KR20200006179A - 이온 교환 크로마토그래피용 충전제 및 핵산 사슬의 분리 검출 방법 - Google Patents

이온 교환 크로마토그래피용 충전제 및 핵산 사슬의 분리 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산 사슬 중의 염기 배열의 상이함이나 1 염기 치환의 차이를 충분히 검출할 수 있는 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또 본 발명은 그 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 사용하는 핵산 사슬의 분리 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 기재 미립자의 표면에 강카티온성기와 약카티온성기를 갖는 이온 교환 크로마토그래피용 충전제이다.

Description

이온 교환 크로마토그래피용 충전제 및 핵산 사슬의 분리 검출 방법 {FILLER FOR ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY AND METHOD FOR SEPARATING AND DETECTING NUCLEIC ACID STRAND}
본 발명은 핵산 사슬의 분리 검출에 사용하는 이온 교환 크로마토그래피용 충전제에 관한 것이다. 또, 본 발명은 그 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 사용하는 핵산 사슬의 분리 검출 방법에 관한 것이다.
핵산은 염기, 당, 인산으로 이루어지는 뉴클레오티드가 인산에스테르 결합으로 연결된 생체 고분자로, 당 구조의 차이에 따라 디옥시리보핵산 (DNA) 과 리보 핵산 (RNA) 으로 분류된다.
최근, 핵산에 있어서, 여러 가지 병이나 약의 부작용과의 관련성이 명확해진 1 염기 다형 (SNP；Single Nucleotide Polymorphism) 을 해석하는 기술이 개발되고 있어, 간편하게 또한 단시간에 양호한 정밀도로 검출하는 것이 중요한 요소로 되어 있다.
SNP 해석의 주요한 방법으로서, SSCP 법 (Single-Stranded Comformation Polymorphism) 이 알려져 있다 (예를 들어, 비특허문헌 1). SSCP 법은 1 개 사슬 DNA 에 있어서의 염기 배열의 상이함에 따라 발생하는 고차 구조의 차이를 이용하여 SNP 를 검출하는 방법이다. 그러나, SSCP 법에서는 라디오아이소토프 또는 형광 물질에 의한 표지가 필요하기 때문에, 공정이 번잡해지거나 시약이 고가가 되거나 한다. 또, 전기 영동을 이용하여 다형을 분리 검출하기 때문에, 작업이 번잡해지거나 해석에 시간을 필요로 하거나 하는 등의 과제가 있다.
또, SNP 해석의 다른 방법으로서, RFLP 법 (Restriction Fragment Length Polymorphism) 이 알려져 있다. RFLP 법은, PCR 증폭 산물 중의 유전자 변이 부위를 인식하는 제한 효소가 존재하는 경우, 공통 배열 부위에 프라이머를 설정하고, 그 내측, 즉 PCR 증폭 산물 내에 다형성을 지니게 하여 증폭시키고, 얻어진 PCR 산물을 제한 효소로 절단하고, 그 단편의 길이에 따라 다형의 유무를 판정하는 방법이다. 그러나, 제한 효소를 이용하기 때문에, 분석 비용이 상승하거나 해석 전체의 시간이 길어지거나 하는 등의 과제가 있다. 또, 전기 영동에 의해 사슬 길이 차이를 검출하기 때문에, 작업이 번잡해지거나 해석 전체의 시간이 길어지거나 하는 등의 과제도 있다.
한편, 생화학이나 의학 등의 분야에 있어서, 핵산, 단백질, 다당류와 같은 생체 고분자의 분리에는, 간편하게 또한 단시간에 양호한 정밀도로 검출할 수 있는 방법으로서 이온 교환 크로마토그래피가 범용되고 있다.
이온 교환 크로마토그래피는 충전제의 이온 교환기와 측정 대상 물질 중의 이온 사이에 작용하는 정전적 상호 작용을 이용하여 측정 대상 물질을 분리하는 방법으로, 아니온 교환에 의한 것과 카티온 교환에 의한 것이 있다. 아니온 교환 액체 크로마토그래피는, 카티온성의 관능기를 갖는 칼럼 충전제를 이용하여, 아니온성의 물질을 분리할 수 있다. 또, 카티온 교환 액체 크로마토그래피는, 아니온성의 관능기를 갖는 칼럼 충전제를 이용하여, 카티온성의 물질을 분리할 수 있다.
