ES2256068T3 - Particulas de cristal magneticas, metodo para su preparacion y usos de las mismas. - Google Patents
Particulas de cristal magneticas, metodo para su preparacion y usos de las mismas.Info
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Abstract
Método para la producción de un compuesto de partículas de vidrio magnéticas que comprende las etapas de a) suspensión de objetos magnéticos con un diámetro entre 5 y 500 nm en un sol, b) secado por atomización de la suspensión en una secadora por atomización de dos boquillas, y c) sinterizado del polvo secado por atomización.
Description
Partículas de cristal magnéticas, método para su
preparación y usos de las mismas.
Esta invención se refiere a las partículas
magnéticas que tienen una superficie de cristal y son básicamente
esféricas. Esta invención también hace referencia a los métodos para
fabricarlas, así como a las suspensiones a partir de ellas y a sus
usos para la purificación del material biológico en procesos
automatizados.
Muchos materiales biológicos, especialmente los
ácidos nucleicos, presentan unos retos especiales en lo que se
refiere a su capacidad para aislarlos de su entorno natural. Por
otro lado, a menudo se encuentran presentes en unas concentraciones
muy pequeñas, y, por otro lado, a menudo se encuentran en presencia
de otras muchas sustancias sólidas y disueltas lo que impide su
aislamiento o medida, en particular en análisis bioespecíficos.
Los análisis de enlaces bioespecíficos permiten
la detección de analitos específicos, por ejemplo, ácidos nucleicos,
o bien unas propiedades específicas del analito y tienen un
importante papel en el campo de los diagnósticos y de los
bioanalíticos. Ejemplos de ello son los análisis de hibridación, los
inmunoanálisis y los análisis de ligandos
receptores.
receptores.
Los análisis de hibridación utilizan el par de
base específico para la detección molecular de los analitos de
ácido nucleico, por ejemplo, de ARN y de ADN. De ahí que las
muestras de oligonucleótidos con una longitud de 18 a 20
nucleótidos puedan permitir el reconocimiento específico de una
secuencia determinada en el genoma humano. Otro análisis que
utiliza el enlace selectivo de dos capas aislantes de
oligonucleótidos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
descrita en US 4.683.195. Este método emplea la amplificación
selectiva de una región específica de ácido nucleico hasta unos
niveles detectables por una polimerasa termoestable en presencia de
trifosfatos desoxinucleótidos en varios ciclos.
Los ácidos nucleicos son analitos
comparativamente complejos que tienen que ser extraídos normalmente
de mezclas de complejos antes de poder ser utilizados en un
análisis basado en una muestra.
Existen varios métodos para la extracción de
ácidos nucleicos:
\bullet métodos bioespecíficos o dependientes
de una secuencia como, por ejemplo:
- \bullet
- cromatografía de afinidad
- \bullet
- hibridación para dar muestras inmovilizadas en perlas
\bullet métodos físico-químicos
o independientes de la secuencia como, por ejemplo:
- \bullet
- extracción líquido-líquido con fenol-cloroformo
- \bullet
- precipitación con etanol puro, por ejemplo.
- \bullet
- Extracción con papel de filtro
- \bullet
- Extracción con agentes que forman micelas como el bromuro de cetiltrimetilamonio
- \bullet
- Adsorción a gel de sílice o tierras de diatomeas
- \bullet
- Adsorción a partículas de cristal magnéticas (PCM) o bien partículas de organosilanos en condiciones caotrópicas
Recientemente, se han propuesto muchos
procedimientos y materiales para aislar ácidos nucleicos de su
entorno natural mediante el uso de su comportamiento enlazante a
las superficies de cristal. En Proc. Natl. Acad. USA 76,
615-691 (1979), por ejemplo, se ha propuesto un
procedimiento para enlazar ácidos nucleicos en geles de agarosa en
presencia de yoduro sódico en un vidrio incoloro.
Se ha descrito la purificación del ADN de
plásmido de las bacterias en polvo de vidrio en presencia de
perclorato sódico en Anal. Biochem. 121,
382-387(1982).
En la DE-A 37 34 442, se ha
descrito el aislamiento del ADN monocatenario del bacteriófago M13
en filtros de fibra de vidrio precipitando las partículas de
bacteriófago usando ácido acético, y la lisis de las partículas de
bacteriófago con percloratos. Los ácidos nucleicos enlazados a los
filtros de fibra de vidrio se lavan y luego se eluyen con una
solución amortiguadora que contiene mentol en una solución de
Tris/EDTA.
Un procedimiento similar para purificar el ADN de
los bacteriófagos \lambda se ha descrito en Anal. Biochem. 175,
196-201(1988).
La EP 757 106 hace referencia a un soporte
magnético enlazable al ácido nucleico que comprende unas partículas
de sílice magnéticas que constan de óxido metálico
super-paramagnético, donde las partículas de sílice
magnético tienen una superficie específica de unos 100 a
aproximadamente 800 m^{2}/g.
Pal, M., y cols., J. Magnetism Magnetic Materials
164(1996), 256-260 se refiere a la ferrita de
níquel-zinc nanocristalina preparada por la vía del
vidrio cerámico.
El procedimiento conocido de técnicas anteriores
permite el enlace selectivo de ácidos nucleicos a superficies de
vidrio en soluciones salinas caotrópicas y separando los ácidos
nucleicos de contaminantes como la agarosa, las proteínas o residuos
celulares. Para separar las partículas de vidrio de los
contaminantes conforme al método anterior, se centrifugarán las
partículas o bien se extraerán los fluidos a través de filtros de
fibra de vidrio. No obstante, esta es una etapa limitadora que
impide que el procedimiento sea utilizado para procesar grandes
cantidades de
muestras.
muestras.
Se ha demostrado que las partículas magnéticas
recubiertas de una superficie de vidrio ofrecen ventajas
considerables para aislar materiales biológicos. Si las partículas
magnéticas no se han puesto en contacto con un campo magnético, la
gravedad es la única fuerza que puede hacer que éstas sedimenten. Se
pueden volver a suspender agitando la solución. El procedimiento de
sedimentación que no utiliza un campo magnético actúa más lentamente
que la inmovilización de materiales biológicos en la superficie de
las partículas. Esto es especialmente cierto para los ácidos
nucleicos. Las partículas magnéticas pueden ser recogidas fácilmente
en un lugar específico en el fluido de muestra por medio de un
imán. Luego el fluido se separa de las partículas, y por ello de los
materiales biológicos inmovilizados.
El uso de partículas magnéticas para inmovilizar
ácidos nucleicos después de la precipitación añadiendo sal y etanol
se ha descrito en Anal. Biochem. 201,
166-169(1992) y PCT GB 91/00212. En este
procedimiento, los ácidos nucleicos son aglutinados junto con las
partículas magnéticas. El aglutinado se separa del disolvente
original aplicando un campo magnético y realizando una etapa de
lavado. Después de una etapa de lavado, los ácidos nucleicos se
disuelven en una solución amortiguadora Tris. Este procedimiento
tiene, sin embargo, un inconveniente. La precipitación no es
selectiva para los ácidos nucleicos. Más bien lo que ocurre es que
una variedad de sustancias sólidas y disueltas se aglutinan y como
resultado de ello este procedimiento no puede ser utilizado para
eliminar cantidades significativas de algunos inhibidores de
reacciones enzimáticas específicas. También se dispone de vidrio
poroso y magnético en el mercado actual, que contiene partículas
magnéticas en una matriz porosa de vidrio y está cubierto de una
capa que contiene estreptavidina. Este producto puede ser utilizado
para aislar materiales biológicos, por ejemplo, proteínas o ácidos
nucleicos, si se modifican en una etapa de preparación compleja
para que puedan formar un enlace covalente con la biotina. Los
adsorbentes especialmente magnetizables resultaban ser muy eficaces
y adecuados para la preparación automática de las muestras. Pueden
utilizarse pigmentos ferrimagnéticos y ferromagnéticos así como
superparamagnéticos con esta finalidad.
Las partículas, según el experto, son materiales
sólidos que tienen un diámetro pequeño. A partículas como éstas
también se les denomina pigmentos.
Dichos materiales se conocen como sustancias
magnéticas que son atraídas por un imán, es decir, materiales
ferromagnéticos o superparamagnéticos, por ejemplo. El
superparamagnetismo se considera como ventajoso y preferible en la
tecnología actual (por ejemplo, US 5.928.958; US 5.925.573; EP 757
106). El vidrio o las superficies de organosilanos a menudo se
tratan para ser utilizadas para reacciones de captura
bioespecíficas, por ejemplo, US 5.928.958, US 5.898.071, US
5.898.071, US 5.925.573, EP 5.925.573, EP 937 497, US 4.554.088 o
bien US 4.910.148. Alternativamente, las superficies de vidrio o de
organosilanos se pueden tratar con varios disolventes o sales para
modificar su hidrofilicidad y/o electropositividad, por ejemplo, US
5.438.127.
Sin embargo, los grupos de silanol no
derivatizados de la superficie de vidrio o de silano se pueden
utilizar para la adsorción con fuerzas
físico-químicas puras en unas condiciones de
reacción adecuadas, tal como se ha descrito en DE 195 20 964, DE
195 37 985, WO 96/41840, WO 96/41811, EP 7575 106 o bien US
5.520.899. Generalmente, los núcleos magnéticos o los agregados de
núcleos magnéticos se cubren de una superficie de vidrio que se
forma por un proceso sol-gel catalizado en un medio
ácido o básico. Estas partículas se denominan partículas
núcleo-cáscara. La cáscara o envoltura de vidrio
tiene un grosor de capa típico (ver por ejemplo DE 195 20 964)
donde el tamaño y la forma del pigmento, que puede contener un
soporte no magnético como, por ejemplo, mica además del óxido
metálico magnético, determina el tamaño y la forma de la partícula
producida (ver, por ejemplo, DE 195 37 985 y WO 96/41811
correspondiente). Para obtener una actividad superficial elevada, se
utiliza material de vidrio de elevada porosidad (ver, por ejemplo,
EP 757 106; WO 99/26605). Además, se describen partículas
magnéticas compuestas, por ejemplo, óxido férrico cubierto de
silicato con una matriz de sílice inorgánica de partículas de
sílice (EP 757 106) o mezclas de vidrio y gel de sílice
(WO95/06652).
El problema que tiene que ser resuelto por la
invención actual puede consistir en lograr partículas de vidrio
magnéticas con mejores propiedades para la preparación de las
muestras y para los análisis biológicos, en particular para los
procesos automatizados.
Las deficiencias de las partículas de vidrio
magnéticas de la tecnología actual se ven superadas por los
hallazgos de la presente invención.
Un objetivo de la invención consiste en lograr
una composición de partículas de vidrio magnéticas. Las partículas
de vidrio magnéticas (PVMs) conforme a la presente invención son una
dispersión sólida de pequeños núcleos magnéticos en vidrio. Las
PVMs son comparativamente pequeñas y son básicamente esféricas. El
contenido fino no magnético de una composición de PVMs es muy bajo
debido al método de su preparación. El resultado de ello es que las
suspensiones de PVMs sedimentan lentamente y por tanto pueden ser
utilizadas para procesos en biología molecular que puedan ser
automatizados. En una configuración de la invención, se dispone de
composiciones y suspensiones de PVMs conforme a la presente
invención. En otra configuración de la invención se dispone de un
método para la composición de las PVMs. En otra configuración de la
invención se dispone de un método para la purificación de ADN o
ARN, en el cual se utilizan PVMs conforme a la presente
invención.
Un objetivo de la presente invención consiste en
lograr una composición de partículas de vidrio magnéticas que sean
básicamente esféricas y tengan un diámetro pequeño y contengan al
menos un objeto magnético con un diámetro entre 5 y 500 nm. Esto
tiene unas consecuencias sorprendentes en la cinética de
sedimentación, cuantificadas por los valores de la mitad del tiempo
t_{1/2}, que es el tiempo transcurrido hasta que el 50% de las
partículas hayan sedimentado de un volumen específico (ver ejemplo
6). El periodo de vida media para la sedimentación de una
suspensión de 3 mg/ml de peso por volumen de la composición en
isopropanol es mayor a 3 min., preferiblemente 4 min., más
preferiblemente 6 min. Sin embargo, los valores más preferidos para
el periodo de vida media son superiores a 10 min. o incluso a 20
min. Cuanto menor y más cercano a la esfera ideal, más largo será el
tiempo en que las PVMs estén en suspensión. Esto puede explicarse
por el hecho de que cuanto más se acerque a una esfera ideal, menor
será la posibilidad de que dos o más partículas se adhieran y formen
agregados que puedan sedimentar más rápidamente. Estos datos se
muestran en el ejemplo 6 y las imágenes de microscopía electrónica
de alta resolución pueden verse en la figura 4 a la figura 10. Esto
tiene la ventaja de que para los procesos automatizados la
intensidad de mezcla y la frecuencia de mezcla requeridas de los
recipientes de almacenamiento que contienen la suspensión de PVM se
reducen ya que la dosificación reiterada de un volumen específico de
suspensión de PVM procedente de un volumen en exceso aspirado en
una jeringa es más fácil (distribución más precisa con respecto a
masa_{PVM}/volumen).
Las PVMs conforme a la presente invención son
gotitas de vidrio en las cuales se dispersan objetos magnéticos no
agregantes muy pequeños. Dichos objetos que se conocen como
magnéticos son atraídos por un imán, es decir, por materiales
ferromagnéticos o superparamagnéticos. Se prefieren materiales
ferromagnéticos, en particular si todavía no han sido
premagnetizados. La premagnetización en este contexto equivale a
poner en contacto con un imán, lo que aumenta la remanencia. Los
materiales magnéticos preferidos son el hierro o el óxido de hierro
como, por ejemplo, la magnetita (Fe_{3}O_{4}) o el
Fe_{2}O_{3}, preferiblemente
\gamma-Fe_{2}O_{3}. En principio, se podría
utilizar ferrita de bario, níquel, cobalto, aleaciones de
Al-Ni-Fe-Co o bien
otros materiales ferro- o ferrimagnéticos. Los objetos magnéticos
pueden ser, por ejemplo, un pigmento magnético. El tamaño de los
objetos magnéticos se sitúa en la escala de los nanómetros, es
decir, conforme a la presente invención, el diámetro se encuentra
entre 5 y 500 nm, preferiblemente, entre 10 y 200 nm, más
preferiblemente, entre 15 y 50 nm. Los pigmentos magnéticos
apropiados son fabricados por la compañía CERAC y tienen un diámetro
medio de 23 nm y constan de
\gamma-Fe_{2}O_{3} (superficie BET de 50
m^{2}/g, CERAC: P.O.Box 1178, Milwaukee, Wilconsin
53201-1178 USA; nº artículo I-2012).
Las partículas de vidrio magnéticas conforme a la presente
invención se caracterizan además por el hecho de que los PVMs tienen
un diámetro de partícula entre 0,5 y 5 \mum, preferiblemente
entre 1 y 2 \mum, determinado por microscopía electrónica de alta
resolución, mientras que los objetos mecánicos tienen un diámetro
entre 5 y 500 nm, preferiblemente entre 10 y 200 nm, más
preferiblemente del orden de 15 a 50 nm, tal como se ha dicho antes.
De ahí que, las PVMs de la presente invención se caractericen
además por un cociente de diámetros del núcleo de pigmento orgánico
respecto a la partícula de vidrio magnética de menos del 1 por 10,
en función de lo que indique la microscopía electrónica de alta
resolución. Debido a estos cocientes de diámetro así como a la
ausencia de algún portador inerte eso determinaría la forma y el
tamaño de las partículas, mientras que la geometría de las PVMs y el
número de objetos magnéticos incorporados son determinados por las
condiciones de fabricación. Las PVMs según la presente invención
son microporosas pero tienen una superficie altamente estructurada y
por tanto relativamente grande con más de 6 m^{2}/g.
Preferiblemente, las partículas de vidrio magnéticas de acuerdo con
la presente invención tienen un área superficial del orden de 5 a
100 m^{2}/g, preferiblemente de 5 a 90 m^{2}/g, más
preferiblemente del orden de 10 a 50 m^{2}/g, más preferiblemente
del orden de 15 a 30 m^{2}/g. Esta superficie es aproximadamente
el doble del tamaño de las partículas descritas en DE 195 37 985.
Esta se puede determinar mediante el método de
Braunauer-Emett-Teller usando un
aparato comercial automatizado (ver ejemplo 4). Para comentar este
método, familiarmente llamado método BET, ver S. Braunauer. The
Adsorption of Gases and Vapors, Vol.1, Princeton University Press,
1943.
Por ejemplo, la muestra
EJ0096.5R-01 que tiene un interés preferencial (ver
ejemplo 1 y tabla 1 a tabla 3 para un resumen de los parámetros de
producción) tiene una superficie BET de 26.8525 m^{2}/g, un área
de microporo de 2.3058 m^{2}/g y un diámetro de poro medio de
24.9132 nm. Esto significa que la superficie del poro es inferior
al 10% de la superficie total y que la partícula de vidrio magnética
es microporosa.
Un poro se entiende como una cavidad pequeña en
la superficie externa de la partícula. La superficie llega tan
lejos en la partícula que una línea perpendicular trazada en la
cavidad por la superficie corta la partícula al menos una vez en la
dirección del entorno adyacente de la partícula. Además, los poros
penetran en la partícula hasta una profundidad que es mayor a un
radio del poro.
La cinética de sedimentación más lenta, la mayor
superficie y la forma esférica inhibidora de la agregación se
manifiestan ellas mismas en el mejor rendimiento funcional como
adsorbentes en el diagnóstico del ácido nucleico (ver ejemplos 3, 5
y 7) si se comparan con las solicitudes de patentes alemanas DE 198
54 973- o bien DE 198 55 259-. Este criterio puede ser cuantificado
por un cambio de los ciclos umbral en los denominados análisis o
ensayos TaqMan®, el cociente señal respecto a ruido y del límite de
detección inferior valorado estadísticamente. Los métodos para este
análisis son publicados en WO92/02638 y las correspondientes
patentes americanas US 5.210.015, US 5.804.375, US 5.487.972). Los
experimentos con indicadores radioactivos (ver ejemplo 5.2)
indicaban que el comportamiento respecto al enlace al ADN y al ARN
era el mismo si se comparaba con material de referencia ya conocido
en la actualidad. Sorprendentemente, los parámetros de producción
tenían una influencia en el rendimiento en los experimentos con
indicadores radioactivos. Otra ventaja del tipo de PVM de la
presente invención es que ninguna tensión en la capa de vidrio
puede conducir a producir fisuras durante el proceso de secado y a
las lesiones correspondientes en la cáscara o cobertura de vidrio
debido a la estructura interna (dispersión sólida de pequeños
núcleos magnéticos en una gota de vidrio). Esto puede ser
investigado mediante métodos productores de imágenes (ver ejemplo
3).
Otra configuración de la presente invención es
una suspensión de partículas magnéticas. Resulto obvio para el
experto en la materia preparar una suspensión añadiendo un líquido a
una composición de PVMs y mezclar la suspensión hasta lograr su
homogeneidad. Un líquido conforme a la presente invención puede
comprender algo de líquido que no influya en la estabilidad de las
partículas magnéticas y que pueda ser utilizado para preparar una
suspensión homogénea.
