JPH11127854A

JPH11127854A - 核酸の回収方法及び装置

Info

Publication number: JPH11127854A
Application number: JP9295474A
Authority: JP
Inventors: Tomoya Sakurai; 智也桜井; Kenji Yasuda; 健二保田
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1997-10-28
Filing date: 1997-10-28
Publication date: 1999-05-18
Anticipated expiration: 2017-10-28
Also published as: JP4025399B2; US7067287B1

Abstract

(57)【要約】【課題】核酸を含有する材料からの迅速、簡便で、精製
度の高い核酸を、収量を低下させずに回収し得る核酸の
回収方法を実現する。【解決手段】核酸含有材料から核酸の遊離を促すための
第１工程と、遊離した核酸と核酸の固相への結合を促進
する物質を混合する第２工程と、混合液と核酸結合性固
相とを接触させる第３工程と、固相と液体とを分離する
第４工程と、核酸が結合した固相を塩を含む溶液により
洗浄する第５工程と、核酸を固相から溶離する第６工程
とを備える。本発明により、遺伝子検査或いは遺伝子解
析に好適な純度の核酸を、迅速、且つ、簡便に、危険性
のある物質を使用することなく回収することが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を含有する物
質からの核酸の回収方法に関する。更に詳しくは、核酸
の検査による遺伝子診断のための体液成分からの内因
性、或いは、外来性の遺伝子として存在する核酸成分の
自動回収装置、或いは、核酸の塩基配列決定のための遺
伝子組換え大腸菌等からのプラスミドＤＮＡの自動回収
装置に適した核酸の回収方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】分子生物学の進歩によって、遺伝子に関
する数々の技術が開発され、また、それらの技術によ
り、多くの疾患性の遺伝子が分離・同定された。その結
果、医療の分野でも、診断、或いは、検査法に分子生物
学的な技法が取り入れられ、従来不可能であった診断が
可能となったり、検査日数の大幅短縮が達成されつつあ
る。

【０００３】この急激な進歩は、主として、核酸増幅
法、特に、ＰＣＲ法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉ
ｎｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応、Ｓａｉ
ｋｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−
４９１（１９８８））に依るところが大きい。

【０００４】ＰＣＲ法は、溶液中の核酸を配列特異的に
増幅することが可能なため、例えば、血清中に極微量し
か存在しないウイルスを、そのウイルスの遺伝子である
核酸を増幅し検出することにより、間接的にそのウイル
スの存在を証明することができる。

【０００５】しかし、このＰＣＲ法を臨床の場で日常検
査に使用した際に、いくつかの問題点が存在する。その
中でも、特に、前処理における核酸の抽出、精製工程の
困難性が問題であり、これら核酸の抽出、精製工程は、
重要であることが指摘されている（大島ほか，ＪＪＣＬ
Ａ，２２（２），１４５−１５０（１９９７））。

【０００６】これは、核酸精製時に除去し得なかった阻
害因子の影響により困難性が生じるものであり、阻害因
子としては、血液中のヘモグロビン、抽出工程で使用さ
れる界面活性剤等が知られている。

【０００７】また、抽出工程に関しては、煩雑な操作と
熟練者による多大な労力とが必要とされる。そのため、
病院の検査室へ新規に遺伝子検査を導入する際の障害と
なっており、この工程の自動化が熱望されている。

【０００８】また、分子生物学的な研究を行う機関で
は、遺伝子組換え操作を行うための材料として、プラス
ミドＤＮＡが頻繁に使用されているが、省力化の点等か
ら、検査室の場合と同様に、核酸を抽出し精製する工程
の自動化が望まれている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】ところで、核酸を含有
する生物試料から阻害因子を含まない精製度の高い状態
で核酸を回収するための既知の方法としては、タンパク
質分解酵素の存在下で、生物試料に界面活性剤を作用さ
せ、核酸を遊離状とし、フェノール（及び、クロロフォ
ルム）と混合し、遠心分離器による水相・有機相分離を
数回行った後、水相からアルコールにより沈殿物の形で
核酸を回収する方法が知られている。

【００１０】しかし、この調製方法は、工程内に有毒物
質であるフェノール等の有機溶媒を使用することに伴う
問題が存在する。つまり、フェノール等の有機溶媒は、
核酸回収に使用する装置のプラスチック部分を溶かす恐
れがあり、装置を劣化させてしまう可能性がある。さら
に、フェノール等の有機溶媒を使用した後、その廃棄に
必要な処理が煩雑である。

【００１１】また、核酸を回収する他の方法としては、
上記の水相・有機相分離を利用した方法以外にも、カオ
トロピック物質の存在下でガラス表面に核酸が結合する
性質を利用して、アガロースゲルからＤＮＡを回収する
方法（Ｂ．ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎａｎｄＤ．Ｇｉｌ
ｌｅｓｐｉｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７６（２），６１５−６１９（１９７
９））、或いは、大腸菌からプラスミドＤＮＡを回収す
る為の方法（Ｍ．Ａ．Ｍａｒｋｏ，Ｒ．Ｃｈｉｐｐｅｒ
ｆｉｅｌｄａｎｄＨ．Ｃ．Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２１，３８２−３８７（１
９８２））が報告されている。

【００１２】さらに、生物材料からの核酸の回収を目的
とし、より操作を簡便にした方法が、特開平２−２８９
５９６号公報に記載されている。この公報記載の方法で
は、生物試料を十分大きい量のカオトロピック物質（例
えばグアニジン塩）及びシリカ粒子と混合し、遊離した
核酸を固相へ結合させることにより迅速に核酸の回収が
行える。

【００１３】しかし、精製された状態の核酸を得るに
は、固相に結合した状態を保持したまま、核酸の結合し
た固相からグアニジン塩を除去する操作が必要である
が、その適切な除去操作については、示されてはいなか
った。

【００１４】また、従来においては、室温で固相の洗浄
のための操作を効率的に行うには、少なくとも７５％濃
度のエタノール使用が推奨されてる（Ｃ．Ｗ．Ｃｈｅｎ
ａｎｄＣ．Ａ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｊｒ．，Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３３９−３４１（１９８
０））が、エタノールは揮発性成分であるため、装置化
に際して、蒸発防止のための蓋の開閉機構や冷却機構が
必要となり、装置の大型化や信頼性の低下を招く。

【００１５】さらに、７０％エタノールやアセトンでの
洗浄が必要とされ、このため、乾燥によるアセトンの除
去作業が必要とされる。しかし、７０％以上のエタノー
ル、及び、アセトンは揮発性であるため、上述したよう
に、自動装置上に実装した際には、気密性の高い容器と
蓋の開閉機構、或いは／及び、揮発を防ぐための冷却機
構が必要とされる。