핵산의 PCR 증폭 산물을 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분리하는 경우, 핵산 분자 중에 포함되는 인산의 마이너스 전하를 이용하고, 아니온 교환 액체 크로마토그래피가 사용된다. 아니온 교환 액체 크로마토그래피에 있어서의 칼럼 충전제의 카티온성의 관능기로는, 디에틸아미노에틸기와 같은 약카티온성기, 4 급 암모늄기와 같은 강카티온성기가 있으며, 이들 카티온성의 관능기를 갖는 칼럼 충전제는 이미 시판되어 각종 연구 분야에서 사용되고 있다.
그러나, 종래의 칼럼 충전제를 사용한 이온 교환 크로마토그래피에서는, 핵산 사슬 중의 염기 배열의 상이함이나 1 염기 치환의 차이를 충분히 검출할 수 없었다.
Orita, M., et al.：Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：2766-2770, 1989.
본 발명은, 핵산 사슬 중의 염기 배열의 상이함이나 1 염기 치환의 차이를 충분히 검출할 수 있는 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또 본 발명은 그 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 사용하는 핵산 사슬의 분리 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 기재 미립자의 표면에 강카티온성기와 약카티온성기를 갖는 이온 교환 크로마토그래피용 충전제이다.
이하에 본 발명을 상세하게 서술한다.
본 발명자들은, 이온 교환 크로마토그래피에 사용하는 충전제로서, 기재 미립자의 표면에, 이온 교환기로서 강카티온성기와 약카티온성기를 갖는 충전제를 사용함으로써, 핵산 사슬 중의 염기 배열의 상이함이나 1 염기 치환의 차이를 충분히 검출할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
본 명세서에 있어서, 상기 강카티온성기란 pH 가 1 내지 14 의 넓은 범위에서 해리되는 카티온성기를 의미한다. 즉 강카티온성기는 수용액의 pH 에 영향을 받지 않고 해리된 (카티온화된) 상태를 유지하는 것이 가능하다.
상기 강카티온성기로는, 4 급 암모늄기를 들 수 있다. 구체적으로는 예를 들어, 트리메틸암모늄기, 트리에틸암모늄기, 디메틸에틸암모늄기 등의 트리알킬암모늄기 등을 들 수 있다. 또, 상기 강카티온성기의 카운터 이온으로는, 예를 들어 염화물 이온, 브롬화물 이온, 요오드화물 이온 등의 할로겐화물 이온을 들 수 있다.
상기 기재 미립자의 표면에 도입되는 강카티온성기량은 특별히 한정되지 않지만, 충전제의 건조 중량당 바람직한 하한은 1 μeq/g, 바람직한 상한은 500 μeq/g 이다. 상기 강카티온성기량이 1 μeq/g 미만이면, 유지력이 약해 분리 성능이 떨어지는 경우가 있다. 상기 강카티온성기량이 500 μeq/g 을 초과하면, 유지력이 지나치게 강해져 용이하게 용출시킬 수 없어, 분석 시간이 지나치게 길어지는 등의 문제가 발생하는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서 상기 약카티온성기란, pka 가 8 이상인 카티온성기를 의미한다. 즉 상기 약카티온성기는 수용액의 pH 에 의한 영향을 받아 해리 상태가 변화된다. 즉 pH 가 8 보다 높아지면, 상기 약카티온성기의 프로톤은 해리되고, 플러스 전하를 갖지 않는 비율이 증가된다. 반대로, pH 가 8 보다 낮아지면, 상기 약카티온성기는 프로톤화되고, 플러스 전하를 갖는 비율이 증가된다.