Preferiblemente se usan líquidos que son
adecuados para los procesos en biología molecular, en particular
los procesos de purificación del ácido desoxirribonucleico (ADN) o
del ácido ribonucleico(RNA) que pueden utilizar el enlace de
estas sustancias a las partículas de vidrio en ciertas condiciones.
Los líquidos preferidos comprenden alcoholes o cualquier mezcla de
los mismos con agua o cetonas. Los alcoholes incluirán de acuerdo
con la invención, en primer lugar alcoholes primarios, secundarios o
terciarios de fórmula general R-OH donde R equivale
a la fórmula general
-(-CH_{2})_{n}-CH_{3} con n>=0. Sin
embargo, también se pueden usar otros alcoholes si son adecuados
para los fines de la biología molecular, como por ejemplo el
glicerol. Son particularmente adecuados el isopropanol, el etanol o
las mezclas de los mismos con agua, preferiblemente una mezcla de
80 partes en volumen de isopropanol con 20 partes en volumen de
agua. En otra configuración de la invención el líquido consta de
cetonas como, por ejemplo, acetona. En una configuración preferida
de la invención, estas suspensiones contienen entre 5 y 60 mg/ml de
PVMs. En otra configuración de la invención, las PVMs se suspenden
en soluciones acuosas amortiguadas que pueden contener de forma
opcional un agente caotrópico en una concentración entre 2 y 8
mol/l, y preferiblemente entre 4 y 6 mol/l. Las sales caotrópicas
pueden ser yoduro sódico, perclorato sódico, tiocianato de
guanidina, isotiocianato de guanidina o hidroclorito de guanidina.
También son posibles otros compuestos. Un agente caotrópico conforme
a la presente invención será cualquier sustancia química que altere
la estructura ordenada del agua líquida y tendrá el efecto de que el
ADN o el ARN se enlazarán a las PVMs según la presente invención si
este agente está presente en la solución que contiene ADN o ARN. El
técnico está habituado a preparar soluciones amortiguadoras o tampón
acuosas adecuadas. Los sistemas tampón que se pueden utilizar para
fines de biología molecular pueden hallarse, por ejemplo, en
Sambrook y cols. (1989); Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Universitty Press, New York, NY; USA. Las sustancias tampón
preferidas son la
tris-hidroximetilamina(TRIS), fosfato,
N-(2-hidroxietil)
piperazina-N'-(2-etanosulfónico)(HEPES),
sales de las mismas o bien otras sustancias adecuadas.
Adicionalmente, pueden estar presentes algunas sustancias que
modifiquen la fuerza iónica de la solución, como por ejemplo, NaCl,
KCl o CaCl_{2}, o bien que sean agentes complejantes del catión
metálico, como por ejemplo, el ácido
etilen-diamina-tetracético (EDTA) o
sales de los mismos. El material biológico conocido por el experto
también puede estar presente. En otra configuración de la
invención, la suspensión de PVMs puede contener además ADN o ARN
opcionalmente, en una mezcla con proteínas, ácidos grasos,
carbohidratos y otro material de origen biológico. En otra
configuración de la invención, el líquido puede contener una mezcla
de uno o varios constituyentes seleccionados del grupo de los
alcoholes, cetonas, soluciones acuosas tamponadas, agentes
caotrópicos, sustancias que modifiquen la fuerza iónica de la
solución, agentes complejantes, material biológico, ADN o ARN todo
con las características anteriormente descritas.
En otra configuración de la invención se dispone
de un tubo o recipiente de reacción que contiene la suspensión
conforme a la invención. El tubo puede ser de plástico pero puede
ser parte de una estructura mayor, por ejemplo, parte de una
microplaca en un formato de 96 ó 384 pocillos. En otra configuración
de la invención se dispone de un recipiente de almacenamiento que
contiene una composición de partículas de vidrio magnéticas o
suspensiones de las mismas.
En otra configuración de la invención se dispone
de un estuche de piezas que comprende un recipiente de
almacenamiento que contiene las partículas de vidrio magnéticas o
una suspensión de las mismas según la presente invención. El
estuche puede ser utilizado para la purificación del ADN o ARN.
Dichos estuches, conocidos en la actualidad, comprenden además
material de plástico que se puede utilizar durante el procedimiento
de purificación como, por ejemplo, microplacas de valoración en el
formato de 96 ó 384 pocillos o bien simplemente tubos de ensayo
fabricados por Eppendorf, Hamburg, Alemania. El estuche puede
constar además de una solución de lavado que sea adecuada para la
etapa de lavado de las partículas de vidrio magnéticas cuando el ADN
o el ARN formen un enlace con ellas. A menudo la solución de lavado
se encuentra como una solución madre que tiene que diluirse antes
de ser empleada. El estuche puede constar además de un eluyente, es
decir, una solución o un tampón (por ejemplo, TE, Tris 10 mM, EDTA
1 mM, pH 8,0) o bien agua pura para eluir el ADN o el ARN enlazados
a las partículas de vidrio magnéticas. Además otros reactivos
pueden estar presentes y ser utilizados para el proceso de
purificación de un ácido nucleico, por ejemplo ADN o ARN. En una
configuración de la invención el estuche de las piezas conforme a la
presente invención se utiliza para la purificación de un ácido
nucleico.
\newpage
En una configuración de la invención se puede
usar la composición de PVMs para preparar una suspensión tal como se
ha descrito.
En otra configuración de la invención las
suspensiones conforme a la presente invención se pueden utilizar
para la purificación de ácidos nucleicos, es decir ARN o ADN de
mezclas complejas con otras sustancias biológicas que las
contengan. Por lo que también se pueden purificar mezclas de
distintos ácidos nucleicos, incluso mezclas que contienen un ácido
nucleico de interés en un nivel bajo. El efecto de purificación es
el resultado del comportamiento del ADN o del ARN para enlazarse a
las partículas de vidrio magnéticas en unas ciertas condiciones,
por ejemplo, en presencia de cierta concentración de un agente
caotrópico. Preferiblemente, las PVMs enlazadas al ADN o ARN se
lavan al menos una vez, preferiblemente con una mezcla de 70 partes
en volumen de etanol con 30 partes en volumen de agua ("70% de
etanol"). Después, las condiciones se invierten, por ejemplo, la
concentración de agente caotrópico se reduce para eluir el ADN o el
ARN enlazado a las PVMs. Preferiblemente, esto se lleva a cabo
triturando las partículas de vidrio magnético, por ejemplo, mediante
una fuerza de gravedad o usando un imán, y volviéndolas a suspender
en una solución sin o bien con una mínima cantidad de agente
caotrópico. Alternativamente, la solución puede ser diluida con una
solución sin o bien con una cantidad mínima de agente caotrópico.
El ADN o ARN purificado se utilizarán para otras reacciones.
Otro objetivo de la invención consiste en
disponer de un método de producción para las PVMs conforme a la
presente invención. Un vidrio conforme a la presente invención
resulta ser un material amorfo que contiene silicio. El vidrio
puede contener otros materiales como
Ba_{2}O_{3}(0-20%), CaO
(0-20%), BaO(0-10%),
K_{2}O(0-20%),
Na_{2}O(0-20%),
MgO(0-18%),
Pb_{2}O_{3}(0-15%). El vidrio puede
contener también un porcentaje inferior (0-5%) de
una serie de otros óxidos como el Mn_{2}O_{3}, TiO_{2},
As_{2}O_{3}, Fe_{2}O_{3}, CuO, CoO, etc.
Se prefieren especialmente los vidrios que se
forman usando el proceso sol gel descrito en WO 96/41811 y luego
secados y comprimidos. Los principios básicos de este proceso son
conocidos y han sido descritos, por ejemplo, en C.J.Brinker, G.W.
Scherer "Sol Gel Science- The Physics and Chemistry of Sol Gel
Processing", Academic Press Inc. 1990, Sol-Gel
Optics, Processing and Applications, Lisa C. Klein, Ed. Kluwer
Academic Publishers 1994, p. 450 ff., y en
DE-A-1941191,
DE-A-3719339,
DE-A-4117041,
DE-A-4217432 y WO 96/41811.
En principio, en el proceso
gel-sol, los alcóxidos de componentes que forman la
red, por ejemplo, SiO_{2}, B_{2}O_{3}, Al_{2}O_{3},
TiO_{2}, ZrO_{2}, GeO_{2} se combinan con óxidos y sales de
otros componentes, por ejemplo, en una solución de alcoholes y
luego se solubilizan. La ecuación siguiente describe el
procedimiento para fabricar un vidrio de silicato de boro aluminio
sódico:
\vskip1.000000\baselineskip
El agua se añade para empezar el proceso de
hidrólisis de los componentes de partida. La reacción evoluciona de
un modo bastante rápido porque los iones alcalinos tienen un efecto
catalítico en la velocidad de hidrólisis del éster de ácido
silícico. Una vez se forma el gel puede secarse y densificarse (o
condensarse) por medio de un proceso térmico para formar
vidrio.
En una configuración de la invención la matriz de
vidrio se fabrica mediante la síntesis sol-gel
catalizada en un medio ácido o básico tal como muestran
esquemáticamente las figuras 1 y 2 y se describen con detalle en el
ejemplo 1. Aquí se utilizan sistemas coloidales donde al principio
se dispersan los constituyentes sólidos en la fase líquida (=sol) y
después se conectan unos con otros como un modelo alveolar o de
panal (=gel). La composición del vidrio (código EJ) se calcula a
partir de la cantidad de eductos y equivale al 70,67% molar de
SiO_{2}, 14,33% molar de B_{2}O_{3}, 5,00% molar de
Al_{2}O_{3}, 4,00% molar de K_{2}O, 2,00% molar de CaO, 4,00%
molar de ZnO. La composición del vidrio (código RN) era del 74,00%
molar de SiO_{2}, 15,00% molar de B_{2}O_{3}, 5,00% molar de
Al_{2}O_{3}, 4,00% molar de K_{2}O, 2,00% molar de CaO. La
composición del vidrio (código EP) era de 73,61% molar de SiO_{2},
14,93% molar de B_{2}O_{3}, 5,21% molar de Al_{2}O_{3},
4,17% molar de K_{2}O, 2,08% molar de CaO.
\newpage
La reacción puede describirse del modo
siguiente:
O bien catalizada por ácido, por ejemplo:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- BCl_{3} + 3 H_{2}O \rightarrow B(OH)_{3} + 3H^{(+)}Cl^{(-)}
- \quad
- AlCl_{3} + 3 H_{2}O \rightarrow Al(OH)_{3} + 3H^{(+)}Cl^{(-)}
- \quad
- SiCl_{4} + 4 H_{2}O \rightarrow Si(OH)_{4} + 4H^{(+)}Cl^{(-)}
- \quad
- Na^{(+)}NO_{3}{}^{(-)} + H_{2}O \rightarrow Na^{(+)}OH^{(-)} + H^{(+)}NO_{3}{}^{(-)}
- \quad
- K^{(+)(-)}OOCCH_{3} + H_{2}O \rightarrow K^{(+)}OH^{(-)} + H^{(+)(-)}OOCCH_{3}
\vskip1.000000\baselineskip
O catalizada por una solución alcalina, p.ej:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- K^{(+)(-)}OCH_{2}CH_{3} + H_{2}O \rightarrow K^{(+)}OH^{(-)} + HOCH_{2}CH_{3}
- \quad
- Na^{(+)(-)}OCH_{3} + H_{2}O \rightarrow Na^{(+)}OH^{(-)} + HOCH_{3}
- \quad
- Al^{(3+)}[^{(-)}OCH_{2}CH_{2}CH_{3}]_{3} + 3 H_{2}O \rightarrow Al(OH)_{3} + 3 HOCH_{2}CH_{2}CH_{3}
- \quad
- B(OCH_{2}CH_{3})_{3} + 3 H_{2}O \rightarrow B(OH)_{3} + 3 HOCH_{2}CH_{3}
\vskip1.000000\baselineskip
Los hidróxidos condensan en los correspondientes
óxidos que forman una red tridimensional, la matriz de vidrio amorfo
de SiO_{2}/B_{2}O_{3}/Al_{2}O_{3} con iones metálicos que
ocupan lugares intersticiales. Además de los iones metálicos
alcalinos y alcalinotérreos capturados, pueden incorporarse a la
matriz como iones de metales de transición, por ejemplo, Zn^{2+} y
Zr^{2+} como agentes modificadores de la red.
En otra configuración de la invención, el vidrio
puede fabricarse con métodos tecnológicos actuales mezclando
material bruto SiO_{2} y carbonatos de metales alcalinos o
alcalinotérreos Na_{2}CO_{3}, K_{2}CO_{3} o CaCO_{3}.
La reacción se puede describir del modo
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Na_{2}CO_{3} + SiO_{2} \rightarrow Na_{2}SiO_{3} (=Na_{2}O'SiO_{2}) + CO_{2}{}^{\shortuparrow}
- \quad
- K_{2}CO_{3} + SiO_{2} \rightarrow K_{2}SiO_{3} (=K_{2}O'SiO_{2}) + CO_{2}{}^{\shortuparrow}
- \quad
- CaCO_{3} + SiO_{2} \rightarrow CaSiO_{3} (=CaO'SiO_{2}) + CO_{2}{}^{\shortuparrow}
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo en la mayoría de casos, no se trata
de una matriz de silicato puro sino que de una matriz de silicato de
borato-aluminato, por ejemplo, respecto al elemento
que forma parte de la red (una parte de SiO_{2} es sustituida por
B_{2}O_{3} y Al_{2}O_{3}).
El cociente sol : pigmento tiene un efecto
considerable en el rendimiento de las partículas aportadas por esta
invención. Resulta esencial para el proceso que el sol (coloide
líquido) pueda ser todavía bombeado y pulverizado.
Para crear un polvo se pulveriza preferiblemente
la suspensión a través de una tobera de doble fluido tal como se ha
descrito en la figura 1 y en el ejemplo 1.3. Los sistemas apropiados
para el secado por pulverizado son fabricados por Nubilosa
Molekularzerstaubung, Ladisch GMBH & Co. KG, Konstanz, Germany,
por ejemplo, el "Labor-Zerstäubungstrockner (tipo
LTK)" o por Büchi AG; Uster, Switzerland, por ejemplo, la Mini
Spray Dryer (tipo B-191).
Debido a que las proporciones de los diámetros de
los núcleos magnéticos respecto a la envoltura de vidrio son
inferiores a 1 a 10, preferiblemente entre 1:10 y 1:1000, la
geometría y el número de núcleos magnéticos incorporados de sus
soportes inertes no determina la forma y el tamaño de las partículas
sino que las condiciones de fabricación, en particular las
condiciones durante el secado por pulverización.
En otras palabras, la elección de presión,
temperatura de entrada, temperatura de salida y velocidad de flujo
durante el procedimiento de secado por pulverización son los grados
de libertad que determinarán la distribución del tamaño, la forma de
las gotas de vidrio y por ello modificarán las PVMs.
Al aumentar la presión de pulverización, la
distribución del tamaño varia al campo de las submicras. La
temperatura reducida del proceso de secado por pulverización
conducirá a una evaporación más lenta del disolvente y con ello la
forma de las PVMs serán más próximas a las de una esfera ideal, es
decir, el ratio de los radios en el plano xy- y xz llegará a ser de
aproximadamente 1. El ratio de los radios variará entre 0,8 y 1,2,
preferiblemente entre 0,9 y 1,1.
En una configuración preferida de la invención
las toberas se calientan. La temperatura de entrada se sitúa entre
120ºC y 500ºC, preferiblemente entre 170ºC y 230ºC o 150ºC y 230ºC,
más preferiblemente entre 150ºC y 200ºC o 190ºC y 210ºC o bien a
200ºC o algo menos. La temperatura de salida depende del punto de
ebullición del sol y por ello del disolvente, y puede ser igual o
ligeramente menor, es decir, menor de 10ºC del punto de ebullición
del disolvente. Si se utiliza etanol como disolvente, se encuentra
entre 50ºC y 300ºC, preferiblemente 70ºC y 150ºC, más
preferiblemente entre 80ºC y 110ºC. La temperatura óptima se
encuentra entre 90ºC y 100ºC. La presión de la tobera es superior a
3 bar, y se regula preferiblemente entre 4 y 6 bar. El experto
apreciará el hecho de que los parámetros exactos dependan del
sistema de secado por pulverización utilizado. Sin embargo, puede
trasladar los conocimientos de la presente invención a cualquier
otro secado por pulverización y descubrir los parámetros teniendo
en cuenta la información de esta invención. Las fórmulas tal como se
describen en Masters: Spray Drying Handbook, Fifth edition, John
Wiley & Sons, 1991, New York pueden mostrar el camino para
averiguar que parámetros tienen que elegirse para otra
configuración. Preferiblemente, el experto consultará los manuales
de su sistema de secado por pulverización o bien entrará en contacto
con el servicio técnico del fabricante del sistema de secado por
pulverización.
Para optimizar el rendimiento, la densificación o
la temperatura de sinterizado deberían ser lo más elevadas posible,
es decir, ligeramente inferiores al punto de fusión. Sin embargo, si
éste es demasiado elevado, las partículas se pegarán y formarán
aglomerados que tendrán que ser tamizados. Si es demasiado bajo, las
PVMs no se densificarán de forma óptima. El tratamiento adicional
de las partículas a una temperatura demasiado elevada dará lugar a
una pérdida de las propiedades magnéticas. Deberían evitarse pues
temperaturas demasiado elevadas. Las temperaturas exactas dependen
de la composición del vidrio pero pueden situarse entre 400ºC y
1200ºC. En el caso de una composición de vidrio EJ la temperatura de
sinterizado se sitúa entre 720ºC y 770ºC, preferiblemente alrededor
de 750ºC. La habilidad del experto consiste en averiguar las
temperaturas para cada composición de vidrio teniendo en cuenta la
teoría de la presente invención. De acuerdo con la presente
invención, el polvo de PVM secado por pulverización puede ser
tratado tal como se muestra en la figura 2 y descrito en el ejemplo
1.4. Preferiblemente, el polvo se calentará durante 1 hora a 200ºC,
opcionalmente se enfría a temperatura ambiente y se calienta a
750ºC (densificación o temperatura de sinterizado) en una atmósfera
de nitrógeno con una velocidad de calentamiento de 1 K/min y se
mantiene a esa temperatura durante 1 hora. Luego el horno se enfría
a 150ºC u se calienta de nuevo a 200ºC durante una hora al aire.
Después de enfriarse a temperatura ambiente, el polvo se transfiere
a un tamiz (50 \mum) y se tamiza durante 30 min. La muestra
tamizada o filtrada se embotella y esteriliza a 200ºC durante 4
horas y luego se enfría a 80ºC. A continuación se retiran los
frascos de vidrio del horno, se cubren con una lámina estéril y se
cierran.
Sorprendentemente, las partículas magnéticas
sobre las que informa la invención son especialmente adecuadas para
aislar materiales biológicos de las muestras. Además, el material
del núcleo es una fuente natural y por tanto causa pocos trastornos
ecológicos. Además, las partículas conforme a la invención son
baratas y fáciles de fabricar.
