JPS63154696A - 生体試料から核酸を単離し精製する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明の利用分野は、生体試料からの核酸、　ＤＮＡお
よび／またはＲＮＡの迅速な分離、単離および精製に関
する。この方法は特に、核酸ハイブリダイゼーション技
術を用いる臨床的診断のための２体液または組織からの
核酸の迅速かつ簡便な精製に関する。

（従来の技術） 生体試料からＤＮＡまたはＩ’ｌＮΔを単離する方法が
いくつか公表されている。細菌のＤＮＡ単離の最も初期
の方法の１つは、アルキルトリメチルアンモニウムプロ
ミドとの沈澱を利用している。Ｊｏｎｅｓ＋財肛遅工、
駐卯坤ルー税頃（１９５３）　１０　：　６０７−６１
２゜およびＪｏｎｅｓ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９６３）
、　１９９　：　２８０−２８２を参照のこと。Ｊｏｎ
ｅｓの方法では、アルキルトリメデルアンモニウムプロ
ミドは他の成分をも沈澱させる。この塩を完全に除去し
なければならず、精製ＤＮＡを得るのにその後の一連の
抽出と沈澱が必要であり、この操作に１〜２日かかる。

複雑な生体試料は用いられなかった。

微生物からのＤＮＡ単離の後期の方法は、最初にＭａｒ
＋＋＋ｕｒ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　（１９６
１）　３　：　２０Ｂ−２１８に記載された。Ｍａｒｍ
ａｒの方法もまた苛性試薬、フェノールおよびクロロホ
ルムを用いる一連の抽出と沈澱を包含する。Ｍａｒｍｕ
ｒおよびＪｏｎｅｓのどちらの方法もエタノールを沈澱
試薬として用いる。Ｍａｒｍａｒの方法はまだ当該分野
で位置をしめていると考えられているが、実施に１〜２
日間を要する。どちらの方法も有害な有機溶媒を用い、
この有機溶媒はこれらの方法を臨床的に受は入れられな
いものとしている。

尿または血液のようないくつかの体液からの。

直接溶解およびスポツティングのような、他の直接的か
つ迅速な調製法が公知である。例えば、　Ｇ１１ｌｅｓ
ら、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　　Ｎｏｖ、／Ｄｅ
ｃ、　１７４−１９２（１９８３）およびＢａｒｋｅｒ
ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　　２３１　：　１４３４−１４
３６（１９８６）を参照のこと。またル瓜υ壮免」劇Ａ
」柱石１倶ヱ酎ユ幻づ−Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ　
　ｒｏａｃｈ、　Ｂ、■ａｎｅｓおよびＳ、　）Ｉｉｇ
ｇｉｎｓ４３、　ＴＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ　（１９８５）に記載の一般技術も参照のこと
。しかし、著者ら自身が議論しているように、この方法
は臨床的に適切なサンプル量では直接使用できず、これ
ら比較的単純なサンプルでさえ、許容されない核酸以外
の成分の干渉がある。

これらの抽出／沈澱精製法に加えて、いくつかの特別に
設計されたカラム充填材を用いたクロマトグラフカラム
分離法が提案されている。すなわち、　ＤｕＰｏｎｔ　
ＮＥＮ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｂｏｓｔｏｎ＋　ＭＡ＋
　により市販されており主として逆相吸着による機能が
あり生体試料には勧められない”ＮＥＮＳＯＲＢ　２０
”′カートリッジ、　Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ、　
Ｄｕｒｅｎ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙから市販され
ているＨＰＬＣ用のＤＥＡＥ弱陰イオン交換体”ＮＵＣ
ＬＥＯＧＥＮ”　、およびＷｈａｔｍａｎ　Ｐａｒｔｉ
ｓｉｌ　５ＡＸｐｉｅのようなＨＰＬＣ用の強陰イオン
交換体を用いる方法が提案されている。しかし、これま
でに用いられたクロマトグラフカラム系は、十分な分離
を得るためには長く、高圧を要する肝ＬＣ装置を必要と
し。

糞便、血液、または他の体液もしくは組織から調製され
るような核酸以外の多くの成分を含む複雑な生体試料か
らの核酸の単離は不可能であった。

このような試料をこれらのカラム系に添加すると。

カラムの避けることのできない劣化１分解損失および閉
塞を引き起こす。そこで、核酸の十分な単離についてこ
れらの系を実用化するためには、試料の前処理がかなり
必要であり、そして機械的背圧には精巧なポンプの作動
と供給系の使用が必要である。

ＤＮＡ　／ＲＮＡ単離の技術の現状は、　Ｍａｒｍａｒ
により記載された２０年前の方法の変法が引続き利用さ
れている。この方法は多くの単調で時間のかかるステッ
プを要し、受は入れ難い有機溶媒での多数の処理を必要
とし、そして臨床研究室でのハイブリダイゼーション分
析に必要な十分に単離された核酸を提供しない。生体試
料中の夾雑物は、　ＤＮＡ　／ＲＮＡハイブリダイゼー
ションの固定および検出を妨害する。結論として、有用
な臨床のハイブリダイゼーション分析を提供するために
、生体試料からハイブリダイゼーション核酸を得るため
の迅速法が必要とされる。現在、このような系は存在し
ない。このような方法は以下のようであるべきである：
（１）迅速・・・時間または日ではなく分；（２）効果
的・・・ハイブリダイゼーションを検出するのに十分な
ＲＮＡまたはＤＮＡを回収可能；（３）試料の前処理が
殆どいらないかまたは不要；（４）高価な装置またはポ
ンプは不必要；（５）有機溶媒または過激な条件を用い
ない：（ｇ）木質的に自然界で万能・・・ＲＮＡまたは
ＯＮへのどのような長さにも、−末鎖または二本鎖にも
用いることが可能；および（７）高い純度のＤＮＡまた
はＲＮＡが得られる。このように、生体材料から夾雑物
のバックグランドを除去すべきである。

本発明は、試料の迅速な溶解と、それに続く簡便化した
陰イオン交換分離による夾雑物が多い生体試料に含まれ
る核酸の単離とを組み合わせた新規な方法を用い、これ
らの要求を満たしている。

試料中に存在する硫酸塩エステル化ムコ多糖類からＤＮ
Ａを分離する電気泳動により、アガロースゲルからＤＮ
Ａを回収し得る実験室操作法が知られている。この方法
は、一般にムコ多糖類が試料からＤＮＡと共に抽出され
ることを容認しており、この特別な電気泳動法をこれら
成分の分離に用いる。

電気泳動によるＤＮＡとムコ多糖類との分離に引続き、
　ＤＮＡ画分を切り出し、電気的に溶出する。ゲル内容
物をさらに精製するために、“’ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａ
ｃｅ＋　’”に溶出物を通すことが提案されている。こ
の方法では、カラムに添加したＤＮＡを０．３Ｍ　Ｎａ
Ｃ１水溶液で洗浄し、その後０．６Ｍ　ＮａＣｌ水溶液
でＤＮＡを溶出する。この溶出液をフェノールで２回、
フェノール／クロロホルムで１回、そしてクロロホルム
で１回抽出する。次いでＤＮＡを精製された溶出液から
エタノール沈澱により回収する。Ｍａｎｉａｔｔｓら。

”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　　（１９８
２）　１６４−１６６頁を参照のこと。上述の操作は所
望のＤＮＡからムコ多糖類を分離するが、この方法は労
力を要する方法である。この方法は電気泳動溶出、カラ
ム分離、そしてフェノール−クロロホルム抽出を包含す
る。

（発明の要旨） 本発明の方法は、生体試料からのＤＮＡまたはＲＮＡの
迅速分離、単離および精製に適用し得る。このＤＮＡ　
／ＲＮＡは二本鎖または一本鎖の形でもよい。

