JP2002191351A - 核酸の精製用装置および核酸捕捉用チップ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】核酸を含有する試料から精製度の高い核酸を回
収するための自動化装置を提供する。 【解決手段】ノズルに接続した分注用チップ１５を用い
て検体及び結合促進剤を処理容器２４に供給し、処理容
器内の混合液を核酸捕捉用チップ３１内に吸入して該チ
ップに内蔵される固相により核酸を捕捉する。固相洗浄
後の核酸捕捉用チップ内に溶離液を吸入し、溶出された
核酸を含む液を精製品用容器２６に回収する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸の精製方法お
よび精製用装置に係り、特に、生物試料に含まれる核酸
を共存物質から分離して取り出すのに適した方法および
装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】分子生物学の進歩によって、遺伝子に関
する数々の技術が開発され、また、それらの技術により
多くの疾患性の遺伝子が分離され、同定された。その結
果、医療の分野でも、診断、或いは、検査法に分子生物
学的な技術法が取り入れられ、従来不可能であった診断
が可能となったり、検査日数の大幅短縮が達成されつつ
ある。

【０００３】このような進歩は、核酸増幅法、特に、ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法と称される、polymerase
chain reaction）の実用化によるところが大きい。Ｐ
ＣＲ法は、溶液中の核酸を配列特異的に増幅することが
可能なため、例えば、血清中に極微量しか存在しないウ
イルスを、そのウイルスの遺伝子である核酸を増幅し検
出することにより、間接的に証明できる。しかし、この
ＰＣＲ法を臨床の場で日常検査に使用した際に、いくつ
かの問題点が存在する。その中でも特に、前処理におけ
る核酸の抽出、精製工程が精度維持のために重要であ
る。核酸の精製に関しては、いくつかの手法が提案され
ている。

【０００４】特開平２−２８９５９６号公報は、カオト
ロピック物質の存在下で核酸と結合することが可能なシ
リカ粒子を、核酸結合用固相として使用することを教示
している。この特開平２−２８９５９６号公報には、シ
リカ粒子の懸濁液とカオトロピック物質としてのグアニ
ジチオシアネート緩衝液とが入った反応容器に、核酸を
含む試料を加えて混合し、核酸がシリカ粒子に結合され
た複合体を遠心分離した後、上清を廃棄し、残った複合
体に洗浄液を加えてボルテックスミキサーを使用して洗
浄し、再沈澱した複合体をエタノール水溶液で洗浄した
後アセトンで洗浄し、アセトンを除去して乾燥した複合
体に溶離用緩衝液を加えて核酸を溶離して回収する精製
方法が記載されている。

【０００５】また、特開平８−３２０２７４号公報は、
単一検体のために多数の容器と分注チプを用いてＤＮＡ
を単離する方法を教示している。この特開平８−３２０
２７４号公報には、次の点が記載されている。すなわ
ち、移動機構によって移動されるピペットノズルに第１
チップを装着し、その第１チップ内に検体を吸引する。
次いで、第１チップの下端に血球の殻を取るフィルタを
嵌合し、該フィルタを通して第１チップ内の検体を第１
容器へ吐出する。その後、ピペットノズルからフィルタ
及び第１チップを取り外し、ピペットノズルの下端に第
２チップを装着し、第１容器内の検体を第２チップ内に
吸引する。

【０００６】次いで、第２チップの下端にＤＮＡを捕獲
するためのシリカメンブランフィルタを嵌合し、第２チ
ップ内の検体をシリカメンブランを通して第２容器へ吐
出することによりシリカメンブランでＤＮＡを捕獲する
と共に爽雑物を第２容器に吐出する。その後、ピペット
ノズルを洗浄液が収容された第３容器まで移送し、ＤＮ
Ａを捕獲したシリカメンブランフィルタを第２チップか
ら取り外して、第３容器の洗浄液中に浸漬する。次い
で、第２チップを取り外したピペットノズルに第３チッ
プを装着し、第３チップ下端に第３容器内のシリカメン
ブランフィルタを嵌合し、第３チップ内に洗浄液とＤＮ
Ａの混合液を吸引した後、その混合液を第４容器内に吐
出する。

【０００７】さらに、特開平７−２５０６８１号公報
は、ガラスパウダー層を２枚のガラス繊維フィルタとメ
ンブランフィルタで挟んだ四重構造の濾過部材を有する
カートリッジ容器を用いてＤＮＡ抽出液を精製する方法
を教示している。この特開平７−２５０６８１号公報で
は、調製されたＤＮＡ含有培養液を前処理しトラップフ
ィルタに形質転換体を集菌し、溶菌用試薬を添加してプ
ラスミドＤＮＡを細胞外に溶出させたものを精製用試料
とする。精製工程では、カートリッジ容器に精製用試薬
とカオトロピックイオン生成用試薬（ヨウ化ナトリウ
ム）を添加し、カートリッジ容器に真空減圧又は遠心分
離処理を施しカートリッジ容器のガラスパウダー層にプ
ラスミドＤＮＡを吸着させる。次いで、カートリッジ容
器に洗浄用緩衝液を添加して真空減圧又は遠心分離処理
により洗浄し、その後、カートリッジ容器に溶出用緩衝
液を添加して真空減圧又は遠心分離操作を施し、プラス
ミドＤＮＡのみを溶出する。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上述した先行技術の
内、特開平２−２８９５９６号公報の方法は、遠心分析
操作が必要なため精製工程の自動化が困難である。ま
た、特開平７−２５０６８１号公報の方法は、真空減圧
又は遠心分離操作を複数回行われなければならないため
自動化が困難である。さらに、特開平８−３２０２７４
号公報の方法は、シリカメンブランを通して検体を第２
チップ内から吐出するときにＤＮＡを捕獲するように構
成されているため、検体とシリカメンブランの接触時間
が短くＤＮＡの捕捉率が低い。

