JP4824312B2 - 微小孔物質、被分析物の局在化及び定量の方法、並びに被分析物の局在化及び定量用物品 - Google Patents
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Description
対象由来のサンプル中に存在する被分析物(analyte)の定量及び同定は、医学分野において重要である。特に、サンプルからの被分析物の定量及び同定は、多数の疾患の診断及び治療の大きな助けとなりうる。
液体サンプル中に存在する1以上の被分析物を分離するための組成物、方法、装置、及び機械が、本明細書中で記載される。一の態様では、該方法は、液体を微小孔物質(Microporous Material)から構成されるフィルターに通すことを含む。ここで被分析物は、微小孔物質の表面に局在化される。被分析物が微小孔物質上に局在された時点で、処理ステップ、例えばハイブリダイゼーション及び増幅が行われる。一の態様では、被分析物が微小孔物質上に局在された時点で、既知の体積を有するサンプル中の被分析物の濃度を検出するために、該被分析物は検出、計数、及び/又は相関される。
A.被分析物の分離及び分析のための組成物及び方法。
所定のサンプルから又は所定のサンプルにおいて被分析物を分離又は分析できることが所望される状況が多くある。被分析物は、例えばサンプル中で分析される標的物質のいずれかでありうる。例えば、疾患診断において、病原体又はその一部により産生される特定の被分析物が存在し、そして医師は、この被分析物の有無を使用して、患者が病原体に感染しているかどうかを決定する。この決定の型に影響する特性及びパラメーターが多くあり、例えば検出効力、検出方法がどの程度の感度であるか、病原体により産生される被分析物の量、分析を行うために必要とされるサンプル量、被分析物の安定性、サンプル中に存在するバックグラウンドとなる被分析物の量などである。検出の感度及び被分析物を検出できる簡便性を増大させる方法及び組成物は所望される。
開示された方法は、サンプル中の被分析物を局在化するために一般的に使用される。使用されうるサンプルであって、被分析物の源となりうるサンプルの多くの異なった類型が存在する。
1.サンプル
液体は、例えば開示されたフィルター又は微小孔物質を通過するように機能するので、サンプルは典型的には液体である。被分析物を含むサンプル液体は、溶液又は懸濁液、例えば分子的に溶解された物質の溶液又は流体力学的に懸濁された物質を含む。被分析物を含むサンプル液体は、生体液、例えば全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、精液、痰、気管支肺胞洗浄液、関節吸引液(joint aspirate)、又は創傷排膿液(wound drainage)を含む。使用されうる別のサンプル液は、細菌、ウイルス、真菌、胞子、細胞培養、糞便、動物組織又は細胞、野菜組織又は細胞、それらの溶解された成分、又はそれらの組合せを含む。被分析物を含む固体サンプルは、ホモジェナイズされうるか、又はそうでなければサンプルの分析を容易にする溶液中に入れられることが理解されるだろう。
サンプルは、しばしば既知の体積状態において利用されるであろう。既知の体積サンプルとは、サンプルの体積又は量が知られているサンプルである。典型的には、処理の間の幾つかの点でサンプル中に存在する被分析物の濃度を測定することを望む場合、さらにサンプル中に存在する被分析物の量が、サンプルの由来元の生物における被分析物の量に相関させる場合、既知の体積サンプルを使用することは重要である。例えば、対象内にどれだけの量のウイルス粒子が存在するかを知ることが所望される場合、血液サンプルなどのサンプルは、対象から取られうる。開示された方法及び組成物を使用して、この血液サンプルが分析され、そしてサンプル中に存在する被分析物の量が測定されうる。どれだけ多くの被分析物が対象中に存在するかを決定するために、既知の体積のサンプル中にどれだけ多くの分析物が存在するかを測定し、そして次にこれを、例えば対象の液体の全体積についての知見に基いて、対象中に存在する被分析物の量に当てはめることを必要とする。
示されたように、開示された組成物及び方法は、情報が所望される被分析物を取り扱うように、典型的に設計される。微小孔物質上への局在化に必要とされる性質を有する被分析物のいずれかは、標的されうるか又は取り扱われうる。
サンプルは、生物の組織のいずれの類型からも取得されうる。例えば、特定の状況では、例えば、組織が血である場合、組織は直接使用されうる。しかしながら、別の状況では、組織は収集され、そして次に例えばホモジェナイザー又は粉砕により、取り扱われうる。
細胞のいずれの類型は、被分析物として考えられうる。例えば、真核細胞及び原核細胞は、被分析物でありうる。被分析物でありうる真核細胞の例は、例えば哺乳動物細胞、爬虫類細胞、両生類細胞、及び鳥類細胞などの動物細胞、血液細胞、肝細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、脳細胞、骨細胞、神経細胞、免疫細胞、リンパ細胞、脳細胞、植物細胞、及び真菌細胞の全ての類型である。別の態様では、被分析物は、細胞の構成要素であることもあり、非限定的に、核、核膜、白色体、小胞体、リボソーム、染色体、細胞膜、ミトコンドリア、核小体、リソソーム、ゴルジ体、ペルオキシソーム、又は葉緑体を含む。
iii. 細菌
細菌の類型のいずれかは、被分析物でありうる。細菌の例は、非限定的にアビオトロフィア(Abiotrophia)、アクロモバクター(Achromobacter)、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)、アシドボラックス(Acidovorax)、アシネトバクター(Acinetobacter)、アクチノバシラス(Actinobacillus)、アクチノバクルム(Actinobaculum)、アクチノマデュラ(Actinomadura)、アクチノマイシス(Actinomyces)、アエロコッカス(Aerococcus)、アエロモナス(Aeromonas)、アフィピア(Afipia)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、アルカリゲネス(Alcaligenes)、アロイオコッカス(Alloiococcus)、アルテロモナス(Alteromonas)、アミコラタ(Amycolata)、アミコラトプシス(Amycolatopsis)、アナエロボスピリラム(Anaerobospirillum)、アナエロラブダス(Anaerorhabdus)、アラクニア(Arachnia)、アルカノバクテリウム(Arcanobacterium)、アクロバクター(Arcobacter)、アルスロバクター(Arthrobacter)、アトポビウム(Atopobium)、アウレオバクテリウム(Aureobacterium)、バクテロイデス(Bacteroides)、バルネアトリクス(Balneatrix)、バルトネラ(Bartonella)、ベルゲイェラ(Bergeyella)、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、ビオフィリア(Bilophila)、ブランハメラ(Branhamella)、ボレリア(Borrelia)、ボルデテラ(Bordetella)、ブラシスピラ(Brachyspira)、ブレビバシラス(Brevibacillus)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、ブレブンジモナス(Brevundimonas)、ブルセラ(Brucella)、ブルコルデリア(Burkholderia)、ブチアウゼラ(Buttiauxella)、ブチリビブリオ(Butyrivibrio)、カリマトバクテリウム(Calymmatobacterium)、カムピロバクター(Campylobacter)、カプノシトファーガ(Capnocytophaga)、カルジノバクテリウム(Cardiobacterium)、カトネラ(Catonella)、セデセア(Cedecea)、セルロモナス(Cellulomonas)、センチペダ(Centipeda)、クラミジア(Chlamydia)、クラミドフィラ(Chlamydophila)、クロモバクテリウム(Chromobacterium)、シセオバクテリウム(Chyseobacterium)、クリセオモナス(Chryseomonas)、シトロバクター(Citrobacter)、クロステリジウム(Clostridium)、コリンセラ(Collinsella)、コマモナス(Comamonas)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、コキセラ(Coxiella)、クリプトバクテリウム(Cryptobacterium)、デルフチア(Delftia)、デルマバクター(Dermabacter)、デルマトフィラス(Dermatophilus)、デスルフォモナス(Desulfomonas)、デスルフォビブリオ(Desulfovibrio)、ジアリスター(Dialister)、ジケルボバクター(Dichelobacter)、ドロシコッカス(Dolosicoccus)、ドロシグラヌルム(Dolosigranulum)、エドワードシエラ(Edwardsiella)、エゲルセラ(Eggerthella)、エクリキア(Ehrlichia)、エイケネラ(Eikenella)、エムペドバクター(Empedobacter)、エンテロバクター(Enterobacter)、エンテロコッカス(Enterococcus)、エルウィニア(Erwinia)、エリシペロスリクス(Erysipelothrix)、エスケリキア(Escherichia)、ユーバクテリウム(Eubacterium)、ユーインジェラ(Ewingella)、エキシグオバクテリウム(Exiguobacterium)、ファックラミア(Facklamia)、フィリファクター(Filifactor)、フラビモナス(Flavimonas)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、フランシセラ(Francisella)、フソバクテリウム(Fusobacterium)、ガルドネレラ(Gardnerella)、ベメラ(Gemella)、グロビカテラ(Globicatella)、ゴルドナ(Gordona)、ハエモフィラス(Haemophilus)、ハフニア(Hafnia)、ヘリコバクター(Helicobacter)、ヘロコッカス(Helococcus)、ホルデマニア (Holdemania)、イグナビグラヌム(Ignavigranum)、ジョンソネラ(Johnsonella)、キンゲラ(Kingella)、クレブシエラ(Klebsiella)、コクリア(Kocuria)、コセレラ(Koserella)、クルチア(Kurthia)、キトコッカス(Kytococcus)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ロートロピア(Lautropia)、レクレルシア(Leclercia)、レジオネラ(Legionella)、レミノレラ(Leminorella)、レプトスピラ(Leptospira)、レプトトリキア(Leptotrichia)、ルコノストック(Leuconostoc)、リステリア(Listeria)、リストネラ(Listonella)、メガスファエラ(Megasphaera)、メチロバクテリウム(Methylobacterium)、ミクロバクテリウム(Microbacterium)、ミクロコッカス(Micrococcus)、ミツオケラ(Mitsuokella)、モビルンカス(Mobiluncus)、モエレレラ(Moellerella)、モラキセラ(Moraxella)、モルガネラ(Morganella)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、ミロイデス(Myroides)、ネイセリア(Neisseria)、ノカルディア(Nocardia)、ノカルディオプシス(Nocardiopsis)、オクロバクトラム(Ochrobactrum)、オエスコビア(Oeskovia)、オリゲラ(Oligella)、オリエンティア(Orientia)、パエニバシラス(Paenibacillus)、ペントエア(Pantoea)、パラクラミジア(Parachlamydia)、パスツレラ(Pasteurella)、ペディオコッカス(Pediococcus)、ペプトコッカス(Peptococcus)、ペプトストレプトコッカス(Peptostreptococcus)、フォトバクテリウム(Photobacterium)、フォトラブダス(Photorhabdus)、プレシモナス(Plesiomonas)、ポルフィリモナス(Porphyrimonas)、プレボテラ(Prevotella)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、プロテアス(Proteus)、プロビデンシア(Providencia)、シュードモナス(Pseudomonas)、シュードノカルジア(Pseudonocardia)、シュードラミバクター(Pseudoramibacter)、シクロバクター(Psychrobacter)、ラネラ(Rahnella)、ラルストニア(Ralstonia)、ロドコッカス(Rhodococcus)、リケッチア(Rickettsia)、ロカリマエア(Rochalimaea)、ロセオモナス(Roseomonas)、ローチア(Rothia)、ルミノコッカス(Ruminococcus)、サルモネラ(Salmonella)、セレノモナス(Selenomonas)、セルプリナ(Serpulina)、セラチア(Serratia)、シュウェンネラ(Shewenella)、シゲラ(Shigella)、シムカニア(Simkania)、スラッキア(Slackia)、スフィンゴバクテリウム(Sphingobacterium)、スフィンゴモナス(Sphingomonas)、スピリラム(Spirillum)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ステノトロフォモナス(Stenotrophomonas)、ストマトコッカス(Stomatococcus)、ストレプトバチルス(Streptobacillus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、ストレプトマイシス(Streptomyces)、スクシニビブロ(Succinivibrio)、ステレラ(Sutterella)、ストネラ(Suttonella)、タツメラ(Tatumella)、ティシエレラ(Tissierella)、トラブルシエラ(Trabulsiella)、トレポネマ(Treponema)、トロフェリマ(Tropheryma)、ツァカムレラ(Tsakamurella)、ツリセラ(Turicella)、ウレアプラズマ(Ureaplasma)、バゴコッカス(Vagococcus)、ベイロネラ(Veillonella)、ビブリオ(Vibrio)、ウィークセラ(Weeksella)、ウォリネラ(Wolinella)、ザントモナス(Xanthomonas)、ゼノラブダス(Xenorhabdus)、イエルシニア(Yersinia)、及びヨケネラ(Yokenella)である。
ウイルスのいずれかの類型は、被分析物でありうる。ウイルスの例は、非限定的に1型単純ヘルペス・ウイルス(Herpes simplex virus type-1)、2型単純ヘルペス・ウイルス(Herpes simplex virus type-2)、サイトメガロウイルス(Cytomegalovirus)、エプステイン-バー・ウイルス(Epstein-Barr virus)、バリセラ-ゾスター・ウイルス(Varicella-zoster virus)、ヒト・ヘルペスウイルス6(Human herpesvirus 6)、ヒト・ヘルペスウイルス7(Human herpesvirus 7)、ヒト・ヘルペスウイルス8(Human herpesvirus 8)、バリオラ・ウイルス(Variola virus)、ベシクラー・ストマチチス・ウイルス(Vesicular stomatitis virus)、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、ライノウイルス(Rhinovirus)、コロナウイルス(Coronavirus)、A型インフルエンザ・ウイルス(Influenza virus A)、B型インフルエンザ・ウイルス(Influenza virus B)、メアスレス・ウイルス(Measles virus)、ポリマーウイルス(Polyomavirus)、ヒト・ポリオーマ・ウイルス(Human Papilomavirus)、呼吸器合胞体ウイルス(Respiratory syncytial virus)、アデノウイルス(Adenovirus)、コクサッキー・ウイルス(Coxsackie virus)、デング・ウイルス(Dengue virus)、ムンプス・ウイルス(Mumps virus)、ポリオウイルス(Poliovirus)、ラビエ・ウイルス(Rabies virus)、ラウス・サルコーマ・ウイルス(Rous sarcoma virus)、黄熱病ウイルス(Yellow fever virus)、エボラ・ウイルス(Ebola virus)、マルバーグ・ウイルス(Marburg virus)、ラッサ熱ウイルス(Lassa fever virus)、東部ウマ脳炎ウイルス(Eastern Equine Encephalitis virus)、日本脳炎ウイルス(Japanese Encephalitis virus)、セントルイス脳炎ウイルス(St. Louis Encephalitis virus)、ムライ渓谷熱ウイルス(Murray Valley fever virus)、西ナイル・ウイルス(West Nile virus)、リフト・バレー熱ウイルス(Rift Valley fever virus)、A型ロタウイルス(Rotavirus A)、B型ロタウイルス(Rotavirus B)、C型ロタウイルス(Rotavirus C)、シンドビス・ウイルス(Sindbis virus)、サル免疫不全ウイルス(Simian Immunodeficiency virus)、1型ヒトT細胞白血病ウイルス(Human T- cell Leukemia virus type-1)、ハンタウイルス(Hantavirus)、ルベラ・ウイルス(Rubella virus)、トリ免疫不全ウイルス(Simian Immunodeficiency virus)、1型ヒト免疫不全ウイルス(Human Immunodeficiency virus type-1)、ワクシニア・ウイルス(Vaccina virus)、SARSウイルス(SARS virus)、及び2型ヒト免疫不全ウイルス(Human Immunodeficiency virus type-2)、又はそれらの系統又は変種のいずれかを含む。
寄生虫のいずれかの類型は、被分析物でありうる。寄生虫の例は、非限定的に、トキソプラスマ・ゴンジー(Toxoplasma gondii)、プラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)、プラスモジウム・ビバクス(Plasmodium vivax)、プラスモジウム・マラリア(Plasmodium malariae)、別のプラスモジウム種、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)、トリパノソーマ・クルジー(Trypanosoma cruzi)、リーシュマニア・メジャー(Leishmania major)、別のリーシュマニア種、シストソーマ・マンソーニ(Schistosoma mansoni)、別のシストソーマ種、エンタモエバ・ヒストリティカ(Entamoeba histolytica)、又はそれらの系統又は変種のいずれかを含む。
タンパク質のいずれかの類型は、被分析物でありうる。例えば、タンパク質は、ペプチド又はタンパク質若しくはペプチドの断片を含みうる。タンパク質は、微小孔物質における孔サイズに依存するいずれかの長さであり、そして1以上のアミノ酸又はそれらのバリアントを含む。タンパク質(1つ又は複数)は、分析前にプロテアーゼ分解などにより断片化されうる。分析されるタンパク質サンプルは、サンプルの複雑度を低減するために分画又は分離されうる。断片化及び分画は、同じアッセイにおいて一緒に使用されうる。そうした断片化及び分画は、タンパク質分析を単純化及び拡張できる。
いずれかの類型の抗体は、被分析物でありうる。本明細書中で使用されるとき、「抗体」という用語は、非限定的に全てのクラスの全免疫グロブリン(つまり、未処理の抗体)、2又は多数の抗原又はエピトープ特異性を有するキメラ抗体及びハイブリッド抗体、並びにハイブリッド断片を含むF(ab’)2、F(ab’)、Fabなどの断片を包含する。こうして、抗体の特異的抗原に結合する能力を保持する抗体断片が提供される。例えば、結合活性を維持する抗体断片は含まれる。そうした抗体及び断片は、当該技術分野に周知である技術により作られうる。抗体を産生する方法及び特異性及び活性について抗体をスクリーニングする方法は、Harlow and Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988)を参照のこと。「抗体」という用語は、本明細書中で広い意味で使用され、そしてポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を含む。無傷の免疫グロブリン分子に加えて、これらの免疫グロブリン分子の断片又はポリマー、並びにヒト又はヒト化免疫グロブリン分子又はその断片もまた、「抗体」という用語の中に含まれる。例えば米国特許第4,704,692号に記載される抗原結合タンパク質(一本鎖抗体)と抗体断片の抱合体も、「抗体」の意味の中に含まれる。該文献の内容は、本明細書中に援用される。
抗原のいずれかの類型は、被分析物でありうる。本明細書中に使用される「抗原」は、投与された際、免疫応答を誘発でき、それにより抗原に特異的に結合する抗体の産生及び放出を刺激する物質を含む。抗原は、抗体により特異的に結合されて、抗原/抗体複合体を形成する分子及び/又は成分を含む。抗原の例は、非限定的にペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、DNA、RNA、多糖、それらの組合せ、それらの断片、又はそれらのミメティクスを含む。
真菌のいずれかの類型は、被分析物でありうる。真菌の例は、非限定的に、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、クリプトコッカス・ネオフォーマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラマ・カプスラツム(Histoplama capsulatum)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、コッシドデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、パラコシジオデス・ブラシリエンシス(Paracoccidiodes brasiliensis)、ブラストマイシス・デルミチジス(Blastomyces dermitidis)、ネモシスチス・カルニ(Pneomocystis carnii)、ペニシリウム・マルネッフィ(Penicillium marneffi)、及びアルテルナリア・・アルテルネート(Alternaria alternate)、並びにそれらの変種又はことなる系統を含む。
