CZ20021608A3 - Magnetické skleněné částice, metody jejich přípravy a použití - Google Patents

Magnetické skleněné částice, metody jejich přípravy a použití Download PDF

Info

Publication number
CZ20021608A3
CZ20021608A3 CZ20021608A CZ20021608A CZ20021608A3 CZ 20021608 A3 CZ20021608 A3 CZ 20021608A3 CZ 20021608 A CZ20021608 A CZ 20021608A CZ 20021608 A CZ20021608 A CZ 20021608A CZ 20021608 A3 CZ20021608 A3 CZ 20021608A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
magnetic
suspension
particles
mgp
nucleic acid
Prior art date
Application number
CZ20021608A
Other languages
English (en)
Inventor
Kurt Weindel
Michael Riedling
Albert Geiger
Original Assignee
Roche Diagnostics Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP00110165A external-priority patent/EP1154443A1/en
Application filed by Roche Diagnostics Gmbh filed Critical Roche Diagnostics Gmbh
Publication of CZ20021608A3 publication Critical patent/CZ20021608A3/cs

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/005—Pretreatment specially adapted for magnetic separation
    • B03C1/01—Pretreatment specially adapted for magnetic separation by addition of magnetic adjuvants
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y25/00—Nanomagnetism, e.g. magnetoimpedance, anisotropic magnetoresistance, giant magnetoresistance or tunneling magnetoresistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03B—MANUFACTURE, SHAPING, OR SUPPLEMENTARY PROCESSES
    • C03B19/00—Other methods of shaping glass
    • C03B19/10—Forming beads
    • C03B19/1005—Forming solid beads
    • C03B19/106—Forming solid beads by chemical vapour deposition; by liquid phase reaction
    • C03B19/1065—Forming solid beads by chemical vapour deposition; by liquid phase reaction by liquid phase reactions, e.g. by means of a gel phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C1/00—Ingredients generally applicable to manufacture of glasses, glazes, or vitreous enamels
    • C03C1/006—Ingredients generally applicable to manufacture of glasses, glazes, or vitreous enamels to produce glass through wet route
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C12/00—Powdered glass; Bead compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C14/00—Glass compositions containing a non-glass component, e.g. compositions containing fibres, filaments, whiskers, platelets, or the like, dispersed in a glass matrix
    • C03C14/004—Glass compositions containing a non-glass component, e.g. compositions containing fibres, filaments, whiskers, platelets, or the like, dispersed in a glass matrix the non-glass component being in the form of particles or flakes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C3/00—Glass compositions
    • C03C3/04—Glass compositions containing silica
    • C03C3/076—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight
    • C03C3/089—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing boron
    • C03C3/091—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing boron containing aluminium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C3/00—Glass compositions
    • C03C3/04—Glass compositions containing silica
    • C03C3/076—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight
    • C03C3/089—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing boron
    • C03C3/091—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing boron containing aluminium
    • C03C3/093—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing boron containing aluminium containing zinc or zirconium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C23—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; CHEMICAL SURFACE TREATMENT; DIFFUSION TREATMENT OF METALLIC MATERIAL; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL
    • C23C—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL BY DIFFUSION INTO THE SURFACE, BY CHEMICAL CONVERSION OR SUBSTITUTION; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL
    • C23C26/00—Coating not provided for in groups C23C2/00 - C23C24/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C23—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; CHEMICAL SURFACE TREATMENT; DIFFUSION TREATMENT OF METALLIC MATERIAL; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL
    • C23C—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL BY DIFFUSION INTO THE SURFACE, BY CHEMICAL CONVERSION OR SUBSTITUTION; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL
    • C23C30/00—Coating with metallic material characterised only by the composition of the metallic material, i.e. not characterised by the coating process
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01F—MAGNETS; INDUCTANCES; TRANSFORMERS; SELECTION OF MATERIALS FOR THEIR MAGNETIC PROPERTIES
    • H01F1/00—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties
    • H01F1/0036—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties showing low dimensional magnetism, i.e. spin rearrangements due to a restriction of dimensions, e.g. showing giant magnetoresistivity
    • H01F1/0045—Zero dimensional, e.g. nanoparticles, soft nanoparticles for medical/biological use
    • H01F1/0054—Coated nanoparticles, e.g. nanoparticles coated with organic surfactant
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01F—MAGNETS; INDUCTANCES; TRANSFORMERS; SELECTION OF MATERIALS FOR THEIR MAGNETIC PROPERTIES
    • H01F1/00—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties
    • H01F1/0036—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties showing low dimensional magnetism, i.e. spin rearrangements due to a restriction of dimensions, e.g. showing giant magnetoresistivity
    • H01F1/0045—Zero dimensional, e.g. nanoparticles, soft nanoparticles for medical/biological use
    • H01F1/0063—Zero dimensional, e.g. nanoparticles, soft nanoparticles for medical/biological use in a non-magnetic matrix, e.g. granular solids
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01F—MAGNETS; INDUCTANCES; TRANSFORMERS; SELECTION OF MATERIALS FOR THEIR MAGNETIC PROPERTIES
    • H01F1/00—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties
    • H01F1/44—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties of magnetic liquids, e.g. ferrofluids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C2214/00—Nature of the non-vitreous component
    • C03C2214/08—Metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C2214/00—Nature of the non-vitreous component
    • C03C2214/32—Nature of the non-vitreous component comprising a sol-gel process
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/101—Taqman

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Geochemistry & Mineralogy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Power Engineering (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Metallurgy (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Glass Compositions (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Glass Melting And Manufacturing (AREA)
  • Soft Magnetic Materials (AREA)
  • Hard Magnetic Materials (AREA)