Otro objetivo de la invención es un procedimiento
para aislar material biológico poniendo una muestra que contiene el
material biológico en un líquido en contacto con las partículas
magnéticas conforme a la invención en unas condiciones en las
cuales el material biológico forma un enlace con la superficie de
las partículas y separando el material biológico del líquido. Según
la invención, el término "en un líquido" significa que el
líquido puede ser añadido a la muestra antes de que se añadan las
partículas magnéticas. Sin embargo, también comprenderá la
situación en la que la propia muestra tenga una viscosidad baja y
sea propiamente un líquido de manera que no tenga que añadirse
líquido o tampón adicional a la muestra para la preparación de la
muestra, lo que se puede hacer añadiendo agentes sólidos antes de
añadir las partículas magnéticas. El orden de la adición de
reactivos puede variar según los requisitos del proceso.
Los materiales biológicos se entiende que son
materiales con una base molecular o particular. Incluyen, en
particular, células como virus o bacterias, así como células
aisladas de organismos multicelulares, por ejemplo, células humanas
y animales como los leucocitos, y compuestos de bajo y alto peso
molecular inmunológicamente activos como los haptenos, antígenos,
anticuerpos y ácidos nucleicos. Se prefieren en particular ácidos
nucleicos como el ADN o ARN. En una configuración de la invención,
se purifican mezclas de ácidos nucleicos específicos, en los cuales
el(los) ácido nucleico diana o específico puede ser un
componente minoritario en términos de concentración (o puede estar
presente en poca abundancia). De acuerdo con la presente invención,
un ácido nucleico diana será el ácido nucleico de interés, es
decir, un ácido nucleico que se investigará como si su presencia
indica una cierta situación o enfermedad de un humano o de un
animal. Por ejemplo, la presencia de una secuencia vírica (por
ejemplo, del virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C o
virus de inmunodeficiencia humana) indica que el individuo
correspondiente está infectado por el virus específico. Por
consiguiente, esta secuencia vírica sería la secuencia diana u
objetivo. Otras secuencias diana son secuencias que son indicativas
de una predisposición de un individuo a una cierta enfermedad como,
por ejemplo, una enfermedad hereditaria como la anemia
drepanocítica o ciertos tipos de cáncer. Estos ejemplos reflejan la
invención pero no la delimitan.
Las muestras conforme a la invención incluyen
muestras clínicas como sangre, suero, orina, fluido cerebral,
esputo, heces, muestras de biopsias y muestras de médula ósea. La
muestra puede ser también de un tipo usado para el análisis
ambiental, el análisis de alimentos o la investigación en biología
molecular, por ejemplo, de cultivos bacterianos, lisados de
bacteriófagos y productos de procedimientos de amplificación como el
PCR.
El procedimiento descrito puede ser usado para
aislar material biológico nativo o modificado. El material
biológico nativo consiste en material cuya estructura no ha cambiado
de forma irreversible en comparación con los materiales biológicos
de aparición natural. Esto no significa que otros componentes de la
muestra no puedan ser modificados. Los materiales biológicos
modificados incluyen materiales que no se encuentran en la
naturaleza, por ejemplo, ácidos nucleicos que son modificados al
adherirles grupos que son reactivos, detectables o capaces de
inmovilización. Un ejemplo de esto son los ácidos nucleicos
biotinilados.
En ciertos casos, la muestra se puede utilizar
sin tratamiento previo en el procedimiento de aislamiento conforme
a la invención. Sin embargo, en muchos casos, la muestra debería ser
descompuesta usando un método apropiado, que liberara el material
biológico contenido en la muestra. Los procedimientos para la
destrucción o descomposición de las muestras son conocidos y pueden
ser de naturaleza química, enzimática o física. También se puede
usar una combinación de todos ellos. Por ejemplo, la lisis puede
realizarse usando ultrasonidos, presión alta, fuerzas de
cizallamiento, álcalis, detergentes o soluciones salinas
caotrópicas, o bien por medio de proteinazas o lipasas. Con
respecto al procedimiento de lisis para obtener los ácidos
nucleicos, se hace especial referencia a Sambrook y cols.:
Molecular Cloning, A laboratory Manual, 2nd Addition, Cold Spring
Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY y Ausubel y
cols.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and
Sons, NY.
Además del material biológico que ha de ser
aislado, la muestra puede contener también otros componentes en un
líquido como residuos celulares, proteínas, sales y otras sustancias
que no tienen que ser aisladas. Esta muestra, que contiene
preferiblemente el material biológico en forma nativa, se pone en
contacto con las partículas en unas condiciones en las que el
material biológico objetivo forma un enlace covalente con la
superficie de las partículas. Las condiciones para ello dependen
del tipo de material biológico implicado, pero son básicamente
conocidas. También dependen del método por el cual el material
biológico se enlaza a la superficie. Si se utilizan interacciones
inmunológicas para el enlace, por ejemplo, deben seleccionarse las
condiciones que sean adecuadas para la formación de complejos
inmunológicos. Si se utilizan ácidos nucleicos modificados, el
enlace puede tener lugar a través de los grupos de ácidos nucleicos
que representan la modificación, por ejemplo, la biotina a través
del enlace con superficies revestidas de estreptavidina. No
obstante, con los ácidos nucleicos en particular es preferible un
enlace directo de los ácidos nucleicos con el vidrio porque entre
otras razones los ácidos nucleicos no tienen que ser modificados e
incluso los ácidos nucleicos nativos pueden ser enlazados. El
procedimiento para enlazar ácidos nucleicos nativos a partículas de
vidrio puede ser análogo al procedimiento descrito en el método
anterior. Se lleva a cabo preferiblemente en presencia de sales
caotrópicas con una concentración entre 2 y 8 mol/l, y
preferiblemente entre 4 y 6 mol/l. Las sales caotrópicas pueden ser
el yoduro sódico, perclorato de sodio, tiocianato de guanidinio,
isotiocianato de guanidinio o bien hidroclorito de guanidinio.
También son posibles otros compuestos. Para poner la muestra en
contacto con las partículas, la muestra se mezcla con las
partículas y se incuba durante un periodo de tiempo suficiente para
que se produzca el enlace. Los expertos están familiarizados con la
duración de la etapa de incubación desde los procedimientos para
realizar el tratamiento con partículas no magnéticas. Esta etapa
puede ser optimizada determinando la cantidad de material biológico
inmovilizado en la superficie en momentos distintos. Los tiempos de
incubación entre 10 segundos y 30 minutos pueden ser apropiados para
los ácidos
nucleicos.
nucleicos.
Dependiendo del tamaño y del tipo de partículas
magnéticas, las partículas o bien se separan del fluido durante el
propio periodo de incubación o la suspensión se mantiene intacta
durante un periodo más largo de tiempo. Si las partículas son de un
tamaño superior, las partículas se separarán lentamente del fluido
durante el periodo de incubación.
La inmovilización no se efectúa a través de la
precipitación reduciendo la solubilidad de los materiales que van a
ser inmovilizados. Sino que la inmovilización se basa en las
interacciones bioespecíficas (moléculas de captura) o en la
adsorción. Esta impide que los contaminantes sean incluidos de forma
no específica.
Después de la incubación, el material biológico
se separa del líquido. Esto se consigue en general separando el
material enlazado a las partículas magnéticas aplicando un campo
magnético. Por ejemplo, las partículas magnéticas pueden ser
empujadas a la pared del recipiente en el que se realiza la
incubación. Ahora puede retirarse el líquido que contiene el
contenido de muestra que no estaba enlazado a las partículas. El
procedimiento de retirada empleado depende del tipo de recipiente
en el que se lleve a cabo la incubación. Las etapas adecuadas
incluyen la extracción del líquido por medio del pipeteo o de la
aspiración.
Las partículas magnéticas pueden ser luego
purificadas una o más veces usando una solución de lavado si se
desea. Se utiliza una solución de lavado que no haga que el material
biológico sea liberado de la superficie de partículas sino que
elimine los contaminantes no deseados lo más profundamente posible.
Esta etapa de lavado tiene lugar preferiblemente incubando la
solución de lavado con las partículas. Las partículas se vuelven a
suspender durante esta etapa mediante la agitación o aplicación de
un campo magnético que no sea idéntico al primer campo magnético.
La solución de lavado contaminada se separa preferiblemente como la
muestra en la etapa descrita antes para enlazar el material
biológico.
Después de la etapa de lavado, las partículas
magnéticas pueden ser secadas ligeramente al vacío o bien puede
dejarse evaporar el fluido. También puede llevarse a cabo una etapa
de pretratamiento usando acetona. Si se desea, el material
biológico purificado de este modo se podrá separar de las partículas
magnéticas. Esta etapa depende también de la forma en que el
material biológico estuviera ligado a las partículas magnéticas. Si
el material biológico son ácidos nucleicos nativos y las partículas
magnéticas son partículas revestidas de vidrio, los ácidos
nucleicos podrán ser retirados de las partículas conforme a la
invención usando un tampón de elución que tenga un contenido bajo
en sal. Las soluciones tampón de esta naturaleza se conocen de DE
3724442 y Analytical Biochemistry 175,
196-201(1988). Las soluciones tampón de
elución con un contenido salino bajo son particularmente soluciones
amortiguadoras con un contenido inferior a 0,2 mol/l. En una
configuración especialmente preferida, el tampón de elución
contiene Tris. En otra configuración especial, el tampón de elución
es agua desmineralizada.
En otra configuración, el procedimiento de
purificación y aislamiento descritos se realizan después de que las
células (por ejemplo, partículas víricas o células procarióticas o
eucarióticas) se separen inmunomagnéticamente de un líquido o
tejido corporal. En esta etapa, la muestra es inmovilizada, por
ejemplo, agitando con partículas magnéticas frente a las cuales un
anticuerpo se inmoviliza frente a un antígeno en la célula. Estas
partículas pueden ser partículas conforme a la invención o
partículas disponibles en el comercio (por ejemplo, MACS Microbeads
de Miltenyl Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany). Una vez
aplicado un campo magnético, se realizan una o más etapas de lavado
usando una solución salina. Se obtienen partículas a las que se
enlazan las células deseadas. Las células enlazadas se suspenden de
nuevo en una solución salina tampón. En una configuración
preferida, esta solución salina tampón es una solución salina
caotrópica de manera que los ácidos nucleicos contenidos en la
célula son liberados de las
células.
células.
Un método especialmente preferido para aislar
ácidos nucleicos de muestras que contienen células se consigue
combinando el aislamiento de las células anteriormente descrito con
el aislamiento de los ácidos nucleicos también descrito. La ventaja
de esta configuración es su simplicidad (método de tubo único),
elevada sensibilidad (especialmente importante en microbiología y
oncología médica) y la facilidad con que se puede automatizar.
Los materiales biológicos aislados usando el
procedimiento conforme a la invención pueden ser utilizados ahora
además como necesarios. Por ejemplo, pueden ser utilizados como un
sustrato para varias reacciones enzimáticas. Cuando los ácidos
nucleicos están implicados, pueden ser utilizados para establecer
secuencias, para el etiquetado radioactivo o no radioactivo, para
la amplificación de una o más de las secuencias que ellos contienen,
trascripción, hibridación con ácidos nucleicos de muestras
marcadas, conversión o enlace. Una ventaja del método conforme a la
invención es que es muy fácil separar el material biológico del
fluido. En el método anterior, se usaba una etapa de centrifugación
para separar las partículas de vidrio de los contaminantes, o bien,
cuando el material biológico se enlaza a los filtros de fibra de
vidrio, el fluido es extraído a través de los filtros. Esta es una
etapa limitadora que dificulta tratar grandes cantidades de muestra.
Los materiales biológicos pueden separarse de los contaminantes de
un modo eficaz usando las partículas conforme a la invención. En
particular, se pueden eliminar en un grado considerable los
inhibidores de ciertas reacciones enzimáticas de acuerdo con la
invención.
En la configuración preferida, las partículas
conforme a la invención se añaden a la mezcla de lisis. Después de
un periodo adecuado de tiempo para la adsorción, que puede ser
optimizado por agitación mecánica - las partículas se separan del
líquido que las rodea y que contiene unos componentes celulares
adicionales que no tienen que ser detectados. Esto se realiza
preferiblemente aplicando un campo magnético colocando un imán
frente a la pared del recipiente.
Para eliminar cualquier contaminante todavía
presente, se lleva a cabo una etapa de lavado con un fluido que no
haga que los ácidos nucleicos que van a ser determinados sean
eliminados de la superficie de vidrio. Se añade una solución tampón
de elución que presenta unas condiciones reactivas en virtud de las
cuales los ácidos nucleicos se separan de la superficie de vidrio.
Estas condiciones son en particular una solución poco salina.
Dependiendo del uso previsto de los ácidos nucleicos, el fluido
puede separarse de las partículas y ser tratado. Esta etapa de
separación se lleva a cabo preferiblemente a través de la aplicación
de un campo magnético de manera que las partículas se separan del
eluido.
Una configuración preferida de la presente
invención consiste en usar las PVMs de la presente invención en
métodos automatizables, como por ejemplo, los descritos en WO
99/16781. Un método automatizable significa que las etapas del
método son adecuadas para ser llevadas a cabo con un aparato o
máquina capaz de funcionar con o sin control externo o influencia
por parte del ser humano. Un método automatizado equivale a que las
etapas del método se llevan a cabo con un aparato o máquina capaz de
funcionar con poco o sin control externo o influencia por parte del
ser humano. Únicamente las etapas de preparación para el método
tienen que realizarse manualmente, por ejemplo, se tienen que
llenar los recipientes de almacenamiento y colocarlos en su sitio,
la elección de las muestras tiene que ser realizada por un ser
humano y otras etapas bien conocidas por el especialista en el
tema, por ejemplo, el funcionamiento del ordenador de control. El
aparato o la máquina puede añadir líquidos automáticamente, mezclar
muestras o llevar a cabo las etapas de incubación a unas
temperaturas específicas. Habitualmente, dicha máquina o aparato es
un robot controlado por un ordenador que realiza un programa en el
cual se especifican cada una de las etapas y de los mandos. Los
métodos automáticos preferidos son aquellos que se llevan a cabo en
un formato de rendimiento elevado, lo que significa que los métodos
y el aparato o máquina usados se optimizan para un rendimiento
elevado de las muestras en un tiempo corto.
En otra configuración, las PVMs conforme a la
presente invención se utilizan en un proceso semiautomático lo que
significa que algunas etapas de reacción pueden realizarse
manualmente. En una configuración preferida de la invención, se
coge una suspensión que contiene las PVMs conforme a la presente
invención de un recipiente de almacenamiento y se añaden volúmenes
parciales a los diferentes frascos de reacción. Los frascos de
reacción pueden ser tubos de ensayo hechos de plástico en un
formato de microplacas que contienen 96 ó 384 pocillos o una
cantidad superior donde se puede llevar a cabo una reacción. Sin
embargo, estos frascos pueden estar hechos de otro material, por
ejemplo, de acero.
Una configuración preferida de la invención son
los métodos de purificación seguidos de una etapa de detección o de
unos métodos de purificación seguidos de una etapa de amplificación
y detección. El ácido nucleico objetivo o los ácidos nucleicos de
interés pueden encontrarse en una matriz de ácidos nucleicos no
definidos, y pueden incluso ser un componente minoritario en dicha
mezcla de ácidos nucleicos específicos. Los métodos adecuados de
detección del ADN son conocidos por el experto en este campo y se
han descrito en manuales estándar como Sambrook y cols.: Molecular
Cloning, A laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour
Laboratory Press, Cold Spring Habour, NY and Ausubel y
cols.:Current protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and
Sons, NY. Pueden existir también otras etapas de purificación antes
de que la etapa de detección del ADN se lleve a cabo, por ejemplo,
como una etapa de precipitación. Los métodos de detección pueden
incluir pero no se limitan al enlace o intercalado de colorantes
específicos como el bromuro de etidio que se intercala en el ADN de
doble cadena y modifica su fluorescencia después de ello. El ADN
purificado puede separarse también mediante métodos
electroforéticos después de una descomposición restringida y ser
visualizado. Existen también análisis basados en pruebas que
utilizan una hibridación de oligonucleótidos a secuencias
específicas y posterior detección del híbrido. También es posible
establecer la secuencia del ADN después de etapas conocidas por el
técnico. Métodos más recientes aplican una diversidad de secuencias
de ADN al chip de silicona al cual se unen muestras específicas y
aportan una señal en caso de un enlace de secuencias
complementario.
Los métodos preferidos conforme a la invención
son los métodos de amplificación como la reacción en cadena de la
ligasa y la reacción en cadena de la polimerasa que amplifican
secuencias diana de un modo específico hasta cantidades
detectables. Los métodos de detección que se prefieren en especial
son el método TaqMan® sobre el que se informa en WO 92/02638 y las
patentes americanas correspondientes US 5.210.015, US 5.804.375, US
5.487.972. Este método utiliza la actividad de la exonucleasa de una
polimerasa para generar una señal. De un modo detallado, el ácido
nucleico es detectado mediante un proceso que comprende la puesta en
contacto de la muestra con un oligonucleótido que contiene una
secuencia complementaria a una región de la misma cadena de
secuencia del ácido nucleico objetivo o diana, pero que no incluye
la secuencia del ácido nucleico definida por el primer
oligonucleótido, para crear una mezcla de duplos durante las
condiciones de hibridación, donde los duplos comprenden el ácido
nucleico definido recocido junto al primer oligonucleótido y al
oligonucleótido marcado de manera que el extremo 3' del primer
oligonucleótido es adyacente al extremo 5' del oligonucleótido
marcado. Luego esta mezcla se trata con una polimerasa de ácido
nucleico dependiente de la plantilla que tiene una actividad
5'\rightarrow3' nucleasa en unas condiciones suficientes como para
permitir que la actividad 5'\rightarrow3'nucleasa de la
polimerasa separe el oligonucleótido marcado, recocido y libere los
fragmentos marcados; y se detecte y/o mida la señal generada por la
hidrólisis del oligonucleótido marcado. La tecnología TaqMan®
elimina la necesidad de que se forme y se haga detectable un
complejo de reacción ligado a una fase sólida.
En términos más generales, se revela un
procedimiento para la purificación de material biológico seguido de
una etapa de detección en el que la reacción de amplificación y/o
detección es una valoración multiplex de fase en solución homogénea
para la detección simultánea de múltiples objetivos (ver ejemplos
7.2).
En otra configuración de la invención, el
procedimiento de purificación descrito se combina con un método de
amplificación que utiliza uno de los métodos descritos a
continuación, preferiblemente el uso de oligonucleótidos
bloqueantes. Un problema asociado a menudo con la amplificación en
particular de grandes cantidades de ácido nucleico es la actividad
de las polimerasas termoestables a temperaturas inferiores
(temperatura ambiente hasta 40ºC). A esta temperatura los
oligonucleótidos de la capa aislante a menudo se enlazan de forma no
específica uno con otro al ácido nucleico de fondo y pueden ser
extendidos por la polimerasa. Esto ocasiona un descenso de los
componentes de reacción y conduce asimismo a un nivel superior de
señal de fondo y consecuentemente a una sensibilidad reducida.
Puede conducir a resultados falsos positivos. Para evitar una
actividad poco específica de las polimerasas se han descrito varios
métodos, como "hot-start"-PCR(Chou y
cols., 1992, Nucl. Acid Res 20, 1717.1723), de polimerasas
modificadas covalentemente (por ejemplo, AmpliTaq Gold, Perkin
Elmer) o bien anticuerpos (Scalice y cols., J).
