JP2005204578A

JP2005204578A - 抽出装置

Info

Publication number: JP2005204578A
Application number: JP2004015089A
Authority: JP
Inventors: Keiichi Fujimoto; 圭一藤本
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 2004-01-23
Filing date: 2004-01-23
Publication date: 2005-08-04

Abstract

【課題】短時間で効率よく試料液の核酸などの特定物質を自動的に抽出でき、各抽出カートリッジで良好な加圧エアの導入および圧力開放を行い、確実な抽出とコンタミネーションを防止する。
【解決手段】フィルター部材を備えた抽出カートリッジ11を用い、試料液を加圧し核酸などの特定物質を吸着させるもので、抽出カートリッジ11に加圧エアを導入する加圧エア供給機構４は、エアポンプ43と、複数の抽出カートリッジ11への加圧エアの供給路には加圧エアの供給を個々に開閉する開閉バルブ45と、抽出カートリッジ11の圧力を個々に大気開放する圧力開放弁44ａとを備える。抽出カートリッジ11へ加圧エアを導入してから密閉し、液排出が完了した時点で圧力開放弁44ａを個々に開放し、抽出カートリッジ11内に残存する加圧エアを放出する。
【選択図】図５

Description

本発明は、フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用いて試料液の特定物質例えば核酸を抽出する抽出装置に関し、特に抽出カートリッジへ加圧エアを導入して抽出する抽出加圧に関するものである。

従来の抽出法、例えば核酸抽出法としては、遠心法によるもの、磁気ビーズを用いるもの、フィルターを用いるものなどがある。

フィルターを用いた核酸抽出装置としては、フィルターを収容したフィルターチューブをラックに多数セットし、これに試料液を分注し、上記ラックの底部の周囲をシール材を介してエアチャンバーで密閉して内部を減圧し、全フィルターチューブを同時に排出側より吸引して試料液を通過させて核酸をフィルターに吸着し、その後、洗浄液および溶出液を分注して、同様に減圧吸引して洗浄・溶出するようにした機構が提案されている（例えば、特許文献１参照）。

この抽出装置では次のような問題がある。採取全血のように各試料液の特性が異なる場合に、特許文献１のように全体を同時に吸引するものでは、一部のフィルターチューブの吸引が終了してその抵抗がなくなると、他のフィルターチューブに作用する減圧が小さくなって粘度の高い試料液の処理が終了しない場合が生じる。その減圧容量を増大することは装置の小型化を図る際の障害となり、減圧容積が大きいために減圧を作用させるまでの時間が掛かり、また、液が全部排出されたことの検出が困難で、時間設定が長く、処理効率の向上の障害となる。一方、粘度の低い試料液では、フィルターチューブより勢いよく液が排出されて、泡状の飛沫が隣接するフィルターチューブおよびラックに付着してコンタミネーションを生じ、精度低下を招く問題がある。

特に、全体の真空吸引では、１つの抽出カートリッジへの試料液注入不良、抽出カートリッジの装填ミス等によってエア抵抗がないものがあると、正常な作動を確保することができず、また、多数の抽出カートリッジを個別に吸引する機構を構成することも困難である。

上記のような点より、他の抽出装置として、フィルター部材を備え核酸の吸着・洗浄・回収を行う抽出カートリッジ内に加圧エアを供給し、加圧した各液をフィルター部材を通過させて廃液容器または回収容器に排出するように構成して、処理効率の向上、小型化を図るようにしたものがある（例えば、特許文献２参照）。
特許第２８３２５８６号公報特開２００３−１２８６９１号公報

上記のように抽出カートリッジに加圧エアを供給して加圧抽出する抽出装置では、加圧された液の全量がフィルター部材を通過した際に、残留加圧エアが抽出カートリッジの排出部より液とともに噴出されてミスト状の排出液が飛散して周囲を汚染し、コンタミネーションの原因となる恐れがある。

また、複数の抽出カートリッジに対する加圧エアの導入において、１つの開閉バルブの動作でその導入を行うと、１つの抽出カートリッジの液排出が完了した際に、この抽出カートリッジより加圧エアがリークして他の抽出カートリッジへの加圧エアの導入が不十分となり、所定圧力にまで高めることができずに、抽出条件が異なると同時に抽出が十分に行われずに核酸純度の低下や、次工程における反応性の低下などの弊害が生起する問題がある。

この点からは、各抽出カートリッジに対し個々に開閉バルブを設置して開閉作動することが好適であるが、エアポンプを複数設置することはコンパクト化、コスト面で不利となる。一方、前述の抽出カートリッジでの液排出完了時には、この抽出カートリッジ内に残留している加圧エアを抽出カートリッジの廃液口より噴出することなく開放することで、排出液の飛散防止が図れることに着目した。

しかし、複数の抽出カートリッジに、それぞれ加圧エアを導入し、密閉して液加圧を行い、液排出完了時に加圧エアを開放する際に、一部の抽出カートリッジへの加圧エアの導入と他の抽出カートリッジでの圧力開放とが同時に行えることが、測定精度を確保する上で重要であることが判明した。例えば、各抽出カートリッジへの加圧エアの導入条件は一定とすることが安定した抽出を得る上で重要であり、また、圧力開放は液排出完了と同時でないと効果ないが、全部の抽出カートリッジで同時に液排出が完了するものではない。そして、液排出途中で圧力開放が行われると抽出不足を招き、核酸純度の低下や、次工程における反応性の低下などの弊害が生起する問題がある。

本発明はこのような点に鑑みなされたもので、短時間で効率よく試料液の核酸等の特定物質を抽出できるとともに、各抽出カートリッジで良好な加圧エアの導入および圧力開放が行えるようにした抽出装置を提供することを目的とするものである。

本発明の抽出装置は、フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用い、該抽出カートリッジに特定物質を含む試料液を注入し加圧して該試料液中の特定物質を前記フィルター部材に吸着させる抽出装置において、前記抽出カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構は、エアポンプと、複数の抽出カートリッジへの供給路には加圧エアの供給を個々に開閉する開閉バルブと圧力を個々に開放作動する圧力開放弁とを備えたことを特徴とするものである。

