JP3752417B2 - 核酸の精製方法および精製装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の精製方法および精製装置に係り、特に、生物試料に含まれる核酸を共存物質から分離して取り出すのに適した方法および装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分子生物学の進歩によって、遺伝子に関する数々の技術が開発され、また、それらの技術により多くの疾患性の遺伝子が分離され、同定された。その結果、医療の分野でも、診断、或いは検査法において分子生物学的な手法が取り入れられ、従来極めて困難であった診断が可能となったり、検査日数の大幅短縮が達成されつつある。
【０００３】
このような進歩は、核酸増幅法、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法と称される、polymerase chain reaction ）の実用化によるところが大きい。ＰＣＲ法は、溶液中の核酸を配列特異的に増幅することが可能なため、例えば、血清中に極微量しか存在しないウイルスを、そのウイルスの遺伝子である核酸を増幅し検出することにより、間接的に証明できる。しかし、このＰＣＲ法を臨床の場で日常検査に使用した際に、いくつかの問題点が存在する。その中でも特に、前処理における核酸の抽出、精製工程が精度維持のために重要である。核酸の精製に関しては、いくつかの手法が提案されている。
【０００４】
特開平１１−２６６８６４号公報では、シリカ含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップを用いて核酸抽出を自動化する方法が記載されている。ノズルチップを液体吸排用可動ノズルに装着し、上記固相への核酸の結合促進剤をボトルより吸引し、次いで核酸含有試料を検体容器から吸引し、それらの混合液を反応容器内に吐出する。混合液を吐出後、ノズルチップを廃棄し、新たに核酸捕捉用チップ内を装着する。前記反応容器内から上記液体吸排用可動ノズルに接続された核酸捕捉用チップ内に吸入する。続いて、吸入された混合液中の核酸を核酸捕捉用チップ内の固相に結合させた後、上記核酸捕捉用チップ内の液体を排出する。続いて、洗浄用容器内に吐出された洗浄液を上記核酸捕捉用チップ内に吸入し、次いで該洗浄液を上記核酸捕捉用チップから排出することにより、核酸を結合した状態の上記固相及び上記核酸捕捉用チップ内を洗浄する。さらに洗浄後の上記核酸捕捉用チップ内に溶離液を吸入し、上記固相から離脱された核酸を含む溶離液を精製品用容器に吐出する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述した特開平１１−２６６８６４号公報の方法では核酸含有試料と各種試薬との反応の際、核酸含有試料を検体容器、もしくは反応容器から吸引し、目的とする反応容器に分注している。このため前記試料がノズルチップを保持している機構まで飛散する可能性があり、核酸精製性能に重大な影響を与えるコンタミネーションの原因となる恐れがある。
【０００６】
また核酸を結合した状態の固相及び核酸捕捉用チップ内を洗浄し専用容器内に吐出された洗浄液を上記チップ内へ吸引、および専用容器内への吐出を繰り返すことによって行なっているため、洗浄効率が著しく悪い。さらに前記チップ内の固相に洗浄液が残った場合、次の溶離液濃度に影響を与え、核酸精製性能を低下させる原因となる。
本発明の目的は、コンタミネーションの発生およびノズルチップ内の液残りがなく、かつ洗浄効率の高い核酸の精製方法及び精製装置を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的を達成するための課題解決手段は次の通りである。
１．核酸捕捉材含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップを用いて、当該固相に核酸を捕捉させ、核酸の抽出を行なう核酸の精製方法において、上記核酸が捕捉された固相を内蔵するチップ内をその頭部から先端部へ向けて一方向に洗浄液を流動させることを特徴とする核酸の精製方法。
上記核酸捕捉材の具体例としては、シリカ等が挙げられる。本発明における核酸捕捉材としては、シリカを主成分とする微細粒子、繊維、繊維ウールなどが好ましい。特に、シリカ繊維からできているシリカウールが好適である。
２．上記１の核酸の精製方法において、核酸捕捉用チップに至る流路中に洗浄液流路の分岐を設け洗浄液を注入することを特徴とする核酸の精製方法。
洗浄剤流路を切り替えることにより、流路部分が短くでき、核酸精製装置の小型化が図られる。
【０００８】
３．上記１の核酸の精製方法において、洗浄液を核酸捕捉用チップに流入される専用流路を設けたことを特徴とする核酸の精製方法。
洗浄液の切り替え流路を設けずに、単純な洗浄液流路をチップに設けることにより、装置の運転、管理が容易になる。
４．上記１の核酸の精製方法において、流路内に空気を送気することを特徴とする核酸の精製方法。
これにより、捕捉材に吸着された核酸に含まれる不純物を含む洗浄液を速やかにチップから除去することができる。
【０００９】
５．上記１の核酸の精製方法において、洗浄液吐出と空気送気を交互に繰り返すことを特徴とする核酸の精製方法。
これにより、チップ内に残留する洗浄液をより効率よく除去することができる。
６．核酸捕捉材含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップを用いて、当該固相に核酸を捕捉させ、核酸の抽出を行なう核酸の精製装置において、上記核酸が捕捉された固相を、内蔵するチップ内をその頭部から先端部へ向けて一方向に試薬を流動させる手段を設けたことを特徴とする核酸の精製装置。
【００１０】
７．上記６の核酸の精製装置において、核酸捕捉用チップに至る流路中に洗浄液流路の分岐を設け洗浄液を注入する手段を備えることを特徴とする核酸の精製装置。
洗浄剤流路を切り替えることにより、流路部分が短くでき、核酸精製装置の小型化が図られる。
８．上記６の核酸の精製装置において、洗浄液を核酸捕捉用チップに流入される専用流路を備えることを特徴とする核酸の精製装置。
洗浄液の切り替え流路を設けずに、単純な洗浄液流路をチップに設けることにより、装置の運転、管理が容易になる。
【００１１】
９．上記６の核酸の精製装置において、流路内に空気を送気する手段を備えること特徴とする核酸の精製装置。
これにより、捕捉材に吸着された核酸に含まれる不純物を含む洗浄液を速やかにチップから除去することができる。
１０．上記６の核酸の精製装置において、洗浄液吐出と空気送気を交互に繰り返す手段を備えることを特徴とする核酸の精製装置。
これにより、チップ内に残留する洗浄液をより効率よく除去することができる。
【００１２】
１１．核酸捕捉材含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップを用いて、当該固相に核酸を捕捉させ、核酸の抽出を行なう核酸の抽出装置において、
核酸捕捉材含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップと、
該核酸捕捉用チップを着脱可能に接触する液体吸排用可動ノズルと、
上記固相への核酸の捕捉を促進する物質と核酸含有試料との混合液を収容し得る処理溶液と、
上記核酸捕捉用チップの頭部から先端部へ向けて一方向に洗浄液を流動させる手段と、
