의 형태로 형성되고 하부챔버(14)(B1 ~ B5)는 상단만 개방된 챔버의 형태로 형성되며, 후술하는 바와 같이 하여 상부챔버(13)와 하부챔버(14)의 직경을 적절히 조절하여 형성함으로써, 상판(11)의 상하이동과 표면장력에 의해 유체가 상부챔버(13)로부터 하부챔버(14)로 남김없이 완전하게 이동될 수 있도록 구성될 수 있다.
더욱이, 각각의 상부챔버(13)와 하부챔버(14)는, 바람직하게는, 상판(11) 및 하판(12)으로부터 분리 가능하도록 구성되어 사용의 편의성을 더욱 높일 수 있도록 구성될 수 있다.
즉, 도 3을 참조하면, 도 3은 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)의 상부챔버(13)와 하부챔버(14)의 구체적인 구성을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, 상판(11) 및 하판(12)에 각각 챔버가 수용되는 수용홈(31)을 형성하고, 이러한 수용홈(31)에 챔버를 각각 결합하도록 구성됨으로써, 사용 후 교체가 용이하여 편의성을 높이는 동시에, 챔버 재사용시 남아있는 유체로 인한 오염이나 오류 발생을 방지하여 보다 신속하고 정확한 검사 및 측정이 가능해진다.
이때, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 고온의 환경인 경우를 고려하여, 예를 들면, 단열재 등으로 각각의 수용홈(31) 주변에 보강재(32)를 설치하도록 구성됨으로써, 검사장치의 수명을 증가시키고 보다 안정적인 검사가 가능해진다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)은, 도시되지는 않았으나, 상판(11)의 상부에 연결되는 지지축을 통하여 상판(11)의 상하운동을 위한 동력을 전달하는 제 1 스텝모터와, 회전축(15)에 연결되어 하판(12)의 회전운동을 위한 동력을 전달하는 제 2 스텝모터 및 마그네틱 로드(21)의 상하이동을 위한 동력을 전달하는 제 3 스텝모터를 포함하는 복수의 구동모터를 포함하여 이루어지는 구동부 및 상기한 각 부의 전체적인 동작을 제어하는 제어부를 포함하여 구성될 수 있다.
아울러, 각각의 챔버(13, 14)와 팁(22)의 위치는 상판(11) 및 하판(12)이 움직이는 동안 원하지 않는 접촉을 방지하도록 신중하게 설계되며, 구동부의 3개의 스텝모터에 의해 상판(11)과 영구자석의 수직운동 및 하판(12)의 회전이 각각 독립적으로 제어되도록 구성된다.
즉, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)은, 온도제어를 위해 투명한 뚜껑이 구비된 리드히터(Lid Heater)(16)가 상판(11)에 배치되고, 열전히터(THU)(17)가 하판(12)의 아래에 배치되며, 스프링(23)에 의해 THU(17)와 하판(12) 사이의 간격이 조정 및 유지되도록 하여 리드히터(16)가 하부챔버(14)(도 1에서 B5)를 밀어 THU(17)와 접촉하도록 하고, THU(17)의 측면에 rRT-PCR의 형광검출을 위한 형광 광원(18, 19) 및 리드히터(16) 상단에 PMT(photomultiplier tube)(20)가 포함된 광검출부를 각각 구비하여 구성될 수 있다.
더 상세하게는, 도 4 및 도 5를 참조하면, 도 4 및 도 5는 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)의 온도조절부, 광원부 및 광검출부의 구체적인 구성을 각각 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 온도조절부는 리드히터(Lid Heater) 및 열전히터(THU)(17)를 포함하여 구성되고, 광원부는 LED와 같은 광원과 여기필터(excitation filter) 및 렌즈(lens)가 일체로 형성되어 구성되며, 광검출부는 리드히터(16) 상단에 배치되는 방출필터(emission filter) 및 광전자증배관(PMT)을 포함하여 구성될 수 있다.
여기서, 상기한 열전히터(THU)는, 알루미늄 등과 같은 연전도성이 우수한 재질로 형성되고, 하단에는 히트싱크와 팬 및 온도센서가 구비되며, 상부에는 PCR 검체가 수용된 챔버가 삽입될 수 있도록 원통형의 삽입홈이 형성되며, 삽입홈의 측면에는 광원부가 삽입될 수 있도록 구멍이 형성되어 구성될 수 있다.
또한, 리드히터는, 투명한 유리(Glass) 위에 속이 빈 알루미늄 실린더(Hollow Al Cylinder)가 배치되고, 알루미늄 실린더는 니켈/크롬 와이어(Ni/Cr wire) 히터를 포함하는 전기 절연 테이프로 덮도록 구성될 수 있다.
아울러, 광원부는 480nm의 광을 발산하는 LED와, 375±10nm의 파장을 가지는 대역통과 필터(bandpass filter) 및 집광을 위한 비구면 렌즈(aspheric lens)를 포함하여, 열전히터(THU) 측면의 구멍을 통해 광이 PCR 검체에 입사되도록 구성될 수 있다.
더욱이, 광검출부는 광전자증배관(PMT)과 파장 510±10nm의 대역통과 필터를 포함하여 구성되고, 온도측정을 위한 온도센서(① ~ ③)가 각각의 위치에 부착되어 열전히터(THU)와 알루미늄 히트싱크 및 리드히터의 온도를 각각 모니터링 하도록 구성될 수 있다.
또한, PCR 검체의 온도는 또 다른 온도센서를 사용하여 측정되며, THU의 측면은 히트싱크 팬에서 나오는 공기흐름에 의한 온도변동을 방지하기 위해 도 5에 나타낸 바와 같이, 3D 프린팅된 벽으로 둘러싸여 있도록 구성될 수 있다.
여기서, 도 1 및 도 2를 참조하여 상기한 본 발명의 실시예에서는, 상판(11)에 3개의 상부챔버(13)가 형성되고 하판(12)에는 5개의 하부챔버(14)가 형성되어 있는 경우를 예로 하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명은 반드시 상기한 실시예의 경우로만 한정되는 것은 아니며, 즉, 본 발명은, 상부챔버(13)와 하부챔버(14)의 개수가 다르게 형성될 수 있는 등, 본 발명의 취지 및 본질을 벗어나지 않는 범위 내에서 필요에 따라 당업자에 의해 다양하게 수정 및 변경하여 적용 가능한 것임에 유념해야 한다.
계속해서, 도 6을 참조하여, 상기한 바와 같이 구성되는 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)의 구체적인 동작에 대하여 설명한다.
즉, 도 6을 참조하면, 도 6은 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)을 이용하여 검체의 준비와 PCR 검사가 수행되는 일련의 처리과정을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)을 이용한 처리과정은, 먼저, 동작 전에 각각의 챔버와 팁을 상판(11) 및 하판(12)에 삽입한 다음, 바이러스 샘플(7μL)과 시약(110μL 용해액(lysis buffer), 20μL 자기비드(magnetic beads), 200μL 세척액(wash buffer), 8.5μL 용출액(elution buffer) 및 16.5μL rRT-PCR 혼합물)을 챔버에 피펫팅(pipetting)한다.
