JP2003514383A

JP2003514383A - 磁性ガラス粒子、それらの製造方法、及びそれらの使用

Info

Publication number: JP2003514383A
Application number: JP2001537749A
Authority: JP
Inventors: バインデル，クルト; リードリンク，ミヒャエル; ガイガー，アルベルト
Original assignee: ロシュダイアグノスティクスゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1999-11-17
Filing date: 2000-11-17
Publication date: 2003-04-15
Also published as: PL356771A1; US20120247150A1; HUP0203386A1; US20050266462A1; EP1232502A1; US8129118B2; HUP0203386A3; CA2392009C; CZ20021608A3; PL202358B1; ES2256068T3; DK1232502T3; WO2001037291A1; JP4361905B2; JP2006193421A; US20030224366A1; SK287932B6; DE60025529D1; PT1232502E; CY1105229T1

Abstract

(57)【要約】本願発明は、ガラス表面をもつナノ・サイズの磁性粒子に関する。本願発明は、それらの作製方法、並びにそれらの懸濁液、及び特に自動化処理によるＤＮＡ又はＲＮＡの精製のためのそれらの使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本願発明は、ガラス表面を有し、そして基本的に球状の磁性粒子に関する。本
願発明は、それら及びそれらの懸濁液の作り方、そして特に自動化工程による生
物物質の精製のためのそれらの使用にも関する。

【０００２】多くの生物物質、特に核酸は、自然環境からのそれらの単離の点から見て特有
の難題を示す。一方で、それらは非常に低濃度で存在し、そしてもう一方で、そ
れらはそれらの単離又は、特に生物特異的なアッセイにおける計測を難かしくす
る多くの他の固体及び溶解物の存在中にしばしば見出される。

【０００３】生物特異的な結合アッセイは、特有の分析物、例えば核酸又は特有の分析物で
あるポリペプチドの検出を可能にし、そして診断及び生物分析の分野で重要な役
割をもつ。

【０００４】ハイブリダイゼーション・アッセイは、核酸分析物、例えばＲＮＡ及びＤＮＡ
の分子検出のために特異的な塩基対形成を利用する。したがって、１８〜２０ヌ
クレオチドの長さをもつオリゴヌクレオチド・プローブは、ヒト・ゲノム内の選
択した配列の特異的な認識を可能にしうる。このオリゴヌクレオチド・プライマ
ーの選択的な結合を利用する他のアッセイはＵＳ４，６８３，１９５に記載の
ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）である。この方法は、数サイクルのうちにデ
オキシヌクレオチド三リン酸の存在下、熱安定性ポリメラーゼにより特定の核酸
領域を検出可能なレベルまで選択的増幅する。

【０００５】核酸は、それらがプローブに基づくアッセイに使用される前に混成混合物から
通常は抽出されるべき、比較的複雑な分析物である。

【０００６】核酸の抽出にはいくつかの方法がある： −配列依存的又は生物特異的な方法として、例えば：・アフィニティー・クロマトグラフィー・ビーズ上に固定したプローブへのハイブリダイゼーション −配列非依存的又は物理学的−化学的方法として、例えば：・例えばフェノール−クロロホルムによる液体−液体抽出・例えば純エタノールによる沈殿・ろ紙による抽出・臭化セチル−トリメチル−アンモニウムといったミセル形成剤による抽出・固定化インターカレート色素、例えばアクリジン誘導体への結合・シリカ・ゲルすなわち珪藻土への吸着・カオトロピック条件下での磁性ガラス粒子（ＭＧＰ）すなわち有機シラン粒子への吸着近年、それらのガラス表面に結合する性質の利用により、それらの自然環境か
らの核酸の分離のための多くの手段及び材料が提案されている。例えば、Proc.
Natl. Acad. USA 76, 615-691 (1979)においてフリントすりガラスによりヨウ化
ナトリウムの存在するアガロース・ゲル内でフリントすりガラスに核酸を結合す
る手順が提案されている。

【０００７】過塩素酸ナトリウムの存在するガラス皿上の細菌からのプラスミドＤＮＡの精
製は、Anal. Biochem. 121, 382-387 (1982)に記載されている。

【０００８】ＤＥ−Ａ３７３４４４２において、酢酸を用いたファージ粒子の沈殿に
よりグラス・ファイバー・フィルター上の１本鎖Ｍ１３ファージＤＮＡの分離及
び過塩素酸によるファージ粒子の溶解が記載されている。グラス・ファイバー・
フィルターに結合した核酸は、洗浄され、そしてその後メタノール含有トリス／
ＥＤＴＡ緩衝液により溶出される。

【０００９】ラムダ・ファージからのＤＮＡ精製のための類似の方法が、Anal. Biochem. 1
75, 196-201 (1988)に記載されている。

【００１０】前記方法は、カオトロピック塩溶液中において核酸のガラス表面への選択的な
結合、そして夾雑物、例えばアガロース、タンパク質又は細胞残渣からの分離を
伴う。夾雑物からガラス粒子を分離するために、前記粒子が遠心分離されるか又
は液体はグラス・ファイバー・フィルターを通されるかのいずれかでありうる。
しかしながら、これは多量のサンプルの処理に前記方法を使用させない制限的な
ステップである。

【００１１】ガラス表面に覆われた磁性粒子は生物材料の単離に相当な利点を提供すること
が、証明される。磁性粒子が磁場と接触しない場合、重力がそれらを沈殿させる
唯一の力である。それらは溶液を振ることにより再懸濁されうる。磁場を利用し
ない沈殿手順はその粒子表面での生物材料の固定よりもゆっくりと進む。これは
特に核酸に当てはまる。磁性粒子は、磁石を使ってサンプル液中の特定の位置に
容易に集められうる。前記の液体はその後粒子から、つまり固定された生物物質
から分離される。

【００１２】塩及びエタノールの添加による析出の後、核酸を固定するための磁性粒子の使
用は、Anal. Biochem. 201, 166-169 (1992)及びＰＣＴＧＢ９１／００２１２
に記載される。この手順において、核酸は前記磁性粒子に吸着される。前記吸着
物は磁場を利用し、そして洗浄ステップを行なうことによりもとの溶媒から分離
される。１回の洗浄ステップの後、核酸はトリス緩衝液中に溶解される。しかし
ながら、この方法は前記析出が核酸について選択的でないという不利な点をもつ
。それどころか、さまざまな固体及び不溶性物質が同様に吸着される。その結果
、この手順に存在するかもしれない特異的な酵素反応の有意な量の全ての阻害物
質の除去に使用できない。

【００１３】磁性の多孔質ガラスは、多孔質の特定のガラス基質中に磁性粒子を含み、そし
てストレプトアビジンを含む層に覆われている市販品も使用できる。ビオチンに
共有結合的に結合するように生物学的物質が複合体調製ステップにおいて修飾さ
れるならば、この製品は生物学的物質、例えばタンパク質又は核酸の分離のため
に利用されうる。磁化できる特定の吸着剤が、自動サンプル調製において能率的
であり、そして好適であることを示した。超常磁性色素、並びにフェリ磁性及び
強磁性色素が、この目的のために使用されうる。

【００１４】当業者によれば粒子は、小さな直径を有する固体物質である。このような粒子
はしばしば色素とも呼ばれる。

【００１５】それらの物質は磁石、すなわち例えば強磁性又は超常磁性物質に引きつけられ
る磁性体ともしばしば呼ばれる。超常磁性は、当技術分野において有利な、そし
て好ましいものと理解される（例えばＵＳ５，９２８，９５８；ＵＳ５，９
２５，５７３；ＥＰ７５７１０６）。ガラス又は有機シラン表面は、生物特
異的捕捉反応に利用するためにしばしば機能的なものにされる、例えばＵＳ５
，９２８，９５８、ＵＳ５，８９８，０７１、ＵＳ５，９２５，５７３、Ｅ
Ｐ９３７４９７、ＵＳ４，５５４，０８８、又はＵＳ４，９１０，１４
８。あるいは、ガラス、又は有機シラン表面は、それらの親水性、及び／又は陽
電性を変更するためにさまざまな溶媒又は塩により処理されうる、例えばＵＳ
５，４３８，１２７。しかしながら、ガラス、又はシラン表面の非誘導体化シラ
ノール基が、ＤＥ１９５２０９６４、ＤＥ１９５３７９８５、ＷＯ
９６／４１８４０、ＷＯ９６／４１８１１、ＥＰ７５７１０６、又はＵＳ
５，５２０，８９９に記載の好適な反応条件下で純粋な物理的−化学的力による
吸着のために使用されうる。典型的には、磁性核又は磁性核集合体は、酸又は塩
基触媒ゾル−ゲル法により形成されるガラス表面により覆われる。これらはコア
−シェル粒子と呼ばれる。そのガラス殻が色素のサイズ及び形状の点で特有な層
の薄さを有するとき（例えばＤＥ１９５２０９６４を参照のこと）、ガラ
ス殻は、例えば磁性酸化金属に加えて作製された粒子のサイズ及び形状を確認す
る雲母のような非磁性補助物を含みうる（例えばＤＥ１９５３７９８５及
び関連のＷＯ９６／４１８１１を参照のこと）。高い界面活性を得るために、高
い多孔度を有するガラス材料が使用される（例えばＥＰ７５７１０６；ＷＯ
９９／２６６０５を参照のこと）。さらに、複合磁性粒子が記載されている、例
えばシリカ粒子からの無機シリカ基質（ＥＰ７５７１０６）又はガラスとシ
リカ・ゲルの混合物（ＷＯ９５／０６６５２）により覆ったシリカ被覆酸化鉄。

【００１６】本発明により解決される問題は、サンプル調製のための、そして生物学的アッ
セイのための、特に自動化された方法のための改良された特性を有する磁性ガラ
ス粒子として知られうる。

【００１７】本技術分野における磁性ガラス粒子の欠陥は、本発明の発見により克服される
。

【００１８】磁性ガラス粒子組成物を提供することが本発明の１つの目的である。本発明に
よる磁性ガラス粒子（ＭＧＰｓ）は、ガラス中への小さな磁性核の固体分散系で
ある。ＭＧＰｓは比較的小さく、そして基本的に球状である。ＭＧＰｓ組成物の
非磁性細粒の含有量は、それらの調製方法のために非常に少ない。これは、ＭＧ
Ｐｓの懸濁液をゆっくりと沈殿させる効果をもち、そしてそれにより自動化され
うる分子生物学における方法のために有利に使用されうる。本発明の１の態様に
おいて、本発明によるＭＧＰｓの組成物及び懸濁液を提供する。本発明の他の態
様において、ＭＧＰｓの組成物のための方法を提供する。本発明のさらなる他の
態様において、本発明によるＭＧＰｓを使用するＤＮＡ又はＲＮＡの精製方法を
提供する。

【００１９】基本的に球状であり、そして小さな直径をもち、さらに少なくとも１の、直径
５〜５００nmの磁性体を含むところの磁性ガラス粒子組成物を提供することは本
発明の目的の１つである。これは半減時間値ｔ_1/2 により定量化される沈殿動力
学における驚くべき結果を有する（実施例６を参照のこと）。前記半減時間値は
、特定の容量の成分から５０％の粒子が沈殿するまでの時間の長さである。イソ
プロパノール中での前記組成物の３mg／ml重量毎容量の懸濁液の沈殿に関する半
減期は、３分、好ましくは４分、より好ましくは６分より長い。しかし、最も好
ましい半減期の値は、１０分より長いか又は２０分より長い。より小さく、そし
て理想的な球により近いことで、より長くＭＧＰｓが懸濁されるであろう。これ
は、理想的な球に似ている形態に近づけることで、２以上の粒子が互いに凝集し
、そして沈殿をより早める凝集を構築する可能性をより低くする事実により明ら
かにされる。これらのデータを実施例６に示しそして高解像走査型電子顕微鏡像
を図４〜図１０において見ることができる。これは、シリンジに引き込まれる必
要以上の量からの一定のＭＧＰ懸濁液容量の反復的な投与がより容易（質量_MGP
／容量に関してより正確なデリバリー）にしながら、そのＭＧＰ懸濁液を含む保
存容器の厳しくそして頻繁な混合を減らすことが求められる自動化方法のための
利点を有する。

【００２０】本発明によるＭＧＰｓは、非常に小さな非凝集磁性体を散在させたガラス滴で
ある。磁性体と呼ばれるそれらのものは、磁石に引きつけられる、すなわち、例
えば強磁性体又は超常磁性体である。特にそれらがまだ前磁化されていない場合
、好ましくは、強磁性材である。本明細書中における前磁化（Premagnetization
）は、残留磁気を増加させる、磁石との接触を意味すると理解される。好ましい
磁性材は、例えば磁鉄鉱（Ｆｅ₃ Ｏ₄ ）又はＦｅ₂ Ｏ₃ 、好ましくはγ−Ｆｅ₂
Ｏ₃ のような鉄又は酸化鉄である。原則として、バリウム・フェライト、ニッケ
ル、コバルト、Ａｌ−Ｎｉ−Ｆｅ−Ｃｏ合金又は他のフェリ若しくは強磁性体を
利用しうるであろう。前記磁性体は、例えば磁性色素でありうる。磁性体のサイ
ズはナノスケールの範囲にある、すなわち本発明により、その直径は５〜５００
nm、好ましくは１０〜２００nm、最も好ましくは１５〜５０nmである。好適な磁
性色素はＣＥＲＡＣ社により製造され、それは２３nmの平均直径をもち、そして
γ−Ｆｅ₂ Ｏ₃ から成る。（ＢＥＴ−表面５０ｍ² ／ｇ、ＣＥＲＡＣ：P.O. Box
1178, Milwaukee, Wisconsin 53201-1178 USA; 商品番号Ｉ−２０１２）。本発
明による磁性ガラス粒子は、そのＭＧＰｓが高解像走査型電子顕微鏡により測定
されるよう０．５μｍ〜５μｍ、好ましくは１μｍ〜２μｍの粒子直径をもち、
これに対してその磁性体が上述のように５〜５００nm、好ましくは１０〜２００
nm、最も好ましくは１５〜５０nmの直径をもつ事実によりさらに特徴づけられる
。したがって、本発明のＭＧＰｓは、高解像走査型電子顕微鏡により測定される
磁性色素核に対する磁性ガラス粒子の１対１０より小さな直径比により特徴づけ
られる。これらの直径比並びに粒子のサイズ及び形状を決定するであろうあらゆ
る挿入担体の存在により、そのＭＧＰｓの外形及び取り込まれる磁性体の数が製
造条件により決定される。本発明によるＭＧＰｓは、微細多孔質であるが、しか
し高次な構造がありそのために６ｍ² ／ｇ超の比較的大きな表面を有する。好ま
しくは、本発明による磁性ガラス粒子は５〜１００ｍ² ／ｇの、好ましくは５〜
９０ｍ² ／ｇの、より好ましくは１０〜５０ｍ² ／ｇの範囲の、最も好ましくは
１５〜３０ｍ² ／ｇの範囲の表面積を有する。この表面は、ＤＥ１９５３７
９８５に記載される粒子のサイズの約２倍である。これはオートメーション化
された市販の装置を用いたBraunauer-Emett-Teller法により決定されうる（実施
例４を参照のこと）。普通はＢＥＴ法と呼ばれる、この方法についての解説は、
S. Braunauer. The Adsorption of Gases and Vapors, Vol. 1, Princeton Univ
ersity Press, 1943を参照のこと。例えば、優先的に着目のサンプルＥＪ００９
６．５Ｒ−０１（製造条件の概要については実施例１、及び表１〜表３を参照の
こと）は、２６．８５２５ｍ² ／ｇのＢＥＴ−表面、２．３０５８ｍ² ／ｇの微
細多孔面積、及び２４．９１３２nmの平均細孔直径をもつ。これは細孔表面は全
表面の１０％未満であり、そして磁性ガラス粒子が微細多孔質であることを意味
する。