【０００９】本発明の目的は、自動化が容易であるにも
かかわらず、核酸捕捉時の試料と固相との接触時間を充
分に確保できる核酸の精製方法及び精製用装置を提供す
ることにある。

【００１０】また、本発明の目的は、核酸の固相への捕
捉、捕捉物の洗浄および捕捉物の溶離の各工程を、液体
が吸排される１つの固相内蔵チップを用いて実行可能で
ある核酸の精製方法および精製用装置を提供することに
ある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明に基づく核酸の精
製方法は、シリカ含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チッ
プを、液体吸排用可動ノズルに着脱可能に接続するこ
と、固相への核酸の結合を促進する物質と核酸含有試料
との混合液を、所定容器内から上記液体吸排用可動ノズ
ルに接続された核酸捕捉用チップ内に吸入すること、吸
入された混合液中の核酸を固相に結合させた後、核酸捕
捉用チップ内の液体を排出すること、液体は排出後の核
酸捕捉用チップ内に洗浄液を吸入し、次いで該洗浄液を
核酸捕捉用チップから排出することにより、核酸を結合
した状態の固相及び核酸捕捉用チップ内を洗浄するこ
と、及び洗浄後の核酸捕捉用チップ内に溶離液を吸入
し、固相から離脱された核酸を含む溶離液を精製品用容
器に吐出すること、を特徴とする。

【００１２】本発明の望ましい実施例では、処理対象の
試料が変わる毎に液体吸排用可動ノズルに接続する核酸
捕捉用チップが新しいものに交換される。また、核酸捕
捉用チップ内への試料混合液の吸入工程では、一旦吸入
した混合液を元の所定容器に吐出して再び核酸捕捉用チ
ップ内へ吸入することを繰り返し混合液と固相との接触
回数を多くする。洗浄工程時の洗浄液及び溶離工程時の
溶離液は、複数回に分けて核酸捕捉用チップに吸排され
る。

【００１３】本発明に基づく核酸の精製用装置は、シリ
カ含有の固相を液体に接触可能に内蔵した核酸捕捉用チ
ップと、該核酸捕捉用チップを着脱可能に接続する液体
吸排用可動ノズルと、固相への核酸の結合を促進する物
質と核酸含有試料との混合液を収容し得る処理容器と、
この処理容器へ洗浄液を供給する手段と、処理容器へ溶
離液を供給する手段と、核酸の精製品を受け入れるため
の精製品用容器と、未使用状態の核酸捕捉用チップを液
体吸排用可動ノズルに接続せしめ、接続状態にある核酸
捕捉用チップを処理容器及び精製品用容器の位置へ移動
せしめる搬送手段と、液体吸排用可動ノズルに接続され
ている核酸捕捉用チップに、混合液を吸排せしめた後、
洗浄液を吸排せしめ、その後に溶離液を吸排せしめる液
体吸排作用手段と、核酸捕捉用チップから精製品用容器
へ溶離液を吐出した後に、液体吸排用可動ノズルから核
酸捕捉用チップを取り外すチップ取り外し手段と、を備
えたことを特徴とする。

【００１４】

【発明の実施の形態】核酸含有試料としては、全血、血
清、喀痰、尿等の生体試料や培養細胞、培養細菌等の生
物学的な試料、あるいは、電気泳動後のゲルに保持され
た状態の核酸、ＤＮＡ増幅酵素等の反応産物や素精製状
態の核酸を含む物質等を対象とすることができる。な
お、ここでの核酸とは、２本鎖、１本鎖、あるいは部分
的に２本鎖もしくは１本鎖構造を有するデオキシリボ核
酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。

【００１５】シリカ含有の固相への核酸の結合を促進す
る物質としては、核酸の吸収ピークがある２６０ｎｍの
波長付近の吸収が少ない物質が好ましい。なぜなら、核
酸の純度や量の検定には、分光光度計により２６０ｎｍ
の吸収を測定することが多いからである。また、チオシ
アン酸を含む物質は、酸と反応すると致死性のガスを発
生するため取り扱い上好ましくない。本発明の望ましい
実施例では、これらの点を考慮し、カオトロピック剤と
して塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）を用いる。塩酸グア
ニジンの使用時の最終濃度は、４〜６ｍｏｌ／ｌである
ことが望ましい。

【００１６】核酸捕捉用チップに内蔵されるシリカ含有
固相としては、ガラス粒子、シリカ粒子、石英濾紙、石
英ウール、あるいは、それら破砕物、ケイソウ土など、
酸化ケイ素を含有する物質であれば使用することができ
るが、チップ外へ固相が出ないようにするために、チッ
プ先端部の内径を小さくし、且つ、固相をチップ先端部
内径よりも大きな外径を持たせる、或いは、チップ内の
先端部付近に、固相の外径より孔径の小さい保持材を設
置するなどにより、チップ内に試料を吸入したときに試
料が固相に大きな接触面積で接触されるように、固相が
チップ内に保持される。

【００１７】核酸を固相から溶離する工程は、洗浄工程
後の固相に対して低塩濃度の水溶液、或いは、水を混合
することにより達成される。この操作により核酸は固相
から水相へと移行するため、その水相を精製品用容器に
回収することで精製済みの核酸水溶液が得られる。