上記核酸捕捉用チップへ溶離液を供給する手段と、
上記核酸捕捉用チップから上記精製品用容器へ溶離液を吐出した後に、上記液体吸排用可動ノズルから上記核酸捕捉用チップを取り外すチップ取り外し手段と、核酸の精製品を受け入れるための精製品容器と、
を備えたことを特徴とする核酸の精製装置。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に基づく一実施例である核酸精製装置を図１〜図８を参照して説明する。本実施例では本発明を洗浄工程に適用した例を示す。図６は一実施例の装置の平面図、図７はその外観図、図８は電気系のブロックダイヤグラム、図１及び２は核酸捕捉用チップを接続した分注器と流路洗浄用の洗浄液送液機構の概略図、図３は液体分注用チップの取り付け動作の説明図、図４はチップを取り外す動作の説明図、図５は核酸捕捉用チップの構成を示す図である。
【００１４】
図６及び図７において、核酸の精製装置１００は、水平方向（Ｘ方向）に移動可能な２本のアーム１６、３３を具備する。一方のアーム１６には、分注ノズル３６（図３）を保持するノズルホルダー１７がアーム１６の長さ方向に沿って水平方向（Ｙ方向）に移動可能に取り付けられている。他方のアーム３３には、液体吸排用可動ノズル３９（図１）を保持するノズルホルダー３４がアーム３３の長さ方向に沿って水平方向（Ｙ方向）に移動可能に取り付けられている。ノズルホルダー１７、３４は、対応するアーム１６、３３に対し、いずれも上下方向（Ｚ方向）に動作できる。アーム１６の水平移動領域とアーム３３の水平移動領域とは、部分的にオーバーラップするので、各アームの取り付け高さ位置を違えてある。
【００１５】
本体架台の作業面５には、未使用の多数の分注用チップ１５を載置した３個のチップラック１４ａ、１４ｂ、１４ｃが所定エリアにセットされる。これらのチップラック１４は、図３に示すように、各分注用チップ１５を挿入し得る穴を有しており、分注用チップの先端部が作業面５又はチップラック底面に接触しないような高さを持った箱形をなす。各チップラック１４ａ、１４ｂ、１４ｃは夫々最大４８本までの分注用チップ１５を保持できる。
【００１６】
また、作業面５には、未使用の多数の核酸捕捉用チップ３１を載置したチップラック３０が所定エリアにセットされる。チップラック３０の形状は、先のチップラック１４と同様である。この例ではチップラック３０上に最大４８本までの核酸捕捉用チップ３１を保持できる。
【００１７】
作業面５には、処理対象となる検体、すなわち核酸を含有する試料を収容した検体容器１３が複数本ずつ保持される検体ラック１２が所定エリアにセットされる。この例では、各検体ラック１２は６本の検体容器１３を保持できる。また、検体ラック１２は８個またはそれ以上の数をセットできる。
【００１８】
また、作業面５には、未使用の処理容器２４を多数保持した容器ラック２３が所定エリアにセットされる。容器ラック２３は、最大４８本までの処理容器２４を保持できる。さらに、作業面５には、未使用の精製品用容器２６を多数保持した容器ラック２５が所定エリアにセットされる。この精製品用容器は、精製処理がなされた核酸含有液を試料別に回収するものである。この例では、容器ラック２５は、最大４８本の精製品用容器２６を保持できる。
【００１９】
作業面５には、プライミングの際に分注ノズル３６から放出される水を受け入れると共に分注ノズル３６のホームポジションとなる液受け部１１と、分注作業をする分注チップ１５を洗浄するための洗浄部１８と、分注ノズル３６に接続された分注用チップ１５及び液体吸排用可動ノズル３９に接続された核酸捕捉用チップ３１を夫々のノズルから取り外すためのチップ外し器２７と、プライミングの際に液体吸排用可動ノズル３９から放出される水を受け入れると共に該可動ノズル３９のホームポジションとなる液受け部２８と、核酸捕捉用チップ３１からの不要な液を排出するための廃液口２９とが設けられる。
【００２０】
また、作業面５上の夫々の所定位置には、核酸捕捉用チップ３１内の固相を洗浄するための洗浄液を収容した洗浄液ボトル１９、固相に結合された核酸を溶出させるための溶離液を収容した溶離液ボトル２０、希釈液を収容した希釈液ボトル２１、及び固相への核酸の結合を促進する結合促進物質の溶液を収容した結合促進剤ボトル２２等がセットされる。
【００２１】
図３に示すシリンジポンプ１０と図１に示すシリンジポンプ３２は、それぞれ本体架台に取り付けられており、液体の吸入動作と吐出動作の制御が各ポンプ独自になされる。図３に示すように、ノズルホルダー１７に保持された分注ノズル３６は、可撓性の管４２を介して液体吸排用のシリンダポンプ１０に連通されている。分注ノズル３６内及び管４２内には純水が満たされており、シリンジポンプ１０は図示しない純水供給源に接続されている。図１に示すように、ノズルホルダー３４に保持された可動ノズル３９は、可撓性の管３５を介してシリンジポンプ３２に接続されている。可動ノズル３９内及び管３５内には純水が満たされており、シリンジポンプ３２は図示しない純水供給源に接続されている。 分注ノズル３６への分注用チップ１５の接続のための装着及び可動ノズル３９への核酸捕捉用チップ３１の接続のための装着は、それぞれに対応するチップラック１４、３０上において、各ノズルを降下してチップをノズルの先端部に嵌合することにより達成される。また、分注ノズル３６に接続された分注用チップ１５及び可動ノズル３９に接続された核酸捕捉用チップ３１をそれぞれのノズルから取り外す場合は、チップ外し器２７を利用する。図６及び図４に示すように、チップ外し器２７は、所定高さ位置に板状部材を有しており、この板状部材には、分注チップ１５の頭部５２及び核酸捕捉用チップ３１の頭部５４の外径よりも小さく、且つ分注ノズル３６及び可動ノズル３９の外径より大きな幅のスリット５５が形成されている。スリット５５が位置する高さよりも各チップの頭部５２，５４が低い状態でノズル３６，３９をスリット内に浸入するように水平移動させ、次いでノズルホルダー１７，３４を上昇させると頭部５２，５４が板状部材の下面に当接し、ノズルホルダーの更なる上昇によりチップ１５，３１がノズルから抜け落ちる。抜け落ちたチップは、チップ廃棄口５０（図６）に落下し回収箱（図示せず）内に回収される。
【００２２】
図８に、図６の核酸精製装置の電気系の構成を示す。動作制御部としてのパーソナルコンピュータ（ＰＣ）６０には、操作条件及び検体情報を入力するための操作パネルとしてのキーボード６１、入力情報や警告情報等を表示するための表示装置としてのＣＲＴ６２、装置の各機構部を制御する機構制御部６５等が接続される。機構制御部６５は、シリンジポンプ１０に吸排動作を行わせるためのピストン駆動用のステッピングモータ７１、シリンジポンプ３２に吸排動作を行わせるためのピストン駆動用のステッピングモータ７２、ノズルホルダー１７を水平移動及び上下動させるためのステッピングモータ７３、ノズルホルダー３４を水平移動及び上下動させるためのステッピングモータ７４、アーム１６を水平移動させるためのＡＣサーボモータ７５、アーム３３を水平移動させるためのＡＣサーボモータ７６、洗浄液吐出用のためのベローズポンプ８０、洗浄液流路の切替えるための電磁弁８１、シリンジポンプ３２内へ空気を吸入するための電磁弁８２等を制御する。精製装置の各部は、所定のプログラムに従って動作される。
【００２３】