【００１６】また、アセトンの使用は、その強力な有機
溶剤としての性質から、上述したように、核酸回収に使
用する装置のプラスチック部分を溶かす恐れがあり、装
置を劣化させてしまう可能性がある。

【００１７】したがって、使用する装置や容器、及び、
分注器等の材質が著しく限定されてしまう。しかも、急
性毒性物質で、且つ、引火性物質であるため、蒸発操作
に伴う環境中へのアセトンの放出を充分に防止する必要
がある。

【００１８】本発明の目的は、核酸を含有する材料から
の迅速、簡便で、精製度の高い核酸の収量を低下させず
に回収し得る核酸の回収方法及び装置を実現することで
ある。

【００１９】また、本発明の他の目的は、生物試料中に
存在する核酸成分を自動回収し得る装置に好適な核酸の
回収方法を実現することである。

【００２０】さらに、本発明の他の目的は、大腸菌から
のプラスミドＤＮＡを自動回収し得る装置に好適な核酸
の回収方法を実現することである。

【００２１】

【課題を解決するための手段】

（１）上記目的を達成するために、本発明は以下のよう
に構成される。すなわち、核酸を含有する材料から核酸
を回収する核酸の回収方法において、核酸と核酸の固相
への結合を促進する物質を混合する第１工程と、混合液
と核酸結合性固相とを接触させる第２工程と、核酸が結
合した固相と液体とを分離する第３工程と、核酸が結合
した固相を塩を含む溶液により洗浄する第４工程と、核
酸を固相から溶離する第５工程とを備える。

【００２２】（２）好ましくは、上記（１）において、
上記第１工程の前に、核酸を含有する材料から核酸の遊
離を促すための工程を備える。

【００２３】（３）また、好ましくは、上記（１）にお
いて、上記第５工程は、核酸が結合した固相から非核酸
成分を洗浄する第５ａ工程と、固相から核酸の固相への
結合を促進する物質を洗浄する第５ｂ工程とを有する。

【００２４】（４）また、好ましくは、上記（３）にお
いて、上記第５ａ工程の固相から非核酸成分を洗浄する
物質は、塩酸グアニジン溶液である。

【００２５】（５）また、好ましくは、上記（１）、
（２）又は（３）において、上記第５工程の洗浄は、酢
酸塩又は塩化物を含む洗浄液により行う。

【００２６】（６）また、好ましくは、上記（５）にお
いて、上記酢酸塩は、０．５モル／リットル以上の濃度
を有する酢酸カリウム水溶液である。

【００２７】（７）また、好ましくは、上記（５）にお
いて、上記塩化物は、０．５モル／リットル以上の濃度
を有する塩化ナトリウムである。

【００２８】（８）また、好ましくは、上記（５）にお
いて、上記塩化物は、０．２モル／リットル以上の濃度
を有する塩化カリウムである。

【００２９】（９）また、好ましくは、上記（３）にお
いて、上記第５ｂ工程は、固相から核酸の固相への結合
を促進する物質を洗浄するために、塩を含む水溶液とア
ルコールとの混合液を使用する。

【００３０】（１０）また、好ましくは、上記（９）に
おいて、上記第６工程で核酸を固相から溶離した後、ア
ルコールを除去する第７工程を有する。

【００３１】（１１）また、好ましくは、上記（１０）
において、上記第７工程で、アルコールを除去するため
に加熱する。

【００３２】（１２）また、好ましくは、上記（９）、
（１０）又は（１１）において、上記第５ｂ工程で使用
するアルコールはエタノールである。

【００３３】（１３）また、好ましくは、上記（９）、
（１０）、（１１）又は（１２）において、上記第５ｂ
工程で、上記洗浄するための溶液は、４０％エタノール
と１０ｍモル／リットル以上の酢酸カリウムとを含む溶
液である。

【００３４】（１４）また、好ましくは、上記（９）、
（１０）、（１１）又は（１２）において、上記第５ｂ
工程で、上記洗浄するための溶液は、４０％エタノール
と２５ｍモル／リットル以上の塩化ナトリウムとを含む
溶液である。

【００３５】（１５）また、好ましくは、上記（１）か
ら（１４）において、上記第２工程で使用する核酸の固
相への結合を促進する物質は、塩酸グアニジンである。

【００３６】（１６）また、好ましくは、上記（１）か
ら（１４）において、上記第３工程で使用する核酸結合
性固相は、二酸化ケイ素を含有する物質である。

【００３７】（１７）また、核酸を含有する材料から核
酸を回収する核酸の回収方法装置において、核酸と核酸
の固相への結合を促進する物質を混合する第１の手段
と、混合液と核酸結合性固相とを接触させる第２の手段
と、核酸が結合した固相と液体とを分離する第３の手段
と、核酸が結合した固相を塩を含む溶液により洗浄する
第４の手段と、核酸を固相から溶離する第５の手段とを
備える。

【００３８】以上のようにして構成した核酸回収方法の
第２工程における、核酸の固相への結合を促進する物質
として、ＧｕＨＣｌを使用する事により核酸の純度や量
の検定に対して悪影響を及ぼす、２６０ｎｍの吸光度へ
の影響を著しく低減可能である。また、致死性のガスを
発生させる潜在的な危険性もない。

【００３９】また、第３工程における、核酸結合性固相
は、ガラス粒子、シリカパウダー、石英濾紙、石英ウー
ル、あるいは、それらの破砕物、ケイソウ土など、酸化
ケイ素を含有する物質であれば使用することが可能で、
１〜１００μｍ程度の粒径の場合、数分から１０分程度
で実用上十分な固相に対する核酸の結合が得られる。

【００４０】また、ケイソウ土を使用した場合、１回の
処理に必要な原価を低減させることが出来る。また、核
酸と固相の接触確率を高めるために、使用する粒子の比
重に応じて、攪拌操作を併用することにより更に結合時
間の効率化や再現性の向上がはかれる。

【００４１】第４工程における、固相と液体を分離する
手段としては、抗原抗体反応を利用した免疫分析装置で
一般的に使用される、Ｂ／Ｆ分離技術が流用できるた
め、既存の免疫分析装置の技術を生かすことが可能であ
る。

【００４２】第５工程における、核酸が結合した固相を
塩を含む溶液により洗浄する手段は、固相に結合した核
酸を保持したまま洗浄する事が可能で、第５工程を第５
ａ工程と第５ｂ工程に分割し、第５ａ工程での洗浄用の
液体にＧｕＨＣｌをしようし、第５ｂ工程での洗浄用の
液体に５００ｍＭ以上の濃度のＮａＣｌを使用すること
により夾雑物の除去を実用上十分なレベルで行うことが
可能である。或いは、第５ｂ工程で、２５ｍモル／リッ
トル以上のＮａＣｌあるいは１０ｍモル／リットル以上
の酢酸カリウムを含む４０％エタノール水溶液を使用す
る事により、冷却の必要無く夾雑物の除去を実用上十分
なレベルで行うことが可能となる。