この方法は細菌、ウィルスおよび哺乳類細胞の遺伝子Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡの分析、および大便、痰、尿および血
液試料を包含するヒト体液および組織試料を用いるのに
特に有利である。

このような生体試料は、酸性ムコ多糖類、および上述の
従来法ではＤＮＡ／ＲＮＡからの分離が特に困難である
夾雑した妨害分子を含有している。酸性ムコ多ｔｉＩ類
は規則正しく配置された糖および負電荷を有するポリマ
ーであり、従って核酸に非常に似ている。病原微生物（
細菌またはウィルス）由来のＤＮＡ／ＲＮＡを検査する
必要のある臨床試料には、カルボキシル化および／また
は硫酸エステル化ムコ多糖類が存在し、ハイブリダイゼ
ーション分析に高いバックグランドを生ずることが知ら
れている。これらのムコ多糖類は膜への結合について望
ましくない様式でＤＮＡ／ＲＮＡと拮抗し、そのためハ
イブリダイゼーションの結果を減じる。

ＤＮＡまたはＲＮＡを妨害成分９特にタンパク、生物色
素、およびヒアルロン酸、コンドロイチン、デルマタン
、ヘパリン、およびケラチンなどのムコ多糖類から効果
的に分離し得ることは９本発明の重要な特徴である。

病原体の臨床的同定には、　　ＤＮＡ／ＲＮＡを細菌／
ウィルスを含有する体液１組織、または排泄物から回収
することが望まれる。このような試料は。

例えば、糞便、尿、血液、痰および傷からの浸出液から
得られる。これらの試料は全て、水溶性成分でかなり汚
染されている。大便試料は、ムコ多糖類に加えて胆汁色
素や他の物質を含有しており。

これらをハイブリダイゼーション分析の前にＤＮＡ／Ｒ
ＮＡから除去しなければ、望ましくない蛍光や吸収のバ
ックグランド効果を生じ得る。本発明のさらに重要な特
徴は、このような妨害物質を分析されるべきＤＮＡ／Ｒ
ＮＡから容易に分離し得ることである。

本発明の方法は、市販されている陰イオン交換体を利用
し得る。強陰イオン交換体または弱陰イオン交換体は、
どちらも水溶液で使用し得る。選択された溶液を吸着お
よび溶出に用いることにより、核酸（ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ）を精製、濃縮、および十分に単離し得る。

核酸を陰イオン交換のカラム充填剤へ最初に結合するの
に既知のイオン強度の溶液を用いることにより、タンパ
ク（比較的弱い結合の夾雑物）のような他の電気的に陰
性の分子を含む大部分の水溶性成分をカラムから洗い出
し得る。溶出のために、必要なイオン強度がＮａＣ１の
ような既知の塩により調製され、　ｐＨ強度を制御する
ために緩衝液と混合される。このイオン強度は、理想的
には核酸が完全に溶出される最低限のイオン強度に相当
する。核酸と同じ条件下で吸着される夾雑物質は。

これによりカラム内に停まる。つまり、より強く結合し
た夾雑物が核酸と分離される。

ある一つの好ましい実施態様では、２つのカラム（また
ばカラム区分）がＤＮＡまたはＲＮＡの分離に用いられ
る。異なった陰イオン交換体の２つのベッドが用いられ
る。流出方向の最初のベッドは弱陰イオン交換体であり
、２番目のベッドは強陰イオン交換体である。好ましい
弱陰イオン交換体は１級、２級、または３級アミン基（
つまりプロトン化できるアミン類）の１つであり、交換
基を提供する。強塩基性陰イオン交換体は、４級アンモ
ニウム基（つまり、プロトン化できず常に正に荷電して
いる）を交換基として有している。ＤＮＡまたはＲＮＡ
を分離するために１両方の交換体は。

それぞれの吸着および溶出のイオン強度および／または
ｐＨに関して選択される。溶液の強度は、結合の強度よ
りも高い。

別々のカラム、または１つのカラムにベッドを積み重ね
て配置しである２ベツド系では、最初のベッドの溶出条
件が第２ベツドの効果的な結合条件でなければならない
。この条件は、全ての核酸を最初のベッドから溶出し得
る最低のイオン強度が、十分に全ての核酸を第２のベッ
ドに結合させるイオン強度および／またはｐＦＩである
ように、関連づけられ得る。

核酸の全てが十分に溶出される最低のイオン強度に溶離
液の条件を限定することにより、ムコ多糖類のようなよ
り強く結合する夾雑成分をベッド内に残し得る。２ベツ
ド系では、第１のベッドに結合されない成分を洗い出す
のに用いられる洗浄液を、第２のベッドに流し得る。こ
のことは、第１のベッドで固定されない核酸のいずれも
が、第２のベッドに結合されることを確実にする。

本発明の方法の好ましい実施態様では、核酸は。

カルボキシル化および／または硫酸エステル化ムコ多糖
類を含有する溶解した細胞またはウィルスの水溶性成分
と共に、該核酸を含む水溶液試料として単離および精製
される。イオン交換のカラム材料は、目的の核酸が該カ
ラムから溶出されるモル濃度より低いモル濃度の塩で、
２本鎖ＤＮＡのような目的の核酸を効果的に結合するも
のを選ぶ。

調製した試料を、カラム材料の陰イオン基が塩化物また
は他の陰イオン型である１選択された陰イオン交換体を
詰めたカラムに添加する。核酸をカラム材料に結合させ
２次いで該核酸がカラム材料に結合して残るような塩化
物モル濃度の塩化物塩水溶液で該カラムを洗浄する。

特に、酸性ムコ多糖類からのＤＮＡ分離を包含する本発
明の精製の結果を達成するために、最初の洗浄のモル濃
度は、核酸が溶出し始める最低の塩化物モル濃度に近い
べきである。次いで、特にカルボキシル化ムコ多Ｗ類を
含む非結合成分をカラムから洗い出すために、この洗浄
を十分な量で行う。次いで結合した核酸を、核酸が完全
に溶出される最低の塩化物モル濃度に相当する溶離用塩
化物モル濃度を有する２塩化物塩の水溶液をカラムに流
して溶出させる。この溶離液を、硫酸エステル化ムコ多
糖類や他の妨害物質をカラム内に残しつつ、核酸をカラ
ムから遊離させるのに十分な容量で流す。次いで溶出さ
れた核酸を、カルボキシル化型および硫酸エステル化型
の両方の種類のムコ多糖類、タンパク、および他の妨害
分子と本質的に遊離した状態で回収する。これは、これ
まで陰イオン交換体を充填したクロマトグラフカラムを
用いることにより達成されなかった。新しくそして予期
されなかった結果である。

カルボキシル化ムコ多糖類をカラムを通過させながら、
同時に核酸および硫酸エステル化ムコ多糖類を選択的に
固定できる塩化物のモル濃度が存在することは、これ迄
知られていなかった。硫酸エステル化ムコ多糖類をカラ
ムに残しながら、結合した核酸をカラムから溶出できる
塩化物のモル濃度が存在することも知られていなかった
。このような分別モル濃度の実用性の発見は１本発明の
重要な部分である。