図５に、核酸捕捉用チップ３１の１つの例の構成を示す。核酸捕捉用チップ３１は、頭部５４が可動ノズル３９の先端部に気密に嵌合される内径を有しており、下方が先端部４８に向けて徐々に内径が細くなるように形成される。チップ３１は透明もしくは半透明な合成樹脂からなる。チップ３１の先端部側には、固相が流出することを防止するための円板状の阻止部材４０ｂを圧入により挿入し、頭部５４の側には円板状の阻止部材４０ａを設ける。これらの阻止部材４０ａ，４０ｂは、液体及び気体が容易に通過し得る多数の孔を有するが、その孔は固相の流出を阻止できる大きさである。阻止部材４０ａ，４０ｂの材質としては、非特異吸着が少なく親水性を有するポリビニリデンフロライドを用いる。この材質は、タンパク質や核酸等の非特異吸着を少なくできるので、核酸の精製度や収率への影響が小さい。阻止部材４０ａは、チップ３１への挿入を容易にするための突起状の挿入用補助ガイド３７を下面側に複数個有する。阻止部材４０ａと４０ｂによって挟まれた部屋には、固相としてフリントガラス（和光純薬工業製）の粉末４４を充填する。このフリントガラスは核酸捕捉効果を有するシリカの含有量が高い。
【００２４】
次に、図６の実施例による核酸の精製操作を説明する。
核酸含有試料の精製操作を開始する前に、市販の精製品であるｐＢＲ３２２ＤＮＡ（Fermentas 社製）をトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．５，ＴＥ溶液）により所定濃度にした溶液を調製し、検体容器１３に入れて検体ラックに保持させ、図６の装置１００上の検体エリアにセットした。分注チップ１５を有するチップラック１４、核酸捕捉用チップ３１を有するチップラック３０、各ボトル１９、２０、２１、２２、処理容器２４を有する容器ラック２３、及び精製品用容器２６を有する容器ラック２５を、それぞれ所定の場所にセットした後、精製装置１００による操作を開始した。
【００２５】
まず、ノズルホルダー１７を動作させ、液受け部１１に位置していた分注ノズル３６を検体用のチップラック１４ａ上へ移動し、第１番目の分注用チップを分注ノズル３６に嵌合する。次いで、取り付けた分注用チップ１５を結合促進剤ボトル２２上へ移動し、該ボトル内へ降下し、シリンジポンプ１０に吸引動作させることにより分注用チップ１５内に所定量の塩酸グアニジン溶液を吸入する。分注用チップを結合促進剤ボトル２２内から上昇させ、分注用チップの先端部に少量の空気を引入し、洗浄部１８へ移動して分注用チップの外壁に洗浄水を噴射させることにより分注用チップ１５の外壁を洗浄する。次いで、分注ノズル３６を検体ラック１２上の第１番目の検体容器１３まで移動し、分注用チップ１５を検体容器内に降下し、シリンジポンプ１０の吸引動作により分注用チップ１５内に所定量の検体を吸入する。これにより、分注用チップ１５内には、塩酸グアニジン溶液、空気、及び核酸含有試料液の各層が形成される。
【００２６】
検体を吸入した分注用チップ１５を容器ラック２３上の第１番目の処理容器２４上へ移動し、その処理容器２４へ分注用チップ１５内の検体及び塩酸グアニジン溶液の全量を吐出する。その吐出後に再び吐出液の全量を同じ分注用チップ１５内に吸入し、更に第１番目の処理容器２４へ吐出することを１回以上行う。これにより核酸含有試料と結合促進剤を混合する。その後、分注ノズル３６をチップ外し器２７まで移動し、上述した取り外し動作に従って、分注ノズル３６から使用済みの分注用チップ１５を取り外す。次いで、分注ノズル３６を液受け部１１の位置に戻し、分注ノズル３６から純水を所定量吐出させた後、分注ノズル３６の先端部に少量の空気を吸入し、ノズルホルダー１７に対する次の動作指令があるまで待機する。
【００２７】
分注ノズル３６が混合動作を行っている間に、アーム３３及びノズルホルダー３４の動作により液体吸排用可動ノズル３９を、液受け部２８からチップラック３０上の第１番目の核酸捕捉用チップ３１の位置へ移動し、可動ノズル３９の先端部に核酸捕捉用チップ３１を嵌合する。その後、可動ノズル３９は核酸捕捉用チップ３１を結合した状態で容器ラック２３上の第１番目の処理容器２４の位置へ移動し、核酸捕捉用チップ３１を降下し、そのチップ内に、第１番目の処理容器に入っている検体と結合促進剤の混合液の全量を、シリンジポンプ３２の吸引動作により核酸捕捉用チップ３１内に吸入する。これにより混合液がチップ３１内の固相としてのガラス粉末４４の表面に接触する。次いで、吸入した混合液を第１番目の処理容器２４内に吐出して戻し、吐出された混合液を再び同一の核酸捕捉用チップ３１内に吸入する。この混合液の吐出と吸入を複数回繰り返すことにより固相表面と混合液との接触数を増大し、固相による核酸の吸着効率を高める。
【００２８】
所定回数の吸排の後に最終的に第１番目の核酸捕捉用チップ３１内へ混合液の全量を吸入し、該チップ３１を廃液口２９へ移動して核酸吸着後の残液を、シリンジポンプ３２の吐出動作により廃液口２９内へ排出する。
続いて流路切替え用電磁弁８１を動作させ、洗浄液流路と核酸捕獲用チップ３１と接続する。続いてベローズポンプ８０を動作させ、洗浄液を該チップ内に注入する。本手段はベローズポンプに限らず、シリンジポンプ等、送液機能を有するものであれば良い。
【００２９】
該洗浄液は該チップの頭部（上方）から先端部（下方）に向けて一方向に流動させる。該チップ内を通過した洗浄液はそのままチップ下面から廃液口２９へ連続的に排出する。洗浄液吐出終了後電磁弁８１を動作させ、流路をシリンジ３２へ切り替える。続いて電磁弁８２を動作させ、シリンジポンプ１０内へ空気を取り入れ可能とする。その後シリンジ３２を動作させ、シリンジ内に空気を吸引する。核酸捕捉用チップ３１には抵抗となる核酸捕捉用固相が設置されているため、空気のほとんどは電磁弁８２で開状態となった抵抗の少ない流路より吸引される。続いて電磁弁８２を閉じ、空気の吸入を停止させる。続いてシリンジ３２を前記と反対方向に動作させ、核酸捕捉用チップ３１内に空気を吐出し、前記チップ内の残液をすべて吐出する。このような洗浄動作により、核酸捕捉用チップ３１の内壁及び固相の表面が洗浄される。
【００３０】
更に洗浄効率を上げるため、洗浄工程を繰り返すことも可能である。２回目の洗浄操作は１回目の洗浄操作と同様のステップを経る。必要であれば、３回目の洗浄操作を行うようにすることができる。洗浄液を廃液口２９へ排出して洗浄操作が終了した核酸捕捉用チップ３１は、液受け部２８へ移動し、待機する。なお、洗浄液は、濃度が７０％のエタノール水溶液である。
【００３１】
核酸の溶離工程に当り、分注ノズル３６がチップラック１４ｃ上の第１番目の分注用チップの位置へ移動され、分注ノズル３６の降下により該ノズル３６の先端部に分注用チップ１５を嵌合する。分注用チップを接続した分注ノズル３６は溶離液ボトル２０の位置へ移動する。溶離液ボトル２０内には、溶離液としての純水が収容されている。望ましくは、溶離液ボトル２０が加温されている。シリンジポンプ１０の吸引動作により、分注用チップ１５内に、複数回使用し得る量の溶離液が吸入される。続いて分注用チップ１５は容器ラック２３上の第１番目の処理容器２４上へ移動され、シリンジポンプ１０の押出し動作により、分注用チップ１５から１回分の量の溶離液を第１番目の処理容器２４内に吐出する。残りの量の溶離液を保有している分注用チップ１５は、液受け部１１へ移動し、待機する。
【００３２】