상기 약카티온성기로는, 예를 들어 3 급 아미노기, 2 급 아미노기, 1 급 아미노기 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 3 급 아미노기인 것이 바람직하다. 또, 상기 기재 미립자의 표면에 도입되는 상기 약카티온성기량은 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한은 0.5 μeq/g, 바람직한 상한은 500 μeq/g 이다. 상기 약카티온성기량이 0.5 μeq/g 미만이면, 지나치게 적어 분리 성능이 향상되지 않는 경우가 있다. 상기 약카티온성기량이 500 μeq/g 을 초과하면, 강카티온성기와 동일하게 유지력이 지나치게 강해져 용이하게 용출시킬 수 없어, 분석 시간이 지나치게 길어지는 등의 문제가 발생하는 경우가 있다.
상기 기재 미립자로는, 예를 들어 중합성 단량체 등을 이용하여 얻어지는 합성 고분자 미립자, 실리카계 등의 무기 미립자 등을 이용할 수 있지만, 합성 유기 고분자로 이루어지는 소수성 가교 중합체 입자인 것이 바람직하다.
상기 소수성 가교 중합체는 적어도 1 종의 소수성 가교성 단량체와 적어도 1 종의 반응성 관능기를 갖는 단량체를 공중합하여 얻어지는 소수성 가교 중합체, 적어도 1 종의 소수성 가교성 단량체와 적어도 1 종의 반응성 관능기를 갖는 단량체와 적어도 1 종의 소수성 비가교성 단량체를 공중합하여 얻어지는 소수성 가교 중합체 중 어느 것이어도 된다.
상기 소수성 가교성 단량체로는, 단량체 1 분자 중에 비닐기를 2 개 이상 갖는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 폴리프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트 등의 디(메트)아크릴산에스테르나 트리메틸올메탄트리(메트)아크릴레이트, 테트라메틸올메탄트리(메트)아크릴레이트 등의 트리(메트)아크릴산에스테르 또는 테트라(메트)아크릴산에스테르나, 디비닐벤젠, 디비닐톨루엔, 디비닐자일렌, 디비닐나프탈렌 등의 방향족계 화합물을 들 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서 상기 (메트)아크릴레이트란 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트를 의미하고, (메트)아크릴이란 아크릴 또는 메타크릴을 의미한다.
상기 반응성 관능기를 갖는 단량체로는, 글리시딜(메트)아크릴레이트, 이소시아네이트에틸(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
상기 소수성 비가교성 단량체로는, 소수성의 성질을 갖는 비가교성의 중합성 유기 단량체이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 메틸(메트)아크릴레이트, 에틸(메트)아크릴레이트, 부틸(메트)아크릴레이트, t-부틸(메트)아크릴레이트 등의 (메트)아크릴산에스테르나, 스티렌, 메틸스티렌 등의 스티렌계 단량체를 들 수 있다.
상기 소수성 가교 중합체가 상기 소수성 가교성 단량체와 상기 반응성 관능기를 갖는 단량체를 공중합하여 얻어지는 것인 경우, 상기 소수성 가교 중합체에 있어서의 상기 소수성 가교성 단량체에서 유래하는 세그먼트의 함유 비율의 바람직한 하한은 10 중량％, 보다 바람직한 하한은 20 중량％ 이다.
본 발명의 이온 교환 크로마토그래피용 충전제는 상기 기재 미립자의 표면에 상기 강카티온성기와 상기 약카티온성기를 갖는 중합체층을 갖는 것이 바람직하다.
또, 상기 강카티온성기와 상기 약카티온성기를 갖는 중합체에 있어서, 상기 강카티온성기와 상기 약카티온성기는 각각 독립된 단량체에서 유래하는 것인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 본 발명의 이온 교환 크로마토그래피용 충전제는 상기 소수성 가교 중합체 입자와, 상기 소수성 가교 중합체 입자의 표면에 공중합된 강카티온성기를 갖는 친수성 중합체의 층으로 이루어지는 피복 중합체 입자의 표면에, 약카티온성기가 도입된 것이 바람직하다.