被分析物は、エフェクター分子でありうる。「エフェクター種」、「エフェクター」、及び「分子エフェクター」とも呼ばれる「エフェクター分子」は、エネルギーを仕事に、仕事をエネルギーに、仕事又はエネルギーを情報に、又は情報を仕事又はエネルギーに変換することができる選択された分子であり、非限定的に、シグナル-生成種、刺激-応答分子、応答-生成分子、酵素、合成酵素、薬剤、触媒抗体、触媒、収縮性タンパク質、輸送タンパク質、制御タンパク質、酸化還元タンパク質、酸化還元酵素、酸化還元メディエーター、シトクロム、電気活性化合物、光反応性化合物、超分子、超分子デバイス、及び形状-記憶構造、又はそれらのバリアント若しくは誘導体のいずれかを含む。
いずれの類型のリガンドは、被分析物でありうる。「リガンド」という用語は、親和性に基いた相互作用によりレセプターに特異的に結合できる分子である。リガンドは、非限定的に、レセプターアゴニスト、部分アゴニスト、混合アゴニスト、アンタゴニスト、応答-誘導又は刺激分子、薬、ホルモン、フェロモン、伝達物質、オータコイド、成長因子、サイトカイン、補欠分子族、補酵素、コファクター、基質、前駆物質、ビタミン、トキシン、制御因子、抗原、ハプテン、炭水化物、分子擬態、プリント(print)分子、構造分子、エフェクター分子、選択分子、ビオチン、ジゴキシゲニン、及びコンジナー、交差反応物質、アナログ、コンペティター、又はそれらの分子の誘導体、並びにライブラリーから選ばれた分子であって選ばれた標的に特異的に結合できる分子、及びこれらの分子のいずれかを第二の分子に付着させることにより形成された抱合体、又はそれらの誘導体又はバリアントを含む。
被分析物は、レセプターでありうる。「レセプター」という用語は、親和性に基く相互作用によりリガンドに特異的に結合できる分子である。「レセプター」は、非限定的に、生物学的、合成の、又は遺伝子組換えにより作られた膜レセプター、ホルモン・レセプター、薬物レセプター、伝達物質レセプター、オータコイド・レセプター、フェロモン・レセプター、刺激応答カップリング又は受容性分子、抗体、抗体断片、遺伝子組換えされた抗体、抗体模倣物又はミメティクス、分子模倣物、分子インプリント、分子認識単位、接着分子、凝集素、レクチン、セレクティング(selecting)、細胞レセプター、アビジン及びストレプトアビジン、及びコンジェナー、アナログ、コンペティター、又はそれらの分子の誘導体、並びに非オリゴヌクレオチド分子であって、例えばコンビナトリアル方法及び/又はライブラリースクリーニングにより、別の選択された分子に特異的に結合するように選ばれる分子、及びこれらの分子のいずれかを第二分子に付着させることにより形成される抱合体を含む。レセプターは、さらに、構造分子、エフェクター分子、及びリガンドを含む選択分子、或いはその誘導体又はバリアントのいずれかを特異的に認識することができる選択分子をさらに含む。
xiii. シグナル生成分子
被分析物は、シグナル生成分子でありうる。「シグナル生成分子」及び「シグナル生成種」は、検出できるシグナルを生成するか、物質の検出性を高める若しくは調節するか、或いは物質のエネルギー、活性、出力、若しくはシグナルを、定性的、定量的又は検出可能な異なるエネルギー、活性、出力、シグナル、状態、若しくは形態に変換することができる分子である。或いは、シグナル-生成分子は、標的分子と相互作用でき、局在できる被分析物を生成する。シグナル-生成分子は、非限定的に、分子、分子群、抱合体及び複合体であって、検出可能な(及び場合により染色された、改変された、結合された、標識された、又は誘導体化された)タグ、トレーサー、ラジオアイソトープ、ラベル、レポーター、ポリマー、集光複合体、アンテナ構造、天然及び合成の並びにバイオミメティックの光合成分子、反応中心、光化学系、シグナル伝達経路、分子カスケード、巨大分子、微小粒子、ナの粒子、コロイド、金属、色素、フルオロフォア、蛍光体、及び別の光子吸収体、光子放出体、及び感光性分子を含むもの、例えば、別の分子又は基の光子吸収又は光子放出性質を増強、減弱、転調、又は消光する分子、エネルギー転移ドナー及びアクセプター、酵素、補酵素、コファクター、触媒抗体、合成酵素及び触媒、分子模倣物及びミメティクス、発光、摩擦発光、音発光、電気発光、化学発光、及び生物発光分子、電子伝達ドナー及びアクセプター、酸化及び還元化合物、メディエーター及び別の電気活性分子、代謝性、光活動性、シグナル及びシグナル処理分子であって、生物学的及び生物ミメティックのプロセス及びシステムにおいてエネルギーを捕捉及び伝達するために使用される分子、例えば場合により天然、合成、ミメティック骨格を含み、組織的及びカップリング分子、シャペロン及びアクセサリー生物又バイオミメティック分子、或いは第一の形態のエネルギー又は情報を第二の形態のエネルギー又は情報への変換に関わる分子群を含む。
被分析物は、構造分子のいずれかでありうる。実施例は、非限定的に、元素、原子、分子、イオン、及び化合物であって、表面、親水・疎水の両性表面(amphibious surfaces)、無機及び有機金属、例えば炭素、シリコン、ガラス、有機及び無機結晶、選択された溶媒、選択された溶質、天然の、バイオミメティックの、及び合成のナノ構造及び微小構造、ファイバー、フィラメント、シルク、分子骨格、ナノチューブ、ナノロッド、フラーレン、バッキーボール、ダイヤモンド様分子、半導体、絶縁体、金属、プラスチック、エラストマー、ポリマー、界面活性剤、潤滑剤、ワックス、オイル、粉末、フィラー、賦形剤、繊維、錠剤化成分、パッケージング物質、紙、工業用プラスチック、環状及び多環分子、デンドロン、デンドリマー、電解質、及び多価電解質、塩、炭化水素、セラミックス、及び生物の、生物適合の、生物ミメティックの、生分解性の、及び刷り込み可能な(Imprintable)モノマー、マルチマー、及びポリマー、例えば脂肪酸、脂質、界面活性剤、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリアミン、ポリ酸、糖、スターチ、セルロース、グリコシル化分子、グリコポリマー、及びそれらの抱合体を含むものを含む。
xv. イオン
被分析物は、いずれのイオンでありうる。イオンの例は、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、遷移金属イオン、又はランタノイド金属イオンを含む。一の態様では、キレートは、イオンを含むサンプルへと加えられ、局在化の前に、イオン/キレート複合体を形成する。この態様では、イオン、キレート、及び/又はイオン/キレート複合体は、被分析物である。別の態様では、キレートは、イオンと相互作用できる微小孔物質の表面付近に共有結合されうる。
xvi. 核酸被分析物
一の態様では、被分析物は核酸である。デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、及びペプチド核酸(PNA)は、重合体であり、特定の条件下で水溶液中に可溶性の多イオン性分子である。pH、イオン強度、対イオン、電荷中和、水和、有機沈殿、分子組成物などに応じた溶液中における核酸の推定の三次元構造は、当業者に周知である。一の態様では、核酸は、一本鎖又は二本鎖DNA又はRNAでありうる。
xvii. 核酸及び関連分子
核酸は、塩基部分、糖部分、及びリン酸エステル部分を含む分子である。ヌクレオチドは、ヌクレオシド間の結合を作るリン酸エステル部分及び糖部分を介して結合されうる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン-9-イル(A)、シトシン-1-イル(C)、グアニン-9-イル(G)、ウラシル-1-イル(U)、及びチミン-1-イル(T)でありうる。ヌクレオチドの糖部分は、リボース又はデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸エステル部分は、5価リン酸エステルである。ヌクレオチドの非制限的な例は、3'-AMP(3’-アデノシン・一リン酸)又は5’-GMP(5’-グアノシン一リン酸)である。
ろ過は、フィルターの流路寸法に対する分子の大きさに主に基く分離方法と考えられる。ろ過は、微小孔物質の孔の寸法が小さく均一であるためフィルターの入口表面上でろ過が主に起こる表面ろ過、或いは微小孔物質の孔が蛇行経路構造を有し、そして粒子をフィルターの深部にトラップする深部フィルターに一般的に分類される。
4. 表面
微小孔物質は、多くの異なる表面を有する。例えば、平面的表面、外部表面、内部表面、及び湿表面がある。微小孔物質から構成されるフィルターの模式図は、図1a及び1bにおいて図示される。図1aは、微小孔物質100を示すフィルターの上面図であり、ここで110は、微小孔物質における多数の穴又は孔のうちの一つをあらわす。これらの穴は、均一の間隔又は大きさである必要はないが、多くの実施態様では、均一の間隔又は大きさである。フィルターに付随する多くの異なる表面が存在する。図1bは、微小孔物質を有するフィルターの断面図である。例えば、微小孔物質の外部表面130により作られる平面、並びに複数の孔及び穴に起因する開口部110により定義される平面的表面120が存在する。内部表面140は、微小孔物質を貫通するチャネル150により形成される。
i. 局在
被分析物が、本明細書中に記載される微小孔物質のいずれかと接触されるとき、微小孔物質は、被分析物が微小孔物質中に入り込むこと及び微小孔物質を通り抜けることを妨げるか又は阻害する。微小孔物質は、被分析物と相互作用して、微小孔物質を通した被分析物の分子崩壊を実質的に妨げる。一の態様では、表面ろ過は、被分析物を迅速に局在化し、そして濃縮するために使用されうる。表面ろ過の効率は、種々のパラメーター、例えば、被分析物対孔サイズ比、ろ過される液体中の不純物の組成、及び被分析物と表面との相互作用に左右されるであろう。
「局在化」という用語はまた、微小孔物質の表面付近に被分析物質を固定化することを含む。本明細書中で使用される「固定化」という用語は、計数されるのに十分長い時間微小孔物質の表面付近の特異的領域に被分析物を制止することとして定義される。一の態様では、被分析物は、特異的検出期間の間、1μm3の領域に固定化される。「局在化」という用語はまた、被分析物を微小孔物質の表面付近に濃縮することも含む。本明細書中に使用される「被分析物の濃縮」は、濃縮された被分析物の純度に関わらず、決められた領域で、微小孔物質の表面付近に被分析物を集積することとして定義される。被分析物が、微小孔物質の表面付近に局在される場合、被分析物は、可逆的に又は非可逆的に微小孔物質に結合されうる。被分析物が「可逆的に」結合される場合、被分析物の大部分が、微小孔から取り外されうる。逆に、被分析物が「不可逆的に」結合される場合、被分析物の大部分を微小孔物質から取り外すことができない。
一の態様では、被分析物の局在化を手助けするために、様々な無機塩は、場合によりサンプル溶液中に使用されうる。例えば、NaClなどの塩又はグアニジニウム・イソチオシアネート、グアニジニウム・ヒドロクロリドなどを含むカオトロピック塩は、望まれるとき、サンプル溶液中にも使用されうる。一の態様では、使用される塩の濃度は、2M未満、例えば1.8M、1.6M、1.4M、1.2M、1.0M、0.8M、0.6M、0.4M、0.2M、0.1M、0.05Mでありうる。ここで、濃度のいずれかは、別の濃度とともに範囲を形成しうる(例えば0.1M〜1.8M)。
本明細書中で使用される「微小孔物質」という用語は、複数の孔、穴、及び/又はチャネルを有する物質のいずれかである。この微小孔物質は、液体が、物質を通過して流れるか又は物質内に流れることを可能にする。微小孔物質は、1ミクロン未満の寸法を有する小さく均一であり、高密度である穴又は孔を一般的に有する。微小孔物質は、局在された被分析物を分析するために使用される特定の検出技術に応じて、場合により可視光、紫外線、又は赤外線に対し透過型でありうる。微小孔物質は、該物質を通した早い水の流れを可能にするため親水性でありうる。微小孔物質は、望まれる場合、場合により不透明(opaque)でありうる。微小孔物質は、簡単な取り扱いのため良好な機械的強度、低い非特異性結合、及び被分析物と比較的反応しない性質を有する。本明細書中で使用される「微小孔物質」という用語は、以下に記載される複合体及び改変微小孔物質のいずれかを含む。
