CN103392128B - 离子交换色谱法用填充剂以及核酸链的分离检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于，提供能够充分地检测核酸链中的碱基序列差异、单碱基替换差异的离子交换色谱法用填充剂。另外，本发明目的在于，提供使用该离子交换色谱法用填充剂的核酸链的分离检测方法。本发明涉及在基材微粒表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团的离子交换色谱法用填充剂。

Description

离子交换色谱法用填充剂以及核酸链的分离检测方法
技术领域
本发明涉及用于核酸链的分离检测的离子交换色谱法用填充剂。另外，本发明涉及使用该离子交换色谱法用填充剂的核酸链的分离检测方法。
背景技术
核酸为含有碱基、糖、磷酸的核苷酸通过磷酸酯键连接而成的生物体高分子，依据糖结构的不同被分类为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
近年来，开发了分析已经明确与各种疾病、药的副作用相关的单核苷酸多态性(SNP；SingleNucleotidePolymorphism)的技术，简便并且在短时间内精度良好地检测成为重要的要素。
作为SNP解析的主要方法，已知SSCP法(单链构象多态性)(例如，非专利文献1)。SSCP法为利用由单链DNA中碱基序列的差异所产生的高次结构的差异来检测SNP的方法。但是，SSCP法中利用放射性同位素或者荧光物质的标识是必要的，因此工程变得复杂，试药变得高价。另外，使用电泳来分离检测多态，因此存在操作繁杂、解析中需要时间等课题。
另外，作为SNP解析的其他方法，已知RFLP法(限制性片段长度多态性)。RFLP法为当存在识别PCR扩增产物中的基因变异部位的限制性酶时，在常规序列部位上设定引物，在其内侧即在PCR扩增产物内保持多态性而进行扩增，用限制性酶将得到的PCR产物切断，依据该片段的长度来判断有无多态的方法。但是，由于使用限制性酶，存在分析成本上升、解析总体的时间变长等课题。另外，由于通过电泳检测链长差异，所以存在操作变得繁杂、解析总体的时间变长等课题。
另一方面，在生化学、医学等领域中，核酸、蛋白质、多糖类这样的生物体高分子的分离中，作为能够简便且短时间内进行精度良好检测的方法，离子交换色谱法被广泛使用。
离子交换色谱法为利用在填充剂的离子交换基团与测定对象物质中的离子之间活动的静电相互作用来分离测定对象物质的方法，有利用阴离子交换的离子交换色谱法和利用阳离子交换的离子交换色谱法。阴离子交换液相色谱法采用具有阳离子性的官能团的柱填充剂，能够分离阴离子性的物质。另外，阳离子交换液相色谱法采用具有阴离子性的官能团的柱填充剂，能够分离阳离子性的物质。
采用离子交换色谱法对核酸的PCR扩增产物进行分离时，利用核酸分子中含有的磷酸的负电荷，使用阴离子交换液相色谱法。作为阴离子交换液相色谱法中的柱填充剂的阳离子性官能团，有二乙基氨基乙基这样的弱阳离子性基团、季铵基团这样的强阳离子性基团，具有这些阳离子性官能团的柱填充剂已经被市售，被用于各种研究领域中。
但是，就使用以往的柱填充剂的离子色谱法而言，无法充分地检测核酸链中的碱基序列差异、单碱基替换的差异。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Orita，M.，etal.：DetectionofpolymorphismsofhumanDNAbygelelectrophoresisassingle-strandconformationpolymorphisms.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：2766-2770，1989.