また、本発明の他の抽出装置は、フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用い、該抽出カートリッジに核酸を含む試料液を注入し加圧して該試料液中の核酸を前記フィルター部材に吸着させた後、前記抽出カートリッジに回収液を分注し加圧して前記フィルター部材に吸着した核酸を分離して回収液とともに回収する抽出装置において、前記抽出カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構は、エアポンプと、複数の抽出カートリッジへの供給路には加圧エアの供給を個々に開閉する開閉バルブと圧力を個々に開放作動する圧力開放弁とを備えたことを特徴とするものである。

前記開閉バルブを個別に開閉作動して、複数の前記抽出カートリッジへそれぞれ加圧エアを導入してから密閉し、各抽出カートリッジで液排出が完了した時点で、前記圧力開放弁を個々に開放作動し、該抽出カートリッジ内に残存する加圧エアを放出するのが好適である。

前記加圧エア供給機構は、前記抽出カートリッジの内圧を個別に検出する圧力センサをさらに備え、該圧力センサの検出に基づいて前記圧力開放弁の開放作動を行うことが好ましい。

上記のような本発明によれば、フィルター部材を備えた抽出カートリッジに特定物質、例えば核酸を含む試料液を注入し加圧して特定物質をフィルター部材に吸着させる抽出動作を短時間で効率よく行って試料液の核酸などの特定物質を抽出できる機構をコンパクトに構成することができる。

さらに、加圧エア供給機構は、複数の抽出カートリッジへの供給路に加圧エアの供給を個々に開閉する開閉バルブと圧力を個々に開放作動する圧力開放弁とを備え、個々に抽出カートリッジの圧力開放が行えることにより、一部の抽出カートリッジでの加圧エアの導入・密閉と、他の抽出カートリッジでの圧力開放とが同時に行え、測定精度が確保できる。

特に、抽出カートリッジからの液の排出が終了した時点で圧力開放弁を開放作動して抽出カートリッジ内に残存する加圧エアを放出することにより、抽出カートリッジの排出部より液と共に残存エアが噴出されてミスト状に飛散するのを防止でき、これに起因するコンタミネーションの発生が防止できる。さらに、個々の抽出カートリッジで最適な条件による加圧エアの導入と最適時期の圧力開放とが行え、コンタミネーションの防止とともに確実な抽出作用を得て、安定した核酸などの特定物質の抽出処理が実施でき、核酸純度の低下、次工程における反応性の低下を招くことなく信頼性が高まる。

また、圧力開放弁の開放作動を圧力センサの検出に基づいて行うと、確実に液排出完了時に開放作動させることができる。

以下、本発明の実施の形態を図面に沿って説明する。図１は抽出装置の一つの実施形態にかかる核酸抽出装置のカバーを除去した状態を示す斜視図、図２は核酸抽出装置の概略機構図、図３は搭載機構におけるラックの斜視図、図４はラックの使用状態を示す斜視図、図５は加圧エア供給機構のエア系統図、図６は加圧エア供給機構の制御系統図、図７および図８は加圧制御例のフローチャート図、図９は抽出カートリッジ内圧力の変動を示す図、図１０は抽出動作の工程図、図１１は抽出カートリッジの斜視図である。

一実施形態の核酸抽出装置１の機構を説明する前に、この核酸抽出装置１は、図１１に示すような抽出カートリッジ１１（フィルターカートリッジ）を用いて試料液中の特定物質としての核酸を抽出するものである。この抽出カートリッジ１１は、上端が開口した筒状本体１１ａの底部にフィルター部材１１ｂが保持され、筒状本体１１ａのフィルター部材１１ｂより下方部位はロート状に形成され、下端中心部に細管ノズル状の排出部１１ｃが所定長さに突出形成され、筒状本体１１ａの側部両側に縦方向の突起１１ｄが形成されてなる。上部開口より後述の試料液、洗浄液、回収液が分注され、上部開口より加圧エアが導入され、各液をフィルター部材１１ｂを通して排出部１１ｃより後述の廃液容器１２または回収容器１３に流下排出する。なお、図示の場合、筒状本体１１ａは上部と下部に分割され嵌着する構造となっている。

そして、核酸抽出装置１は基本的に図１０(ａ)〜(ｇ)に示すような抽出工程によって核酸の抽出精製を行う。まず図１０(ａ)工程で、廃液容器１２上に位置する抽出カートリッジ１１に溶解処理された核酸を含む試料液Ｓを注入する。次に図１０(ｂ)工程で、抽出カートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、フィルター部材１１ｂを通して試料液Ｓを通過させ、このフィルター部材１１ｂに核酸を吸着させ、通過した液状成分は廃液容器１２に排出する。

次に図１０(ｃ)工程で抽出カートリッジ１１に洗浄液Ｗを自動分注し、(ｄ)工程で抽出カートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、フィルター部材１１ｂに核酸を保持したままその他の不純物の洗浄除去を行い、通過した洗浄液Ｗは廃液容器１２に排出される。この(ｃ)工程および(ｄ)工程を複数回繰り返してもよい。

その後、(ｅ)工程で抽出カートリッジ１１の下方の廃液容器１２を回収容器１３に交換してから、(ｆ)工程で抽出カートリッジ１１に回収液Ｒを自動分注し、(ｇ)工程で抽出カートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、フィルター部材１１ｂと核酸の結合力を弱め、吸着されている核酸を離脱させて、核酸を含む回収液Ｒを回収容器１３に排出し回収する。