Description

Magnetické skleněné částice, metody jejich přípravy a použití.
Tento vynález se vztahuje k magnetickým, v podstatě kulovitým, částicím se skleněným povrchem. Tento vynález se také vztahuje k metodám jejich přípravy, k jejich suspenzím a k jejich použití pro purifikaci biologického materiálu, zejména v automatizovaných procesech.
Mnoho biologických materiálů, zejména nukleových kyselin, skýtá při izolaci z jejich normálního prostředí výjimečné problémy. Na jedné straně jsou velmi často přítomné ve velmi malých koncentracích a na druhé straně jsou často v přítomnosti mnoha jiných pevných a rozpustných substancí, které ztěžují izolaci nebo měření, zejména při biologických analýzách.
Biospecifické vazebné analýzy umožňují detekci specifických analytů, např. nukleových kyselin nebo specifických vlastností analytů a hrají důležitou roli na poli diagnostik a bioanalytik. Příklady jsou hybridizační analýzy, immuno analýzy a analýzy typu receptor-ligand.
Hybridizační analýzy využívají pro molekulární detekci analytů nukleových kyselin, např. RNA a DNA, specifické párování baží. Oligonukleotidové sondy o délce 18 až 20 nukleotidů tak můžou umožnit specifické rozpoznání vybrané sekvence v lidském genomu.
Jiná analýza, který využívá selektivní vazby dvou oligonukleotidových primerů, je polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction, PCR) popsaná v US 4,683,195. Tato metoda využívá v několika cyklech selektivní amplifikaci specifické oblasti nukleové kyseliny termostabilní polymerázou, až do detekovatelného množství, za přítomnosti deoxynukleotidových trifosfátů.
Nukleové kyseliny jsou poměrně komplexní analyty, které se musí normálně extrahovat z komplexní směsi před tím, než se můžou použít v testech založených na sondách:
Existuje několik metod pro extrakci nukleových kyselin:
- na sekvenci závislé nebo biospecifické metody, jako např.:
- afinitní chromatografie • · · · • · *· · · » · · · • · · · • ······
- hybridizace k imobilizovaným sondám na kuličkách
- na sekvenci nezávislé nebo fyzikálně-chemické metody, jako např.:
- extrakce vodná fáze - vodná fáze s např. chloroformem
- precipitace např. čistým etanolem
- extrakce s filtračním papírem
- extrakce s činidly tvořící micely, jako cetyl-trimetylammonium-bromid
- navazování k imobilizovaným interkalačním barvivům, např. derivátům akridinu
- adsorpce ke křemičitému gelu nebo dvojmocným zeminám (diatomic earths)
- adsorpce k magnetickým skleněným částicím (MGP) nebo organo silanovým částicím při chaotropních podmínkách
V posledních letech se navrhlo mnoho procedur a materiálů pro izolaci nukleových kyselin z jejich přirozeného prostředí, které využívaly jejich navazování na skleněné povrchy. Například v Proč. Nati. Acad. USA 76, 615-691 (1979) je navržený postup pro navazování nukleových kyselin v agarozových gelech na mleté flintové sklo v přítomnosti jodidu sodného.
V Anal. Biochem. 121, 382-387 (1982) je popsaná purifikace plasmidové DNA z baktérií na skleněném prachu v přítomnosti chloristanu sodného (sodium perchlorate).
V DE-A 37 34 442 je popsaná izolace jednopramenné DNA fága M13 na vláknitých filtrech precipitací fágových částic s využitím kyseliny octové a lýze fágových částic chloristanem. Nukleové kyseliny se naváží na filtry ze skleněných vláken, omyjí a poté vymyjí Tris/EDTA pufrem s obsahem metanolu.
Podobná procedura pro purifikaci DNA z fágů lambda je popsaná v Anal. Biochem. 175, 196-201 (1988).
Procedura, známá již dříve, vyvolá selektivní vazbu nukleových kyselin na skleněný povrch v roztocích chaotropních solí a oddělí nukleové kyseliny od kontaminujících příměsí, jako je agaróza, proteiny nebo buněčné zbytky. K oddělení skleněných částic od znečisťujících látek se částice podle dosavadních postupů buď centrifugují, nebo se tekutina přefiltruje přes skleněný vláknitý • ·
• · · · • ···· · · • * * ···· * filtr. To je ale omezující krok, který zabraňuje použití tohoto postupu pro zpracování velkého počtu vzorků.
Ukázalo se, že magnetické částice pokryté skleněným povrchem nabízí pro izolaci biologických materiálů značné výhody. Když se nevystavily magnetické částice působení magnetického pole, jě jedinou silou použitelnou pro sedimentaci gravitace. Protřepáním roztoku se můžou resuspendovat. Sedimentační procedura, která nevyužívá magnetické pole, je pomalejší, než imobilizace biologických materiálů na částicích. To platí zejména pro nukleové kyseliny. Magnetické částice se můžou snadno soustředit na určitém místě v roztoku pomocí magnetu. Roztok se pak oddělí od částic a tedy také od přichycených biologických materiálů.
Použití magnetických částic k imobilizaci nukleových kyselin po precipitaci, přidáním sole a etanolu, je popsané v Anal. Biochem.
201, 166-169 (1992) a v PCT GB 91/00212. V tomto postupu se nukleové kyseliny aglutinují společně s magnetickými částicemi. Aglutinát se oddělí od původního roztoku aplikací magnetického pole a promývacím krokem. Po jednom promytí se nukleové kyseliny rozpustí v Tris pufru. Tento postup má ale nevýhodu v tom, že precipitace není selektivní pro nukleové kyseliny. Dochází také k aglutinaci řady pevných a rozpuštěných částic. Výsledkem je, že se tato procedura nemůže použít pro odstranění významného množství inhibitorů specifických enzymatických reakcí, které se můžou vyskytovat.
Na trhu je také magnetické porézní sklo, které obsahuje v pórovité, speciální skleněné základní hmotě (matrix) magnetické částice a které je pokryté vrstvou obsahující streptavidin. Tento produkt se může použít pro izolaci biologických materiálů, např. proteinů nebo nukleových kyselin, které jsou modifikovány v komplexním přípravném kroku tak, že se váží kovalentně na biotin. Zmaghetovatelné specifické adsorbenty se ukázaly jako velmi účinné a vhodné pro automatickou přípravu vzorku. Pro tyto účely se můžou použít ferimagnetické, feromagnetické a superparamagnetické pigmenty.
Částečky jsou podle odborníků pevné materiály s malým průměrem. Takovéto částečky se často nazývají pigmenty.
Tyto materiály, které jsou označené jako magnetické, jsou přitahovány k magnetu, tj. například feromagnetické nebo • · · · • · · · ♦ · · • · · • · * • ···· 4 superparamagnetické materiály. Jako výhodný a preferovaný se odborníkům jeví supermagnetismus (např. US 5 928 958; US 5 925 573; EP 757 106). Skleněné nebo organosilanové (organosilane) povrchy jsou často pro použití v biospecifických vazebných reakcích upravovány, např. US 5 928 958, US 5 898 071, US 5 925 573,
EP 937 497, US 4 554 088 nebo US 4 910 148. Nebo se může skleněný nebo organosilanový povrch upravit různými rozpouštědly nebo solemi pro modifikaci jejich hydrofilnosti a/nebo jejich elektropozitivity, např. US 5 438 127.
Nederivatizované silanolové skupiny skla nebo silanového povrchu můžou být ale za vhodných reakčních podmínek popsaných v DE 195 20 964, DE 195 37 985, WO 96/41840, WO 96/41811, EP 757 106 nebo US 5 520 899 použité pro adsorpci pomocí pouhých fyzikálněchemických sil. Typicky jsou magnetická jádra nebo magnetické jaderné agregáty pokryté skleněným povrchem, který se vytvoří kyselinou- nebo zásadou- katalyzovaným sol-gel procesem (by an acidor base- catalyzed sol-gel-process). Tyto částice se nazývají částice typu jádro-plášť (core-shell particles). Skleněný obal má pak typickou tloušťku vrstvy (viz např. DE 195 20 964), kde velikost a tvar pigmentu (který může obsahovat kromě magnetických kovových oxidů také nemagnetické částice, jako např. slídu) určují velikost a tvar produkované částice (viz např. DE 195 37 985 a odpovídající WO 96/41811). Aby se získala vysoká povrchová aktivita, používá se skleněný materiál s velkou porozitou (viz např. EP 757 106;
WO 99/26605). Popsané jsou dále složené magnetické částice, např. křemičitanem obalený oxid železitý obalený anorganickou křemennou hmotou z křemenných částic (EP 757 106), nebo směsi skleněných a křemenných gelů (mixtures of glass and silica gel) (WO 95/06652). Problém, který by měl vyřešit předkládaný vynález, se může vidět jako poskytnutí magnetických skleněných částic se zlepšenými vlastnostmi pro přípravu vzorku a pro biologické analýzy, zejména v automatizovaných procesech.
Nedostatek magnetických skleněných částic v současném stavu vývoje se vyřeší výsledky předkládaného vynálezu.
Cílem vynálezu je poskytnout směs (composition) magnetických skleněných částic. Magnetické skleněné částice (magnetic glass particles - MGPs) jsou podle předkládaného vynálezu pevné disperze • · · · ♦ · 9 * 9999 ·
9999 9 malých magnetických jader ve sklu. MGP jsou relativně malé a jsou v podstatě kulovité. Nemagnetický jemný obsah směsi MGP je velmi nízký, díky metodě jejich přípravy. To má ten účinek, že suspenze MGP sedimentuje pomalu a může tak být výhodně využitá pro postupy v molekulární biologii, které se můžou automatizovat. V jedné formě vynálezu jsou poskytnuté směsi a suspenze MGP podle předkládaného vynálezu. V jiné formě vynálezu je poskytnutá metoda pro směs MGP.
V ještě další formě vynálezu je poskytnuta metoda pro purifikaci DNA nebo RNA, kde se používají MGP podle předkládaného vynálezu.
Cílem předkládaného vynálezu je poskytnou směs magnetických skleněných částic, které jsou v podstatě kulovité, mají malý průměr a obsahují alespoň jeden magnetický objekt s průměrem mezi 5 a 500 nm. To má překvapující následky na sedimentační kinetiky, kvantifikované hodnotami poločasu ti/2, což je časové rozpětí, kdy 50% částic z určitého objemového elementu sedimentovalo (viz Příklad 6). Doba poločasu pro sedimentaci 3 mg/ml (suspenze váha/objem) směsi v izopropanolu je více jak 3 min., lépe 4 min., nebo ještě lépe 6 minut. Nejpreferovanější hodnota poločasu je ale více jak 10 minut, nebo dokonce více jak 20 minut. Čím jsou částice menší a čím více se blíží ideální kouli, tím déle budou MGP sedimentovat. To se může vysvětlit faktem, že čím více se tvar bude podobat ideální kouli, tím je menší možnost, že dvě nebo více částic se k sobě přichytí a vytvoří agregáty, které můžou sedimentovat rychleji. Tyto hodnoty jsou uvedené v Příkladu 6 a obrázky elektronového řádkovacího mikroskopu o vysokém rozlišení je možné vidět na Obrázcích 4 až 10. To má tu výhodu, že pro automatizované procesy je snížená vyžadovaná intenzita a četnost míchání skladovacích nádob obsahujících suspenzi MGP, jak je opakující se dávkování objemu *
specifické suspenze MGP z přebytku objemu nataženého do pipety snazší (přesnější dodávka co se týče hmotaMGp/objem) .
MGP podle předkládaného vynálezu jsou skleněné kapičky, ve kterých jsou rozptýlené velice malé, neagregující magnetické částice. Tyto částice, které se nazývají jako magnetické, jsou přitahovány k magnetu, tj. například feromagnetické nebo superparamagnetické materiály. Preferované jsou feromagnetické materiály, zejména jestliže nebyly doposud předmagnetizovány. Předmagnetizováním se v tomto kontextu rozumí kontakt s magnetem,
• · · · β
···· který zvýší zbytkový magnetismus (remanence). Preferovanými magnetickými materiály jsou železo nebo oxidy železa, jako například magnetit (Fe3O4) nebo Fe2O3, přednostně y-Fe2O3. V zásadě se můžou použít železitan barnatý, nikl, kobalt, slitiny Al-Ni-Fe-Co, nebo jiné feri nebo feromagnetika (ferri- or ferromagnetic). Magnetickými částicemi může být např. magnetický pigment. Velikost magnetických částic je v nano rozsahu, tj. podle předkládaného vynálezu je průměr mezi 5 a 500 nm, lépe mezi 10 a 200 nm a ještě lépe mezi 15 a 50 nm. Vhodné magnetické pigmenty vyrábí firma CERAC; mají střední průměr 23 nm a skládají se z y-Fe2O3 (BET-povrch 50 m2/g, CERAC: P.O. Box 1178, Milwaukee, Wisconsin 53201-1178 USA; Article-No.1-2012). Magnetické skleněné částice podle předkládaného vynálezu jsou dále charakterizovány skutečností, že MGP mají průměr částice mezi 0,5 a 5 pm, přednostně pak mezi 1 a 2 pm, což se určilo pomocí vysokorozlišovacího rastrovacího elektronového mikroskopu, zatímco magnetické částice mají průměr mezi 5 až 500 nm, přednostně mezi 10 a 200 nm, nebo ještě lépe mezi 15 a 50 nm, jak bylo uvedeno výše.
MGP předkládaného vynálezu jsou tedy dále charakterizované poměrem průměrů magnetického pigmentového jádra k magnetické skleněné částici menším než 1 k 10, jak se určilo vysokorozlišovací rastrovací elektronovou mikroskopií. Díky těmto poměrům průměrů a také díky nepřítomnosti jakéhokoliv inertního nosiče, který by určoval tvar a velikost částic, jsou geometrie MGP a počet začleněných magnetických částic určené podmínkami výroby. MGP podle předloženého vynálezu jsou mikroporózní, ale mají vysoce strukturovaný a tedy relativně velký povrch s více než 6 m2/g. Magnetické skleněné částice podle předkládaného vynálezu mají přednostně povrch v rozsahu 5 až 100 m2/g, lépe v rozsahu 5 až 90 m2/g, ještě lépe v rozsahu 10 až 50 m2/g a nejlépe v rozsahu 15 až 30 m2/g. Tento povrch je zhruba dvojnásobný ve srovnání s částicemi popsanými v DE 195 37 985. To se může určit metodou
Braunauer-Emett-Teller s využitím automatického komerčního přístroje (viz Příklad 4). Diskuze této metody, neformálně nazývané BET metoda, je v práci S. Brauner. The Adsorbtion of Gases and Vapors, Vol. 1, Princeton University Press, 1943. Například vzorek EJ0096.5R-01, o který je přednostně zájem (viz Příklad 1 a Tabulky 1 až 3 pro přehled výrobních parametrů), má BET-povrch 26,8525 m2/g, • · · ·
oblast mikropóru 2,3058 m2/g a průměrný průměr póru 24,9132 nm. To znamená, že povrch póru je méně než 10% celkového povrchu a že magnetická skleněná částice je mikroporózní.
Pórem se myslí zářez (recess) ve vnějším povrchu částice.
Povrch zasahuje tak daleko do částice, že svislá linie vynesená v zářezu na povrchu rozdělí částici alespoň jednou ve směru přilehlého prostředí částice. Navíc póry zasahují do částice do hloubky, která je větší než jeden poloměr póru.
Pomalejší sedimentační kinetika, větší povrch a sférický tvar inhibující agregaci se projeví v lepším funkčním chování jako adsorbentu při diagnóze nukleových kyselin (viz Příklad 3, 5 a 7), při porovnání s německými návrhy patentů DE 198 54 973.3, nebo DE 198 55 259.9. Toto kritérium se může kvantifikovat posunem cyklu, kdy dojde k překročení nastaveného prahu (threshold cycle) v tzv. TaqMan® testech, poměru signál-pozadí, a statisticky potvrzeným nižším detekčním limitem. Metody pro tento test jsou uvedené v WO92/02638 a odpovídajících US patentech (US 5,210,015,
US 5,804,375, US 5,487,972). Experimenty s radioaktivním sledováním (viz Příklad 5.2) ukázaly, že způsob navazování pokud jde o DNA a RNA byl ten samý, jako u současného referenčního materiálu.
Produkční parametry měly překvapivě vliv na výsledky experimentů s radioaktivním sledováním. Další výhodou MGP typu předkládaného vynálezu je to, Že neexistence tenze ve skleněné vrstvě může vést kvůli vnitřní struktuře k prasklinám během procesu sušení a odpovídajícím poškozením ve skleněném obalu (důkladný (solid) rozptyl malých magnetických jader ve skleněné kapce). To se může zkoumat metodami tvorby obrazu (viz Příklad 3) .
Jinou formou předkládaného vynálezu je suspenze magnetických částic. Je to zřejmé odborníkům připravujícím suspenze přidáváním tekutiny ke směsi MGP a promícháním suspenze do homogenity. Tekutina podle předkládaného vynálezu může zahrnovat jakoukoliv tekutinu, která neovlivní stabilitu magnetických částic a může se použít pro tvorbu homogenní suspenze.
Přednostně se používají tekutiny vhodné pro procesy v molekulární biologii, zejména pro procesy purifikace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) nebo ribonukleové kyseliny (RNA), které využívají za určitých podmínek navazování těchto látek na
• 999 skleněné částice. Mezi preferované tekutiny patří alkoholy nebo jakékoliv jejich směsi s vodou nebo ketony. Mezi alkoholy by podle předkládaného vynálezu měly patřit především primární, sekundární a terciární alkoholy o obecném složení R-OH, kde R znamená obecný vzorec - (-CH2) n-CH3, kde n >= 0. Ale použité můžou být i jiné alkoholy, jestliže jsou vhodné pro účely molekulární biologie, jako například glycerol. Zvláště vhodné jsou izopropanol, etanol nebo jejich směsi s vodou, přednostně směs 80 objemových částí izopropanolu a 20 objemových částí vody. V jiné formě vynálezu tekutina obsahuje ketony, jako například aceton. V preferované formě vynálezu tyto suspenze obsahují mezi 5 a 60 mg/ml MGP. V jiné formě vynálezu jsou MGP suspendované ve vodných pufrovaných roztocích, které můžou případně obsahovat chaotropní látku v koncentraci mezi 2 a 8 mol/1, nebo lépe mezi 4 a 6.mol/1. Chaotropními solemi můžou být jodid sodný, chloristan sodný, guanidin thiokyanát, guanidin isothiokyanát, nebo guanidin hydrochlorit. Jsou také možné jiné sloučeniny. Chaotropní činidlo podle předkládaného vynálezu bude jakákoliv chemická látka, která rozruší uspořádanou strukturu kapalné vody a způsobí navazování DNA nebo RNA na MGP podle předkládaného vynálezu, jestliže je tato látka v roztoku obsahujícím DNA nebo RNA. Je to samozřejmé pro kvalifikovaného pracovníka připravujícího vhodné pufrované vodné roztoky. Pufrovací systémy, které se můžou použít pro účely molekulární biologie, je možné nalézt například v Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, Cold
Spring Harbour University Press, New York, NY, USA. Preferovanými pufrovacími látkami jsou Tris-hydroxymethylamině fosfát (TRIS),
N-(2-hydroxyetyl)piperazin-N'-(etansulfonová kyselina) (HEPES), jejich soli, nebo jiné látky. Kromě toho můžou být přítomné látky, které upravují iontovou sílu roztoku, jako například NaCl, KC1, nebo CaCl2, nebo které jsou komplexotvorními látkami kovových kationtů, jako například etylen-diamin-tetra-octová kyselina (EDTA), nebo její sole. Může být také přítomný biologický materiál známý odborníkům.
V jiné formě předkládaného vynálezu může suspenze MGP dále obsahovat DNA nebo RNA, případně ve směsi s proteiny, mastnými kyselinami, sacharidy a jinými materiály biologického původu. V jiné formě předkládaného vynálezu může tekutina obsahovat směs jedné nebo více složek vybraných ze skupiny alkoholů, ketonů, vodních pufrovaných • · • · · · ·99 ·
9 9 φ ····
roztoků, chaotropních látek, látek modifikujících iontovou sílu roztoku, komplexotvorných látek, biologický materiál, DNA nebo RNA, všechny s vlastnostmi popsanými výše.
V jiné formě vynálezu je poskytnutá zkumavka nebo reakční nádoba obsahující suspenzi podle předkládaného vynálezu. Zkumavka může být vyrobená z plastů, ale může být také částí větší struktury, například mikrotitrační destičky ve formátu s 96 nebo 384 jamkami. Ještě další poskytnutou formou vynálezu je skladovací nádoba, která obsahuje směs magnetických částic nebo jejich suspenze. Další poskytnutou formou vynálezu je souprava jednotlivých součástí, která obsahuje skladovací nádobu, která obsahuje směs magnetických skleněných částic nebo jejich suspenze podle předkládaného vynálezu. Souprava se může použít pro purifikaci DNA nebo RNA. Takovéto soupravy známé odborníkům dále obsahují výrobky z plastu, které se můžou použít během purifikačního procesu, například mikrotitrační destičky ve formátu s 96 nebo 384 jamkami, nebo obyčejné reakční zkumavky, vyráběné například firmou Eppendorf, Hamburg, Německo. Souprava může dále obsahovat promývací roztok, který je vhodný pro promývací krok magnetických skleněných částic, když je na ně navázána DNA nebo RNA. Často je promývací roztok poskytován jako zásobní roztok, který se musí před použitím zředit. Souprava může dále obsahovat vymývací roztok, tj. roztok nebo pufr (např. TE, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0), nebo čistou vodu pro uvolnění DNA nebo RNA navázané k magnetickým skleněným částicím. Dále pak můžou být přítomná další reakční činidla, která se můžou použít pro proces purifikace nukleových kyselin, tj. DNA nebo RNA. V jedné formě vynálezu je souprava z částí podle předkládaného vynálezu použitá pro purifikaci nukleových kyselin,
V jedné formě vynálezu se může použít směs MGP k přípravě suspenze, jak to bylo již popsáno.
V jiné formě vynálezu se můžou použít suspenze podle předkládaného vynálezu pro purifikaci nukleových kyselin, tj. RNA nebo DNA, z komplexních směsí, které obsahují také ostatní biologické substance. Můžou se tedy purifikovat také směsi různých nukleových kyselin, dokonce i směsi obsahující nukleové kyseliny, které nás zajímají, v malém množství. Purifikační efekt je výsledkem chování DNA nebo RNA, které se váží za určitých podmínek na • · ···· magnetické skleněné částice, například za přítomnosti určité koncentrace chaotropní látky. MGP s navázanými DNA nebo RNA jsou poté raději alespoň jednou promyté, nejlépe směsí 70 objemových částí etanolu s 30 objemovými částmi vody („70% etanol). Poté se podmínky změní, tj. pro vymytí DNA nebo RNA navázaných na MGP částice se sníží koncentrace chaotropní látky. To se přednostně provede peletováním magnetických skleněných částic, například gravitací nebo použitím magnetu a resuspendováním v roztoku bez a nebo s nízkým obsahem chaotropní látky. Nebo se může případně roztok zředit roztokem bez a nebo s nízkým obsahem chaotropní látky. Purifikovaná DNA nebo RNA se nyní může použít pro další reakce.
Jedním cílem předkládaného vynálezu je poskytnutí výrobního postupu pro MGP podle předkládaného vynálezu. Sklem se podle předkládaného vynálezu rozumí amorfní materiál, který obsahuje křemík. Sklo může obsahovat další látky, jako B2O3 (0-30%), A12O3 (020%), CaO (0-20%),' BaO (0-10%), K2O (0-20%), Na2O (0-20%), MgO (018%), Pb2O3 (0-15%). Sklo také může obsahovat menší procento (0-5%) řady dalších oxidů, jako Mn2O3, TiO2, As2O3, Fe2O3, CuO, CoO atd.
Podle předkládaného vynálezu jsou zvláště preferovaná skla, která jsou připravená s použitím gel sol procesu popsaného v WO 96/41811 a poté vysušena a slisována. Základní principy tohoto procesu jsou známé a byly popsány, např. v C.J.Brinker, G.W.Scherer „Sol Gel Science - The Physics and Chemistry of Sol Gel Processing, Academie Press lne. 1990, Sol-Gel Optics, Processing and Applications, Lísá C. Klein, Ed., Kluwer Academie Publishers 1994, p. 450 ff., a v DE-A-1941191, DE-A-3719339, DE-A-4117041, DE-A-4217432 a WO 96/41811. V první řadě jsou v gel-sol procesu alkoholáty síťujících složek, např. SiO2, B2O3, A12O3, TiO2, ZrO2, GeO2 zkombinovány s oxidy a solemi ostatních složek, například v alkoholovém roztoku a potom hydrolyzovány. Následující rovnice popisuje postup pro přípravu sodného borohliníkového silikátového skla:
• 4 4
4 · • 4 ·
4·4· • 4
99 4 • · ···· 4* 4444 • · 4 4 « · • · * * · *
4 4 4 4 4 ♦ « 44 4 4 44 4
9 99 ·· ·*
NáOH + B2O3 + AI(OR)3 + Si(OR)4 +H2O
-ROH
NaOH + B2O3 + <A1(OH)3> + <Si(OH)4>
OH
B-O-AÍ-Si-OH
O- Gel Na+
->(Na2O'B2O3-A32O3-StO2)Skto
Pro zahájení procesu hydrolýzy výchozích komponent se přidá voda. Reakce probíhá relativně rychle, protože alkalické ionty mají katalytický vliv na rychlost hydrolýzy esteru kyseliny křemičité. Jakmile dojde k vytvoření gelu, může se vysušit a zahustit (nebo kondenzovat) termálními procesy, čímž se vytvoří sklo.
V jedné formě vynálezu se sklovitá základní hmota připraví kyselinou nebo zásadou katalyzovanou sol-gel syntézou, jak je naznačeno schematicky na Obrázku 1 a Obrázku 2 a detailně popsáno v Příkladu 1. Využívá se zde koloidní systém, kde jsou nejprve dispergovány pevné složky v tekuté fázi (=sol) a po zpracování jsou vzájemně pospojovány podobně jako včelí plástev (=gel). Složení skla (kód EJ) vypočítané z množství výtažků bylo 70,67Mol%Si02,
14,33Mol%B203, 5,00Mo1%A12O3, 4,00Mol% K2O, 2,00 Mol%CaO, 4,OOMol%ZnO. Slogžení skla (kód RN) bylo 74Mol%Si02, 15Mol%B203, 5,00Mol%Al2O3, 4,00Mol% K2O, 2,00 Mol%CaO. Slogžení skla (kód EP) bylo 73,61Mol%Si02, 14, 93Mo1%B203, 5,21Mo1%A12O3, 4,17Mol% K2Ó, 2,08 Mol%CaO.
Reakce může být popsána následovně:
buď katalyzovaná kyselinou, například:
BC13 + 3 H2O -» B(OH)3 + 3 H <+>ci<->
A1C13 + 3 H2O - AI(OH)3 + 3 Η'+’οΐ1’1
SiCl4 + 4 H2O - Si(OH)4 + 4 H<+,Ci(->
Na(+)NO3(‘) + H2O -> Na(+)OH(' ) + H(+) NO3(_1
K(+) (-)OOCCH3 + h2o - K(+l OH( -) + H(+) (’OOCCH:
9 • 9 • · 9
99 99 ·· ····
9 9· · nebo katalyzovaná zásadou, například:
K<+) (_)OCH2CH3 + Hz0 - K(+)OH(_) + HOCH2CH3
Na(+)( )OCH3 + H20 - Na(+)OH<-) + HOCH3
Al(3+) [ (-)OCH2CH2CH3]3 + 3 H20 -> AI (OH) 3 + 3 HOCH2CH2CH3
B(OCH2CH3)3 + 3 H20 - B(OH)3 + 3 HOCH2CH3
Různé hydroxidy kondenzují na odpovídající oxidy, které tvoří třírozměrnou síť, amorfní skleněnou hmotu SiO2/B2O3/Al2O3 s kovovými ionty na vmezeřených (interstitial) místech. Kromě výše popsaných alkalických iontů a iontů alkalických zemních kovů, se můžou zainkorporovat do hmoty, jako činidla ovlivňující zesíťování, ionty přechodových kovů, jako například Zn2+ a Zr2+.
——§£ Q —~~3> —Sl—Sl
I I I
I t I k(+) —Si—O—Si— ==> —Si—Οω «O-Si—.
I I | . 1
V jiné formě vynálezu se může sklo připravit metodami známými odborníkům - tavením surového SiO2 a uhličitanů alkalických kovů nebo alkalických zemních kovů Na2CO3, K2CO3 nebo CaCO3.
Reakce může být popsána následovně:
Na2CO3 Η- SiO2 —> Na2SiO3 (= Na2O SiO2) 4-CO2
K2CO3 + SiO2 - K2SiO3 (= K20 SiO2) +C02'
CaCO3 + SiO2 -> CaSiO3 (= CaO SiO2) +C02 ’
Ve většině případů ale výsledkem není čistá silikátová matrix, ale matrix boritan-hliník-křemičitan, tj. vzhledem k jednotlivým částem tvořícím síť je část SiO2 nahrazeno B20 a A12O3.
• · · · • ·· ·
Poměr sol:pigment má značný efekt na výnos magnetických částic poskytovaných tímto vynálezem. Pro proces je důležité, že sol může být stále kvalifikovaným pracovníkem pumpován a rozprašován.
Pro přípravu prášku se kaše přednostně rozprašuje přes dvoukapalinovou trysku (two-fluid nozzle) popsanou na Obrázku 1 a v Příkladu 1.3. Vhodné sušící rozprašovací systémy vyrábí Nubilosa Molekularzerstáubung, Ladisch GmbH & Co. KG, Konstanz, Německo, například „Labor-Zerstáubungstrockner (yp LTK) nebo Bůchi AG,
Uster, Švýcarsko, například Mini Spray Dryer (Type B-191).
Protože poměry průměru magnetických jader ke skleněnému obalu jsou menší než 1:10, přednostně mezi 1:10 a 1:1000, geometrie a počet včleněných magnetických jader nebo jejich inertních nosičů neurčují tvar a velikost částic; určují to podmínky výroby, zejména podmínky během sušení rozprašováním. Jinými slovy volba tlaku, vstupní teplota, výstupní teplota a rychlost průtoku během procedury sušení rozprašováním představují stupně volnosti, které určují rozložení částic a tvar skleněných kapek, čímž modifikují MGP.
Když se zvýší rozprašovací tlak, rozložení velikosti se posune směrem k sub-p-oblasti. Snížená teplota během procesu sušení rozprašováním povede k pomalejšímu vypařování rozpouštědla, čímž se tvar MGP přiblíží blíže k ideální kouli, tj. poměr poloměrů v rovinách xy- a xz- se přiblíží zhruba 1. Poměr poloměrů se bude pohybovat mezi 0,8 a 1,2, lépe mezi 0,9 a 1,1.
V preferované formě vynálezu jsou trysky zahřívané. Přívodní teplota je mezi 120 °C a 500 °C, lépe mezi 170 °C a 230 °C, nebo 150 °C a 230 °C a nejlépe mezi 150 °C a 200 °C, nebo 190 °C a 210 °C, nebo při teplotě 200 °C nebo trochu nižší. Výstupní teplota závisí na bodu varu sólu a tím na rozpouštědle a může být nad, stejná nebo slabě pod, tj. méně než 10 °C, teplotou varu rozpouštědla. Když se jako rozpouštědlo použije etanol, je mezi 50 °C a 300 °C, lépe mezi 70 °C a 150 °C a nejlépe mezi 80 °C a 110 °C. Optimální teplota je mezi 90 °C a 100 °C. Tlak trysky je přes 3 bary, nejlépe je-li regulovatelný od 4 do 6 barů. Kvalifikovaný pracovník ví, že přesné parametry budou záviset na použitém systému pro sušení rozprašováním. Může ale upravit poznatky předkládaného vynálezu pro jakoukoliv další rozprašovací sušičku a příslušné parametry hledat s přihlédnutím k poznatkům tohoto
4
· ·
4 4 4
4 4 9 vynálezu. Vztah, jako popsaný v práci Masters: Spray Drying
Handbook, Fifth Edition, John Wiley & Sons, 1991, New York, mu může ukázat cestu pro určení, které parametry se musí vybrat pro jiné nastavení. Přednostně bude asi pracovat s návodem svého systému pro sušení rozprašováním, nebo bude kontaktovat technickou podporu výrobce systému pro sušení rozprašováním.
Pro optimalizaci výtěžku by zhuštění nebo teplota spékání (sinter temperature) měly být co možná nejvyšší, tj. mírně pod teplotou tání. Jestliže je ale.příliš vysoká, částice se budou k sobě přichytávat a tvořit aglomeráty, které se musí přesíváním odstranit. Je-li příliš nízká, nebudou MGP optimálně zhuštěné. Další zpracování částic při příliš vysoké teplotě povede ke ztrátě magnetických vlastností. Příliš vysoká teplota by se tedy neměla používat. Přesná teplota závisí na složení skla, ale může být v rozsahu 400 °C až 1200 °C. V případě skelné směsi EJ je teplota spékání mezi 720 °C a 770 °C, nejlépe okolo 750 °C. Je na zručnosti pracovníka, aby nalezl teploty pro každou skelnou směs při přihlédnutí k poznatkům předkládaného vynálezu. Podle předkládaného vynálezu se může MGP prášek sušený rozprašováním dále zpracovat tak, jak je uvedeno v Obrázku 2 a popsáno v Příkladu 1.4. Přednostně se prášek zahřeje po dobu 1 hodiny na 200 °C, případně ochladí na pokojovou teplotu a zahřeje na dobu 1 hodiny na 750 °C (zahušťování nebo teplota spékání) v dusíkové atmosféře, s rychlostí ohřívání lK/minutu a na této teplotě se udržuje 1 hodinu. Potom se pec ochladí na 150 °C a pak se znovu zahřeje na dobu 1 hodiny na 200 °C vzdušné teploty (in air). Po ochlazení na pokojovou teplotu se prášek přenese na síto (50 pm) a po 30 minut přesívá. Přesátý vzorek se přenese do lahví a 4 hodiny sterilizuje při 200 °C; pak se ochladí na 80 °C. Pak se skleněné nádoby vyjmou z pece, pokryjí sterilní fólií a uzavřou.
Magnetické částice poskytované vynálezem jsou překvapivě vhodné zvláště pro izolaci biologických materiálů ze vzorků. Kromě toho je materiál jádra přírodním zdrojem a tedy nepředstavuje vážný ekologický problém. Navíc nejsou částice podle vynálezu drahé a jsou snadno vyráběné.
Jiným předmětem vynálezu je postup pro izolaci biologických materiálů tak, že se tak, že se vzorek obsahující biologický
materiál v tekutině smíchá s magnetickými částicemi vynálezu za podmínek, kdy dojde navázání biologického materiálu na povrch částic a oddělení biologického materiálu od tekutiny. Podle vynálezu výraz „v tekutině znamená, že tekutina se může přidat ke vzorku před tím, než se přidají magnetické částice. Ale bude také zahrnovat situaci, kdy sám vzorek má nízkou viskozitu a je sám o sobě tekutinou, takže se žádná další tekutina nebo pufr nemusí pro přípravu vzorku přidávat; příprava se může provést přidáním pevných činidel před přidáním magnetických částic. Pořadí přidávaných činidel se může lišit podle požadavků procesu.
Biologickými materiály se myslí materiály se specifickým nebo molekulárním základem. Zahrnují zvláště buňky, jako viry nebo bakterie, také izolované buňky z mnohobuněčných organismů, jako například lidské a zvířecí buňky, jako leukocyty, dále imunologicky aktivní nízko a vysoko molekulární chemické sloučeniny, jako hapteny, antigeny, protilátky a nukleové kyseliny. Nukleové kyseliny jako DNA nebo RNA jsou zvláště upřednostňované. V jedné formě vynálezu se purifikují směsi specifických nukleových kyselin, kde může být cílová nukleová kyselina (nukleové kyseliny) menšinovou součástí, pokud jde o koncentraci (nebo může být přítomná v malém množství). Podle předkládaného vynálezu cílová nukleová kyselina bude zájmová nukleová kyselina, tj. nukleová kyselina, která bude zkoumaná, protože její přítomnost naznačuje určitý stav nebo onemocnění člověka nebo zvířete. Například přítomnost virové sekvence (např. viru hepatitidy B, viru hepatitidy C nebo viru lidské imunodificience) ukazuje, že příslušný jedinec je infikovaný specifickým virem. Potom by tato virová sekvence byla cílovou sekvencí. Jiné cílové sekvence jsou sekvence, které naznačují predispozice jedince k určitému onemocnění, jako například dědičnému onemocnění, jako je srpkovitá chudokrevnost nebo určité typy rakoviny. Tyto příklady by měly ilustrovat vynález, ale neměly by ho vymezovat.
Vzorky podle vynálezu zahrnují klinické vzorky, jako krev, sérum, orální výplachy, moč, mozkovou tekutinu (cerebral fluid), sputum, stolici, bioptické vzorky a vzorky krevní dřeně. Vzorky také můžou být jejich různé typy používané při analýze prostředí, analýze potravin nebo molekulárně biologickém výzkumu, například z *· · ···· ····
• 9 9 · · ♦
9 9 9 9 9 • 999999 9 99
9 9 9 9 9
9999 9 99 99 bakteriálních kultur, lyzátů fágů a produkty amplifikačních procedur, jako je třeba PCR.
Popsané procedury se můžou použít pro izolaci přírodních nebo modifikovaných biologických materiálů. Přírodním biologickým materiálem se rozumí materiál, jehož struktura nebyla nezvratně změněna při srovnání s přirozeně se vyskytujícím biologickými materiály. To ale neznamená, že jiné složky vzorku nemohou být modifikovány. Modifikované biologické materiály zahrnují materiály, které se nevyskytují v přírodě, například nukleové kyseliny, které jsou modifikované připojením skupin, které jsou reaktivní a které umožňují detekci nebo imobilizaci. Příkladem jsou biotinylované nukleové kyseliny.
V určitých případech může být vzorek použitý v izolační proceduře podle předkládaného vynálezu bez předběžné úpravy. V mnoha případech by ale měl být vzorek vhodnou metodou lyžován, čímž se uvolní biologický materiál obsažený ve vzorku.
Procedury pro lýzi vzorků jsou odborníkům známé a můžou být chemické, enzymatické nebo fyzikální povahy. Také se dá použít kombinace těchto procedur. Lýze se může provést například ultrazvukem, vysokým tlakem, střižnými silami, s využitím alkálií, detergentů nebo chaotropních solných roztoků, nebo pomocí proteináz či lipáz. Co se týká lyzačního postupu pro získání nukleových kyselin, speciální referencí je Sambrook et al.: Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, 2nd Addition, Cold Spring Harbour University Press, Cold Spring Harbour, NY a Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY.
Kromě biologického materiálu, který má být izolován, může vzorek v tekutině také obsahovat další složky, jako zbytky buněk, proteiny, sole a další látky, které se nemají izolovat. Tento vzorek, který přednostně obsahuje biologický materiál v přírodní formě, se smíchá s částicemi za podmínek, kdy se cílový biologický materiál naváže na povrch částice. Tyto podmínky závisí na typu dotyčného biologického materiálu, ale v zásadě jsou známé. Také závisí na metodě, kterou se biologický materiál váže na povrch. Jestliže se pro navazování využívají například imunologické reakce, musí se vybrat podmínky, které jsou vhodné pro tvorbu imunokomplexu. Jestliže se používají modifikované nukleové kyseliny, k navázání »« ····
může dojít přes skupiny nukleových kyselin, které představují modifikaci, například biotin navazující se na streptavidinem potažené povrchy. Zejména u nukleových kyselin se ale upřednostňuje přímé navazování nukleových kyselin na sklo, protože (kromě jiných důvodů) se nukleové kyseliny nemusí modifikovat a dokonce se můžou vázat i přírodní nukleové kyseliny. Postup pro navazování přírodních nukleových kyselin na skleněné částice může být analogický postupu popsanému dříve. Přednostně se provádí v přítomnosti chaotropních solí v koncentraci mezi 2 a 8 mol/1, nebo lépe mezi 4 a 6 mol/1. Chaotropními solemi můžou být jodid sodný, chloristan sodný, guanidin thiokyanát, guanidin isothiokyanát nebo guanidin hydrochlorit. Možné jsou i jiné sloučeniny.
Smícháním vzorku s částicemi se dostane vzorek s částicemi do vzájemného kontaktu - inkubace probíhá po dobu dostatečnou na to, aby mohlo dojít k navázání. Odborníci jsou zpravidla seznámeni s dobou nezbytnou pro inkubační krok odvozením z postupů, kde se používají nemagnetické částice. Tento krok se může optimalizovat určením množství navázaného biologického materiálu na povrch v různých časových intervalech. Vhodné inkubační časy pro nukleové kyseliny můžou být mezi 10 vteřinami a 30 minutami.
V závislosti na velikosti a typu magnetických částic jsou částice buď odděleny od tekutiny během vlastní inkubační periody, nebo suspenze zůstane nedotčená po delší časové období. Jestliže jsou částice velmi malé a nezmagnetizované, zůstane suspenze neporušená po delší časové období. Jestliže mají částice větší rozměr, částice se pomalu během inkubační doby oddělují od tekutiny.
Imobilizace se přednostně neprovádí precipitací, snížením rozpustnosti materiálů, které mají být imobilizovány. Imobilizace je spíše založená na biospecifických interakcích (zachycení molekul) nebo adsorpci. To z velké části zabraňuje tomu, aby docházelo k zahrnutí kontaminujících látek.
Po inkubaci se biologický materiál oddělí od tekutiny. Použitím magnetického pole se obecně dosáhne oddělení materiálu navázaného na magnetické částice. Například magnetické částice se můžou přitáhnout ke stěně nádoby, ve které docházelo k inkubaci. Tekutina obsahující obsah vzorku, který se nenavázal na magnetické částice, se potom může odstranit. Proces použitý pro odstranění závisí na typu nádoby, ····
9
9 9 · 9
9999 9 • ·
9 9 9 * •
·« ·«·· • · 9 9
9 ·9
9 9 9 9
9 · · ·
99 ve které se prováděla inkubace. Mezi vhodné kroky patři odstranění tekutiny pipetováním nebo odsátím.
Jestliže je to žádoucí, magnetické částice se můžou dále jednou nebo vícekrát přečistit použitím promývacího roztoku. Použije se promývací roztok, který nezpůsobí uvolnění biologického materiálu z povrchu částic, ale odmyje co možná nejlépe nežádoucí kontaminanty. Promývací krok se nejlépe provede inkubací promývacího roztoku s částicemi. Částice jsou nejlépe během tohoto kroku resuspendované, například protřepáním nebo aplikací magnetického pole, které není identické s tím, které se použilo poprvé. Kontaminovaný promývací roztok se přednostně oddělí stejně jako vzorek v kroku pro navazování biologického materiálu popsaném výše.
Po posledním promývacím kroku se můžou magnetické částice rychle vysušit pomocí vakua, nebo se může nechat roztok vypařit.
Také se může použít krok s předběžnou úpravou acetonem. Jestliže se to vyžaduje, biologický materiál purifikovaný tímto způsobem se může od magnetických částic oddělit. Tento krok také závisí na způsobu, kterým se biologický materiál navázal na magnetické částice.
Jestliže jsou biologickým materiálem přírodní nukleové kyseliny a magnetické částice jsou sklem potažené částice, nukleové kyseliny se můžou uvolnit od částic podle vynálezu s použitím elučního pufru s nízkou koncentrací solí. Pufry těchto vlastností jsou známé z DE 3724442 a Analytical Biochemisty 175, 196-201 (1998). Vymývacími pufry s nízkým obsahem soli jsou zejména pufry s obsahem nižším než 0,2 mol/1. Ve jiné speciální formě je vymývacím pufrem demineralizovaná voda.
V ještě další formě se provádí popsaná purifikční a izolační procedura poté, co jsou buňky (například virové částice nebo prokaryontní či eukaryontní buňky) odděleny imunomagneticky z tělních tekutin nebo pletiva. V tomto kroku je vzorek inkubován, například při protřepávání s magnetickými částicemi, ke kterým je připojena protilátka proti antigenu. Tyto částice můžou být částice podle vynálezu, nebo komerčně dostupné částice (například MACS Microbeads od Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Německo).
Poté, co se aplikuje magnetické pole, se provede jeden nebo více promývacích kroků s využitím solných roztoků. Získají se částice, ke kterým jsou přichycené žádoucí buňky. Přichycené buňky jsou potom • · 4999
9f 9 999
9 · «
9 9 • 9999 9
9
9999 *
9 9 * 9 9
9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
99 9 9 99 9
94 99 99 resuspendované v solném pufru. V preferované případě je tento solný pufr chaotropní solný roztok, takže nukleové kyseliny v buňce jsou z buněk uvolněné.
Zvláště výhodné purifikační procedury pro izolaci nukleových kyselin ze vzorků obsahujících buňky se dosáhne kombinací izolace buněk popsanou výše, s izolací nukleových kyselin popsanou také výše, na magnetických částice podle vynálezu. Výhoda této formy je v potenciální jednoduchosti (metoda využívající jednu zkumavku), vysoké citlivosti (zvláště důležitá v lékařské mikrobiologii a onkologii) a v jednoduchosti, se kterou může být automatizovaná.
Biologické materiály, izolované s využitím postupu podle vynálezu, se nyní můžou použít podle potřeby dále. Můžou se například použít jako substráty pro různé enzymatické reakce. Jedná-li se o nukleové kyseliny, můžou se použít pro sekvenování, radioaktivní nebo neradioaktivní značení, amplifikaci jedné nebo více sekvencí které obsahují, transkripci, hybridizaci se značenými nukleovými kyselinami, translaci nebo ligaci. Výhoda postupu podle vynálezu je v tom, že se velmi snadno oddělí biologický materiál od tekutiny. Dříve se pro oddělení skleněných částic od kontaminant používal centrifugační krok, nebo se (když byl biologický materiál přichycen na skleněná vlákna) tekutina odstranila přes filtry. To je omezující krok, který činí zpracování velkého množství vzorků obtížné. Biologické materiály se můžou od kontaminant oddělit účinněji s využitím částic podle vynálezu. Zejména inhibitory určitých enzymatických reakcí se můžou do značné míry odstranit podle vynálezu.
V preferovaném případě se částice podle vynálezu přidávají k lyžované směsi. Po vhodném časovém úseku nutným pro adsorpci (který se může optimalizovat mechanickým protřepáváním) se částice separují od okolní tekutiny, obsahující buněčné komponenty, které se nemají detekovat. To se provede přednostně aplikací magnetického pole umístěním magnetu ke stěně nádoby.
Pro odstranění všech kontaminat, které můžou stále být přítomné, se provede přednostně promývací krok s roztokem, který neuvolní nukleové kyseliny, které mají být určeny, od skleněného povrchu. Pro uvolnění nukleových kyselin ze skleněného povrchu se přidá eluční pufr s reakčními podmínkami, které to umožní. Těmito ·· · • · • · · · ··· · · · · · · • ···· ·· · · · · · j • · · · · · ···· ···· · ·· ·· ·· ·· podmínkami jsou zejména podmínky s nízkým obsahem solí. V závislosti na zamýšleném dalším použití nukleových kyselin se může tento roztok nyní oddělit od částic a dále zpracovat. Tento separační krok se provede přednostně aplikací magnetického pole, takže se částice oddělí od eluátu.
Preferovanou formou předkládaného vynálezu je použití MGP předkládaného vynálezu v automatizovatelných metodách, jako například popsaných v WO 99/16781. Automatizovatelná metoda znamená, že kroky metody jsou vhodné pro provádění aparátem nebo přístrojem schopným pracovat s malou, nebo bez vnější kontroly či ovlivňování lidskou osobou. Pouze přípravné kroky metody se můžou provést ručně, například skladovací nádoby se musí být naplnit a umístit na místo, člověk musí provést výběr vzorků a jak vědí odborníci, i další kroky, například práce s ovládacím počítačem. Aparát nebo přístroj může například automaticky přidat tekutiny, míchat vzorky nebo provést inkubační kroky při určité teplotě. Typicky je takovýto přístroj nebo aparát robot ovládaný počítačem, který vykonává program, kde jsou specifikované jednotlivé kroky a příkazy.
Preferovanými automatickými metodami jsou ty, které se provádí ve formátu umožňujícím vysokou průchodnost, což znamená, že metody a používané přístroje nebo aparáty jsou optimalizované pro vysokou průchodnost vzorků v krátkém čase.
V jiné formě jsou MGP podle předkládaného vynálezu použité v poloautomatickém postupu, což znamená, že se některé reakční kroky můžou dělat manuálně. V preferované formě vynálezu se vezme ze skladovací nádoby suspenze obsahující MGP podle předkládaného vynálezu a přidá se v určitém množství k různým reakčním nádobám. Reakčními nádobami můžou být reakční zkumavky vyrobené z plastiku nebo mikrotitrační destičky s 69 nebo 384 (nebo i více) jamkami, kde může proběhnout reakce. Tyto nádoby můžou ale být i z jiných materiálů, například ze železa.
Preferovanou formou vynálezu jsou purifikační metody následované detekčním krokem, nebo purifikační metody následované amplifikačním a detekčním krokem. Cílová nukleová kyselina nebo nukleové kyseliny, které nás zajímají, můžou být obsažené v prostředí ne-cílových nukleových kyselin a můžou být dokonce minoritní součástí této zmíněné směsi specifických nukleových