Immunol. Methods, 172, 147-163,
1994) y oligonucleótidos (Dang and Jayasena, JMB 264,
268-278, 1996; US 5.763; US 5.693.502). Conforme a
la presente invención los oligonucleótidos de bloqueo serán
oligonucleótidos capaces de bloquear el centro activo de las
polimerasas hasta dicha temperatura. Estos oligonucleótidos pueden
ser, por ejemplo, un aptámero tal como se ha descrito en el ejemplo
7.2.2.1.3.
En otra configuración de la invención los
aptámeros (ver, por ejemplo, en el ejemplo 7.2.2.1.3) y las capas
aislantes modificadas solas (ver por ejemplo, en el ejemplo
7.2.2.1.3) se pueden usar en una reacción de amplificación y los
métodos de detección conectados a ellos. Esto tiene los efectos
ventajosos y se puede considerar como propiamente una invención que
aporta resultados superiores. En una configuración preferida de la
invención la base nucleica 3'-terminal,
preferiblemente una adenina se modifica con un residuo de
p-(t-butil)benzilo. Otras modificaciones,
que incluyen las de la posición 3'-1 se han descrito
en EP 866 071 A2, al que se hace aquí referencia.
En otra configuración de la invención para la
purificación de material biológico seguida de una etapa de detección
resulta que tienen lugar al menos 5 ciclos de la reacción en cadena
de la polimerasa, la temperatura de recocido es inferior a 8ºC,
preferiblemente menor de 3ºC por encima de la temperatura de
disociación del complejo de
polimerasa-aptámero.
Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar las
configuraciones de la invención.
Figura 1: Esquema de flujo para la producción por
síntesis & secado por pulverización del sol.
Figura 2: Esquema de flujo para la preparación de
las PVMs brutas.
Figura 3: Representación esquemática del secador
de pulverización fabricado por Nubilosa. Los detalles se describen
en el texto bajo el ejemplo 1.3.
Figura 4: Imagen de microscopía electrónica con
barrido de alta resolución de las PVMs con pigmento BM de Merck.
Figura 5: Imagen de microscopía electrónica con
barrido de alta resolución de las PVMs con pigmento CERAC.
Figura 6: Imagen de microscopía electrónica con
barrido de alta resolución de las PVMs con pigmento MMB de
Merck.
Figura 7: Imagen de microscopía electrónica con
barrido de alta resolución de las PVMs con pigmento Strem.
Figura 8: Imagen de microscopía electrónica con
barrido de alta resolución de las PVMs con pigmento FA de Basf.
Figura 9: Imagen de microscopía electrónica con
barrido de alta resolución de las PVMs con pigmento
CE-HQ de Basf.
Figura 10: Imagen de microscopía electrónica con
barrido de alta resolución de las PVMs con pigmento
CE-SU de Basf.
Figura 11: Influencia del pigmento de núcleo
magnético o del secador pulverizador en el aislamiento del ARN
(secador pulverizador: Büchi(B) o Nubilosa(N)).
Figura 12: Influencia del parámetro "Presión de
pulverización" en el aislamiento del ADN o del ARN.
Figura 13: Influencia de los distintos parámetros
de producción de PVMs en el aislamiento del ARN (presión de
pulverización, (L= aire, N= nitrógeno), temperatura de entrada (E) o
temperatura de salida(A).
Figura 14a,b: Comportamiento en la sedimentación
de diferentes PVMs en medios de suspensión distintos.
Figura 15: Imagen de HREM de la muestra
EJ0096.5R-01; PVM con pigmento CERAC.
Figura 16: Imagen de HREM de
EJ0100.5R-01, pulverizada a una presión baja y a una
temperatura elevada, que consiste principalmente de partículas
deformadas de la escala \mu.
\newpage
1 Ejemplo
1
Típicamente, los materiales en bruto como
SiO_{2} y los carbonatos alcalinos y alcalinotérreos
(Na_{2}CO_{3}, K_{2}CO_{3}, CaCO_{3}) se funden juntos.
Tipo de reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Na_{2}CO_{3} + SiO_{2} \rightarrow Na_{2}SiO_{3} (=Na_{2}O'SiO_{2}) + CO_{2}{}^{\shortuparrow}
- \quad
- K_{2}CO_{3} + SiO_{2} \rightarrow K_{2}SiO_{3} (=K_{2}O'SiO_{2}) + CO_{2}{}^{\shortuparrow}
- \quad
- CaCO_{3} + SiO_{2} \rightarrow CaSiO_{3} (=CaO'SiO_{2}) + CO_{2}{}^{\shortuparrow}
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, en la mayoría de casos se usa una
matriz de silicato, borato y aluminato, por ejemplo, pertinente a
los constituyentes de la matriz. El SiO_{2} es sustituido
parcialmente por B_{2}O_{3} y Al_{2}O_{3}. Alternativamente,
el vidrio puede ser sintetizado a través de una reacción
sol-gel. Tipo de reacción:
Reacción sol-gel catalizada por
ácidos, por ejemplo
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- BCl_{3} + 3 H_{2}O \rightarrow B(OH)_{3} + 3H^{(+)}Cl^{(-)}
- \quad
- AlCl_{3} + 3 H_{2}O \rightarrow Al(OH)_{3} + 3H^{(+)}Cl^{(-)}
- \quad
- SiCl_{4} + 4 H_{2}O \rightarrow Si(OH)_{4} + 4H^{(+)}Cl^{(-)}
- \quad
- Na^{(+)}NO_{3}{}^{(-)} + H_{2}O \rightarrow Na^{(+)}OH^{(-)} + H^{(+)}NO_{3}{}^{(-)}
- \quad
- K^{(+)(-)}OOCCH_{3} + H_{2}O \rightarrow K^{(+)}OH^{(-)} + H^{(+)(-)}OOCCH_{3}
\vskip1.000000\baselineskip
O catalizada por bases, como en nuestro caso, por
ejemplo
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- K^{(+)(-)}OCH_{2}CH_{3} + H_{2}O \rightarrow K^{(+)}OH^{(-)} + HOCH_{2}CH_{3}
- \quad
- Na^{(+)(-)}OCH_{3} + H_{2}O \rightarrow Na^{(+)}OH^{(-)} + HOCH_{3}
- \quad
- Al^{(3+)}[^{(-)}OCH_{2}CH_{2}CH_{3}]_{3} + 3 H_{2}O \rightarrow Al(OH)_{3} + 3 HOCH_{2}CH_{2}CH_{3}
- \quad
- B(OCH_{2}CH_{3})_{3} + 3 H_{2}O \rightarrow B(OH)_{3} + 3 HOCH_{2}CH_{3}
{}\hskip9.9cm\Downarrow
\vskip1.000000\baselineskip
Ventaja: los alcoholes se evaporan fácilmente
durante el secado por pulverización; idealmente no se produce
recristalización de sales en la superficie.
Por consiguiente, los alcoholatos se convierten
en hidróxidos, que dan lugar a los óxidos correspondientes por
eliminación de agua. Estos forman luego una matriz de vidrio amorfo
tridimensional que consiste en
SiO_{2}/B_{2}O_{3}/Al_{2}O_{3} en la cual ciertos
ingredientes de óxidos metálicos se encuentran como separadores del
enlace en la matriz, por ejemplo,
Para los experimentos que aquí se describen, el
componente de vidrio se producía a través de una síntesis del
sol-gel catalizada por una base. La composición del
vidrio utilizada en todos los experimentos era la siguiente (a
menos que se indique lo contrario):
70,67% molar de SiO_{2}, 14,33% molar de
B_{2}O_{3}, 5,00% molar de Al_{2}O_{3}, 4,00% molar de
K_{2}O, 2,00% molar de CaO, 4,00% molar de ZnO (calculado para la
masa de eductos especiales que entran en reacción)
Se han investigado diferentes tipos de pigmentos
magnéticos y se resumen en la tabla 1.
Los eductos se añaden siguiendo el orden y la
cantidad siguientes al recipiente calentable y en continua
agitación:
Tetraetoxisilano (TEOS) | 10700 ml |
Borato de trietilo (TEB) | 3305 ml |
K-metanolato 25% (P/V) en metanol | 1601 ml |
Etanol | 11292 ml |
Isopropanolato de aluminio | 1385 g |
Calcio | 54,4 g |
Acetato de zinc | 498 g |
A continuación se cierra el recipiente. El sol
(coloide líquido) se calienta a 70ºC y se agita durante la noche (15
h). La temperatura se regula a través de un termosensor que se
sumerge en el líquido.
Luego el sol se calienta a 90ºC y la mezcla de
alcohol/agua (etanol: 3781 ml, H_{2}O: 1512 ml) se añade a una
velocidad de 5000 ml/h. El recipiente se enfría a 20ºC después de la
adición completa de dicha mezcla.
La temperatura de entrada de la secadora de
atomización se regula a 200ºC. La presión de la tobera se regula en
6 bar y la tobera se enfría durante 3 min. con etanol. Luego la
manguera se conecta a la salida del recipiente de vidrio y el sol
que contiene pigmento es bombeado a una velocidad de 110 ml/min a la
tobera de dos fluidos (diámetro de la abertura: 2 mm; proveedor:
Nubilosa, tipo 1B1VVS1) de la secadora de atomización a través de
un dispositivo de ultrasonidos (200 W). El sistema de secado por
atomización se muestra esquemáticamente en la figura 3. Las
partículas que se forman en los dos primeros minutos se eliminan.
Después del atomizado completo del sol se coge el recipiente bajo
la ciclona (AVO, ver figura 3) con las partículas y las partículas
se tratan seguidamente tal como se ha descrito en las siguientes
etapas.
El sol que contiene el pigmento se agita en un
recipiente de agitación para impedir la sedimentación de las
partículas suspendidas. El sol se traslada del recipiente a la
tobera usando una bomba (SP). El nitrógeno calentado mediante un
calentador eléctrico (EWT) se utiliza como gas de secado. El
pigmento revestido se traslada de la cámara de secado (T) a la
ciclona (ZY). El polvo seco puede ser eliminado del recipiente (AVO)
bajo la ciclona. Mediante un filtro (SF) se extraen partículas muy
finas del nitrógeno. El secador de atomización se utiliza con
sobrepresión para impedir una entrada de aire en el secador. El
flujo de gas es producido por el soplador de gas (AV).
El polvo se traslada a una cubeta de cerámica y
se calienta en un horno a 200ºC a una velocidad de calentamiento de
1 K/min. La temperatura se mantiene a 200ºC durante una hora y luego
el horno se enfría a temperatura ambiente. La cubeta se traslada a
un horno a temperatura atmosférica con un volumen de 27 l que se
lava con 60 l de nitrógeno por hora. El horno se calienta a 750ºC
con una velocidad de calentamiento de 1 K/min y se mantiene a esa
temperatura durante 1 hora. Luego el horno se enfría a 150ºC y se
lava con 60l de aire por hora. El horno se calienta a 200ºC con una
velocidad de calentamiento de 2 K/min y se mantiene a esa
temperatura durante 1 hora y se enfría luego a temperatura
ambiente. El polvo se traslada a una criba (50 \mum) y se tamiza
durante 30 min. Después, la muestra tamizada se coloca en
recipientes de cristal, que son esterilizados sin taparse en una
estufa u horno que se calienta a 200ºC a una velocidad de
calentamiento de 1 K/min, se mantiene a esa temperatura durante 4
horas y luego se enfría a 80ºC. Seguidamente, los recipientes de
vidrio se extraen del horno, se cubre con una lámina estéril y se
cierran con una tapa.
Un resumen de los parámetros importantes del
proceso se presenta en las tablas 2 y 3 y en la tabla 3 aparecen
las muestras individuales fabricadas con algunos datos. Cada muestra
tiene un código específico. Las dos primeras letras describen la
química de vidrio usada (ver a continuación) y los cuatro números
siguientes equivalen al proceso de producción (ver tabla 2). El
número siguiente describe el pigmento usado (ver tabla 1). La letra
R significa que el contenido fino no se ha extraído, mientras que E
significa que el contenido fino se ha extraído con etanol. Los
últimos dos números describen el número del lote. La composición del
vidrio (código EJ) según se ha calculado a partir de la cantidad de
eductos era del 70,67% molar en SiO_{2}, 14,33% molar en
B_{2}O_{3}, 5,00% molar de Al_{2}O_{3}, 4,00% molar de
K_{2}O, 2,00% molar de CaO, 4,00% molar de ZnO. La composición
del vidrio (código RN) era de un 74% molar en SiO_{2}, 15% molar
en B_{2}O_{3}, 5,00% molar de Al_{2}O_{3}, 4,00% molar de
K_{2}O, 2,00% molar de CaO. La composición del vidrio (código EP)
era de un 73,61% molar en SiO_{2}, 14,93% molar en B_{2}O_{3},
5,21% molar de Al_{2}O_{3}, 4,17% molar de K_{2}O, 2,08%
molar de CaO.
\vskip1.000000\baselineskip
2 Ejemplo
2
Para obtener información acerca de la superficie,
el tamaño y la forma de las PVMs realizamos investigaciones con un
microscopio electrónico de barrido de alta resolución fabricado por
la compañía JEOL (JSM). Las muestras se esparcían en el soporte de
muestras con un adhesivo por doble cara conductor de la electricidad
y metalizado por bombardeo iónico con oro durante 36 s con una
corriente de 30 mA. Para la formación de imágenes de la superficie,
se visualizaban los electrones secundarios emitidos (topografía) así
como los electrones retrodispersados (contraste del número de
orden). El voltaje electrónico primario utilizado era de 10 kV
(electrones secundarios) o de 25 kV (electrones
retrodispersados).
La figura 4 muestra las PVCs con mica recubiertas
de óxido férrico como pigmento magnético (BM). La fisura en la
envoltura de vidrio puede verse claramente y resulta del secado por
atomización de las partículas cuando la capa empieza a contraerse
sobre un sustrato que no se contrae (fisuras del secado). Además, se
puede ver un gran número de partículas esféricas que no contienen
una de las partículas magnéticas más grandes (10-60
\mum). Estas esferas sin núcleo magnético (contenido fino no
magnético) pueden ser eliminadas en un campo magnético, pueden ser
transferidas a la reacción en cadena de la polimerasa y crear
interferencias en ella.
Las partículas con pigmento CERAC (ver figura 5)
no presentan fisuras, ya que el pigmento para imanes (tamaño de
partículas medio 23 nm) no causa fuerzas de tensión en la capa de
manera que no se crean fisuras durante el proceso de secado por
atomización. Además, también se incorporan partículas pequeñas de
CERAC al contenido fino de manera que no aparecen partículas no
magnéticas en el mismo. Las partículas son básicamente más pequeñas
que las partículas con mica que se pueden observar en estas figuras
con el mismo aumento. Las PVMs con los otros pigmentos magnéticos
se muestran con el mismo grado de aumento en las figuras 6 a 10.
\vskip1.000000\baselineskip
3 Ejemplo
3
Para permitir una evaluación de las PVMs previa a
las pruebas funcionales efectuadas actualmente se realizaron unas
mediciones físicas con las PVMs. Resultó interesante aprender algo
sobre la solubilidad del hierro en agua, la fuerza magnética, el
contenido en material fina y la densidad. A continuación se
describen los experimentos y los resultados presentados.
Para verificar si se han eliminado los finos,
1000 mg del polvo tamizado y tratado a una temperatura se pesan en
un tubo de centrifugación de 50 ml (Sarstedt), se añaden 40 ml de
agua y se dispersan agitando. Luego, el tubo se sumerge en un baño
de ultrasonidos (Sonorex RK 102H; 120/240 W) con la altura total de
llenado y se coloca en un separador magnético (Roche Diagnostics
GMBH RD nr. 1858 025). Al cabo de 3,5 min. de separación magnética,
se extrae el líquido del recipiente con una pipeta de vidrio pasteur
a la altura de la marca de 15 ml en el lado opuesto del imán y se
llena una cubeta de cuarzo de 5 mm (tipo 110-QS,
Hellma). La extinción del sobrenadante se mide en un espectrómetro
de UV-VIS-INF (Hitachi
U-3000) frente a una cubeta correspondiente llena
de agua desionizada. El margen de medición era de 200 hasta 1100 nm
en etapas de 1 nm para investigar este margen de longitud de onda
para las bandas de absorción de eventuales impurezas. Se tomaba como
referencia la extinción a una longitud de onda de 280 nm y 400
nm.
Para las mediciones de densidad se utiliza un
picnómetro de gas (AccuPyc 1330, Fa. Micromeritics). Como gas se
usa el helio 6.0. El dispositivo se calibra con el estándar
suministrado (perlas de acero con un volumen conocido). Además, la
muestra se seca durante al menos 1 hora a 150ºC y luego se coloca en
un recipiente de medida y se pesa. Después de colocar el recipiente
de medición en el picnómetro de gas, se utilizan 10 ciclos de
lavado y 5 ciclos de medición para determinar el valor medio y la
desviación estándar.
\newpage
La solubilidad del hierro de las muestras
revestidas y tratadas a una temperatura se determina con
Espectroscopia de Emisión Atómica-Plasma acoplado
inductivamente (JY 24, compañía ISA). Por lo tanto, 1 g de muestra
se transfiere a un tubo de polipropileno de 50 ml, se llena con
agua destilada y se mantiene a una temperatura de 60ºC durante 20
horas. Luego, las muestras se filtran con un filtro de jeringa de
0,2 \mum y se mide el filtrado. Se realizan cuatro
determinaciones individuales a una longitud de onda de 259,940 nm y
se calcula un valor medio a partir de ellas.
Para la medición de la fuerza magnética se pesa
un tubo de pesadas PP (Company Licefa, art. Nr.
V2-3) completamente lleno de PVMs. Con la ayuda de
un esténcil, este recipiente de muestra se coloca en el centro del
tubo LDPE (Company Kartell, TS 735) cargado de latón de manera que
se puede cerrar la tapa del tubo. El recipiente se coloca en el
centro de una balanza (exactitud de detección 0,1 g) con la ayuda de
otro esténcil. Después de equilibrar la balanza, un tapón de
plástico que contiene un imán en forma de cilindro (diámetro:30 mm;
altura: 113,5 mm; material: samario-cobalto 2/17)
se coloca en la escala.
Con ello, las PVMs de la escala son atraídas por
la gravedad disminuyendo su peso. Después del ajuste del equilibrio
(1,5 min.) se determina la pérdida de peso de la muestra y se
normaliza el valor para 250 mg de PVM.
Los resultados de la caracterización física de
las PVMs con composición EJ y los diferentes pigmentos se resumen
en la tabla 3. Puede observarse que los valores de extinción son muy
bajos cuando se utiliza pigmento CERAC. Esto puede explicarse por
la ausencia de un contenido en finos no magnético debido a que el
pequeño pigmento CERAC (23 nm) se puede incorporar a cada partícula
de vidrio magnética. La fuerza magnética está sometida a fuertes
fluctuaciones, sin embargo, se ve influida positivamente por el uso
de pigmentos CERAC. Las PVMs CERAC tienen una fuga comparativamente
elevada de hierro al agua. No obstante, incluso valores diez veces
más elevados no mostraban efecto alguno en el proceso de la reacción
de la polimerasa en cadena.
