CN111050903B - 甲基化dna分离和/或检测用色谱用填充剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种能够高精度地检测甲基化DNA的色谱用填充剂。一种甲基化DNA分离和/或检测用离子交换色谱用填充剂,含有在表面具有阳离子性官能团的疏水性交联共聚物粒子构成的基材粒子,该疏水性交联共聚物包含二乙烯基芳香族单体。
Description
技术领域
本发明涉及用于甲基化DNA的分离和/或检测的色谱用填充剂。
背景技术
DNA甲基化是最常见的与癌变相关的表观遗传变化之一。作为癌细胞中的特征性表观遗传异常,已知有CpG岛的异常DNA甲基化。CpG岛是介由磷酸二酯键(p)连接的胞嘧啶(C)-鸟嘌呤(G)的2碱基序列高频出现的区域,大多存在于基因上游的启动子区域。CpG岛的异常DNA甲基化通过抑癌基因的失活等而参与癌变。
作为甲基化DNA的解析方法,已经确立了利用亚硫酸氢盐(bisulfite)法的方法。将单链DNA用亚硫酸氢盐处理时,胞嘧啶转化为尿嘧啶,但甲基化的胞嘧啶仍然为胞嘧啶。因此,对经亚硫酸氢盐处理后的DNA进行PCR时,甲基化胞嘧啶直接扩增为胞嘧啶,但非甲基化胞嘧啶由尿嘧啶置换为胸腺嘧啶而被扩增,因此由于DNA的甲基化而使PCR扩增产物的序列产生差异。以往的甲基化DNA的解析方法中,一般利用电泳、测序来检测该PCR扩增产物的序列的差异。然而,这些方法的缺点是电泳、测序耗费工夫和时间。
在生物化学、医学等领域中,作为能够简便且高精度地分离和检测核酸、蛋白质、多糖类等生物体高分子的方法,广泛使用离子交换色谱。对核酸进行离子交换色谱分离时,一般使用利用核酸分子中的磷酸的负电荷来分离核酸的阴离子交换色谱。作为在阴离子交换色谱的柱填充剂中使用的阳离子性官能团,有二乙氨基乙基等弱阳离子性基团、季铵基等强阳离子性基团。此外,专利文献1中公开了能够通过使用具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两者作为官能团的柱填充剂的离子交换色谱来检测20mer的寡核苷间的一个碱基的差异。
专利文献2中公开了如下方法:通过将样品DNA用亚硫酸氢盐处理后进行PCR扩增,对扩增产物进行使用具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两者作为官能团的柱填充剂的离子交换色谱,从而检测样品DNA的甲基化。这是与以往的使用电泳、测序的方法相比能够实现简便且短时间内的甲基化DNA的解析的优异的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开公报第2012/108516号
专利文献2:国际公开公报第2014/136930号
发明内容
使用专利文献2这样的离子交换色谱的甲基化DNA的检测方法中,为了提高检测精度,要求使色谱法中的甲基化DNA的峰与非甲基化DNA的峰的分离度更大。本发明提供一种能够高精度地分离和/或检测甲基化DNA的色谱用填充剂。
本发明提供以下方案。
〔1〕一种甲基化DNA分离和/或检测用离子交换色谱用填充剂,含有在表面具有阳离子性官能团的疏水性交联共聚物粒子构成的基材粒子,该疏水性交联共聚物包含二乙烯基芳香族单体。
〔2〕根据〔1〕所述的离子交换色谱用填充剂,其中,上述二乙烯基芳香族单体选自二乙烯基苯、二乙烯基萘、二乙烯基蒽、二乙烯基甲苯、二乙烯基二甲苯和二乙烯基联苯。
〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的离子交换色谱用填充剂,其中,上述疏水性交联共聚物在总质量中含有3~15质量%的上述二乙烯基芳香族单体。
〔4〕根据〔1〕~〔3〕中任一项所述的离子交换色谱用填充剂,其中,上述疏水性交联共聚物包含上述二乙烯基芳香族单体、具有2个以上乙烯基的非芳香族疏水性交联性单体和具有反应性官能团的单体。
〔5〕根据〔4〕所述的离子交换色谱用填充剂,其中,上述反应性官能团为缩水甘油基或异氰酸酯基。
〔6〕根据〔4〕或〔5〕所述的离子交换色谱用填充剂,其中,上述具有2个以上乙烯基的非芳香族疏水性交联性单体为选自二乙二醇二甲基丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基甲烷三甲基丙烯酸酯、四羟甲基甲烷三甲基丙烯酸酯、二乙二醇二丙烯酸酯、三乙二醇二丙烯酸酯、四乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基甲烷三丙烯酸酯和四羟甲基甲烷三丙烯酸酯中的至少1种。