kyselin. Vhodné DNA detekční metody jsou známé odborníkům v této oblasti a jsou popsané ve standardních učebnicích, jako Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Addition, Cold Spring Harbour University Press, Cold Spring Harbour, NY a Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY. Před detekcí DNA se může provést další purifikační krok, například precipitační krok. Detekční metody můžou zahrnovat kromě jiného navazování nebo interkalaci specifických barev, jako je etidiumbromid, který se vmezeří do dvoupramenné DNA a tak změní svojí fluorescenci. Purifikovaná DNA se mže také rozdělit pomocí elektroforetických metod, někdy pro rozštěpení restrikčními enzymy, a poté vizualizovat. Existují, také stanovení založené na sondách, které využívají hybridizaci oligonukleotidů ke specifickým sekvencím a s následnou detekcí hybridu. Je také možné, po určitých krocích známých odborníkům, DNA sekvenovat. Novější metody využívají různorodosti DNA sekvencí ve spojení s křemíkovým čipem, ke kterému jsou přichycené specifické sondy - při navázání komplementární sekvence poskytují signál.
Preferovanými metodami podle předkládaného vynálezu psou amplifikační metody, jako ligázová řetězová reakce a polymerázová řetězová reakce, které specificky amplifikují cílovou sekvenci na detekovatelné množství. Zvláště preferovanými detekčními metodami jsou TaqMan metody, uvedené v WO 92/02638 a odpovídajících US patentech US 5,210,015, US 5,804,375, US 5,487,972. Tato metoda využívá exonukleázovou aktivitu polymerázy pro tvorbu signálu. Podrobněji - nukleová kyselina je detekovaná postupem zahrnujícím kontakt vzorku s oligonukleotidem, obsahujícím sekvenci komplementární k oblasti cílové nukleové kyseliny a se značeným oligonukleotidem, obsahujícím sekvenci komplementární k jiné oblasti toho samého řetězce cílové nukleové kyseliny, ale ne té sekvenci nukleové kyseliny, která byla definovaná prvním nukleotidem; tím vznikne při hybridizačních podmínkách směs duplexů zahrnující cílovou nukleovou kyselinu s přichyceným prvním oligonukleotidem a se značeným.oligonukleotidem tak, že 3'- konec prvního nukleotidu je přilehlý 5'- konci značeného nukleotidu. Pak se na tuto směs působí s na templátu závislou polymerázou nukleových kyselin s 5'-3' nukleázovou aktivitou, za podmínek dostatečných pro tuto 5'-3' • · • · · · nukleázovou aktivitu polymerázy rozštěpit připojený značený nukleotid a uvolnit značený fragment; signál produkovaný hydrolýzou značeného oligonukleotidu je detekován a/nebo měřen. TaqMan technologie eliminuje potřebu reakčních komplexů navázaných na pevnou fázi nutných pro detekci.
V obecnějším smyslu je uvedená procedura pro purifikaci biologického materiálu následovaná detekčním krokem, kde je amplifikační a/nebo detekční reakce homogenním multiplexovým testem v roztoku pro současnou detekci více cílů (viz Příklad 7.2).
V jiné formě vynálezu je popsaný purifikační postup kombinovaný s amplifikčním postupem s využitím jedné z dále popsaných metod, přednostně využitím blokujících nukleotidů. Problém často spojený s amplifikací, zejména malých množství nukleových kyselin, je aktivita termostabilní polymerázy při nižší teplotě (pokojová teplota až do 40 °C). Při této teplotě se primerové oligonukleotidy často vážou nespecificky jeden ke druhému nebo k nespecifické nukleové kyselině a můžou být polymerázou prodlužovány. To má za následek pokles reakčních komponent a také vyšší hladinu pozadí a následovně snížení citlivosti. Také to může vést k falešně pozitivním výsledkům. Aby se omezila nespecifická aktivita polymerázy, bylo popsáno několik postupů, jako „hot-start-PCR (Chou et al., 1992, Nucl. Acid Res. 20, 1717-1723), použití kovalentně modifikované polymerázy (např. AmliTaq Gold, Perkin Elmer) nebo protilátky (Scalice et al., J. Immunol. Methods, 172, 147-163, 1994) a oligonukleotidu (Dang a JMB 264, 268-278, 1996; US 5,763173;
ÚS 5,693,502). Podle předkládaného vynálezu blokující oligonukleotidy budou oligonukleotidy, které jsou schopné blokovat aktivní centrum polymerázy až do uvedené teploty. Tyto oligonukleotidy můžou být například aptamer (aptamer), jak je to popsané v Příkladu 7.2.2.1.3
V jiné formě vynálezu se můžou použít v amplifikačni reakci a návazných detekčních metodách aptamery (viz např. Příklad 7.2.2.1.3) a/nebo samotné modifikované primery (viz napříkld Příklad
7.2.2.1.3). To je výhodné a může se to považovat za vynález sám o sobě, který poskytuje lepší výsledky. V preferované formě vynálezu je 3'- koncová nukleotidová báze, nejlépe adenin, modifikovaná
p-(t-butyl)-benzyl zbytkem. Další modifikace, včetně těch na 3'-l pozici jsou popsané v EP 866 071 A2 a jsou tak zde zahrnuté odkazem.
V ještě jiné formě vynálezu pro purifikaci biologického materiálu následovaného detekčním krokem je uveden (postup), kde je alespoň po 5 cyklů polymerázové řetězové reakce teplota nasedání primerů (annealing temperature) nižší o 8 °C, nebo lépe nižší než 3 °C, než disociační teplota komplexu polymeráza-aptamer.
Následující příklady slouží k ilustraci forem vynálezu.
Popis obrázků:
Obrázek 1: Schéma postupu pro výrobu sol syntézou a sušením rozprašováním
Obrázek 2: Schéma postupu při přípravě surových MGP.
Obrázek 3: Schematické zobrazeni rozprašovací sušičky - výrobek
Nubilosa. Detaily jsou popsané v textu pod Příkladem 1.3
Obrázek 4: Vysokorozlišující obrázek MGP s Merck pigmentem BM z rastrovacího elektronového mikroskopu
Obrázek 5: Vysokorozlišující obrázek MGP s CERAC pigmentem z rastrovacího elektronového mikroskopu
Obrázek 6: Vysokorozlišující obrázek MGP s Merck pigmentem MMB z rastrovacího elektronového mikroskopu
Obrázek 7: Vysokorozlišující obrázek MGP se Strem pigmentem z rastrovacího elektronového mikroskopu
Obrázek 8: Vysokorozlišující obrázek MGP s BASF pigmentem FA z rastrovacího elektronového mikroskopu
Obrázek 9: Vysokorozlišující obrázek MGP s BASF pigmentem CE-HQ z rastrovacího elektronového mikroskopu
Obrázek 10: Vysokorozlišující obrázek MGP s BASF pigmentem
CE-SU z rastrovacího elektronového mikroskopu
Obrázek 11: Vliv magnetického jaderného pigmentu nebo rozprašovací sušičky na izolaci RNA (rozprašovací sušička: Buchi (B) nebo Nubilosa (N))
Obrázek 12: Vliv parametru „rozprašoavací tlak na izolaci DNA nebo RNA ·· · ♦····· • · · · · · • · · · · · · • ♦····· · · • · · · · · ···· · · · ·9
Obrázek 13: Vliv různých parametrů při produkci MGP na izolaci RNA (rozprašovací tlak, (L=vzduch, N=dusík), teplota přívodu (E) nebo teplota vývodu (A))
Obrázek 14 a, b: Sedimentační chování různých MGP v různých suspensních médiích
Obrázek 15: HREM-obraz vzorku EJ0096.5R-01; MGP s CERAC pigmentem
Obrázek 16: HREM-obraz vzorku EJ0100.5R-01, rozprášeném při nízkém tlaku a vysoké teplotě, skládajícího se hlavně z deformovaných μ-částic
Příklad 1: Výroba magnetických skleněných částic
Klasicky, surové materiály jako SiO2 a alkalické uhličitany nebo uhličitany alkalických zemin (Na2CO3, K2CO3 nebo CaCO3) se společně roztaví typ reakce:
Na2CO3 + SiO2 -> Na2SiO3 (= Na2O SiO2) +C02'
K2CO3 + SiO2. -» K2SiO3 (= K20 SiO2) +002’
CaCO3 + SiO2 -4 CaSiO3 (= CaO SiO2) +C02 1
Ve většině případů se ale používá kompozitní matrice silikátů, boritanu a hlinitanu, tj. v související matrix je SiO2 částečně nahrazen B2O3 a A12O3. Nebo se sklo může syntetizovat sol-gel reakcí.
typ reakce:
buď kyselinou katalyzovaná sol-gel reakce, například:
BC13 + 3 H20 -4 B(OH)3 + 3 H<+)Cl(-)
A1C13 + 3 H20 -4 Al(OH)3 + 3 Η<+)01(->
SiCl4 + 4 H20 -> Si(OH)4 + 4 H<+)C1,_)
Na(+,N03(_1 + H20 —4 Na(+)OH( ) + H,+) N03(_)
k(+) (_)oocch3 + H20 -> K(+> OH* -) + H(+) (_)OOCCH
nebo zásadou katalyzovaná, jako v našem případě, například:
9 9 • 9
Kt+) <->OCH2CH3 + H20 ->· K(+)OH(_) + HOCH2CH3
Na^^^OCHa + H20 -> Nal+)OHt-’ + HOCH3
A1(3+i t MOCH2CH2CH3] 3 + 3 H20 -> AI (OH) 3 + 3 HOCH2CH2CH3
B(OCH2CH3)3 + 3 H20 -» B(OH)3 + 3 HOCH2CH3
Výhoda: alkoholy se během sušení rozprašováním snadno vypaří; v ideálním případě nedochází k rekrystalizací solí na povrchu.
Alkoholáty jsou tedy změněny na hydroxidy, které po eliminaci vody poskytují odpovídající oxidy. Ty následovně vytvoří 3-rozměrnou amorfní skleněnou hmotu skládající se z Si02/B2O3/Al2O3, do které jsou začleněny určité oxidy kovů, jako oddělovače vazby matrix (matrix bond separators), např.
—Si—O---SÍ—sb=£> —Si~Zn—-Si
Pro experimenty zde popsané byly skleněné složky připraveny sol-gel syntézou katalyzovanou zásadou. Složení skla ve všech experimentech (pokud není uvedeno jinak) bylo následující:
70,67Mol%Si02, 14,33Mo1%B203, 5,00Mo1%A12O3, 4,00Mol% K20, 2,00 Mol%CaO, 4,00Mol%2nO (vypočítané z hmotnosti jednotlivých složek vnesených do reakce)
1.1 Popis zkoumaných magnetických pigmentů
Zkoumaly se různé typy magnetických pigmentů a výsledky jsou shrnuté v Tabulce 1.
1.2 Výroba potahovacího sólu (EJ-směs)
Výtažky (educts) se přidávají v následujícím pořadí a množstvích do vyhřívatelné promíchávané nádoby:
Tetraetoxysilan (Tetraethoxysilane - TEOS) Trietylborát (Triethylborate - TEB)
K-metanolát.
(K-metanolate) 25% (váha/objem) v metanolu etanol
Isopropanolát hliníku (aluminiumisopropanolate) Vápník
Octan zinku (Zincacetatej
10700 ml
3305 ml
1601 ml 11292 ml 1385 g 54,4 g 498 g
Poté se nádoba uzavře. Sol se zahřeje na 70 °C a promíchává přes noc (15 h). Teplota se reguluje pomocí termosenzorů, které jsou ponořené do tekutiny.
Pak se sol zahřívá na 90 °C a přidá se směs alkohol/voda (etanol: 3781 ml, H2O: 1512 ml) rychlostí 5000 ml/h. Po úplném přidání této směsi se nádoba ochladí na 20 °C.
Otevře se víko a za intenzivního promíchávání se přidá 10 249 g magnetického pigmentu (CERAC). Připravený sol se hadicí přemístí do rozprašovací sušičky.
1.3 Sušení rozprašováním
Teplota přívodu rozprašovací sušičky je nastavena na 200 °C. Tlak trysky je nastaven na 6 barů a tryska se 3 minuty ochlazuje etanolem. Pak se připojí na vývod skleněné nádoby hadice a pigment obsahující sol se pumpuje ultrazvukovým zařízením (200W) rychlostí 110 ml/min do dvoukapalinové trysky (průměr otvoru: 2 mm; dodavatel: Nubilosa, Type 1B1VVS1) rozprašovací sušičky. Sušící rozprašovací zařízení je znázorněné schematicky na Obrázku 3. Částice vytvořené během prvních dvou minut se vyhodí. Po úplném rozprášení sólu se kontejner pod odlučovačem (cyclone) (AVO, viz Obrázek 3) s částicemi odebere a částice se v dalších krocích upraví.
Aby se předešlo sedimentaci suspendovaných částic, pigment obsahující sol se míchá v míchací nádobě. Sol se přemístí z nádoby do trysky pomocí pumpy (SP). Jako sušící plyn se využívá dusík ohřívaný elektrickým ohřívacím zařízením (EWT). Obalený pigment se přemístí z sušící komory (T) do odlučovače (ZY). Suchý prášek se pak vyjme z kontejneru (AVO) pod odlučovačem. Velmi jemné částice se odstraní dusíkovým filtrem (SF). Aby se zabránilo nasátí vzduchu do sušičky používá se rozprašovací sušička s přetlakem. Vzduch je foukán pomocí dmychadla (AV).
1.4 Další zpracování rozprašováním vysušeného prášku
Prášek se přenese do keramické misky a zahřeje v peci na 200 °C rychlostí lK/min. Pak se teplota 200 °C udržuje po dobu jedné hodiny a poté se pec ochladí na pokojovou teplotu. Miska se přenese do atmosférické pece o objemu 27 1, která se promývá 60 1 dusíku za hodinu. Pec se zahřeje na 750 °C rychlostí lK/min a tato teplota se udržuje 1 hodinu. Pak se pec ochladí na 150 °C a promyje 60 1 vzduchu za hodinu. Pec se zahřeje na 200 °C rychlostí 2K/min; tato teplota se udržuje 1 hodinu a pak se ochladí na teplotu. Pak se prášek přenese na síto (50 pm) a 30 minut přesívá. Přesátý vzorek se naplní do skleněných nádob, které se nezavřené sterilizují v peci zahřáté rychlostí 1 K/min na 200 °C; tato teplota se udržuje 4 hodiny a pak se sníží na 80 °C. Pak se skleněné nádoby vyjmou z pece, pokryjí sterilní fólií a uzavřou víčkem. Přehled důležitých parametrů procesu je v Tabulce 2 a Tabulce 3, připravené individuální vzorky s některými údaji jsou poskytnuté v Tabulce 3. Každý vzorek má specifický kód. První dvě písmena popisují použitou chemii skla (viz níže) a další čtyři čísla kódují výrobní proces (viz Tabulka 2). Další číslo popisuje použitý pigment (Tabulka 1). Písmeno R znamená, že se neodstranil jemný obsah, zatímco písmeno E znamená, že se jemný obsah etanolem odstranil. Poslední dvě číslice popisují číslo šarže. Složení skla (kód EJ) vypočítané z množství složek vnesených do reakce bylo 70.67Mol%Si02, 14.33Mol%B203,
5.00Mol%Al2O3, 4.00Mol% K20, 2.00 Mol%CaO, 4,OOMol%ZnO. Složení skla (kód RN) bylo 74 Mol%Si02, 15 Mol%B203, 5.00 Mol%Al203, 4.00 Mol% K2O, 2.00 Mol%CaO. Složení skla (kód EP) bylo 73.61 Mol%Si02, 14.93 Mol%B203, 5.21 Mol%Al203, 4.17 Mol% K2O, 2.08 Mol%CaO.
• 9 ··· · • · · · ··· · · · · · ··· · · · ·· ····«·· · 999 9 • · ······
9999 9 99 99 99
Příklad 2: Vysokorozlišovací rastrovací elektronová mikroskopie
Aby se získala informace o povrchu, velikosti a tvaru MGP, provedli jsme vysokorozlišovací rastrovací elektronovou mikroskopii (výrobek firmy JEOL - JSM). Vzorky se elektricky vodivým oboustranným pojidlem (electrically conducting double-sided adhesive) rozptýlily na nosič vzorků a poprášily zlatém po dobu 36 vteřin proudem 30 mA. Pro zobrazení povrchu se použily emitované sekundární elektrony (topografie - topography) a také zpětně rozptýlené elektrony (back scattered electrons) (pravidelný číslovaný kontrast?? - order number contrast). Použité primární elektronové napětí bylo 10 kV (sekundární elektrony) nebo 25 kV (zpětně rozptýlené elektrony).
Obrázek 4 ukazuje MGP se slídou, pokryté oxidem železitým jako magnetickým pigmentem (BM). Je možné zřetelně vidět trhlinu ve skleněném plášti, která pochází ze sušení částic rozprašováním, když se začíná srážet vrstva na nesrazítelném substrátu (smršťovací trhlina vzniklá vysýcháním). Kromě toho je možné vidět větší počet kulovitých částic, které neobsahují jednu z větších magnetických částic (10-60 pm) . Tyto koule bez magnetického jádra (jemný nemagnetický obsah) se nemůžou odstranit v magnetickém poli, můžou se přenést do PCR reakce a interferují s touto reakcí.
Částice s CERAC pigmentem (viz Obrázek 5) nemají trhliny, protože magnetický pigment (průměrná velikost částice 23 nm) nevytváří ve vrstvě tenzní síly, takže nedochází k tvorbě trhlin při procesu sušení rozprašováním. Kromě toho jsou malé CERAC částice také začleněné v jemném obsahu, takže zde nejsou nemagnetické částice. Částice jsou také podstatně menší než částice se slídou, které je možné pozorovat na těchto obrázcích se stejným zvětšením.
Na obrázcích 6 až 10 jsou také ukázány MGP s ostatními magnetickými pigmenty při stejném zvětšení.
Příklad 3: Fyzikální výzkum MGP ··♦♦
4444 • 44 · 4 444
494 44 4 · ·
444444 4 444 · • 4 4444 44 ·44· 4 44 44 44
Pro zhodnocení MGP před skutečnými, funkčními testy se provedlo kromě HREM zkoumání další fyzikální měření MGP. Bylo zajímavé poučit se o rozpustnosti železa ve vodě, magnetické síle, jemném obsahu a hustotě. Dále jsou tyto experimenty popsané a uvedené výsledky.
3.1 Měření extinkce
Aby se testem zjistilo, jestli se odstranily jemné částice, navážilo se 1000 mg teplotně opracovaného a přesátého prášku do 50 ml centrifugační kyvety (Sarstedt), přidalo se 40 ml vody a třepáním se obsah promíchal. Pak se kyveta ponoří do výše naplnění (with the total filling height) do ultrazvukové lázně (Sonorex (RK 102H; 120/240W) a pak se umístí do magnetického separátoru (Roche Diagnostics GmbH RD Art Nr. 1858 025). Po 3,5 minutách magnetické separace se skleněnou pasterkou odebere z nádoby tekutina až k 15 ml značce na straně protilehlé magnetu a tou se naplní 5 mm křemenná kyveta (typ 110-QS, Hellma). Extinkce supernatantu se měří UV-VIS-NIR spektrofotometrem (Hitachi U-3000) oproti odpovídající kyvetě naplněné deionizovanou vodou. Aby se zjistil rozsah vlnových délek absorpčních pásem případných nečistot, měřilo se v rozsahu 200 až 1100 nm v 1 nm krocích. Extinkce při vlnové délce 280 nm a 400 nm se vzaly jako referenční.
3.2 Měření hustoty
Pro měření hustoty se použil plynový pyknometr (AccuPyc 1330,
Fa. Micromeritics). Jako plyn se použilo helium 6.0. Přístroj se kalibroval poskytnutým standardem (kovové kuličky o známém objemu).
Dále se vzorek sušil alespoň 1 hodinu při 150 °C a pak naplnil do měřícího kontejneru a zvážil. Po změření se kontejner umístí do plynového pyknometru a použije se 10 promývacích cyklů a 5 měřících cyklů pro určení průměrné hodnoty a standardní odchylky.
3.3 Určení rozpustnosti železa
Rozpustnost železa obalených (coated) a tepelně opracovaných vzorků se určí Indukčně vázanou plazmou (Inductive Coupled Plasma) 29 ·· · ·« ···· • · · · · » • · · · · · • ♦ · · · · ♦ • · · * ····
99 ·· ··
Atomovou emisní spektroskopií (JY 24, společnost ISA). Proto se přemístil 1 g vzorku do 50 ml polypropylenové zkumavky naplněné destilovanou vodou a udržoval 20 hodin při teplotě 60 °C. Pak se vzorky filtrují 0,2 um injekčním filtrem a filtrát se změří.
Provedou se čtyři jednoduché určení při vlnové délce 259,940 nm a pak se z nich vypočítá průměrná hodnota.
3.4 Měření magnetické síly
Pro měření magnetické síly se zvážila MGP úplně naplněná vážící zkumavka PP (PP-weighing tube) (Company Licefa, Art. Nr. V2-3).
S pomocí šablony se tento obal vzorku umístí do středu LDPE zkumavky (Company Kartell, TS 735) , zatížený mosazí tak, že se víčko zkumavky dalo stále zavřít. Nádoba se s pomocí jiné šablony umístí do středu váhy (přesnost vážení 0., 1 g) . Po ustanovení rovnováhy vah se nad stupnici umístí plastický vršek, který obsahuje magnet ve tvaru válce (průměr: 30 mm; výška: 113,5 mm; samarium-kobalt 2/17).
Tak jsou MGP na váze přitahovány proti gravitaci a snižují tedy svojí váhu. Po ustanovení rovnováhy (1,5 minuty) se určí úbytek váhy vzorku a hodnota se standardizuje na 250 mg MGP.
3.5 Výsledky
Výsledky fyzikální charakterizace MGP s EJ složením a různými pigmenty jsou shrnuté v Tabulce 3. Stojí za povšimnutí, že hodnoty extinkce jsou velmi nízké, když se použije CERAC pigment. To se může vysvětlit nedostatkem nemagnetického jemného obsahu, protože malé CERAC pigmenty (23 nm) se můžou začlenit do každé magnetické skleněné částice. Hustota CERAC-MGP není příliš velká. To má pozitivní vliv na rychlost sedimentování. Magnetická síla je podrobená velkým výkyvům, avšak je pozitivně ovlivněná použitím CERAC pigmentů. CERAC-MGP mají poměrně vysoký únik železa do vody.
Ale ani desetinásobně vyšší hodnoty nevykazují žádný vliv na proces PCR.
Stručně řečeno se může říct, že mezi různými pigmenty nejsou žádné významné rozdíly ve fyzikálních vlastnostech, ale CERAC-MGP má velmi nízký jemný obsah.
·· · ·· ···« ·· ···· ··· 4 4 ··· 4 ··· · 9 9 ·· · ••••444 · 4 4 4 · 4 • · · 4 4 4 4 · · 4
4. Příklad 4: Vliv magnetického jaderného pigmentu a rozprašovací sušičky na BET povrch
Povrch se určil s využitím přístroje od Micromeritics (Type ASAP 2400). Měření se provádělo při teplotě tekutého dusíku. Jako měřící plyn se použil dusík 5.0 (Nitrogen 5.0) a jako inertní plyn se použilo helium 4.6. Typicky se pro jedno měření použil 5g vzorek.
Povrch MGP hraje zřejmou roli při izolaci DNA a RNA. Čím je povrch větší, tím více DNA se může navázat na to samé množství MGP. Je také možné použít menší množství MGP a dosáhnout toho samého výsledku. To má za následek to, že je mezizrnový (intergrain) objem menší a že se tedy dostane menší množství kontaminujícího alkoholu do PCR reakce. Údaje o změřených BET-površích u některých vzorků jsou shrnuté v Tabulce 4. Když se porovnají povrchy vzorků připravených na velkých rozprašovacích sušičkách, mělo by se upozornit na to, že vzorky s malými pigmenty (BASF FA, STREM a CERAC) mají relativně velké povrchy, zatímco velké pigmenty Merck mají malé povrchy. To může být způsobené skutečností, že velké magnetické částice vytváří velké MGP, zatímco malé magnetické částice jsou zainkorporované do kulovitých kapiček během procesu sušení rozprašováním a mají tedy za podobných podmínek procesu sušení rozprašováním podobné povrchy. BASF CE-SU částice mají částice o velikosti od malých (jako BASF FA, STREM a CERAC) až po velké Merck částice. Ve srovnání s Merck částicemi nemají strukturovaný povrch, takže tyto částice mají velmi hladký skleněný povrch. To má za následek menší povrch. U menší rozprašovací sušičky se použil vyšší tlak a tryska této rozprašovací sušičky je výrazně menší než u větší rozprašovací sušičky. To vede k menším částicím a výrazně se zvětší povrch. To je v souladu s výsledky Příkladu 5.2.1.
Jakýkoliv vliv magnetického pigmentu nebo rozprašovacího tlaku na výsledky dalších fyzikálních zkoumání je nedefinovatelný, kromě výše zmíněného vlivu na tvorbu trhlin a jemný obsah. Ale pouze měření povrchu vykazuje přímé spojení s výsledky funkčních zkoumání. Další výsledky fyzikálního zkoumání nevykazují tento přímý vztah.
·· ··«·
9999
9 ·
9 9 9
9999
9 •
• ·
Příklad 5.: Vazebné studie pomocí stopování radioaktivity
Existuje několik metod na hodnocení MGP, co se týče jejich vhodnosti k extrakci nukleových kyselin. Stanovení extinkce při 260nm před a po purifikaci není velmi citlivé a nepodobá se situaci, při které je extrahováno malé množství cílové nukleové kyseliny z klinického materiálu. Výsledky funkčních vyhodnocovacích metod, které se spoléhají na metody amplifikace nukleových kyselin, jako jsou např. PCR, RT-PCR, NASBA či jakékoliv podobné metody, nejsou většinou dostatečně přesvědčivé. Kromě toho tyto metody, které jsou vhodné pro stanovení malého počtu kopií cílového genomu, jsou náchylné na látky, které se mohou nacházet ve vzorcích či na látky používané během přípravy vzorků. Vazebné studie pomocí radioaktivity jsou vhodnou analytickou metodou, která dovoluje analyzovat proces přípravy vzorků krok po kroku. Data týkající se účinnosti nejsou absolutní data, ale jsou vždy relativní k účinnosti referenčních častíc.
5.1 Experimentální protokol
Nejdříve je syntetizována enzymaticky, pomocí PCR, radioaktivně značená DNA nebo RNA nebo in vitro transkripcí, v přítomnosti 32Pznačeného deoxynukleosidu nebo nukleosidtrifosfátu. Poté je značená DNA nebo RNA oddělena od volných nukleosidtrifosfátů. Stanoví se obsah nukleových kyselin a je připraven definované naředění. Malé množství značené DNA nebo RNA se přidá do každého vzorku před pokusem. Během přípravy vzorků se za přítomnosti chaotropních látek všechna nukleová kyselina naváže na MGP. MGP jsou odděleny (peletovány) vystavením magnetickému poli a slije se supernatant. Pelet se promyje a navázané nukleové kyseliny se eluují při zvýšené teplotě opačnými reakčními podmínkami, např. přídavkem elučního pufru s nízkým obsahem solí. Po navázání a případném promývacím kroku se alikvótní část supernatantu nanese na fitr. Také eluát a ve vodě dispergované MGP se taktéž nanesou na filtr. Filtry se poté usuší a nakonec se změří jejich radioaktivita. Pro každý vzorek se spočítá distribuce redioaktivity.