이후, 첫번째 단계(step 1)에서, 5분 또는 10분 동안 챔버 T1에서 챔버 B1까지 상하 이동을 반복하여 바이러스 샘플을 용해시키고, 이러한 상하 이동은 효과적으로 바이러스 샘플을 용해액으로 이동시키고 혼합 및 용해를 촉진한다.
두번째 단계(step 2)에서, 용해된 샘플의 바이러스 RNA는 자기비드에 결합되고(bind), 처리중에 상판(11)은 위로 이동하고 하판(12)은 회전하여 챔버 T2와 챔버 B1을 각각 정렬시키며, 이후 챔버 T2와 챔버 B1이 5분 동안 접촉하여 용해된 샘플에 존재하는 바이러스 RNA와 자기비드를 방출하고 결합한다.
세번째 단계(step 3)에서, 40초 동안 영구자석과 팁(22)의 자동 수직접촉에 의해 구동되는 자기력에 의해 RNA-비드 복합체가 팁(22)에 수집되고, 이후, 네번째 단계(step 4)에서 팁(22)은 RNA-비드 복합체의 세척을 위해 챔버 B2로 이동되며, 이후의 단계들(step 5, step 6)에서 고순도의 RNA를 보장하기 위해 각각 챔버 B3 및 B4에서 세척과정을 반복하고, 이때, 상기한 4 ~ 6 단계는 각각 1 분 정도 소요된다.
다음으로, 7 단계(step 7)에서, 팁(22)은 RNA 용출을 위해 RNA-비드 복합체를 챔버 B5로 이동시키며, 하판(12)이 회전하여 챔버 B5를 리드히터(16) 및 THU(17)와 정렬시키고, 리드히터(16)는 챔버 B5를 밀어 THU(17)와 접촉한 후, 효과적인 용출과정을 위해 챔버 B5는 63℃에서 5분 동안 유지된다.
이어서, 8 단계(step 8)에서 팁(22)은 챔버 B5에서 비드를 제거하고, 9 단계(step 9)에서 챔버 T3는 rRT-PCR 시약을 수용하기 위해 챔버 B5와 접촉하며, 마지막으로, 10 단계(step 10)에서 하판(12)이 회전하여 챔버 B5를 리드히터(16) 및 THU(17)와 각각 정렬시킨다.
또한, 리드히터(16)가 챔버 B5를 THU(17)와 밀착되도록 밀게 되면, 먼저, 55℃에서 15분 동안 상보적(complementary) DNA(cDNA) 합성 후, 95℃에서 2분 동안 연속 40회의 열주기(thermal cycle)로 초기 DNA 변성(denaturation)을 가지는 DNA 증폭을 수행하여 rRT-PCR 과정이 수행되며, 이때, 각 주기는 95℃에서 10 또는 15초 동안 DNA 변성 및 60℃에서 20 또는 30초 동안 결합-연장(annealing-extension)으로 구성된다.
아울러, 열전히터에 의한 온도변동시 리드에 응결(condensation)을 방지하기 위해 리드히터는 일정한 고온을 유지하며, 각 사이클의 결합-연장 동안 PCR 증폭 유전자 산출물(product)의 형광신호는 광원에 의한 여기(excitation) 및 투명 리드히터(16)에 부착된 PMT(20)에 의한 방출(emission)의 검출에 의해 획득된다.
더욱이, 상기한 상판(11) 및 하판(12)과 각각의 챔버(13, 14)와 팁(22)은 각각 3D 프린팅에 의해 제작될 수 있으며, 프린팅 후 이소프로판올에 10분간 담그고 자외선(UV light)에 10분간 노출시킨 후, 65℃의 오븐에 밤새 두었다가 단백질과 핵산의 흡착을 방지하기 위해 2% 소혈청 알부민(bovine serum albumin) 용액으로 코팅하여 제조될 수 있다.
여기서, 다른 챔버와 달리 챔버 B5는 rRT-PCR에 요구되는 투명성과 열 안정성을 위해 사용되는 100μL 상용 폴리프로필렌 튜브(commercial polypropylene tube)로 구성될 수 있고, 장치의 섀시 본체는 모터를 고정하고 시스템에 강성을 제공하기 위해 아크릴 벽으로 구성될 수 있으며, 영구자석을 움직이는 마그네틱 로드(21) 또한 3D 프린팅으로 제작될 수 있다.
따라서 상기한 바와 같은 구성으로부터, 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)은, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 샘플의 준비와 온도조절 및 광검출을 위한 각각의 구성요소들이 단일의 칩에 집적화된 구조로 형성됨으로써, 바이러스 샘플에서 RNA를 분리하는 검체 준비과정부터 실시간 역전사 PCR(rRT-PCR) 까지의 일련의 처리과정이 단일의 칩을 통해 자동으로 수행될 수 있다.
계속해서, 상기한 바와 같이 구성되는 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)을 이용하여 실제 PCR 검사를 수행한 실험결과에 대하여 설명한다.
즉, 본 발명자들은, 상기한 바와 같이 하여 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)을 실제로 구현하고, 그 성능을 검증하기 위해 실험을 진행하였다.
더 상세하게는, 도 1 내지 도 5를 참조하여 상기한 바와 같이 하여 유체제어칩(10)을 제작하고, 아두이노(Arduino) 마이크로 컨트롤러를 이용하여 3개의 스텝모터와 LED 및 PMT 등을 각각 자동으로 제어하였으며, 이를 위해, 오픈소스 소프트웨어의 C ++ 기반 코드가 아두이노(Arduino)에 업로드 되었다.
또한, 혼합효율과 유체수송을 특성화하기 위해 현미경 및 카메라를 사용하여 50fps의 속도로 이미지를 캡처하고 캡처한 이미지를 Octave 소프트웨어를 사용하여 분석하였으며, 혼합효율에 대한 자세한 계산은 후술한다.
아울러, 상부챔버(13)와 하부챔버(14) 사이의 접촉에 의해 생성된 압력은 하부챔버(14)에 연결된 압력센서를 사용하여 측정되었고, Allplex II RV16 Detection(Seegene, Seoul, South Korea)으로 확인된 인플루엔자 A 바이러스 양성 비인두 샘플(nasopharyngeal swab sample)이 본 실험에 적용되었으며, 전반적인 실험내용은 서울 아산병원 기관심의위원회(IRB 번호 : 2020-1679)의 심의 및 승인을 받았다.
더 상세하게는, 70μL의 샘플 부피(volume)가 각 테스트에 사용되었고, 마그네틱 비드와 용해, 세척 및 용출 단계에 대하여 상용 키트(NUCLISENS easyMAG, Biomerieux, USA)를 사용하였으며, 원스텝(One-step) RT-PCR 시약은 5pmol 농도로 1μL의 FAM(carboxy-fluorescein) 프로브 DNA(Macrogen), 1μL Taq 믹스(one-step RT-PCR kit, Invitrogen), 12.5μL 2× 반응믹스(reaction mix)(Invitrogen), 10pmol 농도의 인플루엔자 A 바이러스(하위형(subtype) FluA-H3)용 1μL 정방향(forward) 및 1μL 역방향(reverse) 프라이머쌍(primer pair)을 사용하여 16.5μL rRT-PCR 혼합물을 준비하였다.