【００１８】以下、本発明に基づく一実施例である核酸
精製用装置を、図１〜図７を参照して説明する。図１は
一実施例の装置の平面図、図２はその外観図、図３は電
気系のブロックダイヤグラム、図４は核酸捕捉用チップ
を接続した分注器の概略図、図５は液体分注用チップの
取り付け動作の説明図、図６はチップを取り外す動作の
説明図、図７は核酸捕捉用チップの構成を示す図であ
る。

【００１９】図１及び図２において、核酸の精製用装置
１００は、水平方向（Ｘ方向）に移動可能な２本のアー
ム１６、３３を具備する。一方のアーム１６には、分注
ノズル３６（図５）を保持するノズルホルダー１７がア
ーム１６の長さ方向に沿って水平方向（Ｙ方向）に移動
可能に取り付けられている。他方のアーム３３には、液
体吸排用可動ノズル３９（図４）を保持するノズルホル
ダー３４がアーム３３の長さ方向に沿って水平方向（Ｙ
方向）に移動可能に取り付けられている。ノズルホルダ
ー１７、３４は、対応するアーム１６、３３に対し、い
ずれも上下方向（Ｚ方向）に動作できる。アーム１６の
水平移動領域とアーム３３の水平移動領域とは、部分的
にオーバーラップするので、各アームの取り付け高さ位
置を違えてある。

【００２０】本体架台の作業面５には、未使用の多数の
分注用チップ１５を載置した３個のチップラック１４
ａ、１４ｂ、１４ｃが所定エリアにセットされる。これ
らのチップラック１４は、図５に示すように、各分注用
チップ１５を挿入し得る穴を有しており、分注用チップ
の先端が作業面５又はチップラック底面に接触しないよ
うな高さを持った箱形をなす。各チップラック１４ａ、
１４ｂ、１４ｃは夫々最大４８本までの分注用チップ１
５を保持できる。

【００２１】また、作業面５には、未使用の多数の核酸
捕捉用チップ３１を載置したチップラック３０が所定エ
リアにセットされる。チップラック３０の形状は、先の
チップラック１４と同様である。この例ではチップラッ
ク３０上に最大４８本までの核酸捕捉用チップ３１を保
持できる。

【００２２】作業面５には、処理対象となる検体、すな
わち核酸を含有する試料を収容した検体容器１３が複数
本ずつ保持される検体ラック１２が所定エリアにセット
される。この例では、各検体ラック１２は６本の検体容
器１３を保持できる。また、検体ラック１２は８個また
はそれ以上の数をセットできる。

【００２３】また、作業面５には、未使用の処理容器２
４を多数保持した容器ラック２３が所定エリアにセット
される。容器ラック２３は、最大４８本までの処理容器
２４を保持できる。さらに、作業面５には、未使用の精
製品用容器２６を多数保持した容器ラック２３が所定エ
リアにセットされる。この精製品用容器は、精製処理が
なされた核酸含有液を試料別に回収するものである。こ
の例では、容器ラック２５は、最大４８本の精製品用容
器２６を保持できる。

【００２４】作業面５には、プライミングの際に分注ノ
ズル３６から放出される水を受け入れると共に分注ノズ
ル３６のホームポジションとなる液受け部１１と、分注
作業をする分注チップ１５を洗浄するための洗浄部１８
と、分注ノズル３６に接続された分注用チップ１５及び
液体吸排用可動ノズル３９に接続された核酸捕捉用チッ
プ３１を夫々のノズルから取り外すためのチップ外し器
２７と、プライミングの際に液体吸排用可動ノズル３９
から放出される水を受け入れると共に該可動ノズル３９
のホームポジションとなる液受け部２８と、核酸捕捉用
チップ３１からの不要な液を排出するための廃液口２９
とが設けられる。

【００２５】また、作業面５上の夫々の所定位置には、
核酸捕捉用チップ３１内の固相を洗浄するための洗浄液
を収容した洗浄液ボトル１９、固相に結合された核酸を
溶出させるための溶離液を収容した溶離液ボトル２０、
希釈液を収容した希釈液ボトル２１、及び固相への核酸
の結合を促進する結合促進物質の溶液を収容した結合促
進剤ボトル２２等がセットされる。

【００２６】図５に示すシリンジポンプ１０と図４に示
すシリンジポンプ３２は、それぞれ本体架台に取り付け
られており、液体の吸入動作と吐出動作の制御が各ポン
プ独自になされる。図５に示すように、ノズルホルダー
１７に保持された分注ノズル３６は、可撓性の管４２を
介して液体吸排用のシリンダポンプ１０に連通されてい
る。分注ノズル３６内及び管４２内には純水が満たされ
ており、シリンジポンプ１０は図示しない純水供給源に
接続されている。図４に示すように、ノズルホルダー３
４に保持された可動ノズル３９は、可撓性の管３５を介
してシリンジポンプ３２に接続されている。可動ノズル
３９内及び管３５内には純水が満たされており、シリン
ジポンプ３２は図示しない純水供給源に接続されてい
る。

【００２７】分注ノズル３６への分注用チップ１５の接
続のための装着及び可動ノズル３９への核酸捕捉用チッ
プ３１の接続のための装着は、それぞれに対応するチッ
プラック１４、３０上において、各ノズルを降下してチ
ップをノズルの先端に嵌合することにより達成される。
また、分注ノズル３６に接続された分注用チップ１５及
び可動ノズル３９に接続された核酸捕捉用チップ３１を
それぞれのノズルから取り外す場合は、チップ外し器２
７を利用する。