上記抽出カートリッジ１１におけるフィルター部材１１ｂは、基本的には核酸が通過可能な多孔性であり、その表面は試料液中の核酸を化学的結合力で吸着する特性を有し、洗浄液による洗浄時にはその吸着を保持し、回収液による回収時に核酸の吸着力を弱めて離すように構成されてなる。その一例の具体的構成は、特開２００３−１２８６９１号の核酸の分離精製方法に詳述されているように、例えば、上記フィルター部材１１ｂは表面に水酸基を有する有機高分子で構成されている。表面に水酸基を有する有機高分子としては、アセチルセルロースの表面鹸化物が好ましい。アセチルセルロースとしては、モノアセチルセルロース、ジアセチルセルロース、トリアセチルセルロースのいずれでもよいが、特にはトリアセチルセルロースが好ましい。その表面が鹸化処理液（例えば、ＮａＯＨ）との接触により鹸化され、その構造体はアセチルセルロースのままである。表面鹸化処理の程度（表面鹸化度）で表面の水酸基の量（密度）がコントロールでき、水酸基の数が多い方が核酸の吸着効果が高くなる。例えば、トリアセチルセルロースなどのアセチルセルロースの場合には、表面鹸化率が約５％以上であることが好ましく、１０％以上であることがさらに好ましい。アセチルセルロースは多孔性膜が好適である。

前記「核酸を含む試料液Ｓ」は、細胞またはウィルスを含む検体を溶解処理することにより核酸を液中に分散させた溶液に水溶性有機溶媒を添加したものである。例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは植物（またはその一部）、動物（またはその一部）など、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象となる。「溶解処理」は、細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化する試薬（例えば、グアニジン塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む溶液）を含む水溶液で処理するもので、例えば、対象となる試料が全血の場合、フィルター部材１１ｂへの非特異吸着および目詰まりを防ぐために赤血球および各種タンパク質を分解、低分子化し、抽出の対象である核酸を可溶化させるために白血球および核膜の溶解を行う。「水溶性有機溶媒」としてはエタノール、イソプロパノールまたはプロパノールなどが挙げられ、中でもエタノールが好ましい。水溶性有機溶媒の濃度は好ましくは５〜９０重量％であり、さらに好ましくは２０〜６０重量％である。エタノールの添加濃度は、凝集物を生じない程度でできるだけ高くすることが特に好ましい。

「洗浄液Ｗ」は、核酸と一緒にフィルター部材１１ｂに付着した試料液中の不純物を洗い流す機能を有し、核酸の吸着はそのままで不純物を離脱させる組成を有する。主剤と緩衝剤、および必要に応じて界面活性剤を含む水溶液からなる。主剤としてはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール、アセトン等の約１０〜１００重量％（好ましくは２０〜１００重量％、さらに好ましくは４０〜８０重量％）の水溶液が挙げられる。

「回収液Ｒ」は、塩濃度が低いことが好ましく、特には０．５Ｍ以下の塩濃度の溶液、例えば、精製蒸留水、ＴＥバッファ等が使用される。

前記核酸抽出装置１は、図１および図２に示すように、装置本体２に、複数の抽出カートリッジ１１、廃液容器１２および回収容器１３を保持する搭載機構３と、抽出カートリッジ１１に加圧エアを導入する加圧エア供給機構４と、抽出カートリッジ１１に洗浄液Ｗおよび回収液Ｒを分注する分注機構５などを備えてなる。次に各機構３〜５を具体的に説明する。

＜搭載機構＞
搭載機構３は、装置本体２の前方下部に搭載台２１を備え、この搭載台２１上に複数の抽出カートリッジ１１、廃液容器１２および回収容器１３を保持したラック６が載置される。ラック６は、図３にも示すように、スタンド６１とカートリッジホルダー６２と容器ホルダー６３とを備える。

スタンド６１は両側の柱状部６１ａに上下移動可能にカートリッジホルダー６２を保持し、柱状部６１ａの間の下部の底板６１ｂ上に前後移動可能に容器ホルダー６３を保持している。

カートリッジホルダー６２は、前後のプレート材の接合による２分割構造に構成され、横方向に延びる保持部６２ａの両端に上下方向に延びる支持脚６２ｂを備える。その支持脚６２ｂがスタンド６１の柱状部６１ａの上下方向の摺動溝６１ｃに上下移動可能に挿入され、この支持脚６２ｂがスタンド６１に内蔵された付勢部材（不図示）によって上方に付勢されている。保持部６２ａには複数の保持孔６２ｃが並設され、上方より抽出カートリッジ１１が挿入され、抽出カートリッジ１１の筒状本体１１ａの側部両側に形成された突起１１ｄ（図１１参照）の下端がカートリッジホルダー６２内の係合部材（不図示）に係合保持される。係合部材は移動可能で、移動時には突起１１ｄとの係合を解除して抽出カートリッジ１１を全部同時に下方に落下廃棄するようになっている。

このカートリッジホルダー６２は上面の両側にピン孔６２ｄを備え、使用状態では後述の押えピン４９（図１参照）の先端４９ａが係合して下方に押し下げられる。図３のようにカートリッジホルダー６２が上昇した位置では、カートリッジホルダー６２に保持された抽出カートリッジ１１の排出部１１ｃの下端は容器ホルダー６３にセットされた廃液容器１２および回収容器１３より上方に位置しているが、図４に示すように、カートリッジホルダー６２が下降した際には抽出カートリッジ１１の排出部１１ｃが廃液容器１２または回収容器１３の内部に所定量挿入されるように設定されている。

容器ホルダー６３は、横方向に延びる廃液容器保持孔６３ａと回収容器保持孔６３ｂとを平行２列に備え、後側の廃液容器保持孔６３ａに複数の廃液容器１２が、前側の回収容器保持孔６３ｂに複数の回収容器１３がそれぞれ列状に保持される。廃液容器保持孔６３ａおよび回収容器保持孔６３ｂはカートリッジホルダー６２の保持孔６２ｃと等ピッチで等位置に配設され、複数保持された各抽出カートリッジ１１の下方にそれぞれ廃液容器１２および回収容器１３が位置するように設定されている。この廃液容器１２と回収容器１３とは混同防止のためにサイズ、形状等が異なったものを使用するのが好ましい。