Resumiendo, puede decirse que las propiedades
físicas no presentan diferencias significativas entre los distintos
pigmentos pero las PVMs CERAC tienen un contenido muy escaso en
finos.
\vskip1.000000\baselineskip
4 Ejemplo
4
Las superficies se determinaban usando un
dispositivo de Micromeritics (tipo ASAP 2400). La medición se
realizaba a una temperatura del nitrógeno líquido. Se usaba
nitrógeno 5.0 como gas medidor y helio 4.6 como gas inerte.
Habitualmente se utilizaban 5 g de muestra para una medición.
La superficie de las PVMs tiene un papel obvio
para el aislamiento del ADN y del ARN. Cuanto mayor es la superficie
más ADN puede ser enlazada por la misma masa de PVMs. También es
posible utilizar menos PVMs y obtener el mismo rendimiento. Esto
tiene el efecto de que el volumen entre granos es menor, lo que
significa que puede introducirse menos alcohol que contaminante en
la reacción de PCR (reacción de la polimerasa en cadena). Los datos
para las superficies de BET medidas para algunos ejemplos se resumen
en la tabla 4. Cuando se comparan las superficies de las muestras
producidas en la gran secadora por atomización, debería observarse
que las muestras con pigmentos pequeños (BASF FA, STREM y CERAC)
tienen superficies relativamente grandes, mientras que los grandes
pigmentos de Merck tienen superficies pequeñas. Esto puede deberse
al hecho de que grandes partículas magnéticas causan grandes PVMs
mientras que las partículas magnéticas pequeñas se incorporan a las
gotitas esféricas durante el proceso de secado por atomización y
tienen por ello superficies similares en unas condiciones de
atomización similares. Las partículas CE-SU de BASF
tienen una distribución del tamaño entre las pequeñas (BASF FA,
STREM y CERAC) y las grandes partículas de Merck. En contraste con
las partículas de Merck, no poseen una superficie estructurada de
manera que estas partículas tienen una superficie de vidrio muy
lisa. Esto da lugar a una superficie menor. Una presión elevada se
utilizaba con la secadora de atomización más pequeña y la tobera de
esta secadora es bastante más pequeña que la de la secadora por
atomización más grande. Esto da lugar a partículas más pequeñas
donde la superficie aumenta notablemente. Esto coincide con los
resultados del ejemplo 5.2.1.
Cualquier influencia del pigmento magnético o de
la presión de atomización en los resultados de otras investigaciones
físicas no puede ser reconocida a excepción de la influencia
anteriormente mencionada sobre la formación de fisuras y el
contenido de finos. Sin embargo, solamente las mediciones de la
superficie reflejan una conexión directa con los resultados de las
investigaciones funcionales. Otros resultados de la investigación
física no muestran esta correlación directa.
\newpage
5 Ejemplo
5
Existen varios métodos para la evaluación de las
PVMs con respecto a su adaptabilidad para la extracción de ácidos
nucleicos. La determinación de la extinción a 260 nm antes y después
de la purificación no es muy sensible y no refleja la situación
cuando se extraen pequeñas cantidades del ácido nucleico definido u
objetivo del material clínico. Los resultados de los métodos de
evaluación funcionales que se basan en un método para la
amplificación de ácidos nucleicos, como por ejemplo, por PCR,
RT-PCR, NASBA o algo similar, a menudo no son
suficientemente convincentes. Además, estos métodos que son
adecuados para la determinación de un número pequeño de copias del
genoma objetivo, son susceptibles a trastornos por las sustancias
del material de prueba o del proceso de preparación de la muestra.
Los estudios de enlaces radioactivos son un método analítico
apropiado que permite analizar el proceso de preparación de
muestras paso por paso. Los datos del rendimiento no son datos
absolutos pero siempre se refieren al rendimiento de una partícula
de referencia.
En primer lugar, el ADN o ARN marcado
radiactivamente se sintetiza enzimáticamente en una PCR (reacción en
cadena de la polimerasa) o bien en un proceso de transcripción
in vitro en presencia de desoxinucleósidos
^{32}P-marcados o bien trifosfatos de nucleósidos.
Luego el ADN o ARN se separa de los trifosfatos de nucleósido
libres, se determina el contenido y se prepara una dilución
definida.
Una pequeña cantidad de ADN o ARN marcada se
añade a cada muestra antes del examen. Durante la preparación de la
muestra, todos los ácidos nucleicos se enlazan a las PVMs en
presencia de agentes caotrópicos. Las PVMs se granulan ejerciendo
fuerzas magnéticas y se descarta el sobrenadante. Los gránulos se
lavan y los ácidos nucleicos enlazados son eluidos a una
temperatura elevada invirtiendo las condiciones de reacción, es
decir, añadiendo una solución amortiguadora de la elución poco
salina. Después del enlace y de la etapa de lavado, una parte
alícuota del sobrenadante de partículas se sitúa en un filtro. El
eluido así como las PVMs redispersadas en agua se colocan en un
filtro y se secan. AL final, los filtros se miden en un contador
Beta y se calcula una distribución para cada preparación de
muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Sistema PCR High Fidelity Expand (Roche Molecular Biochemicals nº cat. 732641)
- -
- Mezcla dNTP (Roche Molecular Biochemicals nº cat. 1277049)
- -
- Deoxicitidina 5'-alfa-P32 trifosfato dCTP 3000 Ci/mmol (Amersham Cat.nº PB 10205)
- -
- \lambda-ADN (Roche nº cat.1029053) concentración 1 ng/ml
- -
- Radiotrazador capa aislante 1 (SEQ ID NO 1) concentración 5,3 OD_{260}/ml de radiotrazador capa aislante 2 (SEQ ID NO 2) concentración 5,2 OD_{260}/ml
- -
- QIA Quick PCR estuche de purificación (Qiagen nº cat. 28104)
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- 29,5 \mul de agua doblemente destilada
- -
- 5 \mul de solución tampón Expand High Fidelity
- -
- 2,5 \mul de mezcla NTP diluida 1:10 con agua doblemente destilada
- -
- 1 \mul de radiotrazador capa aislante 1 (SEQ ID NO 1)
- -
- 1 \mul de radiotrazador capa aislante 2 (SEQ ID NO 2)
- -
- 0,3 \mul de ^{32}P-dCTP
- -
- 10 \mul de \lambda-ADN
- -
- 0,75 \mul Mezcla enzimática Expand High Fidelity
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- 2 min. 94ºC
- -
- 10 ciclos (10 seg. 94ºC/30 seg. 60ºC/60 seg. 72ºC)
- -
- 20 ciclos (10 seg. 94ºC/20 seg. 60ºC/72ºC + 10 seg. 72ºC extensión por ciclo)
- -
- 7 min. 72ºC
- -
- 4ºC
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- según el protocolo de Purificación de QIA Quick PCR (Qiagen)
\vskip1.000000\baselineskip
- Dilución de ADN 1:10 en agua doblemente destilada y medición en el contador Beta.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Estuche de transcripción SP6/T7 (Roche Molecular Biochemicals nº cat. 999644)
- -
- Trifosfato de uridina 5'-alfa-P32 UTP 3000 Ci/mmol(Amersham cat.nr. PB 10203)
- -
- Plásmido pBKBH10S, linealizado con EcoRI a 100 \mug/ml
- -
- Estuche de aislamiento de ARN muy puro (Roche Molecular Biochemicals Cat.nr. 1828665)
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- 2 \mul 10 x solución tampón
- -
- 3 \mul mezcla NTP (AGC)
- -
- 1 \mul de UTP (1:50 con agua doblemente destilada)
- -
- 5 \mul ^{32} P-UTP
- -
- 7 \mul plásmido linealizado
- -
- 1 \mul de inhibidor de ARNasa (Roche Molecular Biochemicals Cat. Nr. 802808)
- -
- 1 \mul T7 ARN-polimerasa
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- 20 min de incubación a 37ºC
- -
- Adición de 2 \mul de ADNasa, libre de ARNasa
- -
- 10 min de incubación a 37ºC
- -
- Adición de 178 \mul de agua doblemente destilada
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- conforme al Protocolo de aislamiento del ARN altamente puro (Roche Molecular Biochemicals)
\vskip1.000000\baselineskip
- Dilución de ARN 1:30 en agua doblemente destilada y medición en el contador Beta
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- plasma negativo
- -
- concentración de proteinasa K 20 mg/ml (por ejemplo, Roche Id nr. 1942387)
- -
- Poli-A-ARN (por ejemplo, Roche Id nr.108626) concentración de 1 mg/ml; diluida 1:1000 (volumen/ratio de volumen) con tampón de descomposición
- -
- tampón de descomposición (50 mM Tris pH 7,0 15%(v/v) polidocanol, isotiocianato de guanidina 5M, 1 mM DTT)
- -
- PVM (con composición de vidrio EJ y diferentes pigmentos para el núcleo (BM, MMB, CERAC, STREM, BASF-FA, BASF-CE) suspendida en isopropanol a 60 mg/ml o a 6 mg/ml
- -
- Solución tampón de lavado (20 mM Tris pH 7,5, NaCl 20 mM, 70% (v/v) etanol)
- -
- Solución de elución: agua doblemente destilada
- -
- Material auxiliar
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- 80 \mul de proteinasa K
- -
- añadir 410 \mul de plasma negativo y mezclar
- -
- añadir 500 \mul de tampón de descomposición y mezclar
- -
- añadir 10 \mul de ADN o ARN etiquetado radioactivo y agitar
- -
- 10 min. de incubación a temperatura ambiente agitando
- -
- añadir 500 \mul de suspensión de PVM (concentración 6 mg/ml) y agitar
- -
- 20 min. de incubación a temperatura ambiente agitando
- -
- separación durante 2 min. en separador magnético (Dynal)
- -
- desechar sobrenadante y poner 300 \mul en un filtro
- -
- añadir 750 \mul de tampón de lavado, vórtice, separación de 2 min.
- -
- desechar sobrenadante, colocar eventualmente 375 \mul de sobrenadante en un filtro
- -
- repetir el proceso de lavado dos veces
- -
- añadir 100 \mul de solución de elución, incubar 5 min. a 80ºC en un termoagitador
- -
- separar durante 2 min. en un soporte magnético, colocar sobrenadante en un filtro
- -
- añadir 100 \mul de solución de elución, volver a suspender y colocar PVMs en un filtro
- -
- secar filtros durante 60 min. a 75ºC en una estufa de secado
- -
- trasladar filtros a los tubos de escintilación, añadir 5 ml de solución de escintilación y medir en el contador beta
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- 25 \mul de proteinasa K
- -
- añadir 415 \mul de plasma negativo y mezclar
- -
- añadir 500 \mul de tampón de descomposición y mezclar
- -
- añadir 10 \mul de ADN o ARN etiquetado radioactivo y agitar
- -
- 5 min. de incubación a temperatura ambiente agitando
- -
- añadir 50 \mul de suspensión de PVM (concentración 60 mg/ml) y agitar
- -
- 20 min. de incubación a temperatura ambiente agitando
- -
- separación durante 2 min. en separador magnético (Dynal)
- -
- desechar sobrenadante y poner 300 \mul en un filtro
- -
- añadir 700 \mul de tampón de lavado, vórtice, separación de 2 min.
- -
- desechar sobrenadante, colocar eventualmente 350 \mul de sobrenadante en un filtro
- -
- repetir el proceso de lavado dos veces
- -
- añadir 120 \mul de solución de elución, incubar 10 min. a 80ºC en un termoagitador
- -
- separar durante 2 min. en un soporte magnético, colocar sobrenadante en un filtro
- -
- añadir 100 \mul de solución de elución, volver a suspender y colocar PVMs en un filtro
- -
- secar filtros durante 60 min. a 75ºC en una estufa de secado
- -
- trasladar filtros a los tubos de escintilación, añadir 5 ml de solución de escintilación y medir en el contador beta
\vskip1.000000\baselineskip
Se caracterizaron diferentes tipos de PVM, que se
fabricaban usando química de vidrio EJ y varios núcleos en la
escala de nanómetros o micrómetros (MMB, CERAC, etc.) en distintos
secadores de atomización (Büchi o Nubilosa) con respecto a su
comportamiento en la extracción de ácido nucleico con el método de
trazado radiactivo según el ejemplo 5.1.3.2. El parámetro del ARN
resultó ser el más sensible en el transcurso de los estudios y fue
elegido por ello como parámetro. La figura 11 muestra como el
BASF-CE no es adecuado como material del núcleo
porque solamente pueden hallarse pequeñas cantidades de ARN enlazado
en el eluido. Las partículas de EJ/CERAC que se atomizaban en el
sistema Büchi a 6 bar mostraban el rendimiento del EJ/MMB de
referencia que se pulverizaba en el sistema de Nubilosa.
Los distintos tipos de PVM fabricados con el
sistema Nubilosa con diferentes presiones de atomización se
comparan según el apartado 5.1.3.3. Las partículas de referencia son
EJ/MMB MGP. Se investigan las propiedades de enlace del ADN y del
ARN. Mientras que el parámetro de ADN no presenta dependencia de la
presión de atomización, el parámetro de ARN presenta unas
diferencias significativas en cuanto a funcionamiento. El
funcionamiento de las partículas EJ/CERAC fabricadas con una
presión de atomización de 1,5 bar con el sistema de Nubilosa es
inferior al de referencia. Existe un rendimiento inferior en la
serie dependiendo de la presión de atomización que oscilaba entre
1,5 y 3,4 bar (\sim30%). Las partículas que son atomizadas con 4,3
bar alcanzaban un 90% del rendimiento de las partículas que son
pulverizadas a 1,5 bar (ver figura 12).
Los experimentos demuestran que existe una
conexión directa entre los parámetros del proceso para la producción
de las PVMs y el funcionamiento en la prueba. Debería destacarse
que un incremento en la presión de atomización conduce a un
rendimiento inferior en la prueba, pero a partir de una cierta
presión de atomización las propiedades de las partículas mejoran lo
que conduce a un mejor rendimiento.
Estos experimentos deberían llevar al resultado
siempre que una variación de la presión de atomización condujera a
unas PVMs con un mejor rendimiento.
Por lo tanto, las PVMs se fabrican en el sistema
de Nubilosa a una presión de 1,5 bar, 4,3 bar y 6 bar usando
nitrógeno como gas atomizador.
Con el fin de obtener un proceso de secado
cuidadoso, se reducen además las temperaturas de entrada y salida
de la secadora de atomización. La influencia de estos factores en el
aislamiento del ARN se investiga según el apartado 5.1.3.3 usando
PVM EJ/MMB como referencia.
Los resultados (ver figura 13) muestran el efecto
sorprendente de una reducción dramática del rendimiento que es
causada por el descenso de la temperatura de atomización y no podía
haberse previsto. Ha sido posible conseguir el rendimiento de la
calidad de referencia mediante el incremento de la presión de
atomización. En armonía con una estabilidad superior de la
suspensión, estas partículas son por tanto superiores a las de
referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
6 Ejemplo
6
Un modelo de espectrofotómetro Uvikon 930
fabricado mediante instrumentos Kontron se utiliza para la
evaluación del proceso de sedimentación de las partículas de vidrio
metálicas. Este espectrofotómetro se modifica para conseguir un
ajuste variable de la cubeta a lo largo de la escala gráfica. Para
las mediciones la cubeta se coloca en una posición en la cual el
rayo de medición con una longitud de onda de 650 nm atraviesa la
cubeta en una posición que es 2/3 de la altura de llenado (posición
de escala 7.5). Se utilizan macrocubetas fabricadas a partir de
poliestireno que tienen un volumen de 4 ml y una longitud de
recorrido de 1 cm. Antes de las mediciones, se efectúa la
calibración en un procedimiento de un rayo frente a un medio de
suspensión puro. Las muestras de PVMs se dispersan hasta la
homogeneidad en un medio de suspensión, típicamente en un porcentaje
de masa/volumen de 3 mg/ml, y se miden inmediatamente.
El cambio de la extinción con el tiempo es controlado de forma continuada a dicha longitud de onda de 650 nm.
El cambio de la extinción con el tiempo es controlado de forma continuada a dicha longitud de onda de 650 nm.
La cantidad física utilizada para la comparación
de la velocidad de sedimentación de diferentes muestras es la vida
media (t_{1/2}) en un medio de suspensión en particular. Este es
el periodo de tiempo hasta que la extinción de la suspensión en la
tercera parte superior de la cubeta es la mitad del valor al
principio de la medición. El descenso de la extinción viene
producido por la sedimentación de las partículas y eliminación
concomitante de la tercera parte superior del volumen de prueba.
El dispositivo anteriormente descrito permite
además la instalación de un imán debajo de la cubeta. Con ello se
puede determinar la velocidad de la separación magnética
6.2.1 Experimento 1
Varios tipos de PVMs con diferentes núcleos del
orden de los nano- o micrómetros producidos con la química del
vidrio EJ se investigan espectrofotométricamente para su
sedimentación y separación, es decir, con y sin imán bajo la
cubeta. En este caso masa/volumen es 6 mg/ml. El medio de suspensión
es una mezcla 1:1 de isopropanol y tampón de descomposición. Las
partículas del tipo CERAC presentan una clara ventaja en la
estabilidad de la suspensión pero ningún inconveniente para la
separación magnética (ver también la figura 14).
6.2.2 Experimento 2
La sedimentación de las diferentes PVMs del tipo
CERAC fabricadas con química de vidrio EJ se analiza en el
isopropanol puro.
Parámetros de producción importantes
EJ0100.5R-01 - presión de
atomización de 1,5 bar, 230ºC temperatura de entrada, sistema de
Nubilosa
EJ0108.5R-01 - presión de
atomización de 4,3 bar, 230ºC temperatura de entrada, sistema de
Nubilosa
EJ0096.5R-01 - presión de
atomización de 6,0 bar, 150ºC temperatura de entrada, sistema
Büchi
EJOO96.5R-01 aparece en la figura
15. Estas perlas son básicamente esféricas, con una superficie muy
estructurada y un tamaño de predominantemente 0,5-5
\mum. La muestra de EJ0100.5R-01, atomizada a una
presión baja y a una temperatura elevada, consta principalmente de
partículas de formadas de escala \mu (ver figura 16, que muestra
un equivalente funcional al EJ0100.5R). Concluyendo, las partículas
como la EJ0096.5R-01 presentan un retardo
significativo de la sedimentación, que es más ventajoso para los
traslados de líquido de las suspensiones de PVMs (ver figura 14b).
Los resultados se resumen en.
\vskip1.000000\baselineskip
7 Ejemplo
7
Las partículas del virus en la muestra (por
ejemplo, plasma) se descomponen en presencia de proteasa y
concentraciones elevadas de sal caotrópica así como de detergente.
Luego se añade el adsorbente de las partículas (=PVM) para que
tenga lugar la adsorción físico-química de los
ácidos nucleicos liberados en la superficie de vidrio, seguida de
la separación magnética y el lavado de las perlas cargadas, es decir
la separación libre/enlazada. Finalmente, se realiza la disociación
de los ácidos nucleicos enlazados de las perlas (=elución) en unas
condiciones de reacción invertidas en cuando a la adsorción, es
decir, con solución tampón poco salina o incluso con agua
destilada. Una parte alícuota del eluido se mezcla luego con una
parte alícuota de la mezcla principal de PCR para iniciar la
amplificación de los ácidos nucleicos recuperados en el eluido. La
reacción se caracteriza por la ecuación
N_{1} = N_{0}
\ x \
(1+E)^{n},
Con
N_{0}= número de moléculas al inicio de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
N_{1}= número de moléculas al final de la
reacción en cadena de la polimerasa
E = eficacia de la amplificación =
0\leqE\leq1
n = número de ciclos de reacción = típicamente
20\leqn\leq35
Después de la PCR con al menos una capa aislante
biotinilada, una parte alícuota del amplificado que lleva biotina
se mezcla con el tampón de hibridación y la muestra de detección.
