JP3644641B2 - 核酸回収方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リボ核酸及びデオキシリボ核酸を含む試料から核酸を回収する方法に関する。例えば、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)及び／又はリボ核酸(ＲＮＡ)を選択的に回収できる核酸回収方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
特許文献１には、カオトロピック物質の存在下で核酸と結合する事が可能なシリカ粒子を核酸結合用固相として使用し、核酸を抽出することが開示されている。この特許文献１には、シリカ粒子の懸濁液とカオトロピック物質としてのグアニジンチオシアネート緩衝液とが入った反応容器に、核酸を含む試料を加えて混合し、核酸がシリカ粒子に結合した複合体を遠心分離により沈降させた後、上清を廃棄し、残った複合体に洗浄液を加えて洗浄し、再沈殿させた複合体をエタノール水溶液で洗浄した後にアセトンで洗浄し、アセトンを除去して乾燥した複合体に溶離用緩衝液を加えて核酸を溶離して回収する方法が記載されている。
【０００３】
また、特許文献２には、シリカ含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップによる核酸の精製方法と精製用装置が開示されている。この方法では、核酸捕捉用チップを液体吸排用可動ノズルに脱着可能に接続し、固相への核酸の結合を促進する物質と核酸含有試料との混合液を所定容器から液体吸排用可動ノズルに接続された核酸捕捉用チップ内に吸引し、核酸を固相に結合した後、核酸捕捉用チップ内の液体を排除し、次いで洗浄液を吸引、排出することにより核酸捕捉チップ内を洗浄し、洗浄後の核酸捕捉用チップ内に溶離液を吸入し、固相から溶離された核酸を含む溶離液を精製品容器に吐出する。
【０００４】
さらに、特許文献３には、核酸結合性担体によるＲＮＡの抽出精製方法が開示されている。この方法では、細胞等の生物材料に、カオトロピック物質を含む溶解液、有機溶媒からなる抽出液、および核酸結合性固相担体を酸性条件下にて添加、混合あるいは接触させることにより、生物材料に含まれるＲＮＡを固相上に吸着させ、洗浄液により固相担体を洗浄し、溶出液によりＲＮＡを溶出させる。
【０００５】
さらにまた、特許文献４には、核酸結合性担体によるリボ核酸の単離方法が開示されている。この方法では、ＲＮＡを含有する試料、カオトロピック剤を含有する酸性溶液、水溶性有機溶媒および核酸結合性担体を混合して、ＲＮＡを担体に吸着させ、担体-ＲＮＡ複合体を液相より分離し、必要に応じて担体-ＲＮＡ複合体を洗浄し、ＲＮＡを担体-ＲＮＡ複合体から溶出する。
【０００６】
【特許文献１】
特許2680462号
【特許文献２】
特開平11-266864号公報
【特許文献３】
特開平9-327291号公報
【特許文献４】
特開平11-196869号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
特許文献１記載の方法及び特許文献２記載の方法は、ＤＮＡとＲＮＡが混在した状態で回収される。このため、ＤＮＡを単独で得るために更なる分離、或いは、酵素処理等が必要となる。
【０００８】
また、特許文献３記載の方法及び特許文献４記載の方法は、一連の工程においてＤＮＡが未吸着成分として除去されるため、同一サンプルからＲＮＡの単離とともにＤＮＡを単離することができない。
【０００９】
特許文献１乃至４記載の方法では、いずれにおいても一つのサンプルから、ＲＮＡを含まない精製されたＤＮＡ溶液を得るためには、ＲＮＡを除去するための特別な処理を必要とする。言い換えれば、特許文献１乃至４記載の方法では、同一サンプルを小分けして複数のプロトコルを使用して、ＤＮＡとＲＮＡの回収をそれぞれ別途行う必要性が生じる。このように、従来においては、一つのサンプルからＤＮＡやＲＮＡを単離精製する必要がある場合、非常に煩雑な処理を必要としており、効率が非常に悪かった。
【００１０】
そこで本発明は、リボ核酸及びデオキシリボ核酸を含む試料から効率よくデオキシリボ核酸及び／又はリボ核酸を回収することができる核酸回収方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を捕捉した核酸捕捉物質に、低温の溶離液を接触させる核酸回収方法に関する。溶離液によるＲＮＡ及びＤＮＡの回収率は、溶離液の温度により変化するが、低温の溶離液では、ＤＮＡの回収率がＲＮＡの回収率に比べて飛躍的に大きい。これにより、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料から、ＤＮＡを効率的に回収できる。
【００１２】
また、本発明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを捕捉した核酸捕捉物質に、第１の溶離液を接触させ、その後、第１の溶離液より高温の第２溶離液を接触させる核酸回収方法に関する。第１の溶離液により、主に核酸捕捉物質からＤＮＡが溶離され、核酸捕捉物質には主にＲＮＡが捕捉される。そして、第２の溶離液により、核酸捕捉物質から主にＲＮＡが溶離される。これにより、一の試料から、ＤＮＡとＲＮＡを選択的に回収できる。
【００１３】
また、本発明は、主にＤＮＡが溶離された第１の溶離液にＲＮＡを減少させる試薬を添加する核酸回収方法に関する。第１の溶離液に溶離されるＲＮＡは微量である為、ＲＮＡを減少させる試薬が少量でも、高純度のＤＮＡを回収することができる。
【００１４】
また、本発明は、主にＲＮＡが溶離された第２の溶離液にＤＮＡを減少させる試薬を添加する核酸回収方法に関する。第２の溶離液に溶離されるＤＮＡは微量である為、ＤＮＡを減少させる試薬が少量でも、高純度のＲＮＡを回収することができる。
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明に係る核酸回収方法は、リボ核酸及びデオキシリボ核酸を含む試料に核酸結合性固相を接触させる第１工程と、前記試料に含まれるリボ核酸及びデオキシリボ核酸を捕捉した核酸結合性固相を第１の溶離液中にて、デオキシリボ核酸が前記核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度以上、リボ核酸が前記核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度未満である第１の温度範囲内で処理する第２工程とを含んでいる。
【００１６】
核酸回収方法の具体的なフローチャートを図１に示す。図１に示すように、核酸回収方法では、先ず、ステップ１において、核酸含有物質から核酸の遊離を促進させる。ここで核酸含有物質とは、デオキシリボ核酸（以下、ＤＮＡ）及びリボ核酸（以下、ＲＮＡ）を含む試料を意味し、例えば、全血、血清、喀痰、尿等の生体試料や培養細胞、培養細菌等の生物学的な試料、あるいは、電気泳動後のゲルに保持された状態の核酸、ＤＮＡ増幅酵素等の反応産物や粗精製状態の核酸を含む物質等を挙げることができる。なお、ここでの核酸とは、２本鎖、１本鎖、あるいは部分的に２本鎖もしくは１本鎖構造を有するＤＮＡ及びＲＮＡを含む。