市販される微小孔物質のいくつか、例えばアノポア無機酸化物膜は、低い自己蛍光を有した。しかしながら、幾つかの用途では、少量の自己蛍光でさえ有害である。例えば、蛍光顕微鏡は、生物学的及び形態学的分析において広く使われる強力な分析ツールである。弱い蛍光標本は、並外れて低い自己蛍光を伴う表面、例えば処理融合シリカ、ガラス、またはクリスタリン・シリコン上で調製されなければならない。直接ろ過表面上の小粒子(例えば、細胞、ビリオン、核酸、など)の蛍光分析は、典型的にろ過膜自己蛍光により制限される。無機酸化微小孔物質は、ポリマー製の膜よりずっと低い自己蛍光を示すが、該自己蛍光は、弱い蛍光粒子の分析には高すぎることもある。
本明細書中で使用される「複合体」という用語は、2以上の物質から構成される製品である。材料の選別に依存し、材料は、複合体を作り出すために互いに反応することもあるし、又は反応しないこともある。一の態様では、複合体は、微小孔物質及びピグメントから構成される。本明細書中で使用される「ピグメント」という用語は、微小孔物質の光学的性質を改変する化合物のいずれかである。ピグメントは、微小孔物質中に取り込まれる。本明細書中に使用される「微小孔物質中に取り込まれる」という用語は、ピグメントを微小孔物質に付着する方法のいずれかとして定義される。ピグメントの微小孔物質への付着は、共有結合、イオン性相互作用を介してなされ、微小孔物質の孔によるピグメントのトラップ、又はピグメントを微小孔物質の表面付近及び/又は微小孔物質の内部表面に沈積することによる。ピグメントは、微小孔物質の湿表面のいずれか上に取り込まれうる。本明細書中に記載される複合体のいずれかは、本明細書中に記載される物品、方法、又はキットのいずれかに使用されうる。
被分析物が微小孔物質上に局在化されると、当業者に周知の技術を使用してさらに処理されうる。以下の技術は、例示であり、そして行われる異なる類型の技術に制限することを意図されない。
一の態様では、被分析物が核酸である場合、局在された核酸は、非限定的にポリメラーゼ・チェーン反応、核酸配列に基いた増幅、イソサーマル方法論、リガーゼ・チェーン反応、及びストランド置換増幅を含む増幅技術を使用して分析された。米国特許第4,683,195号;第4,683,202号;第4,965,188号;第5,130,238号;第5,354,668号;第5,427,930号;及び第5,455,166号において開示される増幅技術のいずれかは、本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて使用されうる。これらの文献は、その全てを本明細書中に援用される。使用される増幅技術に依存して、核酸の特定の領域又は核酸全体は、増幅されうる。一の態様では、被分析物が、微小孔物質の表面付近に不可逆的に局在化される場合、増幅は、微小孔物質の表面付近で起こる。別の態様では、被分析物が可逆的に微小孔物質の表面付近に局在化される場合、増幅は、微小孔物質の表面付近でおこるか及び/又は被分析物が微小孔物質の表面付近にもはや存在しない溶液中で起こる。
(a)増幅された核酸を作り出すために既知の体積を有する液体サンプル中で核酸を増幅し、そして
(b)増幅された核酸を含むサンプルを、本明細書中に記載される微小孔物質のいずれかに通すこと
により増幅される。ここで該増幅された核酸は、複合体の表面付近に局在される。
(a) 既知の体積を有し、核酸を含む液体サンプルを、本明細書中に記載されるいずれかの微小孔物質に通し、ここで該核酸は、複合体の表面付近に局在され、そして
(b) 該核酸を増幅すること
により増幅される。
以下は、本明細書中に開示されるハイブリダイゼーション/同定方法において使用されうる化合物の異なる類型について論じる。
i. 配列
本明細書中に開示されるハイブリダイゼーション/同定方法で使用されうる様々な配列が存在し、これらの全ては、核酸又によりコードされるか、又は核酸である。これらの遺伝子のヒトアナログ、並びに別のアナログ、及びこれらの遺伝子のアレル、及びスプライスバリアント及び別のバリアントの類型は、ジェンバンク(Genbank)を含む様々なタンパク質及び遺伝子データーベースにおいて利用できる。この出願の出願時にジェンバンクで利用できる配列は、その全て並びにその中に含まれる個々のサブシーケンスを本明細書中に援用される。ジェンバンクには、http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgiでアクセスできる。当業者は、配列の相異及び違いの決定の仕方、及び特定の配列を別の関連配列と関連付ける組成物及び方法の調節の仕方を理解する。プライマー及び/又はプローブは、本明細書中に開示されそして当該技術分野に周知である情報を与えられた既知配列のいずれかについて設計されうる。
機能性核酸とは、例えば、標的分子を結合し又は特異的反応を触媒するなどの特別な機能を有する核酸分子である。機能性核酸分子は、以下のカテゴリーに分類されうる。このことは制限することを意味しない。例えば、機能性核酸は、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、トリプレックス形成分子、及び外部のガイド配列を含む。機能性核酸分子は、標的分子により所有される特異的活性のアフェクター、阻害因子、調節因子、及び刺激因子として作用しうるか、又は該機能性核酸分子は、いずれの別の分子とは独立した新規の活性を有する。
a. 抗体全般
「抗体」という用語は、広い意味で本明細書中で使用されており、そしてポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方を含む。未処理の免疫グロブリン分子に加えて、これらの免疫グロブリン分子の断片若しくはポリマー、及びヒト又はヒト化バージョンの免疫グロブリン分子若しくはそれらの断片は、「抗体」という用語の中に含まれる。抗体は、本明細書中に開示されるin vitroアッセイを使用して、又はそれらのin vivo治療及び/又は予防活性が該試験の後に既知の臨床試験方法に従って試験される類似の方法によりそれらの所望の活性について試験されうる。
キメラ抗体において、重鎖及び/又は系さの一部は、特定の種由来又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一であるか又は相同であり、一方、鎖(1つ又は複数)の残りは、別の種由来又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、並びにそうした抗体の断片における対応する配列に同一であるか又は相同である(米国特許第4,816,567号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)を参照のこと)。
開示されたヒト抗体は、いずれかの技術を使用して調製されうる。ヒト・モノクローナル抗体の産生技術の例は、Cole et al. (Monoclonal Antibodies and Cancer T7zerapy, Alan R. Liss, p. 77,1985) 及びBoerner et al. (J. Imfsautaol., 147 (1) : 86-95,1991)により記載される。ヒト抗体(及びそれらの断片)は、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーを使用して産生されうる(Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381,1991 ; Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581, 1991)。
抗体ヒト化技術は、抗体分子の1以上のポリペプチドをコードするDNA配列を操作する組換えDNA技術の使用を一般的に含む。従って、非ヒト抗体(又はそれらの断片)のヒト化形態は、キメラ抗体又は抗体鎖(又はそれらの断片、例えばFv、Fab、Fab’、又は抗体の他の抗原結合部位)であって、ヒト(レシピエント)抗体のフレームワーク中に組み込まれた非ヒト(ドナー)抗体由来の抗原結合部位の一部を含むものである。
(a) 液体サンプル中の核酸を、既知の配列を有する結合性オリゴヌクレオチドであって、該核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせて、ハイブリダイゼーションされた核酸を産生し、
(b) ハイブリダイゼーションされた核酸を含む液体サンプルを、本明細書中に記載される微小孔物質のいずれかに通し、ここで該ハイブリダイゼーションされた核酸が、該複合体の表面付近に局在される
ことにより、ハイブリダイゼーションされ及び/又は同定される。別の態様では、核酸は、
(a) 核酸を含む液体サンプルを、本明細書中に記載される微小孔物質のいずれかに通し、ここで該核酸は該複合体の表面付近に局在化され、そして
(b) 該核酸を、該核酸と相補的である結合性オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせることにより、
ハイブリダイゼーションされる。
一の態様では、本明細書中に記載される微小孔物質であって、複合体及び改変微小孔物質を含むもののいずれかは、バイオリアクターとして使用されうる。この態様では、該バイオリアクターは、小さい発酵器、生物化学フロー分析器、又はバイオセンサーの一部として使用されうる。一の態様では、生物活性薬剤は、複合体に直接又は上記リンカーにより共有結合されうる。例えば、酵素は、上記シラン化をとおして複合体に結合され、酵素/支持体システムを作り出す。別の態様では、反応割合を改良するため、サスペンション・ポリマーの方法により、生物活性薬剤は複合体へと結合されうる。一の態様では、反応物質の溶液が、酵素/支持体システムと接触される場合、酵素/支持体システムは、触媒として振る舞い、そして新たな化合物を作り出しうる。別の態様では、酵素/支持体システムは、バイオセンサーとして振舞い、そしてサンプル中に存在する特定の被分析物と相互作用しうる。
一の態様では、局在された被分析物は、液体サンプル中に存在する被分析物の量を定量するために使用されうる。「被分析物の定量」というフレーズは、被分析物が、微小孔物質の表面付近に局在化されるとすぐに、サンプルの既知の量に存在する被分析物の量を計算することとして定義される。一の態様では、被分析物は、被分析物粒子を検出及び計数することにより、そして被分析物粒子の数を、サンプルの既知の体積に基く対応する濃度に相関することにより、定量される。
一の態様では、使用される検出技術に左右されて、被分析物は、検出される前に標識されうる。本明細書中で使用される「標識された被分析物」という用語は、検出可能なトレーサーと相互作用した被分析物として定義される。被分析物と検出可能なトレーサーとの間の相互作用は、化学的又は物理的相互作用、例えば非限定的に共有結合、イオン性相互作用、又はルイス酸-ルイス塩基相互作用を含みうる。本明細書中に示される「検出可能なトレーサー」は、
(1) 上記被分析物と相互作用できる少なくとも1の基、及び
(2) 当該技術分野に周知である技術を使用して検出できる少なくとも1の基
を有する化合物のいずれかとして定義される。一の態様では、被分析物は、局在化の前に標識されうる。別の態様では、該被分析物は、局在された後に標識されうる。