〔7〕根据〔1〕~〔6〕中任一项所述的离子交换色谱用填充剂,其中,上述疏水性交联共聚物在总质量中含有3~15质量%的上述二乙烯基芳香族单体、40~70质量%的上述非芳香族疏水性交联性单体和10~50质量%的上述具有反应性官能团的单体。
〔8〕根据〔1〕~〔7〕中任一项所述的离子交换色谱用填充剂,其中,上述疏水性交联共聚物在总质量中还包含0~5质量%的疏水性非交联性单体。
〔9〕根据〔1〕~〔8〕中任一项所述的离子交换色谱用填充剂,其中,上述阳离子性官能团为强阳离子性基团和弱阳离子性基团。
〔10〕根据〔9〕所述的离子交换色谱用填充剂,其中,上述强阳离子性基团为季铵基,上述弱阳离子性基团为叔氨基。
〔11〕根据〔9〕或〔10〕所述的离子交换色谱用填充剂,其中,上述基材粒子在表面具有聚合物层,该聚合物层具有上述强阳离子性基团和上述弱阳离子性基团。
〔12〕一种甲基化DNA分离和/或检测用离子交换色谱用柱,含有〔1〕~〔11〕中任一项所述的离子交换色谱用填充剂。
〔13〕一种甲基化DNA的分离和/或检测方法,使用〔1〕~〔11〕中任一项所述的离子交换色谱用填充剂。
本发明的离子交换色谱用填充剂实现了阴离子交换色谱中的甲基化DNA的峰与非甲基化DNA的峰的分离度的增大,提高了甲基化DNA的检测精度。
附图说明
图1是通过使用实施例1和比较例1~2的基材粒子的离子交换色谱分析而得到的样品DNA的色谱图。
具体实施方式
本发明提供一种用于甲基化DNA的分离和/或检测的离子交换色谱用填充剂。该本发明的填充剂含有表面具有阳离子性官能团的基材粒子,可优选用于阴离子交换色谱。
本发明的填充剂中含有的基材粒子含有由合成有机高分子构成的疏水性交联聚合物,更详细而言,含有包含二乙烯基芳香族单体(A)的疏水性交联共聚物。优选本发明的填充剂中含有的基材粒子由在表面具有阳离子性官能团的该疏水性交联共聚物构成。
该疏水性交联共聚物除了该二乙烯基芳香族单体(A)以外,还包含非芳香族疏水性交联性单体(B)和具有反应性官能团的单体(C)。此外,还可以含有疏水性非交联性单体(D)。因此,该疏水性交联共聚物可以为将该(A)和(B)和(C)共聚而得到的疏水性交联共聚物,或者也可以为将该(A)和(B)和(C)和(D)共聚而得到的疏水性交联共聚物。
作为该二乙烯基芳香族单体(A)的例子,可举出二乙烯基苯、二乙烯基萘、二乙烯基蒽、二乙烯基甲苯、二乙烯基二甲苯、二乙烯基联苯等。上述例示的二乙烯基芳香族(A)可以单独使用任意1种,也可以组合任意2种以上使用。优选二乙烯基芳香族(A)为二乙烯基苯。
作为该非芳香族疏水性交联性单体(B),只要是1分子单体中具有2个以上乙烯基的非芳香族化合物,就没有特别限定,例如,可举出二乙二醇二甲基丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基甲烷三甲基丙烯酸酯、四羟甲基甲烷三甲基丙烯酸酯、二乙二醇二丙烯酸酯、三乙二醇二丙烯酸酯、四乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基甲烷三丙烯酸酯、四羟甲基甲烷三丙烯酸酯等。上述例示的单体(B)可以单独使用任意1种,也可以组合任意2种以上使用。作为更优选的例子,可举出选自三乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基甲烷三丙烯酸酯中的至少1种。
作为该具有反应性官能团的单体(C)中的反应性官能团,优选缩水甘油基或异氰酸酯基,更优选缩水甘油基。作为该单体(C)的例子,可举出甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸异氰基乙酯、丙烯酸异氰基乙酯等,优选为甲基丙烯酸缩水甘油酯。上述例示的单体(C)可以单独使用任意1种,也可以组合任意2种以上使用。
作为该疏水性非交联性单体(D),只要是具有疏水性的性质的非交联性的聚合性有机单体,就没有特别限定,例如,可举出甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、丙烯酸叔丁酯等甲基丙烯酸酯和丙烯酸酯、苯乙烯、甲基苯乙烯等苯乙烯系单体、以及它们的组合。
作为构成该疏水性交联共聚物的单体(A)~(D)的优选的组合的例子,可举出(A)二乙烯基苯、(B)选自三乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基甲烷三丙烯酸酯和季戊四醇三丙烯酸酯中的至少1种、(C)甲基丙烯酸缩水甘油酯或甲基丙烯酸异氰基乙酯、以及(D)无或苯乙烯。作为更优选的组合的例子,可举出(A)二乙烯基苯、(B)三乙二醇二甲基丙烯酸酯和三羟甲基甲烷三丙烯酸酯、(C)甲基丙烯酸缩水甘油酯或甲基丙烯酸异氰基乙酯、以及(D)无或苯乙烯。进一步优选的组合为(A)二乙烯基苯、(B)三乙二醇二甲基丙烯酸酯和三羟甲基甲烷三丙烯酸酯、以及(C)甲基丙烯酸缩水甘油酯。