【００２１】細孔（ｐｏｒｅ）は、粒子の外側の表面の凹部であると理解される。その表面
は、表面上の凹部の中に引かれた垂直の線が粒子の隣接環境の方向に少なくとも
１度粒子を切断するところの粒子の中まで及ぶ。加えて、細孔は粒子内の、その
細孔の１の半径より大きな深さにまで及ぶ。ドイツ特許出願第ＤＥ１９８５
４９７３．３号又は同第ＤＥ１９８５５２５９．９号と比較した際に、
より遅い沈殿動力学、より広い表面、及び凝集を抑える球状の形態は、核酸診断
における吸着剤としてのより良好な機能的な性能の形でそれら自身が明らかにす
る（実施例３，５、及び７を参照のこと）。この特徴は、いわゆるＴａｑＭａｎ
（商標）アッセイにおけるしきいサイクル、シグナル対ノイズ比、及び静的に確
証されたより低い検出限界の変化により定量化されうる。このアッセイ方法は、
ＷＯ９２／０２６３８、及び関連の米国特許第ＵＳ５，２１０，０１５号、同
第ＵＳ５，８０４，３７５号、同第ＵＳ５，４８７，９７２号に記載される
。放射性トレーシング実験（実施例５．２を参照のこと）は、本技術分野で知ら
れる基準物質と比較した場合、ＤＮＡ及びＲＮＡについての結合性質が同じであ
ることを示した。驚いたことに、製造条件は、放射性トレーシング実験における
性質に影響する。本発明のＭＧＰタイプのさらなる利点は、乾燥工程の間亀裂、
及び内部構造（ガラス滴内の小さな磁性核の固体分散系）によるガラス殻に関連
する損傷をもたらしうるガラス層の緊張がないことである。これは、画像作製（
image-producing)法により調べられる（実施例３を参照のこと）。

【００２２】本発明の他の態様は、磁性粒子の懸濁液である。ＭＧＰｓの組成物に液体を加
え、そしてその懸濁液を混ぜて均質にすることで懸濁液を作製することは当業者
にとって自明である。本発明による液体は、磁性粒子の安定性に影響しない、そ
して均質な懸濁液の作製のために利用されうるところのあらゆる液体を含みうる
。

【００２３】好ましくは分子生物学における工程、特にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリ
ボ核酸（ＲＮＡ）の精製工程であって、特定の条件下、それらの物質のガラス粒
子への結合を利用する上記工程に好適である液体が使用される。好ましい液体は
、アルコール又はそれらと水とのあらゆる混合物あるいはケトンを含む。アルコ
ールは、本発明により好ましくはＲがｎ＞＝Ｏである一般式−（−ＣＨ₂ ）_n −
ＣＨ₃ を意味する一般式Ｒ−ＯＨの一級、二級又は三級アルコールを含むであろ
う。しかしながら、他のアルコールもそれらが、例えばグリセロールのように分
子生物学用途に好適であれば使用されうる。特に好適には、前記アルコール、す
なわちイソプロパノール、エタノール又はそれらと水の混合物、好ましくは８０
容のイソプロパノールと２０容の水の混合物である。本発明の態様において、前
記液体には、例えばアセトンといったケトンが含まれる。本発明の好ましい態様
においてそれらの懸濁液は、５〜６０mg／mlのＭＧＰｓを含む。本発明の他の態
様において、ＭＧＰｓは、場合により２〜８ mol／ｌ、そして好ましくは４〜６
mol／ｌの濃度においてカオトロピック物質を含みうる水性緩衝溶液中に懸濁さ
れる。カオトロピック塩は、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、チオシア
ン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム又は塩酸グアニジニウム
である。他の化合物であることもできる。本発明によるカオトロピック物質は、
液状の水の構造を乱し、そしてＤＮＡ又はＲＮＡを含む溶液中にこの作用物質が
存在した場合、ＤＮＡ又はＲＮＡが本発明によるＭＧＰｓに結合することに対し
て効果を有するあらゆる化学物質である。好適な水性緩衝溶液を作り出すことは
、当業者にとって自明のことである。分子生物学の目的において、好適な緩衝液
系は、例えばSambrook et al. (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbo
r University Press, New York, NY, USA 中に見出されうる。好ましい緩衝物質
は、トリス−ヒドロキシメチルアミン（ＴＲＩＳ）、リン酸、Ｎ−（２−ヒドロ
キシエチル）ピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、そ
れらの塩又は他の好適な物質である。加えて、例えばＮａＣｌ，ＫＣｌ又はＣａ
Ｃｌのような溶液のイオン強度を変える物質又は、例えばエチレン−ジアミン−
四酢酸（ＥＤＴＡ）若しくはそれらの塩のような金属陽イオン錯化剤である物質
が提供されうる。当業者に知られる生物学的物質もまた提供されうる。本発明の
他の態様において、前記ＭＧＰｓ懸濁液は、ＤＮＡ又はＲＮＡを場合によりタン
パク質、脂肪酸、炭水化物、及び生物起源の他の材料との混合物の形でさらに含
みうる。本発明の他の態様において、前記液体は、アルコール、ケトン、水性緩
衝溶液、カオトロピック物質、溶液のイオン強度を変更する物質、錯化剤、生物
材料、前記の特徴を有する全てのＤＮＡ又はＲＮＡの混合物を含みうる。

【００２４】本発明の他の態様において、本発明による懸濁液を含む試験管又は反応容器を
提供する。前記の管はプラスチックで作られうるが、しかし大きな構造物の一部
、例えば９６又は３８４ウェル型のマイクロタイタープレートの一部でもありう
る。本発明のさらなる他の態様において、磁性ガラス粒子の組成物又はその懸濁
液を含む保存容器を提供する。

【００２５】本発明の他の態様において、本発明による磁性ガラス粒子又はその懸濁液を含
む保存容器を含むキットの部品を提供する。前記キットは、ＤＮＡ又はＲＮＡの
精製のために使用されうる。本技術分野で知られる前述のキットは、例えば９６
又は３８４ウェル型のマイクロタイタープレートといった精製手順の間に使用さ
れるプラスチック製品又は、例えばEppendorf, Hamburg, Germany により製造さ
れたまさに普通の反応管をさらに含む。前記キットは、ＤＮＡ又はＲＮＡをそこ
に結合するときの磁性ガラス粒子の洗浄ステップに好適な洗浄溶液をさらに含み
うる。多くの場合、前記洗浄溶液は、使用前に希釈しなくてはならない保存溶液
として提供される。前記キットは、溶出液、すなわち磁性ガラス粒子に結合した
ＤＮＡ又はＲＮＡを溶出するための溶液又は緩衝液（例えばＴＥ：１０mMトリス
、１mM ＥＤＴＡ、pH８．０）あるいは純水をさらに含みうる。さらに、核酸、
すなわちＤＮＡ又はＲＮＡの精製方法に使用されうる補足的な試薬を提供しうる
。本発明の１の態様において、本発明によるキットの部品は、核酸の精製に使用
されうる。

【００２６】本発明の１の態様において、ＭＧＰｓ組成物は、すでに記載した懸濁液の作製
に使用されうる。

【００２７】本発明の他の態様において、本発明による懸濁液は、それらを含む、他の生物
物質をともなう混成混合物からの核酸、すなわちＲＮＡ又はＤＮＡの精製に使用
されうる。それにより、着目の核酸を少量でしか含まない混合であっても、異な
る核酸の混合物を精製しうる。精製効果は、特定の条件のもとでの、例えば特定
の濃度のカオトロピック物質の存在下での磁性ガラス粒子に結合するＤＮＡ又は
ＲＮＡの性質に起因する。好ましくは、結合ＤＮＡ又はＲＮＡをともなうＭＧＰ
ｓは、好ましくは７０容のエタノールと３０容の水の割合の混合物（「７０％エ
タノール」）によりその後少なくとも１回洗浄される。その後、条件を逆方向に
変え、例えばカオトロピック物質の濃度を下げて、ＭＧＰ粒子に結合したＤＮＡ
又はＲＮＡを溶出する。好ましくは、これは例えば重力又は磁石の使用による磁
性ガラス粒子の小粒化、そしてごく少量のカオトロピック物質を含むか又はそれ
を全く含まない溶液内への再懸濁により行われる。あるいは、前記溶液は、ごく
少量のカオトロピック物質か又それを全くともなわない溶液により希釈されうる
。精製されたＤＮＡ又はＲＮＡは、すぐに他の反応のために使用されうる。

【００２８】本発明によるＭＧＰｓの製造方法を提供することは本発明の１つの目的である
。本発明によるガラスはケイ素を含む非結晶材料であることは理解される。ガラ
スは他の物質、例えばＢ₂ Ｏ₃ （０〜３０％）、Ａｌ₂ Ｏ₃ （０〜２０％）、Ｃ
ａＯ（０〜２０％）、ＢａＯ（０〜１０％）、Ｋ₂ Ｏ（０〜２０％）、Ｎａ₂ Ｏ
（０〜２０％）、ＭｇＯ（０〜１８％）、Ｐｂ₂ Ｏ₃ （０〜１５％）を含みうる
。ガラスは、低いパーセンテージ（０〜５％）の多数の他の酸化物、例えばＭｎ ₂ Ｏ₃ ，ＴｉＯ₂ ，Ａｓ₂ Ｏ₃ ，Ｆｅ₂ Ｏ₃ ，ＣｕＯ，ＣｏＯ等を含むこともで
きる。

【００２９】本発明による特に好ましいものは、ＷＯ９６／４１８１１に記載のゲル−ゾル
法を用いて形成され、そしてその後乾燥、及び圧縮されるガラスである。この方
法の基本原理は既知であり、そして例えばC.J. Brinker, G.W. Scherer“Sol Ge
l Science-The Physics and Chemistry of Sol Gel Processing”, Academic Pr
ess Inc. 1990, Sol-Gel Optics, Processing and Applications, Lisa C. Klei
n, Ed., Kluwer Academic Publishers 1994, p.450以降、そしてＤＥ−Ａ−１９
４１１９１，ＤＥ−Ａ−３７１９３３９，ＤＥ−Ａ−４１１７０４１，ＤＥ−Ａ
−４２１７４３２、及びＷＯ９６／４１８１１に記載された。ゲル−ゾル法にお
いて、主に、ネットワーク形成成分であるアルコキシド、例えばＳｉＯ₂ ，Ｂ₂
Ｏ₃ ，Ａｌ₂ Ｏ₃ ，ＴｉＯ₂ ，ＺｒＯ₂ ，ＧｅＯ₂ は、例えばアルコール溶液中
の他の成分の酸化物及び塩と結び付いて、そしてその後加水分解される。以下の
方程式は、ホウ酸アルミニウムケイ酸ナトリウムガラス（sodium boroaluminium
silicate glass）の作成手順を記載する：

【００３０】

【化１】

【００３１】水を加え開始成分の加水分解処理を開始させる。アルカリ・イオンがケイ酸エス
テルの加水分解速度に触媒効果を有するため、この反応工程は比較的速い。いっ
たんガラスを形成したら、それを熱処理により乾燥及び密度を上げて（又は圧縮
して）ガラスを形成しうる。

【００３２】本発明の１の態様において、ガラス基質は、図１及び図２に図式的に示され、
そして実施例１に詳細に記載されるとおり酸又は塩基触媒ゾル−ゲル合成により
作製される。ここで、使用するものは、最初は固体要素を液相中に分散し（＝ゾ
ル）、そして処理の後にそれらをハニカム模様（honeycomb pattern)のように連
結する（＝ｇｅｌ）ところのコロイド性の系で作られる。析出物の量から計算し
たガラス（コードＥＪ）の組成は、７０．６７ Mol％ＳｉＯ₂ 、１４．３３ M
ol％Ｂ₂ Ｏ₃ 、５．００ Mol％Ａｌ₂ Ｏ₃ 、４．００ Mol％Ｋ₂ Ｏ、２．
００ Mol％ＣａＯ、４．００ Mol％ＺｎＯであった。ガラス（コードＲＮ）
の組成は、７４ Mol％ＳｉＯ₂ 、１５ Mol％Ｂ₂ Ｏ₃ 、５．００ Mol％Ａ
ｌ₂ Ｏ₃ 、４．００ Mol％Ｋ₂ Ｏ、２．００ Mol％ＣａＯであった。ガラス
（コードＥＰ）の組成は、７３．６１ Mol％ＳｉＯ₂ 、１４．９３ Mol％Ｂ ₂ Ｏ₃ 、５．２１ Mol％Ａｌ₂ Ｏ₃ 、４．１７ Mol％Ｋ₂ Ｏ、２．０８ Mol
％ＣａＯであった。

【００３３】前記の反応は以下のとおり：酸触媒、例えば：

【００３４】

【化２】

【００３５】又はアルカリ触媒、例えば：

【００３６】

【化３】

【００３７】のいずれかで表現される。三次元ネットワークを形成する対応の酸化物に対する
異った水酸化縮合物、すなわち格子間部位を占める金属イオンを有するＳｉＯ₂
／Ｂ₂ Ｏ₃ ／Ａｌ₂ Ｏ₃ の非結晶性ガラス基質である。先に解説したアルカリ性
及びアルカリ土類金属イオンに加え、例えばＺｎ²⁺及びＺｒ²⁺といった遷移金属
イオンがネットワーク変更物質として基質内に取込まれうる。

【００３８】

【化４】

【００３９】本発明の他の態様において、前記ガラスは、本技術分野で知られる原料ＳｉＯ ₂ 、及びアルカリ又はアルカリ土類金属の炭酸塩、Ｎａ₂ ＣＯ₃ ，Ｋ₂ ＣＯ₃ 又
はＣａＣＯ₃ の融解による方法で作製されうる。その方法は以下のとおり：

【００４０】

【化５】

【００４１】と表現されうる。しかしながらほとんどの場合において、純粋なケイ酸基でなく
、ホウ酸−アルミン酸−ケイ酸−基質である、すなわちネットワーク構築要素の
一部のＳｉＯ₂ は、Ｂ₂ Ｏ₃ 及びＡｌ₂ Ｏ₃ により置き換えられていると考える
。

【００４２】ゾル：色素の比は、本願発明により提供される磁性粒子の産出量に多大な影響
をもつ。前記ゾルが、当業者の技術により今までとおりポンプで吸い上げ、そし
て吹きつけられうることがこの方法にとって不可欠である。

【００４３】粉末を作り出すために、前記スラリーを好ましくは、図１及び実施例１．３に
記載のとおり二流体ノズル（two-fluid nozzle）を通して吹きつける。好適なス
プレードライ装置は、Nubilosa Molekularzerstaeubung, Ladisch GmbH & Co. K
G, Konstanz, Germany、例えば「Labor-Zerstaeubungstrockner (Type LTK) 」
によるか又はBuechi AG, Uster, Switzerland、例えば「Mini Spray Dryer (Typ
e B-191)」により製造される。

【００４４】磁性核対ガラス殻の直径比が１対１０未満、好ましくは１：１０〜１：１００
０であるため、その動力学、又は取込まれる磁性核若しくはそれらの非活性担体
の数は、粒子の形状及びサイズではなく製造条件、特にスプレードライの間の条
件が決定する。言い換えれば、サイズ分布、ガラス滴の形状を決定し、そしてそ
れによりＭＧＰｓを変更するであろうところの、スプレードライ手順の間の圧力
、噴射口温度、出口温度、及び流速の選択は、自由である。