上記容器ホルダー６３はスタンド６１に内蔵された不図示の付勢部材によって前方に付勢されている。容器ホルダー６３の容器交換移動（前後動）は、搭載台２１に設置された作動部材３１（図２参照）が、スタンド６１の底板６１ｂに形成された開口を通して、容器ホルダー６３の底部の係合孔（不図示）に係合されて行われる。容器交換モータ３２（ＤＣモータ）の駆動に応じた作動部材３１の移動動作に応じて容器ホルダー６３が後退移動され、カートリッジホルダー６２の下方に回収容器１３が位置するように作動する。非作動時には廃液容器１２がカートリッジホルダー６２の下方に位置するように不図示の付勢部材で付勢されている。上記容器交換モータ３２の作動は位置センサ３３ａ，３３ｂの検出に応じて制御される。

なお、廃液容器保持孔６３ａおよび回収容器保持孔６３ｂは有底に設けられ、廃液容器１２または回収容器１３がセットされていない状態で誤って液が滴下しても外部に流出して汚染が発生しないようになっている。

＜加圧エア供給機構＞
加圧エア供給機構４は、前記搭載機構３のラック６に対して昇降移動する加圧ヘッド４０に１列に並んで設置された複数（図の場合８個）のエアノズル４１と、図５のエア系統図にも示すように、加圧エアを発生するエアポンプ４３と、各エアノズル４１に対し個々に設置されエアポンプ４３による加圧エアの供給を個別に開閉する開閉バルブ４５と、各エアノズル４１に設置され個々の抽出カートリッジ１１の内圧を大気開放する個別の圧力開放弁４４ａと、エアポンプ４３の直下流のエア通路を大気開放するリリーフバルブ４４ｂと、各エアノズル４１に設置され抽出カートリッジ１１の内圧を検出する個別の圧力センサ４６ａと、エアポンプ４３の吐出圧力を検出する圧力センサ４６ｂとを備え、順次抽出カートリッジ１１に加圧エアを送給する。

前記加圧ヘッド４０は、装置本体２の中間フレーム２２と上フレーム２３との間に上下方向に設置されたガイドロッド２４に上下移動可能に保持されている。同様に上下方向に設置されたボールネジ２５に加圧ヘッド４０に設置されたボールナット４０ａが螺合し、昇降モータ４７（パルスモータ）の駆動に伴うタイミングベルト、プーリを介したボールネジ２５の回転により加圧ヘッド４０が、フォトセンサ４８ａ〜４８ｃの検出に伴う制御により昇降移動される。加圧ヘッド４０の両側には押えピン４９を有し、この押えピン４９はスプリング４９ｂで下方に付勢されて上下移動可能で、先端４９ａがカートリッジホルダー６２の上面のピン孔６２ｄに係合して位置を規制して押えるようになっている。

上記押えピン４９は、カートリッジホルダー６２を押圧作動している状態で、後述の洗浄液分注ノズル５１ｗおよび回収液分注ノズル５１ｒの横方向移動と干渉しないように、カートリッジホルダー６２の前側位置を押えるように配設されている。

エアノズル４１は加圧ヘッド４０にそれぞれ上下移動可能にかつ下方に付勢されて設置され、その下方にはエアノズル４１に対応した連通孔４２ａ（図２参照）が開口されたシート状のシール材４２が配設され、加圧ヘッド４０が下降移動した際に、カートリッジホルダー６２にセットされた抽出カートリッジ１１の上端開口を、エアノズル４１先端でシール材４２を介して押圧して密閉し、連通孔４２ａを通して抽出カートリッジ１１内へ加圧エアが送給可能となる。

各エアノズル４１に対し個々に設置された圧力開放弁４４ａは通常は開閉バルブ４５からエアノズル４１に至るエア通路を開通した状態にあり、その圧力開放作動は抽出カートリッジ１１から液が全部排出された加圧終了の判定に応じて行われ、抽出カートリッジ１１内に残留する加圧エアを大気開放して抜き、先端排出部１１ｃからのエア噴出による液飛散を阻止する。なお、上記圧力開放弁４４ａは、図５では３方電磁弁で構成しているが、リリーフバルブ４４ｂと同様に、エア通路から分岐して接続した２方電磁弁で構成してもよい。

また、エアポンプ４３の直下流のリリーフバルブ４４ｂ（図５）は通常は閉状態にあり、全部の開閉バルブ４５が閉じているときに大気開放作動し、連続駆動されるエアポンプ４３による過剰加圧エアを逃がし、連続運転している間に圧力が上昇した加圧エアが開閉バルブ４５の開作動に伴って急激に抽出カートリッジ１１内に供給されるのを防止している。

開閉バルブ４５（図５では２方電磁弁）は個別に開作動されて、エアポンプ４３からの加圧エアを対応するエアノズル４１を経て抽出カートリッジ１１内に導入するようにエア経路が構成されている。

圧力センサ４６ａは各エアノズル４１に設置され、抽出カートリッジ１１の内圧を個別に検出するものであり、検出圧力が加圧上限用の指定圧力（例えば９０ｋＰａ）となったときに、その信号を受けた制御ユニット８（図６参照）により、対応する開閉バルブ４５を閉作動して加圧エアの送給を停止したり、また、抽出カートリッジ１１よりの液排出の完了に伴う圧力低下の検出により加圧終了を判定し、圧力開放弁４４ａを開放作動して、次の工程に移行するなどの制御が行われる。

また、前記圧力センサ４６ａによる抽出カートリッジ１１内の圧力変動より、カートリッジホルダー６２への抽出カートリッジ１１のセットの有無検出、液の有無検出、液量不足の検出、フィルター詰まりの検出を行うようになっている。詳細は図９により後述する。

図６には、１つの抽出カートリッジ１１に対するエア経路の制御系統を示し、エアポンプ４３の駆動制御、圧力開放弁４４ａおよびリリーフバルブ４４ｂの開閉作動、開閉バルブ４５の個別開閉作動が、制御ユニット８からの出力によって行われ、この制御ユニット８には、圧力センサ４６ａ，４６ｂによる検出圧力信号、装置本体２の上部に設置された操作パネル７からの入力操作信号、情報読取器９からの試料液種信号などに応じ、内蔵されたプログラムに基づいて加圧制御される。