【００４３】また、第５ｂ工程において、アルコールを
含む溶液を使用する際に、第６工程の後に、アルコール
成分を除去するための第７工程を追加することにより、
最終精製溶液にアルコールが混入することを防ぐことが
可能となる。

【００４４】

【発明の実施の形態】

（実施形態１）１モル／リットル塩水溶液を利用した洗浄工程を採用し
た際の核酸の回収図１のフローチャートに従い、核酸を含む水溶液からの
核酸の回収を行った。核酸含有材料としては、市販精製
品のｐＢＲ３２２ＤＮＡをＴＥ緩衝液（ｐＨ７．４）に
より希釈した。

【００４５】この場合、核酸含有材料中で既に核酸は遊
離の状態であるため、核酸含有材料から核酸の遊離を促
す工程である第１工程はスキップした。なお、この第１
の工程において、通常、使用する遊離材料としては、界
面活性剤や酵素等がある。また、核酸含有材料から核酸
の遊離を促進する手段としては、熱を加える手段や、超
音波等を加える手段等がある。

【００４６】第２工程は、遊離した核酸と核酸の固相へ
の結合を促進する物質とを混合する工程であり、１．５
ｍリットル容量の反応容器内で、上記核酸水溶液１００
μリットルに対して６モル／リットルＧｕＨＣｌ溶液９
００μリットルを添加し攪拌を行った。

【００４７】第３工程は、混合液と核酸結合性固相とを
接触させる工程であり、核酸結合性固相としてガラス粒
子を１００ｍｇ添加し、室温中でロータリーミキサーに
より、溶液を攪拌する事により固相と液体の接触を行っ
た。

【００４８】第４工程は、核酸が結合した固相と液体を
分離する工程であり、このために、遠心分離器を使用
し、１５０００ｇ、１分の遠心により固相の沈殿を得、
上清を破棄した。

【００４９】第５工程は、核酸が結合した固相を塩を含
む溶液により洗浄する工程であり、１モル／リットルの
塩水溶液により固相を懸濁し、上清を破棄した。

【００５０】第６工程は、核酸が結合した固相から核酸
を溶離する工程であり、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を固
相へ添加し、６０℃、１分の加温により溶離を行い、１
５０００ｇ、１分の遠心により上清を得た。そして、こ
の一部分を試料とし、０．８％アガロースゲルを支持体
として電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後
に、各バンドの強度をデンシトグラフにより数値化し、
第１工程での核酸量に基づき回収率を算出した。

【００５１】結果を表１に示す。塩化物、酢酸塩を使用
することにより洗浄時に効果的に核酸を保持することが
できる。

【００５２】

【表１】

【００５３】以上のように、本発明の実施形態１は、核
酸含有材料から核酸の遊離を促すための第１工程と、遊
離した核酸と核酸の固相への結合を促進する物質を混合
する第２工程と、混合液と核酸結合性固相とを接触させ
る第３工程と、固相と液体とを分離する第４工程と、核
酸が結合した固相を塩を含む溶液により洗浄する第５工
程と、核酸を固相から溶離する第６工程とを備える。し
たがって、本発明の実施形態１によれば、核酸を含有す
る材料からの迅速、簡便で、精製度の高い核酸を、収量
を低下させずに回収し得る核酸の回収方法を実現するこ
とができる。つまり、遺伝子検査、或いは、遺伝子解析
に好適な純度の核酸を迅速、且つ、簡便に、危険性のあ
る物質を使用することなく回収することができる。

【００５４】また、生物試料中に存在する核酸成分を自
動回収し得る装置に好適な核酸の回収方法を実現するこ
とができる。

【００５５】さらに、大腸菌からのプラスミドＤＮＡを
自動回収し得る装置に好適な核酸の回収方法を実現する
ことができる。

【００５６】（実施形態２）塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸
カリウムを含む溶液を利用した洗浄工程を採用した際の
核酸の回収図２のフローチャートに従い、核酸を含む水溶液からの
核酸の回収を行った。なお、この図２のフローチャート
において、第１、第２、第３、第４及び第６工程は、図
１のフローチャートと同様であり、図１の第５工程が、
図２においては、第５ａ工程と第５ｂ工程とに分かれて
いる。

【００５７】また、この実施形態２においては、実施形
態１と同様に、核酸含有材料としては、市販精製品のｐ
ＢＲ３２２ＤＮＡをＴＥ緩衝液（ｐＨ７．４）により希
釈した。

【００５８】第１工程から第４工程までは、図１の工程
と同様であるので、説明は省略する。第５ａ工程は、核
酸が結合した固相を塩を含む溶液により洗浄し、固相か
ら非核酸成分を洗浄する工程であり、６モル／リットル
のＧｕＨＣｌ（塩酸グアニジン）溶液１０００μリット
ルにより固相を懸濁し、１５０００ｇ、１分の遠心によ
り固相の沈殿を得、上清を破棄する操作により、固相の
洗浄を行った。

【００５９】第５ｂ工程は、核酸が結合した固相を塩を
含む溶液により洗浄し、固相から核酸の固相への結合を
促進する物質を洗浄する工程であって、濃度の異なるＮ
ａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＯＡｃ、ＫＯＡｃ水溶液により固
相を懸濁し、上清を破棄した。

【００６０】第６工程では、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）
を固相へ添加し、６０℃、１分の加温により溶離を行
い、１５０００ｇ、１分の遠心により上清を得、この一
部分を試料とし、０．８％アガロースゲルを支持体とし
て電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後に、各
バンドの強度をデンシトグラフにより数値化し、第１工
程での核酸量に基づき回収率を算出した。

【００６１】結果を図６に示す。ＮａＣｌ、ＫＯＡｃで
は５００ｍモル／リットル以上の濃度で５０％以上の回
収率となり、Ｋｃｌでは２００ｍモル／リットル以上の
濃度で５０％以上の回収率となって、効果的に核酸の回
収が行われていることが分かる。

【００６２】以上のように、本発明の実施形態２におい
ても、上述した実施形態１と同様な効果を得ることがで
きる。

【００６３】（実施形態３）酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムを含む溶液を利用した
洗浄工程を採用した際の核酸の回収図３のフローチャートに従い、核酸を含む水溶液からの
核酸の回収を行った。なお、この図３のフローチャート
において、第１、第２、第３、第４、第５ａ及び第６工
程は、図２のフローチャートと同様である。したがっ
て、第１工程から第５ａ工程までは、説明は省略する。

【００６４】第５ｂ工程では、濃度の異なるＫＯＡｃ、
ＮａＣｌと４０％エタノール水溶液により固相を懸濁
し、上清を廃棄した。第６工程では、ＴＥ緩衝液（ｐＨ
８．０）を固相へ添加し、６０℃、１分の加温により溶
離を行い、１５０００ｇ、１分の遠心により上清を得
た。第７工程は、アルコールを除去する工程であり、６
０℃の加熱、加温によりエタノールを除去し、精製状態
の核酸水溶液を得た。