液受け部２８で待機していた核酸捕捉用チップ３１を容器ラック２３上の第１番目の処理容器２４へ移動し、溶離液が入っている第１番目の処理容器２４内の溶離液を核酸捕捉用チップ３１内に吸入する。これにより溶離液が固相に接触し１３相表面に吸着されていた核酸を溶離液中に溶出させる。チップ３１内に吸入した溶離液を元の処理容器２４へ吐出した後、再度同一チップ３１内に吸入する操作を所定回数繰り返して、最終的に溶離液を吸入保持した核酸捕捉溶チップ３１を、容器ラック２５上の第１番目の精製品用容器２６の位置へ移動する。シリンジポンプ３２の押出し動作により核酸捕捉用チップ３１内にあった溶離液を第１番目の精製品用容器２６内に吐出する。これにより精製品容器２６には、固相から溶出された核酸を含む溶離液が回収される。溶離液吐出後の核酸捕捉用チップ３１は液受け部２８へ移動され待機する。
次いで、溶離液を保持した状態の分注用チップ１５が、液受け部１１から第１番目の処理容器２４へ移動し、次の１回分の溶離液を該当処理容器内へ吐出する。
【００３３】
続いて、液受け部２８にて待機していた核酸捕捉用チップ３１を第１番目の処理容器２４へ移動し、処理容器２４内の溶離液を核酸捕捉用チップ３１内に吸入し、上述したと同様の核酸溶出操作を実行した後、核酸を含む溶離液を第１番目の精製品用容器２６内に回収する。このような分注用チップ１５による溶離液の供給操作と核酸捕捉用チップ３１による溶出操作は、所定回数、例えば３回繰り返される。溶離液の吐出を終了した分注用チップ１５は、チップ外し器２７へ移動し、分注ノズル３６から使用済みの分注用チップ１５を取り外す。分注用チップを外した分注ノズル３６は、液受け部１１へ移動し、ノズル先端部から水を吐出した後、ノズル先端部に微量の空気を吸入し、その位置で待機する。また、精製品用容器２６への核酸含有溶離液の複数回の吐出を終了した核酸捕捉用チップ３１は、チップ外し器２７へ移動し、可動ノズル３９から使用済みの核酸捕捉用チップ３１を取り外す。核酸捕捉用チップを外した可動ノズル３９は、液受け部２８へ移動し、ノズルから所定量の水を吐出した後、ノズル先端部に微量の空気を吸入し、その位置で待機する。
【００３４】
以上で、第１番目の検体に対する核酸の精製操作が終了する。このあと、図６の精製装置１００は、第２番目以降の検体に対し核酸精製操作を続行するが、その操作は上述した例の繰り返しである。なお、第１番目の検体に対しては、各分注ラック１４ａ，１４ｂ，１４ｃ上の第１番目の分注用チップと、チップラック３０上の第１番目の核酸捕捉用チップと、容器ラック２３上の第１番目の処理容器２４と、容器ラック２５上の第１番目の精製品用容器を用いたが、第２番目の検体に対しては、これらの第２番目の部品がそれぞれ使用され、第３番目以降の検体に対しても同様に部品が変更される。従って、容器ラック２５上の精製品容器列には、検体の順番に応じて、精製回収された核酸含有液が検体別に回収される。これらの部品は、検体毎に新しいものが使用されるので、検体相互間のコンタミネーションが防止される。
なお、本実施例では１分注ノズルに対して１洗浄液流路を設けた例を示しているが、切替え弁を増やすことにより複数の洗浄液流路を設けることもできる。
【００３５】
続いて本発明による洗浄方法の他の実施例について説明する。図２は流路内に分岐を設けず、液体吸排用可動ノズル３９内に直接洗浄液を流し込む構成である。他部分の構成は前記実施例と同様である。
所定回数の吸排の後に最終的に第１番目の核酸捕捉用チップ３１内へ混合液の全量を吸入し、該チップ３１を廃液口２９へ移動して核酸吸着後の残液を、シリンジポンプ３２の吐出動作により廃液口２９内へ排出する。
【００３６】
続いて洗浄液開閉弁８３を動作させ、洗浄液容器１９とシリンジポンプ８４とを接続する。続いてシリンジポンプ８４を動作させ洗浄液をシリンジポンプ内に吸引する。続いて洗浄液開閉弁８３を再び動作させ、シリンジポンプ８４を核酸捕捉用チップ３１に接続する。続いてシリンジポンプ８４を反対方向に動作させ、洗浄液を該チップ内に注入する。該洗浄液は該チップ上方から下方に向けて一方方向に吐出させる。該チップ内を通過した洗浄液はそのままチップ下面から廃液口２９へ連続的に排出する。洗浄液吐出終了後、空気吸入切替え弁８２を動作させ、空気取り入れを可能な状態にする。再びシリンジポンプ８４を動作させ、シリンジポンプ内に空気を吸引する。空気吸入切替え弁８２を動作させ、シリンジポンプ８４を核酸捕捉用チップ３１に接続する。再びシリンジポンプ３２を反対方向に動作させ、核酸捕捉用チップ３１内に空気を吐出し、前記チップ内の残液をすべて吐出する。本実施例では１分注ノズルに対して１洗浄液流路を設けた例を示しているが、複数の洗浄液流路を設けることもできる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明により、コンタミネーションの発生およびノズルチップ内の液残りがなく、かつ洗浄効率の高い核酸の精製方法及び精製装置を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の核酸精製装置において、流路切替え弁を設けた分注器の概略構成を示す図である。
【図２】 本発明の核酸精製装置において、洗浄液専用流路を設けた分注器の概略構成を示す図である。
【図３】 本発明の核酸精製装置における液体分注用チップをノズルに取り付ける動作の説明図である。
【図４】 本発明の核酸精製装置におけるノズルからチップを取り外す動作の説明図である。
【図５】 本発明の核酸精製装置における核酸捕捉用チップの概略構成図である。
【図６】 本発明の核酸精製装置の一実施例の平面図である。
【図７】 本発明の核酸精製装置の一実施例の概略外観図である。
【図８】 本発明の核酸精製装置の一実施例における電気系の構成を示すブロックダイヤグラムである。
【符号の説明】
１０，３２…シリンジポンプ、１２…検体ラック、１５…分注用チップ、１６，３３…アーム、１７，３４…ノズルホルダー、１９…洗浄液ボトル、２０…溶離液ボトル、２２…結合促進剤ボトル、２４…処理容器、２６…精製品用容器、２７…チップ外し器、３１…核酸捕捉用チップ、３６…分注ノズル、３９…液体吸排用可動ノズル、４０ａ，４０ｂ…阻止部材、４４…ガラス粉末、８０…洗浄液吸引ポンプ、８１…流路切替え弁、８２…空気吸入切替え弁、８３…洗浄液開閉弁、８４…シリンジポンプ、８５…洗浄液専用流路、８６…エアフィルタ、１００…精製装置。
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の精製方法および精製装置に係り、特に、生物試料に含まれる核酸を共存物質から分離して取り出すのに適した方法および装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分子生物学の進歩によって、遺伝子に関する数々の技術が開発され、また、それらの技術により多くの疾患性の遺伝子が分離され、同定された。その結果、医療の分野でも、診断、或いは検査法において分子生物学的な手法が取り入れられ、従来極めて困難であった診断が可能となったり、検査日数の大幅短縮が達成されつつある。
【０００３】
このような進歩は、核酸増幅法、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法と称される、polymerase chain reaction ）の実用化によるところが大きい。ＰＣＲ法は、溶液中の核酸を配列特異的に増幅することが可能なため、例えば、血清中に極微量しか存在しないウイルスを、そのウイルスの遺伝子である核酸を増幅し検出することにより、間接的に証明できる。しかし、このＰＣＲ法を臨床の場で日常検査に使用した際に、いくつかの問題点が存在する。その中でも特に、前処理における核酸の抽出、精製工程が精度維持のために重要である。核酸の精製に関しては、いくつかの手法が提案されている。