该疏水性交联共聚物中的该二乙烯基芳香族单体(A)的含量在其总质量中,优选为3~15质量%,更优选为5~12质量%,进一步优选为6~11质量%。该疏水性交联共聚物中的该非芳香族疏水性交联性单体(B)的含量在其总质量中,优选为40~70质量%,更优选为55~65质量%。该疏水性交联共聚物中的该具有反应性官能团的单体(C)的含量在其总质量中,优选为10~50质量%,更优选为20~35质量%。该疏水性交联共聚物中的该疏水性非交联性单体(D)的含量在其总质量中,优选为0~5质量%。另外,该疏水性交联共聚物中的该单体(A)~(D)的比率(质量比)优选为(A):(B):(C):(D)=5~12:55~65:20~35:0~5(其中,(A)+(B)+(C)+(D)=100)。
由该单体(A)~(C)制造疏水性交联共聚物的步骤的优选的例子如下:向带有搅拌机的反应器中的5重量%聚乙烯醇水溶液中添加规定比率的该单体(A)、(B)和(C)、以及作为引发剂的过氧化苯甲酰。将得到的混合物一边搅拌一边在氮气氛下以80℃加热1小时,使(A)~(C)聚合。使该单体(A)~(D)聚合时,可以在包含该(A)~(C)的混合物中进一步以规定的比率添加该单体(D),与上述同样地加热搅拌而使该(A)~(D)聚合。
本发明的填充剂中,存在于基材粒子的表面的该阳离子性官能团的种类没有特别限定,优选含有强阳离子性基团,更优选为强阳离子性基团和弱阳离子性基团双方。
本说明书中,强阳离子性基团是指在pH为1~14的宽广范围内进行解离的阳离子性基团。即,该强阳离子性基团能够不受水溶液的pH影响地保持解离的(阳离子化的)状态。
作为该强阳离子性基团,可举出季铵基。具体而言,例如,可举出三甲基铵基、三乙基铵基、二甲基乙基铵基等三烷基铵基等。另外,作为该强阳离子性基团的抗衡离子,例如,可举出氯离子、溴离子、碘离子等卤素离子。
存在于该基材粒子的表面的该强阳离子性基团的量没有特别限定,该填充剂的每单位干燥重量的优选的下限为1μeq/g,优选的上限为500μeq/g。该强阳离子性基团的量小于1μeq/g时,DNA的保持力弱,存在分离性能变差的情况。该强阳离子性基团的量超过500μeq/g时,保持力变得过强,不能使DNA容易地溶出,有时产生分析时间过长等问题。
本说明书中,弱阳离子性基团是指pka为8以上的阳离子性基团。即,该弱阳离子性基团受到水溶液的pH的影响,解离状态发生变化。即,pH高于8时,该弱阳离子性基团的质子解离,不带正电荷的比例增加。相反,pH低于8时,该弱阳离子性基团质子化,带正电荷的比例增加。
作为该弱阳离子性基团,例如,可举出叔氨基、仲氨基、伯氨基等。其中,优选为叔氨基。
存在于该基材粒子的表面的该弱阳离子性基团的量没有特别限定,该填充剂的每单位干燥重量的优选的下限为0.5μeq/g,优选的上限为500μeq/g。该弱阳离子性基团的量小于0.5μeq/g时,存在DNA的分离性能不提高的情况。该弱阳离子性基团的量超过500μeq/g时,与强阳离子性基团同样,保持力变得过强而不能使DNA容易地溶出,有时产生分析时间过长等问题。
该基材粒子的表面的强阳离子性基团或弱阳离子性基团的量可以通过对基团中含有的氮原子进行定量来测定。作为对氮原子进行定量的方法,例如可举出凯氏定氮法。例如,为含有强阳离子性基团和弱阳离子性基团的基材粒子时,首先,在疏水性交联共聚物粒子与强阳离子性基团聚合后对强阳离子性基团中含有的氮进行定量。接着,向该聚合物中导入弱阳离子性基团,对强阳离子性基团和弱阳离子性基团中含有的氮的合计量进行定量。可以由所求出的值来算出弱阳离子性基团中含有的氮量。如此,基于基团的氮原子的定量值,可以将填充剂中含有的强阳离子性基团和弱阳离子性基团的量调整到上述范围内。
本发明中使用的离子交换色谱用填充剂的基材粒子优选在其表面具有聚合物层,该聚合物层具有该强阳离子性基团和该弱阳离子性基团。另外,在具有该强阳离子性基团和该弱阳离子性基团的聚合物层中,优选该强阳离子性基团和该弱阳离子性基团分别来自独立的单体。优选本发明中使用的离子交换色谱用填充剂的基材粒子是向被覆聚合物粒子的表面导入该弱阳离子性基团而得的,所述被覆聚合物粒子是由该疏水性交联聚合物粒子和具有与该疏水性交联聚合物粒子的表面共聚的该强阳离子性基团的亲水性聚合物的层构成的。