【００４５】スプレー圧を上げる場合、そのサイズ分布は、低いμ−範囲に移動するであろ
う。スプレードライ工程の温度低下は、溶媒のよりゆっくりとした蒸発をもたら
し、そしてそれによりＭＧＰｓの形態は理想の形状により近づくであろう、すな
わちｘｙ及びｘｚ平面における半径の比は約１になるであろう。前記半径の比は
、０．８〜１．２、好ましくは０．９〜１．１の間で変化するであろう。

【００４６】本発明の好ましい態様においては、ノズルは加熱される。噴射口温度は１２０
℃〜５００℃、好ましくは１７０℃〜２３０℃又は１５０℃〜２３０℃、最も好
ましくは１５０℃〜２００℃又は１９０℃〜２１０℃又は２００℃若しくはわず
かに低いかである。出口温度はゾル及び溶媒の沸点に依存し、そして溶媒の沸点
より高いか、同じか、又はわずかに、すなわち１０℃未満下回るかでありうる。
エタノールを溶媒として使用する場合、それは５０℃〜３００℃、好ましくは７
０℃〜１５０℃、最も好ましくは８０℃〜１１０℃である。その最適温度は９０
℃〜１００℃である。ノズル圧は３bar より高く、好ましくはそれは４〜６bar
に調節される。当業者は、厳密なパラメーターが使用されるスプレードライ装置
に依存するであろうことを理解する。しかしながら、当業者は、本発明の教示を
あらゆる他のスプレードライに移し、そして本願発明の開示を考慮することによ
りパラメーターを見つけ出しうる。Master : Spray Drying Handbook, Fifth Ed
ition, John Wiley & Sons, 1991, New Yorkに記載の方策は、他の設定のために
選ぶべきパラメーターを見つけ出す方法に当業者を導きうる。好ましくは、当業
者は彼らのスプレードライ装置のマニュアルを調べるか又はそのスプレードライ
装置製造業者の技術サービスに連絡する。

【００４７】産生量を最適化するために、高密化又は焼結温度をできるだけ高くすべきであ
る、すなわち融解限界をわずかに下回る。しかしながら、それが高すぎる場合、
互いにくっついて、そしてふるい分けされなくてはならない凝集塊を形成するで
あろう。低すぎた場合、ＭＧＰｓは最適な高密化がなされないであろう。非常に
高温での粒子のさらなる処理は、磁性特性の損失をもたらす。非常な高温は、そ
れゆえ控えられるべきである。厳密な温度はガラスの組成に依存するが、４００
℃〜１２００℃である。ＥＪガラス組成の場合、焼結温度は７２０℃〜７７０℃
、好ましくは約７５０℃である。本発明の教示を考慮する際に各ガラス組成につ
いて前記温度を見つけ出すことは当業者の技術の範疇である。本発明により、ス
プレードライＭＧＰ粉末は、図２に表わされた、そして実施例１．４に記載され
たとおりさらに処理されうる。好ましくは、前記粉末を、２００℃で１時間加熱
し、場合により室温まで冷やされ、そして窒素雰囲気中、１Ｋ／分の加熱速度に
より７５０℃（高密化又は焼結温度）まで加熱され、そしてその温度で１時間保
持される。その後、炉を１５０℃まで冷まし、そして大気中、再度２００℃で１
時間加熱する。室温まで冷ました後、その粉末をふるい（５０μｍ）に移し、そ
して３０分間ふるいにかける。ふるいがけしたサンプルを瓶に詰め、２００℃で
４時間滅菌し、次に８０℃まで冷ます。その後そのガラス容器をオーブンから取
り出し、滅菌したホイルで覆い、そして蓋をする。

【００４８】驚いたことに、本発明による磁性粒子は、サンプルからの生物材料の単離のた
めに特に適している。さらに、核材料は天然資源であるためほとんど環境問題を
引き起こさない。その上、本発明による粒子は、安価で、そして製造が容易であ
る。

【００４９】本発明の他の目的は、生物物質をその粒子表面に結合する条件下、液体中に生
物物質を含むサンプルを本発明による磁性粒子と接触させることにより生物物質
を単離し、そしてその生物物質をその液体から分離する手順である。本発明によ
り前記用語「液体中」は磁性粒子を加える前に加えられうる液体を意味する。し
かしながら、それは、サンプル自体の粘性が低い、及びサンプル自体が液体の場
合にその結果として磁性ガラス粒子を加える前に固形物質の添加により行われう
るサンプル調製のためにサンプルにさらなる液体又は緩衝液が加えられてはなら
ない状況をも含まれるべきである。試薬添加の指示は、方法の要件により変化し
うる。

【００５０】生物物質は、特有の又は分子的な基準をもつ物質を意味することが理解される
。それらは、特に細胞、例えばウイルス又は細菌、並びに多細胞生物から分離さ
れた細胞、例えばヒト及び動物細胞、例えば白血球、そして免疫学的活性低分子
、及び高分子である。核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡは特に好ましい。本発明の
１の態様において、標的核酸が濃度の点で微量成分である（又は少量でしか存在
しない）特有の核酸の混合物を精製する。本発明により、標的核酸は着目の核酸
、すなわちその存在がヒト又は動物の特定の症状又は疾患を示すものとして調べ
られるべき核酸であるべきである。例えば、（例えばＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝
炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス由来の）ウイルス配列の存在は、個々の個
体が特定のウイルスに感染していることを示す。その後、このウイルス配列は標
的配列となる。他の標的配列は、例えば遺伝性疾患、例えば鎌状赤血球性貧血と
いった特定の疾患又は特定の型の癌に対する個体の素因を示す配列である。この
例は、本発明について説明的であり、範囲を定めるものではない。

【００５１】本発明によるサンプルは、臨床サンプル、例えば血液、血清、うがい水、尿、
脳髄液、痰、便、生検検体、及び骨髄サンプルを含む。前記サンプルは、環境分
析、食品分析又は、例えば細菌培養、ファージ・ライセート、及び増幅手順、例
えばＰＣＲの産物からの分子生物学研究のために使用されるタイプのものでもあ
りうる。

【００５２】記載した手順は、天然又は修飾された生物学的物質の分離に使用されうる。天
然の生物学的物質は、その構造が天然の生物学的物質と比較して不可逆的に修飾
されることのなかった物質であると理解される。これはどのような方法であって
も修飾することができないサンプルの他の成分を意味するものではない。修飾し
た生物学的物質は、天然に存在しない物質、例えば反応性の、検出が可能な、固
定化の可能なそれらの基に接着することにより修飾される核酸を含む。この１つ
の例は、ビオチン化核酸である。特定の場合において、前記サンプルは前処理な
しに本発明の分離手順に使用されうる。しかしながら、多くの場合においては、
前記サンプルはサンプル中に含まれる生物物質を遊離する適当な方法を用いて溶
解されなくてはならない。

【００５３】サンプルの溶解手順は当業者により知られ、そして事実上、化学的、酵素的又
は物理的でありうる。これらの手順の組合わせも応用できる。例えば、溶解は超
音波、高圧を用いて、剪断力により、アルカリを用いて、溶剤又はカオトロピッ
ク生理的食塩溶液、あるいはプロテアーゼ又はリパーゼを使って行われうる。核
酸を得るための溶解手順に関して、専門の文献、Sambrook et al. : Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Addition, Cold Spring Harbour Laborato
ry Press, Cold Spring Harbour, NY、及びAusubel et al. : Current Protocol
s in Molecular Biology 1987, J, Wiley and Sons, NYを参照のこと。

【００５４】分離されるべき生物物質に加え、サンプルは液体中に他の成分、例えば細胞残
渣、タンパク質、塩、及び分離されない他の物質を含むこともできる。好ましく
は生物物質を天然形で含むこのサンプルを、標的生物物質をその粒子表面に結合
する条件下、粒子と接触させる。このための条件は含まれる生物物質のタイプに
依存するが、基本的には既知である。それらは生物物質をその表面に結合させる
方法にも依存する。免疫学的相互作用が結合に利用される場合、免疫複合体の形
成に好適な条件を選ばなくてはならない。修飾された核酸を使用する場合、結合
は修飾に対応する核酸の基を介して行われうる、例えばビオチンを介したストレ
プトアビジン・コートした表面との結合。しかしながら、核酸について、特にガ
ラスへの核酸の直接の結合が好ましい、なぜなら特に、核酸を修飾しなくてもよ
く、そして天然の核酸さえ結合できるからである。ガラス粒への天然核酸の結合
手順は従来技術に記載の手順に類似しうる。それは２〜８ mol／ｌそして好まし
くは４〜６ mol／ｌの濃度のカオトロピック塩の存在下で好ましくは行われる。
カオトロピック塩はヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸グア
ニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム又は塩酸グアニジニウムでありう
る。他の化合物でも可能である。

【００５５】サンプルを前記粒子と接触させるために、サンプルをその粒子と混合し、そし
て結合が起こるのに十分な期間インキュベートする。当業者は、非磁性粒子によ
り処理を行う手順からインキュベーション・ステップの継続期間に一般に精通し
ている。このステップは、さまざまな時点で表面に固定された生物物質の量を測
定することにより最適化されうる。１０秒間〜３０分間のインキュベーション時
間が核酸にとって適当でありうる。

【００５６】粒子が、インキュベーション期間にそれ自身が流体と分離してしまうか、又は
懸濁液は長時間損われずに維持されるかは、磁性粒子のサイズ及びタイプに依存
する。粒子が小さくそして非磁化である場合、懸濁液は長時間損われずに維持さ
れる。粒子が大きなサイズである場合、粒子はインキュベーション期間の間に流
体と分離してしまう。

【００５７】固定化は、好ましくは固定すべき物質の溶解度を下げることによる析出を介し
て行われない。むしろ、固定化は生物特異的相互作用（捕獲分子）又は吸着に基
づく。これは非特異的に含まれることからの混入物を大いに妨げる。

【００５８】インキュベーションの後、生物学的物質は、液体から分離される。これは、一
般的に磁場を利用することにより磁性粒子に結合した物質を分離することによっ
て実現される。例えば、前記磁性粒子を、インキュベーションが行われた試験管
壁に引き寄せることができる。次にその磁性粒子に結合されなかったサンプル内
容物を含む液体を除去しうる。用いる除去方法は、インキュベーションを行った
試験管の種類に依存する。好適なステップは、ピペッティング又は吸収による前
記液体の除去を含む。

【００５９】必要であれば、次に、前記磁性粒子は、洗浄溶液を用いて１回以上浄化されう
る。生物学的物質を粒子表面から遊離させることなく、できるだけ徹底的に望ま
しくない夾雑物を洗い流す洗浄液を使用する。好ましくはこの洗浄ステップは、
粒子を前記洗浄液とともにインキュベートすることによって行われる。好ましく
は粒子を、例えば振り混ぜ又は最初の磁場と異なる磁場を利用することにより、
このステップの間に再懸濁させる。好ましくは汚染された洗浄液は、まさに生物
学的物質の結合についての前記ステップのサンプルの様に除去される。

【００６０】最後の洗浄ステップの後、前記磁性粒子は減圧により軽く乾燥されうるか又は
流体を蒸発させうる。アセトンを用いる前処理ステップも行われる。必要とされ
る場合、本方法により精製された生物学的物質は、磁性粒子から分離されうる。
このステップは、その生物学的物質を磁性粒子に結合した方法にも依存する。前
記生物学的物質が天然の核酸であり、そして磁性粒子がガラス・コート粒子であ
る場合、その核酸は本発明による粒子から低い塩含有量を有する溶出緩衝液を用
いて除かれうる。この種類の緩衝液は、ＤＥ３７２４４４２及びAnalytical B
iochemistry 175, 196-201 (1988）から知られる。低い塩含有量を有する溶出緩
衝液は、特に０．２ mol／ｌ未満の含有量を有する緩衝液である。特に好ましい
態様において、溶出緩衝液はトリスを含む。特殊な他の態様において、溶出緩衝
液は脱塩した水である。本発明による手順の利点は、流体から生物学的物質を分
離することが非常に容易な点である。従来技術において、夾雑物からガラス粒子
を分離するために遠心分離ステップを用い又はその生物学的物質がガラス繊維フ
ィルターに結合される場合には、流体をフィルターに通した。これは、大量サン
プルの処理を難かしくする制限的なステップである。生物学的物質は、本発明に
よる粒子を用いてより効果的に夾雑物から分離されうる。特に、特定の酵素反応
の阻害剤を本発明により大いに除去しうる。

【００６１】好ましい態様において、本発明の粒子は溶解混合物に加えられる。吸着が起こ
るのに好適な期間の後−これは機械的な撹拌により最適化されうる−その粒子は
、検出されるべきでない余分な細胞成分を含む周囲の流体から分離される。これ
は、好ましくは磁石を容器壁のそばに置くことにより磁場を利用することで行わ
れる。

【００６２】まだ存在しているであろうすべての夾雑物を除去すべく、洗浄が好ましくは測
定されるべき核酸をガラス表面から遊離させない流体により行われる。ガラス表
面から核酸を分離する試薬条件を有する溶出緩衝液を加え核酸をガラス表面から
外す。これらの条件は、特に低塩条件である。意図された核酸のさらなる使用に
依存して、前記液体はここで粒子から分離され、そしてさらに処理されうる。こ
の分離ステップは、好ましくは粒子を溶出液から分けるための磁場の利用を介し
て行われる。

【００６３】本発明の好ましい態様は、例えばＷＯ９９／１６７８１に記載のようなオート
メーション化しうる方法における本発明のＭＧＰｓの使用である。オートメーシ
ョン化しうる方法は、ヒトによる外部からの制御又は力をわずかにともなうか又
は全くともなわずに作動が可能である装置又は機械により実行されるのに好適な
、方法の中のステップを意味する。自動化方法は、方法の中のステップが、ヒト
による外部からの制御又は力をわずかにともなうか又は全くともなわずに作動が
可能である装置又は機械により実行されるのに好適であることを意味する。方法
の準備ステップだけはヒトの手により行われるべきである、例えば保存容器を満
たし、そして備え付けなくてはならず、ヒトによる供されるべきサンプルの選択
であり、そしてさらなるステップは当業者に知られる、例えば制御コンピュータ
ーの操作である。前記装置又は機械は、液体を自動的に加えるか、サンプルを混
ぜるか又は特定の温度でインキュベーション・ステップを実行しうる。典型的に
は、そのような機械又は装置は、１つのステップ又は命令を指定するプログラム
を実行するコンピューターにより制御されたロボットである。好ましい自動化方
法は、高処理量様式で実行される方法であり、これは、方法及び短時間にサンプ
ルの高処理量のために最適化される、利用機械又は装置を意味する。

【００６４】他の態様において、本発明によるＭＧＰｓは、いくつかの反応ステップが手作
業により行われることを意味する半自動化過程に使用される。本発明の好ましい
態様において、本発明によるＭＧＰｓを含む懸濁液は保存容器から取出され、そ
して一部が別の反応容器に加えられる。反応容器は、究極的にはそこで反応を実
行しうる９６又は３８４以上のウェルを含むマイクロタイタープレート形である
、プラスチック製の反応試験管でありうる。しかしながら、これらの容器は他の
素材、例えば鋼鉄から作られうる。