· 9» 9999 99 9999 • 9 · 99 999 9
99* *· · 9* 9
9999 *99 9**9 9 • 9 9999 9999
9999 9 99 ·9 99 99
5.1.1 Příprava radioaktivně značené DNA
5.1.1.1 A.1.1. Reagencie
- Expand High Fidelity PCR Systém (Roche Molecular Biochemicals, kat. č. 732641)
- směs dNTP (Roche Molecular Biochemicals, kat. č. 1277049)
- deoxycytidin 5'-alfa-P32 Trifospfát dCTP 3000 Ci/mmol (Amersham kat. č. PB 10205)
- lambda-DNA (Roche kat.č. 1029053), koncentrace lng/ml
- radioznačkovací primer 1 (SEQ ID NO 1) koncentrace
5,3 OD260/ml
- radioznačkovací primer 2 (SEQ ID NO 2) koncentrace
5,2 Οϋζβο/π'ί
- QIA Quick PCR Purification Kit (Qiagen kat. č. 28104)
5.1.1.2 Reakce
- 29,5 μΐ dvojnásobně destilované vody
- 5 μΐ Expand High Fidelity pufr
- 2,5 μΐ směsi dNTP (1:10) ředěné dvojnásobně destilovanou vodou
- 1 μΐ radioznačkovací primer 1 (SEQ ID NO1)
- 1 μΐ radioznačkovací primer 2 (SEQ ID NO 2)
- 0,3 μΐ 32P-dCTP
- 10 μΐ lambda-DNA
- 0,75 μΐ enzymové směsi Expand High Fidelity
5.1.1.3 Amplifikace
- 2 min. 94 °C
- 10 cyklů (10 sek. 94 °C / 30 sek. 60 °C / 60 sek. 72 °C)
- 20 cyklů (10 sek. 94 °C / 30 sek. 60 °C / 60 sek. 72 °C + 10 sek. 72 °C prodloužení na cyklus)
- 7 min. 72 °C
- 4 °C ·· ·«·· • 9 · ·· * • · 9 ···«
·· ·*
5.1.1.4 Purifikace
- podle protokoulu QIA Quick PCR Purification Protocol (Qiagen)
5.1.1.5 Ředění
Ředění DNA 1:10 v dvojnásobně destilované vodě a měření radioaktivity
5.1.2 A.2. Příprava radioaktivně značené RNA
5.1.2.1 - Reagencie
- SP6/T7 Transcription Kit (Roche Molecular Biochernicals kat. č.999644)
- Uridin 5'-alfa-P32 Trifosfát DTP 3000 Ci/mmol (Amersham kat. č. PB 10203)
- Plasmid pBKBHlOS, linearizovaný EcoRI v koncentraci 100pl/ml
- High Pure RNA Isolation Kit (Roche Molecular Biochernicals kat. č. 1828665)
5.1.2.2 - Reakce
- 2μ1 lOx pufru
- 3μ1 směsi NTP (AGC)
- 1 μΐ UTP (1:50 s dvojnásobně destilovanou vodou)
- 5 μΐ 32P-UTP
- 7 μΐ linearizovaného plasmidu
- 1 μΐ RNAse Inhibitor (Roche Molecular Biochernicals kat. č. 802808)
- 1 μΐ T7 RNA-Polymerasy
5.1.2.3 Transkripce a rozštěpení pomocí DNAsy
- 20 min. inkubace při 37°C
- přidání 2 μΐ DNAsy, RNAse free • · · · • · · · · ·
- 10 min. inkubace při 37 °C
- přidání 178 μΐ dvojnásobně destilované vody
5.1.2.4 - Purifikace
- podle High Pure RNA Isolation Protocol (Roche Molecular
I
Biochemicals)
5.1.2.5 Ředění
Ředění RNA v poměru 1:30 dvojnásobně destilovanou vodou a měření radioaktivity.
5.1.3 Příprava radioaktivního vzorku
5.1.3.1 Reagencie
- negativní plasma
- Proteinasa K, koncentrace 20 mg/ml (např. Roche, č. 1942387)
- Poly-A-RNA (např. Roche, č. 1942387), koncentrace lmg/mlz ředěno 1:1000 (objem na objem) lyzačním pufrem
- lyzační pufr (50mM Tris pH 7,0, 15% (obj/obj) Polydocanol, 5M guanidin isothiokyanát, 1 mM DTT)
- MGP (s EJ složením skla a různými pigmenty jádra (BM, MMB, CERAC, STREM, BASF-FA, BASF-CE)) suspendované v isopropanolu 60 mg/ml nebo 6 mg/ml
- promývací pufr (20 mM Tris pH 7,5, 20 mM NaCl, 70% (obj./obj.) etanol)
- eluční roztok: redestiovaná voda
- pomocný materiál: Filtr Whatman GF/D
5.1.3.2 Reakce (protokol pro 1,5 ml)
- 80 μΐ Proteinkinasy K
- přidat 410 μΐ negativní plasmy a zamíchat
- přidat 500 μΐ lyzačního pufru a zamíchat
- přidat 10 μΐ radioaktivně značené DNA nebo RNA, zamíchat * ··:· · : i . · * · ·· · ···· · · · * *
- 10 min. inkubace při pokojové teplotě za míchání
- přidat 500 μΐ suspenze MGP (koncentrace 6 mg/ml) a zamíchat
- 20 min. inkubace při pokojové teplotě za míchání
- dvouminutové ddělení v magnetickém separátoru (Magnetic separator, Dynal)
- odstranění supernatantu a nanesení 300 μΐ na filtr
- přidat 750 μΐ promývacího pufru, zamíchat, 2 min. separovat
- odstranit supernatant, případně nanést 375 μΐ supernatantu na filtr
- opakování promývací postup dvakrát
- přidat 100 μΐ elučního roztoku, inkubace 5 min. při 80 °C za stálého míchání
- separace 2 min. v magnetickém držáku , nanesení supernatantu na filtr
- přidání 100 μΐ elučního roztoku, resuspendovat a nanést MGP na filtr
- usušit filtry 60 min. při 75 °C v sušárně
- přenést filtry do scintilačních lahviček, přidat 5 ml scintilačního roztoku a změřit radioaktivitu
5.1.3.3 Experimentální protokol (na 1 ml)
- 25 μΐ Proteinkinasy K
- přidat 415 μΐ negativní plasmy a zamíchat
- přidat 500 μΐ lyzačního pufru a zamíchat přidat 10 μΐ radioaktivně značené DNA nebo RNA, zamíchat
- 5 min. inkubace při pokojové teplotě při míchání
- přidat 50 μΐ suspenze MGP (koncentrace 60 mg/ml) a zamíchat
- 20 min. inkubace při pokojové teplotě za míchání
- dvouminutové ddělení v v magnetickém separátoru (Magnetic separator, Dynal)
- odstranění supernatantu a nanesení 300 μΐ na filtr
- přidat 700 μΐ promývacího pufru, zamíchat, 2 min. separovat
- odstranit supernatant, případně nanést 350 μΐ supernatantu na filtr
- dvojnásobné opakování promývacích kroků • ·
- přidat 120 μΐ elučního roztoku, inkubace 10 min. při 80 °C za stálého míchání
- separace 2 min. v magnetickém držáku , nanesení supernatantu na filtr
- přidání 100 μΐ elučního roztoku, resuspendovat a nanést MGP na filtr
- sušit filtry 60 min. při 75 °C v sušárně
- přenést filtry do scintilačních lahviček, přidat 5 ml scintilačního koktejlu a změřit radioaktivitu
5.2 Výsledky experimentů pomocí radioaktivního stopování
5.2.1 Vliv magnetického jaderného pigmentu nebo rozprašovací sušičky na izolaci RNA
Charakterizovaly se rozdílné typy MGP, které se připravily za použití EJ skleněné chemie a rozdílné jádra o nano nebo mikro velikosti (MMB, CERAC, atd.) a za použití rozdílných rozprašovacích sušiček (Bůchi nebo Nubilosa) s ohledem na jejich chování během extrakce nukleových kyselin z materiálu prostého virů (negativní plasma). Charakterizace proběhla za pomocí radioaktivního stopování, metodou podle příkladu 5.1.3.2. RNA parametr se během studií ukázal jako nejcitlivější materiál a vybral se proto jako typická veličina. Obrázek 11 ukazuje, že BASF-CF není vhodný jako materiál pro jádro, protože v eluátu se nachází- pouze malá část navázané RNA. Částice EJ/CERAC, rozprašované pomocí systému Buchi při 6 barech, vykazovaly stejnou účinnost jako referenční částice EJ/MMB, které byly rozprašovány pomocí Nubilosa systému.
5.2.2 Vliv parametru tlaku při rozprašování na izolaci DNA nebo
RNA
Rozdílné typy MGP připravené pomocí systému Nubilosa s použitím rozdílných rozprašovacích tlaků jsou porovnány podle 5.1.3.3. Referenčními částicemi jsou EJ/MMB MGP. Zkoumaly se vazebné vlastnosti DNA a RNA. Zatímco DNA parametry neukazují závislost na rozprašovacím tlaku, RNA parametry vykazují významné rozdíly v • · • · · · • ···· · · • · · ·· · · *
účinnosti. Účinnost částic EJ/CERAC, připravovaných při rozprašování tlakem 1,5 barů za použití systému Nubilosa, je nižší, než účinnost referenčních částic. Nižší účinnost je u řady vzorků připravovaných rozprašováním tlakem, který se měnil mezi 1,5 a 3,4 barů (~ 30%) . Částice, které jsou rozprašovány tlakem 4,3 barů dosáhly 90% účinnosti částic, které jsou rozprašovány tlakem 1,5 barů (viz Obrázek 12). Experimenty dokázaly přímou souvislost mezi parametry přípravy MGP a účinností v testu. Mělo by se poznamenat, že zvyšující se tlak rozprašování vede k nižší účinnosti v testu, ale od určitého rozprašovacího tlaku jsou vlastnosti částic zlepšené a vedou k lepší účinnosti.
5.2.3 Vliv rozdílných parametrů přípravy MGP na izolaci RNA a
DNA
Tyto experimenty by měly vést ke zjištění, jestli rozdílné rozprašovací tlaky vedou k MPG s ještě lepší účinností.
Proto se MGP připravují systémem Nubilosa za tlaku 1,5 barů,
4,3 barů a 6 barů a s použitím dusíku jako rozprašovacího plynu. Aby se dosáhlo šetrného sušícího procesu, byly vstupní -i výstupní teploty rozprašovací sušičky dodatečně sníženy. Vliv těchto faktorů na izolaci RNA se zkoumal podle 5.1.3.3. a MGP částice EJ/MMB sloužily jako referenční.
Výsledky (viz Obrázek 13) ukazují překvapivý vliv dramatického snížení účinnosti, které je způsobené snížením teploty rozprašování a které se nemohlo předvídat. Zvýšením rozprašovacího tlaku se mohlo dosáhnout účinnosti referenční kvality. Takto připravené částice jsou lepší než referenční materiál, protože jsou současně stabilnější v suspenzi.
Příklad 6: Sedimentační analýza magnetických skleněných částic
6.1 Experimentální protokol
Pro zhodnocení sedimentačních vlastností magnetických skleněných částic se použil Spektrofotometr Uvikon, Model 930 firmy
Kontron Instruments. Tento spektrofotometr je modifikován tak, aby dovolil variabilní nastavení kyvety podél měřítka. Pro měření se kyveta nastaví do polohy, ve které měřící paprsek o vlnové délce 650nm protíná kyvetu ve 2/3 plnící výšky (měřící pozice 7,5). Používají se makrokyvety z polystyrenu o objemu 4 ml a šířkou 1 cm. Před měřením se udělá kalibrace pomocí jednopaprskového postupu proti čistému suspenznímu médiu. Vzorky MGP jsou dispergovány homogeně v suspenzním médiu, běžně při poměru hmotnost/objem 3 mg/ml, a ihned změřeny. Sledují se změny extinkce v čase, kontinuálně při dané vlnové délce (650 nm).
Fyzikální veličina používaná k porovnání sedimentační rychlosti rozdílných vzorků je poločas života (ti/2) v určitém suspenzním médiu. Je to časový úsek, ve kterém extinkce suspenze v horní třetině kyvety klesne na polovinu hodnoty, která byla na počátku měření. Snižování extinkce je způsobena sedimentací částic a s tím spojeným pročištění horní třetiny testovaného objemu.
Výše popsané zařízení dále umožňuje instalaci magnetu pod kyvetou. Takto může být stanovena rychlost magnetické separace.
6.2 Výsledky sedimentační analýzy
6.2.1 Experiment 1
Několik typů MGP s rozdílnými jádry v rozmezí nano nebo mikrometrů a vyrobených pomocí EJ sklenněné chemie se zkoumaly spektrofotometricky - zjišťovalo se jejich sedimentační a separační chování, tj. s a bez magnetu pod kyvetou. V tomto případě byl poměr hmoty ku objemu 6 mg/ml. Suspenzní médium byla směs izopropanolu a lyzačního pufru v poměru 1:1. Výsledky jsou sumarizovány v . Částice typu CERAC vykazují jasné výhody ve stabilitě suspenze, ale nemají žádné nevýhody pro magnetickou separaci (viz také Obrázek 14).
6.2.2 Experiment 2
Sedimentační chování rozdílných MGP typu CERAC vyrobených skelnou chemií EJ bylo zkoumáno v čistém izopropanolu.
Důležité výrobní parametry: .....
• · ♦ • ····
6» ···· • · • · teplota na vstupu teplota na vstupu teplota na vstupu
EJ0100.5R-01 - rozprašovací tlak 1,5 baru,
230°C, systém Nubilosa
EJ0108.5R-01 - rozprašovací tlak 4,3 baru,
230°C, systém Nubilosa
EJ0096.5R-01 - rozprašovací tlak 6,0 baru,
150°C, systém Buchi
EJ0096.5R-01 jsou ukázány na Obrázku 15. Tyto kuličky jsou většinou kulovité s vysoce strukturovaným povrchem a velikostí převážně 0,5-5 pm. Vzorek EJ0100.5R-01 rozprašovaný při nízkém tlaku a vysoké teplotě se skládá hlavně z deformovaných částic v pm měřítku (viz Obrázek 16, který ukazuje funkční ekvivalent k EJ0100.5R). Závěrem lze konstatovat, že částice jako EJ0096.5R-01 vykazují významné zpomalení sedimentace, což je nejvýhodnější pro přenos kapalných suspenzí MGP (viz Obrázek 14b). Výsledky jsou shrnuty v
Příklad 7: Funkční test pomocí PCR
7.1 Heterogenní funkční testy: amplifikace PCR s pomocí přístroje GeneAmp 9600 od firmy Perkin Elmer a detekce biospecifickým vazebným testem s chemiluminiscenčně značenou detekční sondou na modifikovaném ElecsyslOlO®.
7.1.1 Obecné úvahy
Virové částice ve vzorku (např. plazmě) jsou lyžovány v přítomnosti proteáz, vysoké koncentrace chaotropních solí' a také detergentů. Poté se přidá adsorbent částic (= MGP) pro fyzikálněchemickou adsorpci uvolněných nukleových kyselin na skleněný povrch. Následuje magnetická separace a promytí přidaných kuliček, tj. separace uvolněných a navázaných komponent. Nakonec se provede disociace navázaných nukleových kyselin z kuliček (= eluce) za opačných reakčních podmínek než je tomu u adsorpce, což znamená nízkou koncentrací solí v pufru či dokonce destilovaná vodou. Alikvótní část eluátu se poté smíchá s alikvótní částí PCR mastermixu k nastartování amplifikace nukleových kyselin izolovaných v eluátu. Tato reakce je charakterizována rovnicí:
• 4 • ••O ·· ···· ♦ · · • · · • · · • · · * ·· ··
Ni = No x (1+E)n, kde
No = počet molekul na začátku PCR
Ni = počet molekul na konci PCR
E = účinnost amplifikace = 0 E 1
N = počet reakčních cyklů = typicky 20 n á 35
Po PCR s alespoň jedním biotinylovaným primerem se aiikvót amplifikátu s navázaným biotinem smíchá s hybridizačním pufrem a detekční sondou. Po inkubaci se přidají kuličky potažené streptavidinem a následuje další inkubace. Nakonec se kuličky promyjí, přidá se signální pufr a změří se intenzita signálu chemiluminiscence, která odpovídá množství amplifikované navázané nukleové kyseliny a tudíž množství viru ve vzorku plasmy.
Odborník může také provést ručně 1 ml protokol.
7.1.2 Experimentální protokol
7.1.2.1 Reagencie
7.1.2.1.1 Příprava vzorku
- Proteinasa K v roztoku octanu vápenatého v glycerolu (20 mg/ml)
- Poly-A-RNA, 1 mg/ml, používá se ředění 1:1000 v lyzačním pufru
- Lyzační pufr obsahuje:
- Tris pufr, 50 mmol/1, pH 7,0 (1,0 a případně extrakční protokol) nebo 4,0 (l,5ml protokol)
- Polydokanol (Polydocanol), 15 % (v/v) (1,0 a případně extrakční protokol) nebo Triton X-100 20% (v/v) (1,5 ml protokol)
- guanidin izothiokyanát, 5 mol/1
- 1 mmol/1 DTT
- magnetické skleněné částice (MGP), buď typ EJ/BM, EJ/MMB nebo EJ/CERAC suspendované v izopropanolu (čistota 99,8%) v koncentraci mg/ml
- promývací pufr složený z
- Tris-pufr, 20 mmol/1, pH 7,5
• 4 4 • 4 4·· • · • · · · ·
- 60% etanol ve vodě (1,0 a případně extrakční protokol) nebo 70% (1,5 ml protokol)
- NaCl, 20 mmol/1 Eluent=redestilovaná voda
Amplifikace/Mastermix:
- PCR-pufr obsahující pufrační médium
RT-PCR (virus lidské imunodeficience (HIV Human immunodeficiency virus), virus hepatitidy C (HCVj): 250 mmol/1 Bicin/KOH pH 8,2, 557 mmol/1 octanu draselného, 40% glycerol
HBV-PCR (virus hepatitidy B (HBV)): 20 mmol/1 Tris-HCl pH 8,3; 100 mmol/1 KC1, 0,012% Brij 35 (=2x koncentrovaný) kationty kovů MgCl2 (HBV-PCR) 3 mmol/1 nebo MnCl2 (RT-PCR) 2,5 mmol/L (HCV) a 1,25 mmol/1 (HIV) deoxynukleosid trifosfát (dATP, dGTP. dCTP, dTTP, dUTP) pro analyt specifické dopředně primery (forward) pro analyt specifické zpětné primery (reverse)
Uráčil - N- glykosidasa (UNG)
DNA-polymerasa (Taq nebo Tth polymerasa pro HBV respektive pro HIV/HCV) demineralizovaná H2O (čistota pro molekulární biologii) pro úpravu objemu na 100 μΐ
Stop reagencie pro UNG po amplifikaci
N-lauroylsarkosin (např. Roche kat.č. 133895), 1% (váha/objem); 5 μΐ na 100 μΐ amplifikátu
7.1.2.1.2 Detekce hybridizační pufr (např. Roche kat. č. 1930273) chemiluminiscenčně značené detekční sondy:
HCV (Roche BMO 28.140336), pracovní roztok =8,0 nmol/1
HIV (Roche BMO 28.540948), pracovní roztok = 7,8 nmol/1
HBV (Roche BMO 28.540917), pracovní roztok =9,2 nmol/1
ECL kuličky pokryty SA (např. Roche kat.č. 1865943-001) denaturační roztok (např. Roche kat.č. 1930257) • 9 ····
ProCell (např. Roche kat.č. 1717685) CleanCell (např. Roche kat.č. 1717642)
7.1.2.1.3 Primery a sondy
Primer:
HIV-dopředný: SEQ ID NO
HIV-zpětný: SEQ ID NO 4
HCV-dopředný: SEQ ID NO
HCV-zpětný: SEQ ID NO 6
HBV-dopředný: SEQ ID NO
HBV-zpětný: SEQ ID NO 8
Detekční sondy:
HIV: SEQ ID NO 9
HCV: SEQ ID NO 10
HBV: SEQ ID NO 11
7.1.2.2 Reakční podmínky a pracovní postup
Příprava vzorku:
ml manuální protokol; => použitý pro Pokus 1 viz Příklad 7.3.1 přidat 25 μΐ proteinasy K k 425 μΐ vzorku s plasmou, promíchat přidat 500 μΐ lyzačního pufru , inkubovat 5 min. při pokojové teplotě s mechanickým mícháním (1300 ot./min. v třepačce Eppendorf) přidat 50μ1 MGP suspendovaných v izopropanolu (koncentrace 60 mg/ml), promíchat a inkubovat 20 min. při pokojové teplotě na roleru magnetická separace s použitím magnetického separátoru Dynal (2 min.);
odstranit nenavázanou frakci odsátím, přidat 700 μΐ promývacího pufru, promíchat, separovat a odsát;
zopakovat promývací postup ještě 4x ·· · •9 9999
9999 přidat 120 μΐ DEPC vody, promíchat a eluovat 10 min. při 80 °C v termomixéru Eppendorf při 1300 ot./min., vzorky jsou odzátkované oddělit kuličky od vodného supernatantu (=eluát) pomocí magnetického separátoru Dynal (2 min.) eluát zamrazit až do doby použití
Automatizovaný protokol použitý v námi vyvinutém extraktoru; => použitý v experimentech 2 a 3 (viz Příklad 7.3.2 a Příklad 7.3.3)
V podstatě stejný postup a reagencie jako v předchozím případě. Navíc je do každého vzorku přidána RNA interní kontrola (IC, viz níže). Extrakční postup je termosatován na 40 °C a objemy jsou upraveny na 2 ml celkového lyzačního roztoku, to znamená:
μΐ IC μΐ proteinasy K
850 μΐ vzorku
1000 μΐ lyzačního pufru
100 μΐ suspenze MGP
2200 μΐ promývacího pufru pro každý z pěti promývacích kroků
125 μΐ eluentu
1,5 ml manuální protokol; => použitý pro Experiment 4 (viz Příklad 7.3.4) přidat 80 μΐ proteinasy K k 420 μΐ vzorku plasmy, promíchat přidat 500 μΐ lyzačního pufru , inkubovat 10 min. při pokojové teplotě s mechanickým mícháním (1300 ot./min. v třepačce Eppendorf) přidat 500 μΐ MGP suspendovaných v izopropanolu (koncentrace 6 mg/ml), promíchat a inkubovat 20 min. při pokojové teplotě na roleru magnetická separace s použitím magnetického separátoru Dynal (2 min.) odstranit nenavázanou frakci odsátím, přidat 700 μΐ promývacího pufru, promíchat, separovat a odsát zopakovat promývací postup ještě 4x přidat 100 ml DEPC vody, promíchat a eluovat 15 min. při 80 °C v termomixéru Eppendorf při 1300 ot./min., •0 4··4
4444 ••44 4 ·
4 4
4 4
4 4 4
4 4 4 • 4 4 4 oddělit kuličky od vodného supernatantu (=eluát) pomocí magnetického separátoru Dynal (2 min.) zamrazit eluát až do doby použití
Amplifikace
Celkový objem reakce je 100 μΐ (platí pro všechny vzorky)
HBV: objem eluátu voda (PCR čistota)
DNA-Mastermix
MgCl2 primer SEQ ID NO 7 primer SEQ ID NO 8 UNG
HCV: objem eluátu voda (PCR čistota) bicinový pufr RT 5x MnOAc
DNTP-Mix (dUTP/ DATP/dCTP/dGTP) primer SEQ ID NO 5 primer SEQ ID NO 6 UNG
Tth-polymarasa pro PCR = 20 μΐ zásobní roztok
2x mM μΜ 5 μΜ
1U / μΐ pro PCR = 40 μΐ zásobní roztok
5x
25 mM
30 mM
10 mM
10 μΜ
10 μΜ
1 U / ni
5,5 U / μΐ konečná koncentrace v PCR/μΙ 4 μΐ
lx / 50μ1
3,0 mM / 12μ1
0,2 μΜ / 4 μΐ
0,4 μΜ / 8 μΐ
2U / 2μ1
konečná koncentrace v PCR/μΙ 18 μΐ lx / 20 μΐ
2,5 mM / 10 μΐ
0,6 mM
0,2 mM / 2 μΐ
300 ηΜ / 3 μΐ
300 ηΜ / 3 μΐ
2 U / 2 μΐ
10 U / 2 μΐ
9999
HIV: objem eluátu pro PCR = 40 μΐ
zásobní roztok konečná koncentrace
PCR/μΙ
voda (PCR čistota) 20 μΐ
bicinový pufr RT 5x 5x lx / 20 μΐ
MnOAc 25 mM 1,25 mM / 5 μΐ
DNTP-Mix (dUTP/ 0, 6 mM
DATP/dCTP/dGTP) 10 mM 0,2 mM / 2 μΐ
primer SEQ ID NO 3 5 μΜ 0,2 μΜ / 4 μΐ
primer SEQ ID NO 4 5 μΜ 0,2 μΜ / 4 μΐ
UNG 1 0 / μΐ 2 U / 2 μΐ
Tth-polymarasa 5,5 U / μΐ 10 U / 3 μΐ
Po PCR je UNG zablokována přidáním laurylsarkosinu do koncentrace 1%
Termocyklerové profily byly následující:
HBV:
UNG-krok lx 10 min 37 °C
PCR 35χ 30 sec. 92 °C
30 sec. 55 °C
40 sec. 72 °C
HCV: min. 37 °C
UNG-krok lx 10
krok reverzní transkripce 1 x 30 min. 60 °C
denaturace 1 min. 95 °C
PCR 2x 10 sec. 95 °C
20 sec. 60 °C
33x 15 sec. 90 °C
20 sec. 60 °C
44 · • ·
4··· ·
další inkubace 7 min. 72 °C
HIV:
UNG-krok 1 x 10 min. 37 °C
krok reverzní transkripce 1 x 30 min. 60 °C
PCR 4x 10 sec. 95 °C
10 sec. 55 °C
10 sec. 72 °C
31x 10 sec. 95 °c
10 sec. 60 °c
10 sec. 72 °c
detekce s použití, modifikovaného Elecsys 1010®
reagencie objem čas inkubace
(HBV , HCV, HIV) (HBV, HCV, HIV)
PCR produkt 10 μΐ
denaturační roztok 35 μΐ 5 min.
detekční sonda 120 μΐ 30 min.
SA-kuličky 35 μΐ 10 min.
7.2 Homogenní funkční test: technologie 5'-nukleásového testu na přístroji Cobas Taqman®
7.2.1 Obecné úvahy
Lýze virových částic a také adsorpce, purifikace a eluce nukleových kyselin extrahovaných ze vzorku jsou provedeny způsobem popsaným výše (viz Příklad 7.1.2). Amplifikace cílových molekul je opět popsaná rovnicí Nj=N0 x (1+E)n, kde
No = počet molekul na začátku PCR
Ni - počet molekul na konci PCR ·· · ·· · «· ·· ·· • · · · · · * ··· · · · · · · • ···· ·· · · · · · t · · · · · ··· !·· · ·· ·· ·· **
Ε = účinnost amplifikace = 0 E 1 n = počet reakčních cyklů = v tomto případě typicky 40 n 60
U 5'-nukleásové technologie jsou však amplifikační a detekční reakce těsně propojené a objevují se ve fázi roztoku, to znamená bez imobilizace na pevné fázi' a bez tomu odpovídajících promývacích kroků (= homogenní PCR). Do PCR mastermixu se přidají sondy s dvěmi speciálními chemickými modifikacemi. Jednou z těchto modifikací je na kovalentně navázaná fluorescenční reporterová skupina (R, např. derivát 6-karboxy-fluoresceinu). Tato skupina je navázána na základní řetězec sondy. Druhá modifikace je barvivo (např. derivát polymethin-cyaninu) schopné absorbovat fluorescenčního světlo reportérové skupiny, „zhasnout ji (quencher - zhášeč). Zhášeč je obvykle připojen k základnímu řetězci sondy na 5'-konci, kdežto reporterová skupina se nachází uvnitř oligo sekvence, oddělená od zhášeče množstvím nukleotidových stavebních bloků. Tyto sondy se váží na cílové nukleové kyseliny (na sense nebo antisense vlákno) poblíž 3'-konci primeru (dopřednému či zpětnému). Jakmile se primer naváže na cíl a DNA polymerasa se naváže na hybrid primer:cíl a začne elongace. Díky 5'-nukleasové aktivitě enzymu je, spolu s kopírováním a syntézou nového vlákna, ve chvíli, kdy polymerasa dosáhne vazebného místa sondy, hydrolyzována sonda. Tím se reporterová skupina a zhášeč vzdálí a fluorescenční signál začne být měřitelný. Tento proces se opakuje v každém cyklu a stále více fluorescenčního reportéru se akumuluje v roztoku dokud se nespotřebují reagencie na konci reakce. Takto na grafu závislosti signálu na čase vzniknou sigmoidní křivky. Čím vyšší je No, tím dříve se signální křivka objeví nad pozadím.
Bod na časové ose, kde je již možné spolehlivě oddělit fluorescenční signál od pozadí se nazývá prahový cyklus (threshold cycle = ct). ct je měřítko citlivosti stanovení - čím nižší je hodnota ct, tím citlivější je stanoveni. Hodnotu ct lze vypočítat pomocí různých matematických operací jako jsou například limitní přístupy (průměrná intenzita signálu pozadí násobená konstantním faktorem dá limitní intenzitu signálu pro odlišení negativního od pozitivního) nebo přístup, ve kterém se lokalizuje maximum první derivace křivky závislosti signálu na čase (tedy strmost profilu) • 4 4444 • 4 4 · 4