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于，提供能够充分检测核酸链中的碱基序列差异或者单碱基替换的差异的离子交换色谱法用填充剂。另外，本发明的目的在于，提供使用该离子交换色谱法用填充剂的核酸链的分离检测方法。
用于解决课题的手段
本发明涉及，在基材微粒的表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团的离子交换色谱法用填充剂。
以下详细说明本发明。
本发明者等发现，通过采用在基材微粒的表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团作为离子交换基团的填充剂作为用于离子交换色谱法的填充剂，从而能够充分检测核酸链中的碱基序列的差异、单碱基替换的差异，至此完成了本发明。
本说明书中，所述上述强阳离子性基团表示在pH为1到14的宽范围下发生解离的阳离子性基团。也就是说，强阳离子性基团可以保持不受水溶液pH影响而解离的状态(阳离子化)。
作为上述强阳离子性基团，可以举出季铵基。具体地可以举出例如三甲基铵基、三乙基铵基、二甲基乙基铵基等三烷基铵基等。
另外，作为上述强阳离子性基团的相反离子，可以举出例如氯化物离子、溴化物离子、碘化物离子等卤化物离子。
在上述基材微粒的表面被导入的强阳离子性基团的量没有特别限定，相对于填充剂的干燥重量的优选下限为1μeq/g，优选上限为500μeq/g。如果上述强阳离子性基团的量不足1μeq/g，则存在保持力变弱且分离性能变差的情况。如果上述强阳离子性基团的量超过500μeq/g，则存在产生保持力变得过强而无法容易地洗脱，分析时间变得过长等问题的情况。
所述本说明书中上述弱阳离子性基团表示pka为8以上的阳离子性基团。也就是说，上述弱阳离子性基团受到水溶液的pH的影响，解离状态发生变化。也就是说，若pH变得高于8，则上述弱阳离子性基团的质子解离，不持正电荷的比例增加。相反，若pH低于8，则上述弱阳离子性基团质子化，持正电荷的比例增加。
作为上述弱阳离子性基团，可以举出例如叔氨基、仲氨基、伯氨基等。其中，优选为叔氨基。
另外，在上述基材微粒表面被导入的上述弱阳离子性基团的量没有特别限定，优选下限为0.5μeq/g，优选上限为500μeq/g。如果上述弱阳离子性基团的量为不足0.5μeq/g，则存在过少而分离性能不提高的情况。如果上述弱阳离子性基团的量超过500μeq/g，则与强阳离子性基团同样地存在产生保持力过强而无法容易地洗脱，分析时间变得过长等问题的情况。
作为上述基材微粒可以使用例如使用聚合性单体等而得到的合成高分子微粒、二氧化硅类等无机微粒等，优选为含有合成有机高分子的疏水性交联聚合物粒子。
上述疏水性交联聚合物也可以为：使至少1种疏水性交联性单体与具有至少1种反应性官能团的单体共聚而得到的疏水性交联聚合物、使至少1种疏水性交联性单体和具有至少1种反应性官能团的单体以及至少1种疏水性非交联性单体共聚而得到的疏水性交联聚合物中的任一种。
作为上述疏水性交联性单体，只要是1分子单体中具有2个以上乙烯基的单体，就没有特别限定，可以举出例如乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚丙二醇二(甲基)丙烯酸酯等二(甲基)丙烯酸酯；三羟甲基甲烷三((甲基)丙烯酸酯)、四羟甲基甲烷三((甲基)丙烯酸酯)等三((甲基)丙烯酸酯)或四((甲基)丙烯酸酯)；二乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基二甲苯、二乙烯基萘等芳香族类化合物。需要说明的是，本说明书中上述(甲基)丙烯酸酯表示丙烯酸酯或者甲基丙烯酸酯，(甲基)丙烯酰基表示丙烯酰基或者甲基丙烯酰基。
作为上述具有反应性官能团的单体，可以举出(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸异氰基乙酯等。
作为上述疏水性非交联性单体，只要是具有疏水性性质的非交联性的聚合性有机单体，则没有特别限定，可以举出例如(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯等(甲基)丙烯酸酯；苯乙烯、甲基苯乙烯等苯乙烯类单体。
上述疏水性交联聚合物为使上述疏水性交联性单体与具有上述反应性官能团的单体共聚而得到的聚合物时，上述疏水性交联聚合物中来自于上述疏水性交联性单体的片段的含有比例的优选下限为10重量％，更优选的下限为20重量％。