【００６５】本発明の好ましい態様は、検出ステップが引き続く精製方法又は増幅及び検出
ステップが引き続く精製方法である。標的核酸（target nucleic or nucleic ac
id）又は着目の核酸は、非標的核酸の混合物中に含まれうる、さらに上述の特定
の核酸の混合物中の微量成分でさえありうる。好適なＤＮＡ検出方法は、当業者
に知られ、そしてSambrook et al. : Molecular Cloning, A Laboratory Manual
, 2nd Addition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbou
r, NY及びAusubel et al. : Current Protocols in Molecular Biology 1987, J
. Wiley and Sons, NYといった標準的な教本に記載されている。ＤＮＡ検出ステ
ップの前にもありうるさらなる精製ステップは、例えば沈殿ステップとして行わ
れる。前記検出方法は、二重鎖内に挿入され、そしてその吸光度を変化させる臭
化エチジウムのような特定の染料の結合又は挿入を含みうるがそれだけに制限さ
れない。精製されたＤＮＡは、場合により制限的消化の後に電気泳動により分け
られ、そしてその後に可視化される。特異的な配列へのオリゴヌクレオチドのハ
イブリダイゼーションを利用し、そして引き続いて上記ハイブリッドを検出する
、プローブに基づくアッセイもある。当業者に知られているさらなるステップの
後にＤＮＡの配列決定することも可能である。最近の方法は特異プローブがそれ
に結合されるシリコンチップに多様なＤＮＡ配列を適用し、そして相補的な配列
が結合するときにシグナルを発生する。

【００６６】本発明による好ましい方法は、検出可能な量までの標的配列の特異的増幅であ
るところの、リガーゼ連鎖反応、及びポリメラーゼ連鎖反応といった増幅方法で
ある。時に好ましい検出方法は、ＷＯ９２／０２６３８及びそれに対応する米国
特許第ＵＳ５，２１０，０１５号、同第ＵＳ５，８０４，３７５号、同第Ｕ
Ｓ５，４８７，９７２号に記載のＴａｑＭａｎ（商標）法である。この方法は
、シグナルを発生させるためにポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を利用す
る。詳細には、核酸はサンプルと標的核酸の１の領域に対しての相補的な配列を
含むオリゴヌクレオチド及び同じ標的核酸配列の鎖の、しかし上記第１のオリゴ
ヌクレオチドにより定義される核酸配列を含まない第２の領域に対し相補的な配
列を含む標識されたオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション条件の間に
上記第１オリゴヌクレオチドの３′末端が上記標識オリゴヌクレオチドの５′末
端に隣接するような第１オリゴヌクレオチド及び標識オリゴヌクレオチドにアニ
ールした標的核酸を含む二重鎖の混合物を作り出すための接触を含む工程により
検出される。次に５′→３′ヌクレアーゼ活性をもつ鋳型依存性ポリメラーゼに
よりアニールした標識オリゴヌクレオチドを切断するために、上記ポリメラーゼ
の５′→３′ヌクレアーゼ活性をもたせ、そして標識切片が遊離するのに十分な
条件下でこの混合物を処理する；前記標識オリゴヌクレオチドの加水分解により
発生したシグナルを検出及び／又は計測する。ＴａｑＭａｎ（商標）技術は、固
層結合された反応複合体を形成し、そして検出可能にする必要性を取除く。

【００６７】より一般的な言葉で言えば、増幅及び／又は検出反応が複数の標的の同時検出
のための均質溶液相多重アッセイ（homogeneous solution-phase multiplex ass
ay）（実施例７．２を参照のこと）である検出ステップがそれに引き続く生物学
的物質の精製手順を開示する。

【００６８】本発明の他の態様において、記載の精製手順を、以下に記載の方法の１つを用
いた増幅手順、好ましくはブロッキング・オリゴヌクレオチドの使用と組合わせ
る。多くの場合増幅、特に微量の標的核酸の増幅に関係した問題は、低い温度（
４０℃までの室温）での耐熱性ポリメラーゼの活性である。この温度でプライマ
ー・オリゴヌクレオチドはしばしば互いに又はバックグラウンド核酸に非特異的
に結合し、そしてポリメラーゼにより伸長される。これは反応成分の損失及び高
いレベルのバックグラウンド・シグナルを引き起こし、そしてその結果として感
度の低下を引き起こす。これは誤った陽性結果をももたらす。ポリメラーゼの非
特異的活性を避けるために、「ホット・スタート」−ＰＣＲ（Chou et al., 199
2, Nucl. Acid Res 20, 1717-1723)、共有結合性修飾ポリメラーゼ（例えばAmpl
iTaq Gold, Perkin Elmer)又は抗体（Scalice et al., J. Immunol. Methods, 1
72, 147-163, 1994)、及びオリゴヌクレオチド（Dang and Jayasena, JMB 264,
268-278, 1996; US 5,763,173; US 5,693,502)の様ないくつかの方法が示されて
いる。本発明によりブロッキング・オリゴヌクレオチドは、前述の温度までポリ
メラーゼの活性中心を封鎖しうるオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌ
クレオチドは、例えば実施例７．２．２．１．３に記載のアプタマーでありうる
。

【００６９】本発明の他の態様において、アプタマー（例えば実施例７．２．２．１．３を
参照のこと）及び／又は修飾プライマー（例えば実施例７．２．２．１．３を参
照のこと）を単独で増幅反応及びこれに続く検出方法に使用しうる。これは有益
な効果をもち、そしてそれ自体が優れた結果を提供する発明であるとみなされう
る。本発明の好ましい態様において、３′末端核酸塩基、アデニンがｐ−（ｔ−
ブチル）−ベンジル残基により修飾される。３′−１位にそれを含むさらなる修
飾は、ＥＰ８６６０７１Ａ２（本明細書に援用）に記載される。

【００７０】さらに他の態様において、後に検出ステップが引き続く生物学的物質の精製の
ための本発明は、アニーリング温度がポリメラーゼ−アプタマー複合体の分離温
度を８℃未満、好ましくは３℃未満上回る、少なくとも５サイクルのポリメラー
ゼ連鎖反応のために開示される。

【００７１】以下の実施例は、本発明の態様を説明するための助けとなる。

【００７２】１実施例１：磁性ガラス粒子の製造ＳｉＯ₂ 及びアルカリ−又はアルカリ土類炭酸塩（Ｎａ₂ ＣＯ₃ ，Ｋ₂ ＣＯ₃
，ＣａＣＯ₃ ）の様な未加工の原料を一緒に融解した。反応様式は以下のとおりである：

【００７３】

【化６】

【００７４】しかしながら、たいていの場合において、シリケート、ボレート、及びアルミネ
ートの混成基質を使用する、すなわち、適切な基質構成物質であるＳｉＯ₂ はＢ ₂ Ｏ₃ 及びＡｌ₂ Ｏ₃ により部分的に置き換えられている。

【００７５】あるいは、ガラスをゾル−ゲル反応を介して合成しうる。反応様式は以下のとおりである：我々の場合は、酸触媒ゾル−ゲル反応、例えば

【００７６】

【化７】

【００７７】又は塩基触媒、例えば

【００７８】

【化８】

【００７９】のいずれかである。利点：アルコールがスプレードライの間に容易に蒸発する；理想的には表面上へ
の塩の再結晶化がない。したがって、アルコラートを水酸化物に変え、水を排除するために対応の酸化物
を生じる。次にこれらは、例えば以下：

【００８０】

【化９】

【００８１】のように基質結合のセパレーターとして特定の酸化金属成分をその中に包埋する
、ＳｉＯ₂ ／Ｂ₂ Ｏ₃ ／Ａｌ₂ Ｏ₃ から成る３次元の非晶性ガラス基質を形成す
る。本明細書に記載した実験のために、ガラス成分を塩基触媒ゾル−ゲル合成に
より製造した。全ての実験で用いたガラスの組成は（別に示されない限り）以下
のとおりであった：７０．６７ Mol％ＳｉＯ₂ 、１４．３３ Mol％Ｂ₂ Ｏ₃ 、５．００ Mol％
Ａｌ₂ Ｏ₃ 、４．００ Mol％Ｋ₂ Ｏ、２．００ Mol％ＣａＯ、４．００ M
ol％ＺｎＯ（反応によりもたらされる個々の抽出物の質量から計算）１．１調査した磁性色素の説明異なるタイプの磁性色素を調査し、そして表１に概要を示した。

【００８２】１．２コート・ゾル（ＥＪ組成物）の製造抽出物を加熱できる撹拌容器に以下の順序及び量で加える。

【００８３】

【化１０】

【００８４】その後容器を閉じる。ゾルを７０℃まで加熱して、そして一晩中（１５時間）撹
拌する。液中に浸した温度センサーにより温度を調節する。次にゾルを９０℃ま
で加熱し、そしてアルコール／水の混合物（エタノール：３７８１ml、Ｈ₂ Ｏ：
１５１２ml）を５００ml／ｈの速さで加える。前述の混合物の添加の後、容器を
２０℃まで冷ます。蓋を空け、そして１０２４９ｇの磁性色素（ＣＥＲＡＣ）を
強く撹拌しながら加える。調製したゾルをホースによりスプレー・ドライヤーに
移す。

【００８５】１．３スプレードライスプレー・ドライヤーの噴射口を２００℃に調節する。ノズル圧を６bar に調
節し、そしてそのノズルをエタノールにより３分間冷却する。次にホースをガラ
ス容器の出口につなぎ、そして色素含有ゾルを超音波デバイス（２００ｗ）を通
してスプレー・ドライヤーの二流体ノズル（two fluid nozzle）（開口部の直径
：２mm；部品製造業者：Nubilosa, Type 1B1VVS1）へ１１０ｍ／分の速さで押し
出す。スプレー・ドライヤー・装置を図３に図解の形で示す。最初の２分間に形
成された粒子を捨てる。ゾルの完璧なスプレーの後、粒子をともなうサイクロン
（ＡＶＯ、図３を参照のこと）の下の容器を取り出し、そしてその粒子を次のス
テップに記載のとおりさらに処理する。

【００８６】ゾルを含む色素を撹拌容器内で懸濁した粒子の沈殿を妨げるために撹拌する。
そのゾルをポンプ（ＳＰ）を用いて容器からノズルに移す。電熱器（ＥＷＴ）に
より加熱した窒素を乾燥用のガスとして使用する。コート色素を乾燥用チャンバ
ー（Ｔ）からサイクロン（ＺＹ）に移す。乾燥した粉末をサイクロン下の容器（
ＡＶＯ）から取り出す。非常に細かい粒子をフィルター（ＳＦ）により窒素から
除去する。スプレー・ドライヤーを過度の圧力で使用しドライヤー内への空気の
取込みを防ぐ。ガスの流れをガス送風機（ＡＶ）により作り出す。

【００８７】１．４スプレードライ粉末のさらなる処理前記粉末をセラミックのボールに移し、そして１Ｋ／分の加熱速度で２００℃
まで炉の中で加熱する。次に温度を２００℃で１時間保持し、そしてその後オー
ブンを室温まで冷ます。ボールを１時間当り６０ｌの窒素によりリンスされる２
７ｌの容積をもつガス炉（atmosphere furnace）に移す。その炉を１Ｋ／分の加
熱速度で７５０℃まで加熱し、そしてその温度で１時間保持する。次に炉を１５
０℃まで冷まし、そして１時間当たり６０ｌの空気によりリンスする。炉を２Ｋ
／分の加熱速度で２００℃まで加熱し、そしてその温度で１時間保持し、そして
その後室温まで冷ます。粉末をふるい（５０μｍ）に移し、そして３０分間ふる
いにかける。その後、ふるいにかけたサンプルをガラス容器に詰め、１Ｋ／分の
加熱速度で２００℃まで加熱し、その温度で４時間保持し、そして次に８０℃ま
で冷まされるオーブンにより蓋をせずに滅菌する。次にそのガラス容器を炉から
取り出し、滅菌したホイルにより覆い、そして蓋により閉じた。

【００８８】重要な工程パラメーターの概要は表２及び表３にあり、製造した個々のサンプ
ルをいくつかのデータとともに表３に示す。各サンプルは固有のコードをもつ。
最初の２文字は用いたガラスの化学的性質（以下を参照のこと）を表し、そして
次の４つの数字は製造工程（表２を参照のこと）をコードする。その数字の後に
用いた色素（表１を参照のこと）を記載する。前記の文字Ｒは微細内容物が除か
れていないことを意味するのに対して、Ｅは微細内容物がエタノールにより除か
れていることを意味する。最後の２つの数字はロット番号を表す。抽出物の量か
ら計算したガラス（コードＥＪ）の組成は、７０．６７ Mol％ＳｉＯ₂ 、１４
．３３ Mol％Ｂ₂ Ｏ₃ 、５．００ Mol％Ａｌ₂ Ｏ₃ 、４．００ Mol％Ｋ₂
Ｏ、２．００ Mol％ＣａＯ、４．００ Mol％ＺｎＯであった。ガラス（コー
ドＲＮ）の組成は、７４ Mol％ＳｉＯ₂ 、１５ Mol％Ｂ₂ Ｏ₃ 、５．００ M
ol％Ａｌ₂ Ｏ₃ 、４．００ Mol％Ｋ₂ Ｏ、２．００ Mol％ＣａＯであった
。ガラス（コードＥＰ）の組成は、７３．６１ Mol％ＳｉＯ₂ 、１４．９３ M
ol％Ｂ₂ Ｏ₃ 、５．２１ Mol％Ａｌ₂ Ｏ₃ 、４．１７ Mol％Ｋ₂ Ｏ、２．
０８ Mol％ＣａＯであった。

【００８９】２実施例２：高解像走査型電子顕微鏡検査ＭＧＰの表面、サイズ、及び形態の情報を得るために、我々はＪＥＯＬ社によ
り製造された高解像走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ）により調査を行った。サンプル
を電気伝導性の両面接着テープによりサンプル・ホルダー上に広げ、３０mAの電
流で３６秒間金によりスパッタする。表面を推測するために、放出した２次電子
（トポグラフィー（topography））、及び後方散乱電子（オーダー・ナンバー・
コントラスト）を観察する。使用した主な電子電圧は、１０kV（２次電子）又は
２５kV（後方散乱電子）であった。

【００９０】図４は磁性色素（ＢＭ）として酸化鉄（III)により覆われた雲母によるＭＧＰ
ｓを示す。非収縮性材料上で層が収縮し始める場合の粒子のスプレードライに由
来するガラス殻の亀裂をはっきりと見ることができる（乾燥性亀裂）。さらによ
り大きな磁性粒子（１０〜６０μｍ）を１つも含まない多数の球状粒子を見るこ
とができる。磁性核をもたないこれらの球体（非磁性微細成分）は磁場により除
去できず、ＰＣＲ反応に移され、そしてこの反応を妨げる。

【００９１】磁性色素（平均粒子サイズ２３nm）が層に張力を生じさせないためスプレード
ライ処理の間に亀裂が作られないため、ＣＥＲＡＣ色素による粒子（図５を参照
のこと）には亀裂がない。さらに、小さなＣＥＲＡＣ粒子は、そこに含まれた非
磁性粒子がないため微細成分内に取込まれもする。その粒子は、雲母による粒子
よりも相当小さくもあり、それは同じ倍率のこれらの図において観察されうる。
他の磁性色素によるＭＧＰｓを図６〜図１０に同じ倍率で示す。

【００９２】３実施例３：ＭＧＰｓの物理的調査実際の機能試験の前にＭＧＰｓの評価を与えるために、ＨＲＥＭ調査に加えて
さらに物理的計測をＭＧＰｓについて行った。水中での鉄の溶解度、磁力、微細
成分、密度について知ることは興味深かった。以下にその実験を記載し、そして
結果を示した。