【００６５】この一部分を試料とし、０．８％アガロー
スゲルを支持体として電気泳動を行い、エチジウムブロ
マイド染色後に、各バンドの強度をデンシトグラフによ
り数値化し、第１工程での核酸量に基づき回収率を算出
した。

【００６６】結果を図７に示す。４０％エタノールと組
み合わせることにより、１０ｍモル／リットル以上のＫ
ＯＡｃ、或いは、２５ｍモル／リットル以上のＮａＣｌ
濃度で効果的に核酸の回収を行うことができる。

【００６７】以上のように、本発明の実施形態３におい
ても、上述した実施形態１と同様な効果を得ることがで
きる。

【００６８】（実施形態４）エタロールと酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム溶液を組
み合わせて洗浄工程に利用した際にエタノール濃度が変
化したときの核酸の回収図３のフローチャートに従い、核酸を含む水溶液からの
核酸の回収を行った。なお、この図３のフローチャート
において、第１、第２、第３、第４、第５ａ及び第６工
程は、図２のフローチャートと同様である。したがっ
て、第１工程から第５ａ工程までは、その説明は省略す
る。

【００６９】第５ｂ工程は、核酸が結合した固相を塩を
含む溶液とアルコールとの混合液により洗浄し、固相か
ら核酸の固相への結合を促進する物質を洗浄する工程で
ある。この第５ｂ工程において、２５ｍモル／リット
ル、或いは５０ｍモル／リットル、或いは、１００ｍモ
ル／リットルのＮａＣｌと濃度の異なるエタノール水溶
液により固相を懸濁し、上清を破棄した。

【００７０】第６工程では、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）
を固相へ添加し、６０℃、１分の加温により溶離を行
い、１５０００ｇ、１分の遠心により上清を得た。第７
工程は、アルコールを除去する工程であり、６０℃の加
温によりエタノールを除去し、精製状態の核酸水溶液を
得た。

【００７１】この一部分を試料とし、０．８％アガロー
スゲルを支持体として電気泳動を行い、エチジウムブロ
マイド染色後に、各バンドの強度をデンシトグラフによ
り数値化し、第１工程での核酸量に基づき回収率を算出
した。

【００７２】結果を図８に示す。５０ｍモル／リットル
以上のＫＯＡｃ、或いは、１００ｍモル／リットル以上
のＮａＣｌとエタノールを組み合わせる事で、エタノー
ル濃度が変動した際の回収率が低下することを効果的に
抑制することができる。

【００７３】以上のように、本発明の実施形態４におい
ても、上述した実施形態１と同様な効果を得ることがで
きる。なお、この実施形態４において、エタノールを使
用しているが、２５ｍモル／リットル、或いは５０ｍモ
ル／リットル、或いは、１００ｍモル／リットルのＮａ
Ｃｌと濃度の異なるエタノールとの水溶液であるので、
従来技術のような問題は生じない。

【００７４】（実施形態５）血清へ添加したＤＮＡの回収図３のフローチャートに従い、血清へ添加した核酸の回
収を行った。ヒトの血清に対し、市販精製品のｐＢＲ３
２２ＤＮＡを添加したものを試料とした。核酸は既に遊
離状であるが、ヌクレアーゼ対策のために、第１工程で
ドデシル硫酸ナトリウムを添加した。

【００７５】第２工程から第５ａ工程までは、実施形態
４と同様となるので、説明は省略する。第５ｂ工程で
は、５０ｍモル／リットルのＫＯＡｃを含む５０％エタ
ノール水溶液により固相を懸濁し、上清を破棄した。

【００７６】第６工程では、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）
を固相へ添加し、６０℃、１分の加温により溶離を行
い、１５０００ｇ、１分の遠心により上清を得た。第７
工程で、６０℃の加温によりエタノールを除去し、精製
状態の核酸水溶液を得た。

【００７７】この一部分を試料とし、０．８％アガロー
スゲルを支持体として電気泳動を行い、エチジウムブロ
マイド染色後に、各バンドの強度をデンシトグラフによ
り数値化し、第１工程での核酸量に基づき回収率を算出
した。回収率は７０％であり、Ａ２６０／Ａ２８０は
１．９０であった。また、第１〜第７行程を処理するた
めの時間は約３０分であった。

【００７８】この実施形態５においても、上述した実施
形態１と同様な効果を得ることができる。なお、この実
施形態５において、エタノールを使用しているが、５０
ｍモル／リットルのＫＯＡｃを含む５０％エタノール水
溶液であるので、従来技術のような問題は生じない。

【００７９】（実施形態６）培養した遺伝子組換え大腸菌からのプラスミドＤＮＡの
回収図３のフローチャートに従い、培養した遺伝子組換え大
腸菌からのプラスミドＤＮＡの回収を行った。大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株に対して、ｐＢＲ３２２ＤＮＡを遺伝子工学
的に組み込んだ大腸菌を試料とした。大腸菌をＬＢ培地
１ｍリットル中で、３７℃で一晩培養した物を遠心分離
により集菌し、１００μリットルの０．１５モル／リッ
トルのＮａＣｌに懸濁させた物を試料とした。

【００８０】第１工程では、大腸菌の細胞壁中のペプチ
ドグリカンを破壊するために、５０ｍモル／リットルの
グルコース、１０ｍモル／リットルのＥＤＴＡ、２５ｍ
モル／リットルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に８
ｍｇ／ｍリットルとなるようにリゾチームを加えた溶液
を添加、混合した。

【００８１】更に、０．２モル／リットルのＮａＯＨ、
１％ＳＤＳ溶液を添加し、核酸を遊離状とした。この溶
液に５モル／リットルの酢酸カリウムを添加した。

【００８２】第２工程では、上記核酸含有水溶液に対し
て６モル／リットルのＧｕＨＣｌ溶液１０００μリット
ルを添加し攪拌を行った。

【００８３】第３工程で、核酸結合性固相としてガラス
粒子を１５０ｍｇ添加し、室温中でロータリーミキサー
により、溶液を攪拌する事で固相と液体の接触を行っ
た。

【００８４】第４工程では、核酸が結合した固相と液体
を分離するために、遠心分離器を使用し、１５０００
ｇ、１分の遠心により固相の沈殿を得、上清を破棄し
た。

【００８５】第５ａ工程では、６モル／リットルのＧｕ
ＨＣｌ溶液１０００μリットルにより固相を懸濁し、１
５０００ｇ、１分の遠心により固相の沈殿を得、上清を
破棄する操作により、固相の洗浄を行った。第５ｂ工程
では、５０ｍモル／リットルのＫＯＡｃを含む５０％エ
タノール水溶液により固相を懸濁し、上清を破棄した。