そして、上記構成により、開閉バルブ４５を個別に開作動して対応する抽出カートリッジ１１へ加圧エアを導入し、個々の圧力センサ４６ａで検出した内圧が加圧上限用の指定圧力に到達した際に前記開閉バルブ４５を閉作動して加圧状態で密閉した後、加圧により抽出カートリッジ１１のフィルター部材１１ｂを通して各液が排出され、各抽出カートリッジ１１における液排出が完了した加圧終了時点を、各圧力センサ４６ａにより液排出完了時の内圧低下から個別に検出し、圧力開放弁４４ａの圧力開放作動を制御している。また、エアポンプ４３の吐出流量を圧力センサ４６ｂの検出に基づいて補正制御し、開閉バルブ４５の開作動時から所定時間後に抽出カートリッジ１１内に送給した加圧エア量および圧力が一定となるようにしている。

さらに、制御ユニット８は、操作パネル７からの入力操作信号、または、情報読取器９からの試料液種信号などに応じ、前述の加圧上限用の指定圧力を含むその試料液Ｓの種類に最適な処理手順（プロトコル）、設定値で動作するように制御方法を変更する。つまり、処理する試料液Ｓの種類が変わると、加圧制御方法、処理液量、洗浄回数を変更したり、試薬の分注などを追加したりして対応することになる。例えば、操作パネル７のキーボードから検体種などをキー入力することにより、予めプログラミングしてあるプロトコル、設定値などが選択され制御される。また、処理する検体種ごとに使用する試薬が異なり、その試薬に添付されたバーコードのコード、ＩＣチップの情報を情報読取器９により読み取ることにより、予めプログラミングしてあるプロトコル、設定値などが選択され制御される。同様に試料液に対応した情報を記録してあるＣＦカード（メモリーカード）などの記憶素子を情報読取器９により読み取ることにより、プロトコル、設定値の入れ替えを行うようにしてもよい。

上記加圧処理において、複数の抽出カートリッジ１１への加圧エアの導入は、１つずつ順に行う場合と、複数同時に行う場合とがある。順に行う場合は、全部が閉状態にある開閉バルブ４５のうち１つの開閉バルブ４５を開作動し、対応する抽出カートリッジ１１へ加圧エアを導入し、圧力センサ４６ａの検出に応じて該開閉バルブ４５を閉作動するのに続いて、次の１つの開閉バルブ４５を開作動し、対応する抽出カートリッジ１１へ加圧エアを導入し、圧力センサ４６ａの検出に応じて該開閉バルブ４５を閉作動する動作を繰り返して、複数の抽出カートリッジ１１へ加圧エアを導入する。

また、複数同時に行う場合は、全部が閉状態にある開閉バルブ４５のうち複数の開閉バルブ４５を開作動し、各抽出カートリッジ１１へ同時に加圧エアを導入し、各開閉バルブ４５を各圧力センサ４６ａの検出に応じて個別に閉作動して、複数の抽出カートリッジ１１へ加圧エアを導入する。この複数同時加圧の場合に、エアポンプ４３の吐出量を、開作動する開閉バルブ４５の数に応じて制御し、圧力上昇速度を一定とする。このエアポンプ４３の吐出量制御は、例えばＰＷＭ制御で行う。すなわち、エアポンプ４３に印加する電圧を、抽出カートリッジ１１の数に応じて時間比を変動制御（オンオフデューティ制御）し、エアポンプ４３の回転数を加圧数が多いほど高くするように制御して、抽出カートリッジ１１に導入する加圧エアの圧力上昇速度を均一にし、圧力センサ４６ａが加圧上限用の指定圧力を検出して開閉バルブ４５を閉作動した際の、密閉された圧力が一定となるようにする。前述の吐出流量制御も同様に行える。

前記制御ユニット８による加圧制御における液排出完了検出を図７および図８のフローチャートで後述するが、試料液の粘度等が不明な検体加圧時の制御特性（図７）と、洗浄液および回収液加圧時の制御特性（図８）とが異なっている。つまり、検体加圧時には、圧力低下加速度と圧力低下量との両者で判定しているのに対し、洗浄液および回収液加圧時には圧力低下量のみで判定している。

＜分注機構＞
分注機構５は、ラック６上を横方向に移動可能なノズル移動台５０に設置された洗浄液分注ノズル５１ｗおよび回収液分注ノズル５１ｒと、洗浄液ボトル５６ｗに収容された洗浄液Ｗを洗浄液分注ノズル５１ｗに給送する洗浄液供給ポンプ５２ｗと、回収液ボトル５６ｒに収容された回収液Ｒを回収液分注ノズル５１ｒに給送する回収液供給ポンプ５２ｒと、搭載台２１に載置された廃液ボトル５７などを備える。

ノズル移動台５０は、装置本体２の縦壁２６に水平方向に設置されたガイドレール２７に保持されて横方向に移動可能であり、その移動が不図示のノズル移動モータ（パルスモータ）によって各抽出カートリッジ１１上で順次停止し、復帰状態では廃液ボトル５７上に停止するように駆動制御される。洗浄液分注ノズル５１ｗおよび回収液分注ノズル５１ｒは先端が下方に向けて屈曲され、洗浄液分注ノズル５１ｗは切替弁５５ｗを介して洗浄液供給ポンプ５２ｗに接続され、洗浄液供給ポンプ５２ｗは切替弁５５ｗを介して洗浄液ボトル５６ｗに接続され、回収液分注ノズル５１ｒは切替弁５５ｒを介して回収液供給ポンプ５２ｒに接続され、回収液供給ポンプ５２ｒは切替弁５５ｒを介して回収液ボトル５６ｒに接続されている。洗浄液ボトル５６ｗおよび回収液ボトル５６ｒはそれぞれ装置本体２の側部に装着される。洗浄液供給ポンプ５２ｗおよび回収液供給ポンプ５２ｒはシリンジポンプで構成され、そのピストン部材がそれぞれポンプモータ５３ｗ，５３ｒ（パルスモータ）によってセンサ５４ｗ，５４ｒの位置検出に基づいて所定量の洗浄液Ｗおよび回収液Ｒを分注するように駆動制御される。