本发明的离子交换色谱法用填充剂优选为：在上述基材微粒的表面具备具有上述强阳离子性基团与上述弱阳离子性基团的聚合物层的填充剂。
另外，就具有上述强阳离子性基团与上述弱阳离子性基团的聚合物而言，优选为上述强阳离子性基团与上述弱阳离子性基团分别来源于独立的单体的聚合物。具体地，本发明的离子交换色谱法用填充剂优选为在被覆聚合物粒子的表面导入有弱阳离子性基团的填充剂，所述被覆聚合物粒子含有上述疏水性交联聚合物粒子、和具有共聚在上述疏水性交联聚合物粒子的表面的强阳离子性基团的亲水性聚合物的层。
具有上述强阳离子性基团的亲水性聚合物为由具有强阳离子性基团的亲水性单体构成的聚合物，只要含有来源于具有1种以上的强阳离子性基团的亲水性单体的片段即可。也就是说，作为制备具有上述强阳离子性基团的亲水性聚合物的方法，可以举出使具有强阳离子性基团的亲水性单体单独地聚合的方法、使2种以上具有强阳离子性基团的亲水性单体共聚的方法、使具有强阳离子性基团的亲水性单体与不具有强阳离子性基团的亲水性单体共聚的方法等。
作为具有上述强阳离子性基团的亲水性单体，优选为具有季铵基的亲水性单体。具体地可以举出例如甲基丙烯酸乙酯三甲基氯化铵、甲基丙烯酸乙酯三乙基氯化铵、甲基丙烯酸乙酯二甲基乙基氯化铵、甲基丙烯酸乙酯二甲基苄基氯化铵、丙烯酸乙酯二甲基苄基氯化铵、丙烯酸乙酯三乙基氯化铵、丙烯酸乙酯二甲基乙基氯化铵、丙烯酰胺乙基三甲基氯化铵、丙烯酰胺乙基三乙基氯化铵、丙烯酰胺乙基二甲基乙基氯化铵等。
作为在上述被覆聚合物粒子的表面导入上述弱阳离子性基团的方法，可以使用公知的方法。具体地，例如作为导入叔氨基作为上述弱阳离子性基团的方法，可以举出：
在疏水性交联聚合物粒子的表面共聚具有上述强阳离子性基团的亲水性单体，接着使缩水甘油基与具有叔氨基的试药反应的方法，所述疏水性交联聚合物含有：具备以具有缩水甘油基的单体为来源的片段的疏水性交联聚合物；
在疏水性交联聚合物粒子的表面共聚具有上述强阳离子性基团的亲水性单体，接着使异氰酸酯基与具有叔氨基的试药反应的方法，所述疏水性交联聚合物含有：具备以具有异氰酸酯基的单体为来源的片段的疏水性交联聚合物；
在上述疏水性交联聚合物粒子的表面共聚具有上述强阳离子性基团的亲水性单体和具有叔氨基的单体的方法；
使用具有叔氨基的硅烷偶联剂在具备具有上述强阳离子性基团的亲水性聚合物层的被覆聚合物粒子的表面导入叔氨基的方法；
在疏水性交联聚合物粒子的表面共聚具有上述强阳离子性基团的亲水性单体，接着使用碳二亚胺使羧基与具有叔氨基的试药发生缩聚的方法，所述疏水性交联聚合物含有：具备以具有羧基的单体为来源的片段的疏水性交联聚合物；
在疏水性交联聚合物粒子的表面共聚具有上述强阳离子性基团的亲水性单体，将酯键部水解后，接着使用碳二亚胺使由水解生成的羧基与具有叔氨基的试药发生缩聚的方法，所述疏水性交联聚合物含有：具备以具有酯键的单体为来源的片段的疏水性交联聚合物；等。
其中，优选：
在疏水性交联聚合物粒子的表面共聚具有上述强阳离子性基团的亲水性单体，接着使缩水甘油基与具有叔氨基的试药反应的方法，所述疏水性交联聚合物含有：具备以具有缩水甘油基的单体为来源的片段的疏水性交联聚合物；
在疏水性交联聚合物粒子的表面共聚具有上述强阳离子性基团的亲水性单体，接着使异氰酸酯基与具有叔氨基的试药反应的方法，所述疏水性交联聚合物含有：具备以具有异氰酸酯基的单体为来源的片段的疏水性交联聚合物。
作为与缩水甘油基、异氰酸酯基等反应性官能团反应的具有上述叔氨基的试药，只要具有使叔氨基和反应性官能团能够反应的官能团，没有特别限定。作为使上述叔氨基与反应性官能团能够反应的官能团，可以举出，例如伯氨基、羟基等。其中，优选末端具有伯氨基的基团。作为具体的化合物，可以举出N，N-二甲氨基甲胺、N，N-二甲氨基乙胺、N，N-二甲氨基丙胺、N，N-二甲氨基丁胺、N，N-二乙氨基乙胺、N，N-二乙氨基丙基乙基胺、N，N-二乙氨基丁胺、N，N-二乙氨基戊胺、N，N-二乙氨基己胺、N，N-二丙氨基丁胺、N，N-二丁氨基丙胺等。
上述强阳离子性基团优选季铵盐、与上述弱阳离子性基团优选叔氨基之间的相对的位置关系优选上述强阳离子性基团存在于比上述弱阳离子性基团距离基材微粒的表面远的位置，即，存在于外侧。例如，优选上述弱阳离子性基团存在于距离基材微粒表面以内，上述强阳离子性基团存在于距离基材微粒表面以内且与弱阳离子性基团相比存在于外侧。