상기 강카티온성기를 갖는 친수성 중합체는 강카티온성기를 갖는 친수성 단량체로 구성되는 것이고, 1 종 이상의 강카티온성기를 갖는 친수성 단량체에서 유래하는 세그먼트를 함유하면 된다. 즉, 상기 강카티온성기를 갖는 친수성 중합체를 제조하는 방법으로는, 강카티온성기를 갖는 친수성 단량체를 단독으로 중합시키는 방법, 2 종 이상의 강카티온성기를 갖는 친수성 단량체를 공중합시키는 방법, 강카티온성기를 갖는 친수성 단량체와 강카티온성기를 갖지 않는 친수성 단량체를 공중합시키는 방법 등을 들 수 있다.
상기 강카티온성기를 갖는 친수성 단량체로는, 4 급 암모늄기를 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로는 예를 들어, 메타크릴산에틸트리메틸암모늄클로라이드, 메타크릴산에틸트리에틸암모늄클로라이드, 메타크릴산에틸디메틸에틸암모늄클로라이드, 메타크릴산에틸디메틸벤질암모늄클로라이드, 아크릴산에틸디메틸벤질암모늄클로라이드, 아크릴산에틸트리메틸암모늄클로라이드, 아크릴산에틸트리에틸암모늄클로라이드, 아크릴산에틸디메틸에틸암모늄클로라이드, 아크릴아미드에틸트리메틸암모늄클로라이드, 아크릴아미드에틸트리에틸암모늄클로라이드, 아크릴아미드에틸디메틸에틸암모늄클로라이드 등을 들 수 있다.
상기 피복 중합체 입자의 표면에 상기 약카티온성기를 도입하는 방법으로는, 공지된 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로는 예를 들어, 상기 약카티온성기로서 3 급 아미노기를 도입하는 방법으로는, 글리시딜기를 갖는 단량체에서 유래하는 세그먼트를 갖는 소수성 가교 중합체로 이루어지는 소수성 가교 중합체 입자의 표면에 있어서 상기 강카티온성기를 갖는 친수성 단량체를 공중합하고, 이어서 글리시딜기에 3 급 아미노기를 갖는 시약을 반응시키는 방법, 이소시아네이트기를 갖는 단량체에서 유래하는 세그먼트를 갖는 소수성 가교 중합체로 이루어지는 소수성 가교 중합체 입자의 표면에 있어서 상기 강카티온성기를 갖는 친수성 단량체를 공중합하고, 이어서 이소시아네이트기에 3 급 아미노기를 갖는 시약을 반응시키는 방법, 상기 소수성 가교 중합체 입자의 표면에 있어서 상기 강카티온성기를 갖는 친수성 단량체와 3 급 아미노기를 갖는 단량체를 공중합하는 방법, 3 급 아미노기를 갖는 실란커플링제를 이용하여 상기 강카티온성기를 갖는 친수성 중합체의 층을 갖는 피복 중합체 입자의 표면에 3 급 아미노기를 도입하는 방법, 카르복실기를 갖는 단량체에서 유래하는 세그먼트를 갖는 소수성 가교 중합체로 이루어지는 소수성 가교 중합체 입자의 표면에 있어서 상기 강카티온성기를 갖는 친수성 단량체를 공중합하고, 이어서 카르복실기와 3 급 아미노기를 갖는 시약을, 카르보디이미드를 이용하여 축합시키는 방법, 에스테르 결합을 갖는 단량체에서 유래하는 세그먼트를 갖는 소수성 가교 중합체로 이루어지는 소수성 가교 중합체 입자의 표면에 있어서 상기 강카티온성기를 갖는 친수성 단량체를 공중합하고, 에스테르 결합부를 가수분해한 후, 이어서 가수분해에 의해 생성된 카르복실기와 3 급 아미노기를 갖는 시약을 카르보디이미드를 이용하여 축합시키는 방법 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 글리시딜기를 갖는 단량체에서 유래하는 세그먼트를 갖는 소수성 가교 중합체로 이루어지는 소수성 가교 중합체 입자의 표면에 있어서 상기 강카티온성기를 갖는 친수성 단량체를 공중합하고, 이어서 글리시딜기에 3 급 아미노기를 갖는 시약을 반응시키는 방법이나, 이소시아네이트기를 갖는 단량체에서 유래하는 세그먼트를 갖는 소수성 가교 중합체로 이루어지는 소수성 가교 중합체 입자의 표면에 있어서 상기 강카티온성기를 갖는 친수성 단량체를 공중합하고, 이어서 이소시아네이트기에 3 급 아미노기를 갖는 시약을 반응시키는 방법이 바람직하다.