【００１７】
核酸含有物質から核酸の遊離を促進させるには、核酸含有物質を含む溶液を、当該核酸含有物質から核酸が遊離しやすい条件に調製することを意味する。この条件は、特に限定されないが、例えば核酸の遊離を促進する試薬を、核酸含有物質を含む溶液に添加することで達成できる。この試薬としては、特に限定されないが、高粘度な物の使用は望ましくなく、例えばプロテアーゼＫなどのタンパク質分解酵素、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤、グアニジウム塩などのカオトロピック試薬を使用することができる。また、回収対象とする核酸がＲＮＡの場合には、ＲＮＡ分解酵素による作用を防ぐため、ＲＮａｓｅインヒビターやグアニジンチオシアネートを、核酸含有物質を含む溶液に添加することが望ましい。
【００１８】
次に、ステップ２では、ステップ１で溶液中に遊離した核酸と次のステップで当該溶液に接触させる核酸結合性固相との結合を促進させる試薬を、ステップ１で調製した溶液中に添加する。ステップ２で使用する試薬としては、特に限定されないが、核酸結合性固相がシリカを含有する場合には特にカオトロピック試薬（例えば、グアニジン-HCl）を使用することが好ましい。また、ステップ２では、核酸回収方法の回収対象がＲＮＡの場合、ステップ１と同様の理由からグアニジンチオシアネートを添加することが望ましく、グアニジンチオシアネートの最終濃度を３ｍｏｌ／Ｌ以上とし且つ最終ｐＨを酸性とすることが望ましい。あるいは、特許文献１に記載されているように、ステップ１とステップ２を一括して行うこともできる。
【００１９】
次に、ステップ３では、ステップ２で調製した溶液と核酸結合性固相とを接触させる。核酸結合性固相としては、核酸を表面に固定することができる物質であれば特に限定されないが、例えば、ガラス粒子、シリカ粒子、石英濾紙及びその破砕物、石英ウール、珪藻土等の酸化ケイ素を含む物質、あるいはプラスチック等の表面にシリカを被覆した物等を使用することができる。特に核酸結合性固相としては、シリカ、すなわち二酸化ケイ素を含有するものが望ましい。
【００２０】
核酸結合性固相を粒子状又は顆粒状として使用する場合、ステップ３では、ステップ２で調製した溶液中に当該粒子又は顆粒を混合し、攪拌することで、ステップ２で調製した溶液と核酸結合性固相とを接触させることができる。一方、核酸結合性固相として図２に示すような核酸捕捉チップ１００内に配設して用いる場合、ステップ３では、核酸捕捉チップ１００内部にステップ２で調製した溶液を繰り返し吸引・排出することで、ステップ２で調製した溶液と核酸結合性固相とを接触させることができる。
【００２１】
具体的に、核酸捕捉チップ１００は、図２に示すように、頭部１０３を組み合わせて使用するピペットノズル（図示しない）に気密に嵌合される内径を有しており、下方が先端１０４に向けて徐々に内径が細くなるように形成され、先端側に核酸結合性固相１０２を備えている。また、核酸捕捉チップ１００の先端側には、核酸結合性固相１０２が流出することを防止するため、および、核酸結合性固相１０２の平均間隔を規定するための円板状の阻止部材１０１ａを圧入により配設し、頭部１０３の側には円板状の阻止部材１０１ｂを核酸結合性固相１０２が所定の平均間隔を取るように配設している。これらの阻止部材１０１ａ，１０１ｂは、液体及び気体が容易に通過し得る多数の孔を有するが、その孔は核酸結合性固相１０２の流出を阻止できる大きさである。
【００２２】
核酸捕捉チップ１００は透明もしくは半透明な合成樹脂からなる。阻止部材１０１ａ，１０１ｂの材質としては、直径約０．１ｍｍの石英粒子を核酸捕捉用チップ１００の所定の位置の内径に合わせた形状に焼結させたものを用いる。核酸結合性固相１０２としては、例えば石英ウール（東芝ケミカル製、グレードＢ）を用いる。
【００２３】
次に、ステップ４では、核酸結合性固相と溶液とを分離し、核酸結合性固相を洗浄する。粒子状又は顆粒状の核酸結合性固相を用いた場合には、ステップ３で混合攪拌した後、例えば、吸引装置等で溶液のみを除去し、核酸結合性固相と溶液とを分離することができる。核酸捕捉チップ１００内部に配設された核酸結合性固相を用いた場合には、核酸捕捉チップ１００内部に溜まった溶液を排出することで核酸結合性固相と溶液とを分離することができる。
【００２４】
また、ステップ４では、核酸結合性固相と溶液とを分離した後、核酸結合性固相を洗浄する。核酸結合性固相を洗浄する際には、洗浄用の試薬を核酸結合性固相に接触させる。洗浄用の試薬としては、特に限定されないが、例えば、核酸結合性固相に対する核酸の結合を維持しつつ、ステップ１及びステップ２で添加した試薬を核酸結合性固相から除去できるものであればよい。洗浄用の試薬としては、例えば、エチルアルコール及びイソプロピルアルコール等を７０％以上の濃度とした溶液を使用することができる。また、本方法によって回収された核酸をＰＣＲ等に利用する際には、洗浄用の試薬に含まれるエチルアルコール及びイソプロピルアルコール等を、洗浄効果を有する範囲で可能な限り低濃度とすることが好ましい。これにより、ＰＣＲの際に、洗浄用の試薬に含まれるエチルアルコール及びイソプロピルアルコール等が悪影響を与えるようなことを防止できる。例えば、洗浄用の試薬としては、２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウムを含む５０％エチルアルコールを用いることが好ましい。洗浄用の試薬として、２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウムを含む５０％エチルアルコールを用いることで、ＰＣＲの際に、洗浄用の試薬に含まれる成分が悪影響を与えるようなことを防止できる。
【００２５】
次に、ステップ５では、ステップ４で洗浄した核酸結合性固相から核酸を溶離する。ステップ５では、先ず、ステップ４で洗浄した核酸結合性固相を第１の溶離液に接触させ、ＤＮＡが核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度以上で、ＲＮＡが前記核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度未満の温度範囲（以下、第１の温度範囲と呼ぶ）で処理する。このとき、第１の溶離液としては、核酸結合性固相からＤＮＡを溶離する作用を有する限り特に限定されず、従来公知の溶離液を使用することができる。第１の溶離液としては、例えば、低塩濃度の水溶液や純水を使用することができる。特に、第１の溶離液としては、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス(ｐＨ８．５)、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡからなる溶液を使用することが好ましい。
【００２６】