【００８６】第６工程では、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）
を固相へ添加し、６０℃、１分の加温により溶離を行
い、１５０００ｇ、１分の遠心により上清を得た。第７
工程で、６０℃の加温によりエタノールを除去し、精製
状態の核酸水溶液を得た。この一部分を試料とし、０．
８％アガロースゲルを支持体として電気泳動を行い、エ
チジウムブロマイド染色により、核酸の電気泳動バンド
を得、同時に流した移動量マーカーから、プラスミドＤ
ＮＡとｒＲＮＡのバンドが確認された。

【００８７】この状態で、Ａ２６０／Ａ２８０は１．９
６であった。また、リオボヌクレアーゼ処理、及び、エ
タノール沈殿処理後のＡ２６０吸光度からの算出によ
り、得られたプラスミドＤＮＡの収量は４．５μｇであ
った。また、第１〜第７行程を処理するための時間は約
４５分であった。

【００８８】この実施形態６においても、上述した実施
形態１と同様な効果を得ることができる。なお、この実
施形態６において、エタノールを使用しているが、５０
ｍモル／リットルのＫＯＡｃを含む５０％エタノール水
溶液であるので、従来技術のような問題は生じない。

【００８９】（実施形態７）自動装置である核酸の回収装置による血清へ添加したＤ
ＮＡの回収図９に本発明の実施形態７である核酸の回収装置（自動
装置）の平面レイアウトを示す。図９において、撹拌装
置１０１は、機械制御により円周方向と上下方向への移
動が可能で、粒子吸入口１０７と洗浄場所１０８との間
を移動することができる。ピペッタＡ１０２とピペッタ
Ｂ１０３とは機械制御により円周方向と上下方向への移
動が可能で、それぞれ使い捨てチップを設置するための
ノズル１１８とノズル１１９とを有する。

【００９０】反応容器移送機構１０４は、機械制御によ
り反応容器１２０を、Ａ、Ｂ、Ｃの位置へ移送すること
ができ、位置Ｃの両側には永久磁石１２２が反応容器１
２０の大きさに合わせて設置されている。精製品収納容
器移送機構１０５は機械制御により精製品収納容器１２
１を、Ｄ、Ｅの位置へ移送することができる。

【００９１】図３のフローチャートに従い、図９に示し
た装置により血清へ添加した核酸の回収を行った。ヒト
の血清に対し、市販精製品のｐＢＲ３２２ＤＮＡを添加
したものを試料とし、反応容器１２０に所定量分注し、
Ａの位置へ設置した。核酸は既に遊離状であるが、ヌク
レアーゼ対策のために、第１工程でＳＤＳを添加した。

【００９２】第２工程では、反応容器１２０を反応容器
移送機構１０４によりＢの位置へ移動し、ピペッタＡ１
１８を円周方向の回転によりチップ取り付け位置１０６
でノズル１０２にチップに取り付けた後、ピペッタ１１
８をＧｕＨＣｌ吸入口１０９へ移動し、核酸水溶液１０
０μリットルに対して８モル／リットルＧｕＨＣｌ溶液
９００μリットルを吸引する。

【００９３】更に、ピペッタＡ１１８をＢの位置へ移動
し、反応容器１２０内へＧｕＨＣｌを吐出し、更に吸引
・吐出動作を複数回行い撹拌を行った。その後、ピペッ
トＡ１０２をチップ廃棄位置１１６へ移動し、ノズル１
１８からチップを廃棄した。

【００９４】第３工程では、核酸結合性固相として磁性
粒子溶液を使用し、撹拌機構１０１により磁性粒子吸入
部１０７から内容物を撹拌し、ピペッタＡ１０２のノズ
ル１１８へチップ取り付け位置１０６で新規に取り付け
たチップにより所定の量を吸引する。その後、Ｂの位置
へピペットＡ１０２を移動し、反応容器１２０へチップ
内容物を吐出し、更に、吸引・吐出を行い撹拌を行っ
た。撹拌機構１０１は洗浄部１０８へ移動し、洗浄を行
い、ピペッタＡ１０２はチップ廃棄位置１１６へ移動
し、ノズル１１８からチップを廃棄した。

【００９５】第４工程では、核酸が結合した固相と液体
とを分離するために、反応容器移送機構１０４により反
応容器１２０をＢの位置からＣの位置へ移動し、永久磁
石１２２により反応容器１２０内の磁性粒子を容器側壁
に捕捉する。そして、ピペッタＢ１０３を回転によりチ
ップ取り付け位置１１３へ移動し、ノズル１１９へチッ
プを取り付けた後、Ｃの位置へ移動し、反応容器１２０
内の液相を吸引する。さらに、溶液廃棄位置１１４へ移
動し、チップ内の溶液を廃棄し、チップ廃棄位置１１５
へ移動して、ノズル１１９からチップを廃棄した。

【００９６】第５ａ工程では、反応容器移送機構１０４
により反応容器１２０をＣからＢの位置へ移動し、ピペ
ットＡ１０２をチップ取り付け位置１０６へ移動し、ノ
ズル１１８へチップを取り付ける。その後、ＧｕＨＣｌ
吸入口１１１へ移動し、所定の量を吸引した後、Ｂの位
置へ移動し、反応容器１２０内へＧｕＨＣｌを吐出す
る。この吸引・吐出動作により撹拌した後、チップ廃棄
位置１１６へ移動し、ノズル１１８からチップを廃棄し
た。

【００９７】さらに、反応容器移送機構１０４により反
応容器１２０をＢからＣの位置へ移動し、永久磁石１２
２により反応容器１２０内の磁性粒子を容器側壁に捕捉
する。そして、ピペッタＢ１０３を回転によりチップ取
り付け位置１１３へ移動し、ノズル１１９へチップを取
り付けた後に、Ｃの位置へ移動し、反応容器１２０内の
液相を吸引する。次に、溶液廃棄位置１１４へ移動し、
チップ内の溶液を廃棄し、更に、チップ廃棄位置１１５
へ移動して、ノズル１１９からチップを廃棄した。

【００９８】第５ｂ工程では、反応容器移送機構１０４
により反応容器１２０をＣからＢの位置へ移動する。次
に、ピペットＡ１０２をチップ取り付け位置１０６へ移
動し、ノズル１１８へチップを取り付けた後、５０ｍモ
ル／リットルＫＯＡｃを含む５０％エタノール水溶液吸
入口１１０へ移動し、所定の量を吸引する。その後、Ｂ
の位置へ移動し、反応容器１２０内へ５０ｍモル／リッ
トルＫＯＡｃを含む５０％エタノール水溶液を吐出し、
吸引・吐出動作により撹拌した後、チップ廃棄位置１１
６へ移動し、ノズル１１８からチップを廃棄した。