또한, 준비된 rRT-PCR 시약은 분리된 바이러스 RNA를 포함하는 8.5μL 용출액과 혼합되어 원스텝 rRT-PCR에 대한 최종 부피를 25μL로 구성하였고, 목표 앰플 리콘(target amplicon)(크기 : 155bp)의 프라이머 및 프로브 DNA에 대한 상세한 내용은 도 7의 표에 각각 나타낸 바와 같다.
즉, 도 7을 참조하면, 도 7은 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)의 실제 성능을 검증하기 위한 실험에 적용된 프라이머 DNA 및 프로브 DNA의 구체적인 구성을 표로 정리하여 나타내는 도면이다.
아울러, 본 발명자들은, 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제에칩(10)의 성능을 기존의 rRT-PCR 방법의 성능과 비교하기 위해 시중에서 판매되는 벤치탑 열 사이클러(benchtop thermal cycler)(Rotor-Gene Q, Qiagen)에서 동일한 농도와 부피의 rRT-PCR 시약을 사용하였고, 검출한계(Limit Of Detection ; LOD) 테스트를 수행하기 위해 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 RNA 샘플을 사용하여 상보적(complementary) DNA(cDNA)를 합성하고 UV 분광광도계(sperctrophotometer) (Ultrospec 2100 pro, GE Healthcare UK)에서 정량화하였으며, 이때, 사본 수(copy number)는 다음과 같이 계산되었다.
Copy No. = X·A / N·M·C
여기서, X는 cDNA의 양(ng/μL), A는 아보가드로(Avogadro) 상수 (6×1,023), N은 ssDNA 앰플리콘의 길이, M은 1bp의 평균질량(ssDNA의 경우 330g/mol), C는 곱셈상수(1×109)를 각각 의미한다.
또한, 용액의 혼합을 특성화하기 위해, 5μL의 자기비드(ChargeSwitch, Invitrogen)를 상부챔버(13)에 배치하고 하부챔버(14)에는 물을 배치하였으며, PCR 효율은 기울기 S와 표준곡선(standard curve)의 잔여 표준편차(residual standard deviation) σ를 이용하여 수학식 (10-1/S - 1)×100%을 통해 산출되고, LOD는 3σ/S로 산출된다.
계속해서, 상기한 바와 같이 하여 수행된 실험결과에 대하여 설명한다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)은 기존의 칩들과 달리 펌프나 밸브의 구성이 필요 없이 상부챔버(13)에서 하부챔버(14)로 유체의 완전한 이송이 가능하며, 용액의 이송을 위해, 하판(12)이 회전하여 각 판의 열린 챔버를 쌍으로 정렬하고, 두 판의 접촉에 의해 용액이 상부챔버(13)에서 하부챔버(14)로 완전히 이동된다.
이 과정에서, 속이 빈 원통형의 상부챔버(13)와 접촉하는 용액의 표면장력이 완전한 용액 전달을 촉진하며, 쌍을 이룬 챔버들의 반복적인 접촉에 의해 혼합이 이루어지고, 수직 이동되는 자석을 포함하여 상판(11)에 구비된 팁(22)에 의해 자기 비드의 수집, 운반, 방출, 분산 및 세척이 수행된다.
즉, 도 8을 참조하면, 도 8은 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)의 상부챔버(13)에서 하부챔버(14)로 유체가 이송되는 과정을 개략적으로 나타내는 도면이다.
더 상세하게는, 액체 이송공정은, 먼저, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 속이 빈 실린더 모양의 상부챔버(13)가 아래로 이동하여 하부챔버(14)와 접촉한 후 상부챔버(13)가 위로 이동하면 상부챔버(13)의 액체가 하부챔버(14)로 모두 배출된다.
여기서, DT와 DB를 각각 상부챔버(13) 및 하부챔버(14)의 내경이라 할 때 각 챔버의 직경비율을 DT/(DB - DT)로 정의하였으며, 본 실시예에서는 DB = 5 및 6mm를 사용하고 DT를 변경하여 적용하였고, 도 6에 나타낸 실시예의 1, 2, 9 단계에서, 액체의 완전한 이송을 위해 DT/(DB - DT) = 2.3 및 DB = 5.5mm인 챔버를 사용하였다.
즉, 도 8a의 그래프에 나타낸 바와 같이, 각 챔버의 직경비율이 DT/(DB - DT) = 0.5일 때에는 접촉 후에도 액체가 상부챔버(13)에 남아있는 반면, DT/(DB - DT) ≥ 1.9에서는 챔버의 크기 및 재질에 관계 없이 액체가 완전히 이동되는 것을 확인할 수 있으며, 이러한 과정은 중력하에서 표면장력의 영향을 받는다.
이에, 본 발명자들은, 이러한 용액 수송을 설명하기 위해 상부챔버(13)가 접촉 후 상승시 표면장력의 비율(FL/FU)을 나타내는 간단한 모델을 개발하였으며, 즉, 도 9를 참조하면, 도 9는 상부챔버(13)에서 하부챔버(14)로의 완전한 액체 이송을 위한 챔버 직경의 결정과정을 설명하기 위한 개념도이다.
여기서, FL 및 FU는 각각 상부챔버(13)의 하단 및 하부챔버(14)의 상단에서 용액 메니스커스(meniscus)를 아래로 미는 표면장력 및 위로 당기는 표면장력을 의미하고, 도 9에 있어서, 도 9a는 액체 이송을 설명하기 위한 모델을 나타내는 도면이고, 도 9b는 해당 모델에 대한 표면장력과 중력을 포함하는 힘 분석을 나타내는 도면이다.
상기한 바와 같이, 용액 이송 메커니즘은 상부챔버(13)가 하부챔버(14)와 접촉한 후 위쪽으로 이동하는 순간의 표면장력 비율로 나타낼 수 있으며, 이때의 표면장력의 비율은 FL/FU이고, 여기서 FL과 FU는 각각 용액을 아래로 밀고 위로 당기는 표면장력이며, FU 및 FL은 각각 도 9b의 ①, ②로부터 이하의 [수학식 1] 및 [수학식 2]를 이용하여 각각 계산될 수 있다.
[수학식 1]
Figure 112021053922817-pat00001
[수학식 2]
Figure 112021053922817-pat00002
여기서, FL은 도 9b에서 ①의 액체를 끌어내리므로 FL < 0이며, 도 9b의 ②에서 r1 및 r2는 이하의 [수학식 3]을 이용하여 근사될 수 있다.
[수학식 3]
Figure 112021053922817-pat00003
또한, FL < 0의 결과를 이용하여,
Figure 112021053922817-pat00004
를 고려할 수 있으며, 따라서 [수학식 2] 는 이하의 [수학식 4]와 같이 근사될 수 있다.
[수학식 4]
Figure 112021053922817-pat00005
상기한 [수학식 1] 및 [수학식 4]로부터, 표면장력의 비율은 이하의 [수학식 5]와 같이 나타낼 수 있다.