ステップ５では、第１の温度範囲で第１の溶離液中の核酸結合性固相を処理することによって、主として、当該核酸結合性固相に結合した核酸のうちＤＮＡを溶離させる。ステップ５では、第１の温度範囲で第１の溶離液中の核酸結合性固相を処理することによって、核酸結合性固相に結合した大部分のＲＮＡの核酸結合性固相に対する結合を維持できる。したがって、ステップ５を行うことによって、第１の溶離液中は、核酸結合性固相に結合した核酸のうちＤＮＡを主として含むこととなる。ここで得られたＤＮＡを主として含む溶液は、そのままでも次工程の処理に供することが出来るが、ＤＮＡ分解酵素を含まないＲＮＡ分解酵素を添加し、より高純度のＤＮＡ溶液を得ることも可能である。この際に使用するＲＮＡ分解酵素としては、リボヌクレアーゼＡが望ましい。また、この際に主としてＤＮＡを含むため、ＲＮＡ分解酵素の添加量を減らすことが可能である。
【００２７】
本発明者は、ＤＮＡ及びＲＮＡと核酸結合性固相との結合特性に関する新規な知見として、核酸結合性固相からのＤＮＡの溶離に適した温度範囲は、核酸結合性固相からのＲＮＡの溶離に適した温度範囲より有意に低いことを見いだしている。したがって、上述した第１の温度範囲で処理することによって、ＤＮＡを選択的に溶離させることができる。
【００２８】
ここで、ＤＮＡが核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度以上で、ＲＮＡが前記核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度未満の温度範囲（第１の温度範囲）とは、核酸結合性固相に結合したＲＮＡの溶離率が１０％以下であるような温度範囲を意味する。より具体的に第１の温度範囲は、４℃以上、２０℃以下の温度範囲であること好ましく、１５℃以上、２０℃以下の温度範囲がより好ましい。
【００２９】
さらに、ここで、第１の温度範囲とは、等量のＤＮＡとＲＮＡが結合した核酸結合性固相を用い、標準的な溶離液（ＥＤＴＡ及びトリスを含む溶液）中で温度条件を変えて核酸を溶離させたときに、溶離液中に含まれるＲＮＡ含量がＤＮＡ含量と比較して５０％以下であるような温度範囲と定義することもできる。
【００３０】
回収対象の核酸がＤＮＡである場合には、以上のステップ１〜５によって最終的にＲＮＡを殆ど含まず、ＤＮＡを主とする溶液を得ることができる。また、ＤＮＡ及びＲＮＡを選択的に回収する場合やＤＮＡを含まない状態でＲＮＡを回収する場合には、ステップ６を行う。
【００３１】
ステップ６では、ステップ５でＤＮＡの大部分を溶離させた核酸結合性固相を第２の溶離液に加え、ＲＮＡが前記核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度以上の温度範囲（以下、第２の温度範囲と呼ぶ）で処理する。このとき、ステップ５の処理が終わった核酸結合性固相を、ステップ４と同様にして洗浄した後にステップ６の処理を行っても良いが、洗浄処理を行わずにステップ６を行っても良い。
【００３２】
第２の溶離液としては、核酸結合性固相からＲＮＡを溶離する作用を有する限り特に限定されず、第１の溶離液と同様に従来公知の溶離液を使用することができる。また、第２の溶離液は第１の溶離液と同成分のものを用いても良い。第２の溶離液としては、例えば、低塩濃度の水溶液や純水を使用することができる。特に第２の溶離液としては、１０ｍｍｏｌ／Ｌビシン(ｐＨ８．５)、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡからなる溶液を使用することが好ましい。
【００３３】
ここで、第２の温度範囲とは、核酸結合性固相に結合したＲＮＡの溶離率が７０％以上であるような温度範囲を意味する。より具体的に第２の温度範囲は、４０℃以上であることが好ましく、４０℃〜７０℃の温度範囲であることがより好ましい。ステップ６においては、８０℃以下の温度で処理することによって、ＲＮＡや核酸結合性固相の分解を防止することができる。
【００３４】
ステップ６では、第２の溶離液中で核酸結合性固相を第２の温度範囲で処理することによって、主として、当該核酸結合性固相に結合したＲＮＡを溶離することができる。このとき、ステップ５の処理で核酸結合性固相から溶離しないで結合したままのＤＮＡを、ステップ６でも溶離することとなるが、ステップ５の処理で十分にＤＮＡを溶離させることによって、ステップ６の処理によって得られる溶液中は主としてＲＮＡを含むこととなる。ここで得られたＲＮＡを主として含む溶液は、そのままでも次工程の処理に供することが出来るが、ＲＮＡ分解酵素を含まないＤＮＡ分解酵素を添加し、より高純度のＲＮＡ溶液を得ることも可能である。この際に使用するＤＮＡ分解酵素としては、デオキシリボヌクレアーゼＩが望ましい。また、この際に主としてＲＮＡを含むため、ＤＮＡ分解酵素の添加量を減らすことが可能である。
【００３５】
上述したように、ステップ５及び６を行うことによって、同一の核酸含有物質から一連の工程にてＤＮＡ及びＲＮＡを選択的に回収することができる。すなわち、１の核酸含有試料を、ＤＮＡ回収用とＲＮＡ回収用に分けなくとも良い。したがって、ステップ１で使用できる核酸含有物質が微量であってもＤＮＡ及びＲＮＡを確実に選択的に回収することができる。
【００３６】
一方、ステップ５及びステップ６における処理は、例えば、図３に示すように、温度制御された処理容器２０内で行うことができる。処理容器２０は、温度制御ブロック２１に形成された凹部に配設されており、内部に溶液を保持することができる。また、処理容器２０は、図１に示した核酸捕捉チップ１００を内部に入れることができる。処理容器２０の内部は、温度制御ブロック２１により温度制御されるため、所望の温度の溶液を溜めることができる。
【００３７】
なお、処理容器２０は、内部の液体を保持できれば如何なる材料から形成されていても良いが、熱伝導率の高い材料から形成されることが好ましい。さらに処理容器２０は、内に溜めた液体に対して、温度制御ブロック２１からの熱を効率よく伝達するために薄く成形されることが好ましい。
【００３８】
また、温度制御ブロック２１には、ペルチェ素子等からなる熱源２２が接触している。温度制御ブロック２１は、熱源２２により所望の温度に調節される。熱源２２は、制御装置２３により温度が制御され、所望の温度に設定される。さらに、温度制御ブロック２１には、温度センサ２４が取り付けられている。制御装置２３は、温度センサ２４が測定した温度制御ブロック２１の温度に基づいて、温度制御ブロック２１の温度をフィードバック制御する。
【００３９】
なお、温度制御ブロック２１の材料としては、特に限定されないが、熱伝導率の優れた材料、例えば金属材料等を使用することができる。また、温度制御ブロック２１は、熱源２２により温度制御可能な不定形物質からなるものであっても良い。また、処理容器内の液体を室温以下に制御しない場合、熱源２２は、ヒータ機能のみを有するものであっても良い。
【００４０】
以上のように、例えば、図３に示したように温度制御された処理容器２０内に第１の溶離液や第２の溶離液を注入し、厳密な温度管理のもとでステップ５及び６を行うことで、上述したように、ＤＮＡ及びＲＮＡを選択的に回収することができる。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
本例では、図２に示した核酸捕捉チップ１００を用いてＤＮＡ及びＲＮＡを捕捉し、その後、溶離温度を変えてＤＮＡ及びＲＮＡの回収を行った。