具有该强阳离子性基团的亲水性聚合物由具有该强阳离子性基团的亲水性单体构成,只要含有来自1种以上的具有该强阳离子性基团的亲水性单体的片段即可。即,作为制造具有该强阳离子性基团的亲水性聚合物的方法,可举出使具有该强阳离子性基团的亲水性单体单独聚合的方法、使2种以上的具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚的方法、使具有该强阳离子性基团的亲水性单体与不具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚的方法等。
作为具有该强阳离子性基团的亲水性单体,优选具有季铵基。具体而言,例如,可举出甲基丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰氧基乙基三乙基氯化铵、甲基丙烯酰氧基乙基二甲基乙基氯化铵、甲基丙烯酰氧基乙基二甲基苄基氯化铵、丙烯酰氧基乙基二甲基苄基氯化铵、丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵、丙烯酰氧基乙基三乙基氯化铵、丙烯酰氧基乙基二甲基乙基氯化铵、丙烯酰胺乙基三甲基氯化铵、丙烯酰胺乙基三乙基氯化铵、丙烯酰胺乙基二甲基乙基氯化铵等。
作为使该疏水性交联聚合物的表面形成具有该强阳离子性基团的亲水性聚合物的层的方法,可举出使具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚到该疏水性交联聚合物的表面的方法。
作为向该被覆聚合物粒子的表面导入弱阳离子性基团的方法,可以使用公知的方法。具体而言,例如,作为导入叔氨基作为该弱阳离子性基团的方法,可举出:在含有来自于具有缩水甘油基的单体的片段的疏水性交联聚合物粒子的表面将具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚,接着使具有叔氨基的试剂与该缩水甘油基反应的方法;在含有来自于具有异氰酸酯基的单体的片段的疏水性交联聚合物粒子的表面将具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚,接着使具有叔氨基的试剂与该异氰酸酯基反应的方法;在该疏水性交联聚合物粒子的表面将具有该强阳离子性基团的亲水性单体和具有叔氨基的单体共聚的方法;使用具有叔氨基的硅烷偶联剂向具有含有该强阳离子性基团的亲水性聚合物的层的疏水性交联聚合物粒子的表面导入叔氨基的方法;在具有来自于含有羧基的单体的片段的疏水性交联聚合物粒子的表面将具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚,接着使用碳二亚胺使该羧基和具有叔氨基的试剂缩合的方法;在具有来自于含有酯键的单体的片段的疏水性交联聚合物粒子的表面将具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚,将该酯键部水解,接着使用碳二亚胺使由该水解而生成的羧基和具有叔氨基的试剂缩合的方法等。其中,优选在具有来自于含有缩水甘油基的单体的片段的疏水性交联聚合物粒子的表面将具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚,接着使具有叔氨基的试剂与该缩水甘油基反应的方法;或者在具有来自于含有异氰酸酯基的单体的片段的疏水性交联聚合物粒子的表面将具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚,接着使具有叔氨基的试剂与该异氰酸酯基反应的方法。
作为与缩水甘油基、异氰酸酯基等反应性官能团反应的具有叔氨基的试剂,只要是具有叔氨基和可与该反应性官能团反应的官能团的试剂,就没有特别限定。作为可与该反应性官能团反应的官能团,例如,可举出伯氨基、羟基等。其中,优选在末端具有伯氨基的基团。作为具有该官能团的具体的具有叔氨基的试剂,可举出N,N-二甲基氨基甲基胺、N,N-二甲基氨基乙基胺、N,N-二甲基氨基丙基胺、N,N-二甲基氨基丁基胺、N,N-二乙基氨基乙基胺、N,N-二乙基氨基丙基胺、N,N-二乙基氨基丁基胺、N,N-二乙基氨基戊基胺、N,N-二乙基氨基己基胺、N,N-二丙基氨基丁基胺、N,N-二丁基氨基丙基胺等。
该基材粒子中,该强阳离子性基团、优选季铵盐与该弱阳离子性基团、优选叔氨基的相对位置关系优选该强阳离子性基团位于与该弱阳离子性基团相比远离疏水性交联聚合物粒子的表面的位置、即、外侧。例如,优选该弱阳离子性基团在距疏水性交联聚合物粒子表面以内,该强阳离子性基团在距疏水性交联聚合物粒子表面以内,且与弱阳离子性基团相比位于外侧。
本发明所使用的离子交换色谱用填充剂中使用的该基材粒子的平均粒径没有特别限定,优选的下限为0.1μm,优选的上限为20μm。该平均粒径小于0.1μm时,柱内变为过于高压,有时引起分离不良。该平均粒径超过20μm时,柱内的死体积变得过大,有时引起分离不良。应予说明,本说明书中,平均粒径是指体积平均粒径,可以使用粒度分布测定装置(AccuSizer780/Particle Sizing Systems公司制等)进行测定。