4
·· 4444
4 4
4 4 ·
4444 · · 4
4
nebo se spočítá lokalizace maxima druhé derivace na časové ose a definuje jako ct.
Tato amplifikační/detekční technologie dovoluje sledovat PCR v reálném čase, přičemž zkumavky jsou uzavřené, což je v kontrastu se standardním postupem. PCR zkumavky jsou od napipetování eluátu a mastermixu uzavřené, čímž je účinně snížené riziko kontaminace.
Mimo to je možné použít sady sond a primerů pro rozdílné druhy virů (a tedy rozdílné molekuly analytu a rozdílné cílové sekvence) kombinované v jediném mastermixu. Takto je možné provést několik amlifikačních a detekčních reakcí najednou, v závislosti na přítomnosti virů kontrolovaného jedince. To je základem tzv. vícenásobného stanovení.
A co více. Díky obecné povaze přípravy vzorků pomocí MGP, je veškerá nukleová kyselina přítomná ve vzorcích extrahována na základě fyzikálně-chemické adsorpce na povrch částic, bez ohledu na sekvenční charakteristiku. To zahrne také lidskou DNA (human hDNA), uvolněnou z rozrušených krevních buněk, např. leukocytů, jejichž titr se může ve velké míře lišit v závislosti na fyziologickém nebo patologickém stavu jednotlivých dárců krevních vzorků. Např. v případech autoimunních onemocnění, jako jsou SLE, můžou být hladiny hDNA výrazně zvýšené. Takže hDNA a jedna či více patogeních nukleových kyselin přítomných v daném vzorku tvoří směs rozdílných nukleových kyselin s rozdílnými sekvenčními vlastnostmi, které jsou extrahovány společně. Tvoří síť polynukleotidů, které jsou extrahovány bez rozdílu a následně jsou cílové nukleové kyseliny za vhodných reakčních podmínek sekvenčně specificky amplifikovány a detegovány s pomocí interakce se specifickými primery a sondami.
Daná patologická hladina 4000 ng/ml hDNA (v případě SLE) a nízká hladinu viru - 50 kopií virové genomické DNA na ml plasmy, což je 10000 nukleotidů na genomovou RNA. 50 kopií resp. 50000 nukleotidů cílové RNA s hmotností cca 325 daltonů (1 dalton = 1,66 x 10’24 g) na nukleotid dává cca 2,7 x 10-7 ng na ml plasmy, což vede k výsledku, že relativní zastoupení cílové nukleové kyseliny k necílové je přibližně l:10+12i K monitorování celého procesu může být do vzorků přidáván umělý konstrukt nukleové kyseliny, nejlépe pokud je zabalen (obalen) modifikovanou virovou částicí. Ten je poté ·· · ·* ···« ·» ·»·· «·· ·· ··· · ··· ·· · ·· · • ·**· ··· ···· · « · ·»·· »··· ···· « ·· ·· ·· ·· extrahován a amplifikován dohromady s přírodním cílem. Tato vnitřní kontrola (internal control = IC) představuje unikátní vazebnou oblast pro IC detekční sondu, která se liší od sond specifických pro cíl rozdílnými reportérovými skupinami, s odlišnými emisními charakteristikami. Takto může být IC signál odlišen od cílového signálu a protože je známo, že IC jsou přítomné ve vzorku, může tento signál sloužit k monitorování. Takže vícenásobné značení zvyšuje užitečnost multiplex technologie. Interní kontrola je popsaná ve W098/00547.
7.2.2 Experimentální protokol
7.2.2.1 Reagencie
7.2.2.1.1 Příprava vzorku
Viz výše (Příklad 7.1.2 => automatizovaný protokol na vyvinutém extraktoru)
7.2.2.1.2 5'- nukleázový test, reakční činidla a reakční
podmínky
koncentrace konečná .přídavek
Reagent zásobního koncentrace (μΐ /
roztoku v testu reactionj
Mn(0Ac)2 pH 6.5 50 mM 3 mM 5.75
dNTPs 2.50
(dG, dA, dC) 100 mM 300 μΜ
(dT) 50 μΜ
(dU) 500 μΜ
depc-h2o - 9.50
Glycerol 80% 5,64% celkem 3.50
*2.8% přid. zde
K Oac pH 7.5 2 M 100 mM 5.00
Tricin pH 8.3 1 M 50 mM 5.00
DMSO 80% 5.0% 6.25
Primer SEQ ID NO 12 50 μΜ 150 nM 0.30
Primer SEQ ID NO 13 50 μΜ 150 nM 0.30
Primer SEQ ID NO 14 50 μΜ 400 nM 0.80
Primer SEQ ID NO 15 50 μΜ 150 nM 0.30
Primer SEQ ID NO 16 50 μΜ 400 nM 0.80
Primer SEQ ID NO 17 50 μΜ 150 nM 0.30
4···
t. ···· ·· · ' • · * · • · · · • ···· · · • · · · · • · · · · t a i a·
Primer SEQ ID NO 18 50 μΜ 150 ηΜ 0.30
Sonda SEQ ID NO 19 50 μΜ 100 ηΜ 0.20
Sonda SEQ ID NO 20 50 μΜ 100 ηΜ 0.20
Sonda SEQ ID NO 21 50 μΜ 100 ηΜ 0.20
Sonda SEQ ID NO 22 50 μΜ 100 ηΜ 0.20
UNG 2.4 U/μΙ 10 U 4.20
ZO5 10 ϋ/μΐ 40 U 4.00
Aptamer SEQ ID NO 23 50. 4 μΜ 200 ηΜ 0.40
* Zbytek glycerolu se přidá s enzymy ΖΟ5 (mutovaná Tth-DNA
polymeráza) a UNG (uracil-N-glykosidáza).
Běžný profil pro multiplex termální cyklovací reakci pro všechny testované parametry jsou následující:
UNG krok denaturace °C 94 °C min. 30 sec.
reverzní transkripce sec.
PCR °C 20 sec. / 59 °C 50 sec. - 5x °C 15 sec. / 52 °C 50 sec. - 55x
7.2.2.1.3 Sekvence
Primer:
HIV dopředný SEQ ID NO 12
HIV dopředný SEQ ID NO 13
HIV zpětný SEQ ID NO 14
HCV dopředný SEQ ID NO 15
HCV zpětný SEQ ID NO 16
HBV dopředný SEQ ID NO 17
HBV zpětný SEQ ID NO 18
Sondy:
HIV: SEQ ID NO 19
HIV: SEQ ID NO 20
··· ·
HIV: SEQ ID NO 21
HIV: SEQ ID NO 22
Aptamer:
SEQ ID NO 23
Teplota tání komplexu DNA polymeráza-aptamer =51,7 °C (= 50% disociace).
Terminologie chemické derivatizace:
Některé z nukleotidů jsou derivatizované Cy5, což je Pentamethine-di-indocarbocyanine připojený k alkylphosphatidilovému spojovníku (linker) (Pharmacia Biotech Cy5-N-ethy-phosphoramidite) a který působí jako zhášeč (quencher) (Q) ; λΕΧ = 630 nm, λΕΜ = 665 nm.Některé z oligonukleotidů jsou derivatizované FAM, což je 6-karboxy-fluorescein připojený k 2-(amino-cyklohexyl-) propan1,3-diol(ovému) spojovníku (Biogenex CX-FAM-phosphoramidite) a který funguje jako reportér pro cíle (R) ; λΕΧ = 485 nm, λΕΜ = 515 nm.
Některé z oligonukleotidů jsou derivatiozované hexachloro-6-carboxyfluoresceinem připojeným k 2-(amino- cyklohexyl-) propan1,3-diol(ovému) spojovníku (Biogenex CX-HEX-phosphoramidite) a který působí jako reportér pro interní kontrolu (R) ; λΕΧ = 530 nm, λΕΜ = 585 nm.
7.2.2.1.4 Reakční podmínky
Reakční podmínky jsou popsané ve výsledcích experimentů (viz Příklad 7.3).
7.2.2.1.5 Další potřeby
- virus-negativní plasma (0-Matrix, jednoduchá plasma nebo složená plasma (single plasma or Plasma-Pool)), například citrátplasma nebo EDTA-plasma
- virus pozitivní plasma, nebo virus obsahující supernatanty kultur, které se můžou použít k úpravě určitých titrů virů smícháním s 0-matrix v odpovídajících poměrech.
····
- nebo: in-vitro transkripty se zkoumanými cílovými sekvencemi
- lidská placentární DNA (a. genomová, Sigma kat.č. D4642; b. fragmentovaná, Sigma kat.č. D3287) přidaná ke vzorku pro napodobení patologických podmínek, které vedou ke zvýšenému uvolňování intracelulárních látek a tak ke zvýšeným hladinám DNA/RNA v krvi, například autoimunní onemocnění jako SLE hemolýza.
7.3 Výsledky funkčních testů
7.3.1. Experiment 1
Různé MGP-vzorky typu EJ/CERAC se zkoumaly metodou popsanou v 7.1. Proměnou v testu byl rozprašovací tlak:
EJ0100.5R -1,5 baru
EJ0106.5R - 2,5 baru
EJ0107.5R - 3,5 baru
EJ0108.5R - 4,3 baru
Může se ukázat, že se zvyšujícím se rozprašovacím tlakem, tj. posunem směrem k menšímu průměrnému průměru kuliček, klesá nespecifické navazování (USB, unspecific binding), zatímco tvorba vysoce specifického signálu je nezměněná, což má za následek zvýšený poměr signálu k pozadí.
Upravení titru viru 0,5xGG je přibližně 100 sgu/ml (sgu=signal generating units, signál vytvářející jednotky) v případě HBV a asi 150 sgu/ml v případě HIV. Údaje jsou shrnuté v Tabulce 7.
7.3.2 Experiment 2
Dvě varianty jak EJ/MMB a EJ/CERAC se funkčně porovnaly s využitím metody popsané v Příkladu 7.2 ve spojení se spojenými (multipool, MP) a jednotlivými (PL) vzorky plasmy. EJ0047.2R (MMB) a EJ0100.5R (CERAC) se rozprašovaly za standardních podmínek, tj. 1,5 baru, teplota na vstupu 230 °C a na výstupullO °C. EJ0102.2R (MMB) a EJ0108.5R (CERAC) jsou vývojové varianty co se týče rozprašovacích podmínek (teplota na vstupu snížená na 200 °C [MMB]) a rozprašovací tlak zvýšený na 4,3 baru [CERAC]). Výsledky jsou shrnuté v Tabulce 8 a ukazují možnosti CERAC nano-jaderných částic získat vyšší ··»» citlivost, jak je vysvětlené časnějším „threshold cyklem a/nebo většími rozdíly signálu (saturační signál mínus šum, S-N (signál minus noise)).
7.3.3 Experiment 3
Několik MGP přípravků typu EJ/MMB a EJ/CERAC (viz Tabulka 9) je funkčně porovnáno s využitím metod popsaných v Příkladu 7.2.
Výsledky jsou shrnuté v Tabulce 10 a ukazují potenciál částic typu EJ0096.5R-01 dosáhnout vyšší citlivost, jak dokazuje časnější „threshold cyklus nebo vyšší úspěšnost hledání (hit rate) nezávisle na konkrétním testu.
7.3.4 Experiment 4
Několik MGP přípravků typu EJ/MMB a EJ/CERAC je funkčně porovnáno s využitím metod popsaných v Příkladu 7.1, kde se provádí adsorbční inkubace s a nebo bez třepání. Tím se stane sedimentační rychlost rozhodující, tj. čím je vyšší sedimentační rychlost, tím je vyšší počet částic, které se (ve vytvářejícím se precipitátu) neúčastní interakce s analytem. Na rozdíl od stavu, kdy je sedimentční rychlost menší nežli časové rozpětí, ve kterém se můžou molekuly analytu z tekutiny navázat na povrch adsorbentu. Výsledky shrnuté v Tabulce 11 (EJ0047.2R se použil jako reference) ukazují, že bez mechanického třepání je ztráta výkonnosti největší (>40%) u MMB typu (liší se významně od charakteristik tohoto vynálezu) a nejmenší nebo prakticky vůbec žádná u CERAC typu (nejvíce se podobá v této sérii charakteristikám vynálezu).
Aby bylo možné pečlivě zhodnotit funkčnost různých typů MGP, vypočítal se pro každý typ následujícím způsobem výkonostní index:
- eluáty různých dávek každého typu MGP a každé hladiny titru jsou spojené do 1 spojeného eluátu
- z každého spojeného eluátu se provedly 3 amplifikace každého testu (HIV, HCV, HBV)
- každý amplifikát se měřil zvlášť (in singlicite) na modifikovaném Elecsys 1010® ·· ····
- signál se pro všechny typy MGP, testy a hladiny titrů zprůměrovaly
- pro každý typ MGP a test se vypočítaly faktory signál/šum (S/N), tj. nízký titr (slabě pozitivní) přes O-matrici (negativní) a zvýšený titr přes O-matrici
- S/N faktory jsou normalizovány k referenčnímu typu MGP současně (at the time)
- výpočet součtu normalizovaných S/N faktorů pro každý typ MGP získaný ze všech testů a hladin titrů; S/N faktory pro nízké rozsahy titrů jsou váženy dvojnásobně relativně k hodnotám pro vysoké hladiny titrů, aby se zohlednily aspekty citlivosti
- výsledná suma je přidělený index výkonnosti pro každý zkoumaný typ MGP
7.3.5 Experiment 5
Pro extrakci HCV in vitro transkriptů, které se naředily na různé hladiny titrů ředícím roztokem obsahujícím 10 mmol(l Tris, pH 80, 1 mM EDTA, 20 ugúml poly-A-RNA a 0,05% NaN3 a přidány do spojené plasmy, se použily různé typy MGP.
Lidská DNA pozadí (human background DNA - hBG-DNA) se přidala do vzorku v koncentracích 0 nebo 4000 ng/ml. Překvapivě je možné omezit interferenci hBG-DNA výběrem kuliček, jak ukazují hodnoty uvedené v Tabulce 12.
7.3.6 Experiment 6
Pro zpracování vzorků HCV pozitivní plasmy se použily různé typy MGP. Do vzorku se přidávala lidská DNA pozadí (human background DNA - hBG-DNA) v koncentraci 0 nebo 4000 ng/ml. Opět bylo možné pozorovat značný dopad velikosti kuliček a geometrie kuliček. MGP EJ0096.5R, což je nejlepší představitel MGP předkládaného vynálezu, vykazuje jasné výhody co se týče minimální posunu ct hodnot a snížením ztráty generovaného specifického signálu (S-N), jak ukazují data uvedené v Tabulce 13.
Tabulka 1
A · · · · · * . ·· ···! . · · ··· .·· ί· ·
Společnost Zkratka Popis Kód (viz Příklad 1.4
— — Bez pigmentu 0
Merck Darmstadt, Německo BM Merck Black Mica: Malé plátky slídy (podpora), průměr = 10-60 um, tloušťka asi 1-2 um, připojené jsou kvádříky Fe3O4 a zrna TiO2; typicky dochází k agregaci několika jednotek pigmentu 1
Merck Darmstadt, Německo MMB Merck Microna Matte Black Malé plátky slídy (podpora), průměr = 3-15 um, tloušťka asi 1-2 um, připojené jsou kvádříky Fe3O4; typicky dochází k agregaci několika jednotek pigmentu 2
BASF Ludwigshafen, Německo BASF-FA BASF oxid železitý FA28-41: Jehlice nanovelikosti vyrobené z y-Fe2O3, délka asi 200-400 nm, díky tvaru a velkému, vysoce strukturovanému povrchu velmi vysoká náchylnost k agregaci do částic v u-rozsahu 4
Cerac, Milwaukee WI, USA CERAC CERAC y-Fe2O3, (kat. č. 1-2012, distribuovaný Chemco Chemiprodukte GmbH v Německu) y-Fe203-mikrokuličky v nano-oblasti (čistý oxid železitý), průměr=23 nm, neagregující 5
Strem Chemicals, Newburyport MA, USA STREM STREM Fe3O4 > 95% (kat. č.: 93-2616) mikrokuličky v nano-oblasti vyrobené precipitovaného Fe3O4, průměr = 200-500 nm, silná tendence k agregaci do částic v u-rozsahu 7
BASF Ludwigshafen, Německo BASF-CE Kuličky v μ-oblasti vyrobené z kovového železa - BASF karbonyiový železný prášek HQ: 10% < 1,04 pm, 50% < 1,91 pm, 90% < 3,71 pm, - BASF karbonyiový železný prášek SU: 10% < 0,43 pm, 50% < 0,93 pm, 90% < 1,81 pm, 8 9
.· ···;
Tabulka 2
Kod Ml TEOS ,· Veda (ml/lflO ml) TEOS .Alkolw 1 ί Alkohol (mlZlOO ml TEOS Stárnut 1 (h) Rozpraío vací tlak (bar) Tryska teplota vstupu ; TO Teplota . Ve vzduchu ; . /před FA <°Q: Teplota , «, . po FA Teplota poPA .:' (°Q Tepelné dprácavání v lahvi I (pod vzduch. TO
0005 1250 1833 w .50 1 . 15' Λ Wr* 230· -.05: .500
0009 1786· ' 1353 a®. 1 15' A 230.· 250 - e?s ' saw/ ' 'a®'
Knd Ml TEOS Voda (rai/100 ml) TEOS Álkoho 1 Alkohol (mVXOO ml TEOS Stárnut f (li) Plgraeuit (gAQOg) Oxid Rozprašc vací tlak (bar) Trysk: teplota ystupu PC) Teplota ve vzduchu predRA CQ Teplota : NJ : po FA <°C) Teplota o, poRA TO i Tepelné opracování v lahvi. pód vzduch, TO
eeé 1400 13.33 Mi 80. 0 15 .A 230.. 200 57S '••aw ' ' 8»
0644 350' '1355 B83H 50 6 5 : Wfch' '1 . A 156; w «3: aoa ' '::W( (
0047 · 1800 14.13 aow 13?' 0 1«·. . >0 250 750 ; 3» :200
iso: 141 &Ο» 1*1 0 ' .330 5 ' »eh i .Meh. HO 200 759 200 ' 2».
0097 ISO 14.1 CÍO)-J 141 O 191 5 ISO .200 730 200 200
8098 310 •141 EtOH 1*1 0 230 0; Meh i Sfcb iso .280 .890 .306 ' .300
0099 ..310, 141 a® 1*1 0 330 O; 150 266 710 200
0100 840 14.1 .EtOH 141 0 »0 ' 15' s A '230· JSO 200 200
0101. «40 14.1 EtOH 141 0 •191 . 15 '' A 230 . . 200 750' '260 .. 366 ' ( '2®
0102 1300 14.1 EtOH 191' Ό· 280 Í5 Λ 230. 200 ' 250 . 260
0105 Ol®’ 0108 840 141 ft® 141 0 230 25 ' 35 *5. A A A ' 230 230 . 238 2» 200 200 750 750 7» 200 ' 200 200 200 200 •290
0109 8000 141 :&£>H 1*1' 0 330 ,15· A 210' ' 200 ? 756 . 300 '200·.
0111 1300 14.1 .E10H 1*1 0 .230' 15 A 210' 260 '7S0 . . 26© . 206
0119 013* ia»b 145 j$SB 130 .0. 230 15 ;· 4 A BO«h 210 iso' 260. .20O 750 ' .780'· :W' : :200. ; • ' :a® · • a»·
0128 0129 0130 0131 7S30 . 141 EtOH 141 ,8 230 15 15 48 4 A A A ,A: 230 , 200 206 200 .200 200 200 200 '' i» 730 790 : ?» 200 jgj). M - W: '200' . 206
Tabulka 3 • · • · · • ···· ··
VZOREK VÝSTUPNÍ 'ΓΕΡί,ΟΤΛ CQ HUSTOTA. (t-Zcm’) ΚΧΊΊΝΙΟ Έ (280 nm) EXTINKCE; (400 nm) ROZťUSraOS ŽELEZA (nig/l) MAGNETICKÁ SÍLA (g/25<) mg)
RN0005.2B-01 116 ........xSf- - 0.037 . ......0.027 - detekční limit .:.-.:.16.04-- 1
wraě^r“ .119 '..3,155 0406 0.093 < detekční limit ::.7 :0-9550- -. 7·.-..·
BI0028.2R-Q1 - Π8 ;3S2'..... 0.019 /.?.0s024 < detekční limit -. 77.. 3«2S7:---7.:.----
RNÓ045.4Ř-0Í...... 130 3.647 0.032 0.034 :: <s detekční limit 7.7: --: 7 :9.23
RN0046.7R-01 ' 98 3.866 0.013 0.013 < detekční limit 7:7,7 ::,-:4342- . 7.....
SŇoSísTOT 120 -:3.802 0.019 : 0.017 .-.7 77797527 7 '
BJ0047.2R-DÍ 118 <- 3.659 .. . 0.022 : 0. 018 < detekční limit ·'··· 12:00 , .
EJQ096.5R-01 96 4;2t»3 : :· · 0.001 7000 :< detekční limit ..43.337
SjOOS&ZR-Ol.........' ' ' 96 4.328 0.000 0.001 detekční linilt 77 :777-18^6:- :.
EÍQ097-4R-01 96 '. 3.859 ~ .7.., 0.001 ¥ »000 .< detekční limit :.:.::.-7..:1547:- .- - ’'
b;®H-ói 95 -'7. £5887-7 ':. -.«Βίδ:.··.;.; 0.055 < detekční limit :745^67.:-:
ejoo99.9R-oi ' .' 95 5.538 0.103 i, 0401 777:7.:7:1443..- . ..
EJQ1Q0.7ÍW4...... . . ..«ií Ůí&l&F'· .-.· 0.027 0.003 <detekcni limit :77-73-..:1649:.-..-
EJ0100.5R-01 126 0.012 : ; 0.012 < detekční limit 3.3:::342,4Ζ
BJO101.4R-O1 119 4.079 • ' 0.083 0.084 77::-11567-:-.:
EJ0102.2R-01 .128 '7 3.668 ?.·' 0.009 0.009 <£ detekční limit .7:7,7: ,13067:'
. 118 3.612 .. 0Λ24 : '.70,022··: ú 0459 ..:7-- ':7.·,:1Ϊ46.'·
®»κΓ'' 127 4407 :-7 8.029 8.823 0.054 .7' 14.51 -
EJOIOO.SR-03 «27 4473 0,063 W ' 7 0.126 : - 10.44 .
EJ0106.5R-0I . .127 4.191 :. 0.004 .?./. 0,004 0025 7:7-77-^9-, :.....
EJOÍb/sR-S 127 4.235 ;·.· 0.016 0009 i'-.....- 10.25 7' .
EÍ0108.5R-01.......... 127 - .,4.233 0.026 0026 - 0.039 11.56 ,
EÍ0109.2R-01 no 3.700 0.046 0.043 0028 11.23
tejoiii.sŘ-ái............. 117 7. 3.61-2 -7 : 0.071 •.:···0Λβί5.·3· 0466 -·· 16.48
£101) L5R.-02 . «21 0.065 0040 0461 15.95
BJ0124.5R-01 . ; 3.992 77 0.001 0001 ' . 0.051..... 17.57 .7
EJ0128.5R-01 125 :.-Wř....·· -7 0.023 .' 0.028 8.97
Ěf0l2ft5Ř-at 92 u 4.013 0.044 :· · 0.043 9.64
EJÓ130.5R*Ól :87 4.022 0.031 0036 11.70
WštšOi 89 3,903 0.033 0.037 : -.. 11.73 -
EP0II9.5R-01 127 4.110 0.003 0.003 .. .. 0.079 - - 1745 -:
·· ···;
Tabulka 4 ·· * > · · ·» ··♦· , · · · ·· ··
Šarže BET povrch (m2/g) Poznámka
EJ0096.5R-01 26,85 Cerac, malá rozprašovací sušička, 6 bar
EJ0100.5R-01 8,95 Cerac, velká rozprašovací sušička, 1,5 bar
EJ0101.4R-01 8,47 BASF FA, velká rozprašovací sušička, 1,5 bar
RN0005.2E-01 3,54 MERCK MMB, velká rozprašovací sušička, 1,5 bar
RN0009.1E-O1 3,25 MERCK BM, velká rozprašovací sušička, 1,5 bar
EJ0099.9R 0,74 BASF CE-SU, velká rozprašovací sušička, 6 bar
EJ0100.7R 8,53 STREM, velká rozprašovací sušička, 1,5 bar
··*·
Tabulka 5 • · • · · • ····
• · · ·· ·· , · · * ·· ··
typ MGP velikost izolovaných jader složení forma tl/2 sedimentace [min] tl/2 separace [sec]
MMB 3-15 pm agregované destičky 3.9 14
CERAC 23 nm individuální kuličky » 10 16
STREM 300-500 nm agregované kuličky 4.8 10
BASF-FA 200-300 nm agregované jehličky 4.6 12
Tabulka 6 ·· · • ::. .
• *··· * • · ···· · «ί··· ♦ * » · • « ·>
• · · · ·· ·· ► * ;
> · · « ·* ··
MGP vzorek t0,9 (90%-Wert) sedimentace, [min] ti/2 (90%-Wert) sedimentace [min]
EJ0100.5R-01 0,35 2,78
EJ0108.5R-01 0, 62 7,58
EJ0096.5R-01 1,39 19,85
····
Tabulka 7
MGP USB [impulsy] - 0-matrix SB [impulsy] - 0,5x-matrix
HIV HBV HIV HBV
EJ0100.5R-01 4997 2277 20380 80292
EJ0100.5R-02 6100 3590 22036 53417
EJ0100.5R-03 4856 2270 19791 65109
EJ0106.5R-01 4427 2263 19030 75128
EJ0107.5R-01 3940 2261 19255 68285
EJ0108.5R-01 3429 2217 20048 80426
k· ř
• · 4 • · • 444 • · • 44 4
Tabulka 8
HBV hcv ·;··
VZOREK MGP Šarže Ct · S-N ... ct S-N .
MP2 ' ÍOi 40.49 ' · 19.88 41,68 ' , 1X6
M.P2 EJ100.5 40.96 21,80 43.08 12.74
MP2 EJ0102.2 41.93 21.39 44.74 10.10
MP2 EJ0108.5 40.09 • 22.01 47.36 10.61
EJ0047.2 41.03 ' 18.14. - -
PLJ/i ! EJ100.5 40.12 19.31 -
Pl.% EJ0102.2 41.81 22.80 44.69 14.30
P1.Ví EJ0108.5 39(93 . 21.77 . 43.27 1X58
Pl.4/5 EJ0047.2 46.33 12.83 39.54 .“i-:· j'T&30
Pl. 4/5 EJ100.5 40.82 15.12 38.24 21.48
a 4/5 EJ0102.2 42.49 19.65 39.24 19.05
Pl.4/5 EJ0108.5 47.33 .. 9·51 39.47 ' ; 17.81
PL 6/8 EJ0047.2 41.08 20.83 49.44 9.46
Pl. 6/8 EJ100.5 40.68 23.16 48.98 10.31
PL 6/8 EJ01Q2.2 40.50 22.49 54.50 6.50
Pl.6/8 EJ01O8.5 38.79 18.60 50.41 8.61
a 6/8 EJ0047.2 44,16 17.26 41.40 1059
PL 6/8 EJ100.5 42.97 1859 41.01 11.33
PL 6/8 EJ01022 44.49 12.41 4218 11.32
PL 6/8 EJ0108.5 41.24 18.73 41.46 10,80
Měřicí statistika: Který typ vyhovuje lépe
“standardní vzorky” “vývojové varianty” úhrn: nejlepší typ na vzorek*stanovení
MMB: CERAC MMB; CERAC MMBtČEfe V2
Ct S-N ct ; S-N Ct S-N
2:7 0:9 i (.1 srovnání nemohlo být vj hotlr 3:7 ocení) 5.:5. 1:9 3:7
• « • ·
Tabulka 9
MGP POPIS
EJ0096.5R 6 barů rozprašovací tlak, 150 °C vstupní teplota, Btichi laboratorní vybavení. Tento preparát se blíží charakteristikám podle vynálezu velmi dobře, viz Obrázek 15
EJ0111.5R 1,5 barů rozprašovací tlak, 230 °C vstupní teplota, Nubilosa laboratorní vybavení
EP0119.5R 1,5 barů rozprašovací tlak, 230 °C vstupní teplota, Nubilosa laboratorní vybavení, změněné složení skla bez Zn-acetátu, K-metanolát je nahrazen K-acetátem se stejnou stechiometrií
EJ108,5R 4,3 barů rozprašovací tlak, 230 °C vstupní teplota, Nubilosa laboratorní vybavení
Tabulka 10
999999 • 9 · »999 ♦ ··
9 9 9 «
9
9
9 9
ftweuetr ct-iropoeťtprťs wxjmwn pfrvní derivace ’ ?
W MGP ίώ BJWU.SR-02 AVG MGP Surfe EPM194R AVG MGP Šarže ET8096,5R AVG MGP gJOiOMR AVG
HBV X - - -
10» 46.1 44.1(6/6) 43,4 4<2
40 47.6 46.5(7«) 453(7«) 46.7(6/7}
20 50.6(6/8) 46.1(6«) 4sA{?«) so,$<«re>
w 47.6(5/8) 50.1(5/8) 468(4/8} 47.7(5/7)
5 51,2(3/8) 48.6(4/8) 47,8(5/8) 49.7(4/7)
poinemd četnost 75% 74% 77.5% 673*
c^prapocctpn^wer&i luezaíhodnoíy
Titr MOP Šarže MGP SarSe . MGP Šarže MGFSarže
Paramcie (ígíi/irij EJ01U.SR-02 8P01193R EÍ0096.5R EOT08.5R
AVG AVG AVG AVG
3SBV NK - * • »
too 442 41.7(6/6) 41.5 4Ϊ.9
40 453 44.1(7«) 42.7(6/3} 45.0(6/7)
20 47.7(6/8) 4SMH««> 443(7«} 47.2(6/8}
10 45.5(3/8) 47,7(3«} 44.4(6/8} 45.6(3«}
5 49.3(3/8) 45,7(4/8} 454(4/8) 46.6(4/7)
poměrná četnost 7505 .74% 77,5% 71%
ct-propocct p«5 maximum pwníderivace
Titv MCPSaríe MGPlaržo MGPSarže MÍGjP SarŽe
Parametr (lU/Bll) EJ0U1.5R-O2 EP0119.5R éRKStóR EW1085R
AVG AVG AVG AVG
HCV NK - - - -
400 4X7 42.5(7«) 41.8 4X6(7»}
»0 444(7«} 44,1(6«) 44Λ(7«) 4W/73
60 45.1 44.7(7/7} 44.4(6/7) 43,1(6/6)
40 46.2(7/8) 45.8(7») 439(577) 44,5(7/7)
20 463(5«) 46.3(7/7) 4S2X6/8) <7%(4W}
portwmá četnost 90% 97% 84% 885%
• · · ·
rt-propocet pces vzorec. ineznihodnoty
ntr MGP Šarže mgFšS WS” MGF šarže
Parametr (lU/ml) EJ01113fW52 ÉPOXIŘSR BÍS096.5R E50X08.5R
AVG AVG AVG ' AVG
HCV WK - * *
400 41.8 413(7«) 40.9 41,7(7/7)
80 44.<S(7Z7) 44.0(6/6) 43.4(7/8) 443(7/7)
60 44.7 453(7/7) 45,1(6/7) 443(5/6)
40 47.9(7») 46.1(7/7) 44,7(4/7) 47,5(7/7)
20 «W&t) 47,2(7/7) 4830«) 473(4/8)
pomenui četnost 90% 97% 79% »6%
gžMBfeBBft
et^propocei pres maximum první derivace
ntr MGP šarže fePšarže —S5SPS— -Wšarže-
Parametr ísgu/míj BíMllJR. BF0H9.5R BÍW963K. B10Í08.5R
AVQ AVG AVG AVG
HIV NX - « · *
30 433(6/8) 46.9(3/8) 43.9(3/7) 419(1/7)
60 42.7(4/7) 423(4/7} 423(7/7) 424(2/7}
£50 423(5/7} 42.0 41.7(6/6) 423(6»)
300 419(3/5) 41.0(3/9) 415(6/6) 413(6/6)
600 41,6(7/7) 40.8(6/6) 403(5/5) 413
poměrná četnost 79% 76% 87% 64.0%
ctpropoM t pres vzorec mená hodnoty
Titr MGP šarže MGP šarže MGP šarže ”ws-
Parametr IlU/mlJ BRMI3R EP0119.5R BJ0096.5R EJQI083R
AVG AVG AVG AVG
HIV NK * - -
JO 44.3(1/») 473(2/8) 463(1/7) -(»/?)
60 50.9(3/7) 94.1(1/7) 313(4/7}
150 473(5/7) 49,7(3/8} 435(5/7) «3(2»)
300 42,2(5/5) 44.8(3/5) 41.6(4/6) 4629(60»
600 41.2(7/7) 413(5/6) 41.1(5/3) 42.5