すなわち、洗浄液Ｗまたは回収液Ｒを分注する場合には、切替弁５５ｗまたは５５ｒを洗浄液ボトル５６ｗまたは回収液ボトル５６ｒ側に切り替え、ポンプモータ５３ｗまたは５３ｒを駆動して洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒのピストン部材を後退作動させ、洗浄液Ｗまたは回収液Ｒを洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒの内部に吸引収容し、続いて切替弁５５ｗまたは５５ｒを洗浄液分注ノズル５１ｗまたは回収液分注ノズル５１ｒ側へ切り替え、ポンプモータ５３ｗまたは５３ｒを駆動して洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒのピストン部材を押込作動させ、廃液ボトル５７に対して通路内のエアを排出するまで洗浄液または回収液を洗浄液分注ノズル５１ｗまたは回収液分注ノズル５１ｒより吐出させた後、洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒの駆動を停止させる。その後、洗浄液分注ノズル５１ｗまたは回収液分注ノズル５１ｒを抽出カートリッジ１１上に移動させてから、洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒの駆動量を制御して所定量の洗浄液Ｗまたは回収液Ｒを抽出カートリッジ１１へ分注するものである。

そして、前述の制御ユニット８（図６参照）は、加圧制御だけでなく、上記のような各機構３〜５の駆動制御を行うものであり、装置本体２の上部に設置された操作パネル７の入力操作に対応し、内蔵されたプログラムに基づいて一連の自動抽出動作を行うように制御する。

上記核酸抽出装置１による抽出動作を具体的に説明する。まず搭載機構３のラック６におけるカートリッジホルダー６２に抽出カートリッジ１１をセットし、容器ホルダー６３に廃液容器１２および回収容器１３をそれぞれセットし、このラック６を装置本体２の搭載台２１に載置して準備を行う。次に、溶解処理された試料液Ｓをピペット等によって各抽出カートリッジ１１に順次注入する。なお、装置１に搭載する前のラック６にセットした後またはセットする前の抽出カートリッジ１１に試料液Ｓを先に注入するようにしてもよい。

その後、操作パネル７の操作によって装置を作動させると、加圧エア供給機構４の昇降モータ４７の駆動によって加圧ヘッド４０が下降移動し、押えピン４９の先端４９ａがカートリッジホルダー６２のピン孔６２ｄに係合して押さえつけて、このカートリッジホルダー６２を下降させて位置を規制すると共に、抽出カートリッジ１１の下端排出部１１ｃを図４のように廃液容器１２内に所定量挿入させて、排出液が飛散等によって外部に漏れないようにする。さらに加圧ヘッド４０が下降移動してシール材４２を介して各エアノズル４１の下端部が抽出カートリッジ１１の上端開口に圧接して密閉する。前記押えピン４９がカートリッジホルダー６２の位置を規制していることで、各抽出カートリッジ１１に対し各エアノズル４１が正確に圧接して確実な密閉が確保できる。

その後、加圧エアの供給が行われるもので、一例の検体加圧制御を図７のフローチャートに基づいて説明する。このフローチャートは、１つの抽出カートリッジ１１に対する制御について示している。加圧開始後、ステップＳ１で開閉バルブ４５が開作動されるとともに、エアポンプ４３が駆動される。そして、対応するエアノズル４１を通して抽出カートリッジ１１にエアポンプ４３からの加圧エアが供給され、圧力センサ４６ａにより圧力が検出され、この検出圧力が設定した上限圧力に到達したか否かを判定する（Ｓ２）。

供給圧力が上限圧力に到達してステップＳ２の判定がＹＥＳとなると、開閉バルブ４５を閉作動し（Ｓ３）、加圧状態で抽出カートリッジ１１への圧力を密閉する。加圧エアが導入された抽出カートリッジ１１では、試料液Ｓは圧力の作用によりフィルター部材１１ｂを通って核酸が吸着保持され、その他の液状成分は下端部の排出部１１ｃより廃液容器１２に排出される。

そして、ステップＳ４およびＳ５で液排出完了か否かを判定する。ステップＳ４では圧力低下加速度が所定値ＸkPa/sec²以上になったか否かを判定するもので、液排出に伴う圧力変動を２回微分して変化をみて、液排出完了時点で内圧が急激に低下するのを、試料液Ｓの粘度、加圧速度等の変動要素に関係なく、液排出完了時の圧力変動を精度良く検出する処理である。このステップＳ４による判定が行えないＮＯの場合には、ステップＳ５で圧力が抜け圧力（閾値）以上に低下したか否かを判定するもので、前記開閉バルブ４５を閉作動した時点の上限圧力よりの低下圧力差がこの閾値を越えて大きくなった際を液排出完了時として判定する。このステップＳ４またはＳ５のＹＥＳ判定により、抽出カートリッジ１１における液排出が完了すると、ステップＳ６で圧力開放弁４４ａを大気開放作動して、その抽出カートリッジ１１に対する加圧処理を終了する。

同様に、各抽出カートリッジ１１に加圧エアを供給し、この動作を順に繰り返して全ての抽出カートリッジ１１に圧力を加え、各圧力センサ４６ａによって全部の抽出カートリッジ１１で液排出完了が検出されると全体の加圧処理を終了し、加圧ヘッド４０が上昇作動される。

上記のように、試料液Ｓが全てフィルター部材１１ｂを通過すると内圧が液排出完了時点で急激に低下変動するのを、圧力センサ４６ａに基づいて判別した加圧終了の時点で、対応する圧力開放弁４４ａを開放作動して、抽出カートリッジ１１内に残留している加圧エアを圧力開放弁４４ａを介して大気開放し、抽出カートリッジ１１の排出部１１ｃから液と共に噴出されるのを阻止する。