글리시딜기나 이소시아네이트기 등의 반응성 관능기에 반응시키는 상기 3 급 아미노기를 갖는 시약으로는, 3 급 아미노기와 반응성 관능기에 반응 가능한 관능기를 갖고 있으면, 특별히 한정되지 않는다. 상기 3 급 아미노기와 반응성 관능기에 반응 가능한 관능기로는, 예를 들어 1 급 아미노기, 수산기 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 말단에 1 급 아미노기를 갖고 있는 것이 바람직하다. 구체적인 화합물로는, N,N-디메틸아미노메틸아민, N,N-디메틸아미노에틸아민, N,N-디메틸아미노프로필아민, N,N-디메틸아미노부틸아민, N,N-디에틸아미노에틸아민, N,N-디에틸아미노프로필에틸아민, N,N-디에틸아미노부틸아민, N,N-디에틸아미노펜틸아민, N,N-디에틸아미노헥실아민, N,N-디프로필아미노부틸아민, N,N-디부틸아미노프로필아민 등을 들 수 있다.
상기 강카티온성기, 바람직하게는 4 급 암모늄염과, 상기 약카티온성기, 바람직하게는 3 급 아미노기의 상대적인 위치 관계는, 상기 강카티온성기가 상기 약카티온성기보다 기재 미립자의 표면에서 먼 위치, 즉 외측에 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 약카티온성기는 기재 미립자 표면으로부터 30 Å 이내에 있고, 상기 강카티온성기는 기재 미립자 표면으로부터 300 Å 이내이고, 또한 약카티온성기보다 외측에 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 이온 교환 크로마토그래피용 충전제의 평균 입자직경은 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한은 0.1 ㎛, 바람직한 상한은 20 ㎛ 이다. 상기 평균 입자직경이 0.1 ㎛ 미만이면, 칼럼 내가 지나치게 고압이 되어 분리 불량을 일으키는 경우가 있다. 상기 평균 입자직경이 20 ㎛ 를 초과하면, 칼럼 내의 데드 볼륨이 지나치게 커져 분리 불량을 일으키는 경우가 있다.
또한, 본 명세서에 있어서 상기 평균 입자직경은 체적 평균 입자직경을 나타내고, 입도 분포 측정 장치 (AccuSizer780/Particle Sizing Systems 사 제조) 를 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 사용하는 핵산 사슬의 분리 검출 방법도 또한 본 발명의 하나이다.
본 발명의 핵산 사슬의 분리 검출 방법에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피로 분석할 때의 용리액의 조성으로는, 공지된 조건을 이용할 수 있다.
상기 용리액에 이용하는 완충액으로는, 공지된 염 화합물을 함유하는 완충액류나 유기 용매류를 사용하는 것이 바람직하고, 구체적으로는 예를 들어, 트리스염산 완충액, 트리스와 EDTA 로 이루어지는 TE 완충액, 트리스와 아세트산과 EDTA 로 이루어지는 TAE 완충액, 트리스와 붕산과 EDTA 로 이루어지는 TBA 완충액 등을 들 수 있다.
상기 용리액의 pH 는 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한은 5, 바람직한 상한은 10 이다. 이 범위로 설정함으로써, 상기 약카티온성기도 효과적으로 이온 교환기 (아니온 교환기) 로서 작용한다고 볼 수 있다. 상기 용리액의 pH 의 보다 바람직한 하한은 6, 보다 바람직한 상한은 9 이다.
이온 교환 크로마토그래피에 있어서의 용출에 사용하는 염으로는, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화나트륨, 브롬화칼륨 등의 할로겐화물과 알칼리 금속으로 이루어지는 염이나, 염화칼슘, 브롬화칼슘, 염화마그네슘, 브롬화마그네슘 등의 할로겐화물과 알칼리 토금속으로 이루어지는 염이나, 과염소산나트륨, 과염소산칼륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 황산암모늄, 질산나트륨, 질산칼륨 등의 무기산염 등을 사용할 수 있다. 또, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 숙신산나트륨, 숙신산칼륨 등의 유기산염을 사용할 수도 있다.