Después de la incubación, se añaden perlas revestidas de
estreptavidina y se realiza otra incubación. Finalmente, se lavan
las perlas, se añade el tampón señalizador y se mide la intensidad
de la señal luminiscente que se correlaciona con la masa de ácido
nucleico amplificada enlazada y por tanto con la carga vírica de la
muestra de plasma.
El experto en la materia puede añadir también 1
ml de protocolo manualmente
Proteinasa K, líquido en acetato de Ca/glicerina,
20 mg/ml poly-A-ARN, 1 mg/ml, el
nivel de uso es una dilución 1:1000 en un tampón de descomposición,
que consta de:
- -
- Tampón tris, 50 mmol/l, pH 7,0 (1,0 & protocolo del extractor, respectivamente) o bien 4,0 (1,5 ml de protocolo)
- -
- Polidocanol, 15% (v/v)(1,0 & protocolo del extractor, respectivamente) o bien Triton X-100 20% (v/v)(1,5 ml de protocolo)
- -
- Isotiocianato de guanidina, 5 mol/l
- -
- 1 mmol/l DTT
- -
- partículas de vidrio magnéticas(PVM) del tipo EJ/BM o EJ/CERAC suspendidas en isopropanol (99,8% pureza) a 60 mg/ml
- -
- solución tampón de lavado que consiste en
- -
- Tampón tris, 20 mmol/l, pH 7,5
- -
- 60% de etanol/eq(1,0 & protocolo del extractor, respectivamente) o 70% (1,5 ml de protocolo)
- -
- NaCl, 20 mmol/l
- Eluyente = agua destilada dos veces
Amplificación/Mezcla principal:
- -
- Tampón de PCR, que consta de un medio amortiguador
- RT-PCR(virus de inmunodeficiencia humana(HIV), virus de hepatitis C (HCV): 250 mmol/l de Bicina/KOH pH 8,2 557 mmol/l Acetato de potasio, 40% de glicerina
- HBV-PCR (virus de la hepatitis B(HBV)):20 mmol/l Tris-HCl pH 8,3; 100 mmol/l KCl, 0,012% Brj 35= 2 x concentrado
- Cationes metálicos, MgCl_{2}(HBV-PCR) 3 mmol/l o MnCl_{2}, (RT-PCR)2,5 mmol/l(HCV) y 1,25 mmol/l(HIV)
- Trifosfato de deoxinucleósido (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, dUTP)
- Capa aislante de avance específica del analito
- Capa aislante invertida específica del analito
- Uracil-N-glucosidasa (UNG)
- DNA-polimerasa (Taq ó T-polimerasa para HBV ó HIV/HCV, respectivamente) H_{2}O desmineralizada (grado de biología molecular) para el ajuste del volumen a 100 \mul
- Reactivo de interrupción para UNG después de la amplificación
- - N-lauroilsarcosina (por ej. Roche Id. Nr. 133895), 1% p/v); 5 \mul por 100 \mul de amplificado
- Tampón de hibridación (p.ej. Roche Id. Nr. 1930273)
Muestras de detección marcadas con
quimioluminiscencia:
- HCV(Roche BMO 28.140336), materia de trabajo =8,0 nmol/l
- HIV(Roche BMO 28.540948), materia de trabajo =7,8 nmol/l
- HBV(Roche BMO 28.540917), materia de trabajo =9,2 nmol/l
- Perlas de ECL cubiertas de SA (p.ej. Roche Id.nr. 1865943-001)
- Solución desnaturalizante (p.ej. Roche Id. Nr. 1930257)
- Procell (por ejemplo, Roche Id.Nr. 1717685)
- CleanCell (por ejemplo Roche Id.Nr. 1717642)
HIV-avance: | SEQ ID NO 3 | |
HIV-invertido: | SEQ ID NO 4 | |
HCV-avance: | SEQ ID NO 5 | |
HCV-invertido: | SEQ ID NO 6 |
HBV-avance: | SEQ ID NO 7 | |
HBV-invertido: | SEQ ID NO 8 |
\vskip1.000000\baselineskip
HIV: | SEQ ID NO 9 | |
HCV: | SEQ ID NO 10 | |
HBV: | SEW ID NO 11 |
- \ding{226}
- 1,0 ml protocolo manual;\rightarrow usado para el experimento 1, ver ejemplo 7.3.1
- añadir 25 \mul de proteinasa K a 425 \mul de muestra de plasma, agitación vorticial,
- añadir 500 \mul de tampón de lisis, incubar 5 min a temperatura ambiente con agitación mecánica (1330 rpm en agitador Eppendorf),
- añadir 50 \mul de MGP suspendida en isopropanol (concentración 60 mg/ml), agitación vorticial e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador de rodillos,
- separación magnética usando un separador magnético Dynal (2 min);
- eliminar la fracción no ligada mediante aspiración, y añadir 700 \mul de tampón de lavado, agitación vorticial, separar, aspirar;
- repetir el procedimiento de lavado otras 4 veces,
- añadir 120 \mul de DEPC-agua, agitación vorticial y eluir durante 10 minutos a 80ºC en un Eppendorf Thermomixer a 1300 rpm con los recipientes sin tapar,
- separar las perlas del sobrenadante acuoso (=eluir) con un separador magnético Dynal (2 minutos),
- congelar el eluido hasta posterior uso.
- \ding{226}
- protocolo automatizado o bien extractor incorporado;\rightarrow usado para los experimentos 2 y 3 (ver ejemplo 7.3.2 y ejemplo 7.3.3)
- Básicamente el mismo método y el mismo reactivo que los mencionados. Además, se añade un control interno de ARN (IC, ver a continuación) a todas y cada una de las muestras, se termostata el proceso de extracción a aproximadamente 40ºC y se ajustan los volúmenes a un volumen total de 2 ml de mezcla de lisis, es decir,
- 50 \mul de IC
- 50 \mul de proteinasa K
- 850 \mul de muestra
- 1000 \mul de tampón de lisis
- 100 \mul de suspensión de MGP
- 2200 \mul de tampón de lavado para 5 etapas de lavado respectivamente
- 125 \mul de eluyente
- \ding{226}
- 1,5 ml de protocolo manual; \rightarrow usado para el experimento 4 (ver ejemplo 7.3.4)
- añadir 80 \mul de proteinasa K a 420 \mul de muestra de plasma, agitación vorticial,
- añadir 500 \mul de tampón de lisis, incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación mecánica (1300 rpm en agitador Eppendorf),
- añadir 500 \mul de MGP suspendido en isopropanol (concentración 6 mg/ml), agitación vorticial, e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en un mezclador de rodillos,
- separación magnética usando un separador magnético Dynal (2 min);
- retirar la fracción no ligada a través de aspiración, y añadir 700 \mul de tampón de lavado, agitación vorticial, separar, aspirar; repetir el proceso de lavado otras 4 veces,
- añadir 100 ml de DEPC-agua, cerrar las cubetas, agitación vorticial y eluir durante 15 minutos a 80ºC en un Eppendorf Thermomixer a 1300 rpm,
- separar las perlas del sobrenadante acuoso (=eluir) con separador magnético Dynal (2 min),
- congelar el eluido hasta uso posterior.
Volumen de reacción total = 100 \mul para todas
las valoraciones
HBV: volumen eluido para PCR = 20 \mul | ||
Solución madre | concentración final en PCR/\mul | |
Agua(grado PCR) | 4 \mul | |
ADN-mezcla patrón | 2-x | 1-x/50 \mul |
MgCl_{2} | 25 mM | 3,0 mM/12 \mul |
Aislante SEQ ID NO 7 | 5 \muM | 0,2 \muM/4 \mul |
Aislante SEQ ID NO 8 | 5 \muM | 0,4 \muM/8 \mul |
UNG | 1 U/\mul | 2U/2 \mul |
\vskip1.000000\baselineskip
HCV: Volumen eluido para PCR = 40 \mul | ||
Solución madre | concentración final en PCR/\mul | |
Agua(grado PCR) | 18 \mul | |
Tampón bicina RT 5x | 5-x | 1-x/20 \mul |
MnOAc | 25 mM | 2,5 mM/10 \mul |
Mezcla DNTP (dUTP/ | 30 mM | 0,6 mM |
DATP/dCTP/dGTP) | 10 mM | 0,2 mM/2 \mul |
Aislante SEQ ID NO 5 | 10 \muM | 300 nM/3 \mul |
Aislante SEQ ID NO 6 | 10 \muM | 300 nM/3 \mul |
UNG | 1 U/\mul | 2 U/2 \mul |
Polimerasa T | 5,5 U/\mul | 10 U/2 \mul |
\vskip1.000000\baselineskip
HIV: Volumen eluido para PCR = 40 \mul | ||
Solución madre | concentración final en PCR/\mul | |
Agua(grado PCR) | 20 \mul | |
Tampón bicina RT 5x | 5-x | 1-x/20 \mul |
MnOAc | 25 mM | 1,25 mM/5 \mul |
Mezcla DNTP (dUTP/DATP/ | ||
dCTP/dGTP) | 10 mM | 0,2 mM/2 \mul |
Aislante SEQ ID NO 3 | 5 \muM | 0,2 \muM/4 \mul |
Aislante SEQ ID NO 4 | 5 \muM | 0,2 \muM/4 \mul |
UNG | 1 U/\mul | 2 U/2 \mul |
Polimerasa T | 5,5 U/\mul | 15 U/3 \mul |
Después del PCR, el UNG se ve bloqueado por la
adición de una concentración de laurilsarcosina del 1% del nivel de
uso.
Los perfiles de termociclado son los
siguientes:
HBV: etapa UNG | 1x | 10 min | 37ºC |
\hskip1cm PCR | 35x | 30 seg | 92ºC |
30 seg | 55ºC | ||
40 seg | 72ºC | ||
HCV: etapa UNG | 1x | 10 min | 37ºC |
\hskip1cm Desnaturalización de la | 1x | 30 min | 60ºC |
\hskip1cm etapa de la transcriptasa | 1 min | 95ºC | |
\hskip1cm invertida | |||
\hskip1cm PCR | 2x | 10 seg | 95ºC |
20 seg | 60ºC | ||
33x | 15 seg | 90ºC | |
20 seg | 60ºC | ||
\hskip1cm Incubación complementaria | 7 min | 72ºC | |
HIV: etapa UNG | 1x | 10 min | 37ºC |
\hskip1cm Etapa de transcriptasa invertida | 1x | 30 min | 60ºC |
\hskip1cm PCR | 4x | 10 seg | 95ºC |
10 seg | 55ºC | ||
10 seg | 72ºC | ||
31x | 10 seg | 95ºC | |
10 seg | 60ºC | ||
10 seg | 72ºC |
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivo | Volumen | Tiempo incubación |
(HBV,HCV,HIV) | (HBV,HCV,HIV) | |
Producto PCR | 10 \mul | |
Solución desnaturalizante | 35 \mul | 5 min |
Muestra de detección | 120 \mul | 30 min |
Perlas SA | 35 \mul | 10 min |
La lisis de las partículas víricas así como la
adsorción, purificación y elución de los ácidos nucleicos extraídos
de las muestras se llevan a cabo tal como se ha descrito antes (ver
ejemplo 7.1.2). De nuevo, la amplificación de las moléculas diana
se describe por medio de la ecuación N_{i} =
N_{0}x(1+E)^{n}, con
N_{0}= número de moléculas al inicio de la
reacción en cadena de la polimerasa
N_{i}= número de moléculas al final de la
reacción en cadena de la polimerasa
E = eficacia de la amplificación =0<E<1
n = número de ciclos de reacción = típicamente
40<n<60 en este caso.
Sin embargo, con la tecnología de la
5'-nucleasa las reacciones de amplificación y
detección, respectivamente, se encuentra interrelacionadas y tienen
lugar en la fase de solución, es decir, sin inmovilización de la
fase sólida y en las correspondientes etapas de lavado (=PCR
homogéneo). Con esta finalidad, se añaden muestras de detección con
2 modificaciones químicas especiales a la mezcla patrón PCR. Una de
estas modificaciones es un grupo indicador fluorogénico (R, por
ejemplo, un derivado de
6-carboxi-fluoresceína) unido a la
estructura de la muestra por un enlace covalente, siendo el otro un
colorante (por ejemplo, un derivado de
polimetina-cianina) capaz de absorber la luz
fluorescente del indicador y de extinguirla (agente de extinción).
El elemento de extinción se encuentra normalmente unido a la
estructura de la muestra por el extremo 5', mientras que el grupo
indicador se sitúa en la secuencia oligo, separado del elemento de
extinción por una serie de bloques de nucleótidos. Estas muestras
se unen al ácido nucleico diana o de referencia (hebra transcrita o
hebra complementaria) cerca del extremo 3' de una capa aislante
(avance o invertida). Tan pronto como la capa aislante ha formado
un híbrido y el ADN-polimerasa se une al híbrido
capa aislante: elemento diana, se inicia la elongación. Debido a la
actividad en la 5'-nucleasa del enzima,
simultáneamente a la síntesis de la rama complementaria, la muestra
queda segmentada tan pronto como la polimerasa alcanza el lugar de
enlace de la muestra, los elementos indicador y de extinción se
separan y la luz fluorescente puede medirse. Este proceso se repite
con cada ciclo y se acumula más y más indicador fluorescente en
solución hasta el agotamiento del reactivo al final de la reacción.
Así que en un gráfico señal respecto a tiempo, se generan unas
curvas de crecimiento sigmoidal. Cuanto mayor es N_{0} más pronto
llega la curva de señal al nivel de ruido.
El punto en el eje del tiempo, en el que la señal
fluorescente puede distinguirse de forma significativa de la señal
de fondo se denomina ciclo liminar (ct). ct es una medida de la
sensibilidad de la valoración: cuanto menor es el valor ct, más
sensible es la valoración. Los valores ct se pueden calcular por
medio de diferentes operaciones matemáticas, por ejemplo, métodos
discriminatorios (intensidad de la señal de fondo media
multiplicada por un factor constante da lugar a una intensidad de la
señal límite o umbral que distingue lo positivo de lo negativo) o
bien métodos donde la localización del valor máximo de la primera
diferenciación de la curva señal respecto a tiempo (es decir, el
perfil de inclinación), o bien la localización del valor máximo de
la segunda diferenciación del eje tiempo, se calculan y definen como
ct.
Esta tecnología de amplificación/detección
permite el control a tiempo real del PCR y el tratamiento con tubo
cerrado, es decir, en contraste con los métodos estándar, los tubos
de PCR se mantienen cerrados después de Pipetear el eluido y la
mezcla patrón que reduce eficazmente los riesgos de
contaminación.
Además, si uno utiliza equipos de aislantes y de
muestras para diferentes especies víricas (y, por consiguiente,
diferentes moléculas de analito y secuencias diana) combinadas en
una mezcla patrón, es posible llevar a cabo múltiples reacciones de
amplificación/detección, simultáneamente, dependiendo de la carga
vírica del individuo que se inspecciona. Esta es la base de las
llamadas valoraciones múltiples.
Y lo que es más, debido a la naturaleza genética
de la preparación de muestras a base de MGP, todos los ácidos
nucleicos presentes en la muestra son extraídos por medio de la
adsorción físico-química a la superficie de
partículas, independiente de las características de la secuencia.
Esto incluirá también el ADN humano (hDNA), liberado de las células
sanguíneas destruidas, por ejemplo los leucocitos, cuya valoración
diferirá ampliamente según el estado fisiológico o patológico del
donante individual de muestra sanguínea. Por ejemplo, en los casos
de enfermedades autoinmunitarias como SLE, los niveles de hDNA
pueden elevarse sustancialmente. Así, el hDNA y uno o más ácidos
nucleicos patógenos presentes en una muestra determinada constituyen
una mezcla de varios ácidos nucleicos de diferentes especificidades
de secuencia que son extraídos a la vez. Ellos constituyen una
matriz de polinucleótidos que son extraídos sin discriminación
alguna, a lo que sigue una amplificación específica de la secuencia
y la detección de los ácidos nucleicos diana a través de la
interacción con capas aislantes y muestras específicas en unas
condiciones de reacción apropiadas.
Dado un nivel patológico de 4000 ng/ml de hDNA en
plasma en el caso de SLE, y una carga vírica baja de 50 copias de
ARN genómico vírico por ml de plasma y 10.000 nucleótidos por ARN
genómico. Con aproximadamente 325 dalton (1 dalton = 1,66 x
10^{-24}g) por nucleótido, 50 copias o 500000 nucleótidos de ARN
diana constituyen aproximadamente 2,7 x 10^{-7} ng por ml de
plasma, lo que da lugar a una abundancia relativa de ácido nucleico
diana: no diana de aproximadamente 1:10^{12}. Con el fin de
controlar todo el proceso, puede añadirse a las muestras un ácido
nucleico artificial, preferiblemente empaquetado (armado) en una
partícula vírica modificada, que se extrae y amplifica
simultáneamente al ácido nucleico diana natural. Este control
interno (CI) distingue una región de enlace de muestra única para
una muestra de detección IC, que difiere de las muestras específicas
de referencia por poseer un grupo indicador diferente con unas
características de emisión diferenciables. Por consiguiente, la
señal CI puede discernir de la señal de referencia, y puesto que la
señal CI se sabe que está presente en la muestra, funciona como
agente de control. Así el etiquetado o marcaje múltiple amplía la
utilidad de la tecnología de valoración múltiple. El control interno
(CI) se describe en WO98/00547.