【００９３】３．１吸光度計測前記の微細粒が除かれているかどうか試験するために、１０００mgの加熱処理
し、そしてふるいがけした粉末を５０ml容遠心管（Sarstedt）に量りとり、４０
mlの水を加え、そして振りまぜて分散させる。次にその管を、全体を埋める高さ
を有する超音波バス（Sonorex (RX 102H; 120/240W））に入れ、そして磁性分離
機（Roche Diagnostics GmbH RD Art. Nr. 1858 025)に乗せる。３．５分間の磁
性分離の後、液体を磁石の向かい側の１５mlマークの高さでパスツール・ガラス
・ピペットにより容器から取り、そして５mm石英キュベット（Type 110-QS, Hel
lma)に満たす。その上清の吸光度をＵＶ−ＶＩＳ−ＮＩＲ分光計（Hitachi U-30
00）により脱イオン水で満たした対応のキュベットに対して計測する。計測の範
囲は、偶発的な夾雑物の吸収バンドに関するこの波長範囲を調査するために１nm
きざみで２００〜１１００nmとした。２８０nm及び４００nmの波長での吸光度を
参考として測った。

【００９４】３．２密度計測密度計測のために、ガス・ピクノメーター（AccuPyc 1330, Fa.Micromeritics
）を使用する。ヘリウム６．０をガスとして使用する。装置を市販の標準物質（
容量概知の金属ビーズ）により標準化する。さらに、サンプルを少なくとも１５
０℃で１時間乾燥し、そして次に計測容器に満たし、そして計量する。計測容器
をガス・ピクノメーター内に入れた後、１０の洗浄サイクル及び５の計測サイク
ルを平均容量及び標準偏差を測定するために用いた。

【００９５】３．３溶解度の計測コート及び加熱処理サンプルの鉄溶解度をInductive Coupled Plasma-Atomic
Emission分光法（ＪＹ２４，ＩＳＡ社）により測定する。そのために、１ｇのサ
ンプルを５０ml容ポリプロピレン管に移し、滅菌水で満たし、そして６０℃の温
度で２０時間保持する。次に、サンプルを０．２μｍシリンジ・フィルターによ
りろ過し、そしてそのろ液を計測する。４の単独測定を２５９．９４０nmの波長
で実施し、そしてそこから平均値を計算する。

【００９６】３．４磁力の計測磁力を計測するために、ＭＧＰｓで完全に満たしたＰＰ−計量用試験管（Lice
fa社、Art. Nr. V2-3)を計量する。ステンシルの助けにより、このサンプル容器
を、その管の蓋を閉じたままにできるように真ちゅうをのせたＬＤＰＥ管（Kart
ell社、TS735）の中央に置く。前記容器を他のステンシルの助けにより天秤（検
出精度０．１ｇ）の中央に配置する。天秤の平衡化の後、円柱形の磁石（直径：
３０mm；高さ：１１３．５mm；材質：サマリウム−コバルト２／１７）を含むプ
ラスチック・カプセルを天秤の上に配置する。

【００９７】その結果、天秤のＭＧＰｓは重力に逆らって引き寄せられることでその重量が
減少する。平衡状態の調整（１．５分）の後、サンプルの重量損失を測定し、そ
してその値を２５０mg ＭＧＰについて正規化する。

【００９８】３．５結果ＥＪ組成物及び異なる色素によるＭＧＰｓの物理的特徴づけの結果を表３に概
要として示す。吸光度の値はＣＥＲＡＣ色素を用いた場合、非常に低いことが注
目に値する。これは、小さなＣＥＲＡＣ色素（２３nm）が各磁性ガラス粒子内に
取込まれうることでの非磁性微細成分の欠如により説明されうる。ＣＥＲＡＣ−
ＭＧＰｓの密度は非常に高いわけではない。これは沈殿速度に決定的な影響をも
つ。磁力は、大きな変動の影響下に置かれるが、しかしながらそれはＣＥＲＡＣ
色素の使用により明らかに影響をうける。ＣＥＲＡＣ−ＭＧＰｓは水への鉄の比
較的高い漏出を有する。しかしながら、１０倍多い量であってもＰＣＲ反応にい
かなる影響をも示さなかった。

【００９９】要するに、前記物理的特性には、異なる色素の間での全く違いがないが、ＣＥ
ＲＡＣ−ＭＧＰｓが非常に少ない微細成分を有することを言明しうる。

【０１００】４実施例４:ＢＥＴ表面に対する磁性核色素及びスプレー・ドライヤーの効
果表面をMicromeriticsのデバイス（Type ASAP 2400)を用いて測定した。計測を
液体窒素温度で行った。窒素５．０を計測用ガスとして、そしてヘリウム４．６
を不活性ガスとして用いた。典型的には、５ｇのサンプルを１回の計測に用いた
。ＭＧＰｓの表面はＤＮＡ及びＲＮＡの分離の役割を果たす。優れた表面はより
多くのＤＮＡを同じ質量のＭＧＰｓにより結合しうる。それは少ないＭＧＰｓを
使用し、そして同じ成果を得ることをも可能にする。これはＰＣＲ反応内に夾雑
物として導入されうるアルコールの減少を意味する粒子間の体積を減らす効果を
もつ。いくつかのサンプルについての計測したＢＥＴ表面のデータを表４に概要
として示す。大きなスプレー・ドライヤーで製造したサンプルの表面を比較する
場合、小さな色素（BASF FA, STREM、及びCERAC)によるサンプルは比較的大きな
表面を有し、一方大きなＭｅｒｃｋ色素は小さな表面を有することに留意すべき
である。これは大きな磁気粒子が大きなＭＧＰｓを生じるのに対し、小さな磁性
粒子がスプレー・ドライ処理の間の球状滴中に取込まれ、したがって同じような
スプレー条件下で同じような表面を有するという事実により生じうる。ＢＡＳＦ
ＣＥ−ＳＵ粒子は、小さな粒子（BASF FA, STREM、及びCERAC)と大きなＭｅｒ
ｃｋ粒子の間に分類されるサイズを有する。Ｍｅｒｃｋ粒子との対比において、
その粒子が非常に滑らかなガラス表面を有するので、それらは構造的な表面を持
たない。これは小さな表面をもたらす。より高い圧力が小さなスプレー・ドライ
ヤーにより用いられ、そしてこのスプレー・ドライヤーのノズルは大きなスプレ
ー・ドライヤーのそれよりも異常に小さい。これはより小さな粒子を生じ、それ
により表面が著しく減少する。これは実施例５．２．１の結果とよく一致してい
る。

【０１０１】さらなる物理的調査の結果に対する磁性色素又はスプレー圧のあらゆる効果は
、前述の亀裂形成及び微細成分に対する効果を除いて認められない。しかしなが
ら、表面の計測だけは機能的な効果の結果への直接的なつながりを示す。他の物
理的効果の結果はこの直接的なつながりを示さない。

【０１０２】５実施例５：放射性トレーシングによる結合試験核酸の抽出へのそれらの適合性に関してＭＧＰの評価のためのいくつかの方法
がある。精製前後の２６０nmでの吸光度の測定は、感度が低く、そして少量の標
的核酸を臨床材料から抽出する状況に類似しない。例えばＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲ
，ＮＡＳＢＡ又は他の類似物によるような核酸の増幅方法に頼る機能的な評価方
法の結果は、たいてい十分な説得力がない。さらに、標的ゲノムのわずかなコピ
ーの測定に好適なこれらの方法は、サンプル材料又はサンプル調製処理からの物
質による妨害の影響を受けやすい。

【０１０３】放射性物質結合試験はサンプル調製処理の段階的な分析を可能にする好適な分
析方法である。成果データは完全なデータではないが、必ず言及の粒子の性能に
相関する。

【０１０４】５．１実験プロトコール最初に、放射性標識ＤＮＡ又はＲＮＡを³²Ｐ−標識デオキシヌクレオシド又は
ヌクレオシド−三リン酸の存在下でのＰＣＲ又はインビトロにおける転写処理に
より酵素的に合成する。次に、この標識ＤＮＡ又はＲＮＡを遊離のヌクレオシド
−三リン酸から分離し、含有量を測定し、そして確定した希釈液を調製する。少
量の標識ＤＮＡ又はＲＮＡを実験前に各サンプルに加える。サンプル調製の間に
、全ての核酸はカオトロピック物質存在下、ＭＧＰｓに結合する。そのＭＧＰｓ
を磁力の使用によりペレット形成し、そして上清を捨てることができる。前記ペ
レットを洗浄し、そして結合した核酸を、反応条件の反転により、すなわち低塩
の溶出緩衝液の添加により高めた温度で溶出する。結合の後、そして場合により
洗浄ステップの後、前記粒子上清のアリコートをフィルター上にスポットする。
前記溶出液、及び水中に再分散させたＭＧＰを同様にフィルター上にスポットし
、その後乾かす。最後に、そのフィルターをベータ・カウンターにより計測し、
そして各サンプル調製についての分布を計算する。

【０１０５】５．１．１放射性標識ＤＮＡの調製５．１．１．１Ａ．１．１．試薬 − Expand High Fidelity PCR装置（Roche Molecular Biochemicals Cat . No. 732641) − ｄＮＴＰミックス（Roche Molecular Biochemicals Cat. No. 1277049) − デオキシシチジン５′−アルファ−Ｐ３２三リン酸ｄＣＴＰ３０００Ci ／mmol（Amersham Cat. No. PB 10205) − ランダム−ＤＮＡ（Roche Cat. No. 1029053）濃度１ng／ml − 放射性トレーサー・プライマー１（配列番号１）濃度５，３ＯＤ₂₆₀ ／ml − 放射性トレーサー・プライマー２（配列番号２）濃度５，２ＯＤ₂₆₀ ／ml − QIA Quick PCR精製キット（Qiagen Cat. No. 28104) ５．１．１．２反応 − ２９．５μｌ二重滅菌水 − ５μｌ Expand High Fidelity緩衝液 − 二重滅菌水により希釈した２．５μｌｄＮＴＰミックス（１：１０） − １μｌ放射性トレーサー・プライマー１（配列番号１） − １μｌ放射性トレーサー・プライマー２（配列番号２） − ０．３μｌ ³²Ｐ−ｄＣＴＰ − １０μｌラムダ−ＤＮＡ − ０．７５μｌ Expand High Fidelity−酵素ミックス５．１．１．３増幅 − ２分間９４℃ − １０サイクル（１０秒間、９４℃／３０秒間、６０℃／６０秒間、７２℃ ） − ２０サイクル（１０秒間、９４℃／３０秒間、６０℃／６０秒間、７２℃ ＋１０秒間、７２℃伸長毎サイクル） − ７分間７２℃ − ４℃ ５．１．１．４精製 − QIA Quick PCR 精製プロトコール（Qiagen）による５．１．１．５希釈二重滅菌水によるＤＮＡを１：１０に希釈し、そしてベータ線計数管により計
測する。

【０１０６】５．１．２Ａ．２．放射性標識ＲＮＡの調製５．１．２．１−試薬 − ＳＰ６／Ｔ７転写キット（Roche Molecular Biochemicals Cat. No. 9996 44) − ウリジン５′−ａｌｐｈａ−Ｐ３２三リン酸ＵＴＰ３０００Ci／mmol（ Amersham Cat. No. PB 10203) − プラスミドｐＢＫＢＨ１０Ｓ、ＥｃｏＲＩにより線状化し１００μｇ／ml で − High Pure RNA精製キット（Roche Molecular Biochemicals Cat. No. 182 8665）５．１．２．２−反応 − ２μｌ１０×緩衝液 − ３μｌＮＴＰミックス（ＡＧＣ） − １μｌＵＴＰ（二重滅菌水により） − ５μｌ ³²Ｐ−ＵＴＰ − ７μｌ線状化プラスミド − １μｌＲＮＡｓｅ阻害剤（Roche Molecular Biochemicals Cat. No. 80 2808) − １μｌＴ７ＲＮＡ−ポリメラーゼ５．１．２．３転写及びＤＮａｓｅ消化 − ３７℃で２０分間インキュベーションし、 − ２μｌのＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅを加え、 − ３７℃で１０分間インキュベートし、 − １７８μｌの二重滅菌水を加える。

【０１０７】５．１．２．４−精製 − High Pure RNA 分離プロトコール（Roche Molecular Biochemicals）による。

【０１０８】５．１．２．５−希釈二重滅菌水によりＲＮＡを１：３０に希釈し、そしてベータ線計数管により計
測する。

【０１０９】５．１．３−放射性サンプルの調製５．１．３．１−試薬 − 陰性血漿 − プロテイナーゼＫ濃度２０mg／ml（例えばRoche Id. Nr. 1942387) − ポリ−Ａ−ＲＮＡ（例えばRoche Id. Nr. 108626）濃度１mg／ml；溶解緩衝液により１：１０００（体積／体積比）に希釈 − 溶解緩衝液（５０mMトリスpH７．０、１５％（ｖ／ｖ）ポリドカノール、５Ｍイソチオシアン酸グアニジニウム、１mM ＤＴＴ） − ６０mg／ml又は６mg／mlでイソプロパノール中に懸濁した（ガラス組成物ＥＪ及び異なる核色素（BM, MMB, CERAC, STREM, BASF-FA, BASF-CE)による）ＢＧＰ − 洗浄緩衝液（２０mMトリスpH７．５、２０mM ＮａＣｌ、７０％（ｖ／ｖ）エタノール） − 溶出液：二重滅菌水 − 補助物質：ＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｄフィルター５．１．３．２− 反応（１．５mlプロトコール） − ８０μｌのプロテイナーゼＫに − ４１０μｌの陰性血漿を加え、そして混合し、 − ５００μｌの溶解緩衝液を加え、そして混合し、 − １０μｌの放射性標識ＤＮＡ又はＲＮＡを加え、そして混合し、 − 振り混ぜながら室温で１０分間インキュベートし、 − ５００μｌのＭＧＰ懸濁液（濃度６mg／ml）を加え、混合し、 − 振り混ぜながら室温で２０分間インキュベートし、 − 磁性セパレーター（Ｄｙｎａｌ）により２分間分離し、 − 上清を除き、そして３００μｌをフィルター上にスポットし、 − ７５０μｌの洗浄液を加え、ボルテックスし、２分間分離し、 − 上清を除き、最終的に３７５μｌの上清をフィルター上にスポットし、 − 洗浄手順を２度くり返し、 − １００μｌの溶出液を加え、サーモミキサーにより８０℃で５分間インキュベートし、 − 磁石ホルダーにより２分間分離し、上清をフィルター上にスポットし、 − フィルターを乾燥オーブンにより７５℃で６０分間乾燥し、 − フィルターをシンチレーション管に移し、５mlのシンチレーション液を加え、そしてベータ線計数管により計測する。

【０１１０】５．１．３．３−実験プロトコール（１mlプロトコール） − ２５μｌのプロテイナーゼＫに − ４１５μｌの陰性プラスミドを加え、そして混合し、 − ５００μｌの溶解緩衝液を加え、そして混合し、 − １０μｌの放射性標識ＤＮＡ又はＲＮＡを加え、そして混合し、 − 振り混ぜながら室温で５分間インキュベートし、 − ５０μｌのＭＧＰ懸濁液（濃度６０mg／ml）を加え、混合し、 − 振り混ぜながら室温で２０分間インキュベートし、 − 磁性セパレーター（Ｄｙｎａｌ）により２分間分離し、 − 上清を除き、そして３００μｌをフィルター上にスポットし、 − ７００μｌの洗浄緩衝液を加え、ボルテックスし、２分間分離し、 − 上清を除き、最終的に３５０μｌをフィルター上にスポットし、 − 洗浄手順を２度くり返し、 − １２０μｌの溶出液を加え、サーモミキサーにより８０℃で１０分間インキュベートし、 − 磁石ホルダーにより２分間分離し、上清をフィルター上にスポットし、 − １００μｌの溶出液を加え、再懸濁し、そしてＭＧＰｓをフィルター上にスポットし、 − フィルターを乾燥オーブンにより７５℃で６０分間乾燥し、 − フィルターをシンチレーション管に移し、５mlのシンチレーション溶液を加え、そしてベータ線計数管により計測する。