상기 용리액의 염 농도로는, 분석 조건에 맞춰 적절히 조정하면 되는데, 바람직한 하한은 10 m㏖/ℓ, 바람직한 상한은 2000 m㏖/ℓ 이고, 보다 바람직한 하한은 100 m㏖/ℓ, 보다 바람직한 상한은 1500 m㏖/ℓ 이다.
본 발명에 의하면, 핵산 사슬 중의 염기 배열의 상이함이나 1 염기 치환의 차이를 충분히 검출할 수 있는 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 제공할 수 있다. 또 본 발명에 의하면, 그 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 사용하는 핵산 사슬의 분리 검출 방법을 제공할 수 있다.
도 1 은 실시예 1 에서 제조한 충전제를 충전한 아니온 교환 칼럼을 이용하여, 배열이 상이한 올리고뉴클레오티드 (검체 A, B) 를 측정하여 얻어진 그래프이다.
도 2 는 비교예 1 에서 제조한 충전제를 충전한 아니온 교환 칼럼을 이용하여, 배열이 상이한 올리고뉴클레오티드 (검체 A, B) 를 측정하여 얻어진 그래프이다.
도 3 은 실시예 1 에서 제조한 충전제를 충전한 아니온 교환 칼럼을 이용하여, 1 염기가 상이한 올리고뉴클레오티드 (검체 C, D) 를 측정하여 얻어진 그래프이다.
도 4 는 비교예 1 에서 제조한 충전제를 충전한 아니온 교환 칼럼을 이용하여, 1 염기가 상이한 올리고뉴클레오티드 (검체 C, D) 를 측정하여 얻어진 그래프이다.
이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에만 한정되지 않는다.
(실시예 1)
교반기가 부착된 반응기 내의 3 중량％ 폴리비닐알코올 (닛폰 합성 화학사 제조) 수용액 2000 ㎖ 에, 테트라에틸렌글리콜디메타아크릴레이트 (신나카무라 화학 공업사 제조) 200 g, 트리에틸렌글리콜디메타아크릴레이트 (신나카무라 화학 공업사 제조) 100 g, 글리시딜메타크릴레이트 (와코 준야쿠 공업사 제조) 100 g 및 과산화벤조일 (키시다 화학사 제조) 1.0 g 의 혼합물을 첨가하였다. 교반하면서 가열하고, 질소 분위기하에서 80 ℃ 에서 1 시간 중합하였다. 다음으로, 강카티온성기를 갖는 친수성 단량체로서, 메타크릴산에틸트리메틸암모늄클로라이드 (와코 준야쿠 공업사 제조) 100 g 을 이온 교환수에 용해하였다. 이것을 동일한 반응기에 첨가하고, 동일하게 하여, 교반하면서 질소 분위기하에서 80 ℃ 에서 2 시간 중합하였다. 얻어진 중합 조성물을 물 및 아세톤으로 세정함으로써, 4 급 암모늄기를 갖는 친수성 중합체의 층을 표면에 갖는 피복 중합체 입자를 얻었다.
얻어진 피복 중합체 입자에 대하여, 입도 분포 측정 장치 (AccuSizer780/ Particle Sizing Systems 사 제조) 를 이용하여 측정한 결과, 평균 입자직경은 10 ㎛ 였다.