poměrná četnost 62% 35% 59% 44%
Tabulka 11 ·· · ·
typ MGP HIV 1 HCV HBV výkonostní index index poměr výkonnosti
60 sgu /neg 600 sgu neg 4800 sgu /neg 40 sgu /neg 400 sgu /neg kumulovaný / vážený/ normalizov aný s třepáním/ bez třepání
E]0047.2R (reference) 100 100 100 100 100 100 900 -
EJ0096.5R 55 34 44 74 146 112 709 -
EJ0096.7R 47 47 18 8 116 107 523 -
EJ0097.4R 32 54 29 47 169 132 692 -
RN0045.5R 85 64 76 63 7 84 545 -
RN0046.7R 109 80 43 40 121 135 803 -
RN0045.4R 48 93 112 128 136 96 908 -
EJ0047.2R (reference) 24' 24 52 49 93 122 534 0.59
EJ0096.5R 28 23 47 88 102 154 619 0.87
EJ0096.7R 34 23 38 14 99 70 449 0.86
EJ0097.4R 33 36 20 18 101 94 456 0.66
RN0045.5R 53 74 60 25 107 72 610 1.12
RN0046.7R 141 90 16 8 32 40 518 0.64
RN0045.4R 55 113 25 146 78 101 675 0.74
Tabulka 12 • ·
částice HCV-titr (IVT-KNA) AhDNA Act AS-N
RNOOQ9.1E= velké destičky lOOOcp/PCR 4000 ng/rnl +2 -6,i
(3-60 μιη)
EJ0100.5R = deformované kuličky -i ' -3,2
(ca. 1-12 μ-rozsah)
EJ0I08.5R= deformovaní * kuličky (ca. 1-4 μ-rozsah) 1 1 r ±0 -1,2
* vysokotlaká varianta, viz sekce 7.2.4.2. a 7.3.1 poznámka:
(+)áct = méně citlivý (tj. tendence k falešně negativním výsledkům); (-)Act = citlivější (tendence k falešně pozitivním výsledkům?) (-)AS-N = tvorba méně specifického signálu = negativní interference
Tabulka 13 • ·· · · • · • · ·
(EJ/CERAC pouze)
HCV-títr (extrahovaná genoinová RNA)
AhDNA
E/009ó.5R= zamýšlený dl*
EJ0127.5R =5 standard EJO129.5R = p-varíant
EJ0130.5R = p-variant EJ0131.5Ř = p-variant
200 WJttů vzorek
4000 ng/ral
Act AS-N
-0,95 -8,5
-3,08 -13,89
-2,30 jit
-2,62 40,57
-2,46 42,41
v* = 0,5-5 μ-rozsah; > 50% sub-p-stupnice; velká povrchová plocha (27 m2/g BET); dokonale kulovité kuličky p-variant = sušení rozprašováním při vyšším tlaku (viz sekce 7.3.1) .
PŘEHLED SEKVENCÍ <110> Roche Diagnostice GmbH <120> Magnetické skleněné částice, metody jejich přípravy a použití <130> 52960AEP engl AB <140>
<141>
<150> EP99122853.7 <151> 1999-11-17 <160> 23 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotidový primer <400> 1 tcagggcaaa actcagctca ccg <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence : synetický oligonukleotid <400> 2 gatgagttcg tgtccgtaca act <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Umělá sekvence ^7 «· * * · · » · i ► ·· <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotidový primer (HIV dopředný) <220> <221> modifikovaná_báze <222> (1) <223> derivatizace biotinu <400> 3 agttggagga catcaagcag ccatgcaaat <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotidový primer (HIV zpětný) <220>
<221> modifikovaná_báze <222> (1) <223> derivatizace biotinu <400> 4 tgctatgtca gttccccttg gttctct <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotidový primer (HCV dopředný) <400> 5 gcagaaagcg tctagccatg gcgt <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> umělá sekvence
CL·©*-“*’ »9* · <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotidový primer (HCV zpětný) <220>
<221> modifikovaná_báze <222> (1) <223> derivatizace biotinu <400> 6 ctcgcaagca ccctatcagg cagt <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotidový primer (HBV dopředný) <400> 7 ggagtgtgga ttcgcact <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotidový primer (HBV zpětný) <220>
<221> modifikovaná_báze <222> (1) <223> derivatizace biotinu <400> 8 tgagatcttc tgcgacgc <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
• · • · · · ·* ···· ·· ··
<223> Popis umělé sekvence: syntetická oligonukleotidová sonda (HIV)
<220> <221> modifikovaná báze
<222> (1)
<223> Ruthenium3+-(tris-bipyridyl)-derivatizace
<400> 9
atcaatgagg aagctgcaga
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetická oligonukleotidová sonda (HCV)
<220>
<221> modifikovaná_báze <222> (1) <223> Ruthenium3+-(tris-bipyridyl)-derivatizace <400> 10 gtcgtgcagc ctccaggacc c
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetická oligonukleotidová sonda (HCV)
<220>
<221> modifikovaná báze
<222> (1)
<223> Ruthenium3+-(tris-bipyridyl)-derivatizace
<400> 11
agaccaccaa atgcccct
<210> 12
<211> 29
« · • ·· · <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotidový primer (HIV) <220>
<221> modifikovaná_báze <222> (29) <223> derivatizace p-(t-butyl)benzyl-zbytkem <400> 12 agtgggggga catcaagcag ccatgcaaa <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotidový primer (HIV) <220>
<221> modifikovaná_báze <222> (29) <223> derivatizace p-(t-butyl)benzyl-zbytkem <400> 13 agtgggggga caccaggcag caatgcaaa <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotidový primer (HIV zpětný) <220>
<221> modifikovaná_báze <222> (30) <223> derivatizace p-(t-butyl)benzyl-zbytkem <400> 14
·· · • · β • « · » · · · · ·· · · *· ··· · ggtactagta gttcctgcta tgtcacttcc <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotidový primer (HCV dopředný)
<220> <221> modifikovaná_báze <222> (26) <223> derivatizace p-(t-butyl)benzyl-zbytkem <400> 15 gcagaaagcg tctagccatg gcgtta <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotidový primer (HCV dopředný)
<220>
<221> modifikovaná báze <222> (28) <223> derivatizace p-(t-butyl)benzyl-zbytkem <400> 16 gcaagcaccc tatcaggcag taccacaa
<210> 17
<21i> 28
<212> DNA
<213> umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotidový primer (HBV dopředný) <220>
<221> modifikovaná báze ···· « · · » · · · · • · · · · ·· «» <222> (20) <223> i <220>
<221> modifikovaná_báze <222> (28) <223> derivatizace p-(t-butyl)benzyl-zbytkem <400> 17 agaagtcaga aggcaaaaaa gagagtaa <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotidový primer (HBV dopředný) <220>
<221> modifikovaná báze <222> (27) <223> derivatizatizace p-(t-butyl)benzyl-zbytkem <400> 18 cacctctgcc taatcatctc ttgttca <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetická oligonukleotidová sonda (HIV) <220>
<221> modifikovaná_báze <222> (1) <223> derivatizace Pentamethine-di-indocarbocyanine via a alkylphosphatidyl-spojovnikem (Pharmacia Biotech CyS-N-ethyl-phosphoramidite) <220>
<221> různ vlastnost
• · · *
• ' · • · • · ·· .··· <222> (10) <223> N představuje 2-(amino-cyclohexyl-)propane-1,3-diol-spojovník derivatizovaný 6-carboxyfluoresceinem (Hiogenex CX-FAM-phosphoramidite) <220>
<221> modifikovaná báze <222> (31) <223> derivatizace 3'-koncovou fosfátovou skupinou <400> 19 tctgcagctn tcctcattga tggtatcttt to <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetická oligonukleotidová sonda (HCV) <220>
<221> modifikovaná_báze <222> (1) <223> derivatizace Pentamethine-di-indocarbocyanine přes a alkylphosphatidyl-spojovník (Pharmacia Biotech CyS-N-ethyl-phosphoramidite) <220>
<221> různ vlastnost <222> (15) <223> N představuje 2-(amino-cyclohexyl-)propane-l,3-diol-spojovník derivatzovaný 6-carboxyfluoresceinem (Biogenex CX-FAM-phosphoramidite) <220>
<221> modifikovaná_báze <222> (31) <223> derivatizace 3'-‘koncovou fosfátovou skupinou <400> 20 cggtgtactc accgnttccg cagaccacta tg
* · • · · ♦ ·· ··«·
<210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotid <220>
<221> modifikovaná_báze <222> (1) <223> derivatizace Pentamethine-di-indocarbocyanine via a alkylphosphatidyl-spojovníkem (Pharmacia Biotech CyS-N-ethyl-phosphoramidite) <220>
<221> růz_vlastnost <222> (17) <223> N představuje 2-(amino-cyclohexyl-)propane-l,3-diol-spojovnik derivatizovaný 6-carboxyfluoresceinem (Biogenex CX-FAM-phosphoramidite) <220>
<221> modifikovaná báze <222> (32) <223> derivatizace 3'-terminál fosfátovou skupinou <400> 21 ccaagctgtg ccttggntgg ctttggggca tgg <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotid <220>
<221> modifikovaná_báze <222> (1) <223> derivatizace
·· ···· · · » « · · • * * « · * · · · · • · · »
Pentamethine-di-indocarbocyanine přes alkylphosphatidyl-spojovník (Pharmacia Biotech CyS-Nethyl-phosphoramidite) <220>
<221> různ_vlastnost <222> (14) <223> N představuje 2-(amino-cyclohexyl-)propane-l,3-diol-spojovník derivatizovaný hexachloro6-carboxy-fluoresceinem (Hiogenex CX-HEX-phosphoramidite) <220>
<221> modifikovaná_báze <222> (30) <223> derivatizace 3'-koncovou fosfátovou skupinou <400> 22 tggactcagt cctntggtca tctcaccttc t <210> 23 <211> 46 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotid (Aptamer) <220>
<221> modifikovaná_báze <222> (46) <223> derivatizace 3'-koncovou fosfátovou skupinou <400> 23 cgatcatctc agaacattct tagcgttttg ttcttgtgta tgatcg
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (63)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Směs magnetických skleněných částic charakterizovaná tím, že magnetické skleněné částice obsahují alespoň jeden magnetický objekt se středním průměrem mezi 5 a 500 nm.
  2. 2. Směs podle nároku 1 charakterizovaná tím, že magnetický objekt má střední průměr mezi 100 a 200 nm, přednostně mezi 15 a 50 nm.
  3. 3. Směs podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 charakterizovaná tím, že poločas pro sedimentaci suspenze 3 mg/ml (váha/objem) směsi v isopropanolu je delší než 3 minuty.
  4. 4. Směs podle nároku 3 charakterizovaná tím, že poločas je delší než 6 minut.
  5. 5. Směs podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 charakterizovaná tím, že magnetický objekt má střední průměr 23 nm.
  6. 6. Směs.podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 charakterizovaná tím, že poměr průměru magnetického útvaru a skleněného obalu je menší než 1 k 10.
    Ί. Směs podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 charakterizovaná tím, že magnetické skleněné částice mají střední průměr mezi 0,5 pm a
    5 pm.
    99 9999
    99 9 999 • 9 9 9 9 9 9 9 9
    9 9 9 9 9 9 9 9 9 * 9999 99 9 999 · · • « · · * · · * · ·
    9999 9 99 99 99 99
  7. 8. Směs podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 charakterizovaná tím, že magnetické skleněné částice mají střední průměr mezi 1 pm a
    2 pm.
  8. 9. Směs podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 charakterizovaná tím, že magnetické skleněné částice jsou mikroporézní.
  9. 10. Směs podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 charakterizovaná tím, že povrch póru magnetických skleněných částic je menší než 10% celkového povrchu.
  10. 11. Směs podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 charakterizovaná tím, že magnetický objekt je superparamagnetický.
  11. 12. Směs podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 charakterizovaná tím, že magnetický objekt je ferimagnetický nebo feromagnetický
  12. 13. Směs podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 charakterizovaná tím, že magnetický objekt obsahuje železo nebo oxid železitý.
  13. 14. Směs podle nároku 13 charakterizovaná tím, že oxid železitý je Fe3C>4 nebo 7-Fe2O3.
  14. 15. Směs podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14 charakterizovaná tím, že magnetické skleněné částice mají povrchovou plochu větší než 4 m2/g.
  15. 16. Směs podle nároku 15 <84 ·♦·« • · · φ· ·· · •4 ···· • ' · ·· · ·· · charakterizovaná tím, že magnetické skleněné částice mají povrchovou plochu mezi 5 a 100 m2/g, přednostně v rozsahu 10 až 50 m2/g, nejlépe v rozsahu 15 až 30 m2/g
  16. 17. Směs podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16 charakterizovaná tím, že magnetické skleněné částice jsou v podstatě kulovité.
  17. 18. Suspenze obsahující směs magnetických skleněných částic v roztoku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17.
  18. 19. Suspenze podle nároku 18 charakterizovaná tím, že roztok obsahuje alkohol.
  19. 20. Suspenze podle nároku 19 charakterizovaná tím, že alkoholem je izopropanol nebo etanol.
  20. 21. Suspenze podle nároku 19 charakterizovaná tím, že roztok je 70% (objem/objem) etanol.
  21. 22. Suspenze podle nároku 18 charakterizovaná tím, že roztok je pufrovaný vodný roztok.
  22. 23. Suspenze podle nároku 22 charakterizovaná tím, že roztok je pufrovaný Tris-hydroxymetylamin fosfátem,
    N-(2-hydroxyetyl)piperazin-N'-(etansulfonovou kyselinou), nebo jejich solemi.
  23. 24. Suspenze podle kteréhokoliv nároku 22 až 23 charakterizovaná tím, že roztok dále obshuje substance modifikující iontovou sílu nebo komplexotvorní látky pro kovy (metal-complexing agents).
    • · 9
    9 9
    9999
  24. 25. Suspenze podle kteréhokoliv nároku 22 až 24 charakterizovaná tím, že suspenze dále obsahuje DNA nebo RNA
  25. 26. Suspenze podle kteréhokoliv nároku 22 až 24 charakterizovaná tím, že suspenze dále obsahuje DNA nebo RNA nebo obojí ve směsi s jednou nebo více látkami vybranými ze skupiny proteiny, mastné kyseliny, sacharidy nebo jiný biologický materiál.
  26. 27. Suspenze podle kteréhokoliv nároku 18 až 26 charakterizovaná tím, že suspenze dále obsahuje chaotropní látku.
  27. 28. Suspenze podle kteréhokoliv nároku 27 charakterizovaná tím, že chaotropní látka je vybraná ze skupiny obsahující joditan sodný, chloristan sodný, guanidin thiokyanát, guanidin isothiokyanát nebo guanidin hydrochlorid.
  28. 29. Suspenze podle kteréhokoliv nároku 28 až 29 charakterizovaná tím, že chaotropní látka je přítomná v koncentraci mezi 2 a 8 mol/1, lépe mezi 4 a 6 mol/1.
  29. 30. Suspenze podle kteréhokoliv nároku 28 až 29 charakterizovaná tím, že suspenze obsahuje 5 až 60 mg/1 směsi podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17.
  30. 31. Zkumavku obsahující směs podle kteréhokoliv nároku 1 až 17 nebo suspenzi podle kteréhokoliv nároku 18 až 30.
  31. 32. Skladovací nádoba obsahující směs podle kteréhokoliv nároku 1 až 17 nebo suspenzi podle kteréhokoliv nároku 18 až 30.
    φφ • · • Φ · ♦ φ
    ···· *
    • Φ
  32. 33. Souprava z jednotlivých částí obsahující zkumavku podle nároku 31, nebo skladovací nádobu podle nároku 32.
  33. 34. Souprava z jednotlivých částí podle nároku 33 obsahující dále promývací roztok nebo eluent.
  34. 35. Souprava z jednotlivých částí podle nároku 33 až 34, obsahující dále činidla vhodná pro purifikaci nukleových kyselin.
  35. 36. Použití směsi podle kteréhokoliv nároku 1 až 17 pro přípravu suspenze.
  36. 37. Použití suspenze podle kteréhokoliv nároku 18 až 30 pro purifikaci nukleových kyselin.
  37. 38. Použití soupravy z jednotlivých částí podle nároků 33 až 35 pro purifikaci nukleových kyselin.
  38. 39. Metoda pro přípravu směsi magnetických skleněných částic podle kteréhokoliv nároku 1 až 17 obsahující kroky
    a) suspendování magnetických objektů s průměrem mezi 5 a 500 nm v sólu
    b) sušení rozprašováním v dvou tryskové (two nozzle) rozprašovací sušičce a
    c) slinování (sintering) rozprašováním vysušeného prášku
  39. 40. Metoda podle nároku 39 charakterizovaná tím, že vstupní teplota dvoutryskové rozprašovací sušičky je mezi 120 °C a 500 °C, výstupní teplota je vybraná podle bodu varu sólu a rozprašovací tlak je alespoň 3 bary.
  40. 41. Metoda podle kteréhokoliv nároku 39 až 40 charakterizovaná tím, že vstupní teplota dvoutryskové rozprašovací sušičky je mezi 170 °C a 230 °C, nejlépe mezi 190 °C a 210 °C.
    • 4 «··· • 4 • 00 0 4
  41. 42. Metoda podle kteréhokoliv nároku 39 až 40 charakterizovaná tím, že vstupní teplota dvoutryskové rozprašovací sušičky je 200 °C.
  42. 43. Metoda podle kteréhokoliv nároku 39 až 42 charakterizovaná tím, že rozprašovací tlak je mezi 4 a 6 bary.
  43. 44. Metoda podle kteréhokoliv nároku 39 až 43 charakterizovaná tím, že sol obsahuje jako rozpouštědlo etanol.
  44. 45. Metoda podle nároku 44 charakterizovaná tím, že výstupní teplota je mezi 50 °C a 300 °C.
  45. 46. Metoda podle kteréhokoliv nároku 44 až 45 charakterizovaná tím, že výstupní teplota je mezi 90 °C a 100 °C.
  46. 47. Metoda podle kteréhokoliv nároku 39 až 46 charakterizovaná tím, že sintrovací teplota je mezi 400 °C a 1200 °C, přednostně mezi 720 °C a 770 °C.
  47. 48. Magnetické skleněné částice dosažitelné procesem nárokovaným v kterémkoliv z nároků 39 až 47.
  48. 49. Pracovní postup pro izolaci biologického materiálu zahrnující
    a) smíchání vzorku, který obsahuje biologický materiál v roztoku, se směsí podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17, magnetickými skleněnými částicemi podle nároku 48, nebo suspenzí podle kteréhokoliv z nároků 18 až 30, za podmínek, kdy se biologický materiál váže přímo na skleněný povrch a
    b) separaci biologického materiálu z roztoku.
    • · · • 4 · • ♦··· • · ···· · ·· ··· ·· ····
  49. 50. Pracovní postup podle nároku 49, charakterizovaný tím, že biologickým materiálem je nukleová kyselina.
  50. 51. Pracovní postup podle nároku 49, charakterizovaný tím, že biologický materiál obsahuje směs nukleových kyselin, kde cílová nukleová kyselina nebo cílové nukleové kyseliny je/jsou přítomné v malém množství.
  51. 52. Pracovní postup podle kteréhokoliv nároku 49 až 51 charakterizovaný tím, že separace se provádí s pomocí magnetu.
  52. 53. Pracovní postup podle kteréhokoliv nároku 49 až 52 charakterizovaný tím, že magnetické částice nejsou předmagnetizované, když se dostanou do kontaktu se vzorkem,.
  53. 54. Pracovní postup podle kteréhokoliv nároku 49 až 53 charakterizovaný tím, že pracovní postup je automatizovaný.
  54. 55. Pracovní postup podle kteréhokoliv nároku 49 až 54 charakterizovaný tím, že pracovní postup je vysokopropustný (high-throughput).
  55. 56. Pracovní postup podle kteréhokoliv nároku 49 až 55 charakterizovaný tím, že se během postupu suspenze, podle kteréhokoliv nároku 18 až 26, odebere ze skladovací nádoby a do různých reakčních nádob se přidá dílčí objem suspenze.
  56. 57. Pracovní postup podle kteréhokoliv nároku 49 až 56 charakterizovaný tím, že je nukleová kyselina po izolaci detekována.
  57. 58. Pracovní postup podle kteréhokoliv nároku 49 až 57 <řé ·« ··»·
    99 ···· • · 9 · · · « · 9 9 9 ·
    9 9 9 9 9 9 9 9
    9 9 9 9 9 9 9 9
    99 99 99 99 charakterizovaný tím, že je nukleová kyselina detekovaná po amplifikačním kroku.
  58. 59. Pracovní postup podle kteréhokoliv nároku 57 až 58 charakterizovaný tím, že nukleová kyselina je detekovaná postupem zahrnujícím:
    a) kontakt vzorku s oligonukleotídem, obsahujícím sekvenci komplementární k oblasti cílové nukleové kyseliny a se značeným oligonukleotídem, obsahujícím sekvenci komplementární k jiné oblasti toho samého řetězce cílové nukleové kyseliny, ale ne té sekvenci nukleové kyseliny, která byla definovaná prvním oligonukleotídem; tím vznikne při hybridízačních podmínkách směs duplexů zahrnující cílovou nukleovou kyselinu s přichyceným prvním oligonukleotídem a se značeným oligonukleotídem tak, že 3'- konec prvního nukleotidu je přilehlý 5ř- konci značeného nukleotidu;
    b) udržování reakční směsi kroku a) s na templátu závislou polymerázou nukleových kyselin s 5' -3' nukleázovou aktivitou, za podmínek dostatečných pro tuto 5'-3' nukleázovou aktivitu polymerázy rozštěpit připojený značený nukleotid a uvolnit značený fragment; a
    c) detekce a/nebo měření signálu tvořeného hydrolýzou značeného oligonukleotidu.
  59. 60. Pracovní postup podle kteréhokoliv nároku 58 až 59 charakterizovaný tím, že se detekce provádí za přítomnosti blokujícího oligonukleotidu.
  60. 61. Pracovní postup podle nároku 60 charakterizovaný tím, že blokujícím oligonukleotídem je aptamer.
  61. 62. Pracovní postup podle nároku 61 charakterizovaný tím, že aptamer má sekvenci SEQ ID NO: 23.
  62. 63. Pracovní postup podle kteréhokoliv nároku 60 až 62 charakterizovaný tím, že se amplifikační a detekční reakce provádí • 9 9
    9 9 ·
    9 9 9
    9 99*·
    9 9
    9949 9 »9 ···· > 9 I > 9 9 1
    99 «4 •9 »··9 ve formátu homogenního multíplexního testu v roztoku, pro současnou detekci více cílů.
  63. 64. Pracovní postup podle kteréhokoliv nároku 61 až 63 charakterizovaný tím, že po alespoň po 5 cyklů polymerázové řetězové reakce je teplota nasedání primerů (annealing temperature) nižší než
    8 °C, nebo lépe nižší než 3 °C, nad disociační teplota komplexu polymeráza-aptamer.
    Obrázek 1
    Schematické znázornění přípravy syntézou sólu a sušením rozprašováním
    K(+)-metanolát ....................,,............................
    Tetraetyl-ortosilikat —
    Trietylborát __________
    Isopropanolát hlinitý .....
    Etanol (rozpouštědlo) ——---Kovový vápník ---------------------Oetan zinečnatý .............— ▼
    Výroba čisté fyzikální směsi složek
    Přidání směsi etanil/voda =spuštění reakce zásadou katalyzovanů syntéza sóla
    V homogenní průzračný sol přidání magnetického pigmentu -* ▼
    sol 8 disperzí pigmentu vhodný pro rozprašováni proces sušení rozprašováním (proměnlivý tlak, teplota, rychlost průtokn, geometrie trysky
    V
    Xerogel částice s magnetickým jádrem
    Obrázek 2 ·· · • · · · · • ♦····· ·
    Schematické znázornění přípravy nehotových částic
    Předkondenzace teplotním působením (4h/200 °C) na vzduchu pro stabilizaci povrchu
    Konečná kondenzace a spékání v inertní atmosféře (N2) působením vysoké teploty (lh, 750 °C) => jádra pigmentů obklopené slabě podchlazenou taveninou
    Rychlé ochlazení => sklem obalené částice s magnetickým jádrem = MGP
    Teplotní opracování na vzduchu (4h, 200 °C) = oxidace skleněného obalu
    Příprava neagregující frakce použitím síta
    Plnění MGP prášku do lahví, pak teplotní opracování 4h/200 °C
    I
    Ochlazení na asi 80 °C, uzavření lahve fólií a zašroubování víčka f
    I
    Skladování MGP částic ==> suspenze v R-OH (např. izopropanolu) 'X
    Obrázek 3
    I* 99 9 9
    9 9 9 9
    9 9 9 9 9
    9 999999 9
    9 9 9
    9 9 9 99
    9 99 9 čištění odpadního
    WB nádoba se sólem plynu
    SP plnící pumpa
    EWT elektrický ohřívač
    T sušící komora
    ZY odlučovač
    SF filtr
    WT kondenzátor
    AV ventilátor
    AVO nádoba
    US ultrazvukové zařízení
    Technické údaje: Průměr sušící komory Výška sušící komory Vypařovací schopnost
    0,75 m 2,5 m 1-2 1/h
    Obrázek 4 • · 4 44 4 ·· 4444
    J 444 44 4 44 4
    4444444 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4444
    4444 4 44 44 44 44
CZ20021608A 1999-11-17 2000-11-17 Magnetické skleněné částice, metody jejich přípravy a použití CZ20021608A3 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99122853 1999-11-17
EP00110165A EP1154443A1 (en) 2000-05-12 2000-05-12 Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof
US10/147,679 US20030224366A1 (en) 1999-11-17 2002-05-16 Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20021608A3 true CZ20021608A3 (cs) 2003-06-18