タンパク、色素、カルボキシル化ムコ多糖類。

硫酸エステル化ムコ多糖頬、およびこれらの混合物でな
る群から選択された水溶性夾雑成分と共に。

核酸を含有する生体試料の水溶液から核酸を単離し精製
する本発明の方法は。

（ａ）目的の核酸が溶離するモル濃度よりも低い塩化物
のモル濃度で該目的の核酸を有効に結合する陰イオン交
換体カラム材料を選択すること；（ｂ）該核酸が結合す
るような、」１記の選択された陰イオン交換体材料であ
り、陰イオン基が塩化物の形である陰イオン交換体材料
を充填したカラムに該試料を注入すること； （ｃ）該核酸が該カラム材料に結合し続ける塩化物モル
濃度であり、該核酸が溶離し始める最低の塩化物モル濃
度に接近した洗浄液濃度の塩化物水溶液によって、カル
ボキシル化ムコ多糖類を含む非結合成分を該カラムから
洗い流すのに十分な容量で該カラムを洗浄すること； （ｄ）該目的の核酸が完全に溶離する最低の塩化物モル
濃度に対応する溶離塩化物モル濃度を有する塩化物の水
溶液を、該カラムから該核酸を取り出すのに十分な容量
で該カラムに通過させることによって、該結合した核酸
を溶離させる一方で。

硫酸エステル化されたムコ多Ｉｉ類を含む夾雑成分を該
カラム中に残留させること；および（ｅ）ムコ多糖類お
よび他の夾雑成分を実質的に含有せずに溶離された核酸
を回収すること。

を包含する。

溶解した細胞またはウィルスの水溶性夾雑成分であり、
タンパク、色素、カルボキシル化ムコ多糖類、硫酸エス
テル化ムコ多糖類、およびこれらの混合物でなる群から
選択された水溶性夾雑成分と共に、核酸を含有する水溶
液試料から、細胞またはウィルスの核酸を単離し精製す
る本発明の方法は。

（ａ）目的の核酸が溶離するモル濃度よりも低い塩化物
モル濃度の水溶液で該目的の核酸をを効に結合する弱塩
基陰イオン交換体を含む第１のイオン交換体カラム材料
を選択すること； （ｂ）該目的の核酸が溶離するモル濃度よりも低Ｉ い水性塩化物モル濃度であり、該第１のカラム材料の溶
離モル濃度に対応する結合モル濃度で該目的の核酸を有
効に結合する強塩基陰イオン交換体を含む第２のイオン
交換体カラム材料を選択すること； （ｃ）塩化物の形の該第１のカラム材料および該第２の
カラム材料をそれぞれ充填した第１のカラムおよび第２
のカラムを１分離カラムまたは堆積カラムのどちらかと
して調製すること；（ｄ）該目的の核酸が該第１のカラ
ム材料に結合する該第１のカラムであり、該弱塩基交換
体を含む該第Ｉのカラムに該試料を注入すること；（ｅ
）Ｆｊ核酸が該第１のカラム材料に結合し続ける塩化物
モル濃度であり、該核酸が溶離し始める塩化物モル濃度
に接近した洗浄液モル濃度の塩化物水溶液によって、カ
ルボキシル化ムコ多糖類を含む非結合成分を該第１のカ
ラムから洗い流すのに十分な容量で該第１のカラムを洗
浄すること；（ｆ）該目的の核酸が溶出し始める最低の
塩化物モル濃度に対応する溶離塩化物モル濃度を有する
塩化物の水溶液を、該第１のカラムから該核酸を取り出
すのに十分な容量で該第１のカラムに通過させることに
よって、該結合した核酸を溶離させる一方で、硫酸エス
テル化されたムコ多糖類を該第１のカラム中に残留させ
ること； （員該第１のカラム材料から溶離された該核酸を含む該
第１のカラムの溶出液を、該核酸が結合する該第２のカ
ラム材料を含む該第２のカラムに通過させること： （ｈ）該核酸が該第２の材料から完全に溶離する最低の
塩化物モル濃度に対応し、該第１０カラムの溶離液より
も高い溶離塩化物モル濃度を有する塩化物の水溶液を、
該第２のカラムから該核酸を取り出すのに十分な容量で
該第２のカラムに通過させることによって、該結合した
核酸を溶離させること；および （ｉ）ムコ多ＦＴ類および他の夾雑成分を実質的に含有
せずに単離され精製された核酸を回収すること。

を包含する。

（発明の構成） 本発明の実施に必要な原材料は、市販の陰イオン交換カ
ラム材料、塩、およびｐＨを制御するための適当な緩衝
液である。カラム吸着材には、４級アンモニウム型の強
塩基イオン交換体、アミン型弱塩基陰イオン交換体が包
含される。弱塩基陰イオン交換体は、１級アミン交換部
位を有するものも用いることができるが、３級アミン交
換部位を有するものが好適である。そのような陰イオン
交換体は、土弟孔体として、一般にはクロマトグラフィ
ーカラムで用いられるサイズの球状または不規則な粒状
で、供給される。適当な粒子径は約２０μｍから２００
μｍの範囲であり得る。有効な孔径は、目的とするＤＮ
Ａ／ＲＮＡおよび混入物のサイズに依存し、約５０人か
ら数千人の範囲である。市販材料は、　Ｂｉｏ−Ｒａｄ
　Ｃｈｅｍｊｃａｌ、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
　Ｃｏｍｐａｎｙ＋Ｔｏｙｏ　５ｏｄａ　Ｍｆｇ、Ｃｏ
、＋およびＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓを含む数社から得られる。弱塩基交換体は、ア
ガロース、シリカガラス、ビニルポリマーなどを含むマ
トリックスを基本として有し得る。シリカガラスは被覆
され得、それには例えば、　“グリコフェーズ”被覆物
、グリセロールガラスなどがある。

３級アミン基は１通常、　Ｄｉ！ＡＨ交換体と呼ばれる
ジエチルアミノエチル基である。他の３級アミン基も採
用され得る。１級アミン基は９通常、アミノエチル型で
あるが、他の１級または２級アミングループも存在し得
る。強塩基陰イオン交換体は。

被覆されていない、またはグリコフェーズ被覆が施され
たシリカガラスのマトリックスを基本として、もしくは
、アガロースを基本として供給される。４級基は通常、
ジエチルメチルアンモニウムまたはトリメチルアンモニ
ウムであり、それぞれ“ＱＡＥ”または“ＩＩＩＭＡ”
交換体と呼ばれる。

本発明の好適な実施態様においては、塩化物形の陰イオ
ン交換カラム材料が用いられ、そして試料をカラムにか
けること、洗浄すること２および核酸を溶出することの
ために５選択された臨界モル濃度の塩化物が用いられる
。好ましい塩化物は塩化ナトリウムであるが、塩化物の
陽イオンは変えることができる。つまり、塩化ナトリウ
ムの代わりに塩化アンモニウムおよび塩化カリウムのよ
うな他のアルカリ金属塩化物を使用することができる。

好ましくはないが、その陽イオンにはまた。

アンモニウムイオン、または２価イオン（例えばマグネ
シウム）も含まれ得る。選択された弱塩基および／また
は強塩基交換体の分別結合および溶出の塩化物モル濃度
は、試験される試料（目的とする核酸を含む）のＤＮＡ
またはＲＮ＾の分子型に相当する。純粋のＤＮＡまたは
ＲＮＡの試験物質を用いて決定され得る。選択された陰
イオン交換体のそれぞれの結合および溶出のモル濃度を
決定するには、標準的なりロフトグラフィー法が採用さ
れ得。

試験物質の吸着と溶出とが検出される。例えば。

ＤＮＡまたはＲＮＡは、それらがカラムから出るときに
溶液を連続的にモニターできるように、および／または
溶出濃度を分光光学的に追跡し得るように。

適当なマーカーで標識され得る。

典型的には、調べられるべき特異的目標ＤＮＡまたはＲ
ＮＡの純水溶液（５０＋ｎｇ／ｍｆｆ　〜２５０ｍｇ／
ｍｌ）は。

充分に結合することが確かな充分低い既知量が。

塩の形で実験カラムにかけられる。次に、拮抗する塩の
濃度を段階的にまたは勾配をつけて上げることにより、
核酸が溶出し始める。そしてそれらが最大に回収される
モル濃度の範囲が見出される。