次に図８のフローチャートに基づいて、上記検体加圧による核酸抽出後における後述の洗浄処理および回収処理における洗浄液Ｗまたは回収液Ｒを注入した後の加圧処理での一例の加圧制御を同様に説明する。加圧開始後、ステップＳ１１で個別に開閉バルブ４５が開作動され、エアノズル４１を通して抽出カートリッジ１１に加圧エアが供給され、圧力センサ４６ａによる検出圧力が上限圧力に到達したか否かを判定する（Ｓ１２）。供給圧力が上限圧力に到達してステップＳ１２の判定がＹＥＳとなると、開閉バルブ４５を閉作動する（Ｓ１３）。加圧エアが導入・密閉された抽出カートリッジ１１では、洗浄液Ｗまたは回収液Ｒは圧力の作用によりフィルター部材１１ｂを通って排出される。

そして、ステップＳ１４で液排出完了か否かを判定するが、洗浄液Ｗまたは回収液Ｒは粘度が低く既知であり、圧力低下速度を判定する必要がない。このステップＳ１４は、図７のフローチャートにおけるステップＳ５と同様の処理であり、圧力が抜け圧力（閾値）以上に低下したか否かを判定する。このステップＳ１４のＹＥＳ判定により、抽出カートリッジ１１における液排出が完了すると、ステップＳ１５で圧力開放弁４４ａを大気開放作動して、その抽出カートリッジ１１に対する加圧処理を終了する。

次に、図９は上記加圧処理における抽出カートリッジ１１内への加圧エアの導入に伴う内圧変動を示し、正常動作状態においては曲線Ａで示す特性で変動し、曲線Ｂはその変化量を示す微分波形である。まず、開閉バルブ４５が開作動されて加圧エアが導入開始された時間０点より圧力が直線的に上昇し、加圧上限用の指定圧力（例えば９０ｋＰａ）に到達したａ点で開閉バルブ４５が閉作動されて、抽出カートリッジ１１の内部空間は加圧状態で密閉される。その圧力が液に作用してフィルター部材１１ｂを通過させるように加圧し、液が徐々に減少するのに伴って圧力が低下し、ｂ点で液の全量がフィルター部材１１ｂを通過して液排出が完了すると、フィルター部材１１ｂでのエア抵抗が低減して圧力は急激に低下する。その圧力変動は微分波形曲線Ｂでは顕著に発生し、曲線Ｂで顕著でなくてもこれをさらに微分した２回微分波形では顕著となり、その変化量が前述の所定値ＸkPa/sec²以上となったことの検出により加圧終了を判定する。または、上記加圧終了の判定は、ａ点の閉止圧力から液排出に伴う低下圧力差が、設定した抜け圧力（閾値）以上に低下したことにより判定する。

なお、前述のように試料液Ｓの加圧の場合には、その粘度等に応じて圧力変動が異なり、粘度が低い液では、ａ点後のｂ点に至る圧力低下度合いが大きくなり、ｂ点までの時間が短くなる。また、液の粘度が大きい場合で、フィルター部材１１ｂに軽度の詰まりが生じているときには、ａ点後のｂ点に至る圧力低下度合いが小さくなり、ｂ点までの時間が長くなる。

そして、前記圧力センサ４６ａにより検出された内圧の変動特性から加圧不良状態の検出、例えば、抽出カートリッジ１１のセットの有無検出、液の有無検出、密閉不良の検出、また、液量不足の検出、フィルター詰まりの判定検出を行うようになっている。

まず加圧不良状態の検出は、開閉バルブ４５を開作動してエアノズル４１より加圧エアを噴出してから所定時間経過後にも圧力センサ４６ａによる検出圧力が、例えば１０ｋＰａと低く設定された加圧不良判定用の指定圧力に到達しない場合に行うもので、この場合には、エア抵抗が少ない異常状態であって、抽出カートリッジ１１がセットされてない状態、または、試料液が注入されていない状態、または、エアノズル４１と抽出カートリッジ１１との間が密閉不良状態であると判定できる。

また、抽出カートリッジ１１への試料液Ｓの注入が規定量でなく微量である場合には、初期圧力は上記加圧不良判定用の指定圧力以上に上昇するが、開閉バルブ４５を閉作動する加圧上限用の指定圧力までは上昇せず、その途中で液の排出が完了して圧力が急激に低下することにより液量不足であったと判定できる。

一方、フィルター詰まりの検出は、液排出に伴って検出圧力は徐々に低下するが、この圧力低下が少なく、所定時間経過しても前述の液排出完了時の加圧終了判定が行えず、加圧終了判定用の指定圧力より低下しない場合に、フィルター詰まりが発生していると判定する。また、圧力低下変化量が所定値以上とならない時間が所定時間以上継続したことによりフィルター詰まりを検出するようにしてもよい。

この加圧時の圧力上昇不足時の加圧不良検出、液排出完了に伴う加圧終了検出、およびフィルター詰まり検出は、後述の洗浄処理および回収処理においても同様に行われる。

次に、洗浄処理に移行するが、上記加圧エア供給後の加圧ヘッド４０の上昇は、エアノズル４１が抽出カートリッジ１１より離れ、ノズル移動台５０の移動が許容できる高さまで上昇した位置で停止し、押えピン４９がカートリッジホルダー６２を押さえつけ、抽出カートリッジ１１の下端が廃液容器１２内に挿入されている図４の状態を保持して行う。そして、ノズル移動台５０を移動させて洗浄液分注ノズル５１ｗを１番目の抽出カートリッジ１１上に停止させて洗浄液Ｗを所定量分注し、ノズル移動台５０を次の抽出カートリッジ１１に移動させて順次洗浄液Ｗを分注する。全部の抽出カートリッジ１１への洗浄液Ｗの分注が終了すると、加圧ヘッド４０が下降移動し、各エアノズル４１の下端部がシール材４２を介して抽出カートリッジ１１の上端開口に圧接して密閉してから、前述と同様に開閉バルブ４５が順次開作動されて各抽出カートリッジ１１に加圧エアが供給される。圧力が作用した洗浄液Ｗは、フィルター部材１１ｂを通って核酸以外の不純物の洗浄除去を行い、洗浄液Ｗは下端部の排出部１１ｃより廃液容器１２に排出され、液排出完了時には前述のように圧力開放弁４４ａが開放作動される。全部の抽出カートリッジ１１における洗浄液Ｗが全てフィルター部材１１ｂを通過して排出されると、加圧ヘッド４０が初期の位置まで上昇作動される。洗浄処理を複数回行う場合には上記動作を繰り返す。