[수학식 5]
Figure 112021053922817-pat00006
더 상세하게는, FL/FU가 >> 1이면 상부챔버(13)의 용액이 하부챔버(14)로 완전히 배출되고, 이때, FL 및 FU는 주로 챔버의 크기와 모양에 의해 영향을 받으며, 각각 1/(DB - DT) 및 1/DT에 비례한다.
이는 FL/FU ~ DT/(DB - DT)의 관계로 이어지며, 따라서 FL/FU >> 1에 의해 완전한 배출을 위해서는 DT/(DB - DT)가 충분히 커야 하고, 이는 DT와 DB - DT가 각각 상대적으로 크고 작아야 함을 의미하며, 이러한 관계는 도 8a의 그래프에 표시된 결과와 정량적으로 일치한다.
또한, 중력은 부분적으로 배출을 도우며, 즉, ρ와 σ는 각각 용액의 밀도와 표면장력이고 g는 중력이라 할 때 결합수(Bond number) Bo = ρgDT 2/σ이고, 중력 대 표면장력의 비율은 DT가 증가함에 따라 0.1에서 2.2로 증가하며, 따라서 DT가 증가함에 따라 중력이 배출에 더 도움을 준다.
따라서 상기한 바와 같은 내용으로부터 상부챔버(13)에서 하부챔버(14)로 유체가 완전히 이송되도록 하는 최적의 직경비율(DT/(DB - DT))을 결정할 수 있으며, 즉, 본 발명자들은, 실험을 통해 DT/(DB - DT) 값이 1.9 이상이면 접촉후 상판 챔버에서 유체가 잔량없이 모두 전달됨을 확인하였다.
여기서, 상판챔버의 하부만 뚫려있고 상부는 막혀있는 구조에서는 상판챔버의 직경과 하판챔버의 직경비율을 상기한 바와 같이 최적값으로 조절하더라도 상판챔버에 유체가 남아있으나, 본 발명의 실시예에 따른 유체저어 칩(10)은, 상부챔버(13)의 상하부가 모두 뚫려있는 양면 개방형 구조로 형성되어 접촉한 유체의 표면장력과 중력에 의해 별도의 펌프나 밸브 등의 구성이 필요 없이 유체가 상부챔버(13)에서 하부챔버(14)로 자동으로 이송되며, 이때, 상부챔버(13)의 직경과 하부챔버(14)의 직경비율(DT/(DB - DT))을 1.9 이상으로 형성함으로써, 상부챔버(13)에 유체가 남지 않고 모두 하부챔버(14)로 전달됨을 실험적으로 확인하였다.
다음으로, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 액체가 하부챔버(14)로 이동된 후 혼합을 위해 상부챔버가 하부챔버로 반복하여 삽입되어 혼합이 이루어지며, 이러한 반복 횟수가 증가될수록 상부챔버(13)에 있던 자기 비드가 하부챔버(14)의 용액에 균일하게 혼합된다.
여기서, 본 발명자들은, 혼합효율(mixing efficiency)에 미치는 영향을 파악하기 위해 상부챔버(13)의 삽입속도(U)와 깊이(z)를 변경하여 실험을 진행하였으며, 즉, 도 8c의 좌측 그래프를 참조하면, 빠른 혼합을 위해 높은 U 값이 중요함을 나타내고 있다.
예를 들면, 6개의 접점에서 혼합효율은 U = 18mm/s에서 > 90%에 도달한 반면 효율은 U = 2mm/s에서 55% 미만이었고, 대조적으로, 삽입깊이 z는 혼합효율에 미치는 영향이 작게 나타났으며, 즉, 도 8c의 오른쪽 그래프에 나타낸 바와 같이, h를 챔버의 높이라 할 때 6개의 접점에서 혼합효율은 z/h가 0.3에서 0.9까지 변화하는 것에 관계 없이 약 90%로 나타났다.
또한, U 및 z/h가 혼합효율에 미치는 영향을 더 잘 이해하기 위해, 본 발명자들은 하부챔버(14)의 압력(P)을 측정하였으며, 즉, 도 8d를 참조하면, 도 8d는 z/h = 0.3에서 두 U값(1 및 18mm/s)에 대한 압력(P) 분석결과(profile)를 나타내고 있다.
여기서, 상태 a, b 및 c는 각각 상부챔버(13)의 전진(advance), 정지(halt) 및 후퇴(retreat) 기간에 해당하고, 상태 a와 c는 U = 1mm/s에 대하여 동일한 거리를 이동하는 데 더 많은 시간이 걸렸으므로 U = 18mm/s보다 U = 1mm/s인 경우가 더 길게 나타냈다.
아울러, 상태 b는 두 경우 모두 3.5초 동안 유지되었으며, P는 U = 1mm/s보다 U = 18mm/s에 대하여 더 넓은 범위에 걸쳐 변화하여 U = 18mm/s에서 혼합효율을 향상시키는 것으로 나타났고, 특히, 상태 a와 c에서 P는 U = 18mm/s에 대하여 큰 진폭으로 변동한 반면, P는 U = 1mm/s에 대하여 작은 진폭으로 점차적으로 변화하였고, 상태 b에서 P는 양(positive)의 값으로 유지되었다.
이러한 결과는 표면장력과 관성(inertia)의 영향을 받는 것이고, 웨버 수(Weber number) We(관성 대 표면장력의 비율)로 설명할 수 있으며, 즉, 상부챔버(13)가 움직일 때 U = 1mm/s에서 We는 0.05이고 U = 18mm/s에서 We는 13이며, 이는 U = 18 mm/s에 대한 P의 더 큰 변동이 관성효과에 기인한 것임을 시사한다.
더 상세하게는, 본 발명자들은, 혼합효율을 측정하기 위해 비드 직경이 1㎛인 자기비드 용액(ChargeSwitch, Invitrogen) 5μL를 사용하여, 비드를 50μL PBS 완충액에 담가 얻어진 55μL의 혼합물을 상부챔버(13)에 수용한 후, 100μL PBS로 채워진 하부챔버(14)와 부분적으로 접촉시켰으며, 접촉(혼합) 중에는 실체현미경(u-SZ40, Olympus)과 카메라(u-Nova20C, Novitec)를 사용하여 40fps의 속도로 혼합 과정을 캡처하였다.
이후, 캡처된 이미지를 Octave 소프트웨어를 사용하여 분석하고 이하의 [수학식 6]을 이용하여 혼합효율(η)을 산출하였다.
[수학식 6]
Figure 112021053922817-pat00007
여기서, I는 정규화된 그레이스케일 값(normalized gray scale value)이고, Ii는 캡처된 이미지의 i번째 픽셀에 있는 각 픽셀의 값이며, Ir은 완전혼합 상태(fully mixed state)에서 기준이미지(reference image)의 정규화된 값이고, N은 픽셀 수이며, I0i는 초기상태, 즉, 혼합 없이 i번째 픽셀에서 정규화된 값을 각각 의미한다.
따라서 사전 혼합조건(pre-mixed condition)에 대하여 η = 0%이 얻어지고, 완전 혼합조건(completely mixed condition)에 대하여 η = 100%이 얻어지며, 자기 비드의 수집은 또한 상기한 [수학식 6]에 의해 정량화될 수 있다.