ＤＮＡ回収用の処理用試料は、Ｂ型肝炎患者の血清を使用した。血清 200μＬに第一試薬 700μＬを添加し、攪拌した後、室温で10分間放置し、ウイルスの溶解を行った。なお、ここで第一試薬には、８％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＬＫＢ製）、５.５ｍｏｌ／Ｌ グアニジンチオシアン酸塩（和光純薬工業(株)製、生化学用）を含むＭＥＳ（２−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ：２−モルホリノエタンスルホン酸、(株)同仁化学研究所製）緩衝液を使用した。
【００４２】
10分間の放置後、第二試薬 100μＬを添加し、攪拌した後、シリンジに取り付けられた図２に示した核酸捕捉チップ１００により２０回の吸引吐出を行った。この際、吸引時には混合液の液面が阻止部材１０１ａを、吐出時には阻止部材１０１ｂを通過しないよう操作を行なった。なお、ここで第二試薬には、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＬＫＢ製）、５.０ｍｏｌ／Ｌ グアニジンチオシアン酸塩（和光純薬工業(株)製、生化学用）を含むＭＥＳ（(株)同仁化学研究所製）緩衝液を使用した。
【００４３】
２０回の吸引吐出後、シリンジ操作により核酸捕捉用チップより混合液の液面が阻止部材１０１ｂを通過しない状態まで廃液操作を行った。混合液の廃液後、シリンジ操作により核酸捕捉チップ１００により、第二試薬 900μＬ 5回の吸引吐出操作を行った。この際、吸引時には混合液の液面が阻止部材１０１ａを、吐出時には阻止部材１０１ｂを通過しないよう操作を行った。第二試薬の廃液後、シリンジ操作により核酸捕捉チップ１００により、第三試薬 900μＬ 5回の吸引吐出操作を行った。ここで、第三試薬には、２５ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸カリウム（和光純薬工業(株)製、試薬特級）を含む５０％エタノール（和光純薬工業(株)製、試薬特級）を使用した。
【００４４】
５回の吸引吐出後、シリンジ操作により核酸捕捉チップ１００から全液体を廃液し、更に、排気操作により、核酸捕捉チップ１００内部に残存する溶液を除去した。除去後、上記第三試薬による洗浄を再度繰り返し行った。２回目の排気操作後、シリンジ操作により核酸捕捉チップ１００に、ブロックインキュベータ（図３）により所定の温度に制御した第１の溶離液 60μＬ 20回の吸引吐出操作を行った。ここで、第１の溶離液には、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ エチレンジアミン四酢酸（(株)ニッポンジーン製、遺伝子工学研究用）を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（(株)同仁化学研究所製）緩衝液（ｐＨ８．５）を使用した。そして、20回の吸引吐出操作の後、第１の溶離液中に含まれるＤＮＡの濃度を測定し、ＤＮＡの溶離率を算出した。
【００４５】
一方、ＲＮＡ回収用の処理試料は、Ｃ型肝炎患者の血清を使用し、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の回収と同様の処理手順で行った。なお、ＲＮＡ回収に際しては、第１の溶離液に代えて、第２の溶離液を用いた。第２の溶離液には、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ エチレンジアミン四酢酸（(株)ニッポンジーン製、遺伝子工学研究用）を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ ビシン（(株)同仁化学研究所製）緩衝液（ｐＨ８．５）を使用した。そして、第２の溶離液中に含まれるＲＮＡの濃度を測定し、ＲＮＡの溶離率を算出した。
【００４６】
第１の溶離液の温度とＤＮＡの溶離率との関係及び、第２の溶離液の温度とＲＮＡの溶離率との関係を図４に示す。なお、図４では、第１の溶離液の温度とＤＮＡの溶離率との関係を破線で示し、第２の溶離液の温度とＲＮＡの溶離率との関係を実線で示している。
【００４７】
図４に示すように、ＤＮＡとＲＮＡとでは、核酸結合性固相からの溶離に際して適切な温度範囲が異なることが明らかとなった。特に、ＤＮＡは比較的低温で溶離を開始するのに対して、ＲＮＡは比較的高温で溶離を開始することが明らかとなった。したがって、ＤＮＡが核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度以上、ＲＮＡが核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度未満で、核酸を結合させた核酸結合性固相を処理することによって、第１の溶離液中に主としてＤＮＡを回収できることが判った。また、ＤＮＡを回収した後の核酸結合性固相を、ＲＮＡが核酸結合性固相から溶離しうる温度以上で処理することによって、第２の溶離液中に主としてＲＮＡを回収できることが明らかとなった。
【００４８】
これらの結果から、ＤＮＡとＲＮＡが含まれる試料に対して核酸結合性固相を接触させ、当該核酸結合性固相にＤＮＡ及びＲＮＡが捕捉された場合であっても、溶離液の温度を制御することによって、ＤＮＡ及びＲＮＡを選択的に回収できることが明らかとなった。
【００４９】
特に、図４から判るように、ＤＮＡ及びＲＮＡが捕捉された核酸結合性固相を溶離液中で４℃以上２０℃以下の温度で処理することによって、主としてＤＮＡを回収できることが判る。さらに、図４から判るように、ＤＮＡを回収した後の核酸結合性固相を溶離液中で４０℃以上で処理することによって、当該核酸結合性固相に捕捉されているＲＮＡを回収できることが判る。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、デオキシリボ核酸及びリボ核酸を含む試料からデオキシリボ核酸及び／又はリボ核酸を効率的に回収できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を適用した核酸回収方法を示すフローチャートである。
【図２】核酸捕捉チップの断面図である。
【図３】核酸結合性固相に捕捉した核酸を溶離する際に使用する装置の構成を概略的に示す図である。
【図４】ＤＮＡ及びＲＮＡの溶離率と温度との関係を示す特性図である。
【符号の説明】
１００…核酸捕捉チップ、１０２…核酸結合性固相
【発明の属する技術分野】
本発明は、リボ核酸及びデオキシリボ核酸を含む試料から核酸を回収する方法に関する。例えば、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)及び／又はリボ核酸(ＲＮＡ)を選択的に回収できる核酸回収方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
特許文献１には、カオトロピック物質の存在下で核酸と結合する事が可能なシリカ粒子を核酸結合用固相として使用し、核酸を抽出することが開示されている。この特許文献１には、シリカ粒子の懸濁液とカオトロピック物質としてのグアニジンチオシアネート緩衝液とが入った反応容器に、核酸を含む試料を加えて混合し、核酸がシリカ粒子に結合した複合体を遠心分離により沈降させた後、上清を廃棄し、残った複合体に洗浄液を加えて洗浄し、再沈殿させた複合体をエタノール水溶液で洗浄した後にアセトンで洗浄し、アセトンを除去して乾燥した複合体に溶離用緩衝液を加えて核酸を溶離して回収する方法が記載されている。