本发明的离子交换色谱用填充剂优选作为甲基化DNA分离和/或检测用的离子交换色谱用柱的填充剂使用。在使用了本发明的离子交换色谱用填充剂的甲基化DNA的分离和/或检测中,作为对象的样品DNA可以是来自生物的DNA,也可以是化学合成DNA。来自生物的DNA可以由从生物采取的检体(例如,组织细胞、血细胞、或尿、粪便、唾液、其它体液或分泌液中存在的细胞)、培养细胞株等进行提取、分离或纯化。来自检体的样品DNA的提取、分离或纯化可以使用市售的DNA提取试剂盒等公知的方法。
样品DNA在供于使用本发明的填充剂的色谱之前,用亚硫酸氢盐处理,进而进行扩增。DNA的亚硫酸氢盐处理的步骤是公知的,也可以使用市售的试剂盒。DNA的扩增可以使用PCR等任意的核酸扩增方法。扩增反应的条件也没有特别限制,可以根据扩增对象的DNA的序列、长度、量等而适当地选择使用公知的方法。
对DNA进行亚硫酸氢盐处理时,该DNA中的非甲基化胞嘧啶被转化为尿嘧啶,但甲基化胞嘧啶仍然为胞嘧啶。将该亚硫酸氢盐处理后的DNA用PCR等扩增时,来自非甲基化胞嘧啶的尿嘧啶进一步被置换为胸腺嘧啶。结果,在甲基化DNA和非甲基化DNA之间,扩增产物中的胞嘧啶与胸腺嘧啶的存在比率产生差异。在使用了本发明的填充剂的离子交换色谱中,利用该碱基的存在比率的差异,对甲基化DNA和非甲基化DNA进行分离和/或检测。
在使用本发明的填充剂的甲基化DNA的分离和/或检测中,试样对色谱柱的注入量没有特别限定,可以根据柱的离子交换容量和试样浓度而适当地调整。试样对该色谱柱的注入量的下限优选为0.1μL,更优选为0.5μL,进一步优选为1μL。试样对该色谱柱的注入量的上限优选为50μL,更优选为25μL,进一步优选为10μL。例如,该色谱柱的内径为2.1mm~4.6mm时,试样对该柱的注入量更优选为0.1μL~50μL,更优选为0.5μL~25μL,进一步优选为1μL~10μL。流速优选为0.1mL/min~3.0mL/min,更优选为0.5mL/min~1.5mL/min。流速变慢时能够期待分离的提高,但变得过慢时分析需要较长时间,或者有可能因峰变宽而导致分离性能降低。相反,流速变快时在分析时间缩短的方面具有优点,但由于峰被压缩而导致分离性能降低。因此,流速是可根据柱的性能而适当地调整的参数,但优选设定在上述的流速的范围。色谱中的各样品的保留时间可以通过对各样品进行预实验而预先确定。送液方法可以使用线性梯度洗脱法、分级洗脱法等公知的送液方法,作为本发明中的送液方法,优选线性梯度洗脱法。梯度(gradient)的大小可以将用于洗脱的洗脱液在0%~100%的范围配合柱的分离性能和分析对象物(DNA)的特性而适当地调整。
作为使用本发明的填充剂的离子交换色谱中使用的洗脱液的组成,可以使用公知的条件。
作为该洗脱液中使用的缓冲液,优选使用含有公知的盐化合物的缓冲液类、有机溶剂类。具体而言,例如,可举出Tris盐酸缓冲液、由Tris和EDTA构成的TE缓冲液、由Tris和硼酸和EDTA构成的TBA缓冲液等。
该洗脱液的pH没有特别限定,优选的下限为5,优选的上限为10。认为通过设定在该范围,从而该弱阳离子性基团也有效地作为离子交换基团(阴离子交换基团)发挥作用。该洗脱液的pH的更优选的下限为6,更优选的上限为9。
作为该洗脱液中含有的盐,例如,可以使用氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾等由卤化物和碱金属构成的盐;氯化钙、溴化钙、氯化镁、溴化镁等由卤化物和碱土金属构成的盐;高氯酸钠、高氯酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾等无机酸盐等。另外,也可以使用乙酸钠、乙酸钾、琥珀酸钠、琥珀酸钾等有机酸盐。该盐可以任一种单独使用或组合使用。
作为该洗脱液的盐浓度,可以根据分析条件而适当地调整,优选的下限为10mmol/L,优选的上限为2000mmol/L,更优选的下限为100mmol/L,更优选的上限为1500mmol/L。
此外,该洗脱液为了进一步提高分离性能而含有反离液离子。反离液离子具有与离液离子相反的性质,具有使水合结构稳定化的作用。因此,具有增强填充剂与核酸分子之间的疏水性相互作用的效果。本发明中使用的离子交换色谱的主要相互作用是静电相互作用,此外,还利用疏水性相互作用的作用,由此使分离性能提高。