【００９９】さらに、反応容器移送機構１０４により反
応容器１２０をＢからＣの位置へ移動し、永久磁石１２
２により反応容器１２０内の磁性粒子を容器側壁に捕捉
する。次に、ピペッタＢ１０３を回転によりチップ取り
付け位置１１３へ移動し、ノズル１１９へチップを取り
付けた後、Ｃの位置へ移動し、反応容器１２０内の液相
を吸引し、溶液廃棄位置１１４へ移動しチップ内の溶液
を廃棄する。さらに、チップ廃棄位置１１５へ移動し、
ノズル１１９からチップを廃棄した。この工程を、さら
に所定の回数繰り返した。

【０１００】第６工程では、反応容器移送機構１０４に
より反応容器１２０をＣからＢの位置へ移動し、ピペッ
トＡ１０２をチップ取り付け位置１０６へ移動し、ノズ
ル１１８へチップを取り付けた後、６０°Ｃ加温ＴＥ緩
衝液（ｐＨ８．０）吸引口１０９へ移動し、所定の量を
吸引した後、Ｂの位置へ移動する。そして、反応容器１
２０内へ６０°Ｃに加温したＴＥ緩衝液を吐出し、吸引
・吐出動作により撹拌した後、チップ廃棄位置１１６へ
移動し、ノズル１１８からチップを廃棄した。

【０１０１】さらに、反応容器移送機構１０４により反
応容器１２０をＢからＣの位置へ移動し、永久磁石１２
２により反応容器１２０内の磁性粒子を容器側壁に捕捉
し、ピペッタＢ１０３を回転によりチップ取り付け位置
１１３へ移動する。次に、ノズル１１９へチップを取り
付けた後、Ｃの位置へ移動し、反応容器１２０内の液相
を吸引した後、位置Ｄへ移動する。そして、精製品収納
容器１２１へ溶液を吐出し、さらに、この工程を所定の
回数だけ繰り返した。

【０１０２】第７工程で、精製品収納容器移送機構１０
５により精製品収納容器１２１を６０°Ｃのヒートブロ
ック１１２上の位置Ｅへ移動し、所定の時間加熱し、精
製状態の核酸水溶液を得た。

【０１０３】この一部分を試料とし、０．８％アガロー
スゲルを支持体として電気泳動を行い、エチジウムブロ
マイド染色後に、各バンドの強度をデンシトグラフによ
り数値化し、第１工程での核酸量に基づき、回収率を算
出した。その結果、回収率は６５％であった。また、第
１〜第７工程を処理するための時間は、約３０分であっ
た。

【０１０４】以上のように、本発明の実施形態７によれ
ば、核酸を含有する材料からの迅速、簡便で精製度の高
い核酸を収量を低下させずに回収する核酸の回収装置を
実現することができる。なお、この実施形態７におい
て、エタノールを使用しているが、５０ｍモル／リット
ルＫＯＡｃを含む５０％エタノール水溶液であるので、
従来技術のような問題は生じない。

【０１０５】次に、本発明と従来技術とを比較するため
の比較例について説明する。

【０１０６】（比較例）従来例と同様に、エタノール水溶液のみによる洗浄工程
を使用した際の核酸の回収図４のフローチャートに従い、核酸を含む水溶液からの
核酸の回収を行った。核酸含有材料としては、市販精製
品のｐＢＲ３２２ＤＮＡをＴＥ緩衝液（ｐＨ７．４）に
より希釈した。

【０１０７】この場合、核酸含有材料中で既に核酸は遊
離の状態であるため、核酸含有材料から核酸の遊離を促
す工程である第１工程はスキップした。第２工程は、遊
離した核酸と核酸の固相への結合を促進する物質とを混
合する工程であって、１．５ｍリットル容量の反応容器
内で、核酸水溶液１００μリットルに対して６モル／リ
ットルＧｕＨＣｌ溶液９００μリットルを添加し攪拌を
行った。

【０１０８】第３工程は、混合液と核酸結合性固相とを
接触する工程であり、核酸結合性固相としてガラス粒子
を１００ｍｇ添加し、室温中でロータリーミキサーによ
り、溶液を攪拌する事により固相と液体の接触を行っ
た。

【０１０９】第４工程は、核酸が結合した固相と液体と
を分離する工程であって、核酸が結合した固相と液体と
を分離するために、遠心分離器を使用し、１５０００
ｇ、１分の遠心により固相の沈殿を得、上清を破棄し
た。

【０１１０】第５工程は、核酸が結合した固相をエタノ
ール水溶液により洗浄する工程であって、濃度の異なる
各種エタノール水溶液により固相を懸濁し、１５０００
ｇ、１分の遠心により固相の沈殿を得、上清を破棄する
操作により、固相の洗浄を行った。

【０１１１】第６工程は、核酸が結合した固相から核酸
を遊離する工程であって、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を
固相へ添加し、６０℃、１分の加温により溶離を行い、
１５０００ｇ、１分の遠心により上清を得た。そして、
この一部分を試料とし、０．８％アガロースゲルを支持
体として電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色を
行った。その後、各バンドの強度をデンシトグラフによ
り数値化し、第１工程での核酸量に基づき回収率を算出
した。

【０１１２】結果を図５に示す。エタノール濃度８０％
付近を境に回収率が低下する事が確認された。つまり、
エタノール濃度８０％で、核酸の回収率は最も高い率と
なるが、高濃度のエタノールを使用しなければならず、
上述したように、７０％以上のエタノールは揮発性であ
るため自動装置上に実装した際には、気密性の高い容器
と蓋の開閉機構、或いは／及び、揮発を防ぐための冷却
機構が必要とされ、装置構成が複雑となってしまう。

【０１１３】これに対して、上述した本発明の実施形態
１〜７は、核酸を含有する材料からの迅速、簡便で、精
製度の高い核酸の収量を低下させずに回収し得る核酸の
回収方法及び装置を実現することができる。

【０１１４】なお、本発明は、核酸を含有する材料であ
れば適応可能であるが、特に、全血、血清、喀痰、尿等
の臨床検体、或いは、培養細胞、培養細菌等の生物学的
な試料、或いは、電気泳動後のゲルに保持された状態の
核酸、等が好適である。

【０１１５】また、本発明の方法は、ＤＮＡ増幅酵素等
の反応産物や素精製状態の核酸を含む材料に対しても有
効である。なお、ここでいう核酸は、２本鎖、１本鎖、
或いは、部分的に２本鎖、もしくは、１本鎖構造を採る
ＤＮＡ、或いは、ＲＮＡである。

【０１１６】また、本発明の第１工程における、核酸含
有材料から核酸の遊離を促すための方法は、乳鉢、超音
波、マイクロウエーブなどによる物理的な方法、或い
は、界面活性剤、変性剤などによる化学的な方法、或い
は、タンパク質分解酵素などによる生化学的な方法、及
び、それらを組み合わせた方法などが使用できる。