Ver antes (ejemplo 7.1.2 \rightarrow protocolo
automatizado en extractor incorporado)
Reactivo | Concentración de | Concentración final | Adición |
la solución madre | en la prueba | (\mul/reacción) | |
Mn(OAc)_{2} pH 6,5 | 50 Mm | 3 mM | 5,75 |
DNTPs | 2,50 | ||
(dG,dA,dC) | 100 mM | 300 \muM | |
(dT) | 50 \muM | ||
(dU) | 500 \muM | ||
DEPC-H_{2}O | - | 9,50 | |
Glicerina | 80% | 5,64% en total | 3,50 |
2,8% añadido* | |||
K Oac pH 7,5 | 2M | 100 mM | 5,00 |
Tricina pH 8,3 | 1M | 50 mM | 5,00 |
DMSO | 80% | 5,0% | 6,25 |
Aislante SEQ ID NO 12 | 50 \muM | 150 nM | 0,30 |
Aislante SEQ ID NO 13 | 50 \muM | 150 nM | 0,30 |
Aislante SEQ ID NO 14 | 50 \muM | 400 nM | 0,80 |
Aislante SEQ ID NO 15 | 50 \muM | 150 nM | 0,30 |
Aislante SEQ ID NO 16 | 50 \muM | 400 nM | 0,80 |
Aislante SEQ ID NO 17 | 50 \muM | 150 nM | 0,30 |
Aislante SEQ ID NO 18 | 50 \muM | 150 nM | 0,30 |
Muestra SEQ ID NO 19 | 50 \muM | 100 nM | 0,20 |
Muestra SEQ ID NO 20 | 50 \muM | 100 nM | 0,20 |
Muestra SEQ ID NO 21 | 50 \muM | 100 nM | 0,20 |
Muestra SEQ ID NO 22 | 50 \muM | 100 nM | 0,20 |
UNG | 2,4 U/\mul | 10 U | 4,20 |
Z05 | 10 U/\mul | 40 U | 4,00 |
Aptámero SEQ ID NO 23 | 50,4 \muM | 200 nM | 0,40 |
* \begin{minipage}[t]{155mm} El resto de glicerina se añade a través de los enzimas Z05 (una muteína de la T-ADN-polimerasa) y UNG (uracil-N-glucosidasa).\end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
El perfil de termociclado múltiple frecuente para
todos los parámetros es el siguiente:
Etapa UNG | 45ºC - 10 min |
Desnaturalización | 94ºC - 30 seg |
Transcripción invertida | 58ºC - 30 min |
PCR | 95ºC-20 seg/59ºC-50 seg 5x |
91ºC-15 seg/52ºC-50 seg 55x |
\vskip1.000000\baselineskip
VIH avance: | SEQ ID NO 12 | |
VIH avance: | SEQ ID NO 13 | |
VIH inverso: | SEQ ID NO 14 | |
HCV avance: | SEQ ID NO 15 | |
HCV inverso: | SEQ ID NO 16 | |
HBV avance: | SEQ ID NO 17 | |
HBV inverso: | SEQ ID NO 18 |
VIH : | SEQ ID NO 19 | |
HCV : | SEQ ID NO 20 | |
HBV : | SEQ ID NO 21 | |
IC: | SEQ ID NO 23 |
Temperatura de fusión del complejo de ADN
polimerasa-aptámero = 51,7ºC(= 50% de
disociación)
Algunos de los oligonucleótidos se derivatizan
con Cy5 que es un
pentametina-di-indocarbocianina
acoplado a un conector de alquilfosfatidilo (Pharmacia Biotech
Cy5-N-etil-fosforamidita)
y que funciona como un elemento de extinción (Q);
\lambda_{EX}=630 nm, \lambda_{EM}=665 nm. Algunos de los
oligonucleótidos se derivatizan con FAM que es la
6-carboxi-fluoresceína acoplada a
una
2-(amino-ciclohexil)-propano-1,3-diol-conector
(Biogenex CF-FAM-fosforamidita) y
que funciona como indicador para elementos de referencia (R);
\lambda_{EX}=485 nm, \lambda_{EM}=515 nm. Algunos de los
oligonucleótidos forman derivados con
hexacloro-6-carboxi-fluoresceína
acoplada a un
2-(amino-ciclohexil)-propano-1,3-diol-conector
(Biogenex CX-HEX-fosforamidita) y
que funciona como indicador del control interno (R);
\lambda_{EX}=530 nm, \lambda_{EM}=585 nm
Las condiciones de reacción se describen en los
resultados de los experimentos (ver ejemplo 7.3).
- plasma de virus negativo(matriz 0,
plasma simple o pool de plasma), p.ej. plasma de citrato o plasma
de EDTA
- plasma de virus positivo o sobrenadantes del
cultivo que contiene virus, que se pueden usar para ajustar ciertas
valoraciones de virus mezclando con la matriz 0 en proporciones
apropiadas.
- Alternativamente: transcripciones in
vitro con las secuencias de referencia a investigar
- ADN de placenta humana (a. genómico, Sigma,
cat. nr. D4642; b. fragmentado, Sigma cat. Nr. D3287), que se añade
a las muestras para simular condiciones patológicas que conducen a
la liberación de sustancias intracelulares y por consiguiente a
niveles elevados de ADN/ARN en la sangre, por ejemplo, la
enfermedad autoinmunitaria como SLE o la hemólisis.
7.3.1 Experimento 1
Diferentes muestras de MGP del tipo EJ/CERAC se
analizan con los métodos descritos en 7.1. La variable de ensayo
era la presión de pulverizado:
EJ0100.5R - 1,5 bar
EJ0106.5R - 2,5 bar
EJ0107.5R - 3,5 bar
EJ0108.5R - 4,3 bar
Podía demostrarse que aumentando la presión de
pulverizado, es decir cambiando hacia un diámetro de perla medio
más pequeño, el enlace no específico (USB) disminuye mientras que se
mantiene inalterada la generación de la señal altamente específica
que da lugar a unas proporciones o ratios elevados de
señal-ruido.
El ajuste de la valoración vírica 0,5xGG es
aproximadamente 100 sgu/ml (sgu = unidades generadoras de señales)
en el caso del HBV, y aproximadamente de 150 sgu/ml en el caso del
VIH. Los datos se resumen en la tabla 7.
7.3.2 Experimento 2
Dos variantes de los tipos EJ/MMB y EJ/CERAC,
respectivamente, se comparan funcionalmente usando el método tal
como se describe en el ejemplo 7.2 junto con muestras de plasma
individuales (PL) y en conjunto(MP). La
EJ0047.2R(MMB) y EJ0100.5R(CERAC) se pulverizan en
unas condiciones estándar, es decir 1,5 bar, 230ºC temperatura de
entrada y aproximadamente 110ºC temperatura de salida.
EJ0102.2R(MMB) y EJ0108.5R(CERAC) son variantes de
desarrollo con respecto a las condiciones de pulverizado (la
temperatura de entrada disminuía a 200ºC(MMB)), y la presión
de pulverizado aumentaba a 4,3 bar (CERAC). Los resultados se
recogen en la tabla 8 y muestran el potencial de las partículas de
núcleos nano CERAC para obtener una sensibilidad superior tal como
queda claro en los ejemplos debido al ciclo liminar prematuro y/o a
unas diferencias de señal superiores (señal de saturación menos
nivel de ruido, S-N).
7.3.3 Experimento 3
Varias preparaciones MGP del tipo EJ/MMB y
EJ/CERAC (ver tabla 9) se comparan funcionalmente usando el método
tal como se ha descrito en el ejemplo 7.2. Los resultados se resumen
en la tabla 10 y muestran el potencial de las partículas tipo
EJ0096.5R-01 para obtener una sensibilidad superior
como se refleja en los ejemplos en el ciclo liminar prematuro o en
un ratio superior independientemente de la valoración en
particular.
7.3.4 Experimento 4
Varias preparaciones MGP del tipo EJ/MMB y
EJ/CERAC se comparan funcionalmente usando el método tal como se ha
descrito en el ejemplo 7.1 donde la incubación por adsorción se
realiza con o sin agitación. Debido a ello, la velocidad de
sedimentación resulta decisiva, es decir, cuanto mayor es la
velocidad de sedimentación mayor es el número de partículas que son
retiradas de la interacción con el analito en el precipitado que se
forma. En contraste con ello, si la velocidad de sedimentación es
inferior entonces el intervalo de tiempo es mayor, en el cual las
moléculas de analito del líquido pueden adsorberse a la superficie
del adsorbente. Los resultados se resumen en la tabla 11 (EJ0047.2R
se usaba como una referencia), que demuestra que sin agitación
mecánica la pérdida de rendimiento es máxima (>40%) con el tipo
MMB (difiere considerablemente de las características de esta
invención), y mínima o prácticamente nula con el tipo CERAC (más
cerca de las características de la invención de esta serie).
Para poder evaluar la funcionalidad de los
diferentes tipos de MGP, se calculaba un índice de rendimiento para
cada tipo del modo siguiente:
- -
- Los eluidos de varios lotes para cada tipo de MGP y cada nivel de valoración, respectivamente, se recogen en 1 mezcla de eluido.
- -
- Fuera de cada mezcla de eluido, se realizaban 3 amplificaciones para cada valoración (HIV,HCV,HBV).
- -
- Cada amplificado se medía de forma unívoca en el Elecsys 1010® odificado.
- -
- Las señales se promedian para cada tipo de MGP, valoración y nivel de valoración.
- -
- Se calculan los factores señal-ruido (S/N) para cada tipo de MGP y valoración, respectivamente, es decir, valoración baja (positivo débil) o bien matriz O(negativo) y valoración elevada sobre la matriz O.
- -
- Los factores S/N se normalizan respecto al tipo de referencia de MGP en ese momento.
- -
- Cálculo de la suma de factores S/N normalizados para cada tipo de MGP, acumulados de todas las valoraciones y de los niveles de valoración; factores S/N para el margen de valoración bajo se pesan 2 veces con respecto a los del nivel de valoración alto para pronunciar los aspectos de sensibilidad.
- -
- A la suma resultante se asigna un índice de rendimiento para cada tipo de MGP investigado.
7.3.5 Experimento 5
Se utilizaban diferentes tipos de MGP para
extraer HCV en los transcritos in vitro que se diluían en
distintos niveles de diluyente que contenían 10 mmol/l de Tris, pH
80, EDTA 1 mM, 20 \mug/ml de
poli-A-RNA y un 0,05% de NaN_{3},
y se añadían al conjunto del plasma.
El ADN de fondo humano (hBG-DNA)
se añadía a 0 ó 4000 ng/ml en la muestra, respectivamente.
Sorprendentemente, es posible reducir la interferencia causada por
hBG-DNA por medio de la selección de perlas, tal
como demuestran los datos presentados en la tabla 12.
7.3.6 Experimento 6
Varios tipos de MGP se utilizaban para tratar las
muestras de plasma positivo. El ADN de fondo humano
(hBG-DNA) se añadía a la muestra en una
concentración de 0 ó 4000 ng/ml, respectivamente. De nuevo, se
observa un impacto significativo del tamaño de la perla y de la
geometría de la perla. La preparación EJ0096.5R de MGP que
representa la calidad de MGP de acuerdo con la presente invención
muestra unas ventajas muy bien definidas tanto en términos de
variación mínima de los valores ct, y reduce la pérdida de la
generación específica de la señal (S-N), tal como
indican los datos presentados en la tabla 13.
Lote | Superficie BET (m^{2}/g) | Observaciones |
EJ0096.5R-01 | 26,85 | Cerac, pequeña secadora de atomización, 6 bar |
EJ0100.5R-01 | 8,95 | Cerac, gran secadora de atomización, 1,5 bar |
EJ0101.4R-01 | 8,47 | BASF FA, gran secadora de atomización, 1,5 bar |
RN0005.2E-01 | 3,54 | MERCK MMB, gran secadora de atomización, 1,5 bar |
RN0009.1E-01 | 3,25 | MERCK BM, gran secadora de atomización, 1,5 bar |
EJ0099.9R | 0,74 | BASF CE-SU, gran secadora de atomización, 6 bar |
EJ0100.7R | 8,53 | STREM, gran secadora de atomización, 1,5 bar |
Tipo | Tamaño de los | Constitución | Forma | T_{1/2} sedimentación | T_{1/2} separación |
PVM | núcleos aislados | (min) | (seg) | ||
MMB | 3-15 \mum | Agregada | Placas | 3,9 | 14 |
CERAC | 23 nm | Singular | Perlas | \may{2}10 | 16 |
STREM | 300-500 nm | Agregada | Perlas | 4,8 | 10 |
BASF-FA | 200-300 nm | Agregada | Agujas | 4,6 | 12a |
Muestra de PVM | T_{0,9} (valor del 90%) de | T_{1/2} (valor del 50%) |
sedimentación (min) | de sedimentación (min) | |
EJ0100.5R-01 | 0,35 | 2,78 |
EJ0108.5R-01 | 0,62 | 7,58 |
EJ0096.5R-01 | 1,39 | 19,85 |
PVM | USB(recuentos)-0-matriz | SB(recuentos)-0,5xGG | ||
HIV | HBV | HIV | HBV | |
EJ0100.5R-01 | 4997 | 2277 | 20380 | 80292 |
EJ0100.5R-02 | 6100 | 3590 | 22036 | 53417 |
EJ0100.5R-03 | 4856 | 2270 | 19791 | 65109 |
EJ0106.5R-01 | 4427 | 2263 | 19030 | 75128 |
EJ0107.5R-01 | 3940 | 2261 | 19255 | 68285 |
EJ0108.5R-01 | 3429 | 2217 | 20048 | 80426 |
HBV | HCV | ||||
Muestra | MGP lote# | C | S-N | Ct | S-N |
MP2 | EJ0047.2 | 40,49 | 19,88 | 41,68 | 12,6 |
MP2 | EJ100.5 | 40,96 | 21,80 | 43,08 | 12,74 |
MP2 | EJ0102.2 | 41,93 | 21,39 | 44,74 | 10,10 |
MP2 | EJ0108.5 | 40,09 | 22,01 | 47,36 | 10,61 |
Pl.1/2 | EJ0047.2 | 41.03 | 18,14 | - | - |
Pl.1/2 | EJ100.5 | 40,12 | 19,31 | - | - |
Pl.1/2 | EJ0102.2 | 41,81 | 22,80 | 44,69 | 14,30 |
Pl.1/2 | EJ0108.5 | 39,93 | 21,77 | 43,27 | 12,58 |
Pl.4/5 | EJ0047.2 | 46,33 | 12,83 | 39,54 | 18,30 |
Pl.4/5 | EJ100.5 | 40,82 | 15,12 | 38,24 | 21,48 |
Pl.4/5 | EJ0102.2 | 42,49 | 19,65 | 39,24 | 19,05 |
Pl.4/5 | EJ0108.5 | 47,33 | 9,51 | 39,47 | 17,81 |
Pl.6/8 | EJ0047.2 | 41.08 | 20,83 | 49,44 | 9,46 |
Pl.6/8 | EJ100.5 | 40,68 | 23,16 | 48,98 | 10,31 |
Pl.6/8 | EJ0102.2 | 40,50 | 22,49 | 54,50 | 6,50 |
Pl.6/8 | EJ0108.5 | 38,79 | 18,60 | 50,41 | 8,61 |
Pl.6/8 | EJ0047.2 | 44,16 | 17,26 | 41,40 | 10,59 |
Pl.6/8 | EJ100.5 | 42,97 | 18,59 | 41.01 | 11,33 |
Pl.6/8 | EJ0102.2 | 44,49 | 12,41 | 42,18 | 11,32 |
Pl.6/8 | EJ0108.5 | 41,24 | 18,73 | 41,46 | 10,80 |
Estadística de recuento: Que tipo tiene la mejor puntuación? | |||||
"muestras estándar" | "variantes de desarrollo" | total: mejor tipo por | |||
valoración de muestra | |||||
MMB:CERAC | MMB:CERAC | MMB:CERAC | |||
Ct S-N | Ct S-N | Ct S-N | |||
2:7 0:9 | 3:7 5:5 | 1:9 3:7 | |||
(1 comparación no pudo evaluarse) |
\vskip1.000000\baselineskip
PVM | Descripción |
EJ0096.5R | \begin{minipage}[t]{110mm} Presión de atomización de 6,0 bar, temperatura de entrada 150^{o}C, equipo de laboratorio Büchi. Esta preparación se acerca mucho a las características conforme a la invención, ver figura 15.\end{minipage} |
EJ0111.5R | \begin{minipage}[t]{110mm} Presión de atomización de 1,5 bar, temperatura de entrada 230^{o}C, equipo de laboratorio Nubilosa\end{minipage} |
EP0119.5R | \begin{minipage}[t]{110mm} Presión de atomización de 1,5 bar, temperatura de entrada 230^{o}C, equipo de laboratorio Nubilosa, composición de vidrio alterada sin acetato de Zn, K-metanolato sustituido por acetato de K, con idéntica estequiometría\end{minipage} |
EJ108.5R | \begin{minipage}[t]{110mm} Presión de atomización de 4,3 bar, temperatura de entrada 230^{o}C, equipo de laboratorio Nubilosa\end{minipage} |
Valores
Ct(HBV)
Cálculo de ct a través del máximo de
la primera
diferenciación
Parámetro HBV | ||||
Valoración | Lote MGP | Lote MGP | Lote MGP | Lote MGP |
(sgu/ml) | EJ0111.5R-02 | EJ0119.5R | EJ0096.5R | EJ0108.5R |
AVG | AVG | AVG | AVG | |
NK | - | - | - | - |
100 | 46,1 | 44,1(6/6) | 43,4 | 44,2 |
40 | 47,6 | 46,5(7/8) | 45,5(7/8) | 46,7(6/7) |
20 | 50,6(6/8) | 46,1(6/8) | 46,8(7/8) | 50,0(4/8) |
10 | 47,6(5/8) | 50,1(5/8) | 46,8(4/8) | 47,7(3/7) |
5 | 51,2(3/8) | 48,6(4/8) | 47,8(5/8) | 49,7(4/7) |
hit rate | 75% | 74% | 77,5% | 67,5% |
\vskip1.000000\baselineskip
Cálculo de ct a través de la
fórmula límite o
discriminatoria
Parámetro HBV | ||||
Valoración | Lote MGP | Lote MGP | Lote MGP | Lote MGP |
(sgu/ml) | EJ0111.5R-02 | EJ0119.5R | EJ0096.5R | EJ0108.5R |
AVG | AVG | AVG | AVG | |
NK | - | - | - | - |
100 | 44,2 | 41,7(6/6) | 41,5 | 41,9 |
40 | 45,5 | 44,1(7/8) | 42,7(6/8) | 45,0(6/7) |
20 | 47,7(6/8) | 43,5(6/8) | 44,3(7/8) | 47,2(6/8) |
10 | 45,5(5/8) | 47,7(5/8) | 44,4(6/8) | 45,6(3/8) |
5 | 49,3(3/8) | 45,7(4/8) | 45,4(4/8) | 46,6(4/7) |
hit rate | 75% | 74% | 77,5% | 71% |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Valores
Ct(HCV)
Cálculo de ct a través del máximo de
la primera
diferenciación
Parámetro HCV | ||||
Valoración | Lote MGP | Lote MGP | Lote MGP | Lote MGP |
(IU/ml) | EJ0111.5R-02 | EJ0119.5R | EJ0096.5R | EJ0108.5R |
AVG | AVG | AVG | AVG | |
NK | - | - | - | |
400 | 42,7 | 42,5(7/8) | 41,8 | 42,6(7/7) |
80 | 44,4(7/8) | 44,1(6/6) | 44,2(7/8) | 44,2(7/7) |
60 | 45,1 | 44,7(7/7) | 44,4(6/7) | 45,1(6/6) |
40 | 46,2(7/8) | 45,8(7/7) | 43,9(5/7) | 44,5(7/7) |
20 | 46,5(5/8) | 46,3(7/7) | 45,0(6/8) | 47,4(4/8) |
hit rate | 90% | 97% | 84% | 88,5% |
\newpage
TABLA 10
(continuación)
Cálculo de ct a través de la
fórmula límite o
discriminatoria
Parámetro HCV | ||||
Valoración | Lote MGP | Lote MGP | Lote MGP | Lote MGP |
(IU/ml) | EJ0111.5R-02 | EJ0119.5R | EJ0096.5R | EJ0108.5R |
AVG | AVG | AVG | AVG | |
NK | - | - | - | - |
400 | 41,8 | 41,6(7/8) | 40,9 | 41,7(7/7) |
80 | 44,6(7/7) | 44,0(6/6) | 43,4(7/8) | 44,5(7/7) |
60 | 44,7 | 45,3(7/7) | 45,1(6/7) | 44,3(5/6) |
40 | 47,9(7/8) | 46,1(7/7) | 44,7(4/7) | 47,5(7/7) |
20 | 49,6(5/8) | 47,2(7/7) | 45,3(5/8) | 47,4(4/8) |
hit rate | 90% | 97% | 79% | 86% |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Valores
Ct(HIV)
Cálculo de ct a través del máximo de
la primera
diferenciación
Parámetro HIV | ||||
Valoración | Lote MGP | Lote MGP | Lote MGP | Lote MGP |
(sgu/ml) | EJ0111.5R-02 | EJ0119.5R | EJ0096.5R | EJ0108.5R |
AVG | AVG | AVG | AVG | |
NK | - | - | - | - |
30 | 43.2(6/8) | 46,9(3/8) | 43,9(3/7) | 41,9(1/7) |
60 | 42,7(4/7) | 42,6(4/7) | 42,8 (7/7) | 42,4(2/7) |
150 | 42,4(5/7) | 42,0 | 41,7(6/6) | 42,6(6/8) |
300 | 41,9(5/5) | 41,0(5/5) | 41,5(6/6) | 41,3(6/6) |
600 | 41,6(7/7) | 40,8(6/6) | 40,8(5/5) | 41,5 |
hit rate | 79% | 76% | 87% | 64,0% |
\vskip1.000000\baselineskip
Cálculo de ct a través de la
fórmula límite o
discriminatoria
Parámetro HIV | ||||
Valoración | Lote MGP | Lote MGP | Lote MGP | Lote MGP |
(IU/ml) | EJ0111.5R-02 | EJ0119.5R | EJ0096.5R | EJ0108.5R |
AVG | AVG | AVG | AVG | |
NK | - | - | - | - |
30 | 44,3(1/8) | 47,3(2/8) | 46,8(1/7) | -(0/7) |
60 | 50,3(3/7) | 54,1(1/7) | 51,4(4/7) | -(0/7) |
150 | 47,4(5/7) | 43,7(5/8) | 45,5(5/7) | 52,2(2/8) |
300 | 42,2(5/5) | 44,8(5/5) | 41,6(4/6) | 46,5(6/6) |
600 | 41,2(7/7) | 41,3(5/6) | 41,1(5/5) | 42,5 |
hit rate | 62% | 53% | 59% | 44% |
Tipo MGP | HIV 1 | HCV | \rightarrow | HBV | Indice | Relación de | ||
rendimiento | índices de | |||||||
funcionamiento | ||||||||
60 | 600 | 480 | 4800 | 40 | 400 | Acumulado/ | Sin/con | |
sgu/neg | sgu/neg | sgu/neg | sgu/neg | sgu/neg | sgu/neg | pesado/ | agitación | |
normalizado | ||||||||
EJ0047.2R | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 900 | - - - |
(referencia) | ||||||||
EJ0096.5R | 55 | 34 | 44 | 74 | 146 | 112 | 709 | - |
EJ0096.7R | 47 | 47 | 18 | 8 | 116 | 107 | 523 | - |
EJ0097.4R | 32 | 54 | 29 | 47 | 169 | 132 | 692 | - |
RN0045.5R | 85 | 64 | 76 | 63 | 7 | 84 | 545 | - |
RN0046.7R | 109 | 80 | 43 | 40 | 121 | 135 | 803 | - |
RN0045.4R | 48 | 93 | 112 | 128 | 136 | 96 | 908 | - |
EJ0047.2R | 24 | 24 | 52 | 49 | 93 | 122 | 534 | 0,59 |
(referenc.) | ||||||||
EJ0096.5R | 28 | 23 | 47 | 88 | 102 | 154 | 619 | 0,87 |
EJ0096.7R | 34 | 23 | 38 | 14 | 99 | 70 | 449 | 0,86 |
EJ0097.4R | 33 | 36 | 20 | 18 | 101 | 94 | 456 | 0,66 |
RN0045.5R | 53 | 74 | 60 | 25 | 107 | 72 | 610 | 1,12 |
RN0046.7R | 141 | 90 | 16 | 8 | 32 | 40 | 518 | 0,64 |
RN0045.4R | 55 | 113 | 25 | 146 | 78 | 101 | 675 | 0,74 |
Partículas | Valoración | \DeltahADN | \Deltact | \DeltaS-N |
HCV(IVT-ARN) | ||||
RN0009.1E= grandes laminillas | ||||
(3-60 \mum) | 1000 cp/PCR | 4000 ng/ml | +2 | -6,1 |
EJ0100.5R= bolas deformadas | ||||
(aprox. 1-12 \mu) | -1 | -3,2 | ||
EJ0108.5R= bolas deformadas* | ||||
(aprox. 1-4 \mu) | \pm0 | -1,2 | ||
* variante de elevada presión, ver secciones 7.2.4.2 \textamp 7.3.1, respectivamente. | ||||
\begin{minipage}[t]{155mm} Nota: (+)\Delta ct = menos sensible (es decir, tendencia hacia resultados falsos negativos); (-)\Delta ct = más sensible (tendencia hacia resultados falsos positivos?) (-)\Delta S-N = generación de la señal menos específica = interferencia negativa\end{minipage} |
Partículas | Valoración | \DeltahADN | \Deltact | \DeltaS-N |