作为该洗脱液中含有的反离液离子,可举出磷酸根离子(PO4 3-)、硫酸根离子(SO4 2-)、铵离子(NH4 +)、钾离子(K+)、钠离子(Na+)等。这些离子的组合中,优选使用硫酸根离子和铵离子。该反离液离子可以任一种单独使用或组合使用。应予说明,该反离液离子的一部分可以包含上述洗脱液中含有的盐、缓冲液的成分。这样的成分由于具备作为洗脱液中含有的盐的性质或缓冲能力和作为反离液离子的性质这两者,因此在本发明中是适宜的。
该洗脱液中含有的反离液离子的浓度可以根据分析对象物而适当地调整,作为反离液盐,优选为2000mmol/L以下。具体而言,可以举出使反离液盐的浓度在0~2000mmol/L的范围进行梯度洗脱的方法。因此,色谱分析开始时的反离液盐的浓度无需为0mmol/L,另外,分析结束时的反离液盐的浓度也无需为2000mmol/L。该梯度洗脱的方法可以为低压梯度法,也可以为高压梯度法,优选基于高压梯度法的边进行精密的浓度调整边进行洗脱的方法。
该反离液离子可以仅添加于洗脱所使用的洗脱液中的1种,也可以添加于多种洗脱液。另外,该反离液离子可以具备增强填充剂与DNA之间的疏水性相互作用的效果或缓冲能力和使DNA从柱中洗脱的效果这两种作用。
在使用本发明的填充剂的离子交换色谱中,分析DNA时的柱温优选为30℃以上,更优选为40℃以上,进一步优选为45℃以上,还优选为60℃以上。该柱温小于30℃时,填充剂与DNA之间的疏水性相互作用变弱,难以得到所期望的分离性能。另一方面,该柱温变得更高时,甲基化DNA和非甲基化DNA被更清晰地分离。该柱温为60℃以上时,甲基化DNA与非甲基化DNA之间的色谱检测信号的峰的保留时间之差扩大,且各自的峰也更清楚,因此能够精度更好地进行甲基化DNA的检测。
另一方面,离子交换色谱的柱温为90℃以上时,DNA的双链解离,因此在分析上不优选。此外,柱温为100℃以上时,由于有可能发生洗脱液的沸腾,因此分析上不优选。因此,本发明所使用的离子交换色谱中,分析DNA时的柱温可以为30℃以上且小于90℃,优选为40℃以上且小于90℃,更优选为45℃以上且小于90℃,进一步优选为55℃以上且小于90℃,进一步优选为60℃以上且小于90℃,进一步优选为55℃~85℃,还优选为60℃~85℃。
如上所述,亚硫酸氢盐处理后扩增的DNA具有根据甲基化而不同的序列。对该具有不同序列的DNA进行使用本发明的填充剂的离子交换色谱时,得到根据其序列的差异而显示不同信号的色谱图。
更详细而言,使用本发明的填充剂的离子交换色谱分析中,DNA的甲基化率的高低被反映为检测信号的峰的保留时间。例如,该离子交换色谱分析中,100%甲基化DNA和非甲基化DNA可以作为各自独立的峰而进行检测(参照专利文献2)。优选100%甲基化DNA的峰在比非甲基化DNA短的保留时间出现。此外,来自一部分甲基化的样品DNA的峰的保留时间根据其甲基化率而变动。更详细而言,样品DNA的甲基化率越高,其峰越向100%甲基化DNA的峰移动,即,保留时间变得更短。
样品DNA的甲基化可以通过将使用本发明的填充剂的色谱法的检测信号与对照DNA的检测信号进行比较来评价。对照DNA使用与样品DNA序列相同且甲基化率已知(例如,0%或100%)的DNA。例如,可以根据0%甲基化对照(阴性对照)和100%甲基化对照(阳性对照)的保留时间之差来评价样品DNA有无甲基化、甲基化率。或者,也可以根据由来自已知的具有不同甲基化率的多个DNA的数据制作的标准曲线来算出样品DNA的甲基化率。
作为判定有无基于色谱法的检测信号的峰的方法,可举出使用已有的数据处理软件例如LCsolution(岛津制作所)、GRAMS/AI(Thermo Fisher Scientific公司)、Igor Pro(WaveMetrics公司)等的峰检测。检测信号的峰不清晰时,可以基于该检测信号的微分值来检测峰的有无。检测信号的微分值可以用上述的数据处理软件自动进行计算,或者也可以通过表计算软件(例如,Microsoft(注册商标)Excel(注册商标))等进行计算。
实施例
以下,根据实施例对本发明进行详细说明,本发明不限定于以下的实施例。
实验1
制备实施例1和比较例1~2的基材粒子。将基材粒子的组成示于表1。将该基材粒子作为离子交换色谱用填充剂使用而进行HPLC分析。
(1)离子交换色谱用填充剂的制造
(1-1)疏水性交联聚合物粒子的制备
对于实施例1,以下记载疏水性交联聚合物粒子的制备步骤的详细内容。向带有搅拌机的反应器中的5重量%聚乙烯醇(日本合成化学公司制)水溶液1000mL中添加二乙烯基苯(和光纯药工业公司制)20g、三乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)80g、三羟甲基甲烷三丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)30g、甲基丙烯酸缩水甘油酯(和光纯药工业公司制)50g和过氧化苯甲酰(KISHIDA化学公司制)0.8g。将得到的混合物一边搅拌一边在氮气氛下以80℃加热1小时,生成聚合物。应予说明,对于比较例1和2,将单体的组成如表1所示地变更,除此以外,按照同样的步骤来制备疏水性交联性聚合物粒子。