蛍光核酸染色は、標的核酸分子を標識するために使用されうる。蛍光核酸色素は、相互作用、マイナー・グルーブ結合などを介して選択的に核酸を染色する。これらの色素の最も有用なものは、核酸に結合されると強い蛍光の増大を示す。そうした色素の非限定的な例は、エチジウム・ブロマイド、プロピジウム・アイオダイド、サイバーグリーンI、トト-3(Toto-3)、サイトックス・オレンジ(Sytox・Orange)などを含む。これらの色素の幾つかは、高い量子収量(約50%超)及び核酸の特定の類型に結合した際、1000を超える蛍光増強を有する。核酸に結合した際の蛍光増強は、蛍光トレーサーのシグナル-対-ノイズ制限を最小化し、そして色素非特異的結合は、実質的に非蛍光である。さらに、標的核酸あたりの色素充填度は高く、しばしば4塩基対あたり1の蛍光色素分子に達する。蛍光核酸色素の制限は、標的表面上の全ての核酸を染色することを含むが、二重鎖DNA、RNAなどについての選択性を有する事が多い。
別の実施態様では、酵素技術は、被分析物を高SNRで標識するために、検出可能なトレーサーとして使用されうる。「サスペンドされた(suspended)」反応物質の増大された活性の原理が使用されうる。例えば、抗体及び別のタンパク質、並びに別の分子は、表面に保持されるとき活性を失うということが知られている。微小孔物質に局在される巨大分子の「足場(scaffolding)」に被分析物を保持することは、表面での不活性化を最小限にすることによって、並びに活性微小孔物質を通した流れを許容することにより物質移動を改良することによって、活性をかなり改良しうる。
別の態様では、サスペンドされた反応物質の増大された反応割合は、有利に使用されうる。一の態様では、サスペンション・ポリマーは、本明細書中に記載のいずれの複合体を含む微小孔物質の表面付近に局在されて、改変された微小孔物質を作り出す。1の態様では、改変された微小孔物質は、微小孔物質をサスペンション・ポリマーを含む溶液と反応することにより産生されうる。ここで、該溶液は、微小孔物質を通り抜け、そしてサスペンション・ポリマーは、微小孔物質の表面付近に局在化される。別の態様では、サスペンション・ポリマーは、サンプルを微小孔物質へと接触する前に、被分析物を含むサンプル中へと加えられる。この実施態様では、該サスペンション・ポリマーは、微小孔物質の表面付近へと局在化される前に、被分析物と相互作用した。サスペンション・ポリマーは、共有結合又はいずれかの物理的又はイオン性相互作用を介して、被分析物と相互作用できる。
プラスモン共鳴粒子(PRP)は、特異な光学的性質を示す金属製のサブミクロンである。特に、金及び銀のPRPは、格別高くかつ波長選択性の光散乱能力を有することが知られている。1個の60ナノメートルの金粒子は、500,000個のフルオレセイン分子の蛍光発光と同等の光子を散乱する。銀のPRPは、金の約8倍の効果を有すると知られているが、化学的に安定でない。PRPは、診断における使用を提案されてきており、そしてPRP及び関連技術を商業化するために数社が形成されてきた。
1. かなり小さいPRPでは(金について40nm以下)、散乱断面は6倍になるまで粒子半径に比例し、一方、ピーク散乱波長は一定である。この形態では、金は主に520nmで散乱し、一方銀は380nmで散乱する。
2. PRPが大きくなるにつれて(金について40nm超)、散乱断面は増大し続け、一方、ピーク散乱波長はより長い波長へとシフトする。例えば、以下の散乱光の色が見られる:
金RPP直径 散乱光の色
40nm 緑色
78nm 黄色
118nm 橙色
140nm 赤色
3. 透明誘電散乱粒子(ガラス、プラスチック・ビーズなど)とは異なり、PRPは、媒体屈折率適合に関する散乱パラメーターの低減を示さない。実際、液浸培地屈折率を固有粒子屈折率に適合することにより、PRPからの散乱は培地屈折率の増加を伴って増加し、並びにピーク散乱波長における明白な赤方偏移をうける一方、慣用粒子からの散乱は実質的に取り除かれる。
のアッセンブリを区別することができる。例えば5-プローブ・システムは、SNP検出に使用されうる。一の態様では、該プローブは、センター(#3)プローブの下のSNP位置と近接するように設計されうる。この場合では、SNPがない場合、予測された融解を行なう5PRPのアッセンブリ、及び問題のSNPを含む核酸についての2PRPの2個のアッセンブリへと融解する5PRPのアッセンブリは、予期される。融解の間における#3プローブの欠失は、主要分散波長の遠赤外(1×5〜40nm金PRPアッセンブリ)から黄色(2×2〜40nm金PRPアッセンブリ)への偏移をもたらす。別のスキームは可能であり、球状のPRP直径、材質、及びPRPアッセンブリ・パラメーターに左右される。さらに、かなり小さい金粒子で開始する溶液中でPRPを「成長」するために、銀の増強が使用されうるということがよく知られている。一の態様では、これらの小さい金粒子(直径2nm未満)は、アノポア膜上のNSBを少なくすると証明されうる。小さな金核に基く銀によるPRAの増強は、より多くの棒状構造及び固有の検出をもたらす。
標的被分析物が局在された時点で、被分析物は次に、検出システムにより検出されうる。一の態様では、局在された被分析物は標識される。検出技術に左右されて、被分析物は、局在の前又は後に標識されうる。一の態様では、当該技術分野に周知であるように、アナログタイプ検出スキームが使用されうる。ここで、標識された被分析物の各々は、検出のため十分な強度を必要とする総量のシグナルに寄与する。別の態様では、デジタル分子計数(MC)又はデジタル核酸計数(NAC)検出システムは、蛍光の有無について、アッセイ標的表面上の分子サイズ領域を調べるために使用されうる。
1. 約1〜10ミクロン2の面積の調査領域からの蛍光を明確に単離する。
2. 使用される蛍光標識システムに一致させて、調査領域から蛍光発光を高効率及び高感度で計測する。
3. 一秒あたり約5,000〜500,000の別個の調査領域を計測する。
4. 計測の間、焦点を標的表面上に維持する。
5. バックグラウンド差分について強度-位置の関係を維持(画像形成)する。
分子計数において使用するための適切なスキャン検出システムの1の態様は、図8に模式的に示される。該検出システムは、一般的に800と名付けられており、光線デリバリー及びコレクション・モジュール804と光路で繋がっているレーザー光源802を含み、該コレクション・モジュール804は、計測されるサンプルにレーザー光を向けるため及び蛍光を収集するための様々な光学要素含みうる。図8において示されるように、デリバリー及びコレクションモジュール804の光学要素は、コリメータレンズ806を含み、蛍光ビーム・スプリッタ808、偏向ビーム・スプリッタ810、4分の1波長板812、ダイナミック・フォーカス対物レンズ813、及び焦点検出器814を含む。該焦点検出器814は、焦点レンズ815、円柱レンズ816、及び4分割フォトダイオード検出器817を含む。これらの光学要素と光源802からのレーザー・ビームとの相互作用は、以下にさらに詳細に記載される。デリバリー及びコレクション・モジュール804は、検出器モジュール818と光路で繋がっており、該検出器モジュール818は、干渉フィルター820、第一焦点レンズ822、空間フィルター824、第二焦点レンズ826、及び光子計数アバランシェ・フォトダイオード(APD)828を含む。
本明細書中に記載される分子計数法において使用されうる別の適切な検出システムは、模式的に図9において示される。該検出システムは、一般的に900と名付けられ、微小孔物質上に局在される核酸を検出するために特に適している。該検出システム900は、励起フィルター950を含む光源902を含み、これは、検出器モジュール904、例えば電荷結合素子(CCD)カメラと光路で繋がっている。該検出器モジュール904は、標識された核酸蛍光を単離するため、1以上の干渉フィルター906を含む。検出器モジュール904はフラット・フィールド(flat field)対物レンズ908、例えば約0.1〜約0.3のNAを有して、約5ミクロン〜約15ミクロンの焦点深度をもたらすレンズを有しうる。この大きな焦点深度は、サンプルフィルター膜の位置の自由度を許容する。或いは、高NAの対物レンズは、さらなるシグナルを集めるために使用されうるが、焦点深度を小さくしてしまう。検出器モジュールはまた、検出レンズ910、及びCCDアレイ912、例えば数秒間〜数分間の照射用の冷却型高量子効率裏面入射型CCD検出器を含む。別のレンズ及び光ファイバー照射(fiber optic illumination)を介したものを含む別の光学デザインもまた、代わりの態様において使用されうる。
一の態様では、プラスモン共鳴アッセンブリ(MC-PRA)検出に基く分子計数に適した検出器を、図10に示し、そして一般的に1000と名付ける。これは、暗視野、共焦点スキャン分光法として最適に特徴付けられる。分子計数用に前部で記載された蛍光に基くシステムとは異なって、この検出器は、十分な光のレベルで作動し、そして高い感度の検出を必要としない。
被分析物が核酸である場合、融解曲線分析(MCA)は、核酸ハイブリダイゼーションの可逆的な性質に基いた技術である。二本鎖の核酸、並びに広範な二次構造(自己ハイブリダイゼーション)を有する一本鎖の核酸は、温度及び溶媒組成のよく規定された条件下で単純な一本鎖構造へと戻される。この過程は、融解と呼ばれている。多くの核酸染色は、二本鎖核酸断片に結合されたとき蛍光の大幅な増大を示し、そしてこれらの二本鎖断片が融解すると、蛍光を失う。融解曲線は、一般的に、蛍光染色された核酸の蛍光対温度のプロットである。曲線の形は、融解核酸の構造についての情報を含み、そして、低い分解能ではあるが、核酸同定の特異的指標として使用されうる。この技術は、リアルタイムPCR分析及び分子生物学において広く使用される。
iii. 計数
比較的純粋な被分析物を微小孔物質の表面付近に固定化することであって、本明細書中に記載される技術により達成される固定化は、被分析物の計数に関して重要な変量である。「計数」という用語は、本明細書中で、微小孔物質の特定の領域で、微小孔物質の表面付近に局在された個々の被分析粒子の数を測定することとして定義される。比較的大きく、多標識された被分析物についてでさえ、単一分子の計数は、特別な検出能力を必要とする。結果として、単一分子計数は、競合又は相互作用物質がないかなり精製された非分析物を固定化することを必要とする。以下の原理は、本明細書中で記載される技術により達成される表面固定化が、どれだけ分子計数を高めるかを示す。
1. シグナル-対-ノイズ比(SNR):標的被分析物は、許容されるエラー割合に一致する装置のシグナル-対-ノイズ比を達成するために十分蛍光を有するべきである。核酸の場合、3より大きい、又は約3〜約50、約3〜約40、約3〜約30、約3〜約20、又は約3〜約10のSNRが、明確な、低エラー割合の核酸計数に所望されるということが計算により示される。
2. アッセイ特異性:非標的被分析物は、許容されるアッセイ特異性の要件に合致して非蛍光性であるべきである。
3. ダイナミックレンジ:標的被分析物は、微小孔物質の表面付近に、解像でき、蛍光実体を分離できるものとして、局在されるべきである。つまり、各々の標的被分析物は、他の全てから個別に計測できるべきである。こうして、検出器が調べる各ピクセル又は検出領域は、1又は0の蛍光標的被分析物を含むべきであり、又はシグナル処理技術は、計数間違いを防ぐため、個々の分子の境界線を同定するために使用されうる。
本明細書中で使用される「相関」という用語は、微小孔物質上で計数される被分析粒子の数に基き、そして既知の関係、例えば微小孔物質、標識効率、検出効率、視野、などについて訂正されたサンプルの既知体積中に存在する被分析物の濃度を定量することとして定義される。
例えば、単純に比較的高濃度のサンプルをきれいな石英表面と接触することにより、核酸が石英表面に固定されうることは、当該技術分野に周知であった。核酸の幾つかは、石英に「くっつき」、そして原子間力顕微鏡(AFM)、走査電子顕微鏡(SEM)などにより計測されうる。一の態様では、本発明に記載される微小孔物質、方法、及び物品は、核酸が微小孔物質へ局在化される簡便さ及び速さにより、広範なサンプル類型及び微小孔物質への局在を許容する精製度により、並びに計数された核酸を最初の核酸サンプル濃度へと相関する能力により、当該技術分野に周知である技術の現状を改良する。
1. ビリオン溶解効率
2. 捕捉膜を通す開始サンプル体積
3. 核酸の捕捉効率
4. 核酸の標識効率