次に、測定の感度を上げ、そして容量／回収測定が行わ
れる。溶出開始と完全回収との間のモル濃度範囲が狭い
マトリックスを使うことが有利である。

本性は自然流出カラムを使用することが有効であり、こ
のカラム操作の方法が単純であるため好ましい。

結合および溶出の塩化物モル濃度は２代表的な市販陰イ
オン交換体では、　　ＤＮＡおよびＲＮＡ試験材料およ
び塩化ナトリウム水溶液を用いて決定されている。本発
明の方法のこれら陰イオジ交換体を用いての実施に使う
ことができる分別モル濃度は次の表に要約される。

（以下余白） 十Ｊ開”ａ６Ｊ−１５４６ａｔｉ　Ｌ日ノ上の表におい
て、結合塩化物モル濃度はまた。

好適な洗浄モル濃度でもある。これらの結合／洗浄モル
濃度は実質的に全ての目的とするＤＮＡまたはＲＮＡが
結合するモル濃度であるが、これは、核酸が溶出し始め
るモル濃度に近いモル濃度である。

完全な結合と溶出開始との間の差は、少なくとも塩化物
が０．１Ｍの点であり、そして通常、約０．１Ｍと０．
３Ｍの間である。表に示す完全溶出のモル濃度は。

溶出が開始される最低のモル濃度より実質的に高く、核
酸の完全な溶出が起きる最低のモル濃度を包含する。こ
こに示すよりも高い溶出モル濃度も採用され得る。しか
し、　０．１Ｍから０．２Ｍを越える増加は他の吸着成
分の溶出を引き起こし、最終産物の純度を低下させる。

陰イオン交換体の単一ベッドを分離に用いる場合には、
４級または３級アミン交換体が好適である。２つのベッ
ドを用いる場合、第１のベッドは３級アミン型のような
弱塩基陰イオン交換体を含み、そして第２のベッドは強
塩基４級アンモニウム交換体を含まねばならない。この
２つのベッドリ０ は分離した別々のカラムであっても、または両方のベッ
ドを単一のカラム内に積層したものであってもよい。

２つのベッドを使用する実施態様においては。

第１のベッドの溶出に用いるモル濃度は、核酸が第２の
ベッドに完全に結合するモル濃度に対応し得る。例えば
、上記の表を参照すると、“°フラクトゲル゛３級アミ
ン吸着剤は、第２ベツドの［ｌＡＥグリコフェーズ４級
アンモニウム交換体と組み合わせて、第１ベツドとして
用いられる。上記表に示されるように、　　ｄｓＤＮＡ
は゛°フラクトゲル０、５Ｍで溶出する。その濃度は，
　　ＱＡＥ交換体の有効結合モル濃度である。第１のベ
ッドに用いられる洗浄溶液は，第２のベッドに入り，第
１のベッドに同定されない可溶性成分をそこに保持させ
得る。

核酸の完全な溶出を確実にするために，有機溶媒を，溶
離液に少量加えてもよい。この目的にはメタノールが好
ましいが，他の低級アルコール（エタノール、プロパツ
ール、およびイソプロパツールを包含する）も使用され
得る。尿素またはホルムアミドのような他の有機成分も
さらに用いられ得る。表の脚注に示すように溶離液のあ
るものでは．メタノールが加えられるが，メタノールの
そのような使用は必要に応じて行われる。しかし。

それによりマトリックスの望ましくない結合性を減する
ことにより，　　ＤＮＡまたはＲＮＡのより完全な回収
がなされ得る。

本発明の実施に用いられるカラムは小さいサイズと容量
のものでよい。例えば、典型的にはベッド容量は約０．
１から１．Ｏｃ［　（ｃｃ）が用いられ得。

カラムまたはカートリッジに含まれるベッドは内径が約
０．３から３ｃｍである。本発明を用いた市販品として
は，小さくコンパクトなカートリッジが調製され得る。

積層したベッド系を用いる場合には，各ベッドの容量は
指示されているものと同じでよい。陰イオン交換体を溶
液に懸濁させる回分操作もまた使用され得るが，溶出カ
ラムが一般に速くかつより効果的である。本発明の特定
の実施態様においては，重力による流れを良好にし，夾
雑物の捕捉を最大にするために，樹脂のメツシュサイズ
と孔径サイズとを選択することにより，流出特性が最適
化され得る。

結合のための上記塩化ナトリウム水溶液は，好ましくは
中性附近のｐＨを有する。つまり強塩基性でも酸性でも
ない。例えば、既知の緩衝液を用いて，約５から９の範
囲のｐＨとしたものを使用することができる。しかし、
ある実施態様（例えば。

ＤＥＡＥ樹脂に有効なｐ）ｌ勾配に必要とされるような
場合）においては、よりアルカリ性または酸性のｐｌ＋
が用いられ得る。

本発明の方法に用いる試料を調製し得る生物材料には，
細菌培養物．ウィルスに感染した細胞。

単離ウィルス、そして培養物，細胞系列，および細菌に
汚染された食品を包含するが，これらに限定されない。

本方法は特に病原体の診断のための臨床試料に対して設
計されている。例えば、試料は大便．血液または血清，
細菌に感染した尿，または他の排出物（例えば痰や傷の
滲出液）から調製され得る。

試験試料は，細胞またはウィルスの核酸水溶液を得るた
めに細胞および／またはウィルスを溶解させるのに用い
られる既知の操作により、調製され得る。そのような溶
液は核酸および他の溶解細胞またはウィルスの水溶性成
分を含有する。体液や、滲出液の場合、その試料は通常
、酸性ムコ多糖類を含む。大便が試料の場合、存在する
全核酸はさらに、患者が食べた肉または野菜細胞に由来
する核酸および正常な腸内および大便の菌相に由来する
核酸を含み得る。

粗製物質は水性懸濁液として調製され、または得られる
。例えば、固体便は、試料をカラム材料にかけるのに相
当するイオン強度および／またはｐＨで、水溶液に懸濁
させる。例えば、望ましいモル濃度にするために、塩化
ナトリウムが水溶液中の物質に加えられる。ラウリル硫
酸ナトリウムまたは溶解酵素剤のような、細胞またはウ
ィルス溶解剤が加えられる。ブロテイナーゼにのような
溶解酵素が陰イオン、非イオン、または両性イオン界面
活性剤と共に用いられても良い。ＤＮＡ／　ＲＮＡを保
護するために、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ
）のようなキレート剤が加えられてもよい。

ヌクレアーゼおよび／または２価金属イオンによるＤＮ
Ａ／　ＲＮＡの分解が阻止される。制御された温度（２
０〜７０℃）において短時間（５〜６０分間）インキュ
ベートするのもまた。有効である。溶解後。

固体成分は遠心分離または濾過により除去され得る。上
清を本発明の方法に用いる試料に供する。

必要に応じて、試料のｐＨはより中性のｐｉ（に調整さ
れる。イオン強度を上げるために塩が、またはイオン強
度を下げるために水が加えられ得る。

試料を血液から調製する場合には、抗凝固剤が加えられ
ねばならない。ＤＮＡ／　ＲＮＡが分離するのを保護す
るために用いられるＥＤＴＡはまた。抗凝固能を有する
。酸性ムコ多糖類であり、そのように夾雑物のバックグ
ランドに寄与し得るヘパリンの添加が好ましい。

尿から試料を調製する場合には、尿中の細菌細胞をまず
遠心分離（ベレット化）により集め１次に溶菌剤中に懸
濁させる。

培養細胞は、平板プレートまたは培養液から集められる
。細胞がグリセロールまたはジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）中に存在する場合には、これら試薬を除くため
に細胞が洗浄される。ベレット化した細胞を再懸濁し、
尿中の細菌細胞について述べたように処理が行われる。