本发明的离子交换色谱法用填充剂的平均粒径没有被特别是限定，优选下限为0.1μm，优选上限为20μm。如果上述平均粒径为不足0.1μm，则存在柱内变得过于高压而引起分离不良的情况。如果上述平均粒径超过20μm，则存在柱内的死体积变得过大而引起分离不良的情况。
需要说明的是，本说明书中上述平均粒径表示体积平均粒径，可以使用粒度分布测定装置(AccuSizer780/ParticleSizingSystem公司制)测定。
使用本发明的离子交换色谱法用填充剂的核酸链的分离检测方法也是本发明之一。
本发明的核酸链的分离检测方法中，作为利用离子交换色谱发进行分析时的洗脱液的组成，可以使用公知条件。
作为上述洗脱液所使用的缓冲液，优选使用含有公知氯化合物的缓冲液类、有机溶剂类，具体地可以举出例如Tris-HCl缓冲液；含有Tris与EDTA的TE缓冲液；含有Tris、醋酸与EDTA的TAE缓冲液；含有Tris、硼酸与EDTA的TBA缓冲液等。
上述洗脱液的pH没有特别限定，但优选下限为5，优选上限为10。可认为：通过设定在该范围，从而上述弱阳离子性基团也有效地作为离子交换基团(阴离子交换基团)来发挥作用。上述洗脱液的pH的更优选下限为6，更优选上限为9。
作为离子交换色谱中用于洗脱的盐，例如可以使用氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾等卤化物与碱金属所形成的盐；氯化钙、溴化钙、氯化镁、溴化镁等卤化物与碱土金属所形成的盐；高氯酸钠、高氯酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾等无机酸盐等。另外，也可以使用醋酸钠、醋酸钾、琥珀酸钠、琥珀酸钾等有机酸盐。
作为上述洗脱液的盐浓度，只要依据分析条件来适当调整即可，优选的下限为10mmol/L，优选的上限为2000mmol/L，更优选的下限为100mmol/L，更优选的上限为1500mmol/L。
发明效果
通过本发明可以提供能够充分检测核酸链中的碱基序列差异、单碱基替换的差异的离子交换色谱法用填充剂。另外，通过本发明可以提供使用该离子交换色谱法用填充剂的核酸链的分离检测方法。
附图说明
图1为使用填充了在实施例1中制备出的填充剂的阴离子交换柱，测定序列不同的低聚核苷酸(检体A、B)所得到的图。
图2为使用填充了在比较例1中制备出的填充剂的阴离子交换柱，测定序列不同的低聚核苷酸(检体A、B)所得到的图。
图3为使用填充了在实施例1中制备出的填充剂的阴离子交换柱，测定单碱基不同的低聚核苷酸(检体C、D)所得到的图。
图4为使用填充了在比较例1中制备出的填充剂的阴离子交换柱，测定单碱基不同的低聚核苷酸(检体C、D)所得到的图。
具体实施方式
以下，公开实施例来更详细地说明本发明，本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
在带有搅拌机的反应器中的3重量％聚乙烯醇(日本合成化学社制)水溶液2000mL中，添加四乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业社制)200g、三乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业社制)100g、甲基丙烯酸缩水甘油酯(和光纯药物工业社制)100g以及过氧化苯甲酰(KISHIDACHEMICALCo.，Ltd.制)1.0g的混合物。一边搅拌一边加热，在氮气氛下于80℃下聚合1小时。接着，作为具有强阳离子性基团的亲水性单体，将甲基丙烯酸乙酯三甲基氯化铵(和光纯药物工业社制)100g溶解于离子交换水。将其添加至同一反应器中，同样地一边搅拌一边在氮气氛下于80℃下聚合2小时。通过用水和丙酮对得到的聚合组合物进行洗涤，从而得到在表面具备具有季铵基的亲水性聚合物的层的被覆聚合物粒子。
对得到的被覆聚合物粒子，采用粒度分布测定装置(AccuSizer780/ParticleSizingSystem社制)测定后，平均粒径为10μm。
使得到的被覆聚合物粒子10g分散于离子交换水100mL中，准备反应前浆料。接着，一边搅拌该浆料，一边加入N，N-二甲氨基丙胺(和光纯药物工业社制)10mL，于70℃反应4小时。反应结束后，用离心分离机(日立制作所社制，“HimacCR20G”)除去上清液，用离子交换水洗涤。洗涤后，用离心分离机除去上清液。用该离子交换水进一步重复4次洗涤，得到在基材微粒表面具有季铵基和叔氨基的离子交换色谱法用填充剂。
比较例1