【０１１１】５．２放射性トレーシング実験の結果５．２．１ＲＮＡ単離に対する磁性核色素又はスプレー・ドライの影響ＥＪガラス化学及びナノ−又はマイクロの範囲のさまざまな色素（MMB, CERAC
等）を用いて異なるスプレー・ドライヤー（Buechi又はNubilosa）で製造された
異なるＭＧＰタイプをウイルス−陰性貯留物質からの核酸の抽出でのそれらの振
る舞いに関して実施例５．１．３．２による放射性トレーシング法により特徴づ
けした。ＲＮＡパラメーターはその試験の内で最も高感度であることが証明し、
そしてその結果、パラメーターとして選ばれた。図１１は、溶出液中に少量の結
合ＲＮＡしか見ることができなかったため、ＢＡＳＦ−ＣＥが核材料として好適
ではないことを示す。６bar でＢｕｅｃｈｉ装置によりスプレーされたＥＪ／Ｃ
ＥＲＡＣ粒子は、Ｎｕｂｉｌｏｓａ装置によりスプレーされた基準ＥＪ／ＭＭＢ
の性能を示した。

【０１１２】５．２．２ＤＮＡ又はＲＮＡの単離に対するスプレー処理パラメーターの影響異なるスプレー圧のＮｕｂｉｌｏｓａ装置により製造された異なるＭＧＰタイ
プを実施例５．１．３．３により比較する。基準粒子は、ＥＪ／ＭＭＢＭＧＰ
である。ＤＮＡ及びＲＮＡ結合特性を調査する。ＤＮＡパラメーターがスプレー
圧への非依存を示すのに対し、ＲＮＡパラメーターは顕著な性能の違いを示す。
Ｎｕｂｉｌｏｓａ装置により１．５bar のスプレー圧によって製造したＥＪ／Ｃ
ＥＲＡＣの性能は、基準のそれよりも低い。１．５〜３．４bar 変化したスプレ
ー圧への依存により１連の中でより低い性能が存在する（〜３０％）。４．３ba
r でスプレーされる粒子は、１．５bar でスプレーされた粒子の性能の９０％に
達する（図１２を参照のこと）。前記実験は、ＭＧＰ製造に関する処理パラメー
ターと試験における性能の直接的なつながりを証明する。スプレー圧の増加は低
い試験性能をもたらすが、特定のスプレー圧からの開始は、粒子特性をより良好
な性能をもたらすように改善することに留意すべきである。

【０１１３】５．２．３ＲＮＡ及びＤＮＡの単離に対するさまざまなＭＧＰ製造パラメーターの影響これらの実験は、スプレー圧の変異がより良好な性能を有するＭＧＰｓをもた
らすかどうかの結果を導くはずである。

【０１１４】そのため、ＭＧＰｓを、スプレーガスとして窒素を用いて１．５bar ，４．３
bar 、及び６bar の圧力でＮｕｂｉｌｏｓａ装置により製造する。

【０１１５】完全な乾燥処理を得るために、スプレー・ドライヤーの噴射口及び出口温度を
さらに下げる。ＲＮＡ単離に対するこれらの因子の影響を、基準としてＥＪ／Ｍ
ＭＢＭＧＰを用いて実施例５．１．３．３により調査する。

【０１１６】結果（図１３を参照のこと）は、スプレー温度の低下により引き起こされる、
そして予測しえなかった劇的な性能低下の驚くべき効果を示す。スプレー圧の上
昇により基準に似た性質の性能を達成することは可能であった。優れた懸濁液安
定性に付随して、結果として、これらの粒子は基準よりも優れている。

【０１１７】６実施例６：磁性ガラス粒子の沈殿分析６．１実験プロトコール Kontron Instruments製のUrikon分光光度計モデル９３０を磁性ガラス粒子の
沈殿性質の評価のために使用する。この分光光度計を、物差しの目盛りにそって
キュベットの可変調節を可能にするために変更する。計測のためにキュベットを
、６５０nmの波長をもつ計測ビームが内容物の高さの２／３の位置（物差しの位
置は７．５）でキュベットを横切る位置にセットする。４mlの容量及び１cmの光
路長を有するポリスチレン製のマクロ・キュベットを用いる。計測に先立ち、較
正を純粋な懸濁溶媒に対して単ビーム法により行う。ＭＧＰを、典型的には３mg
／mlの質量／容量比で懸濁媒質中に均質に分散させ、そして直ちに計測する。時
間による吸光度の変化を前述の６５０nmの波長で連続的に観察する。

【０１１８】異なるサンプルの沈殿速度の比較のために使用される物理的な量は特定の懸濁
媒質における半減期（ｔ_1/2）である。これはキュベットの上部３分の１におけ
る懸濁液の吸光度が計測の開始時の半量になるまでの時間である。吸光度の低下
は、粒子の沈殿、及び付随する試験容量の上部３分の１のクリアランスにより生
じる。

【０１１９】前記デバイスは、さらにキュベットの下方の磁石の据えつけを可能にする。そ
のため、磁気分離の速度を計測しうる。

【０１２０】６．２沈殿分析の結果６．２．１実験１：ナノ−又はマイクロメートルの範囲のさまざまな核、及びＥＪガラス化学反応
により製造されたいくつかのＭＧＰタイプを、それらの沈殿及び分離性質、すな
わちキュベットの下の磁石の有無について分光光学的に評価する。質量／容量は
、この場合６mg／mlである。前記懸濁媒質は、イソプロパノールと溶解緩衝液の
１:１混合物である。結果は概要を示す。ＣＥＲＡＣタイプからの粒子は懸濁液
の安定性において明らかな優位性を示すが、磁気分離についての劣性は示さない
（図１４も参照のこと）。

【０１２１】６．２．２実験２：ＥＪガラス化学反応により製造されるＣＥＲＡＣタイプからのさまざまなＭＧ
Ｐｓの沈殿性質を純粋なイソプロパノール中で評価する。

【０１２２】主要な製造パラメーターは、以下のとおりである。

【０１２３】ＥＪ０１００．５Ｒ−０１−１．５bar のスプレー圧、２３０℃の噴射口温度、Ｎｕｂｉｌｏｓａ装置ＥＪ０１０８．５Ｒ−０１−４．３bar のスプレー圧、２３０℃の噴射口温度、Ｎｕｂｉｌｏｓａ装置ＥＪ００９６．５Ｒ−０１−６．０bar のスプレー圧、１５０℃の噴射口温度、Ｂｕｅｃｈｉ装置ＥＪ００９６．５Ｒ−０１を図１５に示す。これらのビーズは、大きな球状で
、高次構造表面を有し、そして主に０．５〜５μｍのサイズである。低い圧力及
び高温でスプレーされたサンプルＥＪ０１００．５Ｒ−０１は主に変形したμ−
スケールの粒子から成る（ＥＪ０１００．５Ｒと機能的当量を示す、図１６を参
照のこと）。最後に、ＥＪ００９６．５Ｒ−０１のような粒子は、ＭＧＰ懸濁液
の液体の移動について最も有用である懸濁液の顕著な沈殿の遅延を示す（図１４
ｂを参照のこと）。結果を概要の形で示す。

【０１２４】７実施例７：ＰＣＲによる機能試験７．１異質系機能分析：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＧｅｎｅＡｍｐ９
６００（商標）によるＰＣＲにより増幅し、そして変更したＥｌｅｃｓｙｓ１
０１０（商標）による化学発光標識検出プローブを用いる生物特異的結合により
検出する。

【０１２５】７．１．１全般的な考え方サンプル（例えば血漿）中のウイルス粒子をプロテアーゼ及び高濃度のカオト
ロピック塩、及び界面活性剤の存在により溶解する。次に遊離核酸をガラス表面
に物理学化学的吸収のために微粒子吸収体（＝ＭＧＰ）を加え、その後に磁気に
よる分離及び加えられたビーズ、すなわち結合型／遊離型吸収体の洗浄が引き続
く。最後に、ビーズからの結合した核酸の分離（溶出）を吸収に対して反対にし
た反応条件下、すなわち低い塩の緩衝液によるか又は滅菌水によってでさえ実行
される。次に溶出物のアリコートをＰＣＲマスター・ミックスと混合し、溶出物
内に発見される核酸の増幅を始める。この反応は以下の等式により特徴づけられ
る。

【０１２６】Ｎ_ｉ＝Ｎｏ×（１＋Ｅ）ⁿ ここで、Ｎ_ｏ＝ポリメラーゼ連鎖反応開始時の分子数Ｎ_ｉ＝ポリメラーゼ連鎖反応終了時の分子数Ｅ＝増幅効率＝０≦Ｅ≦１ｎ＝反応サイクル数＝典型的には２０≦ｎ≦３５少なくとも１のビオチン化プライマーによるＰＣＲの後、ビオチン・タグ化増
幅物をハイブリダイゼーション緩衝液及び検出プローブと混合する。インキュベ
ーションの後、ストレプトアビジン・コートビーズを加え、引き続いてもう１度
インキュベーションする。最後にそのビーズを洗浄し、シグナル緩衝液を加え、
そして増幅された核酸結合の量、すなわち血漿サンプル中のウイルス混入量に相
関する化学発光シグナル強度を計測する。

【０１２７】当業者は１mlプロトコールを手作業で実行することもできる。

【０１２８】７．１．２実験プロトコール７．１．２．１試薬７．１．２．１．１サンプル調製プロテイナーゼＫ、グリセロール／Ｃα−酢酸による液体、２０mg／mlポリ−
Ａ−ＲＮＡ、１mg／ml、使用レベルは溶解緩衝液による１：１０００希釈液溶解
緩衝液、以下の・トリス緩衝液、５０mmol／ｌ、pH７．０（それぞれ、１．０及び抽出器プロト
コール）、又は４．０（１．５mlプロトコール）・ポリドカノール、１５％（ｖ／ｖ）（それぞれ１．０及び抽出器プロトコール
）、又はＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００２０％（ｖ／ｖ）（１５mlプロトコ
ール）・イソチオシアン酸グアニジニウム、５mol／ｌ・１mmol／ｌＤＴＴから成る。

【０１２９】 − ＥＪ／ＢＭ，ＥＪ／ＭＭＢ又はＥＪ／ＣＥＲＡＣタイプの磁性ガラス粒子（ＭＧＰ）を６０mg／mlでイソプロパノール（純度９９．８％）中に懸濁させる。

【０１３０】 − 洗浄緩衝液は以下の・トリス緩衝液、２０mmol／ｌ、pH７．５・６０％エタノール／水（それぞれ、１．０及び抽出器プロトコール）、又は７
０％（１．５mlプロトコール）・ＮａＣｌ，２０mmol／ｌから成る。

【０１３１】溶出液＝二重滅菌水増幅／マスター・ミックス： − ＰＣＲ緩衝液、以下の緩衝媒質ＲＴ−ＰＣＲ（ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ））：２５０mmol／ｌビシン（ｂｉｃｉｎｅ）／ＫＯＨ pH８．２，５５７
mmol／ｌＫ−酢酸、４０％グリセロールＨＢＶ−ＰＣＲ（Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））：２０mmol トリス−ＨＣＬ
pH８．３，１００mmol／ｌＫＣｌ，０．０１２％Ｂｒｉｊ３５（＝２倍濃
度）金属陽イオン、ＭｇＣｌ₂ （ＨＢＶ−ＰＣＲ）３mmol／ｌ又はＭｎＣｌ₂ （Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ）２．５mmol／ｌ（ＨＣＶ）、及び１．２５mmol／ｌ（ＨＩＶ）デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，
ｄＵＴＰ）分析物特異的な正プライマー分析物特異的な逆プライマーウラシル−Ｎ−グリコシダーゼ（ＵＮＧ）ＤＮＡポリメラーゼ（それぞれ、ＨＢＶ又はＨＩＶ／ＨＣＶのためのＴａｑ又
はＴｔｈポリメラーゼ）１００μｌに容量調節するための鉱物質を除いた水（分
子生物学グレード）から成る。増幅後のＵＮＧ停止試薬 − Ｎ−ラウロイルサルコシン（例えばRoche Id.Nr.133895）、１％（ｗ／ｖ
）；増幅物１００μｌ当たり５μｌ７．１．２．１．２検出ハイブリダイゼーション緩衝液（例えばRoche Id.Nr.1930273）化学発光標識検出プローブＨＣＶ（Roche BMO 28.140336）、作業原液＝８．０nmol／ｌＨＩＶ（Roche BMO 28.540948）、作業原液＝７．８nmol／ｌＨＢＶ（Roche BMO 28.540917）、作業原液＝９．２nmol／ｌＳＡで覆ったＥＣＬビーズ（例えばRoche Id.Nr.1865943-001）変性溶液（例えばRoche Id.Nr.1930257） Pro Cell（例えばRoche Id.Nr.1717685） Clean Cell（例えばRoche Id.Nr.1717642）７．１．２．１．３プライマー及びプローブ

【０１３２】

【表１】

【０１３３】７．１．２．２反応条件及び試験手順サンプル調製 → １．０ml手作業プロトコール；＝＞実験１に使用される実施例７．３．１を参照のこと４２５μｌの血漿サンプルに２５μｌのプロテイナーゼＫを加え、ボルテック
スし、５００μｌの溶解緩衝液を加え、機械的な撹拌（Eppendorfミキサーによ
り１３００rpm)しながら室温で５分間インキュベートし、５０μｌのイソプロパノール中に懸濁したＭＧＰ（濃度６０mg／ml）を加え、
ボルテックスし、そしてローラー・ミキサーにより室温で２０分間インキュベー
トし、Ｄｙｎａｌ磁気セパレーターを用いて磁気分離し（２分間）；結合されていない画分を吸引を通して除き、そして７００μｌまで水を加え、
ボルテックスし、分離し、吸引し；あと４回洗浄手順をくり返し、１２０μｌのＤＥＰＣ水を加え、ボルテックスし、そして蓋のないカップによ
りEppendorfサーモミキサーにより１３００rpm 、８０℃で１０分間溶出し、ビーズをＤｙｎａｌ磁気セパレーターにより水性上清（＝溶出液）から分離し
（２分間）、溶出液をこの先使用するまで冷凍しておく。

【０１３４】 → 屋内設置型抽出器による自動化プロトコール；＝＞実験２及び３に使用される（実施例７．３．２及び実施例７．３．３を参照のこと）基本的には前記同じ手順及び試薬セットである。さらに、アモールドＲＮＡ（
amoured RNA）内部標準（ＩＣ、以下を参照のこと）をそれぞれの、そしてどの
サンプルにもスパイクさせ、抽出工程を約４０℃で一定温度とし、そして容量を
２ml総量の溶解ミックス、すなわち以下の５０μｌＩＣ５０μｌプロテイナーゼＫ８５０μｌサンプル１０００μｌ溶解緩衝液１００μｌＭＧＰ懸濁液２２００μｌ洗浄緩衝液、５回の洗浄ごとに１２５μｌ溶出液に調節する。

【０１３５】 → １．５ml手作業プロトコール；＝＞実験４で使用される（実施例７．３．４）４２０μｌの血漿サンプルに８０μｌのプロテイナーゼＫを加え、ボルテック
スし、５００μｌの溶解緩衝液を加え、機械的な撹拌（Eppendorfミキサーにより１
３００rpm)をともない室温で５分間インキュベートし、５００μｌのイソプロパノール中に懸濁したＭＧＰ（濃度６０mg／ml）を加え
、ボルテックスし、そしてローラー・ミキサーにより室温で２０分間インキュベ
ートし、Ｄｙｎａｌ磁気セパレーターを用いて磁気分離し（２分間）；結合されていない画分を吸引を通して除き、そして７００μｌまで洗浄緩衝液
を加え、ボルテックスし、分離し、吸引し；あと４回洗浄手順をくり返し、１００μｌのＤＥＰＣ水を加え、カップを閉じて、ボルテックスし、そしてEp
pendorfサーモミキサーによって１３００rpm 、８０℃で１５分間溶出し、ビーズをＤｙｎａｌ磁気セパレーターにより水性上清（＝溶出液）から分離し
（２分間）、溶出液をこの先使用するまで冷凍しておく。