【０００３】
また、特許文献２には、シリカ含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップによる核酸の精製方法と精製用装置が開示されている。この方法では、核酸捕捉用チップを液体吸排用可動ノズルに脱着可能に接続し、固相への核酸の結合を促進する物質と核酸含有試料との混合液を所定容器から液体吸排用可動ノズルに接続された核酸捕捉用チップ内に吸引し、核酸を固相に結合した後、核酸捕捉用チップ内の液体を排除し、次いで洗浄液を吸引、排出することにより核酸捕捉チップ内を洗浄し、洗浄後の核酸捕捉用チップ内に溶離液を吸入し、固相から溶離された核酸を含む溶離液を精製品容器に吐出する。
【０００４】
さらに、特許文献３には、核酸結合性担体によるＲＮＡの抽出精製方法が開示されている。この方法では、細胞等の生物材料に、カオトロピック物質を含む溶解液、有機溶媒からなる抽出液、および核酸結合性固相担体を酸性条件下にて添加、混合あるいは接触させることにより、生物材料に含まれるＲＮＡを固相上に吸着させ、洗浄液により固相担体を洗浄し、溶出液によりＲＮＡを溶出させる。
【０００５】
さらにまた、特許文献４には、核酸結合性担体によるリボ核酸の単離方法が開示されている。この方法では、ＲＮＡを含有する試料、カオトロピック剤を含有する酸性溶液、水溶性有機溶媒および核酸結合性担体を混合して、ＲＮＡを担体に吸着させ、担体-ＲＮＡ複合体を液相より分離し、必要に応じて担体-ＲＮＡ複合体を洗浄し、ＲＮＡを担体-ＲＮＡ複合体から溶出する。
【０００６】
【特許文献１】
特許2680462号
【特許文献２】
特開平11-266864号公報
【特許文献３】
特開平9-327291号公報
【特許文献４】
特開平11-196869号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
特許文献１記載の方法及び特許文献２記載の方法は、ＤＮＡとＲＮＡが混在した状態で回収される。このため、ＤＮＡを単独で得るために更なる分離、或いは、酵素処理等が必要となる。
【０００８】
また、特許文献３記載の方法及び特許文献４記載の方法は、一連の工程においてＤＮＡが未吸着成分として除去されるため、同一サンプルからＲＮＡの単離とともにＤＮＡを単離することができない。
【０００９】
特許文献１乃至４記載の方法では、いずれにおいても一つのサンプルから、ＲＮＡを含まない精製されたＤＮＡ溶液を得るためには、ＲＮＡを除去するための特別な処理を必要とする。言い換えれば、特許文献１乃至４記載の方法では、同一サンプルを小分けして複数のプロトコルを使用して、ＤＮＡとＲＮＡの回収をそれぞれ別途行う必要性が生じる。このように、従来においては、一つのサンプルからＤＮＡやＲＮＡを単離精製する必要がある場合、非常に煩雑な処理を必要としており、効率が非常に悪かった。
【００１０】
そこで本発明は、リボ核酸及びデオキシリボ核酸を含む試料から効率よくデオキシリボ核酸及び／又はリボ核酸を回収することができる核酸回収方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を捕捉した核酸捕捉物質に、低温の溶離液を接触させる核酸回収方法に関する。溶離液によるＲＮＡ及びＤＮＡの回収率は、溶離液の温度により変化するが、低温の溶離液では、ＤＮＡの回収率がＲＮＡの回収率に比べて飛躍的に大きい。これにより、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料から、ＤＮＡを効率的に回収できる。
【００１２】
また、本発明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを捕捉した核酸捕捉物質に、第１の溶離液を接触させ、その後、第１の溶離液より高温の第２溶離液を接触させる核酸回収方法に関する。第１の溶離液により、主に核酸捕捉物質からＤＮＡが溶離され、核酸捕捉物質には主にＲＮＡが捕捉される。そして、第２の溶離液により、核酸捕捉物質から主にＲＮＡが溶離される。これにより、一の試料から、ＤＮＡとＲＮＡを選択的に回収できる。
【００１３】
また、本発明は、主にＤＮＡが溶離された第１の溶離液にＲＮＡを減少させる試薬を添加する核酸回収方法に関する。第１の溶離液に溶離されるＲＮＡは微量である為、ＲＮＡを減少させる試薬が少量でも、高純度のＤＮＡを回収することができる。
【００１４】
また、本発明は、主にＲＮＡが溶離された第２の溶離液にＤＮＡを減少させる試薬を添加する核酸回収方法に関する。第２の溶離液に溶離されるＤＮＡは微量である為、ＤＮＡを減少させる試薬が少量でも、高純度のＲＮＡを回収することができる。
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明に係る核酸回収方法は、リボ核酸及びデオキシリボ核酸を含む試料に核酸結合性固相を接触させる第１工程と、前記試料に含まれるリボ核酸及びデオキシリボ核酸を捕捉した核酸結合性固相を第１の溶離液中にて、デオキシリボ核酸が前記核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度以上、リボ核酸が前記核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度未満である第１の温度範囲内で処理する第２工程とを含んでいる。
【００１６】
核酸回収方法の具体的なフローチャートを図１に示す。図１に示すように、核酸回収方法では、先ず、ステップ１において、核酸含有物質から核酸の遊離を促進させる。ここで核酸含有物質とは、デオキシリボ核酸（以下、ＤＮＡ）及びリボ核酸（以下、ＲＮＡ）を含む試料を意味し、例えば、全血、血清、喀痰、尿等の生体試料や培養細胞、培養細菌等の生物学的な試料、あるいは、電気泳動後のゲルに保持された状態の核酸、ＤＮＡ増幅酵素等の反応産物や粗精製状態の核酸を含む物質等を挙げることができる。なお、ここでの核酸とは、２本鎖、１本鎖、あるいは部分的に２本鎖もしくは１本鎖構造を有するＤＮＡ及びＲＮＡを含む。
【００１７】
核酸含有物質から核酸の遊離を促進させるには、核酸含有物質を含む溶液を、当該核酸含有物質から核酸が遊離しやすい条件に調製することを意味する。この条件は、特に限定されないが、例えば核酸の遊離を促進する試薬を、核酸含有物質を含む溶液に添加することで達成できる。この試薬としては、特に限定されないが、高粘度な物の使用は望ましくなく、例えばプロテアーゼＫなどのタンパク質分解酵素、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤、グアニジウム塩などのカオトロピック試薬を使用することができる。また、回収対象とする核酸がＲＮＡの場合には、ＲＮＡ分解酵素による作用を防ぐため、ＲＮａｓｅインヒビターやグアニジンチオシアネートを、核酸含有物質を含む溶液に添加することが望ましい。
【００１８】