계속해서, 상태 b에 있어서, 상부챔버(13)의 움직임이 없으면 표면장력만이 P를 생성하고, P의 양의 값은 상부챔버(13)와 하부챔버(14)의 경계면에서 메니스커스의 유효 형태(effective shape)가 볼록함을(convex) 의미한다.
즉, 도 10을 참조하면, 도 10은 상부챔버(13)의 삽입 깊이에 따른 하부챔버(14)에서의 압력의 변화를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
여기서, 도 10에 있어서, 도 10a는 U를 18mm/s로 고정하고 z/h를 0.3과 0.9로 변경하여 각각 측정된 압력 프로파일이고, 도 10b는 하부챔버(14)에서의 최대 압력을 각각 나타내고 있다.
도 10에 나타낸 바와 같이, U를 18mm/s로 고정하고 z/h를 0.3과 0.9로 변경했을 때 P는 두 z/h의 경우에 대하여 거의 유사한 값으로 변경되었고, 이는 유효 메니스커스(effective meniscus)가 z에 의해 크게 영향받지 않음을 나타낸다.
다음으로, 도 8e를 참조하면, 도 8e는 비드 조작 과정을 나타내는 도면으로, 비드의 수집, 운반 및 혼합을 포함한 비드 조작은 RNA 분리 및 rRT-PCR 프로세스를 위한 칩의 또 다른 중요한 기능이다.
도 8e에 나타낸 바와 같이, 시간 t = 0s에서 비드를 수집하기 위해 팁(22)이 아래로 이동하고 자기 비드가 들어있는 하부챔버(14)의 메니스커스와 접촉된 후, t = 1s에서 자석이 팁(22) 내부로 이동되어 비드에 자기력을 가하고 비드를 수집한다.
이때, 수집은 45초도 채 걸리지 않았고, t = 45 ~ 60초 동안 팁(22)은 비드를 새로운 챔버로 옮기고 혼합하였으며, 특히, 팁(22)과 자석이 수직으로 이동하고 하판(12)이 회전하여 팁(22)과 새 챔버를 쌍으로 정렬하였고, 그 후, 팁(22)이 새 챔버의 메니스커스에 접촉하고 자석이 별도로 위로 이동하여 팁(22)의 자력을 제거하여 비드를 챔버 내로 방출한 다음, 팁(22)의 반복된 수직 스윙에 의해 효과적으로 비드를 혼합하였다.
계속해서, 도 8f를 참조하면, 도 8f는 열순환(thermal cycle) 과정 동안 챔버 B5와 알루미늄 블록 내의 액체의 온도 프로파일을 나타내는 도면이다.
즉, 핵산의 성공적인 증폭을 위해서는 정확하고 빠른 열순환이 필수적이며, 도 8f에 나타낸 바와 같이, 변성 및 어닐링/연장에 대한 설정점 온도는 각각 95℃ 및 60℃ 이고, 변성 및 어닐링/연장 단계 동안의 온도는 0.2℃ ~ 0.3℃의 높은 정밀도(측정온도의 표준편차의 평균)와 0.1℃ 및 0.2℃의 높은 정확도(설정점과 측정된 평균온도의 차이)로 각각 측정되었다.
더 상세하게는, 도 11을 참조하면, 도 11은 열순환 동안 챔버 내부의 온도변화에 대한 분석결과를 나타내는 도면이다.
여기서, 도 11에 있어서, 도 11a는 PCR 챔버의 온도 균일성에 대한 측정결과를 나타내는 도면이고, 도 11b는 어닐링/확장 과정 동안 온도 균일성을 나타내는 PCR 챔버의 열화상 이미지이며, 점선이 PCR 챔버의 경계선이고, 도 11c는 가열블록과 액체의 온도를 측정한 결과를 각각 나타내는 도면이다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 액체의 가열 및 냉각률(heating and cooling rate)은 각각 25μL의 부피에서 2.8 및 2.5℃/s였고, 결과적으로 40 PCR 사이클 동안 총 16분의 램핑시간이 발생하였으며, 이에 비해 기존의 벤치탑 사이클러의 경우는 35분이 소요되었다.
계속해서, 본 발명자들은, 바이러스 탐지에 대한 높은 감도를 유지하면서 칩의 작동시간을 줄이기 위해 몇 가지 파라미터를 특정하였으며, 이하의 설명에서는, 별도의 언급이 없는 한 10분의 용해시간(lysis time), 30초의 어닐링/연장 주기(annealing/extension period)(TAE), 15초의 변성주기(denaturation period)(TD) 및 70μL의 바이러스 샘플을 사용하여 35 사이클의 PCR 프로세스가 수행되었고, 칩의 모든 단계(도 6의 1 내지 10 단계) 동안, 하나의 파라미터 값을 변경했을 때 다른 파라미터는 고정된 상태로 유지되었다.
첫째로, 바이러스 탐지 민감도에 미치는 영향을 평가하기 위해 용해시간을 변경하였고, 용해과정(1 단계) 동안 상부챔버(13)의 연속적인 움직임(18mm/s 속도)에 의해 샘플과 용해액(lysis buffer) 사이의 혼합이 바이러스 샘플의 효과적인 용해를 촉진함을(facilitate) 확인하였다.
즉, 도 12를 참조하면, 도 12는 분석시간의 최적화를 위해 각각의 파라미터를 변경하여 PCR을 수행한 실험결과를 나타내는 도면으로, 35번째 사이클의 형광강도(fluorescent intensities)를 측정한 결과이며, 도 12a는 용해시간 및 세척조건(washing condition)에 따른 영향을 나타내며, 각 세척단계(도 6의 4 ~ 6 단계)에 대하여 조건 A, B 및 C에서 버퍼 부피는 각각 100, 200 및 100μL(각 챔버당) 이었다.
또한, 도 12b는 어닐링-연장 시간(annealing-extension time)(왼쪽) 및 변성시간(denaturation time)(오른쪽)이 PCR 증폭에 미치는 영향을 나타내고, 도 12c는 PCR 동안 형광의 변화를 각각 나타내며, 주기 임계값(cycle threshold ; CT)의 표준곡선(standard curve)을 나타내고 있다.
더 상세하게는, 도 12a의 좌측 그래프에 나타낸 바와 같이, 용해시간을 10분에서 5분으로 변경한 경우 PCR 증폭(단계 10)의 형광강도는 2% 감소하였고, 용해시간이 더 감소하면 강도가 크게 감소하여 검출감도가 감소하였으며, 반면, 세척조건은, 도 12a의 우측 그래프에 나타낸 바와 같이, 형광강도에 미치는 영향이 적음을 확인할 수 있다.
이때, 세가지 세척과정에 있어서, 높은 RNA 순도를 보장하기 위해 세가지 유형의 세척액(wash buffer)이 사용되었고(도 6의 단계 4 ~ 6), 각 세척단계는 도 8e에 나타낸 바와 같이 하여 수행되었으며, 각 단계에 대하여, 조건 A 및 B에서 버퍼 부피는 각각 100 및 200μL이었고, 조건 C에서는 각 챔버에 100μL의 버퍼를 사용하여 두 번의 세척을 위해 2개의 챔버가 사용되었다.