【０１３６】

【表２】

【０１３７】ＰＣＲの後、ＵＮＧを、使用レベルが濃度１％のラウリルサルコシンの添加に
より妨害する。

【０１３８】温度サイクルの一覧は以下のとおりである：

【０１３９】

【表３】

【０１４０】変更したＥｌｅｃｓｙｓ１０１０（商標）による検出

【０１４１】

【表４】

【０１４２】７．２均質系機能分析：ＣｏｂａｓＴａｑｍａｎ（商標）による５′ヌク
レアーゼ・アッセイ・テクノロジー７．２．１全般的な考え方ウイルス粒子の溶解、並びにサンプルから抽出された核酸の吸着、精製、及び
溶出を前記のとおり実施する（実施例７．１．２を参照のこと）。再び、標的分
子の増幅を以下の等式により説明する。

【０１４３】Ｎ_ｉ＝Ｎｏ×（１＋Ｅ）ⁿ ここで、Ｎ_ｏ＝ポリメラーゼ連鎖反応開始時の分子数Ｎ_ｉ＝ポリメラーゼ連鎖反応終了時の分子数Ｅ＝増幅効率＝０≦Ｅ≦１ｎ＝反応サイクル数＝この場合において典型的には４０≦ｎ≦６０しかしながら、５′ヌクレアーゼ・テクノロジーにより、増幅及び検出反応の
それぞれは密接に絡み合い、そして溶液相の中で起こっている、すなわち固相の
固定及び対応の洗浄ステップをもたない（＝均質系ＰＣＲ）。この最後に、２の
特有の化学修飾を有する検出プローブをＰＣＲマスターミックスに加える。これ
ら修飾の１つは、プローブの骨格に共有結合させた蛍光発生的レポーター基（Ｒ
、例えば６−カルボキシ−フルオレッセインの誘導体）であり、もう１つは上記
レポーターの蛍光発光を吸収することができ、そしてそれをクエンチする色素（
例えばポリメチン−シアニン誘導体）（消光剤）である。前記消光剤はプローブ
骨格の５′末端に典型的には付着する、それに対して前記レポーターは妨害状態
を形成する一定のヌクレオチドだけ消光剤から間隔をおいて置かれるオリゴ配列
中に配置される。これらのプローブは、標的核酸（センス又はアンチセンス鎖）
にプライマー（逆又は正）の３′末端の間近に結合する。プライマーが標的にア
ニールし、そしてＤＮＡポリメラーゼがプライマー：標的ハイブリッドに結合す
るとすぐに伸長が始まる。酵素の５′ヌクレアーゼ活性のために、複製鎖の合成
と並行してポリメラーゼはプローブ結合部位に到達するとすぐに前記プローブを
切断し、レポーターと消光剤が切り離され、そして蛍光シグナルが計測できるよ
うになる。この工程はサイクルごとにくり返され、そして反応の終了時の試薬の
消耗まで溶液中にますます多くの蛍光レポーターを蓄積する。なので、シグナル
対時間のプロットにおいて、シグモイド成長曲線を生じる。より大きなＮ₀ 、そ
してより初期のシグナル曲線ほど高いノイズ・レベルを現す。

【０１４４】前記蛍光シグナルがバックグラウンド・シグナルと有意に区別されうる点であ
るところの時間軸上の点は、しきいサイクル（ｃｔ）と呼ばれる。ｃｔは分析感
度の指標である：小さなｃｔ値ほどその分析は高感度である。ｃｔ値は別の数学
的操作、例えば除外（ｃｕｔ−ｏｆｆ）法（一定の因子により増幅された平均バ
ックグラウンド・シグナル強度は除外シグナル強度をもたらし正から負を識別す
る）又はシグナル対時間曲線の最初の微分の最大値の位置（すなわち勾配きつさ
の特徴）若しくは時間軸上の第２の微分最大値の位置を計算し、そしてｃｔとし
て定義する方法により算出されうる。

【０１４５】この増幅／検出テクノロジーは、ＰＣＲのリアルタイム測定だけでなく、閉管
での処理をももたらす、すなわち標準的な手順との比較において、ＰＣＲ管は溶
出液及びマスターミックスのピペッティングの後、閉じられたままであり、これ
は効果的に汚染の危険性を減らす。

【０１４６】その上、異なるウイルス種についてのプライマー及びプローブ・セット（つま
り、異なる分析分子及び標的配列）を１つのマスターミックス中に組合わせて使
用する場合、検査を受けた個体のウイルス感染に依存した同時の多重増幅／検出
反応の実行が可能である。これはいわゆる多重アッセイの基礎である。

【０１４７】さらには、ＭＧＰの一般的性質に基づくサンプル調製により、サンプル中に存
在する全ての核酸は、配列の特徴とは無関係に粒子表面への物理化学的吸着によ
り抽出される。これは破裂させたヒトの血球、例えば白血球から放出されるヒト
ＤＮＡ（ｈＤＮＡ）をも含み、そのタイターは、血液サンプル提供者の個々の生
理学的又は病理学的状態により大きく異なる。例えばＳＬＥのような自己免疫疾
患の場合、ｈＤＮＡレベルは相当に上昇しているであろう。前述のように、与え
られたサンプル中に存在するｈＤＮＡ及び１以上の病因性核酸は共に抽出される
、異なる配列特異性のさまざまな核酸の混合物を形成する。それらはポリヌクレ
オチドのマトリックスを形成し、区別なく抽出され、その後には適切な反応条件
下、特異的なプライマー及びプローブを介した標的核酸の配列特異的な増幅及び
検出が続く。

【０１４８】ＳＬＥの場合、血漿中に４０００ng／mlのｈＤＮＡの、そして血漿１ml当たり
ウイルス・ゲノムＲＮＡ５０コピー、及びゲノムＲＮＡ当たり１００００ヌクレ
オチドの低いウイルス感染の病理的レベルが得られる。１ヌクレオチド当たり約
３２５ダルトン(１ダルトン＝１．６６×１０^-24ｇ）とすると、血漿１ml当たり
標的ＲＮＡ５０コピーつまり５０００００ヌクレオチドは約２．７×１０^-7ngと
なり、約１：１０⁺¹² の標的：非標的核酸の相対量をもたらす、さらに工程全体
を観察するために、人工の核酸構築物、好ましくは天然の標的と共に抽出され、
そして共に増幅される改変ウイルス粒子内に包まれ（外装され）、サンプルに加
えられうる。この内部標準（ＩＣ）は、識別しうる放射特徴を有する異なるレポ
ーター基の点で標的特異性プローブと異なるＩＣ検出プローブのための特有のプ
ローブ結合領域が特色となっている。したがって、ＩＣシグナルは標的シグナル
から識別されうる、そして上記ＩＣはサンプル中に存在することが知られている
ので、観察物質として機能しうる。このように、多重ラベルは多重アッセイ・テ
クノロジーの有用性を広げる。前記内部標準（ＩＣ）は、ＷＯ９８／００５４７
に記載されている。

【０１４９】７．２．２実験プロトコール７．２．２．１試薬７．２．２．１．１サンプル調製前記（実施例７．１．２＝＞屋内設置型抽出器による自動化プロトコール）を
参照のこと。

【０１５０】７．２．２．１．２５′ヌクレアーゼ・アッセイ、反応物及び反応条件

【０１５１】

【表５】

【０１５２】 ^* グリセロールの残りを、酵素ＺＯ５（Ｔｔｈ−ＤＮＡポリメラーゼの突然変
異タンパク質）及びＵＮＧ（ウラシル−Ｎ−グリコシダーゼ）を介して加える。

【０１５３】全ての試験パラメーターに関する全般的な複合温度リサイクルの概要は以下の
とおりである：

【０１５４】

【表６】

【０１５５】

【表７】

【０１５６】ＤＮＡポリメラーゼ−アプタマー複合体の融解温度＝５１．７℃（＝５０％解
離）化学的誘導体化用語いくつかのオリゴヌクレオチドは、アルキルホスファチジル・リンカーに共役
したペンタメチン−ジ−インドカルボシアニン（Pharmacia Biotech Cy5-N-ホス
ホルアミド酸エチル）であるＣｙ５により誘導体化され、そして消光剤（Ｑ）；
λ_EX＝６３０nm、λ_EM＝６６５nmとして機能する。いくつかのオリゴヌクレオチ
ドは、２−（アミノ−シクロヘキシル−）プロパン−１，３−ジオール・リンカ
ーと共役した６−カルボキシ−フルオレッセイン（Biogenex, CX-FAM-ホスホル
アミド酸）であるＦＡＭにより誘導体化され、そして標的に対するレポーター（
Ｒ）；λ_EX＝４８５nm、λ_EM＝５１５nmとして機能する。いくつかのオリゴヌク
レオチドは、２−（アミノ−シクロヘキシル−）プロパン−１，３−ジオール・
リンカーに共役したヘキサクロロ−６−カルボキシ−フルオレッセイン（Biogen
ex, CX-HEX-ホスホルアミド酸）により誘導体化され、そして内部標準に対する
レポーター（Ｒ）；λ_EX＝５３０nm、λ_EM＝５８５nmとして機能する。

【０１５７】７．２．２．１．４反応条件反応条件を実験結果の中に記載する（実施例７．３を参照のこと）。

【０１５８】７．２．２．１．５他の材料 − ウイルス陰性血漿（０−マトリックス（0-Matrix)、単一血漿又は貯留血
漿）、例えばクエン酸血漿又はＥＤＴＡ血漿 − ウイルス陽性血漿又はウイルス含有培養上清、これらは適切な割合で０− マトリックスと混合することにより特定のウイルス力価に調節するために使用されうる。

【０１５９】 − あるいは：調査されるべき標的配列を有するインビトロ転写産物 − ヒト胎盤ＤＮＡ（ａ．ゲノムＤＮＡ、Ｓｉｇｍａｃａｔ．ｎｏ．Ｄ４６４２；ｂ．断片化ＤＮＡ、Ｓｉｇｍａｃａｔ．ｎｏ．Ｄ３２８７）、細胞内物質の促進された放出をもたらし、そしてそれにより血中ＤＮＡ／ＲＮＡレベルが高められた病理的状況、例えばＳＬＥ又は溶血といった自己免疫疾患）をまねるためにサンプルに加えた。

【０１６０】７．３機能試験の結果７．３．１実験１ＥＪ／ＣＥＲＡＣタイプの、それぞれ異なるＭＧＰサンプルを７．１に記載の
方法により調査する。試験の変数はスプレー圧とした：ＥＪ０１００．５Ｒ−１．５bar ＥＪ０１０６．５Ｒ−２．５bar ＥＪ０１０７．５Ｒ−３．５bar ＥＪ０１０８．５Ｒ−４．３bar スプレー圧の減少により、すなわち平均ビーズ直径が小さくなる方向に向かう
と、非特異的結合（ＵＳＢ）が減少するのに対して、シグナル対ノイズ比を上昇
させる高い特異的シグナル産生を変化させないことを証明できた。

【０１６１】ウイルス力価調製用０．５×ＧＧはＨＢＶの場合、約１００sgu ／ml(sgu＝シ
グナル産生単位）であり、そしてＨＩＶの場合、約１５０sgu ／mlである。デー
タを表７に概要として示す。

【０１６２】７．３．２実験２それぞれＥＪ／ＭＭＢ及びＥＪ／ＣＥＲＡＣの各２の変異型を複合貯留（ＭＰ
）及び個体（ＰＬ）血漿サンプルとの結合において、実施例７．２に記載の方法
を用いて機能の上で比較する。ＥＪ００４７．２Ｒ（ＭＭＢ）及びＥＪ０１００
．５Ｒ（ＣＥＲＡＣ）は標準的な条件下、すなわち１．５bar 、２３０℃の噴射
口温度及び約１１０℃の出口温度でスプレーされる。ＥＪ０１０２．２Ｒ（ＭＭ
Ｂ）及びＥＪ０１０８．５Ｒ（ＣＥＲＡＣ）は、スプレー条件（噴射口温度を２
００℃〔ＭＭＢ〕まで下げ、そしてスプレー圧を４．３bar 〔ＣＥＲＡＣ〕まで
上げた）に関する発展的変異型である。結果は表８に概要として示され、より早
いしきいサイクル及び／又は大きなシグナルの差異（飽和シグナルからノイズを
引いたレベルＳ−Ｎ）により例示されるより高い感度を獲得するためのＣＥＲＡ
Ｃナノ核粒子の性能を示す。

【０１６３】７．３．３実験３ＥＪ／ＭＭＢ及びＥＪ／ＣＥＲＡＣタイプのいくつかのＭＧＰ調製物（表９を
参照のこと）を実施例７．２に記載の方法を用いて機能の上で比較する。結果は
表１０に概要として示され、そしてより早いしきいサイクル又は個々のアッセイ
に関係のないより高いヒット率により例示されるより高い感度を獲得するための
ＥＪ００９６．５Ｒ−０１型粒子の性能を示す。

【０１６４】７．３．４実験４ＥＪ／ＭＭＢ及びＥＪ／ＣＥＲＡＣタイプのいくつかのＭＧＰ調製物を吸着の
ためのインキュベーションが振り混ぜながらか又はそれなしに実施されるかで、
実施例７．１に記載の方法を用いて機能の上で比較する。それについて、沈殿速
度が決め手となる、すなわち沈殿速度が早いほど分析物との相互作用から外され
、沈殿物を形成する粒子の数が多くなる。それに反して、沈殿速度が遅い場合、
液体からの分析物分子が吸着剤表面に吸着されうる時間はより長くなる。結果は
１１（ＥＪ００４７．２Ｒを基準として用いた）に概要として示され、機械的撹
拌をともなわないときの性能の損失は、ＭＭＢの場合に最も高く（＞４０％）（
本願発明の特徴とは著しく異なる）、そしてＣＥＲＡＣの場合に最も低いか又は
実質的に損失していない（この組の中で本発明の特徴に最も近い）。

【０１６５】異なるタイプのＭＧＰの機能性を徹底的に評価できるようにするために、性能
指標を以下の方法により各タイプについて計算した： → 各タイプのＭＧＰについていくつかのバッチの溶出液、及び各力価レベル
のそれぞれを１つの溶出液プールに貯める。

【０１６６】 → 各溶出液プール中から、３の増幅を各アッセイ（ＨＩＶ，ＨＣＶ，ＨＢＶ
）について行った。

【０１６７】 → 各増幅産物を変更したＥｌｅｃｓｙｓ１０１０（商標）により単回で計
測した。

【０１６８】 → シグナルをＭＧＰの各タイプ、アッセイ、及び力価レベルについて平均す
る。

【０１６９】 → シグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）因子をＭＧＰの各タイプ、及びアッセイのそ
れぞれについて計算する、すなわち０−マトリックス（陰性）について低い力価
（弱い活性）、及び０−マトリックスについての上昇した力価。

【０１７０】 → Ｓ／Ｎ因子をそのときどきにＭＧＰの基準タイプに対して正規化する。

【０１７１】 → ＭＧＰの各タイプ、全てのアッセイの累積、及び力価レベルについての正
規化Ｓ／Ｎ因子の合計；感度の側面を明言するために、低い力価範囲に関するＳ
／Ｎ因子を高い力価レベルのそれに関連して２倍に加重する。