ウィルス感染細胞については、ウィルスは通常細胞内に
存在する。細胞を溶解すると、ウィルスは遊離する。う
イルスＴ）ＮＡ／　ＲＮＡは適当な既知の条件により遊
離される。試料調製のための添加物および処理は特に但
書のない限り上記のとおりである。溶解終了後、固体を
除き、上澄を得る。

陰イオン交換体は使用時の形で供給されるか。

または塩の水溶液をそれに通すことにより所望の形に変
えられ得る。例えば、カラム内で、ベッドまたは樹脂を
塩化物形に変えるために、　ＮａＣ１溶液を使用するこ
とができる。あるいは、カラムにつめる前に交換体Ｎａ
Ｃ１溶液に浸漬するか、もしくはＨＣＩおよびＮａＯＨ
を用いる既知の方法を繰り返すこともできる。

カラム（または連結したカラム）を調製後、清透な、固
形物を含まない試料がカラムに添加される。重力を利用
した流出系を用いる場合には、または好ましくは、試料
はカラム上に注がれる。添加された試料は結合／洗浄工
程に用いるよりも低いＮａＣｌモル濃度（例えば０．Ｉ
Ｍ　ＮａＣ１）である。試料は、上記のように、核酸が
溶出し始めるイオン強度および／またはｐｉのＮａＣｌ
水溶液で、カラム内へ洗い込まれる。洗浄容量は、結合
しにくい成分をカラムから洗い出すのに充分でなければ
ならない。

通常１から５カラム容量で洗浄すれば充分である。

洗浄液は単一ベッドを用いる場合、および第２ベツドを
用いる場合にも、廃棄される。しかし。

好ましくは、第２ベツドを用いる場合には、洗浄液は第
２ベツドを通過する。

結合した核酸は、カラムまたは第１ベツトにイオン強度
の高い溶離水溶液を通すことにより溶出する。上記水溶
液は、核酸が完全に溶出するような最低条件に相当する
。好ましくはより高い塩化物モル濃度の水溶液である。

溶離液は、その充分な量が流され、カラムまたは第１ベ
ツドから核酸が除去される。通常、溶離液はカラム容量
の約１から５容量が必要である。単一のベッドを使用す
る実施態様においては、核酸は溶離液中に回収される。

しかし、その溶離液は５例えば、核酸沈澱試薬を加える
ことにより、さらに処理され得る。

２つの分離されたベッドまたは１本のカラムに積層した
ベッドを用いる場合には、第１ベツドからの溶離液は第
２ベツドを通過する。溶離液のイオン強度は、第２ベツ
ドに有効に結合させるような条件の強度であり、そして
核酸は第２のベッドに結合する。さらに水溶液を第２の
ベッドに、または第１および第２のベッドに引き続いて
流し。

非結合成分を洗い出すこともできる。この洗浄工程にお
いては２通常約１から５カラム容量が充分な量である。

第２のベッドに吸着した核酸は、第１カラム溶離液より
も高い塩化物モル濃度を有する水性溶離液を積層カラム
または分離カラムの第２のベッドに通すことにより、溶
出する。上記の、より高いモル濃度は、好ましくは、核
酸が第２のベッドから完全に溶出するときの最低の塩化
物モル濃度に相当する。この溶離液は、核酸をカラムか
ら除去するのに充分な容量だけカラムまたは第２ベツド
を通過する。

特に、２本鎖ＤＮＡのような目的とする核酸を含む試料
が、カルボキシル化ムコ多ｌ！類および硫酸エステル化
ムコ多糖類を、他の水溶性成分（溶解細胞またはウィル
ス水溶性成分）と共に含む実施態様においては２分別し
得る塩化物モル濃度を用いることにより、目的の核酸を
酸性ムコ多Ｖｌａ類のいずれかもしくは両者から分離し
得る。実質的にすべての核酸がカラム材料に結合する塩
化物モル濃度で試料をカラムにかけた後、そのカラムを
臨界的な塩化物モル濃度で洗浄することにより、カルボ
キシル化ムコ多糖類が分離される。洗浄液として、核酸
がカラム材料に結合して残留する塩化物モル濃度の塩化
物水溶液を用い、そして、該核酸が溶出し始める最低の
塩化物モル濃度に近いモル濃度を選択することにより、
カラムは、充分な量の洗浄液で洗浄され得、比較的弱く
結合している成分（特に、カルボキシル化ムコ多Ｐｉ類
を包含する）が除去される。この方法の次の工程におい
ては、結合している核酸は、該核酸が溶出する最低の塩
化物モル濃度に相当する塩化物モル濃度を有する塩化物
の水溶液をカラムに通すことにより。

選択的に溶出する。この溶離液は１次に、充分な量でカ
ラム内に流され、核酸がカラムから除去される。他方、
硫酸エステル化ムコ多Ｉｉ類はカラム内に残留する。こ
こで得られたこの回収溶出核酸は、実質的にムコ多糖類
を含まない。

本発明の方法は、さらに１本発明を実施するのに対して
現在のところ好ましい様式である１次の代表的な実施例
により示される。

（以下余白） （実施例） 本発明の方法は、以下の実施例によってさらに例証され
るが、これら実施例は本発明の好ましい実施態様である
。

１、ｌ！艶Ｉｑ屋Ｍコ （ａ）約８．Ｏｄの０．５Ｍ　ＮａＣ１１０，０２Ｍ　
ＮａＪＤＴ八を含む封入管に、約１．０ｇの大便（好ま
しくは新鮮なものであるが、核酸の分解を防ぐために冷
蔵されるかまたは冷凍されたものでもよい）を加える。

この封入管には２激しく振盪する場合に固い健康型の大
便中の大きな線維状塊状物を粉砕するのに役立つ少量の
不活性な弾丸（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を含有させても
よい。（下痢の大便は２通常、微生物をＮａＣ１／ＥＤ
ＴＡ溶液中に懸濁するために、このような激しい振盪工
程を必要としない）。

上記試験管は、塊状物を粉砕する必要があるので２手で
３〜８分間激しく振盪する。次いで、大きな破片を穏や
かに遠心分離することによってペレット化する（臨床用
遠心分離機を用いて低速度で５分間）。可溶性の上清が
次の溶解の手順で用いられる。この上清は、懸濁した微
生物、可溶性の夾雑物、および小さな粒子状の夾雑物を
含有している。

（ｂ）各カラムに対して、５００μＰの試料を以下のも
のに添加するニ ア５０ｕＥのプロテイナーゼＫ（濃度１０ｍｇ／ｄ）　
；１００μ！の２０％ＳＤＳ　；および １５０μ！０８Ｍ尿素。

最終容量＝１．５雇 最終濃度−０，０１，３Ｍ　ＮａＣ１ ０，０５Ｍ　Ｎａ２ＥＤＴＡ ５ｍｇ／戚　プロテイナーゼに １．３％５ＯＳ Ｏ０８ヒ尿素 そして大便の成分および塩類。

この試料を今度は、水浴中で中程度に撹拌しながら１５
〜２０分間、５０〜６０°Ｃに加熱する。

二の試料を取り出し、　　１５ｍｆｌの脱イオン水を用
いて１：２に希釈する。大便の溶液自身は自然に緩衝さ
れた溶液であり、従って付加的な緩衝液は用いられてい
ない。典型的には、　ｐＨは６．５〜７．５の範囲を維
持している。

２、左旦人久側１： （ａ）表Ａに示された第４アンモニウム陰イオン交換体
（ピアースＱＡＢグリコフェーズガラス；７５〜１２５
μｍの不規則粒子、小孔サイズ２００人）を乾燥したま
ま、　０．ＩＭ　ＮａＣ１を含むフラスコに加える。