5. 標識核酸の検出効率
6. 検出器により調べられる膜の割合
7. システムの線形性対検出されたシグナル
微小孔物質のいずれかは、ろ過装置の一部でありうる。本明細書中で名付けられる「ろ過装置」という用語は、本明細書中で記載される微小孔物質の少なくとも1を含む装置のいずれかとして定義される。
(a) 第一表面及び第二表面を有するプレートであって、ここで該プレートは、少なくとも1の穴を有し、該穴は、プレートの第一表面と第二表面で一定の幅を有する、前記プレート、及び
(b) 第一表面と第二表面を有する微小孔物質であって、ここで該微小孔物質の該第一表面は、プレートの第二表面に隣接しており、該微小孔物質がプレートにおける各穴を覆う、前記微小孔物質
を含む。本明細書中で使用される「隣接」という用語は、プレート及び本明細書中で記載される微小孔物質のいずれかであって、互いに物理的に接触しているものとして定義される。「隣接」という用語はまた、別の物質により分離されているプレートと微小孔物質のことも指す。例えば、プレフィルターは、プレートと微小孔物質との間に配置されうる。
本発命の組成物、物品、装置、及び/又は方法が開示又は記載される前では、特記ない限り、それらは特定の合成方法又は特定の組換えバイオテクノロジーの方法に制限されず、又は特記がない限り特定の試薬に制限されず、そのようなものとして当然変わりうるということを理解されるべきである。また、本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施態様を記述する目的のみであり、制限することを意図されていないということも理解されるべきである。
以下の実施例は、当業者に、本明細書中に開示及び特許請求される化合物、組成物、及び方法が、どうやって作られ、そして評価されるかについての完全な開示及び記載を与えるために記載され、そして純粋に例示的であることを意図し、そして発明者が、発明であるとみなす範囲を制限することを意図しない。エフェクターは、数(例えば、量、温度など)に関する正確性を保証するために作られたが、幾つかの間違い及び偏差は、説明されるべきである。他に記載がない限り、割合は、重量による割合であり、温度は、℃で表されるか室温であり、そして圧力は、大気圧又はその付近である。反応条件、例えば、濃度要素、所望の溶媒、溶媒混合液、温度、圧力、及び他の反応試薬、並びに記載の方法から得た産物の純度及び収率を最適化するために使用されうるの多数の変動及び組合せが存在する。正当かつルーチンな実験のみが、そうした処理条件を最適するために必要とされる。
迅速なウイルス量アッセイにおいて、試験される核酸は、約8000塩基又は塩基対を有するRNA又はDNAでありうる。このサイズ範囲における核酸(DNA及びRNA)ラダーは、局在化用に試験された。他に特記がない限り、EcoRIで切断されたラムダ・ファージDNAであって、3,530、4,878、5,643、5,804、 7,421、及び21,226塩基対のDNAを、モデル核酸として使用した。50〜10,000塩基又は塩基対の断片を有する別のDNA及びRNAラダーとの比較は、RNAとDNA局在における類似性を示した。ろ過された核酸ラダー上のゲル電気泳動は、約1500塩基又は塩基対より大きい分子の高い保持効率を示した。精製されたウシ胸腺DNAであって13,000平均塩基対長を有するものは、様々な条件下でろ過され、そして結果は以下の実施例において記された。ろ過は、0.2ミクロンのアノポア膜フィルターを含むように改変されたミリポア・マルチウェル・フィルター・プレートを含むフィルター・アッセンブリであって、図15aにおいて示される直径約5ミリメートルの改変又は未改変の0.2ミクロン・アノポア膜フィルター表面を伴うウェル・アッセンブリと類似であるアッセンブリを用いて行われる。
図24a及び24bは、プレーン未改変、ジオール(酸加水分解されたグリシドオキシプロピルトリメトキシシラン)改変、及びアミン(アミノプロピルトリメトキシシラン)改変0.2ミクロンアノポア膜についてのNaCl濃度に対する核酸保持率のグラフである。図24aは、0〜1000mM・NaCl範囲を示し、一方図24bは、図24aから拡大された0〜100mMの範囲を示す。これらの結果は、1mM・トリス緩衝液、pH8.0において得られた。グラフから明らかであるように、100mMの塩が、プレーンの及びジオール改変膜上で実質的に完全に核酸を保持することに必要とされ、アミン改変膜については、実質的に塩の効果がない。
図25a及び25bは、プレーンの未改変アノポア膜についての塩濃度に対する核酸保持率のグラフである。図25aは、0〜4500mMの塩濃度の範囲であり、一方図23bは、図25aから拡大された0〜100mMの範囲を示す。これらの結果は、上記のDNA切断部位を使用して、1mM・トリス緩衝液、pH8.0中で得られた。図25a及び25bのグラフ中に記されるように、NaCl(カオトロピック塩ではない)は、プレーンの0.2ミクロン・アノポア膜上への核酸保持を促進する点で、グアニジン・チオシアネートと同じくらい効果的であり、そしてグアニジン・ヒドロクロリドよりずっと効果的である。
図26は、プレーン未改変、ジオール改変、及びアミン(APS)改変の0.2ミクロン・アノポア膜についてのpHに対する核酸保持率のグラフである。結果は、1M・NaCl、50mMリン酸緩衝液、及び前に記載されるように切断されたDNAで得られた。図26のグラフにおいて示されるように、核酸保持率は、pH4において一貫して高くそして表面改変とは無関係であったが、重大な表面改変効果は、pH6〜8で示され、プレーン膜は、5%以下の核酸保持率へと下がり、そしてジオール改変膜は、65%の保持率まで下がった。高pH(10)では、核酸保持率は、プレーン及びジオール改変膜について実質的に0まで下がったが、アミン改変膜についてはまだ50%を超えていた。
図27〜29のグラフは、1mMトリス緩衝液pH8.0中で、NaClを変量として、プレーン未改変、アミン(APS)改変、及びジオール改変のアノポア膜上での核酸保持率の性質を示した。これらのグラフはそれぞれ、3つの場合:
全膜保持率(プロットは図24aと同一である);
膜を通した洗浄液 - 核酸を含む特定の緩衝液が膜を通してろ過された後に、等量の同一の緩衝液であって核酸を含まないものが、膜を通してろ過され、そして分析される。
膜の表面からの洗浄液 - 膜を洗浄したのち(上記膜を通した洗浄ののち)、等量の同一の緩衝液であって核酸を含まない緩衝液は、膜上のウェル中に配置される。この緩衝液は、約10回膜上で吸引と注入が行われて、表面から局在された核酸を洗浄する。この表面洗浄液を、吸光度により分析し、そして溶出された核酸を計測した。
についての核酸保持率(%)対NaCl濃度をプロットする。
図30のグラフは、プレーン未改変及びアミン(エチレンジアミノプロピルトリメトキシシラン、EDAPS)改変膜に関して、リン酸緩衝液濃度の核酸保持又は溶出についての効果を示す。リン酸二ナトリウムを、グラフ上に挙げた濃度で、1MのNaClに加え、pHを8.0に調節した。リン酸イオンは、酸化アルミニウム・クロマトグラフィー・パッキングに結合することが知られ、そして核酸と同様のアノポア膜上の弱い結合部位と競合しうる。図30のグラフにおいて示されるように、EDAPS改変アノポア膜により局在化される核酸は、リン酸濃度に対する反応性について、プレーン膜の反応性とは程遠い。
表面の性質は、弱い相互作用を妨げる化学種の吸着により影響されることが多い。そうした化学種は、膜被膜物質として使用され、そして本明細書中に記載される幾つかの用途において存在する血漿要素及び界面活性剤を含む。表5は、ウイルス量アッセイにおいてみつかる条件下での、DNAの局在化割合を示す。該条件は、1mg/mlプロテイナーゼK酵素、2%トウィーン20界面活性剤、記された添加塩、及び65%EDTAヒト血漿の有無を含む。
高感度のウイルス量アッセイでは、かなり少量の核酸が定量される。以下の表4は、貯蔵された臨床サンプル対ビリオン溶解液/血漿消化反応条件から得られたHIV・RNAの局在化割合を示す。全てのサンプルは、135μlの患者サンプル(EDTA血漿)、2mg/mlプロテイナーゼK、2%トウィーン、および400mMのグアニジン・チオシアネートを含んだ。該サンプルを30分間、表4に記載の条件下でオインキュベーションした。
ヒト血漿ろ過上での試験サンプル切断の効果は、成分を含む300μlの全インキュベーション混合液を使用することにより、及び以下の表5に載せられる条件にかけることにより調査された。使用されるフィルター・アッセンブリは、改変ミリポア96ウェル・フィルタープレートの底に熱融合された直径約5mmの未改変0.2ミクロンアノポア・膜フィルターを含んだ。これは、例えば、図15aの実施態様に示される。
2 - プロテイナーゼK酵素- 濃縮液体(23mg/ml),Sigma-Aldrich Co.
3 - 界面活性剤- 分子研究用品質 トライトンX-100、トウィーン20、又はSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)
4 - インキュベーション条件- RT(室温)25℃ベンチトップ;55℃水浴
5 - ろ過時間- 局在化膜フィルターを通して250μlのインキュベーション後の液体をろ過するための秒数。
図31は、脳脊髄液(CSF)、ヒト血清、及び全血についてのサンプル切断/ろ過試験の棒グラフである。全ろ過体積は、左の軸に示され、一方、約3.5ミリメートルの直径の未改変0.2ミクロン・アノポア膜を通して全体積をろ過するのにかかる時間が、右の軸に記載される。様々な体積及び切断条件が示され、水(コントロール)、無傷(未切断)CSF、及び切断CSF、血清、血漿、及び全血液を含む。切断条件は、以下:
CSF、血清、血漿
31mM トリスHCl、10mM EDTA
800mM グアニジン・イソチオシアネート
0.5% トライトンX-100
5.2% トウィーン20
0.9AU プロテイナーゼ
全血
18mM トリスHCl、6mM EDTA
500mM グアニジン・イソチオシアネート
0.3% トライトンX-100
3.0% トウィーン20
2.0mg/ml プロテイナーゼK
を含んで示される全切断体積において37℃で15分であった。
PCR増幅を含む全血からのゲノム核酸の抽出及び精製は、以下の方法を使用して行われる。最初に、10μlのEDTA抗凝集ヒト全血を、180μlの分子研究用品質の水であって、10%ドデシル硫酸ナトリウム溶液を10μl含む水に最終濃度0.5%になるように溶解した。混合液を軽く混合し、次に室温で約15分間インキュベーションした。サンプル全体を、未処理の完全0.2ミクロン・アノポア膜を備えるマルチウェル・フィルター・プレート(前記改変ミリポアフィルター・プレート)中に配置した。混合液を約30秒かけて乾燥するまで吸引ろ過し、次に約100μlの蒸留水で洗浄し、それを再び乾燥するまで膜を通して吸引ろ過した。洗浄された膜は、実質的に白色であり、かなり少量の結合されたヘモグロビンが見えた。その後、ヒトβグロビンタンパク質の遺伝子コード中に含まれる核酸配列を増幅するためのプライマーを含む20μlのPCRマスター・ミックスをフィルター上に分注し、そして最初のSDSで溶解された血液サンプルから捕捉された局在化ゲノムDNAのいずれかを簡単に再溶解させた。再溶解は、繰り返し20μlのマスターミックスを膜上で注入及び吸入することにより助けられた。マスター・ミックスを吸引しそしてPCRキャピラリー・チューブへと移し、そしてリアルタイムPCR(Roche Lightcycler)により、ヒトβグロビンタンパク質の遺伝子コード内に含まれる核酸配列について分析した。陽性の結果を得た。