【００２８】図１及び図６に示すように、チップ外し器
２７は、所定高さ位置に板状部材を有しており、この板
状部材には、分注チップ１５の頭部５２及び核酸捕捉用
チップ３１の頭部５４の外径よりも小さく、且つ分注ノ
ズル３６及び可動ノズル３９の外径より大きな幅のスリ
ット５５が形成されている。スリット５５が位置する高
さよりも各チップの頭部５２，５４が低い状態でノズル
３６，３９をスリット内に浸入するように水平移動さ
せ、次いでノズルホルダー１７，３４を上昇させると頭
部５２，５４が板状部材の下面に当接し、ノズルホルダ
ーの更なる上昇によりチップ１５，３１がノズルから抜
け落ちる。抜け落ちたチップは、チップ廃棄口５０（図
１）に落下し回収箱（図示せず）内に回収される。

【００２９】図３に、図１の核酸精製用装置の、電気系
の構成を示す。動作制御部としてのパーソナルコンピュ
ータ（ＰＣ）６０には、操作条件及び検体情報を入力す
るための操作パネルとしてのキーボード６１、入力情報
や警告情報等を表示するための表示装置としてのＣＲＴ
６２、装置の各機構部を制御する機構制御部６５等が接
続される。

【００３０】機構制御部６５は、シリンジポンプ１０に
吸排動作を行わせるためのピストン駆動用のステッピン
グモータ７１、シリンジポンプ３２に吸排動作を行わせ
るためのピストン駆動用のステッピングモータ７２、ノ
ズルホルダー１７を水平移動及び上下動させるためのス
テッピングモータ７３、ノズルホルダー３４を水平移動
及び上下動させるためのステッピングモータ７４、アー
ム１６を水平移動させるためのＡＣサーボモータ７５、
アーム３３を水平移動させるためのＡＣサーボモータ７
６等を制御する。精製装置の各部は、所定のプログラム
に従って動作される。

【００３１】図７に、核酸捕捉用チップ３１の１つの例
の構成を示す。核酸捕捉用チップ３１は、頭部５４が可
動ノズル３９の先端に気密に嵌合される内径を有してお
り、下方が先端４８に向けて徐々に内径が細くなるよう
に形成される。チップ３１は透明もしくは半透明な合成
樹脂からなる。チップ３１の先端側には、固相が流出す
ることを防止するための円板状の阻止部材４０ｂを圧入
により挿入し、頭部５４の側には円板状の阻止部材４０
ａを設ける。

【００３２】これらの阻止部材４０ａ，４０ｂは、液体
及び気体が容易に通過し得る多数の孔を有するが、その
孔は固相の流出を阻止できる大きさである。阻止部材４
０ａ，４０ｂの材質としては、非特異吸着が少なく親水
性を有するポリビニリデンフロライドを用いる。この材
質は、タンパク質や核酸等の非特異吸着を少なくできる
ので、核酸の精製度や収率への影響が小さい。阻止部材
４０ａは、チップ３１への挿入を容易にするための突起
状の挿入用補助ガイド３７を下面側に複数個有する。阻
止部材４０ａと４０ｂによって挟まれた部屋には、固相
としてフリントガラス（和光純薬工業 製）の粉末４４
を充填する。このフリントガラスはシリカ含有量が高
い。

【００３３】次に、図１の実施例による核酸の精製操作
を説明する。核酸含有試料の精製操作を開始する前に、
市販の精製品であるｐＢＲ３２２ＤＮＡ（Ｆｅｒｍｅｎ
ｔａｓ 社製）をトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．
５，ＴＥ溶液）により所定濃度にした溶液を調製し、検
体容器１３に入れて検体ラックに保持させ、図１の装置
１００上の検体エリアにセットした。分注チップ１５を
有するチップラック１４、核酸捕捉用チップ３１を有す
るチップアック３０、各ボトル１９、２０、２１、２
２、処理容器２４を有する容器ラック２３、及び精製品
用容器２６を有する容器ラック２５を、それぞれ所定の
場合にセットした後、精製用装置１００による操作を開
始した。

【００３４】まず、ノズルホルダー１７を動作させ、液
受け部１１に位置していた分注ノズル３６を検体用のチ
ップラック１４ａ上へ移動し、第１番目の分注用チップ
を分注ノズル３６に嵌合する。次いで、取り付けた分注
用チップ１５を結合促進剤ボトル２２上へ移動し、該ボ
トル内へ降下し、シリンジポンプ１０に吸引動作させる
ことにより分注用チップ１５内に所定量の塩酸グアニジ
ン溶液を吸入する。分注用チップを結合促進剤ボトル２
２内から上昇させ、分注用チップの先端に少量の空気を
引入し、洗浄部１８へ移動して分注用チップの外壁に洗
浄水を噴射させることにより分注用チップ１５の外壁を
洗浄する。次いで、分注ノズル３６を検体ラック１２上
の第１番目の検体容器１３まで移動し、分注用チップ１
５を検体容器内に降下し、シリンジポンプ１０の吸引動
作により分注用チップ１５内に所定量の検体を吸入す
る。これにより、分注用チップ１５内には、塩酸グアニ
ジン溶液、空気、及び核酸含有試料液の各層が形成され
る。

【００３５】検体を吸入した分注用チップ１５を容器ラ
ック２３上の第１番目の処理容器２４上へ移動し、その
処理容器２４へ分注用チップ１５内の検体及び塩酸グア
ニジン溶液の全量を吐出する。その吐出後に再び吐出液
の全量を同じ分注用チップ１５内に吸入し、更に第１番
目の処理容器２４へ吐出することを１回以上行う。これ
により核酸含有試料と結合促進剤を混合する。その後、
分注ノズル３６をチップ外し器２７まで移動し、上述し
た取り外し動作に従って、分注ノズル３６から使用済み
の分注用ノズル１５を取り外す。次いで、分注ノズル３
６を液受け部１１の位置に戻し、分注ノズル３６から純
水を所定量吐出させた後、分注ノズル３６の先端に少量
の空気を吸入し、ノズルホルダー１７に対する次の動作
指令があるまで待機する。