真空ポンプまたはアスピレータ−を用いて１０〜１５分
間脱ガスする。次いで、これを０．７ｃｍ　Ｘ　１．ｏ
ｃｍＯカラムに充填し、ベッド容積を３．０ｍとした。

振動を加えることによって充填を容易にした。

（ハ）マトリックスが塩化物の形に変換されることを確
実にするために、このカラムに１５ｍ２の２．０ＭＮａ
Ｃ１，次いで６．０ｄのＨｚＯ、１５ｍ１の洗浄溶液（
０，５Ｍ　ＮａＣ１１７％ＭｅＯＨ）　、および１５ｄ
の溶離溶液（０，８Ｍ　ＮａＣ１１７％ＭｅＯＨ）を通
過させ１次いで６　ｍｌｌのＨｚＯですすぎ、そして０
．５Ｍ　ＮａＣｌ　１７％ＭｅＯＨ（９滅）で平衡化し
た。こうして、このカラムは試料を適用する準備がなさ
れた。このカラムは乾燥させてはならない。（本実施例
および以下の実施例におけるすべての溶液のモル濃度は
、特に断らない限り、水溶液について言及している。） ゛　　３６猜製至王皿： （ａ）　８１４製された試料（３，０ｄ）を上記のカラ
ムにゆっくりと注入し、場合によっては重力によって。

あるいは栓をしたシリンジを用いて手動で穏やかに圧力
を印加することによって流す。

（ｂ）このカラムを今度は、５カラム容量の水性洗浄溶
液（０，５Ｍ　ＮａＣｌ　；　１７％ＭｅＯＨ、この洗
浄に先立って０．５Ｍ　ＮａＣ１だけによる洗浄を行い
得る）で洗浄する。ポリカルボキシル化ムコ多Ｉｉ類お
よびタンパクは、このようにしてカラムから洗い流され
るが、　ＤＮＡ／ＲＮＡはカラムに結合したままである
。

硫酸エステル化ムコ多糖類もカラムに残留している。

（ｃ）核酸（ＤＮＡ　）は、９ｄの水性０．８Ｍ　Ｎａ
Ｃ１，１７％ＭｅＯＨで溶離し、０．５ｄずつの両分を
採集して分析ｚ した。得られた核酸は、要求されるいかなる目的にも直
接用い得る程度のものである。硫酸エステル化ムコ多糖
類は、カラムに結合したままである。

このようにして得られたＤＮＡ／ＲＮＡは、実質的に酸
ムコ多Ｉｉ類を含まない。

４、■： 純度および濃度に関する典型的な核酸の分析は。

分光光度計による走査（２１０ｎｍ→３００ｎｍ）、　
２６０ｎｍ／２８０ｎｍにおける吸光度比の比較、およ
び２３０ｎｍ／２６０ｎｍにおける吸光度比の比較を包
含する。アガロースゲル電気泳動によってＤＮＡの状態
（完全な状能）が測定され、スティン−オールを用いた
染色は。

タンパクおよび酸ムコ多糖類からの精製を確認する助け
となる。螢光スキャンを用いて夾雑物の螢光を検出し得
る。また、　　ＤＮＡのハイブリダイゼーション試験を
行うことによって、採集されたＤＮＡの完全な目的領域
が存在することを決定し得る。

５、庭果： これらの手順によって、有意な量の核酸が糞便から単離
され、そして精製される。単離された核酸の８０％を越
える部分は、全容量が１．０〜２．０ｍｌの溶液中に濃
縮されて見い出され得る。

１、試料勿皿製： 糞便試料は、実施例■に記述したように調製する。

２、ｈ５罠すｊ」裂： 表Ａに示された第３アミン陰イオン交換体（ＴＳＫフラ
クトゲルＤＥＡＩＩ！−６５ＯＳ）を用いる。該陰イオ
ン交換体は、予め膨潤され、　２０〜５０ｐｍの粒子と
されている。０．ＩＭ　ＮａＣ１を含むフラスコに、こ
の樹脂の濃縮量を添加する。真空ポンプまたはアスピレ
ータ−を用いて１０〜１５分間脱ガスし１次いで０．７
ＣＩ１１×４ＣＩＩｌＯカラムに充填し、ベッド容量を
１．０ｄとした。これらの球状粒子の充填は１重力によ
る沈降によって達成され得る（他方、実施例Ｉの不規則
なガラス粒子は、良好で稠密な一定のベッドを用意する
ために、トラップを行いおよび／または穏やかな振動を
加える必要がある）。

０））次に、二〇カラムは、必要に応じて、５カラム容
量の２．ＯＭ　ＮａＣ１を通過させ１次いで３カラム容
量（３ＩｎＩ！、）のＨ２Ｏですすぎ、そして３カラム
容量（３ｄ）の０．３Ｍ　ＮａＣ１で平衡化することに
よって。

塩化物の対イオンの形に変換する。こうして、二〇カラ
ムは試料を適用する準備がなされた。二〇カラムは乾燥
させてはならない。

３、葺製■手皿： （ａ）調製された糞便試料（実施例Ｉ、１．．ａおよび
ｂを参照；全容量３．Ｏｍｆ）を上記のカラムにゆっく
りと注入し１重力によって、あるいは栓をしたシリンジ
を用いて手動で穏やかに圧力を印加することによって流
す。

（ｂ）このカラムを今度は、１５カラム容量（１５ｍｆ
ｆ）の０．３Ｍ　ＮａＣ１で洗浄する。ポリカルボキモ
ル化ムコ多ｔｌ１Ｍはカラムから洗い流されるが、　Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡはカラムに結合したままである。

（ｃ）次いで、このカラムを３カラム容量（３ｍＢ　）
の０．５Ｍ　ＮａＣｌで溶離する。画分を採集すると２
通常、８０％を越える量の回収された核酸が約１　、　
Ｏｒｙｔｌの容量中に見い出される。溶出したＤＮＡは
、要求されるいかなる目的にも直接用い得る程度のもの
である。硫酸エステル化ムコ多糖類はカラムに結合した
ままである。

４、分析： 分析は実施例Ｉ、　　４と同様である。ＤＮＡ／ＲＮＡ
は。

実質的に酸ムコ多糖類を含まずに得られる。

■ １、跋料Ω■製： 試料の調製は、実施例１，１．ａおよびｂの記述と同様
である。

２、左プ人■■裂； 使用した第３アミンおよび第４アンモニウム交換体は、
実施例■および■に記述したものと同様である。この調
製は、実施例１２．　ａ　）および実施例ＩＩ　２．　
ａ　）と実質的に同様である。強塩基ガラス交換体をま
ず０．７ｃｍＸ１０ｃｍＯカラムに入れ、振動を加えて
２．０−の容積高さまで充填する。次いで。

ポリエチレンのカラムディスクをベッドの上部に載せ、
さらに弱塩基フラクトゲルを重力によって１．０ｄのベ
ッド高さまで充填する（全カラム容積は３．０戚）。

（ｂ）５．０カラム容量（１５ｄ）の０．２Ｍ　ＮａＣ
ｌを、この複合カラムに通過させてイオン交換を行う。

次いで、　　６１Ｒ１ｎ、ｏ、　５．０カラム容量（１
５成）の０．５ＭＮａＣ１１７％ＭｅＯＨ、および１５
ｍ２の０．８Ｍ　ＮａＣ１１７％ＭｅＯＨ，さらに６ｄ
ｌｏ、ｏを通過させ、そして最後に９ｍｌ！　（３容量
）の０，３Ｍ　ＮａＣ１で平衡化する。こうして、この
カラムは使用する準備がなされた。