(1-2)强阳离子性基团的导入
作为具有强阳离子性基团的亲水性单体,将甲基丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵(和光纯药工业公司制)100g溶解于离子交换水。将其添加到装入有(1)的疏水性交联性聚合物粒子的反应器中,一边搅拌一边在氮气氛下以80℃加热2小时,使具有强阳离子性基团的单体与该疏水性交联性聚合物粒子聚合。将得到的产物用水和丙酮清洗,由此得到表面具有含有季铵基的亲水性聚合物的层的被覆聚合物粒子。聚合反应中使用的具有强阳离子性基团的亲水性单体的量和反应条件如表1所示。
(1-3)弱阳离子性基团的导入
使得到的被覆聚合物粒子10g分散于离子交换水100mL,准备反应前浆料。接着,一边搅拌该浆料,一边加入具有弱阳离子性基团的试剂即N,N-二乙基氨基丙基胺(和光纯药工业公司制)10mL,在70℃使其反应4小时。反应结束后,使用离心分离机(日立制作所公司制,“Himac CR20G”)除去上清液,用离子交换水清洗。清洗后,使用离心分离机除去上清液。进一步重复4次利用该离子交换水进行的清洗,向(2)的被覆聚合物粒子的表面导入弱阳离子性基团。反应中使用的弱阳离子性基团的量和反应条件如表1所示。按照以上步骤,得到由表面具有季铵基和叔氨基的疏水性交联性聚合物粒子构成的基材粒子。
(1-4)粒径的测定
使用粒度分布测定装置(AccuSizer780/Particle Sizing Systems公司制)对得到的基材粒子的体积平均粒径进行测定。
[表1]
*1:二乙烯基苯(和光纯药工业公司制)
*2:三乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)
*3:三羟甲基甲烷三丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)
*4:甲基丙烯酸缩水甘油酯(和光纯药工业公司制)
*5:甲基丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵(和光纯药工业公司制)
*6:N,N-二乙基氨基丙基胺(和光纯药工业公司制)
(2)基于HPLC的甲基化DNA的检测
(2-1)样品DNA的制备
将基于FAM150A基因的DNA序列(384bp,具有39个CpG位点)而构建的合成DNA作为样品DNA。
样品1:甲基化DNA:39个CpG位点的碱基全部为CG
样品2:非甲基化DNA:39个CpG位点的碱基全部为TG
样品1、2分别相当于FAM150A基因的甲基化DNA(甲基化率100%)和非甲基化DNA(甲基化率0%)的亚硫酸氢盐处理物。将对这些样品1、2的DNA(15ng/100μL)进行PCR扩增后的反应液作为HPLC分析用的试样使用。
(2-2)HPLC分析条件
将(1)中得到的基材粒子作为离子交换色谱用填充剂使用,进行HPLC分析。将实施例1和比较例1~2的基材粒子分别填充于液相色谱系统的不锈钢制柱(内径4.6mm×长度20mm)。使用得到的阴离子交换柱,按照以下条件进行离子交换色谱。
系统:LC-20A系列(岛津制作所公司制)
洗脱液:洗脱液A 25mmol/L Tris盐酸缓冲液(pH7.5)
洗脱液B 25mmol/L Tris盐酸缓冲液(pH7.5)
+2mol/L硫酸铵
分析时间:15分钟
洗脱法:按照以下的梯度条件线性增加洗脱液B的混合比率。
0分钟(洗脱液B 40%)→10分钟(洗脱液B 100%)
流速:1.0mL/min
检体:(1)中记载的样品1、2的PCR扩增产物
检体注入量:5μL
柱温:70℃
检测波长:260nm
(2-3)分析结果
将使用实施例1和比较例1~2的基材粒子的HPLC中得到的样品DNA的色谱图示于图1。在使用实施例1的填充剂的HPLC的色谱图中,与比较例1~2相比,甲基化DNA(样品1)和非甲基化DNA(样品2)的峰清楚,且两者的保留时间之差增大。根据下述公式而算出甲基化DNA和非甲基化DNA的峰的分离度。如表2所示,使用实施例1的基材粒子时,分离度显著提高。由此表明实施例1的基材粒子的甲基化DNA和非甲基化DNA的分离性能高。
分离度=1.18×(非甲基化DNA的保留时间-甲基化DNA的保留时间)÷(非甲基化DNA的半峰宽+甲基化DNA的半峰宽)