(ARN genómico extraído) | ||||
EJ0096.5R= objetivo de | 200 IU/muestra | 4000 ng/ml | -0,95 | -8,5 |
diseño* | ||||
EJ0127.5R= estándar | -3,08 | -13,89 | ||
EJ0129.5R= variante p | -2,30 | -12,62 | ||
EJ0130.5R= variante p | -2,62 | -10,57 | ||
EJ0131.5R= variante p | -2,46 | -12,41 | ||
* = margen de 0,5-5 \mu; >50% subescala \mu; área de gran superficie (27 m^{2}/g BET); perlas perfectamente esféricas | ||||
variante p = secado por atomización a una presión elevada (ver apartado 7.3.1) |
<110> Roche Diagnostics GMBH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Partículas de vidrio magnéticas,
método para su preparación y usos de las mismas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 52960AEP engl AB
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP99122853.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-11-17
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: capa aislante sintética de oligonucleótidos
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagggcaaa actcagctca ccg
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgagttcg tgtccgtaca act
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (VIH
avance)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización de biotina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagttggagga catcaagcag ccatgcaaat
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (VIH
invertido)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización de biotina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctatgtca gttccccttg gttctct
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (HCV
avance)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagaaagcg tctagccatg gcgt
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (HCV
invertido)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización de biotina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgcaagca ccctatcagg cagt
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (HBV
avance)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagtgtgga ttcgcact
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (HBV
invertido)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización de biotina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgagatcttc tgcgacgc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Muestra de oligonucleótido sintético (VIH)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización de rutenio
3+-(trisbipiridilo)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcaatgagg aagctgcaga
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Muestra de oligonucleótido sintético (HCV)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización de rutenio
3+-(trisbipiridilo)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgtgcagc ctccaggacc c
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Muestra de oligonucleótido sintético (HCV)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización de rutenio
3+-(trisbipiridilo)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaccaccaa atgcccct
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (VIH)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización con residuo de
p-(t-butil)benzilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtgggggga catcaagcag ccatgcaaa
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (VIH)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización con residuo de
p-(t-butil)bencilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtactagta gttcctgcta tgtcacttcc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (VIH
avance)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización con residuo de
p-(t-butil)bencilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaagcaccc tatcaggcag taccacaa
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (VIH
avance)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización con residuo de
p-(t-butil)bencilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaagtcaga aggcaaaaaa gagagtaa
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (HBV
invertido)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización con residuo de
p-(t-butil)bencilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacctctgcc taatcatctc ttgttca
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Muestra de oligonucleótido sintético (VIH)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización con una
pentametina-di-indocarbocianina a
través de un conector de alquilfosfatidilo (Pharmacia Biotech
Cy5-N-etil-fosforamidita)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo equivocado
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N representa un conector
2-(amino-ciclohexil)-propano-1,3-diol
derivatizado con
6-carboxi-fluoresceina
(Biogen-ex
CX-FAM-fosforamidita).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización con un grupo fosfato
3'-terminal
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgcagctn tcctcattga tggtatcttt ta
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Muestra de oligonucleótido sintético (HCV)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización con una
pentametina-di-indocarbocianina a
través de un conector de alquilfosfatidilo (Pharmacia Biotech
Cy5-N-etil-fosforamidita)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo equivocado
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N representa un conector
2-(amino-ciclohexil)-propano-1,3-diol
derivatizado con
6-carboxi-fluoresceína
(Biogen-ex
CX-FAM-fosforamidita).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización con un grupo fosfato
3'-terminal
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggtgtactc accgnttccg cagaccacta tg
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización con una
pentametina-di-indocarbo-cianina
a través de un conector de alquilfosfatidilo (Pharmacia Biotech
Cy5-N-etil-fosforamidita)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo equivocado
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N representa un conector
2-(amino-ciclohexil)-propano-1,3-diol
derivatizado con
6-carboxi-fluoresceína
(Biogen-ex
CX-FAM-fosforamidita).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización con un grupo fosfato
3'-terminal
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaagctgtg ccttggntgg ctttggggca tgg
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Muestra de oligonucleótido sintético (VIH)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización con una
pentametina-di-indocarbo-cianina
a través de un conector de alquilfosfatidilo (Pharmacia Biotech
Cy5-N-etil-fosforamidita)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo equivocado
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N representa un conector
2-(amino-ciclohexil)-propano-1,3-diol
derivatizado con
6-carboxi-fluoresceina
(Biogen-ex
CX-FAM-fosforamidita).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización con un grupo fosfato
3'-terminal
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptggactcagt cctntggtca tctcaccttc t
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
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<211> 46
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido sintético (aptámero)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (46)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivatización con un grupo fosfato
3'-terminal
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatcatctc agaacattct tagcgttttg ttcttgtgta tgatcg
\hfill
Claims (54)
1. Método para la producción de un compuesto de
partículas de vidrio magnéticas que comprende las etapas de
- a)
- suspensión de objetos magnéticos con un diámetro entre 5 y 500 nm en un sol,
- b)
- secado por atomización de la suspensión en una secadora por atomización de dos boquillas, y
- c)
- sinterizado del polvo secado por atomización.
2. Método conforme a la reivindicación 1 que se
caracteriza porque la temperatura de entrada de la secadora
por atomización de dos boquillas se encuentra entre 120ºC y 500ºC,
la temperatura de salida se elige conforme al punto de ebullición
del sol y la presión de atomización es de cómo mínimo 3 bar.
3. Método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, que se caracteriza porque la
temperatura de entrada de la secadora por atomización de doble
boquilla se encuentra entre 170ºC y 230ºC, preferiblemente entre
190ºC y 210ºC.
4. Método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza porque la presión
de atomización se sitúa entre 4 y 6 bar.
5. Método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que se caracteriza porque el sol
contiene etanol como disolvente.
6. Método conforme a la reivindicación 5, que se
caracteriza porque la temperatura de salida se encuentra
entre 50ºC y 300ºC.
7. Método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 6, que se caracteriza porque la
temperatura de salida se sitúa entre 90ºC y 100ºC.
8. Método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que se caracteriza porque la
temperatura de sinterizado se encuentra entre 400ºC y 1200ºC,
preferiblemente entre 720ºC y 770ºC.
9. Partículas de vidrio magnéticas que se
obtienen según un proceso reivindicado en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8.
10. Composición de partículas de vidrio
magnéticas que se obtienen mediante un proceso como el reivindicado
en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que contiene al menos
un objeto magnético con un diámetro medio entre 5 y 500 nm, que se
caracteriza porque el periodo de vida media para la
sedimentación de una suspensión de 3 mg/ml de peso por volumen de la
composición en isopropanol es mayor de 3 min.
11. Composición conforme a la reivindicación 10
que se caracteriza porque el objeto magnético tiene un
diámetro medio entre 10 y 200 nm, preferiblemente entre 15 y 50
nm.
12. Composición conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 11, que se caracteriza porque el
periodo de vida media es superior a 6 min.
13. Composición conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, que se caracteriza porque el objeto
magnético tiene un diámetro medio de 23 nm.
14. Composición conforme a la reivindicación 10 o
13, que se caracteriza porque el ratio del diámetro del
cuerpo magnético respecto a la envoltura de vidrio es menor de
1:10.
15. Composición conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 14, que se caracteriza porque las
partículas de vidrio magnéticas tienen un diámetro medio entre 0,5 y
5 \mum.
16. Composición conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 15, que se caracteriza porque las
partículas de vidrio magnéticas son microporosas.
17. Composición conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 16, que se caracteriza porque la
superficie de los poros de las partículas de vidrio magnéticas es
inferior al 10% de la superficie total.
18. Composición conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 17, que se caracteriza porque el objeto
magnético es superparamagnético.
19. Composición conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 18, que se caracteriza porque el objeto
magnético es ferrimagnético o ferromagnético.
20. Composición conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 19, que se caracteriza porque el objeto
magnético consta de hierro o bien óxido de hierro.
21. Composición conforme a la reivindicación 20,
que se caracteriza porque el óxido de hierro es
Fe_{3}O_{4} o bien \gamma-Fe_{2}O_{3}.
22. Composición conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 21, que se caracteriza porque las
partículas de vidrio magnéticas tienen un área superficial superior
a 4 m^{2}/g.
23. Composición conforme a la reivindicación 22,
que se caracteriza porque las partículas de vidrio magnéticas
tienen un área superficial entre 5 y 100 m^{2}/g, preferiblemente
del orden de 10 a 50 m^{2}/g, más preferiblemente entre 15 y 30
m^{2}/g.
24. Composición conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 23, que se caracteriza porque las
partículas de vidrio magnéticas son básicamente esféricas.
25. Suspensión que contiene una composición de
partículas de vidrio magnéticas en un líquido conforme a cualquiera
de las reivindicaciones 10 a 24.
26. Suspensión conforme a la reivindicación 25,
que se caracteriza porque el líquido consta de un
alcohol.
27. Suspensión conforme a la reivindicación 26,
que se caracteriza porque el alcohol es isopropanol o
etanol.
28. Suspensión conforme a la reivindicación 25,
que se caracteriza porque el líquido es una solución acuosa
tampón.
29. Suspensión conforme a la reivindicación 28,
que se caracteriza porque la suspensión contiene además ADN o
ARN
30. Suspensión conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 29, que se caracteriza porque la
suspensión contiene además un agente caotrópico.
31. Suspensión conforme a la reivindicación 30,
que se caracteriza porque el agente caotrópico está presente
en una concentración entre 2 y 8 mol/l, y preferiblemente entre 4 y
6 mol/l.
32. Suspensión conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 31, que se caracteriza porque la
suspensión contiene 5 a 60 mg/ml de un compuesto conforme a
cualquiera de las reivindicaciones 10-24.
33. Un tubo que contiene una composición conforme
a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 24 o bien una suspensión
conforme a cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32.
34. Un estuche de piezas que contiene un tubo
conforme a la reivindicación 33.
35. Un estuche de piezas conforme a la
reivindicación 34 que contiene además una solución de lavado o
eluyente.
36. Un estuche de piezas conforme a cualquiera de
las reivindicaciones 34 a 35 que comprende además reactivos
adecuados para la purificación de un ácido nucleico.
37. Uso de una composición conforme a cualquiera
de las reivindicaciones 10 a 24 para la preparación de una
suspensión.
38. Uso de una suspensión conforme a cualquiera
de las reivindicaciones 25 a 32 para la purificación de ácidos
nucleicos.
39. Uso de un estuche de piezas conforme a
cualquiera de las reivindicaciones 34 a 35 para la purificación de
ácidos nucleicos.
40. Procedimiento para aislar un material
biológico que comprende
- a)
- poner una muestra que contiene el material biológico en un líquido en contacto con una composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 24, las partículas de vidrio magnéticas conforme a la reivindicación 9 o bien una suspensión conforme a cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32 en unas condiciones en las cuales el material biológico enlaza directamente con la superficie de vidrio, y
- b)
- separar el material biológico del líquido.
41. Procedimiento conforme a la reivindicación
40, que se caracteriza porque el material biológico es un
ácido nucleico.
42. Procedimiento conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 41, que se caracteriza porque la
separación se realiza con ayuda de un imán.
43. Procedimiento conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 42, que se caracteriza porque las
partículas magnéticas no son premagnetizadas cuando se ponen en
contacto con la muestra.
44. Procedimiento conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 43, que se caracteriza porque el
procedimiento es automatizado.
45. Procedimiento conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 44, que se caracteriza porque el
procedimiento está en un formato de gran capacidad.
46. Procedimiento conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 45, que se caracteriza porque durante
el procedimiento se coge una suspensión conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 28 de un recipiente de almacenamiento y se
añaden volúmenes parciales de la suspensión a diferentes recipientes
de reacción.
47. Procedimiento conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 46, que se caracteriza porque el ácido
nucleico se detecta después de la purificación.
48. Procedimiento conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 46 a 47, que se caracteriza porque el ácido
nucleico se detecta después de una etapa de amplificación.
49. Procedimiento conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 48, que se caracteriza porque el ácido
nucleico se detecta mediante un proceso que comprende:
- a)
- puesta en contacto de la muestra con un oligonucleótido que contiene una secuencia complementaria a una región del ácido nucleico objetivo y con un oligonucleótido marcado que contiene una secuencia complementaria a una segunda región de la misma rama de secuencia del ácido nucleico, pero no incluye la secuencia de ácido nucleico definida por el primer oligonucleótido, para crear una mezcla de duplos durante las condiciones de hibridación, donde los duplos comprenden el ácido nucleico definido recocido al primer oligonucleótido y al oligonucleótido marcado de manera que el extremo 3' del primer oligonucleótido sea adyacente al extremo 5' del oligonucleótido marcado;
- b)
- mantenimiento de la mezcla de la etapa a) con una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla que tiene una actividad 5'\rightarrow3' nucleasa en unas condiciones suficientes para permitir que la actividad 5'\rightarrow3' nucleasa de la polimerasa parta el oligonucleótido marcado, recocido, y libere los fragmentos marcados; y
- c)
- detección y/o medición de la señal generada por la hidrólisis del nucleótido marcado.
50. Procedimiento conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 48 a 49 que se caracteriza porque la
detección se realiza en presencia de un oligonucleótido
bloqueante.
51. Procedimiento conforme a la reivindicación 50
que se caracteriza porque el oligonucleótido bloqueante es un
aptámero.
52. Procedimiento conforme a la reivindicación 51
que se caracteriza porque el aptámero tiene la secuencia SEQ
ID NO:23.
53. Procedimiento conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 50 a 52 que se caracteriza porque la
reacción de amplificación y detección se lleva a cabo en un formato
de análisis múltiple de una fase de solución homogénea para la
detección simultánea de múltiples objetivos.
54. Procedimiento conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 51 a 53 que se caracteriza porque para como
mínimo 5 ciclos de la reacción en cadena de la polimerasa, la
temperatura de recocido es inferior a 8ºC, preferiblemente menor de
3ºC por encima de la temperatura de disociación del complejo de
polimerasa-aptámero.
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