Family

ID=32096539

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20021608A CZ20021608A3 (cs) 1999-11-17 2000-11-17 Magnetické skleněné částice, metody jejich přípravy a použití

Country Status (15)

Country Link
US (3) US20030224366A1 (cs)
EP (1) EP1232502B1 (cs)
JP (2) JP2003514383A (cs)
AT (1) ATE315826T1 (cs)
CA (1) CA2392009C (cs)
CY (1) CY1105229T1 (cs)
CZ (1) CZ20021608A3 (cs)
DE (1) DE60025529T2 (cs)
DK (1) DK1232502T3 (cs)
ES (1) ES2256068T3 (cs)
HU (1) HUP0203386A3 (cs)
PL (1) PL202358B1 (cs)
PT (1) PT1232502E (cs)
SK (1) SK287932B6 (cs)
WO (1) WO2001037291A1 (cs)

Families Citing this family (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19520398B4 (de) 1995-06-08 2009-04-16 Roche Diagnostics Gmbh Magnetisches Pigment
PL202358B1 (pl) 1999-11-17 2009-06-30 Roche Diagnostics Gmbh Sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cząstek szklanych, magnetyczne cząstki szklane, kompozycja magnetycznych cząstek szklanych, zawiesina z magnetycznymi cząstkami szklanymi, probówka z kompozycją lub zawiesiną magnetycznych cząstek szklanych, zestaw części z tą probówką, zastosowanie kompozycji, zawiesiny i zestawu zawierających magnetyczne cząstki szklane, sposób izolowania materiału biologicznego
DE10140089A1 (de) * 2001-08-16 2003-02-27 Degussa Superparamagnetische oxidische Partikel, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung
DE10153547A1 (de) 2001-10-30 2003-05-22 Degussa Dispersion, enthaltend pyrogen hergestellte Abrasivpartikel mit superparamagnetischen Domänen
DK1466018T3 (da) 2002-01-08 2008-02-04 Hoffmann La Roche Anvendelse af silicamateriale i en amplifikationsreaktion
DE10201084A1 (de) * 2002-01-14 2003-07-24 Bayer Ag Siliziumhaltige Magnetpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung der Partikel
DE60316748T2 (de) * 2002-06-27 2008-02-07 Toyo Boseki K.K. Magnetischer Träger für biologische Substanzen, Verfahren zur seiner Produktion und seiner Verwendung zur Isolierung dieser biologischen Substanzen
GB0215185D0 (en) 2002-07-01 2002-08-07 Genovision As Binding a target substance
EP1394172A1 (en) * 2002-08-29 2004-03-03 Boehringer Mannheim Gmbh Improved method for bisulfite treatment
US9394332B2 (en) 2002-08-29 2016-07-19 Epigenomics Ag Method for bisulfite treatment
US7597936B2 (en) 2002-11-26 2009-10-06 University Of Utah Research Foundation Method of producing a pigmented composite microporous material
US7682688B2 (en) * 2002-11-26 2010-03-23 University Of Utah Research Foundation Microporous materials, methods, and articles for localizing and quantifying analytes
US7560231B2 (en) 2002-12-20 2009-07-14 Roche Molecular Systems, Inc. Mannitol and glucitol derivatives
EP1590362B8 (en) 2003-01-29 2015-06-03 Epigenomics AG Improved method for bisulfite treatment
JP3644641B2 (ja) * 2003-03-07 2005-05-11 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸回収方法
CA2463719A1 (en) 2003-04-05 2004-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleotide analogs with six membered rings
EP1524317B1 (en) * 2003-10-13 2015-03-04 Roche Diagnostics GmbH Methods for isolating nucleic acids
CA2482097C (en) 2003-10-13 2012-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for isolating nucleic acids
EP1692315A1 (en) 2003-12-02 2006-08-23 Roche Diagnostics GmbH Improved method for bisulfite treatment
US7727710B2 (en) 2003-12-24 2010-06-01 3M Innovative Properties Company Materials, methods, and kits for reducing nonspecific binding of molecules to a surface
US7939249B2 (en) 2003-12-24 2011-05-10 3M Innovative Properties Company Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step
US20070281294A1 (en) 2004-02-10 2007-12-06 Roche Moleculr Systems, Inc. Primers And Probes For The Detection Of Parvovirus B19
US7939251B2 (en) 2004-05-06 2011-05-10 Roche Molecular Systems, Inc. SENP1 as a marker for cancer
EP1632578A1 (en) 2004-09-03 2006-03-08 Roche Diagnostics GmbH DNA decontamination method
EP1642648A1 (de) 2004-09-30 2006-04-05 Roche Diagnostics GmbH Vorrichtung und Verfahren zum Einstellen einer Temperatur einer Flüssigkeit
US7842794B2 (en) 2004-12-17 2010-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Reagents and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae
EP1749892B1 (en) 2005-08-02 2008-03-19 Roche Diagnostics GmbH Nucleotide sequence for assessing TSE
US7249521B1 (en) 2005-08-24 2007-07-31 Peter Frasca Method for determining the presence of a magnetically susceptible or magnetic material in a sample
US7569367B2 (en) 2005-09-07 2009-08-04 Roche Diagnostics Operations, Inc. Nucleic acid preparation from whole blood for use in diagnosis of transmissible spongiform encephalopathy
US7981606B2 (en) 2005-12-21 2011-07-19 Roche Molecular Systems, Inc. Control for nucleic acid testing
EP1932913B1 (en) 2006-12-11 2013-01-16 Roche Diagnostics GmbH Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives
CN101200716B (zh) 2006-12-11 2012-08-29 霍夫曼-拉罗奇有限公司 使用聚多卡醇和衍生物的核酸分离
EP2094846B8 (en) 2006-12-13 2013-10-16 Roche Diagnostics GmbH Use of tde for the isolation of nucleic acids
ATE490320T1 (de) 2006-12-13 2010-12-15 Hoffmann La Roche Verwendung von acetalen zur isolation von nukleinsäuren
US8535888B2 (en) 2006-12-29 2013-09-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Compositions and methods for detecting methicillin-resistant S. aureus
EP2140001A2 (en) * 2007-04-25 2010-01-06 3M Innovative Properties Company Methods for nucleic acid amplification
AU2008245707A1 (en) * 2007-04-25 2008-11-06 3M Innovative Properties Company Compositions, methods, and devices for isolating biological materials
DE102007063102B4 (de) 2007-12-28 2022-02-10 Robert Bosch Gmbh Verfahren zur Erfassung eines periodisch pulsierenden Betriebsparameters
WO2009154852A2 (en) * 2008-04-14 2009-12-23 Integrated Nano-Technologies Llc Paramagnetic nucleation nanoparticles
WO2009129236A2 (en) * 2008-04-14 2009-10-22 Integrated Nano-Technologies Llc Method for manipulating samples with magnetic nucleation nanoparticles
ES2439951T3 (es) 2008-06-06 2014-01-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Detección y cuantificación multiplex de ácidos nucleicos microbianos controlada de forma interna
EP2177271B8 (en) 2008-10-15 2019-12-18 F. Hoffmann-La Roche AG Magnetic separation system comprising flexible magnetic pins and corresponding method
CA2688174C (en) 2008-12-19 2018-08-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Dry composition of reaction compounds with stabilized polymerase
US20110028703A1 (en) * 2009-03-06 2011-02-03 Nanosphere, Inc. Method and apparatus for suspending magnetic microparticles
DE102009058650A1 (de) 2009-12-16 2011-06-22 Leibniz-Institut für Neue Materialien gemeinnützige GmbH, 66123 Magnetische Kompositpartikel
US20120258553A1 (en) * 2009-12-23 2012-10-11 Koninklijke Philips Electronics N.V. Analyte measurement apparatus and method
PE20131009A1 (es) * 2010-06-11 2013-09-19 Basf Se Proceso para separar al menos un primer material de una mezcla que comprende al menos el primer material, al menos un segundo material y particulas magneticas
US8865000B2 (en) 2010-06-11 2014-10-21 Basf Se Utilization of the naturally occurring magnetic constituents of ores
ES2569220T3 (es) 2010-06-22 2016-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Envase de suspensión para partículas de unión para el aislamiento de material biológico
US9725754B2 (en) 2010-07-29 2017-08-08 Sean F. Boyle Generic sample preparation
EP2598653B1 (en) 2010-07-29 2017-08-23 F. Hoffmann-La Roche AG Generic pcr
CA2802563C (en) 2010-07-29 2018-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Preparation of nucleic acids from different types of biological fluid samples
EP2598655B1 (en) 2010-07-29 2016-10-05 F.Hoffmann-La Roche Ag Qualitative and quantitative detection of microbial nucleic acids
ES2640522T3 (es) 2010-07-29 2017-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Ácidos nucleicos de control para múltiples parámetros
US8609340B2 (en) 2010-07-29 2013-12-17 Roche Molecular Systems, Inc. Control nucleic acids for multiple parameters
US9175332B2 (en) 2010-07-29 2015-11-03 Roche Molecular Systems, Inc. Generic PCR
EP2426222A1 (en) 2010-09-07 2012-03-07 F. Hoffmann-La Roche AG Generic buffer for amplification
US9184099B2 (en) 2010-10-04 2015-11-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biosensor devices, systems and methods therefor
US9399217B2 (en) 2010-10-04 2016-07-26 Genapsys, Inc. Chamber free nanoreactor system
CN103328981B (zh) 2010-10-04 2017-04-12 吉纳普赛斯股份有限公司 用于自动化可重复使用的平行生物反应的系统和方法
EP2465945A1 (en) 2010-12-17 2012-06-20 F. Hoffmann-La Roche AG Generic matrix for control nucleic acids
US8585973B2 (en) 2011-05-27 2013-11-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nano-sensor array
US9926596B2 (en) 2011-05-27 2018-03-27 Genapsys, Inc. Systems and methods for genetic and biological analysis
EP2535712A1 (en) 2011-06-15 2012-12-19 F. Hoffmann-La Roche AG Analytical system for the preparation of biological material
GB201113698D0 (en) * 2011-08-09 2011-09-21 Wirtz Ralf M Matrix and method for purifying and/or isolating nucleic acids
US20130071946A1 (en) 2011-09-21 2013-03-21 Roche Molecular Systems, Inc. Suspension Container For Binding Particles For The Isolation Of Biological Material
US10093975B2 (en) 2011-12-01 2018-10-09 Genapsys, Inc. Systems and methods for high efficiency electronic sequencing and detection
CA2873099C (en) * 2012-06-07 2021-06-15 Somalogic, Inc. Aptamer-based multiplexed assays
US9399986B2 (en) 2012-07-31 2016-07-26 General Electric Company Devices and systems for isolating biomolecules and associated methods thereof
EP2965817B1 (en) 2012-10-24 2017-09-27 Genmark Diagnostics Inc. Integrated multiplex target analysis
US20140322706A1 (en) 2012-10-24 2014-10-30 Jon Faiz Kayyem Integrated multipelx target analysis
RU2527047C1 (ru) * 2013-02-14 2014-08-27 Виталий Богданович Черногиль Способ изготовления микрошариков и микросфер
RU2527427C1 (ru) * 2013-02-14 2014-08-27 Виталий Богданович Черногиль Способ производства микрошариков и микросфер
US20140272971A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Health Diagnostic Laboratory, Inc. Unheated extraction of genomic dna in an automated laboratory system
WO2014152625A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Genapsys, Inc. Systems and methods for biological analysis
JP6351702B2 (ja) 2013-03-15 2018-07-04 ジェンマーク ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 変形可能流体容器を操作するためのシステム、方法、および装置
US9409148B2 (en) 2013-08-08 2016-08-09 Uchicago Argonne, Llc Compositions and methods for direct capture of organic materials from process streams
RU2540312C1 (ru) * 2013-10-22 2015-02-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химии и химической технологии Сибирского отделения Российской академии наук Способ получения магнитного аффинного сорбента для выделения рекомбинантных белков
USD881409S1 (en) 2013-10-24 2020-04-14 Genmark Diagnostics, Inc. Biochip cartridge
US9498778B2 (en) 2014-11-11 2016-11-22 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument for processing cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
KR102393203B1 (ko) 2013-11-19 2022-04-29 삼성전자주식회사 발광 입자, 그를 포함하는 물질 및 제품, 및 방법
WO2015089238A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Genapsys, Inc. Systems and methods for biological analysis and computation
US9822401B2 (en) 2014-04-18 2017-11-21 Genapsys, Inc. Methods and systems for nucleic acid amplification
CN107112105A (zh) 2014-10-23 2017-08-29 康宁股份有限公司 聚合物包封的磁性纳米颗粒
US9598722B2 (en) 2014-11-11 2017-03-21 Genmark Diagnostics, Inc. Cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
US10005080B2 (en) 2014-11-11 2018-06-26 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument and cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system employing electrowetting fluid manipulation
US10544456B2 (en) 2016-07-20 2020-01-28 Genapsys, Inc. Systems and methods for nucleic acid sequencing
EP3299471B1 (en) 2016-09-23 2019-10-23 Roche Diagniostics GmbH Methods for determining the amount of a nucleic acid of interest in an unprocessed sample
JP2021500858A (ja) 2017-09-21 2021-01-14 ジナプシス インコーポレイテッド 核酸シーケンシングのためのシステム及び方法
MA55371A (fr) 2019-03-19 2022-01-26 Amgen Inc Détergents alternatifs pour inactivation virale
EP4032854A4 (en) * 2019-09-19 2023-10-25 Sanyo Chemical Industries, Ltd. MAGNETIC PARTICLE COMPOSITION, USE OF A MAGNETIC PARTICLE COMPOSITION FOR SEPARATING NUCLEIC ACIDS, KIT FOR PRODUCING A MAGNETIC PARTICLE COMPOSITION, MAGNETIC PARTICLES, CHAOTROPIC SALT AND METHOD FOR SEPARATION AND PURIFICATION
CA3174047A1 (en) 2020-03-30 2021-10-07 Universite De Liege, Gembloux Agro-Bio Tech Preparation of magnetic core-shell particles
EP4015074A1 (en) 2020-12-17 2022-06-22 Université de Liège Preparation of magnetic core-shell particles
WO2022060732A1 (en) 2020-09-17 2022-03-24 Nanophase Technologies Corporation Magnetic beads, method of making and method of use thereof

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2913419A (en) * 1956-04-18 1959-11-17 Du Pont Chemical process and composition
US2885366A (en) * 1956-06-28 1959-05-05 Du Pont Product comprising a skin of dense, hydrated amorphous silica bound upon a core of another solid material and process of making same
US3290122A (en) * 1964-07-28 1966-12-06 Sam D Clinton Process for preparing oxide gel microspheres from sols
DE2313331C2 (de) * 1973-03-17 1986-11-13 Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt Eisenoxidhaltige Glimmerschuppenpigmente
US3945862A (en) * 1973-06-26 1976-03-23 Merck & Co., Inc. Coated ferrous substrates comprising an amorphous magnesia-silica complex
DE2625106C2 (de) * 1976-06-04 1982-03-11 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Eisenoxidschwarz-Pigmente mit verbesserter Oxidationsbeständigkeit und Verfahren zu ihrer Herstellung
US4126437A (en) * 1976-12-02 1978-11-21 Xerox Corporation Magnetic glass carrier materials
US4124385A (en) * 1976-12-02 1978-11-07 Xerox Corporation Magnetic glass carrier materials
US4124735A (en) * 1976-12-02 1978-11-07 Xerox Corporation Magnetic glass carrier materials
US4297337A (en) * 1979-04-13 1981-10-27 Corning Glass Works Solid-phase immunoassays using magnetic glass
US4233169A (en) * 1979-04-13 1980-11-11 Corning Glass Works Porous magnetic glass structure
US4395271A (en) * 1979-04-13 1983-07-26 Corning Glass Works Method for making porous magnetic glass and crystal-containing structures
JPS5676510A (en) * 1979-11-28 1981-06-24 Tdk Corp Manufacture of magnetic recording material
JPS56105337A (en) * 1980-01-28 1981-08-21 Tdk Corp Magnetic recording medium and its production
US4280918A (en) * 1980-03-10 1981-07-28 International Business Machines Corporation Magnetic particle dispersions
US4360441A (en) * 1981-06-25 1982-11-23 Corning Glass Works Glass-encapsulated magnetic materials and methods for making them
US4448884A (en) 1982-03-03 1984-05-15 Kms Fusion, Inc. Glass-surface microcarrier for growth of cell cultures
DE3211309A1 (de) * 1982-03-26 1983-09-29 Metin Dipl.-Ing. 6100 Darmstadt Colpan Chromatographisches verfahren zur isolierung von makromolekuelen
US4477492A (en) * 1983-04-22 1984-10-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for preparing superficially porous supports for chromatography and catalysts
US4672040A (en) * 1983-05-12 1987-06-09 Advanced Magnetics, Inc. Magnetic particles for use in separations
US4695393A (en) * 1983-05-12 1987-09-22 Advanced Magnetics Inc. Magnetic particles for use in separations
US4698302A (en) * 1983-05-12 1987-10-06 Advanced Magnetics, Inc. Enzymatic reactions using magnetic particles
US4628037A (en) * 1983-05-12 1986-12-09 Advanced Magnetics, Inc. Binding assays employing magnetic particles
US4554088A (en) * 1983-05-12 1985-11-19 Advanced Magnetics Inc. Magnetic particles for use in separations
US4695392A (en) * 1983-05-12 1987-09-22 Advanced Magnetics Inc. Magnetic particles for use in separations
GB8401636D0 (en) * 1984-01-21 1984-02-22 British Petroleum Co Plc Coating process
US5236623A (en) * 1984-07-11 1993-08-17 Rhone-Poulenc Chimie Process for the production of a silica colloid
US4824712A (en) * 1984-07-16 1989-04-25 Ppg Industries, Inc. Treatment of glass to reduce venting during thermal treatment and a glass article made thereby
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5597531A (en) * 1985-10-04 1997-01-28 Immunivest Corporation Resuspendable coated magnetic particles and stable magnetic particle suspensions
US5512332A (en) * 1985-10-04 1996-04-30 Immunivest Corporation Process of making resuspendable coated magnetic particles
US5076950A (en) * 1985-12-20 1991-12-31 Syntex (U.S.A.) Inc. Magnetic composition for particle separation
US5206568A (en) * 1986-03-26 1993-04-27 Beckman Instruments, Inc. Coordinated control of stepper motors
US4751211A (en) * 1986-08-07 1988-06-14 Aluminum Company Of America Composite adsorbent for removing acids from organophosphate functional fluids
JPS63109105A (ja) * 1986-10-25 1988-05-13 Chisso Corp 強磁性金属微粒子の製造方法
DE3639949A1 (de) * 1986-11-22 1988-06-09 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren
US4767670A (en) * 1987-01-21 1988-08-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Chromatographic supports for separation of oligonucleotides
NO162946C (no) * 1987-08-21 1990-03-14 Otto Soerensen Anordning for magnetisk separasjon av celler.
DE3724442A1 (de) 1987-07-23 1989-02-02 Europ Lab Molekularbiolog Verfahren und vorrichtung zur reinigung von m-13-phagen-dna
ES2066851T3 (es) * 1988-05-24 1995-03-16 Anagen Uk Ltd Particulas atraibles magneticamente y metodo de preparacion.
US5312485A (en) * 1988-08-05 1994-05-17 J. M. Huber Corporation Precipitated encapsulated paper pigments and methods
US5041390A (en) * 1988-08-11 1991-08-20 Skov Per S Method and means for allergy diagnosis
US5075430A (en) * 1988-12-12 1991-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Process for the purification of DNA on diatomaceous earth
NL8900725A (nl) 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
US5234809A (en) * 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
US5352645A (en) * 1989-04-14 1994-10-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Silica microspheres, method of improving attrition resistance and use
JP2545282B2 (ja) * 1989-04-17 1996-10-16 日東化学工業株式会社 球状シリカ粒子の製造方法
US5055194A (en) * 1989-07-28 1991-10-08 University Of Pennsylvania Support for high performance liquid chromatography in a magnetically stabilized fluidized bed
US5698271A (en) * 1989-08-22 1997-12-16 Immunivest Corporation Methods for the manufacture of magnetically responsive particles
US5279936A (en) * 1989-12-22 1994-01-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Method of separation employing magnetic particles and second medium
US5523231A (en) * 1990-02-13 1996-06-04 Amersham International Plc Method to isolate macromolecules using magnetically attractable beads which do not specifically bind the macromolecules
DE69108958T2 (de) * 1990-02-21 1995-12-14 Toda Kogyo Corp Superparamagnetische feine Teilchen aus Eisenoxid und magnetische Aufzeichnungsträger, welche diese enthalten.
US5316699A (en) * 1990-03-28 1994-05-31 The United States Of America As Repesented By The Secretary Of Commerce Process for the controlled preparation of a composite of ultrafine magnetic particles homogeneously dispersed in a dielectric matrix
ATE154981T1 (de) * 1990-04-06 1997-07-15 Perkin Elmer Corp Automatisiertes labor für molekularbiologie
US5763173A (en) * 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases
US5693502A (en) * 1990-06-11 1997-12-02 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases
US5210015A (en) * 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5217804A (en) * 1990-11-06 1993-06-08 Eastman Kodak Company Magnetic particles
US5155018A (en) * 1991-07-10 1992-10-13 Hahnemann University Process and kit for isolating and purifying RNA from biological sources
US5395498A (en) * 1991-11-06 1995-03-07 Gombinsky; Moshe Method for separating biological macromolecules and means therfor
US5610274A (en) * 1991-11-20 1997-03-11 Cpg, Inc. Production and use of magnetic porous inorganic materials
US5734020A (en) * 1991-11-20 1998-03-31 Cpg, Inc. Production and use of magnetic porous inorganic materials
US5346994A (en) * 1992-01-28 1994-09-13 Piotr Chomczynski Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins
EP0555798B1 (en) * 1992-02-13 1999-05-06 Becton, Dickinson and Company Hydrated celite and purification of DNA
US5389482A (en) * 1992-04-23 1995-02-14 Toda Kogyo Corp. Magnetic particle powder included in magnetic toners for magnetic image character recognition
TW221381B (cs) * 1992-04-28 1994-03-01 Du Pont
IT1256064B (it) * 1992-07-28 1995-11-27 Donegani Guido Ist Metodo per la preparazione di geli porosi contenenti boro
CA2107524C (en) * 1992-10-06 1999-01-19 Hiromitsu Misawa Iron oxide particles and process for producing the same
US5578238A (en) * 1992-10-30 1996-11-26 Lord Corporation Magnetorheological materials utilizing surface-modified particles
AU669398B2 (en) * 1992-11-13 1996-06-06 Becton Dickinson & Company Boron silicates aluminum silicates phosphosilicates and purification of DNA
DE4307262A1 (de) 1993-03-02 1994-09-08 Christian Bergemann Magnetisches polymeres Siliciumdioxid
US5648170A (en) * 1993-04-27 1997-07-15 Toda Kogyo Corporation Coated granular magnetite particles and process for producing the same
WO1995004140A1 (en) 1993-07-28 1995-02-09 Akzo Nobel N.V. Process for isolating nucleic acid from gram positive microorganisms
EP0723549B1 (en) * 1993-08-30 2003-12-17 Promega Corporation Nucleic acid purification compositions and methods
US5523065A (en) * 1993-09-27 1996-06-04 Alfred University Process for making ultra-fine barium titanate particles
US5468427A (en) * 1993-09-27 1995-11-21 Alfred University Process for making ultra-fine ceramic particles
US5438127A (en) * 1993-09-27 1995-08-01 Becton Dickinson And Company DNA purification by solid phase extraction using a PCl3 modified glass fiber membrane
US5503816A (en) * 1993-09-27 1996-04-02 Becton Dickinson And Company Silicate compounds for DNA purification
US5599627A (en) 1993-10-08 1997-02-04 Toda Kogyo Corporation Magnetic particles comprising magnetite core and process for producing the same
US5538848A (en) * 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US5990301A (en) * 1994-02-07 1999-11-23 Qiagen Gmbh Process for the separation and purification of nucleic acids from biological sources
ATE179425T1 (de) * 1994-02-07 1999-05-15 Qiagen Gmbh Verfahren zur abreicherung oder entfernung von endotoxinen
GB9411572D0 (en) * 1994-06-09 1994-08-03 Amersham Int Plc Magnetic bead precipitation method
US5817327A (en) * 1994-07-27 1998-10-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Incorporation of biologically active molecules into bioactive glasses
US5928958A (en) * 1994-07-27 1999-07-27 Pilgrimm; Herbert Superparamagnetic particles, process for their manufacture and usage
US5582988A (en) * 1994-09-15 1996-12-10 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same
US5705628A (en) * 1994-09-20 1998-01-06 Whitehead Institute For Biomedical Research DNA purification and isolation using magnetic particles
US5660984A (en) * 1994-12-09 1997-08-26 Davis; Thomas E. DNA isolating apparatus comprising a non-porous DNA binding, anion exchange resin and methods of use thereof
FR2732116B1 (fr) * 1995-03-21 1997-05-09 Bio Merieux Procede et dispositif pour la determination qualitative et/ou quantitative d'un analyte, notamment d'une bacterie, dans un echantillon, par voie magnetique
US5683875A (en) * 1995-05-04 1997-11-04 Hewlett-Packard Company Method for detecting a target nucleic acid analyte in a sample
IN188702B (cs) * 1995-06-01 2002-10-26 Degussa
KR100463475B1 (ko) * 1995-06-08 2005-06-22 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 자기성피그먼트
DE19520964A1 (de) * 1995-06-08 1996-12-12 Inst Neue Mat Gemein Gmbh Beschichtete anorganische Pigmente, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
DE19854973B4 (de) * 1998-11-30 2010-02-04 Institut Für Neue Materialien Gem. Gmbh Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren
DE19520398B4 (de) * 1995-06-08 2009-04-16 Roche Diagnostics Gmbh Magnetisches Pigment
WO2000032762A1 (de) * 1998-11-30 2000-06-08 Roche Diagnostics Gmbh Magnetische partikel zur reinigung von nukleinsäuren
JP2965131B2 (ja) * 1995-07-07 1999-10-18 東洋紡績株式会社 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法
US5578179A (en) * 1995-07-12 1996-11-26 The Perkin-Elmer Corporation Method and silicate composition for conditioning silica surfaces
US5783686A (en) * 1995-09-15 1998-07-21 Beckman Instruments, Inc. Method for purifying nucleic acids from heterogenous mixtures
US5904848A (en) * 1996-02-21 1999-05-18 Cpg, Inc. Controlled pore glass-synthetic resin membrane
US5972721A (en) * 1996-03-14 1999-10-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Immunomagnetic assay system for clinical diagnosis and other purposes
DE19622885A1 (de) 1996-06-07 1997-12-11 Boehringer Mannheim Gmbh Reagenzzubereitung enthaltend magnetische Partikel in Form einer Tablette
DE69810080T2 (de) * 1997-01-21 2003-10-09 Grace W R & Co Siliciumdioxidadsorbent auf magnetischem träger
US6027945A (en) * 1997-01-21 2000-02-22 Promega Corporation Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles
DE69827060T2 (de) 1997-03-20 2005-03-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Modifizierte Primer
DE19743518A1 (de) * 1997-10-01 1999-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Automatisierbare universell anwendbare Probenvorbereitungsmethode
US5990479A (en) * 1997-11-25 1999-11-23 Regents Of The University Of California Organo Luminescent semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
EP0937497B9 (en) 1997-12-25 2003-10-29 Tosoh Corporation Magnetic carrier, preparation thereof, and method of extraction of nucleic acid
PL202358B1 (pl) 1999-11-17 2009-06-30 Roche Diagnostics Gmbh Sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cząstek szklanych, magnetyczne cząstki szklane, kompozycja magnetycznych cząstek szklanych, zawiesina z magnetycznymi cząstkami szklanymi, probówka z kompozycją lub zawiesiną magnetycznych cząstek szklanych, zestaw części z tą probówką, zastosowanie kompozycji, zawiesiny i zestawu zawierających magnetyczne cząstki szklane, sposób izolowania materiału biologicznego
US7267964B2 (en) * 2000-03-31 2007-09-11 Merial Limited DNA molecules encoding ligand gated ion channels from Dermacentor variabilis
US20030032146A1 (en) 2001-07-10 2003-02-13 Dwulet Francis Edward Enzyme/tag binding and detection system

Also Published As

Publication number Publication date
PL356771A1 (en) 2004-07-12
EP1232502A1 (en) 2002-08-21
JP4361905B2 (ja) 2009-11-11
JP2003514383A (ja) 2003-04-15
PL202358B1 (pl) 2009-06-30
JP2006193421A (ja) 2006-07-27
DE60025529D1 (de) 2006-04-06
US20030224366A1 (en) 2003-12-04
HUP0203386A3 (en) 2010-01-28
CA2392009A1 (en) 2001-05-25
PT1232502E (pt) 2006-05-31
CY1105229T1 (el) 2010-03-03
ATE315826T1 (de) 2006-02-15
DE60025529T2 (de) 2006-08-24
HUP0203386A1 (hu) 2002-12-28
DK1232502T3 (da) 2006-05-22
US20120247150A1 (en) 2012-10-04
US8129118B2 (en) 2012-03-06
SK287932B6 (sk) 2012-05-03
WO2001037291A1 (en) 2001-05-25
CA2392009C (en) 2009-07-14
EP1232502B1 (en) 2006-01-11
US20050266462A1 (en) 2005-12-01
SK6642002A3 (en) 2003-08-05
ES2256068T3 (es) 2006-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20021608A3 (cs) Magnetické skleněné částice, metody jejich přípravy a použití
JP4148900B2 (ja) 増幅反応におけるシリカ物質の使用
US6255477B1 (en) Particles having a magnetic core and outer glass layer for separating biological material
JP5537894B2 (ja) 磁性色素
JP5153048B2 (ja) 亜硫酸水素塩処理のための改善された方法
US20190241885A1 (en) Magnetic particles with a closed ultrathin silica layer, method for the production thereof and their use
EP1932913A1 (en) Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives
KR20220059418A (ko) 다중 진단을 위한 핵산 분리 및 검출용 미세입자 프로브
EP1154443A1 (en) Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof
US10752892B2 (en) Multilayer complex, method for manufacturing said complex and use of said complex
KR102880002B1 (ko) 단일 염기 다형성 분석을 위한 미세입자 프로브