그 결과, 조건 C가 가장 높은 형광강도를 나타내었으나, 칩 구조가 더 복잡하고(세척공정을 위한 총 6개의 챔버) 신호강도의 현저한 개선이 없이 처리시간의 증가가 요구되어, 이에, 본 발명자들은, 세척과정을 위해 조건 B를 선택하였다.
또한, 본 발명자들은, 도 12b에 나타낸 바와 같이, rRT-PCR에 대하여 TAE와 TD를 변경하고 35번째 사이클이 끝날 때 형광강도에 미치는 영향을 분석하였으며, 그 결과, TAE를 40초에서 20초로 변경하면 형광강도가 24%까지 완만하게 감소하였으나, TAE를 40초에서 10초로 변경하면 신호강도가 73% 감소함을 확인하였다.
마찬가지로, TD를 15초에서 10초로 줄이면 강도가 6%까지 약간 감소한 반면, 추가적인 TD의 변화는 실질적으로 강도를 감소시켰으며, rRT-PCR의 40번째 사이클의 경우(도 6의 10 단계), TAE가 40초에서 20초로 변경되고 TD가 15초에서 10초로 변경된 결과 감지감도를 크게 저하시키지 않고 총 사이클 시간이 57분에서 40분으로 17분 단축되었다.
다음으로, 본 발명자들은, 용해시간 5분, TAE 20초, TD 10초의 조건에서 PCR 효율과 LOD를 평가하였으며, 표준곡선을 생성하기 위해 cDNA 템플릿(template)의 10배 연속희석(10-fold serial dilution)을 사용하여 칩에서 PCR(도 6의 10 단계)을 수행하였다.
즉, 도 12c를 참조하면, 도 12c는 서로 다른 카피 수(copy number)의 템플릿 cDNA를 사용하여 PCR을 수행한 경우의 형광강도의 변화를 나타내고 있으며, 즉, 본 실시예에 있어서, 32 사이클의 주기 임계값(CT)을 가지는 cDNA 템플릿을 사용하여 1,400 복제/반응(copy/reaction) 만큼 낮은 바이러스 유전자를 검출 할 수 있는 반면, 음성 대조군(negative control)(표적 없음)의 CT 값은 40주기 이상이었다.
칩에서 수행된 PCR의 표준곡선은 카피 수와 CT값(도 12c에 삽입된 그래프) 사이에 선형관계(R2 = 0.95)를 나타내었고, 본 발명의 실시예에서 PCR 효율은 93.1%, LOD는 26 복제/반응을 각각 나타내었으며, 이러한 결과는 PCR 효율이 96.4%이고 LOD가 14 복제/반응인 기존의 벤치탑 사이클러의 결과와 유사한 것이다.
다음으로, 본 발명자들은, 임상 검체에서 바이러스의 신속한 검사능력을 검증하기 위해, 인플루엔자 A 바이러스의 가변 역가를 포함하는 10개의 임상 샘플에 대한 평가를 수행하였다.
즉, 도 13을 참조하면, 도 13은 본 발명의 실시예에 따른 유체제어 칩(10)을 이용한 바이러스 검출결과와 기존의 방식으로 수행된 결과를 각각 비교하여 나타낸 도면이다.
여기서, 도 13에 있어서, 도 13a는 각 처리과정의 시간 및 온도 측정결과를 나타내는 도면이고, 도 13b는 인플루엔자 A에 바이러스에 양성인 10개의 샘플에 대하여 본 발명의 실시예에 따른 유체제어 칩(10)과 기존의 벤치탑 사이클러를 이용하여 각각 얻어진 PCR CT값을 비교하여 나타낸 도면이다.
더 상세하게는, 본 발명자들은, 미리 정의된 사이클링 조건에서 77분 동안 본 발명의 실시예에 따른 유체제어 칩(10)을 통하여 자동화된 방식으로 전체 처리과정을 수행하고, 바이러스 RNA를 수동으로 추출한 다음 별도의 열순환기에서 rRT-PCR이 수행되는 기존의 벤치탑 열순환기를 사용하여 얻어진 결과와 비교하였다.
그 결과, 도 13b에 나타낸 바와 같이, 샘플번호 3을 제외한 모든 샘플에 대하여 유사한 CT값을 나타내었으며, 샘플번호 3의 경우는 기존의 벤치탑 사이클러가 더 높은 CT값을 제공했으나, 3번 시료의 경우, 수동으로 RNA 추출을 반복했을 때 사이클러의 CT값(20.8)이 본 실시예의 유체제어 칩(10)과 유사하게 나타났다.
이러한 결과는 PCR 단계 이전의 수동 RNA 추출에 인적 오류(human error)가 개입된 것으로 추정될 수 있으며, 이는 종래의 바이러스 유전자에 대한 분자진단에 영향을 미칠 수 있다.
또한, 바이러스 RNA를 검출하기 위해 열 사이클러에 샘플을 수동으로 분리하고 로드하는 여러 단계에서 오염이 발생할 수 있으나, 이와 반대로, 본 발명의 실시예에 따른 유체제어 칩(10)은 모든 단계가 사람의 개입 없이 수행되는 자동화된 칩으로 구성되므로, 상기한 바와 같이 인적 오류나 오염 등의 문제 발생이 미연에 방지될 수 있는 장점을 가지는 것이다.
상기한 바와 같이, 본 발명에서는, 바이러스 샘플에서 RNA 분리 및 실시간 역전사 PCR(rRT-PCR)을 포함하는 바이러스 검출의 전체 과정이 자동화된 방식으로 정밀하게 제어되고 수행되도록 구성되는 PCR 검사용 유체제어칩(10)을 제시하였으며, 그것에 의해, 기존의 플랫폼에 비해 다음과 같은 장점을 가진다.
즉, 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)은, 시약 및 마그네틱 비드의 운반, 혼합 및 세척을 포함하는 여러 단계를 온칩 밸브 및 펌프 없이 간단하고 자동화된 방식으로 제어할 수 있고, 개방형 챔버의 설계를 통해 미세유체 장치에서 일반적으로 발생하는 기포형성 및 시약증발과 관련된 문제에 영향을 받지 않으며, 분리가능한 챔버 설계로 시약 및 샘플의 교차오염을 방지할 수 있고, 작은 크기로 인해 기존의 미세유체 장치에서 제시되지 못했던 충분히 많은 양의 샘플과 PCR 시약(각각 70 및 25μL)을 수용할 수 있는데 더하여, 히터 및 광검출기가 통합되어 단시간(총 77분의 분석시간) 내에 고감도(LOD 26 복제/반응)의 rRT-PCR을 통해 바이러스 감염을 정량화하고 감지할 수 있는 실시간 검사시스템을 용이하게 구현 가능한 장점을 가지는 것이다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)은, 분리가능한 챔버를 구비한 재사용 가능한 상판 및 하판을 포함하여 구성되는 것에 의해 미리 적재된(perloaded) 시약을 구비하여 일회용으로 설계될 수 있다.