【０１７２】 → 得られた合計は、調査された各タイプのＭＧＰに関する性能指標を定める
。

【０１７３】７．３．５実験５さまざまなタイプのＭＧＰを、１０mmol／ｌトリス，pH８．０、１mM ＥＤＴ
Ａ、２０μｇ／ml ポリＡ−ＲＮＡ、及び０．０５％ＮａＮ₃ を含む希釈液中
にさまざまな力価レベルまで希釈され、そして貯留血漿中にスパイクされたＨＣ
Ｖインビトロ転写産物の抽出に使用した。

【０１７４】ヒト・バックグラウンドＤＮＡ（ｈＢＧ−ＤＮＡ）をそれぞれのサンプルに０
又は４０００ng／mlでスパイクした。驚いたことに、表１２に提示したデータに
より証明されるとおり、ビーズを選択することによりｈＢＧ−ＤＮＡによる干渉
の減少が可能である。

【０１７５】７．３．６実験６さまざまなタイプのＭＧＰをＨＣＶ陽性血漿サンプル処理のために使用した。
ヒト・バックグラウンドＤＮＡ（ｈＢＧ−ＤＮＡ）をそれぞれのサンプルに０又
は４０００ng／mlでスパイクした。再び、ビーズ・サイズ及びビーズ形状の顕著
な影響が観察されている。本発明によるＭＧＰ特性を最もよく表すＭＧＰ調製物
ＥＪ００９６．５Ｒは、表１３に提示したデータにより示されるとおり、ｃｔ値
の最小限の移動、及び特異的シグナル産生（Ｓ−Ｎ）の損失の減少の両方に関し
て非常にはっきりとした利点を示す。

【０１７６】

【表８】

【０１７７】

【表９】

【０１７８】

【表１０】

【０１７９】

【表１１】

【０１８０】

【表１２】

【０１８１】

【表１３】

【０１８２】

【表１４】

【０１８３】

【表１５】

【０１８４】

【表１６】

【０１８５】

【表１７】

【０１８６】

【表１８】

【０１８７】

【表１９】

【０１８８】

【表２０】

【０１８９】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ゾル合成及びスプレードライによる製造に関するフロー図。

【図２】未処理ＭＧＰの調製に関するフロー図。

【図３】Ｎｕｂｉｌｏｓａによるスプレー・ドラヤー生産の概略図。詳細を実施例１．
３以降の本明細書中に記載する。

【図４】Ｍｅｒｃｋ色素ＢＭによるＭＧＰの高解像走査型電子顕微鏡画像。

【図５】ＣＥＲＡＣ色素によるＭＧＰの高解像走査型電子顕微鏡画像。

【図６】Ｍｅｒｃｋ色素ＭＭＢによるＭＧＰの高解像走査型電子顕微鏡画像。

【図７】Ｓｔｒｅｍ色素によるＭＧＰの高解像走査型電子顕微鏡画像。

【図８】ＢＡＳＦ色素ＦＡによるＭＧＰの高解像走査型電子顕微鏡画像。

【図９】ＢＡＳＦ色素ＣＥ−ＨＱによるＭＧＰの高解像走査型電子顕微鏡画像。

【図１０】ＢＡＳＦ色素ＣＥ−ＳＵによるＭＧＰの高解像走査型電子顕微鏡画像。

【図１１】ＲＮＡ分離に対する磁性核色素又はスプレー・ドライヤーの影響（スプレー・
ドライヤー：Ｂｕｅｃｈｉ（Ｂ）又はＮｕｂｉｌｏｓａ（Ｎ））。

【図１２】ＤＮＡ又はＲＮＡ分離に対するパラメーター「スプレー圧」の影響。

【図１３】ＲＮＡ分離に対するさまざまなＭＧＰ製造パラメーターの影響（スプレー圧、
（Ｌ＝空気、Ｎ＝窒素）、噴射口温度（Ｅ）又は出口温度（Ａ））。

【図１４ａ】さまざまな懸濁媒質における種々のＭＧＰｓの沈殿特性。

【図１４ｂ】さまざまな懸濁媒質における種々のＭＧＰｓの沈殿特性。

【図１５】サンプルＥＪ００９６．５Ｒ−０１のＨＲＥＭ画像；ＣＥＲＡＣ色素によるＭ
ＧＰ。

【図１６】ＥＪ０１００．５Ｒ−０１のＨＲＥＭ画像、低圧及び高温でスプレーされ、主
に変形したμ−スケールの粒子により構成される。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年５月３０日（２００２．５．３０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０３Ｃ 14/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ５Ｅ０４０Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｈ０１Ｆ 1/06 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＣＡ，ＣＺ，ＨＵ，ＪＰ，ＰＬ，ＳＫ，ＵＳ (72)発明者ガイガー，アルベルトドイツ連邦共和国，82377 ペンツベルク，アーオルンシュトラーセ 66 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR55 QR62 QR82 QS25 QS36 QX02 4G014 AH02 AH06 4G062 AA13 BB04 BB05 CC08 DA03 DA04 DA05 DA06 DA07 DB01 DB02 DB03 DB04 DC01 DC02 DC03 DC04 DD01 DE01 DF01 DF02 DF03 DF04 EA01 EB01 EB02 EB03 EB04 EC01 EC02 EC03 EC04 ED01 ED02 ED03 ED04 EE01 EE02 EE03 EE04 EF01 EG01 EG02 EG03 FA01 FB01 FB02 FC01 FD01 FE01 FF01 FG01 FH01 FJ01 FK01 FL01 GA01 GB01 GC01 GD01 GE01 HH01 HH03 HH04 HH05 HH07 HH09 HH11 HH12 HH13 HH15 HH17 HH20 JJ01 JJ03 JJ04 JJ05 JJ07 JJ10 KK01 KK03 KK05 KK07 KK10 MM13 MM29 NN32 4G072 AA35 AA38 BB05 BB07 BB14 BB15 DD04 GG02 JJ26 4G075 AA27 BA10 CA02 DA02 EA06 EB01 EC01 5E040 AB03 BC01 BC08 CA01 HB14 HB17 NN01 NN05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】その磁性ガラス粒子が、５〜５００nmの平均直径を有する少
なくとも１の磁性体を含む磁性ガラス粒子組成物。
【請求項２】前記磁性体が１０〜２００nm、好ましくは１５〜５０nmの平
均直径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】イソプロパノール中、前記組成物の３mg／ml重量毎容量の懸
濁液の沈降の半減期が３分より長い、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】前記半減期が６分より長い、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】前記磁性体が２３nmの平均直径を有する、請求項１〜４のい
ずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】前記磁性体対ガラス殻の直径比が１対１０より小さい、請求
項１又は５に記載の組成物。
【請求項７】前記磁性ガラス粒子が０．５μｍ〜５μｍの平均直径を有す
る、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】前記磁性ガラス粒子が１μｍ〜２μｍの平均直径を有する、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】前記磁性ガラス粒子が微小孔性である、請求項１〜８のいず
れか１項に記載の組成物。
【請求項１０】前記磁性ガラス粒子の多孔質表面（pore surface）が表面
全表面の１０％未満である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】前記磁性体が超常磁性である、請求項１〜１０のいずれか
１項に記載の組成物。
【請求項１２】前記磁性体がフェリ磁性体又は強磁性体である、請求項１
〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】前記磁性体が鉄又は酸化鉄を含む、請求項１〜１２のいず
れか１項に記載の組成物。
【請求項１４】前記酸化鉄がＦｅ₃ Ｏ₄ 又はγ−Ｆｅ₂ Ｏ₃ である、請求
項１３に記載の組成物。
【請求項１５】前記磁性ガラス粒子が４ｍ² ／ｇより広い表面積を有する
、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】前記磁性ガラス粒子が５〜１００ｍ² ／ｇの、好ましくは
１０〜５０ｍ² ／ｇの範囲の、最も好ましくは１５〜３０ｍ² ／ｇの範囲の表面
積を有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】前記磁性ガラス粒子が基本的に球状である、請求項１〜１
６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】液体中に請求項１〜１７のいずれか１項に記載の磁性ガラ
ス粒子の組成物を含む懸濁液。
【請求項１９】前記液体がアルコールを含む、請求項１８に記載の懸濁液
。
【請求項２０】前記アルコールがイソプロパノール又はエタノールである
、請求項１９に記載の懸濁液。
【請求項２１】前記アルコールが７０％（ｖ／ｖ）エタノールである、請
求項１９に記載の懸濁液。
【請求項２２】前記液体が緩衝化水溶液である、請求項１８に記載の懸濁
液。
【請求項２３】前記溶液がトリス−ヒドロキシメチルアミン、リン酸、Ｎ
−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）又は
それらの塩により緩衝化されている、請求項２２に記載の懸濁液。
【請求項２４】前記溶液がイオン強度を変える物質又は金属錯体をさらに
含む、請求項２２又は２３に記載の懸濁液。
【請求項２５】前記懸濁液がＤＮＡ又はＲＮＡをさらに含む、請求項２２
〜２４のいずれか１項に記載の懸濁液。
【請求項２６】前記懸濁液がＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはその両方を、１
以上の、タンパク質、脂肪酸、炭水化物又はその他の生物物質の群から選ばれる
化合物との混合物としてさらに含む、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の
懸濁液。
【請求項２７】前記懸濁液がカオトロピック物質をさらに含む、請求項１
８〜２６のいずれか１項に記載の懸濁液。
【請求項２８】前記カオトロピック物質がヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナ
トリウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム又は
塩酸グアニジニウムから成る群から選ばれる、請求項２７に記載の懸濁液。
【請求項２９】前記カオトロピック物質が２〜８ mol／ｌ、そして好まし
くは４〜６ mol／ｌの濃度で存在する、請求項２８又は２９に記載の懸濁液。
【請求項３０】前記懸濁液が５〜６０mg／mlの請求項１〜１７のいずれか
１項に記載の組成物を含む、請求項１８〜２９のいずれか１項に記載の懸濁液。
【請求項３１】請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物又は請求項
１８〜３０のいずれか１項に記載の懸濁液を含む試験管。
【請求項３２】請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物又は請求項
１８〜３０のいずれか１項に記載の懸濁液を含む保存容器。
【請求項３３】請求項３１に記載の試験管又は請求項３２に記載の保存容
器を含む部品から成るキット。
【請求項３４】洗浄液又は溶出液をさらに含む、請求項３３に記載の部品
から成るキット。
【請求項３５】核酸の精製に好適な試薬をさらに含む、請求項３３又は３
４に記載の部品から成るキット。
【請求項３６】懸濁液の製造のための、請求項１〜１７のいずれか１項に
記載の組成物の使用。
【請求項３７】核酸の精製のための、請求項１８〜３０のいずれか１項に
記載の懸濁液の使用。
【請求項３８】核酸の精製のための、請求項３３〜３５のいずれか１項に
記載の部品から成るキットの使用。
【請求項３９】以下の：ａ）直径５〜５００nmを有する磁性体をゾルの中に懸濁し、ｂ）その懸濁液を２−ノズル・スプレードライヤーによりスプレードライし、
そしてｃ）そのスプレードライ粉末を焼結する、ステップを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の磁性ガラス粒子の組成
物の製造方法。
【請求項４０】前記２−ノズル・スプレードライヤーの噴射口（ｉｎｌｅ
ｔ）温度が１２０℃〜５００℃であり、出口（ｏｕｔｌｅｔ）温度がそのゾルの
沸点により選ばれ、そしてスプレー圧が少なくとも３bar である、請求項３９に
記載の方法。
【請求項４１】前記２−ノズル・スプレードライヤーの噴射口温度が１７
０℃〜２３０℃、好ましくは１９０℃〜２１０℃である、請求項３９又は４０に
記載の方法。
【請求項４２】前記２−ノズル・スプレードライヤーの噴射口温度が２０
０℃である、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】前記スプレー圧が４〜６bar である、請求項３９〜４２の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】前記ゾルが溶媒としてエタノールを含む、請求項３９〜４
３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】前記出口温度が５０℃〜３００℃である、請求項４４に記
載の方法。
【請求項４６】前記出口温度が９０℃〜１００℃である、請求項４４又は
４５に記載の方法。
【請求項４７】前記焼結温度が４００℃〜１２００℃、好ましくは７２０
℃〜７７０℃である、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の方法により得る
ことができる磁性ガラス粒子。
【請求項４９】以下の：ａ）その生物物質をそのガラス表面に直接結合する条件下、請求項１〜１７の
いずれか１項に記載の組成物、請求項４８に記載の磁性ガラス粒子又は請求項１
８〜３０のいずれか１項に記載の懸濁液との接触により液体内に生物物質を含む
サンプルをもたらし、そして、ｂ）その液体から生物物質を分離する、ことを含む生物材料の単離手順。
【請求項５０】前記生物物質が核酸である、請求項４９に記載の手順。
【請求項５１】前記生物物質が核酸の混合物を含み、ここで単独の又は複
数の標的核酸が少量で存在する、請求項４９に記載の手順。
【請求項５２】前記分離が磁石の助けにより果たされる、請求項４９〜５
１のいずれか１項に記載の手順。
【請求項５３】サンプルと接触させるとき、前記磁性粒子が磁化されてい
ない、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の手順。
【請求項５４】前記手順が自動化されている、請求項４９〜５３のいずれ
か１項に記載の手順。
【請求項５５】前記手順が高処理量様式である、請求項４９〜５４のいず
れか１項に記載の手順。
【請求項５６】前記手順の間に、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載
の懸濁液を保存容器から取り出し、そしてその懸濁液の１部を異なる反応容器に
加える、請求項４９〜５５のいずれか１項に記載の手順。
【請求項５７】前記核酸が精製の後に検出される、請求項４９〜５６のい
ずれか１項に記載の手順。
【請求項５８】前記核酸が増幅ステップの後に検出される、請求項４９〜
５７のいずれか１項に記載の手順。
【請求項５９】前記核酸を以下の：ａ）サンプルを標的核酸の領域に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、及
び同じ標的核酸配列鎖の、第１のオリゴヌクレオチドにより定義された核酸配列
を含まない第２の領域に相補的な配列を含む標識オリゴヌクレオチドと接触させ
、ハイブリダイゼーション条件の間に二本鎖の混合物を作り、ここで上記二本鎖
が、第１のオリゴヌクレオチドの３′末端が標識オリゴヌクレオチドの５′末端
に隣接するように第１のオリゴヌクレオチド及び標識オリゴヌクレオチドにアニ
ールした標的核酸を含み；ｂ）アニールした標識オリゴヌクレオチドを切断し、標識断片を放出するポリ
メラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性を可能にするのに十分な条件下、ステッ
プａ）の混合物と５′→３′ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存性核酸ポリメラ
ーゼを保持し；そしてｃ）前記標識オリゴヌクレオチドの加水分解により生じたシグナルを検出、及
び／又は計測する、ことを含む方法により検出する、請求項５７又は５８に記載の手順。
【請求項６０】前記検出がブロッキング・オリゴヌクレオチドの存在下で
行われる、請求項５８又は５９に記載の手順。
【請求項６１】前記ブロッキング・オリゴヌクレオチドがアプタマーであ
る、請求項６０に記載の手順。
【請求項６２】前記アプタマーが配列番号２３の配列をもつ、請求項６１
に記載の手順。
【請求項６３】増幅及び検出反応が多数の標的の同時検出のための均質溶
液相多重アッセイ（homogeneous solution-phase multiplex assay）様式で行わ
れる、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の手順。
【請求項６４】少なくとも５サイクルのポリメラーゼ連鎖反応法について
、アニーリング温度がポリメラーゼ−アプタマー複合体の解離温度を上回ること
８℃未満、好ましくは３℃未満である、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載
の手順。