【０１１７】また、本発明の第２工程における、核酸の
固相への結合を促進する物質としては、ＮａＩ（ヨウ化
ナトリウム）、ＫＩ（ヨウ化カリウム）、ＮａＣｌ
Ｏ₄、ＮａＳＣＮ（チオシアン酸ナトリウム）、ＧｕＳ
ＣＮ（チオシアン酸グアニジン）、などのカオトロピッ
ク剤が好適だが、これらの物質は核酸が吸収を持つ２６
０ｎｍ付近にピークの裾野がかかるため、万が一、精製
核酸溶液中に混入した際には、一般的に利用される、分
光光度計を利用した核酸の純度や量の検定結果に対して
悪影響を与える可能性がある。

【０１１８】また、チオシアン酸を含むＮａＳＣＮ、Ｇ
ｕＳＣＮは、酸と反応することにより致死性のＨＣＮ
（シアン化水素）を発生するため、廃液の取り扱いに注
意が要求される。

【０１１９】そのため、本発明においては、核酸の固相
への結合を促進する物質としては、ＧｕＨＣｌ（塩酸グ
アニジン）の使用が望ましい。ＧｕＨＣｌは容易に入手
可能で、且つ、上記カオトロピック剤に比し２６０ｎｍ
の吸光度への悪影響は著しく低い。また、致死性のガス
を発生させる潜在的な危険性がない。

【０１２０】また、本発明においては、特異的に核酸成
分を固相へ結合させるために、ＧｕＨＣｌの最終濃度
を、４〜６モル／リットルとするのが望ましい。

【０１２１】本発明の第３工程における、核酸結合性固
相は、ガラス粒子、シリカパウダー、石英濾紙、石英ウ
ール、あるいは、それらの破砕物、ケイソウ土など、酸
化ケイ素を含有する物質であれば使用することができる
が、核酸とカオトロピック剤の混合液中で、核酸と固相
の接触確率を高める事により、結合効率の向上、或い
は、結合時間の短縮が可能であるため、粒径の小さい粒
子の使用が望ましい。

【０１２２】本発明においては１〜１００μｍ程度の粒
径が好適であった。また、核酸と固相の接触確率を高め
るために、使用する粒子の比重に応じて、攪拌操作を行
うことが望ましい。

【０１２３】また、本発明の第４工程における、固相と
液体を分離する手段としては、遠心分離や濾過により分
離可能であるが、自動化、及び、装置化に際しては、抗
原抗体反応を利用した免疫分析装置で一般的に使用され
る、既知のＢ／Ｆ（ｂｏｎｄｆｏｒｍ／ｆｒｅｅｆｏ
ｒｍ）分離技術を応用することができる。

【０１２４】また、本発明の第５工程における、核酸が
結合した固相を塩を含む溶液により洗浄する手段は、第
４工程終了後の固相に対して、核酸の固相への結合を保
持しつつ、固相を洗浄するための塩を含む溶液を混合
し、第４工程と同様、固相と液体の分離をすることによ
り洗浄を行うことができる。

【０１２５】また、第５工程は、固相に対して非特異的
に結合している非核酸成分を固相から分離するための第
５ａ工程、及び、固相から核酸の固相への結合を促進す
る物質を洗浄する第５ｂ工程に分割される。この際に、
第５ａ、第５ｂ工程で固相の洗浄のために使用する液体
は、固相に結合した核酸を溶離させないことが重要であ
り、これは最終的に得られる核酸の収率に影響を及ぼ
す。

【０１２６】また、本発明は、７５％以上の濃度のエタ
ノールは、洗浄用の液体として使用用しないが、第５ａ
工程で使用する洗浄用の液体としては、第４工程と同様
に、ＧｕＨＣｌが好適である。これは、ＧｕＨＣｌが変
性剤作用を持つためで、４〜６モル／リットルの濃度で
の使用により固相から非特異吸着物質を除去することが
出来る。

【０１２７】また、第５ｂ工程で使用する洗浄用の液体
としては、溶離した後の核酸の使用に対して悪影響を与
えない塩で、且つ、中程度の濃度の水溶液を調製できる
ものが好適である。これは、固相の表面上で非溶液状と
なった核酸が、塩濃度が高い水溶液に対して溶けにくく
なる性質を利用したものであり、例えば、ＮａＣｌ（塩
化ナトリウム）を５００ｍＭ以上の濃度で使用すること
が望ましい。或いは、第５ｂ工程に塩を含む水溶液とア
ルコールとの混合液を使用することもできる。

【０１２８】この場合には、塩を単独で使用する場合よ
りも、更に、低い濃度にすることが可能であり、また、
アルコール成分の揮発によるアルコール濃度変化に対し
ても寛容性を持つ。本発明においては、５０ｍモル／リ
ットル以上のＮａＣｌを含む５０％エタノール水溶液の
使用が有効であった。

【０１２９】また、第５ｂ工程において、アルコールを
含む溶液を使用する際には、第６工程の後に、精製した
核酸溶液中に混入する恐れのある微量のアルコール成分
を除去するための第７工程を追加することが必要とな
る。この第７工程は、溶液の加温などにより達成するこ
とが出来る。

【０１３０】本発明の第６工程における、核酸を固相か
ら溶離する手段は、洗浄後の固相に対して固相の体積以
上の低塩濃度の水溶液、或いは、水を混合することによ
り達成される。この操作により核酸は固相から水相へと
移行するため、第４工程と同様に固相と液体を分離する
ことで精製状態の核酸水溶液が得られる。

【０１３１】本発明において使用される、低塩濃度の水
溶液、或いは、水は滅菌状態であることが好適で、或い
は、必要に応じて、ＤＥＰＣ処理を行った物の使用が望
まれる。

【０１３２】また、ここで使用される、低塩濃度の水溶
液、或いは、水は、得られる核酸の収率を高めるため
に、５５〜６０℃に加温した状態で使用することが望ま
しいが、溶離を行う際に使用する容器を同様の温度に加
温した場合でも同様の効果が得られる。また、本発明に
おいて、核酸の収率を高めるためには、第６工程を少な
くとも２回行うことが望ましい。

【０１３３】また、第５工程の洗浄は、酢酸塩又は塩化
物を含む洗浄液により行うが、酢酸塩は、０．５モル／
リットル以上の濃度を有する酢酸カリウム水溶液とする
ことができる。また、上記塩化物は、０．５モル／リッ
トル以上の濃度を有する塩化ナトリウム、又は、０．２
モル／リットル以上の濃度を有する塩化カリウムとする
ことができる。