なお、洗浄処理および後述の回収処理の場合の加圧エアの供給は、複数同時に行ってもよく、前述の加圧不良状態と判定された箇所またはフィルター詰まりが発生した箇所の抽出カートリッジ１１を除いて、その他の正常動作状態にある全部の抽出カートリッジ１１に対する複数の開閉バルブ４５を同時に開作動させ、ＰＷＭ制御で可変駆動されたエアポンプ４３による加圧エアを導入し、それぞれの圧力センサ４６ａの加圧上限圧力の検出により個別に開閉バルブ４５を閉作動する。

次に、回収処理に移行する。まず洗浄処理後の前記加圧ヘッド４０の上昇により、押えピン４９が上昇してラック６のカートリッジホルダー６２も上昇移動し、抽出カートリッジ１１の下端排出部１１ｃが廃液容器１２より上方へ移動した後、搭載機構３の作動部材３１を作動させて容器ホルダー６３を後退移動させ、抽出カートリッジ１１の下方に回収容器１３を位置させる容器交換を行う。

続いて、加圧ヘッド４０が下降移動し、押えピン４９の先端がカートリッジホルダー６２のピン孔６２ｄに係合して押さえつける。そして、ノズル移動台５０を移動させて回収液分注ノズル５１ｒを１番目の抽出カートリッジ１１上に停止させて回収液Ｒを所定量分注し、ノズル移動台５０を次の抽出カートリッジ１１に移動させて順次回収液Ｒの分注を行う。全部の抽出カートリッジ１１への回収液Ｒの分注が終了すると、前述と同様にさらに加圧ヘッド４０が下降し、各エアノズル４１の下端部をシール材４２を介して抽出カートリッジ１１の上端開口に圧接させて密閉してから、開閉バルブ４５が順次開作動されて各抽出カートリッジ１１に加圧エアが供給される。圧力が作用した回収液Ｒは、フィルター部材１１ｂを通ってそれに吸着されている核酸を離脱させて、回収液Ｒとともに核酸が下端部の排出部１１ｃより回収容器１３に排出され、液排出完了時には前述のように圧力開放弁４４ａが開放作動される。全部の抽出カートリッジ１１における回収液Ｒが全て回収容器１３に排出されると、加圧ヘッド４０が上昇作動され、一連の動作が終了する。

抽出動作が終了したラック６は搭載台２１より下ろされ、抽出カートリッジ１１および廃液容器１２はカートリッジホルダー６２および容器ホルダー６３より取り出されて廃棄され、一方、回収容器１３は容器ホルダー６３より取り出され、必要に応じて蓋がされて、次の核酸分析処理等が施される。

なお、本実施形態では、洗浄液Ｗによる洗浄処理を実施しているが、フィルター部材１１ｂの濾過能力によっては必ずしも必要とするものではない。

また、上記実施形態では、核酸の抽出装置について記載しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、種々の特定物質をフィルター部材に接触させる方法にも適用可能であり、また、必ずしも回収液を用いて回収する必要はなく、フィルター部材に特定物質を接触させたまま分析したり、処理液を入れて反応色を分析することも可能である。

本発明の一つの実施の形態における核酸抽出装置のカバーを除去した状態を示す斜視図核酸抽出装置の概略機構図搭載機構におけるラックの斜視図ラックの使用状態を示す斜視図加圧エア供給機構のエア系統図加圧エア供給機構の制御系統図検体加圧制御例のフローチャート図洗浄液または回収液加圧制御例のフローチャート図抽出カートリッジの内圧変動を示す図抽出動作の工程図抽出カートリッジの斜視図

符号の説明

１抽出装置（核酸抽出装置）
２装置本体
３搭載機構
４加圧エア供給機構
８制御ユニット
11 抽出カートリッジ
11b フィルター部材
12 廃液容器
13 回収容器
40 加圧ヘッド
41 エアノズル
43 エアポンプ
44a 圧力開放弁
45 開閉バルブ
46a 圧力センサ
Ｓ試料液
Ｗ洗浄液
Ｒ回収液

Claims

フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用い、該抽出カートリッジに特定物質を含む試料液を注入し加圧して該試料液中の特定物質を前記フィルター部材に吸着させる抽出装置において、
前記抽出カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構は、エアポンプと、複数の抽出カートリッジへの供給路には加圧エアの供給を個々に開閉する開閉バルブと圧力を個々に開放作動する圧力開放弁とを備えたことを特徴とする抽出装置。
フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用い、該抽出カートリッジに核酸を含む試料液を注入し加圧して該試料液中の核酸を前記フィルター部材に吸着させた後、前記抽出カートリッジに回収液を分注し加圧して前記フィルター部材に吸着した核酸を分離して回収液とともに回収する抽出装置において、
前記抽出カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構は、エアポンプと、複数の抽出カートリッジへの供給路には加圧エアの供給を個々に開閉する開閉バルブと圧力を個々に開放作動する圧力開放弁とを備えたことを特徴とする抽出装置。
前記開閉バルブを個別に開閉作動して、複数の前記抽出カートリッジへそれぞれ加圧エアを導入してから密閉し、各抽出カートリッジで液排出が完了した時点で、前記圧力開放弁を個々に開放作動し、該抽出カートリッジ内に残存する加圧エアを放出することを特徴とする請求項１または２に記載の抽出装置。
前記加圧エア供給機構は、前記抽出カートリッジの内圧を個別に検出する圧力センサをさらに備え、該圧力センサの検出に基づいて前記圧力開放弁の開放作動を行うことを特徴とする請求項１，２または３に記載の抽出装置。