아울러, 이러한 방식으로 칩에 샘플만 로드하여 즉시 사용할 수 있고, 구조적 단순성으로 인해 챔버의 수와 부피(수백 마이크로 리터)에 맞게 확장할 수 있으므로, 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩(10)을 이용하면 특별히 숙련된 인력이 필요하지 않으며, 다양한 바이러스 검사 및 현장 진료에서 샘플 대 응답 검출(sample-to-answer detection)에 사용될 수 있다.
따라서 상기한 바와 같이 하여 본 발명의 실시예에 따른 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템을 구현할 수 있으며, 그것에 의해, 본 발명에 따르면, 수직으로 이동가능한 상판과 회전 가능한 하판을 통하여 상부챔버에서 하부챔버로 유체가 표면장력과 중력만으로 자동적으로 완전히 이송되고, 온도조절을 위한 열전히터(THU) 및 광검출을 위한 광전자 증배관(PMT)이 단일의 칩에 집적화된 구조로 형성되어 검체의 준비로부터 실시간 역전사 PCR(rRT-PCR) 까지의 과정이 단일의 칩을 통해 자동으로 수행되는 것에 의해 간단한 구성으로 신속하고 정확한 검사가 가능한 동시에, 전체적인 검사시스템의 구성을 간소화하고 비용을 절감할 수 있도록 구성되는 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템이 제공됨으로써, PCR 검사를 위한 미세유체 용액의 펌핑, 부피정량 및 혼합 과정이 여러 가지 복잡한 외부 제어기와 내부 밸브 등에 의해 제어됨으로 인해 전체적인 구성이 복잡해지고 고가의 부품이 사용되어 비용이 증가하게 되는 문제가 있었던 종래기술의 미세유체 제어용 칩들의 문제점을 해결할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기한 바와 같이 단일의 칩을 통해 검사대상이 포함된 미세유체의 준비와 온도제어 및 검출을 모두 수행할 수 있으므로 기존에 비해 간단한 구성으로 신속하고 정확한 검사가 가능한 동시에, 전체적인 검사시스템의 구성을 간소화하고 비용을 절감할 수 있도록 구성되는 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템이 제공됨으로써, 감염병과 같은 질병의 감염 여부를 검사하기 위해 세균이나 바이러스 등의 DNA를 증폭하여 특정 표적 유전물질을 검출하는 중합효소 연쇄반응(PCR) 검사시 유전자의 추출, 증폭, 검지에 이르는 일련의 과정 및 각각의 과정을 제어하기 위한 구성들이 매우 복잡함으로 인해 전체적인 시스템의 구성 및 비용이 증가하게 되는 문제가 있었던 종래기술의 PCR 검사시스템 및 방법들의 문제점을 해결할 수 있다.
이상, 상기한 바와 같은 본 발명의 실시예를 통하여 본 발명에 따른 PCR 검사용 유체제어칩 및 이를 이용한 PCR 검사시스템의 상세한 내용에 대하여 설명하였으나, 본 발명은 상기한 실시예에 기재된 내용으로만 한정되는 것은 아니며, 따라서 본 발명은, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 설계상의 필요 및 기타 다양한 요인에 따라 여러 가지 수정, 변경, 결합 및 대체 등이 가능한 것임은 당연한 일이라 하겠다.
10. PCR 검사용 유체제어칩 11. 상판
12. 하판 13. 상부챔버
14. 하부챔버 15. 회전축
16. 리드히터(Lid Heater) 17. 열전히터(THU)
18. LED 19. 필터
20. 광전자 증배관(PMT) 21. 마그네틱 로드
22. 팁 23. 스프링
24. 지지대 31. 수용홈
32. 보강재

Claims (13)

  1. PCR 검사용 유체제어칩에 있어서,
    수직방향으로 이동 가능하도록 이루어지는 상판;
    상기 상판의 하부에 미리 정해진 일정 간격을 두고 이격되어 배치되고 회전 가능하도록 이루어지는 하판;
    유체를 수용하기 위해 상기 상판에 형성되는 복수의 상부챔버;
    유체가 수용되고 상기 상기 상판의 하강에 의해 상기 상부챔버가 내측으로 삽입될 수 있도록 각각의 상기 상부챔버에 대응하여 상기 하판에 형성되는 복수의 하부챔버;
    상기 하판을 회전 가능하게 지지하는 회전축;
    각각의 상기 상부챔버 및 상기 하부챔버에 수용된 유체의 온도조절을 위한 온도조절부;
    상기 하판과 상기 온도조절부 사이의 간격을 유지하기 위해, 상기 회전축에 형성된 지지대와 상기 하판 사이에 배치되는 스프링을 포함하여 이루어지는 간격유지부;
    광검출을 위한 빛을 조사하는 광원부;
    상기 광원부로부터 조사된 광을 검출하기 위한 광검출부;
    상기 상부챔버에 수용된 유체 내의 자성물질을 수집하기 위해 상기 상판의 상부에 형성되는 마그네틱 로드(magnetic rod);
    단부에 영구자석을 삽입할 수 있도록 속이 빈 돔(dome)이 형성되어 상기 마그네틱 로드의 하부에 배치되는 팁;
    상기 상판과 상기 하판 및 상기 마그네틱 로드의 이동을 위한 동력을 전달하는 구동부; 및
    상기 유체제어칩의 전체적인 동작을 제어하는 제어부를 포함하여 구성되며,
    상기 상부챔버는 상하 양단이 개방된 중공형 실린더의 형태로 형성되고,
    상기 하부챔버는 상단만 개방된 형태로 형성되며,
    미리 정해진 비율에 따라 상기 상부챔버와 상기 하부챔버의 직경을 형성하는 것에 의해 상기 상판의 상하이동과 표면장력에 의해 유체가 상기 상부챔버로부터 상기 하부챔버로 남김없이 완전하게 이동될 수 있도록 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 검사용 유체제어칩.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 상부챔버 및 상기 하부챔버는,
    상기 상판 및 상기 하판에 각각의 상기 상부챔버 및 상기 하부챔버가 수용되는 수용홈을 각각 형성하고, 상기 수용홈에 상기 상부챔버 및 상기 하부챔버가 각각 결합되도록 구성됨으로써,
    각각의 상기 상부챔버 및 상기 하부챔버가 상기 상판 및 상기 하판으로부터 분리, 결합이 가능하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 검사용 유체제어칩.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 유체제어칩은,
    각각의 상기 수용홈 주변을 덮도록 형성되는 보강재를 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 검사용 유체제어칩.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 상부챔버 및 상기 하부챔버는,
    상기 상부챔버의 내경을 DT라 하고, 상기 하부챔버의 내경을 DB라 할 때, 상기 상부챔버와 상기 하부챔버의 직경비율 DT/(DB - DT)가 1.9 이상으로 형성되도록 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 검사용 유체제어칩.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 온도조절부는,
    상기 상판의 일측에 배치되는 리드히터(Lid Heater); 및
    상기 하판의 상기 리드히터에 대응되는 위치의 하부에 미리 정해진 일정 간격으로 이격되어 배치되며, 상기 하부챔버가 내측에 수용되도록 속이 빈 원통형 실린더의 형태로 형성되고, 측면에는 상기 광원부로부터 조사된 광이 입사될 수 있도록 관통공이 형성되며, 하부에는 히트싱크가 구비되는 열전히터(Thermoelectric Heater Unit ; THU)를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 검사용 유체제어칩.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 온도조절부는,
    상기 열전히터(THU)와 상기 히트싱크 및 상기 리드히터의 온도를 각각 측정하고 모니터링하기 위한 복수의 온도센서를 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 검사용 유체제어칩.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 광원부는,
    LED를 포함하는 광원과 여기필터(excitation filter) 및 집광렌즈(lens)가 원통형의 케이스 내에 각각 구비되어 일체로 형성되고, 상기 열전히터(THU)의 측면에 배치되어 상기 열전히터(THU)의 내측에 수용된 상기 하부챔버 내의 유체에 검출을 위한 광을 조사하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 검사용 유체제어칩.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 광검출부는,
    상기 광원부로부터 조사되어 상기 열전히터(THU)의 내측에 수용된 상기 하부챔버 내의 유체를 통과한 광을 검출하기 위해 상기 리드히터의 상단에 각각 배치되는 방출필터(emission filter) 및 광전자 증배관(photomultiplier tube ; PMT)을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 검사용 유체제어칩.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 구동부는,
    상기 상판의 상부에 연결되는 지지축을 통하여 상기 상판의 상하운동을 위한 동력을 전달하는 제 1 스텝모터;
    상기 회전축에 연결되어 상기 하판의 회전운동을 위한 동력을 전달하는 제 2 스텝모터; 및
    상기 마그네틱 로드의 상하이동을 위한 동력을 전달하는 제 3 스텝모터를 포함하여 구성됨으로써,
    상기 상판과 상기 마그네틱 로드의 수직운동 및 상기 하판의 회전운동이 각각 독립적으로 제어되도록 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 검사용 유체제어칩.