얻어진 피복 중합체 입자 10 g 을 이온 교환수 100 ㎖ 에 분산시켜, 반응전 슬러리를 준비하였다. 이어서, 이 슬러리를 교반하면서, N,N-디메틸아미노프로필아민 (와코 준야쿠 공업사 제조) 을 10 ㎖ 첨가하고, 70 ℃ 에서 4 시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 원심 분리기 (히타치 제작소사 제조, 「Himac CR20G」) 를 이용하여 상청액을 제거하고, 이온 교환수로 세정하였다. 세정 후, 원심 분리기를 이용하여 상청액을 제거하였다. 이 이온 교환수에 의한 세정을 추가로 4 회 반복하고, 기재 미립자의 표면에 4 급 암모늄기와 3 급 아미노기를 갖는 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
(비교예 1)
교반기가 부착된 반응기 내의 3 중량％ 폴리비닐알코올 (닛폰 합성 화학사 제조) 수용액 2000 ㎖ 에, 테트라에틸렌글리콜디메타아크릴레이트 (신나카무라 화학 공업사 제조) 300 g, 트리에틸렌글리콜디메타아크릴레이트 (신나카무라 화학 공업사 제조) 100 g 및 과산화벤조일 (키시다 화학사 제조) 1.0 g 의 혼합물을 첨가하였다. 교반하면서 가열하고, 질소 분위기하에서 80 ℃ 에서 1 시간 중합하였다. 다음으로, 강카티온성기를 갖는 친수성 단량체로서 메타크릴산에틸트리메틸암모늄클로라이드 (와코 준야쿠 공업사 제조) 100 g 을 이온 교환수에 용해하였다. 이것을 동일한 반응기에 첨가하고, 동일하게 하여, 교반하면서 질소 분위기하에서 80 ℃ 에서 2 시간 중합하였다. 얻어진 중합 조성물을 물 및 아세톤으로 세정함으로써, 4 급 암모늄기를 갖는 친수성 중합체의 층을 표면에 갖는 피복 중합체 입자를 얻었다.
얻어진 피복 중합체 입자에 대하여, 실시예 1 과 동일하게 하여 입도 분포 측정 장치 (AccuSizer780/Particle Sizing Systems 사 제조) 를 이용하여 측정한 결과, 평균 입자직경은 10 ㎛ 였다.
＜평가＞
실시예 및 비교예에서 제조한 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 액체 크로마토그래피 시스템의 스테인리스제 칼럼 (칼럼 사이즈：내경 4.6 ㎜ × 길이 20 ㎜) 에 충전하였다.
＜분리 성능의 확인＞
실시예 및 비교예에서 제조한 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 충전한 아니온 교환 칼럼을 이용하여, 표 1 에 나타낸 조건으로 하기의 검체 A ∼ D 를 측정하여, 분리 성능의 비교를 실시하였다.
Figure pat00001
(1) 배열이 상이한 올리고뉴클레오티드의 분리
검체：올리고뉴클레오티드 20 mer (오페론 바이오 테크놀로지사 제조)
검체 A … 5＇-AACTTGAGTTCGGCGATCAC-3＇
검체 B … 5＇-CCAGCATCGATCATATTGGG-3＇
또한, 상기 검체 A, B 는 배열만 상이하고, 함유되는 염기의 수는 A5, T5, G5, C5 이다. 염기 배열은 난수를 이용하여 임의로 결정하였다.
(2) 1 염기가 치환된 올리고뉴클레오티드의 분리
검체：올리고뉴클레오티드 20 mer (오페론 바이오 테크놀로지사 제조)
검체 C … 5＇-CCAGCATCGATCATATTGGG-3＇
검체 D … 5＇-CCAGCATCGATCATATTGCG-3＇
실시예 1, 비교예 1 에서 제조한 충전제를 충전한 아니온 교환 칼럼을 이용하여, 배열이 상이한 올리고뉴클레오티드 (검체 A, B) 를 측정하여 얻어진 그래프를 각각 도 1, 2 에 나타내었다.
도 1, 2 의 비교로부터, 기재 미립자의 표면에 강카티온성기와 약카티온성기가 공존하는 실시예 1 의 충전제를 충전한 칼럼에서는, 배열이 상이한 올리고뉴클레오티드를 양호하게 분리할 수 있는 것을 알 수 있었다. 한편으로, 비교예 1 의 충전제를 충전한 칼럼에서는, 분리는 불충분하였다.
실시예 1, 비교예 1 에서 제조한 충전제를 충전한 아니온 교환 칼럼을 이용하여 1 염기가 상이한 올리고뉴클레오티드 (검체 C, D) 를 측정하여 얻어진 그래프를 각각 도 3, 4 에 나타내었다.