在带有搅拌机的反应器中的3重量％聚乙烯醇(日本合成化学社制)水溶液2000mL中，添加四乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业社制)300g、三乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业社制)100g以及过氧化苯甲酰(KISHIDACHEMICALCo.，Ltd.制)1.0g的混合物。一边搅拌一边加热，在氮气氛下于80℃下聚合1小时。接着，作为具有强阳离子性基团的亲水性单体，将甲基丙烯酸乙酯三甲基氯化铵(和光纯药物工业社制)100g溶解于离子交换水。将其添加至同一反应器，同样地一边搅拌一边在氮气氛下于80℃聚合2小时。通过用水以及丙酮对得到的聚合组合物进行洗涤，从而得到在表面具备具有季铵基的亲水性聚合物的层的被覆聚合物粒子。
对得到的被覆聚合物粒子，与实施例1同样地采用粒度分布测定装置(AccuSizer780/ParticleSizingSystem社制)测定后，平均粒径为10μm。
<评价>
将在实施例以及比较例中制备出的离子交换色谱法用填充剂填充至液相色谱系统的不锈钢制柱(柱尺寸：内径4.6mm×长度20mm)中。
<分离性能的确认>
使用填充了在实施例及比较例中制备出的离子交换色谱法用填充剂的阴离子交换柱，在表1所示的条件下测定下述检体A～D，进行分离性能的比较。
[表1]
(1)序列不同的低聚核苷酸的分离
检体：低聚核苷酸20mer(OperonBiotechnologies公司制)
检体A…5’-AACTTGAGTTCGGCGATCAC-3’
检体B…5’-CCAGCATCGATCATATTGGG-3’
需要说明的是，上述检体A、B只是序列不同，所含的碱基的数量为A5、T5、G5、C5。碱基序列采用任意数任意确定。
(2)单碱基替换的低聚核苷酸的分离
检体：低聚核苷酸20mer(OperonBiotechnologies公司制)
检体C…5’-CCAGCATCGATCATATTGGG-3’
检体D…5’-CCAGCATCGATCATATTGCG-3’
使用填充了在实施例1、比较例1中制备出的填充剂的阴离子交换柱，测定序列不同的低聚核苷酸(检体A、B)，将所测得的图分别示于图1、图2。
由图1、图2的比较可知，利用填充了在基材微粒表面共存有强阳离子性基团与弱阳离子性基团的实施例1的填充剂的柱，能够将序列不同的低聚核苷酸良好地分离。另一方面，利用填充了比较例1的填充剂的柱，分离不充分。
使用填充了在实施例1、比较例1中制备出的填充剂的阴离子交换柱，测定单碱基不同的低聚核苷酸(检体C、D)，将所测得的图别示于图3、图4。
由图3、图4的比较可知，利用填充了在基材微粒的表面共存有强阳离子性基团和弱阳离子性基团的实施例1的填充剂的柱，能够将单碱基替换的低聚核苷酸良好地分离。
另一方面，利用填充了比较例1的填充剂的柱，分离不充分。
产业上的可利用性
根据本发明，可以提供能够充分地检测核酸链中的碱基序列差异、单碱基替换差异的离子交换色谱法用填充剂。另外，根据本发明，可以提供使用该离子交换色谱法用填充剂的核酸链的分离检测方法。

Claims (7)

1.一种核酸链的分离检测方法，其特征在于，采用填充有离子交换色谱法用填充剂的柱，通过离子交换色谱法对检体中的序列不同的低聚核苷酸或单碱基不同的低聚核苷酸进行分离、检测，
所述离子交换色谱法用填充剂在基材微粒的表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团，
所述强阳离子性基团为在pH为1到14的范围下发生解离的阳离子性基团，
所述弱阳离子性基团是pka为8以上的阳离子性基团。
2.根据权利要求1所述的核酸链的分离检测方法，其特征在于，强阳离子性基团为季铵基。
3.根据权利要求1所述的核酸链的分离检测方法，其特征在于，弱阳离子性基团为叔氨基。
4.根据权利要求1所述的核酸链的分离检测方法，其特征在于，强阳离子性基团为季铵基，弱阳离子性基团为叔氨基。
5.根据权利要求1所述的核酸链的分离检测方法，其特征在于，在基材微粒的表面具备具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团的聚合物层。
6.根据权利要求5所述的核酸链的分离检测方法，其特征在于，强阳离子性基团与弱阳离子性基团分别来源于独立的单体。
7.根据权利要求1所述的核酸链的分离检测方法，其特征在于，基材微粒含有合成有机高分子。
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