  11. 제 6항에 있어서,
    상기 PCR 검사용 유체제어칩은,
    상기 상부챔버 및 상기 하부챔버에 유체를 각각 주입하고, 상기 상판의 상하이동 및 상기 하판의 회전동작에 의해 상기 상부챔버와 상기 하부챔버를 정렬시킨 다음, 상기 상부챔버와 상기 하부챔버가 접촉되도록 상기 상판을 하강시켜 상기 상부챔버의 유체를 상기 하부챔버에 전달하고, 상기 상판의 상하이동을 반복하여 각각의 유체를 혼합하며,
    그 후, 상기 상판을 더욱 하강시켜 혼합유체가 수용된 상기 하부챔버가 상기 열전히터에 삽입되도록 하여 온도제어 및 광검출이 수행되고,
    다시 상기 상판을 상승시키면 상기 스프링에 의해 상기 하판이 원위치로 복귀되도록 구성됨으로써,
    바이러스 샘플에서 RNA를 분리하는 검체 준비과정부터 실시간 역전사 PCR(real-time reverse transcription polymerase chain reaction ; rRT-PCR) 까지의 처리과정이 단일의 칩을 통해 자동으로 수행될 수 있도록 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 검사용 유체제어칩.
  12. PCR(Polymerase Chain Reaction) 검사시스템에 있어서,
    PCR 검사를 위한 처리가 수행되는 검진부; 및
    상기 검진부의 검진결과에 근거하여 질병의 유무를 판단하는 처리가 수행되는 분석부를 포함하여 구성되고,
    상기 검진부는,
    청구항 1항 내지 청구항 3항, 청구항 5항 내지 청구항 11항 중 어느 한 항에 기재된 PCR 검사용 유체제어칩을 이용하여 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 검사시스템.
  13. 청구항 1항 내지 청구항 3항, 청구항 5항 내지 청구항 11항 중 어느 한 항에 기재된 PCR 검사용 유체제어칩을 이용한 PCR 검사방법에 있어서,
    상기 유체제어칩의 상판 및 하판에 상부챔버 및 하부챔버를 각각 삽입하고, 바이러스 샘플, 용해액(lysis buffer), 자기비드(magnetic beads), 세척액(wash buffer) 및 용출액(elution buffer)을 포함하는 PCR 검사를 위한 유체들을 각각의 챔버에 피펫팅(pipetting)하는 처리가 수행되는 준비단계;
    미리 정해진 시간 동안 상기 상판의 상하 이동을 반복하여 바이러스 샘플이 수용된 제 1 상부챔버를 용해액이 수용된 제 1 하부챔버와 접촉시키고 상기 바이러스 샘플을 용해시키는 처리가 수행되는 용해단계;
    상기 상판의 상하 이동과 상기 하판의 회전에 의해 각각의 챔버를 정렬시킨 후, 상기 상판을 하강시켜 용해된 상기 바이러스 샘플이 수용된 상기 제 1 하부챔버와 자기비드가 수용된 제 2 상부챔버를 미리 정해진 시간 동안 접촉시키는 것에 의해 용해된 상기 바이러스 샘플에 존재하는 바이러스 RNA와 상기 자기비드를 결합시켜 RNA-비드 복합체를 형성하는 처리가 수행되는 결합단계;
    상기 유체제어칩의 팁을 상기 RNA-비드 복합체가 수용된 상기 제 1 하부챔버와 미리 정해진 시간 동안 접촉시키는 것에 의해 상기 팁에 상기 RNA-비드 복합체를 수집하는 처리가 수행되는 수집단계;
    상기 RNA-비드 복합체가 수집된 상기 팁을 세척액이 수용된 제 2 하부챔버로 이동시켜 상기 팁에 수집된 상기 RNA-비드 복합체를 세척하고, RNA의 순도를 높이기 위해 미리 정해진 설정에 따라 서로 다른 챔버에서 세척과정을 반복하는 처리가 수행되는 세척단계;
    RNA의 용출을 위해 상기 팁을 용출액이 수용된 제 3 하부챔버로 이동시키고, 상기 하판을 회전시켜 상기 제 3 하부챔버를 상기 유체제어칩의 리드히터 및 열전히터(THU)와 정렬시킨 다음, 상기 상판을 하강시켜 상기 제 3 하부챔버를 상기 열전히터(THU)와 접촉시킨 후 미리 정해진 시간 동안 미리 정해진 온도로 유지하여 상기 바이러스 RNA를 용출시키는 처리가 수행되는 용출단계;
    상기 바이러스 RNA가 용출된 상기 제 3 하부챔버를 PCR 시약이 수용된 제 3 상부챔버와 접촉시켜 상기 제 3 하부챔버에 상기 시약을 혼합하는 처리가 수행되는 시약혼합단계; 및
    상기 하판을 회전시켜 시약이 혼합된 상기 제 3 하부챔버를 상기 리드히터 및 상기 열전히터(THU)와 각각 정렬시키고, 상기 상판을 하강시켜 상기 제 3 하부챔버를 상기 열전히터(THU)와 밀착되도록 하고 미리 정해진 시간 동안 미리 정해진 온도로 유지하여 상보적(complementary) DNA(cDNA)를 합성한 후, 미리 정해진 시간, 온도 및 열주기(thermal cycle)로 초기 DNA 변성(denaturation)을 가지는 DNA 증폭을 행하는 실시간 역전사 PCR(rRT-PCR) 처리가 수행되는 PCR 수행단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 검사방법.
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