【０００４】
特開平１１−２６６８６４号公報では、シリカ含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップを用いて核酸抽出を自動化する方法が記載されている。ノズルチップを液体吸排用可動ノズルに装着し、上記固相への核酸の結合促進剤をボトルより吸引し、次いで核酸含有試料を検体容器から吸引し、それらの混合液を反応容器内に吐出する。混合液を吐出後、ノズルチップを廃棄し、新たに核酸捕捉用チップ内を装着する。前記反応容器内から上記液体吸排用可動ノズルに接続された核酸捕捉用チップ内に吸入する。続いて、吸入された混合液中の核酸を核酸捕捉用チップ内の固相に結合させた後、上記核酸捕捉用チップ内の液体を排出する。続いて、洗浄用容器内に吐出された洗浄液を上記核酸捕捉用チップ内に吸入し、次いで該洗浄液を上記核酸捕捉用チップから排出することにより、核酸を結合した状態の上記固相及び上記核酸捕捉用チップ内を洗浄する。さらに洗浄後の上記核酸捕捉用チップ内に溶離液を吸入し、上記固相から離脱された核酸を含む溶離液を精製品用容器に吐出する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述した特開平１１−２６６８６４号公報の方法では核酸含有試料と各種試薬との反応の際、核酸含有試料を検体容器、もしくは反応容器から吸引し、目的とする反応容器に分注している。このため前記試料がノズルチップを保持している機構まで飛散する可能性があり、核酸精製性能に重大な影響を与えるコンタミネーションの原因となる恐れがある。
【０００６】
また核酸を結合した状態の固相及び核酸捕捉用チップ内を洗浄し専用容器内に吐出された洗浄液を上記チップ内へ吸引、および専用容器内への吐出を繰り返すことによって行なっているため、洗浄効率が著しく悪い。さらに前記チップ内の固相に洗浄液が残った場合、次の溶離液濃度に影響を与え、核酸精製性能を低下させる原因となる。
本発明の目的は、コンタミネーションの発生およびノズルチップ内の液残りがなく、かつ洗浄効率の高い核酸の精製方法及び精製装置を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的を達成するための課題解決手段は次の通りである。
１．核酸捕捉材含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップを用いて、当該固相に核酸を捕捉させ、核酸の抽出を行なう核酸の精製方法において、上記核酸が捕捉された固相を内蔵するチップ内をその頭部から先端部へ向けて一方向に洗浄液を流動させることを特徴とする核酸の精製方法。
上記核酸捕捉材の具体例としては、シリカ等が挙げられる。本発明における核酸捕捉材としては、シリカを主成分とする微細粒子、繊維、繊維ウールなどが好ましい。特に、シリカ繊維からできているシリカウールが好適である。
２．上記１の核酸の精製方法において、核酸捕捉用チップに至る流路中に洗浄液流路の分岐を設け洗浄液を注入することを特徴とする核酸の精製方法。
洗浄剤流路を切り替えることにより、流路部分が短くでき、核酸精製装置の小型化が図られる。
【０００８】
３．上記１の核酸の精製方法において、洗浄液を核酸捕捉用チップに流入される専用流路を設けたことを特徴とする核酸の精製方法。
洗浄液の切り替え流路を設けずに、単純な洗浄液流路をチップに設けることにより、装置の運転、管理が容易になる。
４．上記１の核酸の精製方法において、流路内に空気を送気することを特徴とする核酸の精製方法。
これにより、捕捉材に吸着された核酸に含まれる不純物を含む洗浄液を速やかにチップから除去することができる。
【０００９】
５．上記１の核酸の精製方法において、洗浄液吐出と空気送気を交互に繰り返すことを特徴とする核酸の精製方法。
これにより、チップ内に残留する洗浄液をより効率よく除去することができる。
６．核酸捕捉材含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップを用いて、当該固相に核酸を捕捉させ、核酸の抽出を行なう核酸の精製装置において、上記核酸が捕捉された固相を、内蔵するチップ内をその頭部から先端部へ向けて一方向に試薬を流動させる手段を設けたことを特徴とする核酸の精製装置。
【００１０】
７．上記６の核酸の精製装置において、核酸捕捉用チップに至る流路中に洗浄液流路の分岐を設け洗浄液を注入する手段を備えることを特徴とする核酸の精製装置。
洗浄剤流路を切り替えることにより、流路部分が短くでき、核酸精製装置の小型化が図られる。
８．上記６の核酸の精製装置において、洗浄液を核酸捕捉用チップに流入される専用流路を備えることを特徴とする核酸の精製装置。
洗浄液の切り替え流路を設けずに、単純な洗浄液流路をチップに設けることにより、装置の運転、管理が容易になる。
【００１１】
９．上記６の核酸の精製装置において、流路内に空気を送気する手段を備えること特徴とする核酸の精製装置。
これにより、捕捉材に吸着された核酸に含まれる不純物を含む洗浄液を速やかにチップから除去することができる。
１０．上記６の核酸の精製装置において、洗浄液吐出と空気送気を交互に繰り返す手段を備えることを特徴とする核酸の精製装置。
これにより、チップ内に残留する洗浄液をより効率よく除去することができる。
【００１２】
１１．核酸捕捉材含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップを用いて、当該固相に核酸を捕捉させ、核酸の抽出を行なう核酸の抽出装置において、
核酸捕捉材含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップと、
該核酸捕捉用チップを着脱可能に接触する液体吸排用可動ノズルと、
上記固相への核酸の捕捉を促進する物質と核酸含有試料との混合液を収容し得る処理溶液と、
上記核酸捕捉用チップの頭部から先端部へ向けて一方向に洗浄液を流動させる手段と、
上記核酸捕捉用チップへ溶離液を供給する手段と、
上記核酸捕捉用チップから上記精製品用容器へ溶離液を吐出した後に、上記液体吸排用可動ノズルから上記核酸捕捉用チップを取り外すチップ取り外し手段と、核酸の精製品を受け入れるための精製品容器と、
を備えたことを特徴とする核酸の精製装置。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に基づく一実施例である核酸精製装置を図１〜図８を参照して説明する。本実施例では本発明を洗浄工程に適用した例を示す。図６は一実施例の装置の平面図、図７はその外観図、図８は電気系のブロックダイヤグラム、図１及び２は核酸捕捉用チップを接続した分注器と流路洗浄用の洗浄液送液機構の概略図、図３は液体分注用チップの取り付け動作の説明図、図４はチップを取り外す動作の説明図、図５は核酸捕捉用チップの構成を示す図である。
【００１４】
図６及び図７において、核酸の精製装置１００は、水平方向（Ｘ方向）に移動可能な２本のアーム１６、３３を具備する。一方のアーム１６には、分注ノズル３６（図３）を保持するノズルホルダー１７がアーム１６の長さ方向に沿って水平方向（Ｙ方向）に移動可能に取り付けられている。他方のアーム３３には、液体吸排用可動ノズル３９（図１）を保持するノズルホルダー３４がアーム３３の長さ方向に沿って水平方向（Ｙ方向）に移動可能に取り付けられている。ノズルホルダー１７、３４は、対応するアーム１６、３３に対し、いずれも上下方向（Ｚ方向）に動作できる。アーム１６の水平移動領域とアーム３３の水平移動領域とは、部分的にオーバーラップするので、各アームの取り付け高さ位置を違えてある。