【００３６】分注ノズル３６が混合動作を行っている間
に、アーム３３及びノズルホルダー３４の動作により液
体吸排用可動ノズル３９を、液受け部２８からチップラ
ック３０上の、第１番目の核酸捕捉用チップ３１の位置
へ移動し、可動ノズル３９の先端に核酸捕捉用チップ３
１を嵌合する。その後、可動ノズル３９は核酸捕捉用チ
ップ３１を結合した状態で容器ラック２３上の、第１番
目の処理容器２４の位置へ移動し、核酸捕捉用チップ３
１を降下し、そのチップ内に、第１番目の処理容器に入
っている検体と結合促進剤の混合液の全量を、シリンジ
ポンプ３２の吸引動作により核酸捕捉用チップ３１内に
吸入する。これにより混合液がチップ３１内の固相とし
てのガラス粉末４４の表面に接触する。次いで、吸入し
た混合液を第１番目の処理容器２４内に吐出して戻し、
吐出された混合液を再び同一の核酸捕捉用チップ３１内
に吸入する。この混合液の吐出と吸入を複数回繰り返す
ことにより固相表面と混合液との接触数を増大し、固相
による核酸の吸着効率を高める。

【００３７】所定回数の吸排の後に最終的に第１番目の
核酸捕捉用チップ３１内へ混合液の全量を吸入し、該チ
ップ３１を廃液口２９へ移動して核酸吸着後の残液を、
シリンジポンプ３２の吐出動作により廃液口２９内へ排
出する。核酸捕捉用チップ３１を接続した状態の可動ノ
ズル３９は、液受け部２８の位置へ移動され、ノズルホ
ルダー３４に対するその後の動作指令があるまで液受け
部２８の位置で待機する。

【００３８】核酸捕捉用チップ３１が混合液の吸排を行
っている間に、ノズルホルダー１７に対し次の動作指令
が出される。すなわち、分注ノズル３６を液受け部１１
の位置からチップラック１４ｂ上の、第１番目の分注用
チップの位置へ移動し、分注ノズル３６を降下してその
先端に第１番目の分注用チップを嵌合する。核酸捕捉用
チップ３１が廃液口２９へ移動されるまでの間に、分注
用チップ１５を接続した分注ノズル３６を洗浄液ボトル
１９の位置へ移動し分注用チップ内に複数回使用するた
めの所定量の洗浄液を吸入する。次いで、混合液が吸入
されて空になっている容器ラック２３上の第１番目の処
理容器２４上に分注ノズル３６を移動し、シリンジポン
プ１０の押出し動作により第１番目の処理容器２４内に
分注用チップ１５から洗浄液の一部（１回分の量）を吐
出する。洗浄液の吐出後に分注用チップ１５を液受け部
１１に移動し待機させる。

【００３９】続いて、液受け部２８上で待機していた核
酸捕捉用チップ３１を洗浄液が入れられた第１番目の処
理容器２４に移動し、シリンジポンプ３２の吸引動作に
より核酸捕捉用チップ３１内に処理容器２４の洗浄液を
吸入する、一旦吸入した洗浄液は、第１番目の処理容器
２４に吐出され、再度チップ３１内に吸入される。この
吐出と吸引を２回繰り返した後、最終的にチップ３１内
に吸入した状態で可動ノズル３９を廃液口２９へ移動
し、使用済みの洗浄液を廃液口２９内へ排出する。この
ような洗浄動作により、核酸捕捉用チップ３１の内壁及
び固相の表面が洗浄される。

【００４０】次いで、液受け部１１で待機していた分注
用チップ１５を第１番目の処理容器２４へ移動し、分注
用チップ１５内に保持されている洗浄液の一部又は全部
を第１番目の処理容器内に吐出する。洗浄液を吐出済み
の分注用チップ１５はチップ外し器２７の位置へ移動さ
れ、分注ノズル３６から取り外される。第１番目の処理
容器２４に新たに加えられた洗浄液は、核酸捕捉用チッ
プ３１内に吸入され、２回目の洗浄を行う。この２回目
の洗浄操作は１回目の洗浄操作と同様のステップを経
る。必要であれば、３回目の洗浄操作を行うようにする
ことができる。洗浄液を廃液口２９へ排出して洗浄操作
が終了した核酸捕捉用チップ３１は、液受け部２８へ移
動し、待機する。なお、洗浄液は、濃度が７０％のエタ
ノール水溶液である。

【００４１】核酸の溶離工程に当り、分注ノズル３６が
チップラック１４ｃ上の第１番目の分注用チップの位置
へ移動され、分注ノズル３６の降下により該ノズル３６
の先端に分注用チップ１５を嵌合する。分注用チップを
接続した分注ノズル３６は溶離液ボトル２０の位置へ移
動する。溶離液ボトル２０内には、溶離液としての純水
が収容されている。望ましくは、溶離液ボトル２０が加
温されている。シリンジポンプ１０の吸引動作により、
分注用チップ１５内に、複数回使用し得る量の溶離液が
吸入される。続いて分注用チップ１５は容器ラック２３
上の第１番目の処理容器２４上へ移動され、シリンジポ
ンプ１０の押出し動作により、分注用チップ１５から１
回分の量の溶離液を第１番目の処理容器２４内に吐出す
る。残りの量の溶離液を保有している分注用チップ１５
は、液受け部１１へ移動し、待機する。