[表2]
实施例1 | 比较例1 | 比较例2 | |
分离度 | 1.84 | 1.02 | 0.99 |
实验2
按照与实验1(1)相同的步骤,如表3所示地制造单体(A)的含量不同的基材粒子1~3(体积平均粒径10μm)。将得到的基材粒子作为离子交换色谱用填充剂使用,按照与实验1(2)相同的步骤进行HPLC分析,算出甲基化DNA和非甲基化DNA的峰的分离度。将结果示于表3。
[表3]
*1:二乙烯基苯(和光纯药工业公司制)
*2:三乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)
*3:三羟甲基甲烷三丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)
*4:甲基丙烯酸缩水甘油酯(和光纯药工业公司制)
*5:甲基丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵(和光纯药工业公司制)
*6:N,N-二乙基氨基丙基胺(和光纯药工业公司制)
如表3所示,在使用基材粒子1~3的HPLC中,与比较例1和2相比,甲基化DNA与非甲基化DNA的分离度提高。由此表明基材粒子1~3的甲基化DNA和非甲基化DNA的分离性能高。
Claims (13)
1.一种甲基化DNA分离和/或检测用离子交换色谱用填充剂,含有在表面具有阳离子性官能团的疏水性交联共聚物粒子构成的基材粒子,该疏水性交联共聚物包含二乙烯基芳香族单体、具有2个以上乙烯基的非芳香族疏水性交联性单体和具有反应性官能团的单体,所述反应性官能团为缩水甘油基或异氰酸酯基。
2.根据权利要求1所述的离子交换色谱用填充剂,其中,所述二乙烯基芳香族单体选自二乙烯基苯、二乙烯基萘、二乙烯基蒽、二乙烯基甲苯、二乙烯基二甲苯和二乙烯基联苯。
3.根据权利要求1或2所述的离子交换色谱用填充剂,其中,所述具有2个以上乙烯基的非芳香族疏水性交联性单体为选自二乙二醇二甲基丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基甲烷三甲基丙烯酸酯、四羟甲基甲烷三甲基丙烯酸酯、二乙二醇二丙烯酸酯、三乙二醇二丙烯酸酯、四乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基甲烷三丙烯酸酯和四羟甲基甲烷三丙烯酸酯中的至少1种。
4.根据权利要求1或2所述的离子交换色谱用填充剂,其中,所述疏水性交联共聚物在总质量中含有3~15质量%的所述二乙烯基芳香族单体、40~70质量%的所述非芳香族疏水性交联性单体和10~50质量%的所述具有反应性官能团的单体。
5.根据权利要求1或2所述的离子交换色谱用填充剂,其中,所述疏水性交联共聚物在总质量中还包含0~5质量%的疏水性非交联性单体。
6.根据权利要求5所述的离子交换色谱用填充剂,其中,所述疏水性交联共聚物中的(A)所述二乙烯基芳香族单体与(B)所述非芳香族疏水性交联性单体与(C)所述具有反应性官能团的单体与(D)所述疏水性非交联性单体的比率以质量比计为(A):(B):(C):(D)=5~12:55~65:20~35:0~5,其中(A)+(B)+(C)+(D)=100。
7.根据权利要求1或2所述的离子交换色谱用填充剂,其中,所述二乙烯基芳香族单体是二乙烯基苯。
8.根据权利要求7所述的离子交换色谱用填充剂,其中,所述二乙烯基芳香族单体是二乙烯基苯,所述非芳香族疏水性交联性单体是选自三乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基甲烷三丙烯酸酯和季戊四醇三丙烯酸酯中的至少1种,所述具有反应性官能团的单体是甲基丙烯酸缩水甘油酯或甲基丙烯酸异氰基乙酯,不含有疏水性非交联性单体,或者含有疏水性非交联性单体且所述疏水性非交联性单体是苯乙烯。
9.根据权利要求1或2所述的离子交换色谱用填充剂,其中,所述阳离子性官能团为强阳离子性基团和弱阳离子性基团。
10.根据权利要求9所述的离子交换色谱用填充剂,其中,所述强阳离子性基团为季铵基,所述弱阳离子性基团为叔氨基。
11.根据权利要求9所述的离子交换色谱用填充剂,其中,所述基材粒子在表面具有聚合物层,该聚合物层具有所述强阳离子性基团和所述弱阳离子性基团。
12.甲基化DNA分离和/或检测用离子交换色谱用柱,含有权利要求1~11中任一项所述的离子交换色谱用填充剂。
13.一种甲基化DNA的分离和/或检测方法,使用权利要求1~11中任一项所述的离子交换色谱用填充剂。
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