【００１５】
本体架台の作業面５には、未使用の多数の分注用チップ１５を載置した３個のチップラック１４ａ、１４ｂ、１４ｃが所定エリアにセットされる。これらのチップラック１４は、図３に示すように、各分注用チップ１５を挿入し得る穴を有しており、分注用チップの先端部が作業面５又はチップラック底面に接触しないような高さを持った箱形をなす。各チップラック１４ａ、１４ｂ、１４ｃは夫々最大４８本までの分注用チップ１５を保持できる。
【００１６】
また、作業面５には、未使用の多数の核酸捕捉用チップ３１を載置したチップラック３０が所定エリアにセットされる。チップラック３０の形状は、先のチップラック１４と同様である。この例ではチップラック３０上に最大４８本までの核酸捕捉用チップ３１を保持できる。
【００１７】
作業面５には、処理対象となる検体、すなわち核酸を含有する試料を収容した検体容器１３が複数本ずつ保持される検体ラック１２が所定エリアにセットされる。この例では、各検体ラック１２は６本の検体容器１３を保持できる。また、検体ラック１２は８個またはそれ以上の数をセットできる。
【００１８】
また、作業面５には、未使用の処理容器２４を多数保持した容器ラック２３が所定エリアにセットされる。容器ラック２３は、最大４８本までの処理容器２４を保持できる。さらに、作業面５には、未使用の精製品用容器２６を多数保持した容器ラック２５が所定エリアにセットされる。この精製品用容器は、精製処理がなされた核酸含有液を試料別に回収するものである。この例では、容器ラック２５は、最大４８本の精製品用容器２６を保持できる。
【００１９】
作業面５には、プライミングの際に分注ノズル３６から放出される水を受け入れると共に分注ノズル３６のホームポジションとなる液受け部１１と、分注作業をする分注チップ１５を洗浄するための洗浄部１８と、分注ノズル３６に接続された分注用チップ１５及び液体吸排用可動ノズル３９に接続された核酸捕捉用チップ３１を夫々のノズルから取り外すためのチップ外し器２７と、プライミングの際に液体吸排用可動ノズル３９から放出される水を受け入れると共に該可動ノズル３９のホームポジションとなる液受け部２８と、核酸捕捉用チップ３１からの不要な液を排出するための廃液口２９とが設けられる。
【００２０】
また、作業面５上の夫々の所定位置には、核酸捕捉用チップ３１内の固相を洗浄するための洗浄液を収容した洗浄液ボトル１９、固相に結合された核酸を溶出させるための溶離液を収容した溶離液ボトル２０、希釈液を収容した希釈液ボトル２１、及び固相への核酸の結合を促進する結合促進物質の溶液を収容した結合促進剤ボトル２２等がセットされる。
【００２１】
図３に示すシリンジポンプ１０と図１に示すシリンジポンプ３２は、それぞれ本体架台に取り付けられており、液体の吸入動作と吐出動作の制御が各ポンプ独自になされる。図３に示すように、ノズルホルダー１７に保持された分注ノズル３６は、可撓性の管４２を介して液体吸排用のシリンダポンプ１０に連通されている。分注ノズル３６内及び管４２内には純水が満たされており、シリンジポンプ１０は図示しない純水供給源に接続されている。図１に示すように、ノズルホルダー３４に保持された可動ノズル３９は、可撓性の管３５を介してシリンジポンプ３２に接続されている。可動ノズル３９内及び管３５内には純水が満たされており、シリンジポンプ３２は図示しない純水供給源に接続されている。 分注ノズル３６への分注用チップ１５の接続のための装着及び可動ノズル３９への核酸捕捉用チップ３１の接続のための装着は、それぞれに対応するチップラック１４、３０上において、各ノズルを降下してチップをノズルの先端部に嵌合することにより達成される。また、分注ノズル３６に接続された分注用チップ１５及び可動ノズル３９に接続された核酸捕捉用チップ３１をそれぞれのノズルから取り外す場合は、チップ外し器２７を利用する。図６及び図４に示すように、チップ外し器２７は、所定高さ位置に板状部材を有しており、この板状部材には、分注チップ１５の頭部５２及び核酸捕捉用チップ３１の頭部５４の外径よりも小さく、且つ分注ノズル３６及び可動ノズル３９の外径より大きな幅のスリット５５が形成されている。スリット５５が位置する高さよりも各チップの頭部５２，５４が低い状態でノズル３６，３９をスリット内に浸入するように水平移動させ、次いでノズルホルダー１７，３４を上昇させると頭部５２，５４が板状部材の下面に当接し、ノズルホルダーの更なる上昇によりチップ１５，３１がノズルから抜け落ちる。抜け落ちたチップは、チップ廃棄口５０（図６）に落下し回収箱（図示せず）内に回収される。
【００２２】
図８に、図６の核酸精製装置の電気系の構成を示す。動作制御部としてのパーソナルコンピュータ（ＰＣ）６０には、操作条件及び検体情報を入力するための操作パネルとしてのキーボード６１、入力情報や警告情報等を表示するための表示装置としてのＣＲＴ６２、装置の各機構部を制御する機構制御部６５等が接続される。機構制御部６５は、シリンジポンプ１０に吸排動作を行わせるためのピストン駆動用のステッピングモータ７１、シリンジポンプ３２に吸排動作を行わせるためのピストン駆動用のステッピングモータ７２、ノズルホルダー１７を水平移動及び上下動させるためのステッピングモータ７３、ノズルホルダー３４を水平移動及び上下動させるためのステッピングモータ７４、アーム１６を水平移動させるためのＡＣサーボモータ７５、アーム３３を水平移動させるためのＡＣサーボモータ７６、洗浄液吐出用のためのベローズポンプ８０、洗浄液流路の切替えるための電磁弁８１、シリンジポンプ３２内へ空気を吸入するための電磁弁８２等を制御する。精製装置の各部は、所定のプログラムに従って動作される。
【００２３】
図５に、核酸捕捉用チップ３１の１つの例の構成を示す。核酸捕捉用チップ３１は、頭部５４が可動ノズル３９の先端部に気密に嵌合される内径を有しており、下方が先端部４８に向けて徐々に内径が細くなるように形成される。チップ３１は透明もしくは半透明な合成樹脂からなる。チップ３１の先端部側には、固相が流出することを防止するための円板状の阻止部材４０ｂを圧入により挿入し、頭部５４の側には円板状の阻止部材４０ａを設ける。これらの阻止部材４０ａ，４０ｂは、液体及び気体が容易に通過し得る多数の孔を有するが、その孔は固相の流出を阻止できる大きさである。阻止部材４０ａ，４０ｂの材質としては、非特異吸着が少なく親水性を有するポリビニリデンフロライドを用いる。この材質は、タンパク質や核酸等の非特異吸着を少なくできるので、核酸の精製度や収率への影響が小さい。阻止部材４０ａは、チップ３１への挿入を容易にするための突起状の挿入用補助ガイド３７を下面側に複数個有する。阻止部材４０ａと４０ｂによって挟まれた部屋には、固相としてフリントガラス（和光純薬工業製）の粉末４４を充填する。このフリントガラスは核酸捕捉効果を有するシリカの含有量が高い。
【００２４】
次に、図６の実施例による核酸の精製操作を説明する。
核酸含有試料の精製操作を開始する前に、市販の精製品であるｐＢＲ３２２ＤＮＡ（Fermentas 社製）をトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．５，ＴＥ溶液）により所定濃度にした溶液を調製し、検体容器１３に入れて検体ラックに保持させ、図６の装置１００上の検体エリアにセットした。分注チップ１５を有するチップラック１４、核酸捕捉用チップ３１を有するチップラック３０、各ボトル１９、２０、２１、２２、処理容器２４を有する容器ラック２３、及び精製品用容器２６を有する容器ラック２５を、それぞれ所定の場所にセットした後、精製装置１００による操作を開始した。