３、簾翌少王皿： 試料を注入した後、このカラムを５カラム容量（１５戚
）の水性０．３Ｍ　ＮａＣ１で洗浄すること以外は。

実施例Ｉおよび■と同様の手順である。核酸は。

今度は上方の弱塩基カラム（フラクトゲル）に結合する
。ＤＮＡは、今度は５．０カラム容量（１５ｍ）の０．
５Ｍ　ＮａＣ１，１７％Ｍ　ｅ　ＯＨを用いることによ
り。

上方のカラムから下方のカラム（強塩基グリコフェーズ
ガラス）に溶離する。この溶離液は、下方のカラムを洗
浄する役目も果たす。最後に、　　ＤＮＡ／ＲＮＡは、
３．０カラム容量（９，（ｌｄ）の０．８Ｍ　ＮａＣ１
１７％Ｍｏｏｒｅを用いて下方のカラムから溶離する。

画分の分析によって、核酸が１．０〜２．０ｍｌの容積
中に濃縮されていることが確認されるはずである。

核酸の回収率が向上し、純度も実施例■および■より高
い。裏施孤互 全皇試皿Ｘ遣まれるダ　の　　および゛　１１、拭料皇
皿製： （ａ）抗凝血剤ＥＤＴＡ（Ｋ３）　（最終濃度２５１）
を含む血液採集バイアルに新鮮血を採取する。次いで、
以下の混合物を調製する： ２５０μ２の血液溶液 ２５０ｕＡの０．ＩＸ　ＳＳＣ（＝１５ｍＭ　ＮａＣ１
１，５ｎＭクエン酸ナトリウム） ５００μｌのプロテイナーゼＫ（濃度１０＋ｎｇ／戚）
１００μｌの１％５Ｏ５ Ｌ１００μ！合計 （Ｉ））この溶液を中程度に穏やかに撹拌しながら。

５０°Ｃにて１０〜２０分間インキュベートする。この
混合物は清浄となり、澄んだ濃褐色になる。

２、左旦ムｑ皿製： カラムの調製は、実施例Ｉ、■または■の記述と同様で
あり得る。

３、籠製皇手皿： 精製の手順は、実施例Ｉ、■または■の記述と同様であ
り得る。

４、ゴ： 分析の手順は、実施例■の記述と同様であり得る。

５、猪果： このように全血をスクリーニングすることによって、血
球、および血球の内側または外側のいずれかの病原体（
存在すれば）から核酸が採取される。目的の核酸が、単
に細胞内に存在するか、あるいは細胞外、すなわち被膜
形成リンパ球の外側に存在することが知られている場合
には、適当な血液分別技術を用いて、まずこれら目的の
核酸を含有する成分を単離し、その後で本発明の方法を
利用し得る。例えば、デュポンアイソレーター１０マイ
クロバイアルチユーブを用いて、細菌をベレット化し得
る。酸ムコ多糖類を実質的に含まない精製されたＲＮ＾
／ＤＮＡが得られる。

１、跋粁■皿製： （ａ）感染した尿は細胞培養液として考え得る。好まし
い方法は、まず細胞を遠心分離によって採集することで
あり、これより非常に濃縮され、多量の夾雑物が取り除
かれる。次いで、これら細胞を懸濁させ、そして典型的
な細胞培養物の溶解のように溶解させ得る。例えば、ベ
レット化された細胞を、　　１６０μｆｆｉの０．２５
Ｍ　ＮａＪＤＴＡ　、　８０μｍの１．０％ＳＤＳ、お
よび２５０μ！のプロテイナーゼＫ（濃度１．０ｍｇ／
ｍｌ）を含む５００μｆｉの０．３１’ｌ　ＮａＣｌ中
に懸濁させ得る。次いで、この溶液を湯浴中で５０°Ｃ
に１０〜２０分間加熱する。

（ｂ）必要に応じて、最初に細胞をベレット化して濃縮
することなく、全尿をスクリーニングすること可能であ
る。単に、　　２５０ｕｆｉの０．３Ｍ　ＮａＣｌ　０
．２ＭＮａＪＤＴＡ、　５００μｌプロテイナーゼＫ（
濃度１０　ｍｇ　／戚）および１００μ！の１％ＳＤＳ
を、２５０μ！の尿に添加して、この溶液を５０℃にて
１０〜２０分間インキュベートする。

以後のすべての手順については、実施例１．　　Ｉｆお
よび／または■に与えられている。精製された核酸は、
実質的に酸ムコ多糖類を含まずに得られる。

１、試率しυ」裂： このＮａＯＨによる手順は、上述の試料および他の試料
のいずれに対しても行い得る。塩基性の条件ではＲＮＡ
が分解されるので、　ＮａＯＨ溶解はＤＮＡの採取に用
いられるべきである。グリコフェーズＱＡＨのようなガ
ラスのカラムマトリックスは、塩基性の条件によって害
を受ける。従って、　ＮａＯＨによって溶解させた試料
はカラムにかける前に中和すべきである。

典型的には、大便、′尿、または血液を、　ＮａＣｌ。

ＥＤＴＡ　、およびＮａＯＨに懸濁するかまたは混合し
て。

それぞれＯ，ＬＭおよび０．５Ｍの濃度にする。これに
より、　ｐＨは、約１３となって溶解が容易になる。室
温で５〜２０分間インキュベートし１次いで５００μ！
の０．５Ｍ　　）リスアセテ−１・でｐｕｓ、ｏに中和
する（最終容量１．０ｒｄ）。

以後の手順については　実施例Ｉ、Ｉｆおよび／または
■に記述した通りである。

１、拭對至■裂： この実施例は全〈実施例■に従う。大便、尿。

または他の試料が用いられ得る。簡単には９例えば尿か
ら細胞を採取する。これらの細胞は、２００μ２の８Ｍ
尿素に懸濁して溶解させる。必要に応ら　９ じて、（５０°Ｃにて）５〜２０分間加熱することによ
って、この溶解を促進させ得る。澄んだ溶解物は。

直ちに微小遠心して微粒子を除去し９次いで実施例■〜
■のように調製したカラムに直接注入する。

以後の手順については、実施例１．■および／または■
に記述したとおりである。

上の実施例１−Ｖおよび■に記述された条件は。

特にＤＮＡの単離と精製に関するものである。しかしな
がら、実施例■におけるＮａＯＨ溶解の手順がＲＮＡの
単離には用いられないことを除けば、夾雑物を多く含ん
だ同種の生体試料からＲＮＡを単離し精製するために、
実質的に同様の手順を用い得る。最適な精製に用いられ
るべき正確なＮａＣ１のモル濃度は、調整する必要があ
るが、これは容易に行い得る。適当な注入／洗浄／溶離
のモル濃度は２本発明の原理に基づいて容易に決定し得
る。

同様に、　ＮａＣ１に代わる別のアルカリ金属の塩化物
を塩化アンモニウムとして用いる場合９本発明の目的を
達成するために必要なモル濃度は、最適なＴＩＩＮＡ／
ＲＮＡの精製に必要なように予め決定し調整し得る。

実ｍ Ｅ、　ｃｏ旦のＤＮＡを０．２Ｍ　ＮａＣｌに懸濁して
、カラムに添加する。このカラムを少量の０．３Ｍ塩化
ナトリウム、および０．４Ｍ塩化ナトリウムで洗浄する
。