次に、ステップ２では、ステップ１で溶液中に遊離した核酸と次のステップで当該溶液に接触させる核酸結合性固相との結合を促進させる試薬を、ステップ１で調製した溶液中に添加する。ステップ２で使用する試薬としては、特に限定されないが、核酸結合性固相がシリカを含有する場合には特にカオトロピック試薬（例えば、グアニジン-HCl）を使用することが好ましい。また、ステップ２では、核酸回収方法の回収対象がＲＮＡの場合、ステップ１と同様の理由からグアニジンチオシアネートを添加することが望ましく、グアニジンチオシアネートの最終濃度を３ｍｏｌ／Ｌ以上とし且つ最終ｐＨを酸性とすることが望ましい。あるいは、特許文献１に記載されているように、ステップ１とステップ２を一括して行うこともできる。
【００１９】
次に、ステップ３では、ステップ２で調製した溶液と核酸結合性固相とを接触させる。核酸結合性固相としては、核酸を表面に固定することができる物質であれば特に限定されないが、例えば、ガラス粒子、シリカ粒子、石英濾紙及びその破砕物、石英ウール、珪藻土等の酸化ケイ素を含む物質、あるいはプラスチック等の表面にシリカを被覆した物等を使用することができる。特に核酸結合性固相としては、シリカ、すなわち二酸化ケイ素を含有するものが望ましい。
【００２０】
核酸結合性固相を粒子状又は顆粒状として使用する場合、ステップ３では、ステップ２で調製した溶液中に当該粒子又は顆粒を混合し、攪拌することで、ステップ２で調製した溶液と核酸結合性固相とを接触させることができる。一方、核酸結合性固相として図２に示すような核酸捕捉チップ１００内に配設して用いる場合、ステップ３では、核酸捕捉チップ１００内部にステップ２で調製した溶液を繰り返し吸引・排出することで、ステップ２で調製した溶液と核酸結合性固相とを接触させることができる。
【００２１】
具体的に、核酸捕捉チップ１００は、図２に示すように、頭部１０３を組み合わせて使用するピペットノズル（図示しない）に気密に嵌合される内径を有しており、下方が先端１０４に向けて徐々に内径が細くなるように形成され、先端側に核酸結合性固相１０２を備えている。また、核酸捕捉チップ１００の先端側には、核酸結合性固相１０２が流出することを防止するため、および、核酸結合性固相１０２の平均間隔を規定するための円板状の阻止部材１０１ａを圧入により配設し、頭部１０３の側には円板状の阻止部材１０１ｂを核酸結合性固相１０２が所定の平均間隔を取るように配設している。これらの阻止部材１０１ａ，１０１ｂは、液体及び気体が容易に通過し得る多数の孔を有するが、その孔は核酸結合性固相１０２の流出を阻止できる大きさである。
【００２２】
核酸捕捉チップ１００は透明もしくは半透明な合成樹脂からなる。阻止部材１０１ａ，１０１ｂの材質としては、直径約０．１ｍｍの石英粒子を核酸捕捉用チップ１００の所定の位置の内径に合わせた形状に焼結させたものを用いる。核酸結合性固相１０２としては、例えば石英ウール（東芝ケミカル製、グレードＢ）を用いる。
【００２３】
次に、ステップ４では、核酸結合性固相と溶液とを分離し、核酸結合性固相を洗浄する。粒子状又は顆粒状の核酸結合性固相を用いた場合には、ステップ３で混合攪拌した後、例えば、吸引装置等で溶液のみを除去し、核酸結合性固相と溶液とを分離することができる。核酸捕捉チップ１００内部に配設された核酸結合性固相を用いた場合には、核酸捕捉チップ１００内部に溜まった溶液を排出することで核酸結合性固相と溶液とを分離することができる。
【００２４】
また、ステップ４では、核酸結合性固相と溶液とを分離した後、核酸結合性固相を洗浄する。核酸結合性固相を洗浄する際には、洗浄用の試薬を核酸結合性固相に接触させる。洗浄用の試薬としては、特に限定されないが、例えば、核酸結合性固相に対する核酸の結合を維持しつつ、ステップ１及びステップ２で添加した試薬を核酸結合性固相から除去できるものであればよい。洗浄用の試薬としては、例えば、エチルアルコール及びイソプロピルアルコール等を７０％以上の濃度とした溶液を使用することができる。また、本方法によって回収された核酸をＰＣＲ等に利用する際には、洗浄用の試薬に含まれるエチルアルコール及びイソプロピルアルコール等を、洗浄効果を有する範囲で可能な限り低濃度とすることが好ましい。これにより、ＰＣＲの際に、洗浄用の試薬に含まれるエチルアルコール及びイソプロピルアルコール等が悪影響を与えるようなことを防止できる。例えば、洗浄用の試薬としては、２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウムを含む５０％エチルアルコールを用いることが好ましい。洗浄用の試薬として、２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウムを含む５０％エチルアルコールを用いることで、ＰＣＲの際に、洗浄用の試薬に含まれる成分が悪影響を与えるようなことを防止できる。
【００２５】
次に、ステップ５では、ステップ４で洗浄した核酸結合性固相から核酸を溶離する。ステップ５では、先ず、ステップ４で洗浄した核酸結合性固相を第１の溶離液に接触させ、ＤＮＡが核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度以上で、ＲＮＡが前記核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度未満の温度範囲（以下、第１の温度範囲と呼ぶ）で処理する。このとき、第１の溶離液としては、核酸結合性固相からＤＮＡを溶離する作用を有する限り特に限定されず、従来公知の溶離液を使用することができる。第１の溶離液としては、例えば、低塩濃度の水溶液や純水を使用することができる。特に、第１の溶離液としては、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス(ｐＨ８．５)、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡからなる溶液を使用することが好ましい。
【００２６】
ステップ５では、第１の温度範囲で第１の溶離液中の核酸結合性固相を処理することによって、主として、当該核酸結合性固相に結合した核酸のうちＤＮＡを溶離させる。ステップ５では、第１の温度範囲で第１の溶離液中の核酸結合性固相を処理することによって、核酸結合性固相に結合した大部分のＲＮＡの核酸結合性固相に対する結合を維持できる。したがって、ステップ５を行うことによって、第１の溶離液中は、核酸結合性固相に結合した核酸のうちＤＮＡを主として含むこととなる。ここで得られたＤＮＡを主として含む溶液は、そのままでも次工程の処理に供することが出来るが、ＤＮＡ分解酵素を含まないＲＮＡ分解酵素を添加し、より高純度のＤＮＡ溶液を得ることも可能である。この際に使用するＲＮＡ分解酵素としては、リボヌクレアーゼＡが望ましい。また、この際に主としてＤＮＡを含むため、ＲＮＡ分解酵素の添加量を減らすことが可能である。
【００２７】
本発明者は、ＤＮＡ及びＲＮＡと核酸結合性固相との結合特性に関する新規な知見として、核酸結合性固相からのＤＮＡの溶離に適した温度範囲は、核酸結合性固相からのＲＮＡの溶離に適した温度範囲より有意に低いことを見いだしている。したがって、上述した第１の温度範囲で処理することによって、ＤＮＡを選択的に溶離させることができる。