【００４２】液受け部２８で待機していた核酸捕捉用チ
ップ３１を容器ラック２３上の第１番目の処理容器２４
へ移動し、溶離液が入っている第１番目の処理容器２４
内の溶離液を核酸捕捉用チップ３１内に吸入する。これ
により溶離液が固相に接触し、固相表面に吸着されてい
た核酸を溶離液中に溶出させる。チップ３１内に吸入し
た溶離液を元の処理容器２４へ吐出した後、再度同一チ
ップ３１内に吸入する操作を所定回数繰り返して、最終
的に溶離液を吸入保持した核酸捕捉溶チップ３１を、容
器ラック２５上の第１番目の精製品用容器２６の位置へ
移動する。シリンジポンプ３２の押出し動作により核酸
捕捉用チップ３１内にあった溶離液を第１番目の精製品
用容器２６内に吐出する。これにより精製品容器２６に
は、固相から溶出された核酸を含む溶離液が回収され
る。溶離液吐出後の核酸捕捉用チップ３１は液受け部２
８へ移動され待機する。

【００４３】次いで、溶離液を保持した状態の分注用チ
ップ１５が、液受け部１１から第１番目の処理容器２４
へ移動し、次の１回分の溶離液を該当処理容器内へ吐出
する。続いて、液受け部２８にて待機していた核酸捕捉
用チップ３１を第１番目の処理容器２４へ移動し、処理
容器２４内の溶離液を核酸捕捉用チップ３１内に吸入
し、上述したと同様の核酸溶出操作を実行した後、核酸
を含む溶離液を第１番目の精製品用容器２６内に回収す
る。

【００４４】このような分注用チップ１５による溶離液
の供給操作と核酸捕捉用チップ３１による溶出操作は、
所定回数、例えば３回繰り返される。溶離液の吐出を終
了した分注用チップ１５は、チップ外し器２７へ移動
し、分注ノズル３６から使用済みの分注用チップ１５を
取り外す。分注用チップを外した分注ノズル３６は、液
受け部１１へ移動し、ノズル先端から水を吐出した後、
ノズル先端に微量の空気を吸入し、その位置で待機す
る。

【００４５】また、精製品用容器２６への核酸含有溶離
液の複数回の吐出を終了した核酸捕捉用チップ３１は、
チップ外し器２７へ移動し、可動ノズル３９から使用済
みの核酸捕捉用チップ３１を取り外す。核酸捕捉用チッ
プを外した可動ノズル３９は、液受け部２８へ移動し、
ノズルから所定量の水を吐出した後、ノズル先端に微量
の空気を吸入し、その位置で待機する。

【００４６】以上で、第１番目の検体に対する核酸の精
製操作が終了する。このあと、図１の精製用装置１００
は、第２番目以降の検体に対し核酸精製操作を続行する
が、その操作は上述した例の繰り返しである。なお、第
１番目の検体に対しては、各分注ラック１４ａ，１４
ｂ，１４ｃ上の第１番目の分注用チップと、チップラッ
ク３０上の第１番目の核酸捕捉用チップと、容器ラック
２３上の第１番目の処理容器２４と、容器ラック２５上
の第１番目の精製品用容器を用いたが、第２番目の検体
に対しては、これらの第２番目の部品がそれぞれ使用さ
れ、第３番目以降の検体に対しても同様に部品が変更さ
れる。

【００４７】従って、容器ラック２５上の精製品容器列
には、検体の順番に応じて、精製回収された核酸含有液
が検体別に回収される。これらの部品は、検体毎に新し
いものが使用されるので、検体相互間のコンタミネーシ
ョンが防止される。

【００４８】次に、核酸捕捉用チップの他の構成例を説
明する。図８の核酸捕捉用チップ３１ａは、その内部に
チップ３１ａの先端内径よりも大きな外形になるように
焼結して形成した複数個のシリカ焼結ブロック４５を固
相として保有する。核酸捕捉用チップ３１ａの頭部側に
は、固相の流出を防止するための円板状の阻止部材４０
ｃが圧入固定されている。この阻止部材４０ｃの材質は
図７のものと同じである。

【００４９】図９の核酸捕捉用チップ３１ｂは、その内
部に石英ウール４６を固相として保有する。核酸捕捉用
チップ３１ｂの先端側には円板状の阻止部材４０ｄが圧
入され、頭部側には阻止部材４０ｃが圧入されている。
これらの阻止部材も液体及び気体の流通が自由な多数の
小孔が形成されており、材質はポリビニリデンフロイラ
イドからなる。

【００５０】次に、図７〜図９に示す各々の核酸捕捉用
チップを用い、図１の精製用装置により市販の核酸精製
品を処理した場合の、核酸の回収率に関する実験例を説
明する。処理用試料としては、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（Ｆ
ｅｒｍｅｎｔａｓ 社製）をトリス−ＥＤＴＡ緩衝液に
より所定濃度に調製したものを用いた。図１の装置によ
る洗浄工程では処理容器２４に対し所定量の洗浄液を２
回供給し、溶離工程では処理容器２４に対し所定量の溶
離液（純水）を２回供給した。核酸捕捉用チップの種類
が異なるように用いた試料毎に、それぞれ別の精製品用
容器２６に回収した回収液について電気泳動測定をし
た。電気泳動には０．８％アガロースゲルを用い、エチ
ジウムブロマイド染色後に、各バンドの強度をデンシト
グラフ（ＡＴＴＯ 社製）により数値化し、処理操作前
後の核酸量に基づいて回収率を算出した。