これらの濃度では、　ＤＮＡは溶離しない。０．５Ｍ　
ＮａＣ１を用いると、　　ＤＮＡが溶出する。ＮａＣｌ
をＭＣＩに代えても、同じ溶出パターンが観察される。

ＬｃｏｌｔのＤＮＡを０．２Ｍ　ＮＨ４Ｃｌに懸濁しカ
ラムに注入すると、やはりＤＮＡは０．５Ｍ　ＮＨ４Ｃ
ｌで溶離する。

本発明の方法が発明の原理を依然として用いるように変
更し得ることは当業者に明らかである。

上述したように、陰イオン交換体カラム材料は。

塩化物の形であり、そして吸着、洗浄および溶離に対し
て９次第に増加するモル濃度の塩化物を用いるのが好ま
しいが、他のハロゲン化物（例えば。

臭化物またはヨウ化物）も使用し得る。例えば。

ナトリウムまたはカリウムの臭化物またはヨウ化は、塩
化ナトリウムに対して述べたように使用し得る。この場
合、カラムは塩と同じ陰イオンの形。

すなわち臭化物を用いる時は臭化物の形、ヨウ化物を用
いる時はヨウ化物の形を用いる。

（発明の要約） 生体試料から核酸を単離し精製する本発明の方法は、陰
イオン交換体材料、好ましくはこのような材料の塩化物
形のものを用いて核酸を結合させる。次いで９次第にモ
ル濃度を上昇させたハロゲン化物、好ましくは塩化物を
用いて、核酸を吸着させ、洗浄し、そして溶出させる。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、タンパク、色素、カルボキシル化ムコ多糖類、硫酸
   エステル化ムコ多糖類、およびこれらの混合物でなる群
   から選択された水溶性夾雑成分と共に、核酸を含有する
   生体試料の水溶液から核酸を単離し精製する方法であっ
   て、 （ａ）目的の核酸が溶離するモル濃度よりも低い塩化物
   のモル濃度で該目的の核酸を有効に結合する陰イオン交
   換体カラム材料を選択すること； （ｂ）該核酸が結合するような、上記の選択された陰イ
   オン交換体材料であり、陰イオン基が塩化物の形である
   陰イオン交換体材料を充填したカラムに該試料を注入す
   ること； （ｃ）該核酸が該カラム材料に結合し続ける塩化物モル
   濃度であり、該核酸が溶離し始める最低の塩化物モル濃
   度に接近した洗浄液濃度の塩化物水溶液によって、カル
   ボキシル化ムコ多糖類を含む非結合成分を該カラムから
   洗い流すのに十分な容量で該カラムを洗浄すること； （ｄ）該目的の核酸が完全に溶離する最低の塩化物モル
   濃度に対応する溶離塩化物モル濃度を有する塩化物の水
   溶液を、該カラムから該核酸を取り出すのに十分な容量
   で該カラムに通過させることによって、該結合した核酸
   を溶離させる一方で、硫酸エステル化されたムコ多糖類
   を含む夾雑成分を該カラム中に残留させること；および （ｅ）ムコ多糖類および他の夾雑成分を実質的に含有せ
   ずに溶離された核酸を回収すること、を包含する方法。 ２、前記核酸が、一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ、そして
   ニ本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡでなる群から選択される、
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記核酸が、細胞またはウィルスの起源に由来する
   、特許請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。 ４、前記試料が、病原体の検査を必要とする体液または
   排泄物から調製される、特許請求の範囲第１項から第３
   項までのいずれかに記載の方法。 ５、前記試料が、糞便、血液、尿、または唾液から調製
   される、特許請求の範囲第４項に記載の方法。 ６、前記陰イオン交換体材料が、交換部位として第３ア
   ミン基を有する、特許請求の範囲第１項から第５項まで
   のいずれかに記載の方法。 ７、前記陰イオン交換体材料が、交換部位として第４ア
   ンモニウム基を有する、特許請求の範囲第１項から第５
   項までのいずれかに記載の方法。 ８、前記洗浄溶液および溶離溶液が、重力による流れに
   よって前記カラムを通過する、特許請求の範囲第１項か
   ら第７項までのいずれかに記載の方法。 ９、前記洗浄溶液および溶離溶液が、塩化ナトリウムの
   溶液である、特許請求の範囲第１項から第８項までのい
   ずれかに記載の方法。 １０、溶解した細胞またはウィルスの水溶性夾雑成分で
   あり、タンパク、色素、カルボキシル化ムコ多糖類、硫
   酸エステル化ムコ多糖類、およびこれらの混合物でなる
   群から選択された水溶性夾雑成分と共に、核酸を含有す
   る水溶液試料から、細胞またはウィルスの核酸を単離し
   精製する方法であって、 （ａ）目的の核酸が溶離するモル濃度よりも低い塩化物
   モル濃度の水溶液で該目的の核酸を有効に結合する弱塩
   基陰イオン交換体を含む第１のイオン交換体カラム材料
   を選択すること； （ｂ）該目的の核酸が溶離するモル濃度よりも低い水性
   塩化物モル濃度であり、該第１のカラム材料の溶離モル
   濃度に対応する結合モル濃度で該目的の核酸を有効に結
   合する強塩基陰イオン交換体を含む第２のイオン交換体
   カラム材料を選択すること； （ｃ）塩化物の形の該第１のカラム材料および該第２の
   カラム材料をそれぞれ充填した第１のカラムおよび第２
   のカラムを、分離カラムまたは堆積カラムのどちらかと
   して調製すること； （ｄ）該目的の核酸が該第１のカラム材料に結合する該
   第１のカラムであり、該弱塩基交換体を含む該第１のカ
   ラムに該試料を注入すること； （ｅ）該核酸が該第１のカラム材料に結合し続ける塩化
   物モル濃度であり、該核酸が溶離し始める塩化物モル濃
   度に接近した洗浄液モル濃度の塩化物水溶液によって、
   カルボキシル化ムコ多糖類を含む非結合成分を該第１の
   カラムから洗い流すのに十分な容量で該第１のカラムを
   洗浄すること； （ｆ）該目的の核酸が溶出し始める最低の塩化物モル濃
   度に対応する溶離塩化物モル濃度を有する塩化物の水溶
   液を、該第１のカラムから該核酸を取り出すのに十分な
   容量で該第１のカラムに通過させることによって、該結
   合した核酸を溶離させる一方で、硫酸エステル化された
   ムコ多糖類を該第１のカラム中に残留させること； （ｇ）該第１のカラム材料から溶離された該核酸を含む
   該第１のカラムの溶出液を、該核酸が結合する該第２の
   カラム材料を含む該第２のカラムに通過させること； （ｈ）該核酸が該第２の材料から完全に溶離する最低の
   塩化物モル濃度に対応し、該第１のカラムの溶離液より
   も高い溶離塩化物モル濃度を有する塩化物の水溶液を、
   該第２のカラムから該核酸を取り出すのに十分な容量で
   該第２のカラムに通過させることによって、該結合した
   核酸を溶離させること；および （ｉ）ムコ多糖類および他の夾雑成分を実質的に含有せ
   ずに単離され精製された核酸を回収すること、 を包含する方法。 １１、前記カラムの両方が重力による流れによって操作
   され、前記工程（ｄ）の洗浄が前記第２のカラムについ
   て行われる、特許請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２、前記ムコ多糖類がカルボキシル化ムコ多糖類およ
   び硫酸エステル化ムコ多糖類の両方を含み、該カルボキ
   シル化ムコ多糖類が前記カラムの両方から洗い流され、
   そして前記核酸が前記第２のカラムから取り出された後
   も該硫酸エステル化ムコ多糖類が前記第１のカラムまた
   は該第２のカラムのいずれかに残留している、特許請求
   の範囲第１０項または第１１項に記載の方法。 １３、前記試料が、糞便、血液、尿、および唾液でなる
   群から選択された体液または排泄物から調製される、特
   許請求の範囲第１０項から第１２項までのいずれかに記
   載の方法。 １４、前記第１の材料が陰イオン交換部位として第３ア
   ミン基を有し、前記第２の材料が陰イオン交換部位とし
   て第４アンモニウム基を有する、特許請求の範囲第１０
   項から第１３項までのいずれかに記載の方法。 １５、前記核酸が、一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ、そし
   て二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡでなる群から選択される
   、特許請求の範囲第１０項から第１４項までのいずれか
   に記載の方法。