도 3, 4 의 비교로부터, 기재 미립자의 표면에 강카티온성기와 약카티온성기가 공존하는 실시예 1 의 충전제를 충전한 칼럼에서는, 1 염기가 치환된 올리고뉴클레오티드를 양호하게 분리할 수 있는 것을 알 수 있었다.
한편으로, 비교예 1 의 충전제를 충전한 칼럼에서는 분리는 불충분하였다.
산업상 이용가능성
본 발명에 의하면, 핵산 사슬 중의 염기 배열의 상이함이나 1 염기 치환의 차이를 충분히 검출할 수 있는 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 제공할 수 있다. 또 본 발명에 의하면, 그 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 사용하는 핵산 사슬의 분리 검출 방법을 제공할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> SEKISUI MEDICAL CO., LTD. <120> ENGLISH TITLE <130> S-1341 <150> JP 2011-027493 <151> 2011-02-10 <160> 4 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 aacttgagttcggcgatcac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 ccagcatcgatcatattggg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 ccagcatcgatcatattggg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 ccagcatcgatcatattgcg 20

Claims (9)

  1. 기재 미립자의 표면에 강카티온성기와 약카티온성기를 갖는 핵산 사슬의 분리 검출용 이온 교환 크로마토그래피용 충전제로서,
    상기 기재 미립자는, 단량체 1 분자 중에 비닐기를 2 개 이상 갖는 적어도 1 종의 소수성 가교 단량체와 적어도 1 종의 반응성 관능기를 갖는 단량체를 공중합하여 얻어지는 합성 유기 고분자로 이루어지는 소수성 가교 중합체 입자,
    또는
    단량체 1 분자 중에 비닐기를 2 개 이상 갖는 적어도 1 종의 소수성 가교 단량체와 적어도 1 종의 반응성 관능기를 갖는 단량체와 적어도 1 종의 소수성 비가교성 단량체를 공중합하여 얻어지는 합성 유기 고분자로 이루어지는 소수성 가교 중합체 입자이고,
    상기 강카티온성기는 4 급 암모늄기이고, 상기 약카티온성기는 3 급 아미노기인 것을 특징으로 하는 핵산 사슬의 분리 검출용 이온 교환 크로마토그래피용 충전제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    단량체 1 분자 중에 비닐기를 2 개 이상 갖는 적어도 1 종의 소수성 가교 단량체는 디(메트)아크릴산에스테르 또는 방향족계 화합물인 것을 특징으로 하는 핵산 사슬의 분리 검출용 이온 교환 크로마토그래피용 충전제.
  3. 제 1 항에 있어서,
    적어도 1 종의 반응성 관능기를 갖는 단량체는 글리시딜(메트)아크릴레이트 또는 이소시아네이트에틸(메트)아크릴레이트인 것을 특징으로 하는, 핵산 사슬의 분리 검출용 이온 교환 크로마토그래피용 충전제.
  4. 제 1 항에 있어서,
    적어도 1 종의 소수성 비가교성 단량체는 (메트)아크릴산에스테르 또는 스티렌계 단량체인 것을 특징으로 하는 핵산 사슬의 분리 검출용 이온 교환 크로마토그래피용 충전제.
  5. 제 1 항에 있어서,
    강카티온성기는 4 급 암모늄기인 것을 특징으로 하는 핵산 사슬의 분리 검출용 이온 교환 크로마토그래피용 충전제.
  6. 제 1 항에 있어서,
    약카티온성기는 3 급 아미노기인 것을 특징으로 하는 핵산 사슬의 분리 검출용 이온 교환 크로마토그래피용 충전제.
  7. 제 1 항에 있어서,
    기재 미립자의 표면에 강카티온성기와 약카티온성기를 갖는 중합체층을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 사슬의 분리 검출용 이온 교환 크로마토그래피용 충전제.
  8. 제 7 항에 있어서,
    강카티온성기와 약카티온성기는 각각 독립된 단량체에서 유래하는 것인 것을 특징으로 하는 핵산 사슬의 분리 검출용 이온 교환 크로마토그래피용 충전제.
  9. 제 1 항에 기재된 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 이용하는 것을 특징으로 하는 핵산 사슬의 분리 검출 방법.
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