遺伝子分析用に、全血液サンプルをリアルタイムPCR(RT-PCR)中で使用する能力は、研究の作業の流れを単純化し、そしてコストを削減し、そして別の利益を与える。実施例10の全血PCR増幅は、前記図18及び19において示される単純化された使い捨て形式を使用し、図17bの系に類似する系において分析を行うことにより作られたアンプリコンをリアルタイム検出することを含むように拡大された。10μlの全血は溶解され、次に図18において一般的に示されるように、及び実施例10に記載されるように、ろ過されそして未改変のアノポア・フィルターを介して洗浄された。アノポアの乾燥された底表面は、全血サンプルから由来される局在されたゲノムDNAを含み、熱溶接ポリプロピレン、熱シーリングフィルム1910により、図19に示されるように直接乾燥膜上にシールされた。以前に記載されたとおりであるが、1:6000希釈のサイバーグリーンI色素(molecular Probes)を含んだむ組成の50μlのPCRマスター・ミックスを次にウェル1901中に加えた。ウェル1901のトップは、PCR反応液1913を含み、次に透明の粘着テープ1911又は透明のキャップ1912によりシールした。このアッセンブリを、図17bにおいて図示されるようにアノポア-シーリングフィルム表面を直接通して熱を伝えるように設計されたリアルタイムPCR装置で熱サイクルした。ウェル内の蛍光の変化は、ウルトラ・ブライト(ultra blight)青色発光ダイオード、フォトダイオード検出器、及び適切な干渉フィルター、エレクトロニクス、及びソフトウェアから構成される単純化された蛍光光度計により、サーマルサイクルされる間モニターされた。蛍光データーをライトサイクラー(Roche)ソフトウェアにより評価した。サーマルサイクルをPerkin Elmer480装置であって、特注フラットサーマルサイクル領域を遠隔操作することを許容するように改変された装置を使用することにより達成した。サーマルサイクル・プロファイルは、実施例10(99℃×20秒、50℃×3秒、75℃×60秒)と同じであった。融解分析は、温度を1時間かけて65℃〜99℃まで上昇させることにより行われた。
ヒトゲノムDNAは、蛍光染色により直接的に可視化されうる。100万細胞/ml超に濃縮され精製されたヒト白血球細胞10μlを、0.5%ドデシル硫酸ナトリウムを含む190μlのTE緩衝液に加え、そして20分間、56℃でインキュベーションして、血球細胞を溶解し、DNAを放出させた。TE緩衝液中に1〜10,000希釈のサイバーゴールドから構成される溶液中で、1〜400,000の細胞溶液10μlで開始することに基いて、この溶液を終濃度まで希釈した。希釈DNA溶液を、サイバーゴールド溶液中で数分インキュベーションし、次に50μlを実施例22に従ったニッケル-ホウ素改変アノポア膜を通してろ過した。局在されたヒトゲノムDNAを含む膜を簡単にTE緩衝液で洗浄し、次に図9及びさらに実施例13において示されるのと類似の装置に基いて可視化された。実施例に従った、典型的なヒトゲノムDNAのイメージは、図11に示される。
核酸を光学的に分析した。精製された約13,000塩基対のウシ胸腺DNAは、100nMのYOYO1核酸色素を含むろ過された10mMトリス-HCl、1mM・EDTA中に1〜128の相対濃度で段階希釈された。室温でのインキュベーションの5分後、100μlの標識核酸サンプルを、黒色ポリプロピレン・ホルダー上に熱融合された活性フィルター直径約3mmの0.2ミクロンの未改変アノポア膜を通してろ過した。488nmでの単線で作動する20ミリワットの空冷アルゴンレーザー、並びに1024×1058ピクセルの裏面入射型CCDカメラであって、−10に冷却され、0.3NA、10×平面顕微鏡対物レンズを備えるカメラを使用し、図9に示される機器構成の蛍光顕微鏡で、フィルターを画像化した。DNAを約5秒の照射で簡単に可視化した。画像をシグナル処理して、縁部を際立たせ、明らかに核酸ではない不具合を取り除き、バックグラウンドの蛍光について訂正し、次に残っている処理されたDNAスポットを計数した。処理された画像を図12において示し、得られた単純希釈曲線を図13において示し、装置に対し訂正された希釈曲線及びシステム・パラメーターを図14において示した。
例えば図8に記載される共焦点スキャン検出システムについての種々の検出パラメーターを評価するために、理論モデリングを行った。理論モデリングのため、以下の仮定を行った。
1.1mlサンプル中に含まれる核酸を1cm2の領域に結合する。
2.1cm2あたり1の計数間違いによる誤診率は許容される。
3.核酸を25又は100色素分子/核酸で染色する。
4.各蛍光色素分子は、検出ゾーンに存在するとき、50000光子/秒の検出されたシグナルを生ずる。これは、100kW/cm2の照射密度で達成される。
5.ノイズは、器具によるノイズ、ラマン散乱、プラスチックの蛍光などのバックグランド源由来である。さらに、核酸染色由来の表面非特異結合(NSB)は、均一に分散され、単離された(密集していない)色素分子であって、スキャンエリアあたり複数の色素が存在する可能性がかなり低い色素分子をもたらす。密集された蛍光シグナルを与える表面に結合された非特異的核酸などの不慮の染色は、考慮されなかった。
1.ポアソンランダム変数方程式:
P(I)=e-GGI/I!
[式中、Iは、規定の間隔における光子数であり;
Pは、規定の間隔においてI個の光子が生じる確率であり;そして
Gは、規定の間隔において光子が生じる平均確率である]
2.一般的な関係:
T=秒/1cm2スキャン
D=スポット寸法、ミクロンである。
光子バースト時間(μ秒)=T(D2)1×108
[式中、1×108は、cm2あたりのミクロン2の数である]
スキャンスピード(cm/秒)=1×104/TD
核酸シグナル(光子数/光子バースト時間)=FRTD2/1×108
[式中、Fは、蛍光色素分子の数/核酸であり;そして
Rは、検出された光子計数率/色素分子(50,000光子/秒/想定分子)である]
バックグラウンド・シグナル(光子計数/光子バースト時間)=BTD4/1×108
[式中、Bは、平均バックグラウンド・シグナル(光子計数/秒/ミクロン2)である]
NSBシグナル(光子計数/光子バースト時間)=ZTRD4/1×108
[式中、Zは、光学表面に非特異的に結合される蛍光色素分子/ミクロン2である]
フォトン・バースト・時間に基いて発現されるシグナルに関して、それらは、ポアソン・ランダム変数方程式において以下のように有用である:
I=核酸シグナル;
これは、1擬陽性/cm2につき最小核酸シグナル(光子/バースト時間)である。
G=バックグラウンド・シグナル+NSBシグナル;
これは、全ての非核酸源についての平均光子計数/バースト時間である。
P<D2/1×108
この条件は、完全な1cm2スキャンにおける、1未満の擬陽性の統計的発生を示す。これらの関係に関して、様々な条件下の計数パフォーマンスの曲線は、以下の実施例において記載されるように作られた。
図35は、以下の5個の検出条件についてのスキャン時間対スポット寸法のグラフである。
1. 100色素分子/核酸、10khz/ミクロン2ノイズ、0色素分子/ミクロン2NSB;
2. 100色素分子/核酸、40khz/ミクロン2ノイズ、0色素分子/ミクロン2NSB;
3. 100色素分子/核酸、40khz/ミクロン2ノイズ、1色素分子/ミクロン2NSB;
4. 25色素分子/核酸、10khz/ミクロン2ノイズ、0色素分子/ミクロン2NSB;及び
5. 25色素分子/核酸、40khz/ミクロン2ノイズ、1色素分子/ミクロン2NSB
図36〜39は、スキャン時間対シグナル/ノイズのグラフであり、ここで:
シグナル対ノイズ比(SNR)=核酸シグナル/バックグラウンド・シグナル+NSBシグナル
図36のグラフは、種々のスポット寸法で、2〜500のSNRの間で、100色素分子/核酸の条件に作られた。図37のグラフは、種々のスポット寸法で、2〜100SNRの拡大されたスケールの100色素分子/核酸の条件について作られる。図38のグラフは、種々のスポット寸法、2〜500SNRでの25色素分子/核酸の条件について作られた。図39の該グラフは、2〜100SNRの拡大されたスケールを伴う種々のスポット直径で、25色素分子/核酸の条件について作られた。
図40は、未改変0.2ミクロンの孔サイズのアノポア膜フィルター上に局在化され、そしてYOYO1色素で染色された48,502塩基対長のラムダ・ファージDNAの高倍率反転顕微鏡写真であり、実施例3に記載の技術に従って画像化された。図40は、DNA分子の形が容易に明らかにされる膜フィルターの表面上のDNAを明らかに示す。図40における明るい細長い形は、十分に伸張された局在化DNAに一致し、暗い球形は、崩壊された分子構造に一致する。さらに、中間体構造は、容易に現われ、ここで直線状の尻尾は、暗いスポットとくっついて見られて、特定の分子伸張を表す。
サンプルのウイルス量は、核酸計数により測定される。計数された核酸からの、開始サンプルウイルス量濃度を相関させる多数の例は、以下の値:
1.ビリオン溶解効率 99%
2.サンプル体積 200μl
3.核酸捕捉効率 85%
4.核酸標識効率 95%
5.核酸検出効率 99%
6.検出された膜割合(%) 25%
7.システム線形性 95%
に基きうる。
アッセイの間、膜分析の画像は、1,000の検出された別個の標識された核酸を示しうる。パラメーター7で開始し、そして後ろから薦めると、1000の検出された別個の核酸は、システムの線形性のため、1,053(1000/0.95)個の実際の核酸に一致する。つまり、検出器は、確かな濃度で全ての核酸を正確には計数できない。全体の膜ろ過の25%のみが画像化されるので、1053個の核酸は、サンプル由来の全てのフィルター上の核酸4212個(1053/0.25)を表す。さらに、核酸のある割合のみが、別の理由から検出されうるので、及びある割合の核酸のみが標識されて検出を可能にする。従って、4212個の核酸は、フィルター上の存在する4478個(4212/0.99×0.95)の核酸が、フィルター上に存在した。フィルター上の4,478個の核酸は、実際フィルターを通して流れた核酸5269個(4,478/0.85)個の核酸を実際あらわす。なぜなら、85%のそうした核酸のみが、フィルター上に実際保持されるからである。フィルターをとおして流された5269個の核酸は200μlの開始サンプル由来であり、つまり10538(5269/0.2ml)個の核酸/ml(サンプル)の濃度由来である。最終的に、溶解条件は、標的ビリオンから標的核酸を95%の効率で産生することが知られている。従って計算された10538個の核酸/mlは、10644(10538/0.99)個の患者サンプルの1mlにおける実際のビリオンを表す。
0.2ミクロンの47ミリメートルの直径のアノポア膜を以下のように色素で改変した:
3mlのEDAPS(エチレンジアミノプロピル・トリメトキシシラン)を27mlの高純度の水へと混合して溶解した。該溶液を25mmの直径のアノトップ・フィルター(Whatman, 0.2ミクロン)を通してろ過して、全ての不純物、ゲル化された試薬、沈殿などを取り除いた。乾燥アノポア膜を、次にろ過溶液中で完全に浸した。浸された膜を含む溶液を、軽く超音波処理し、次に吸引オーブン中に起き、そして空気を吸引して膜が湿るのに役に立つ。5分の全浸潤時間の後、湿った膜を、丁寧に溶液から移して、そして100mlの高純度水中にゆっくり混合して2回浸潤することにより洗浄して、未結合のシラン試薬を取り除いた。膜を同様に100mlの5×TE緩衝液中で同様に洗浄して、表面に結合されたアミノ基を中和し、次に再び100mlの高純度水中で洗浄した。
0.2ミクロンの直径47mmのアノポア膜を、以下のように、カーボンブラック光学的なピグメントを取り込むことにより改変した:約0.2gのカーボンブラック(Raven 5000 Ultra 2, Columbian Chemicals, Inc.)は、界面活性剤であるトウィーン20を約2%含む高純度水1ml中へと機械的に分散された。得られた黒色ピグメント分実機を、膜表面に適用して、数分間沈殿させ、次に水で膜から洗浄された。得られた黒色膜は、光学的に不透明であり、そしていくらか疎水性であるが、水をろ過することができる。