【００２５】
まず、ノズルホルダー１７を動作させ、液受け部１１に位置していた分注ノズル３６を検体用のチップラック１４ａ上へ移動し、第１番目の分注用チップを分注ノズル３６に嵌合する。次いで、取り付けた分注用チップ１５を結合促進剤ボトル２２上へ移動し、該ボトル内へ降下し、シリンジポンプ１０に吸引動作させることにより分注用チップ１５内に所定量の塩酸グアニジン溶液を吸入する。分注用チップを結合促進剤ボトル２２内から上昇させ、分注用チップの先端部に少量の空気を引入し、洗浄部１８へ移動して分注用チップの外壁に洗浄水を噴射させることにより分注用チップ１５の外壁を洗浄する。次いで、分注ノズル３６を検体ラック１２上の第１番目の検体容器１３まで移動し、分注用チップ１５を検体容器内に降下し、シリンジポンプ１０の吸引動作により分注用チップ１５内に所定量の検体を吸入する。これにより、分注用チップ１５内には、塩酸グアニジン溶液、空気、及び核酸含有試料液の各層が形成される。
【００２６】
検体を吸入した分注用チップ１５を容器ラック２３上の第１番目の処理容器２４上へ移動し、その処理容器２４へ分注用チップ１５内の検体及び塩酸グアニジン溶液の全量を吐出する。その吐出後に再び吐出液の全量を同じ分注用チップ１５内に吸入し、更に第１番目の処理容器２４へ吐出することを１回以上行う。これにより核酸含有試料と結合促進剤を混合する。その後、分注ノズル３６をチップ外し器２７まで移動し、上述した取り外し動作に従って、分注ノズル３６から使用済みの分注用チップ１５を取り外す。次いで、分注ノズル３６を液受け部１１の位置に戻し、分注ノズル３６から純水を所定量吐出させた後、分注ノズル３６の先端部に少量の空気を吸入し、ノズルホルダー１７に対する次の動作指令があるまで待機する。
【００２７】
分注ノズル３６が混合動作を行っている間に、アーム３３及びノズルホルダー３４の動作により液体吸排用可動ノズル３９を、液受け部２８からチップラック３０上の第１番目の核酸捕捉用チップ３１の位置へ移動し、可動ノズル３９の先端部に核酸捕捉用チップ３１を嵌合する。その後、可動ノズル３９は核酸捕捉用チップ３１を結合した状態で容器ラック２３上の第１番目の処理容器２４の位置へ移動し、核酸捕捉用チップ３１を降下し、そのチップ内に、第１番目の処理容器に入っている検体と結合促進剤の混合液の全量を、シリンジポンプ３２の吸引動作により核酸捕捉用チップ３１内に吸入する。これにより混合液がチップ３１内の固相としてのガラス粉末４４の表面に接触する。次いで、吸入した混合液を第１番目の処理容器２４内に吐出して戻し、吐出された混合液を再び同一の核酸捕捉用チップ３１内に吸入する。この混合液の吐出と吸入を複数回繰り返すことにより固相表面と混合液との接触数を増大し、固相による核酸の吸着効率を高める。
【００２８】
所定回数の吸排の後に最終的に第１番目の核酸捕捉用チップ３１内へ混合液の全量を吸入し、該チップ３１を廃液口２９へ移動して核酸吸着後の残液を、シリンジポンプ３２の吐出動作により廃液口２９内へ排出する。
続いて流路切替え用電磁弁８１を動作させ、洗浄液流路と核酸捕獲用チップ３１と接続する。続いてベローズポンプ８０を動作させ、洗浄液を該チップ内に注入する。本手段はベローズポンプに限らず、シリンジポンプ等、送液機能を有するものであれば良い。
【００２９】
該洗浄液は該チップの頭部（上方）から先端部（下方）に向けて一方向に流動させる。該チップ内を通過した洗浄液はそのままチップ下面から廃液口２９へ連続的に排出する。洗浄液吐出終了後電磁弁８１を動作させ、流路をシリンジ３２へ切り替える。続いて電磁弁８２を動作させ、シリンジポンプ１０内へ空気を取り入れ可能とする。その後シリンジ３２を動作させ、シリンジ内に空気を吸引する。核酸捕捉用チップ３１には抵抗となる核酸捕捉用固相が設置されているため、空気のほとんどは電磁弁８２で開状態となった抵抗の少ない流路より吸引される。続いて電磁弁８２を閉じ、空気の吸入を停止させる。続いてシリンジ３２を前記と反対方向に動作させ、核酸捕捉用チップ３１内に空気を吐出し、前記チップ内の残液をすべて吐出する。このような洗浄動作により、核酸捕捉用チップ３１の内壁及び固相の表面が洗浄される。
【００３０】
更に洗浄効率を上げるため、洗浄工程を繰り返すことも可能である。２回目の洗浄操作は１回目の洗浄操作と同様のステップを経る。必要であれば、３回目の洗浄操作を行うようにすることができる。洗浄液を廃液口２９へ排出して洗浄操作が終了した核酸捕捉用チップ３１は、液受け部２８へ移動し、待機する。なお、洗浄液は、濃度が７０％のエタノール水溶液である。
【００３１】
核酸の溶離工程に当り、分注ノズル３６がチップラック１４ｃ上の第１番目の分注用チップの位置へ移動され、分注ノズル３６の降下により該ノズル３６の先端部に分注用チップ１５を嵌合する。分注用チップを接続した分注ノズル３６は溶離液ボトル２０の位置へ移動する。溶離液ボトル２０内には、溶離液としての純水が収容されている。望ましくは、溶離液ボトル２０が加温されている。シリンジポンプ１０の吸引動作により、分注用チップ１５内に、複数回使用し得る量の溶離液が吸入される。続いて分注用チップ１５は容器ラック２３上の第１番目の処理容器２４上へ移動され、シリンジポンプ１０の押出し動作により、分注用チップ１５から１回分の量の溶離液を第１番目の処理容器２４内に吐出する。残りの量の溶離液を保有している分注用チップ１５は、液受け部１１へ移動し、待機する。
【００３２】
液受け部２８で待機していた核酸捕捉用チップ３１を容器ラック２３上の第１番目の処理容器２４へ移動し、溶離液が入っている第１番目の処理容器２４内の溶離液を核酸捕捉用チップ３１内に吸入する。これにより溶離液が固相に接触し１３相表面に吸着されていた核酸を溶離液中に溶出させる。チップ３１内に吸入した溶離液を元の処理容器２４へ吐出した後、再度同一チップ３１内に吸入する操作を所定回数繰り返して、最終的に溶離液を吸入保持した核酸捕捉溶チップ３１を、容器ラック２５上の第１番目の精製品用容器２６の位置へ移動する。シリンジポンプ３２の押出し動作により核酸捕捉用チップ３１内にあった溶離液を第１番目の精製品用容器２６内に吐出する。これにより精製品容器２６には、固相から溶出された核酸を含む溶離液が回収される。溶離液吐出後の核酸捕捉用チップ３１は液受け部２８へ移動され待機する。
次いで、溶離液を保持した状態の分注用チップ１５が、液受け部１１から第１番目の処理容器２４へ移動し、次の１回分の溶離液を該当処理容器内へ吐出する。
【００３３】
続いて、液受け部２８にて待機していた核酸捕捉用チップ３１を第１番目の処理容器２４へ移動し、処理容器２４内の溶離液を核酸捕捉用チップ３１内に吸入し、上述したと同様の核酸溶出操作を実行した後、核酸を含む溶離液を第１番目の精製品用容器２６内に回収する。このような分注用チップ１５による溶離液の供給操作と核酸捕捉用チップ３１による溶出操作は、所定回数、例えば３回繰り返される。溶離液の吐出を終了した分注用チップ１５は、チップ外し器２７へ移動し、分注ノズル３６から使用済みの分注用チップ１５を取り外す。分注用チップを外した分注ノズル３６は、液受け部１１へ移動し、ノズル先端部から水を吐出した後、ノズル先端部に微量の空気を吸入し、その位置で待機する。また、精製品用容器２６への核酸含有溶離液の複数回の吐出を終了した核酸捕捉用チップ３１は、チップ外し器２７へ移動し、可動ノズル３９から使用済みの核酸捕捉用チップ３１を取り外す。核酸捕捉用チップを外した可動ノズル３９は、液受け部２８へ移動し、ノズルから所定量の水を吐出した後、ノズル先端部に微量の空気を吸入し、その位置で待機する。