【０１３４】また、第５ｂ工程で、洗浄するための溶液
は、４０％エタノールと１０ｍモル／リットル以上の酢
酸カリウムとを含む溶液とすることができる。また、第
５ｂ工程で、洗浄するための溶液は、４０％エタノール
と２５ｍモル／リットル以上の塩化ナトリウムとを含む
溶液とすることができる。また、第３工程で使用する核
酸結合性固相は、二酸化ケイ素を含有する物質とするこ
とができる。

【０１３５】

【発明の効果】本発明は、以上説明したように構成され
ているため、次のような効果がある。核酸を含有する材
料からの迅速、簡便で、精製度の高い核酸を、収量を低
下させずに回収し得る核酸の回収方法及び装置を実現す
ることができる。つまり、遺伝子検査、或いは、遺伝子
解析に好適な純度の核酸を迅速、且つ、簡便に、危険性
のある物質を使用することなく回収することができる。

【０１３６】また、生物試料中に存在する核酸成分を自
動回収し得る装置に好適な核酸の回収方法及び装置を実
現することができる。

【０１３７】さらに、大腸菌からのプラスミドＤＮＡを
自動回収し得る装置に好適な核酸の回収方法及び装置を
実現することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施形態１における核酸の回収を行う
ための動作フローチャートである。

【図２】本発明の実施形態２における塩化ナトリウム等
を含む溶液による洗浄工程を含む核酸の回収を行うため
の動作フローチャートである。

【図３】本発明の実施形態３、４、５、６における洗浄
工程を含む核酸の回収を行うための動作フローチャート
である。

【図４】従来技術の核酸の回収方法であり、エタノール
水溶液のみによる洗浄工程を含む核酸の回収を行うため
の動作フローチャートである。

【図５】従来技術におけるエタノールによる洗浄工程の
結果を表すグラフである。

【図６】本発明の実施形態２による洗浄工程の結果を表
すグラフである。

【図７】本発明の実施形態３による洗浄工程の結果を表
すグラフである。

【図８】本発明の実施形態４による洗浄工程の結果を表
すグラフである。

【図９】本発明の実施形態７である核酸の回収装置の平
面レイアウト図である。

【符号の説明】

１０１撹拌装置１０２、１０３ピペッタ１０４反応容器移送機構１０５精製品収納容器移送機構１０６、１１３チップ取り付け位置１０７磁性粒子吸入部１０８洗浄場所１０９、１１１ＧｕＨＣｌ吸入口１１０５０％エタノール水溶液吸入口１１２ヒートブロック１１４溶液廃棄位置１１５、１１６チップ廃棄位置１１８、１１９ノズル１２０反応容器１２１精製品収納容器１２２永久磁石

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸を含有する材料から核酸を回収する核
酸の回収方法において、核酸と核酸の固相への結合を促進する物質を混合する第
１工程と、混合液と核酸結合性固相とを接触させる第２工程と、核酸が結合した固相と液体とを分離する第３工程と、核酸が結合した固相を塩を含む溶液により洗浄する第４
工程と、核酸を固相から溶離する第５工程と、を備えることを特
徴とする核酸の回収方法。
【請求項２】請求項１記載の核酸の回収方法において、
上記第１工程の前に、核酸を含有する材料から核酸の遊
離を促すための工程を備えることを特徴とする核酸の回
収方法。
【請求項３】請求項１記載の核酸の回収方法において、
上記第５工程は、核酸が結合した固相から非核酸成分を
洗浄する第５ａ工程と、固相から核酸の固相への結合を
促進する物質を洗浄する第５ｂ工程とを有することを特
徴とする核酸の回収方法。
【請求項４】請求項３記載の核酸の回収方法において、
上記第５ａ工程の固相から非核酸成分を洗浄する物質
は、塩酸グアニジン溶液であることを特徴とする核酸の
回収方法。
【請求項５】請求項１、２又は３記載の核酸の回収方法
において、上記第５工程の洗浄は、酢酸塩又は塩化物を
含む洗浄液により行うことを特徴とする核酸の回収方
法。
【請求項６】請求項５記載の核酸の回収方法において、
上記酢酸塩は、０．５モル／リットル以上の濃度を有す
る酢酸カリウム水溶液であることを特徴とする核酸の回
収方法。
【請求項７】請求項５記載の核酸の回収方法において、
上記塩化物は、０．５モル／リットル以上の濃度を有す
る塩化ナトリウムであることを特徴とする核酸の回収方
法。
【請求項８】請求項５記載の核酸の回収方法において、
上記塩化物は、０．２モル／リットル以上の濃度を有す
る塩化カリウムであることを特徴とする核酸の回収方
法。
【請求項９】請求項３記載の核酸の回収方法において、
上記第５ｂ工程は、固相から核酸の固相への結合を促進
する物質を洗浄するために、塩を含む水溶液とアルコー
ルとの混合液を使用することを特徴とする核酸の回収方
法。
【請求項１０】請求項９記載の核酸の回収方法におい
て、上記第６工程で核酸を固相から溶離した後、アルコ
ールを除去する第７工程を有することを特徴とする核酸
の回収方法。
【請求項１１】請求項１０記載の核酸の回収方法におい
て、上記第７工程で、アルコールを除去するために加熱
することを特徴とする核酸の回収方法。
【請求項１２】請求項９、１０又は１１記載の核酸の回
収方法において、上記第５ｂ工程で使用するアルコール
は５０％未満のエタノールであることを特徴とする核酸
の回収方法。
【請求項１３】請求項９、１０、１１又は１２記載の核
酸の回収方法において、上記第５ｂ工程で、上記洗浄す
るための溶液は、４０％エタノールと１０ｍモル／リッ
トル以上の酢酸カリウムとを含む溶液であることを特徴
とする核酸の回収方法。
【請求項１４】請求項９、１０、１１又は１２記載の核
酸の回収方法において、上記第５ｂ工程で、上記洗浄す
るための溶液は、４０％エタノールと２５ｍモル／リッ
トル以上の塩化ナトリウムとを含む溶液であることを特
徴とする核酸の回収方法。
【請求項１５】請求項１から１４に記載の核酸の回収方
法において、上記第２工程で使用する核酸の固相への結
合を促進する物質は、塩酸グアニジンであることを特徴
とする核酸の回収方法。
【請求項１６】請求項１から１４に記載の核酸の回収方
法において、上記第３工程で使用する核酸結合性固相
は、二酸化ケイ素を含有する物質であることを特徴とす
る核酸の回収方法。
【請求項１７】核酸を含有する材料から核酸を回収する
核酸の回収方法装置において、核酸と核酸の固相への結合を促進する物質を混合する第
１の手段と、混合液と核酸結合性固相とを接触させる第２の手段と、核酸が結合した固相と液体とを分離する第３の手段と、核酸が結合した固相を塩を含む溶液により洗浄する第４
の手段と、核酸を固相から溶離する第５の手段と、を備えることを
特徴とする核酸の回収装置。