アノポア膜を以下のように無電解金属沈殿物により光学的に改変した:無電解沈殿に適した金属合金は、当該技術分野に周知であり、そしてニッケル、リン、ホウ素、金、パラジウム、銀などを含んだ。メタライゼーションは、光学改変が行われ、一方液体ろ過性質が保たれることを可能にするように制御されなければならない。アノポア膜上のメタライゼーション方法は、一般的に2個の方法である;
活性化−アノポアは、一般的にメタライゼーション溶液と非反応性である。従って、膜は、メタライゼーションの前にパラジウムを取り込むことにより活性化される。これは以下のように達成された。
100nM R-フィコエリトリン(Molecular Probes, Inc)
1×TE緩衝液(10mMトリス、1mM・EDTA、pH8.0)
1%BSA
を含んで調製された。
酵素結合蛍光(ELF)による核酸検出及び定量は、以下のように行われうる。
20の相補的にビオチン化されたオリゴヌクレオチドプローブは、ラムダファージDNAに対して特注されて合成された。これらのプローブは、各々10プローブを有する2つの群として標的DNAに特異的に結合された。各群におけるプローブは、約200の塩基対の典型的な間隔で結合するように設計された。これは、ラムダDNAターゲット上の高いプローブ結合密度の2の領域をもたらした。ラムダDNAが完全に直鎖であるなら、各領域における10のプローブが、約0.6ミクロンの長さに含まれるということを計算が示した。この2つの領域が、約25000塩基対、又は完全な直鎖の場合7〜8ミクロンにより分離された。
ラムダDNAを、以下に記すように上記プローブに前以ってハイブリダイズさせた:
1μlの精製ラムダファージDNA(500μg/ml)を、4mM・MgCl2及び200nMの各20の上記プローブを含む499μlのPCRファーストスタート緩衝液(Roche)中に加えた。この混合液を95℃で10分間熱し、冷却して56度で5分間おき、冷却して37℃で2分間置き、次に室温まで冷却した。未反応性のプローブを、キアゲンPCRクローン・アップキットで製品説明書に従い取り除いた。20個のハイブリダイゼーションされたビオチン化プローブを含む最終ラムダDNAを、TE緩衝液中で1μg/mlに希釈し、そして-20℃で冷凍した。
Claims (56)
- 非蛍光性微小孔物質及びピグメントから実質的になるフィルター状複合体であって、該ピグメントが該微小孔物質内に組み込まれており、そして当該ピグメントが、金属元素、金属酸化物、合金、又はそれらの組合せの不連続沈積から実質的になり;そしてここで当該複合体が、光学的に不透明であり、そして当該複合体を通して又は複合体中に液体の流れを許容する、前記複合体。
- 前記ピグメントが微小孔物質に共有結合されている、請求項1に記載の複合体。
- 前記微小孔物質が、セラミック、金属、炭素、又はガラスを含む、請求項1に記載の複合体。
- 前記微小孔物質が、金属酸化物を含む、請求項1に記載の複合体。
- 前記金属酸化物が、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、酸化チタン、ゼオライト、又はそれらの組合せを含む、請求項4に記載の複合体。
- 前記微小孔物質が、無機電気化学的に形成された物質又はポリマー膜へのイオン化放射を使用して孔を空けることにより形成された物質を含む、請求項1に記載の複合体。
- 前記微小孔物質が、0.02ミクロン〜0.2ミクロンの直径を有する微小孔を含む、請求項1に記載の複合体。
- 前記ピグメントが、前記微小孔物質上に沈積される、請求項1に記載の複合体。
- 前記ピグメントが、金属元素、金属酸化物、合金、又はそれらの組合せを含む、請求項8に記載の複合体。
- 前記ピグメントが前記金属元素を含む場合、当該金属元素が遷移金属である、請求項9に記載の複合体。
- 前記遷移金属が、パラジウム、ニッケル、銀、又は金である、請求項10に記載の複合体。
- 前記微小孔物質が酸化アルミニウムを含み、そして前記ピグメントが該微小孔物質上に沈積される1以上の遷移金属元素を含む、請求項1に記載の複合体。
- 前記遷移金属元素が、パラジウム又はニッケルである、請求項12に記載の複合体。
- 前記複合体がさらにサスペンション・ポリマーを含み、ここで該サスペンション・ポリマーが該複合体の表面付近に局在化される、請求項1に記載の複合体。
- 前記サスペンション・ポリマーが、オリゴヌクレオチド、多糖、タンパク質、又はそれらの組合せを含む、請求項14に記載の複合体。
- 前記サスペンション・ポリマーが、オリゴヌクレオチドを含む場合、該オリゴヌクレオチドが核酸を含む、請求項14に記載の複合体。
- 前記複合体が、ビーズ又は膜を含む、請求項1に記載の複合体。
- ピグメントを微小孔物質に共有結合することを含む、請求項1に記載の複合体の製造方法。
- ピグメントを微小孔物質上に沈積することを含む、請求項1に記載の複合体の製造方法。
- 請求項18に記載の方法により作られる複合体。
- 請求項19に記載の方法により作られる複合体。
- 被分析物の検出のための、請求項1に記載の複合体の使用。
- 前記被分析物が、核酸、タンパク質、寄生虫、真菌、エフェクター分子、リガンド、レセプター、シグナル生成分子、イオン、抗原、抗体、組織、細胞、細胞要素、細菌、タンパク質、又はそれらの組み合わせを含む、請求項22に記載の使用。
- 被分析物を請求項1に記載の複合体と接触することを含む、被分析物の局在化方法。
- 液体サンプルを請求項1に記載の複合体と接触することを含む、液体サンプルから被分析物を分離する方法。
- 被分析物の定量方法であって、以下のステップ:
(a)該被分析物を含む既知の体積を有する液体サンプルを、請求項1に記載の複合体に通し、ここで該被分析物が、該複合体の表面付近に局在化され、そして
(b)該複合体上の該被分析物を検出するステップ
を含む前記方法。 - ステップ(a)の後又は前のいずれかにおいて、前記被分析物のうちの少なくとも幾つかは、検出可能なトレーサーで標識されて、標識された被分析物を作り出す、請求項26に記載の方法。
- 前記被分析物が、タンパク質、寄生虫、真菌、エフェクター分子、リガンド、レセプター、シグナル-生成分子、イオン、抗原、抗体、組織、細胞、細胞要素、細菌、タンパク質、又はそれらの組合せを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記被分析物が核酸を含む、請求項26に記載の方法。
- ステップ(a)の前に、サスペンション・ポリマーを前記液体サンプルに加え、ここで該サスペンション・ポリマーが、前記被分析物と相互作用する、請求項26に記載の方法。
- 核酸の増幅方法であって、(a)該核酸を含む既知の体積を有する液体サンプルを、請求項1に記載の複合体に通し、ここで該核酸が、該複合体の表面付近に局在化され、そして(b)該核酸を増幅することを含む、前記方法。
- 核酸の増幅方法であって、(a)既知の体積を有する液体サンプル中の核酸を増幅して、増幅された核酸を作り出し、そして(b)増幅された核酸を含む該サンプルを、請求項1に記載の複合体に通すことを含み、ここで該増幅された核酸が該複合体の表面付近に局在化される、前記方法。
- 核酸のハイブリダイゼーション方法であって、(a)該核酸を含む液体サンプルを、請求項1に記載の複合体に通し、ここで該核酸が該複合体の表面付近に局在化され、そして(b)該核酸を、該核酸に相補的である結合性オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションすることを含む、前記方法。
- 核酸のハイブリダイゼーション方法であって、(a)液体サンプル中の核酸を、該核酸と相補的である既知の配列を有する結合性オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションして、ハイブリダイゼーションされた核酸を作り出し、そして(b)該ハイブリダイゼーションされた核酸を含む液体サンプルを、請求項1に記載の複合体に通し、ここで該ハイブリダイゼーションされた核酸が、該複合体の表面付近に局在化される、前記方法。
- 核酸同定方法であって、(a)該核酸を含む液体サンプルを、請求項1に記載の複合体に通し、ここで該核酸が、該複合体の表面付近に局在化され、そして(b)該核酸を、該核酸に相補的である既知の配列を有する結合性オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションすることを含む、前記方法。
- 核酸同定方法であって、(a)液体サンプル中の核酸を、該核酸と相補的である既知の配列を有する結合性オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションして、ハイブリダイゼーションされた核酸を作り出し、そして(b)ハイブリダイゼーションされた核酸を含む液体サンプルを、請求項1に記載の複合体に通すことを含み、ここで該ハイブリダイゼーションされた核酸が、該複合体の表面付近に局在される、前記方法。
- 請求項1に記載の複合体を含む物品。
- 前記物品がろ過装置である、請求項37に記載の物品。
- 請求項1に記載の複合体、並びに被分析物を検出するための検出手段を含むキット。
- 請求項37に記載の物品、並びに被分析物を検出するための検出手段を含む、キット。
- 既知の体積を有する液体サンプル中の1以上の被分析物を分離するための方法であって、(a)該液体を、微小孔物質を含む請求項1に記載の複合体に通すことを含み、ここで該被分析物が該微小孔物質の表面付近に局在化される、前記方法。
- 前記局在化ステップ(a)の前又は後に、前記被分析物が検出可能トレーサーで標識される、請求項41に記載の方法。
- 前記微小孔物質が、無機電気化学的に形成された膜又はポリマー膜上にイオン化放射を使用して当該物質に孔を空けることにより形成された膜を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記微小孔物質が、金属酸化物を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記金属酸化物が、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、酸化チタン、ゼオライト、又はそれらの組合せを含む、請求項44に記載の方法。
- 前記被分析物が、タンパク質、寄生虫、真菌、エフェクター分子、リガンド、レセプター、シグナル-生成分子、イオン、抗原、抗体、組織、細胞、細胞要素、細菌、タンパク質、又はそれらの組合せを含む、請求項41に記載の方法。
- 前記被分析物が、核酸を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記微小孔物質が、前記核酸に相補的である結合性オリゴヌクレオチドを含まない、請求項47に記載の方法。
- ステップ(a)の後に、前記核酸が、非特異的に局在された核酸を含む、請求項47に記載の方法。
- ステップ(a)の後、前記被分析物が増幅される、請求項41に記載の方法。
- ステップ(a)の後に、前記被分析物が、前記核酸と相補的な結合性オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションされる、請求項47に記載の方法。
- ステップ(a)の後に、前記核酸が、該核酸を同定するため、該核酸と相補的である既知の配列を有する結合性オリゴヌクレオチドでハイブリダイゼーションされる、請求項47に記載の方法。
- ステップ(a)の前に、サスペンション・ポリマーを前記液体サンプルに加え、ここで該サスペンション・ポリマーが、前記被分析物と相互作用する、請求項41に記載の方法。
- ステップ(a)の前に、前記微小孔物質の表面付近へ、サスペンション・ポリマーを局在化する、請求項41に記載の方法。
- 前記サスペンション・ポリマーは、オリゴヌクレオチド、多糖、タンパク質、又はそれらの組合せを含む、請求項54に記載の方法。
- 前記サスペンション・ポリマーがオリゴヌクレオチドを含むとき、該オリゴヌクレオチドが核酸を含む、請求項55に記載の方法。
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