【００３４】
以上で、第１番目の検体に対する核酸の精製操作が終了する。このあと、図６の精製装置１００は、第２番目以降の検体に対し核酸精製操作を続行するが、その操作は上述した例の繰り返しである。なお、第１番目の検体に対しては、各分注ラック１４ａ，１４ｂ，１４ｃ上の第１番目の分注用チップと、チップラック３０上の第１番目の核酸捕捉用チップと、容器ラック２３上の第１番目の処理容器２４と、容器ラック２５上の第１番目の精製品用容器を用いたが、第２番目の検体に対しては、これらの第２番目の部品がそれぞれ使用され、第３番目以降の検体に対しても同様に部品が変更される。従って、容器ラック２５上の精製品容器列には、検体の順番に応じて、精製回収された核酸含有液が検体別に回収される。これらの部品は、検体毎に新しいものが使用されるので、検体相互間のコンタミネーションが防止される。
なお、本実施例では１分注ノズルに対して１洗浄液流路を設けた例を示しているが、切替え弁を増やすことにより複数の洗浄液流路を設けることもできる。
【００３５】
続いて本発明による洗浄方法の他の実施例について説明する。図２は流路内に分岐を設けず、液体吸排用可動ノズル３９内に直接洗浄液を流し込む構成である。他部分の構成は前記実施例と同様である。
所定回数の吸排の後に最終的に第１番目の核酸捕捉用チップ３１内へ混合液の全量を吸入し、該チップ３１を廃液口２９へ移動して核酸吸着後の残液を、シリンジポンプ３２の吐出動作により廃液口２９内へ排出する。
【００３６】
続いて洗浄液開閉弁８３を動作させ、洗浄液容器１９とシリンジポンプ８４とを接続する。続いてシリンジポンプ８４を動作させ洗浄液をシリンジポンプ内に吸引する。続いて洗浄液開閉弁８３を再び動作させ、シリンジポンプ８４を核酸捕捉用チップ３１に接続する。続いてシリンジポンプ８４を反対方向に動作させ、洗浄液を該チップ内に注入する。該洗浄液は該チップ上方から下方に向けて一方方向に吐出させる。該チップ内を通過した洗浄液はそのままチップ下面から廃液口２９へ連続的に排出する。洗浄液吐出終了後、空気吸入切替え弁８２を動作させ、空気取り入れを可能な状態にする。再びシリンジポンプ８４を動作させ、シリンジポンプ内に空気を吸引する。空気吸入切替え弁８２を動作させ、シリンジポンプ８４を核酸捕捉用チップ３１に接続する。再びシリンジポンプ３２を反対方向に動作させ、核酸捕捉用チップ３１内に空気を吐出し、前記チップ内の残液をすべて吐出する。本実施例では１分注ノズルに対して１洗浄液流路を設けた例を示しているが、複数の洗浄液流路を設けることもできる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明により、コンタミネーションの発生およびノズルチップ内の液残りがなく、かつ洗浄効率の高い核酸の精製方法及び精製装置を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の核酸精製装置において、流路切替え弁を設けた分注器の概略構成を示す図である。
【図２】 本発明の核酸精製装置において、洗浄液専用流路を設けた分注器の概略構成を示す図である。
【図３】 本発明の核酸精製装置における液体分注用チップをノズルに取り付ける動作の説明図である。
【図４】 本発明の核酸精製装置におけるノズルからチップを取り外す動作の説明図である。
【図５】 本発明の核酸精製装置における核酸捕捉用チップの概略構成図である。
【図６】 本発明の核酸精製装置の一実施例の平面図である。
【図７】 本発明の核酸精製装置の一実施例の概略外観図である。
【図８】 本発明の核酸精製装置の一実施例における電気系の構成を示すブロックダイヤグラムである。
【符号の説明】
１０，３２…シリンジポンプ、１２…検体ラック、１５…分注用チップ、１６，３３…アーム、１７，３４…ノズルホルダー、１９…洗浄液ボトル、２０…溶離液ボトル、２２…結合促進剤ボトル、２４…処理容器、２６…精製品用容器、２７…チップ外し器、３１…核酸捕捉用チップ、３６…分注ノズル、３９…液体吸排用可動ノズル、４０ａ，４０ｂ…阻止部材、４４…ガラス粉末、８０…洗浄液吸引ポンプ、８１…流路切替え弁、８２…空気吸入切替え弁、８３…洗浄液開閉弁、８４…シリンジポンプ、８５…洗浄液専用流路、８６…エアフィルタ、１００…精製装置。
Claims (11)
- 核酸捕捉材含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップを用いて、当該固相に核酸を捕捉させ、核酸の抽出を行なう核酸の精製方法において、上記核酸が捕捉された固相を内蔵するチップ内をその頭部から先端部へ向けて一方向に洗浄液を流動させることを特徴とする核酸の精製方法。
- 請求項１において、核酸捕捉用チップに至る流路中に洗浄液流路の分岐を設け洗浄液を注入することを特徴とする核酸の精製方法。
- 請求項１において、洗浄液を核酸捕捉用チップに流入される専用流路を設けたことを特徴とする核酸の精製方法。
- 請求項１において、流路内に空気を送気することを特徴とする核酸の精製方法。
- 請求項１において、洗浄液吐出と空気送気を交互に繰り返すことを特徴とする核酸の精製方法。
- 核酸捕捉材含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップを用いて、当該固相に核酸を捕捉させ、核酸の抽出を行なう核酸の精製装置において、上記核酸が捕捉された固相を、内蔵するチップ内をその頭部から先端部へ向けて一方向に洗浄液を流動させる手段を設けたことを特徴とする核酸の精製装置。
- 請求項６において、核酸捕捉用チップに至る流路中に洗浄液流路の分岐を設け洗浄液を注入する手段を備えることを特徴とする核酸の精製装置。
- 請求項６において、洗浄液を核酸捕捉用チップに流入される専用流路を備えることを特徴とする核酸の精製装置。
- 請求項６において、流路内に空気を送気する手段を備えること特徴とする核酸の精製装置。
- 請求項６において、洗浄液吐出と空気送気を交互に繰り返す手段を備えることを特徴とする核酸の精製装置。
- 核酸捕捉材含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップを用いて、
当該固相に核酸を捕捉させ、核酸の抽出を行なう核酸の抽出装置において、
核酸捕捉材含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップと、
該核酸捕捉用チップを着脱可能に接触する液体吸排用可動ノズルと、
上記固相への核酸の捕捉を促進する物質と核酸含有試料との混合液を収容し得る処理溶液と、
上記核酸捕捉用チップの頭部から先端部へ向けて一方向に洗浄液を流動させる手段と、
上記核酸捕捉用チップへ溶離液を供給する手段と、
上記核酸捕捉用チップから上記精製品用容器へ溶離液を吐出した後に、上記液体吸排用可動ノズルから上記核酸捕捉用チップを取り外すチップ取り外し手段と、核酸の精製品を受け入れるための精製品容器と、
を備えたことを特徴とする核酸の精製装置。
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