【００２８】
ここで、ＤＮＡが核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度以上で、ＲＮＡが前記核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度未満の温度範囲（第１の温度範囲）とは、核酸結合性固相に結合したＲＮＡの溶離率が１０％以下であるような温度範囲を意味する。より具体的に第１の温度範囲は、４℃以上、２０℃以下の温度範囲であること好ましく、１５℃以上、２０℃以下の温度範囲がより好ましい。
【００２９】
さらに、ここで、第１の温度範囲とは、等量のＤＮＡとＲＮＡが結合した核酸結合性固相を用い、標準的な溶離液（ＥＤＴＡ及びトリスを含む溶液）中で温度条件を変えて核酸を溶離させたときに、溶離液中に含まれるＲＮＡ含量がＤＮＡ含量と比較して５０％以下であるような温度範囲と定義することもできる。
【００３０】
回収対象の核酸がＤＮＡである場合には、以上のステップ１〜５によって最終的にＲＮＡを殆ど含まず、ＤＮＡを主とする溶液を得ることができる。また、ＤＮＡ及びＲＮＡを選択的に回収する場合やＤＮＡを含まない状態でＲＮＡを回収する場合には、ステップ６を行う。
【００３１】
ステップ６では、ステップ５でＤＮＡの大部分を溶離させた核酸結合性固相を第２の溶離液に加え、ＲＮＡが前記核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度以上の温度範囲（以下、第２の温度範囲と呼ぶ）で処理する。このとき、ステップ５の処理が終わった核酸結合性固相を、ステップ４と同様にして洗浄した後にステップ６の処理を行っても良いが、洗浄処理を行わずにステップ６を行っても良い。
【００３２】
第２の溶離液としては、核酸結合性固相からＲＮＡを溶離する作用を有する限り特に限定されず、第１の溶離液と同様に従来公知の溶離液を使用することができる。また、第２の溶離液は第１の溶離液と同成分のものを用いても良い。第２の溶離液としては、例えば、低塩濃度の水溶液や純水を使用することができる。特に第２の溶離液としては、１０ｍｍｏｌ／Ｌビシン(ｐＨ８．５)、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡからなる溶液を使用することが好ましい。
【００３３】
ここで、第２の温度範囲とは、核酸結合性固相に結合したＲＮＡの溶離率が７０％以上であるような温度範囲を意味する。より具体的に第２の温度範囲は、４０℃以上であることが好ましく、４０℃〜７０℃の温度範囲であることがより好ましい。ステップ６においては、８０℃以下の温度で処理することによって、ＲＮＡや核酸結合性固相の分解を防止することができる。
【００３４】
ステップ６では、第２の溶離液中で核酸結合性固相を第２の温度範囲で処理することによって、主として、当該核酸結合性固相に結合したＲＮＡを溶離することができる。このとき、ステップ５の処理で核酸結合性固相から溶離しないで結合したままのＤＮＡを、ステップ６でも溶離することとなるが、ステップ５の処理で十分にＤＮＡを溶離させることによって、ステップ６の処理によって得られる溶液中は主としてＲＮＡを含むこととなる。ここで得られたＲＮＡを主として含む溶液は、そのままでも次工程の処理に供することが出来るが、ＲＮＡ分解酵素を含まないＤＮＡ分解酵素を添加し、より高純度のＲＮＡ溶液を得ることも可能である。この際に使用するＤＮＡ分解酵素としては、デオキシリボヌクレアーゼＩが望ましい。また、この際に主としてＲＮＡを含むため、ＤＮＡ分解酵素の添加量を減らすことが可能である。
【００３５】
上述したように、ステップ５及び６を行うことによって、同一の核酸含有物質から一連の工程にてＤＮＡ及びＲＮＡを選択的に回収することができる。すなわち、１の核酸含有試料を、ＤＮＡ回収用とＲＮＡ回収用に分けなくとも良い。したがって、ステップ１で使用できる核酸含有物質が微量であってもＤＮＡ及びＲＮＡを確実に選択的に回収することができる。
【００３６】
一方、ステップ５及びステップ６における処理は、例えば、図３に示すように、温度制御された処理容器２０内で行うことができる。処理容器２０は、温度制御ブロック２１に形成された凹部に配設されており、内部に溶液を保持することができる。また、処理容器２０は、図１に示した核酸捕捉チップ１００を内部に入れることができる。処理容器２０の内部は、温度制御ブロック２１により温度制御されるため、所望の温度の溶液を溜めることができる。
【００３７】
なお、処理容器２０は、内部の液体を保持できれば如何なる材料から形成されていても良いが、熱伝導率の高い材料から形成されることが好ましい。さらに処理容器２０は、内に溜めた液体に対して、温度制御ブロック２１からの熱を効率よく伝達するために薄く成形されることが好ましい。
【００３８】
また、温度制御ブロック２１には、ペルチェ素子等からなる熱源２２が接触している。温度制御ブロック２１は、熱源２２により所望の温度に調節される。熱源２２は、制御装置２３により温度が制御され、所望の温度に設定される。さらに、温度制御ブロック２１には、温度センサ２４が取り付けられている。制御装置２３は、温度センサ２４が測定した温度制御ブロック２１の温度に基づいて、温度制御ブロック２１の温度をフィードバック制御する。
【００３９】
なお、温度制御ブロック２１の材料としては、特に限定されないが、熱伝導率の優れた材料、例えば金属材料等を使用することができる。また、温度制御ブロック２１は、熱源２２により温度制御可能な不定形物質からなるものであっても良い。また、処理容器内の液体を室温以下に制御しない場合、熱源２２は、ヒータ機能のみを有するものであっても良い。
【００４０】
以上のように、例えば、図３に示したように温度制御された処理容器２０内に第１の溶離液や第２の溶離液を注入し、厳密な温度管理のもとでステップ５及び６を行うことで、上述したように、ＤＮＡ及びＲＮＡを選択的に回収することができる。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
本例では、図２に示した核酸捕捉チップ１００を用いてＤＮＡ及びＲＮＡを捕捉し、その後、溶離温度を変えてＤＮＡ及びＲＮＡの回収を行った。
ＤＮＡ回収用の処理用試料は、Ｂ型肝炎患者の血清を使用した。血清 200μＬに第一試薬 700μＬを添加し、攪拌した後、室温で10分間放置し、ウイルスの溶解を行った。なお、ここで第一試薬には、８％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＬＫＢ製）、５.５ｍｏｌ／Ｌ グアニジンチオシアン酸塩（和光純薬工業(株)製、生化学用）を含むＭＥＳ（２−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ：２−モルホリノエタンスルホン酸、(株)同仁化学研究所製）緩衝液を使用した。
【００４２】