【００５１】実験結果によれば、核酸回収率は、図７の
チップを用いた場合が８７％、図８のチップを用いた場
合が５２％、図９のチップを用いた場合が８０％であっ
た。図１の精製用装置による処理時間は１検体当り約１
０分である。

【００５２】次に、核酸の種類もしくは性状と、回収率
との関係に関する実験例を説明する。市販精製品のλＤ
ＮＡ（48502塩基長の２本鎖直鎖状ＤＮＡ、Ｆｅｒｍｅ
ｎｔａｓ 社製）、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（4361塩基長の
２本鎖環状ＤＮＡ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 社製）、ＭＳ
２ＲＮＡ（3569塩基長の１本鎖直鎖状ＲＮＡ、ベーリン
ガー・マンハイム 社製）をＴＥ溶液により所定の濃度
とした容液を検体として、検体ラック１２に保持させ、
その検体ラックを図１の装置上にセットした。

【００５３】図７の核酸捕捉用チップを用い、上述の実
験例と同様の工程により、ＤＮＡの自動回収を行った。
それぞれの検体毎に回収した精製品用容器２６内に得ら
れた核酸溶液の一部分を用いて、０．８％アガロースゲ
ルにより電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後
に、各バンドの強度をデンシトグラフ（ＡＴＴＯ 社
製）により数値化し、操作前後の核酸量に基づき回収率
を算出した。結果は、λＤＮＡが６８％、ｐＢＲ３３２
が８６％。ＭＳ２ＲＮＡが７８％であった。核酸の性状
により多少の差異は見られるが、本発明を用いること
で、簡便に高回収率で核酸の回収が可能であることが分
かる。

【００５４】次に、血清が共存する場合のＤＮＡの精製
状態を確認するための実験例を説明する。ヒトの血清に
市販精製品のλＤＮＡ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 社製）を
添加し、ヌクレアーゼ対策、及び、実使用条件に近づけ
るためにドデシル硫酸ナトリウム（終濃度で１％）を添
加したものを検体として、図７の核酸捕捉用チップを用
いて上述の実験例と同様の工程により、ＤＮＡの自動回
収を行った。

【００５５】各精製品用容器２６内に回収された核酸回
収液に対しＰＣＲ処理を行った。ＰＣＲ処理時の試薬の
宝酒造（株）製のＰＣＲ専用試薬キットを使用し、キッ
トに付随のλＤＮＡ用コントロールプライマーにより、
λＤＮＡ中の、特定の５００塩基の増幅を試みた。ＰＣ
Ｒ処理時の遺伝子増幅システムは宝酒造（株）製のＴＰ
３０００を使用し、９４℃の熱変性３０ｓ、６８℃のア
ニーリングと伸長反応３０ｓを２５回繰り返し、更に６
８℃で７min加温しＰＣＲを行った。ＰＣＲ処理後に、
１．５％のアガロースゲルにより電気泳動を行い、エチ
ジウムブロマイド染色を行った。

【００５６】図１の精製用装置による精製処理をせずに
そのままの検体をＰＣＲ処理した場合をＡとし、図１の
精製用装置により精製処理をした後にＰＣＲ処理した場
合をＢとし、前記市販精製品のλＤＮＡを血清と混合せ
ずにＢの場合の検体と同じ核酸濃度になるように調製し
たものをＰＣＲ処理した場合をＣとして比較した。実験
結果によれば、Ａではドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ
溶液）等の阻害により目的とするＤＮＡ断片が得られな
かったのに対し、ＢではＣの場合と同等のＤＮＡ断片が
得られた。これにより、血清が共存する試料に対する核
酸の精製が、図１の精製用装置でなされることを確認で
きた。

【００５７】次に、培養した遺伝子組換え大腸菌からの
プラスミドＤＮＡを精製によって回収するための実験例
を説明する。図１の精製用装置にセットすべき試料を準
備するために前処理が必要である。この前処理では、大
腸菌ＨＢ１０１株に対して、ｐＢＲ３２２ＤＮＡを遺伝
子工学的に組み込んだ大腸菌をＬＢ培地１ml中で、３７
℃で一晩培養し、遠心分離により集菌し、１００μlの
０．１５mol／l NaClに懸濁させ、大腸菌の細胞壁中の
ペプチドグリカンを破壊するために、５０mmol／lグル
コース、１０mmol／l EDTA、２５mmol／l Tris−HCl(pH
８．０)に８mg／mlとなるようにリゾチームを加えた溶
液を添加、混合し、更に、０．２mol／lNaOH、１％ＳＤ
Ｓ溶液を添加し、一定時間放置後、この溶液に５mol／l
酢酸カリウムを添加することにより、対象試料を得た。

【００５８】前処理済みの試料を検体ラック１２に収納
し、図７の核酸捕捉用チップを用いて図１の精製用装置
によりプラスミドＤＮＡの精製操作を行った。精製用容
器２６に回収された回収液について分光光度計により吸
光度測定した結果、波長２８０nmの吸光度に対する波長
２６０nmの吸光度の比は、１．９６であった。核酸の吸
収浪長が２６０ｎｍであり、蛋白質の吸収波長が２８０
ｎｍであるので、吸光度比が１．８以上であれば核酸の
精製度が高いといえる。

【００５９】さらに、精製用容器２６内の回収液を検体
として、０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行
い、エチジウムブロマイド染色を行った。同時に流した
移動量マーカーから、精製溶液からプラスミドＤＮＡと
ｒＲＮＡが確認された。また、ＲＮＡ分解酵素によるＲ
ＮＡの消化処理、及び、アルコール溶液による沈殿処理
後の、プラスミドＤＮＡ容器の２６０ｎｍの吸光度か
ら、得られたプラスミドＤＮＡの収量は４．１μgであ
った。

【００６０】

【発明の効果】本発明によれば、核酸の精製操作を自動
化することができ、且つ、核酸含有試料と固相との接触
時間が十分に確保されるので、核酸を高い回収率で精製
することができる。また、本発明によれば、固相への核
酸の捕捉工程、核酸を捕捉した固相の洗浄工程、及び固
相からの核酸の溶離工程を、固相内蔵の核酸捕捉用チッ
プを可動ノズルに接続したままの状態で実行できるの
で、精製操作を簡易に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例である核酸精製用装置の平面
図である。

【図２】図１の核酸精製用装置の概略外観図である。

【図３】図１の実施例における電気系の構成を示すブロ
ックダイヤグラムである。

【図４】図１の実施例における核酸捕捉用チップを接続
した分注器の概略構成を示す図である。

【図５】図１の実施例における液体分注用チップをノズ
ルに取り付ける動作の説明図である。

【図６】図１の実施例におけるノズルからチップを取り
外す動作の説明図である。

【図７】図１の実施例における核酸捕捉用チップの概略
構成図である。

【図８】核酸捕捉用チップの他の例を示す図である。

【図９】核酸捕捉用チップのもう１つの例を示す図であ
る。

【符号の説明】

１０，３２…シリンジポンプ、１２…検体ラック、１５
…分注用チップ、１６，３３…アーム、１７，３４…ノ
ズルホルダー、１９…洗浄液ボトル、２０…溶離液ボト
ル、２２…結合促進剤ボトル、２４…処理容器、２６…
精製品用容器、２７…チップ外し器、３１，３１ａ，３
１ｂ…核酸捕捉用チップ、３６…分注ノズル、３９…液
体吸排用可動ノズル、４０ａ，４０ｂ，４０ｃ，４０ｄ
…阻止部材、４４…ガラス粉末、４５…シリカ焼結ブロ
ック、４６…石英ウール、１００…精製用装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松本 孝一 茨城県ひたちなか市大字津田字関場1939 那珂インスツルメンツ株式会社内 Ｆターム(参考） 4B029 AA07 AA23 BB20 CC02 CC08 FA12

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】核酸を含有する試料の核酸を精製する装置
   において、 シリカを含有する固相と液体が接触できるように内蔵で
   きる核酸捕捉用チップと、 前記核酸捕捉用チップを着脱可能に接続する液体吸排用
   可動ノズルと、 前記固相への核酸の結合を促進する物質と核酸含有試料
   との混合液を収容し得る処理容器と、 核酸の精製品を受け入れるための精製品用容器と、 前記接続状態にある前記核酸捕捉用チップを前記処理容
   器および前記精製品用容器の位置へ移動せしめる搬送手
   段と、 前記核酸捕捉用チップに前記混合液を吸排する手段と、 前記核酸捕捉用チップに前記溶離液を吸排せしめる液体
   吸排作用手段と、 前記液体吸排用可動ノズルから前記核酸捕捉用チップを
   取り外すチップ取り外し手段と、を備えたことを特徴と
   する核酸の精製用装置。
2. 【請求項２】請求項１記載の精製用装置において、さら
   に前記処理容器へ洗浄液を供給する手段と、前記処理容
   器へ溶離液を供給する手段と、を備えたことを特徴とす
   る核酸の精製用装置。
3. 【請求項３】請求項１記載の精製用装置において、前記
   核酸捕捉用チップは、前記核酸捕捉用チップ内の前記固
   相が外部に流出することを阻止するための流体流通可能
   な阻止部材を具備することを特徴とする核酸の精製用装
   置。
4. 【請求項４】請求項３記載の精製用装置において、前記
   阻止部材は、ポリビニリデンフロライドにより形成され
   ていることを特徴とする核酸の精製用装置。
5. 【請求項５】請求項３記載の精製用装置において、前記
   阻止部材は、前記核酸捕捉用チップにおける前記固相の
   内蔵領域よりも前記液体吸排用可動ノズルとの接続端側
   に配置されており、挿入用補助ガイドが形成されている
   ことを特徴とする核酸の精製用装置。
6. 【請求項６】請求項１記載の精製用装置において、前記
   処理容器へ前記試料および前記結合促進物質を分注する
   ための液体分注用チップを備えることを特徴とする核酸
   の精製用装置。
7. 【請求項７】シリンジポンプと、前記シリンジポンプに
   パイプを介して接続された可動ノズルと、前記可動ノズ
   ルに着脱可能に接続され、液体に接触可能に収容された
   シリカ含有固相を有する核酸捕捉用チップと、前記可動
   ノズルを移動させるノズルホルダーとを有する核酸の精
   製用装置。
8. 【請求項８】核酸捕捉用チップと、前記核酸捕捉用チッ
   プに着脱可能に接続された可動ノズルと、ノズルホルダ
   ーと、シリンジポンプと、表示装置と、所定のプログラ
   ムを内蔵するコンピュータと、前記コンピュータに情報
   または指令を入力するキーボードと、前記コンピュータ
   からの信号により動作する機構制御部とを有し、前記機
   構制御部によって前記シリンジポンプおよびノズルホル
   ダーを制御するように構成されたことを特徴とする核酸
   の精製用装置。
9. 【請求項９】液体に接触可能に収容されたシリカ含有固
   相を有する核酸捕捉用チップであって、前記固相は石英
   ウールであることを特徴とする核酸の精製用装置に用い
   られる核酸捕捉用チップ。