10分間の放置後、第二試薬 100μＬを添加し、攪拌した後、シリンジに取り付けられた図２に示した核酸捕捉チップ１００により２０回の吸引吐出を行った。この際、吸引時には混合液の液面が阻止部材１０１ａを、吐出時には阻止部材１０１ｂを通過しないよう操作を行なった。なお、ここで第二試薬には、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＬＫＢ製）、５.０ｍｏｌ／Ｌ グアニジンチオシアン酸塩（和光純薬工業(株)製、生化学用）を含むＭＥＳ（(株)同仁化学研究所製）緩衝液を使用した。
【００４３】
２０回の吸引吐出後、シリンジ操作により核酸捕捉用チップより混合液の液面が阻止部材１０１ｂを通過しない状態まで廃液操作を行った。混合液の廃液後、シリンジ操作により核酸捕捉チップ１００により、第二試薬 900μＬ 5回の吸引吐出操作を行った。この際、吸引時には混合液の液面が阻止部材１０１ａを、吐出時には阻止部材１０１ｂを通過しないよう操作を行った。第二試薬の廃液後、シリンジ操作により核酸捕捉チップ１００により、第三試薬 900μＬ 5回の吸引吐出操作を行った。ここで、第三試薬には、２５ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸カリウム（和光純薬工業(株)製、試薬特級）を含む５０％エタノール（和光純薬工業(株)製、試薬特級）を使用した。
【００４４】
５回の吸引吐出後、シリンジ操作により核酸捕捉チップ１００から全液体を廃液し、更に、排気操作により、核酸捕捉チップ１００内部に残存する溶液を除去した。除去後、上記第三試薬による洗浄を再度繰り返し行った。２回目の排気操作後、シリンジ操作により核酸捕捉チップ１００に、ブロックインキュベータ（図３）により所定の温度に制御した第１の溶離液 60μＬ 20回の吸引吐出操作を行った。ここで、第１の溶離液には、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ エチレンジアミン四酢酸（(株)ニッポンジーン製、遺伝子工学研究用）を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（(株)同仁化学研究所製）緩衝液（ｐＨ８．５）を使用した。そして、20回の吸引吐出操作の後、第１の溶離液中に含まれるＤＮＡの濃度を測定し、ＤＮＡの溶離率を算出した。
【００４５】
一方、ＲＮＡ回収用の処理試料は、Ｃ型肝炎患者の血清を使用し、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の回収と同様の処理手順で行った。なお、ＲＮＡ回収に際しては、第１の溶離液に代えて、第２の溶離液を用いた。第２の溶離液には、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ エチレンジアミン四酢酸（(株)ニッポンジーン製、遺伝子工学研究用）を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ ビシン（(株)同仁化学研究所製）緩衝液（ｐＨ８．５）を使用した。そして、第２の溶離液中に含まれるＲＮＡの濃度を測定し、ＲＮＡの溶離率を算出した。
【００４６】
第１の溶離液の温度とＤＮＡの溶離率との関係及び、第２の溶離液の温度とＲＮＡの溶離率との関係を図４に示す。なお、図４では、第１の溶離液の温度とＤＮＡの溶離率との関係を破線で示し、第２の溶離液の温度とＲＮＡの溶離率との関係を実線で示している。
【００４７】
図４に示すように、ＤＮＡとＲＮＡとでは、核酸結合性固相からの溶離に際して適切な温度範囲が異なることが明らかとなった。特に、ＤＮＡは比較的低温で溶離を開始するのに対して、ＲＮＡは比較的高温で溶離を開始することが明らかとなった。したがって、ＤＮＡが核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度以上、ＲＮＡが核酸結合性固相から効果的に溶離しうる温度未満で、核酸を結合させた核酸結合性固相を処理することによって、第１の溶離液中に主としてＤＮＡを回収できることが判った。また、ＤＮＡを回収した後の核酸結合性固相を、ＲＮＡが核酸結合性固相から溶離しうる温度以上で処理することによって、第２の溶離液中に主としてＲＮＡを回収できることが明らかとなった。
【００４８】
これらの結果から、ＤＮＡとＲＮＡが含まれる試料に対して核酸結合性固相を接触させ、当該核酸結合性固相にＤＮＡ及びＲＮＡが捕捉された場合であっても、溶離液の温度を制御することによって、ＤＮＡ及びＲＮＡを選択的に回収できることが明らかとなった。
【００４９】
特に、図４から判るように、ＤＮＡ及びＲＮＡが捕捉された核酸結合性固相を溶離液中で４℃以上２０℃以下の温度で処理することによって、主としてＤＮＡを回収できることが判る。さらに、図４から判るように、ＤＮＡを回収した後の核酸結合性固相を溶離液中で４０℃以上で処理することによって、当該核酸結合性固相に捕捉されているＲＮＡを回収できることが判る。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、デオキシリボ核酸及びリボ核酸を含む試料からデオキシリボ核酸及び／又はリボ核酸を効率的に回収できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を適用した核酸回収方法を示すフローチャートである。
【図２】核酸捕捉チップの断面図である。
【図３】核酸結合性固相に捕捉した核酸を溶離する際に使用する装置の構成を概略的に示す図である。
【図４】ＤＮＡ及びＲＮＡの溶離率と温度との関係を示す特性図である。
【符号の説明】
１００…核酸捕捉チップ、１０２…核酸結合性固相
Claims (11)
- リボ核酸回収方法であって、
少なくともリボ核酸を含む試料と核酸結合性固相とを接触させ、
リボ核酸を捕捉した核酸結合性固相と第１の溶離液とを接触させ、
核酸結合性固相と、第１の溶離液より高温の第２の溶離液とを接触させ、
第２の溶離液にリボ核酸を溶離する方法。 - 請求項１記載のリボ核酸回収方法であって、前記第１の溶離液の温度が、４℃以上２０℃以下である方法。
- 請求項１記載のリボ核酸回収方法であって、リボ核酸が溶離された第２の溶離液に、デオキシリボ核酸を減少させる試薬を混ぜる方法。
- 請求項１記載のリボ核酸回収方法であって、前記核酸結合性固相が二酸化ケイ素を含有する物質である方法。
- 請求項１記載のリボ核酸回収方法であって、前記試料に、核酸と核酸結合性固相との結合を促進させる試薬が添加されている方法。
- 請求項１記載のリボ核酸回収方法であって、前記試料に、カオトロピック試薬が添加されている方法。
- 請求項１記載のリボ核酸回収方法であって、前記第２の溶離液の温度が、４０℃以上７０℃以下である方法。
- 請求項１記載のリボ核酸回収方法であって、前記第２の溶離液の温度が、４０℃以上である方法。
- 請求項１記載のリボ核酸回収方法であって、前記第２の溶離液の温度が、８０℃以下である方法。
- 請求項１記載のリボ核酸回収方法であって、前記第１の溶離液の温度が、当該溶離液に含まれるリボ核酸含量がデオキシリボ核酸含量と比較して５０％以下となる温度である方法。
- 請求項１記載のリボ核酸回収方法であって、前記第２の溶離液の温度が、ＲＮＡの溶離率が７０％以上となる温度である方法。
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