ES2256068T3

ES2256068T3 - Particulas de cristal magneticas, metodo para su preparacion y usos de las mismas.

Info

Publication number: ES2256068T3
Application number: ES00981267T
Authority: ES
Inventors: Kurt Weindel; Michael Riedling; Albert Geiger
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1999-11-17
Filing date: 2000-11-17
Publication date: 2006-07-16
Anticipated expiration: 2020-11-17
Also published as: SK287932B6; US20030224366A1; DE60025529D1; SK6642002A3; DE60025529T2; PT1232502E; HUP0203386A3; WO2001037291A1; JP2003514383A; PL356771A1; EP1232502B1; ATE315826T1; US20120247150A1; EP1232502A1; DK1232502T3; CA2392009A1; US8129118B2; HUP0203386A1; JP2006193421A; JP4361905B2

Abstract

Método para la producción de un compuesto de partículas de vidrio magnéticas que comprende las etapas de a) suspensión de objetos magnéticos con un diámetro entre 5 y 500 nm en un sol, b) secado por atomización de la suspensión en una secadora por atomización de dos boquillas, y c) sinterizado del polvo secado por atomización.

Description

Partículas de cristal magnéticas, método para su preparación y usos de las mismas.

Esta invención se refiere a las partículas magnéticas que tienen una superficie de cristal y son básicamente esféricas. Esta invención también hace referencia a los métodos para fabricarlas, así como a las suspensiones a partir de ellas y a sus usos para la purificación del material biológico en procesos automatizados.

Muchos materiales biológicos, especialmente los ácidos nucleicos, presentan unos retos especiales en lo que se refiere a su capacidad para aislarlos de su entorno natural. Por otro lado, a menudo se encuentran presentes en unas concentraciones muy pequeñas, y, por otro lado, a menudo se encuentran en presencia de otras muchas sustancias sólidas y disueltas lo que impide su aislamiento o medida, en particular en análisis bioespecíficos.

Los análisis de enlaces bioespecíficos permiten la detección de analitos específicos, por ejemplo, ácidos nucleicos, o bien unas propiedades específicas del analito y tienen un importante papel en el campo de los diagnósticos y de los bioanalíticos. Ejemplos de ello son los análisis de hibridación, los inmunoanálisis y los análisis de ligandos
receptores.

Los análisis de hibridación utilizan el par de base específico para la detección molecular de los analitos de ácido nucleico, por ejemplo, de ARN y de ADN. De ahí que las muestras de oligonucleótidos con una longitud de 18 a 20 nucleótidos puedan permitir el reconocimiento específico de una secuencia determinada en el genoma humano. Otro análisis que utiliza el enlace selectivo de dos capas aislantes de oligonucleótidos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrita en US 4.683.195. Este método emplea la amplificación selectiva de una región específica de ácido nucleico hasta unos niveles detectables por una polimerasa termoestable en presencia de trifosfatos desoxinucleótidos en varios ciclos.

Los ácidos nucleicos son analitos comparativamente complejos que tienen que ser extraídos normalmente de mezclas de complejos antes de poder ser utilizados en un análisis basado en una muestra.

Existen varios métodos para la extracción de ácidos nucleicos:

\bullet métodos bioespecíficos o dependientes de una secuencia como, por ejemplo:

\bullet: cromatografía de afinidad

\bullet: hibridación para dar muestras inmovilizadas en perlas

\bullet métodos físico-químicos o independientes de la secuencia como, por ejemplo:

\bullet: extracción líquido-líquido con fenol-cloroformo

\bullet: precipitación con etanol puro, por ejemplo.

\bullet: Extracción con papel de filtro

\bullet: Extracción con agentes que forman micelas como el bromuro de cetiltrimetilamonio

\bullet: Adsorción a gel de sílice o tierras de diatomeas

\bullet: Adsorción a partículas de cristal magnéticas (PCM) o bien partículas de organosilanos en condiciones caotrópicas

Recientemente, se han propuesto muchos procedimientos y materiales para aislar ácidos nucleicos de su entorno natural mediante el uso de su comportamiento enlazante a las superficies de cristal. En Proc. Natl. Acad. USA 76, 615-691 (1979), por ejemplo, se ha propuesto un procedimiento para enlazar ácidos nucleicos en geles de agarosa en presencia de yoduro sódico en un vidrio incoloro.

Se ha descrito la purificación del ADN de plásmido de las bacterias en polvo de vidrio en presencia de perclorato sódico en Anal. Biochem. 121, 382-387(1982).

En la DE-A 37 34 442, se ha descrito el aislamiento del ADN monocatenario del bacteriófago M13 en filtros de fibra de vidrio precipitando las partículas de bacteriófago usando ácido acético, y la lisis de las partículas de bacteriófago con percloratos. Los ácidos nucleicos enlazados a los filtros de fibra de vidrio se lavan y luego se eluyen con una solución amortiguadora que contiene mentol en una solución de Tris/EDTA.

Un procedimiento similar para purificar el ADN de los bacteriófagos \lambda se ha descrito en Anal. Biochem. 175, 196-201(1988).

La EP 757 106 hace referencia a un soporte magnético enlazable al ácido nucleico que comprende unas partículas de sílice magnéticas que constan de óxido metálico super-paramagnético, donde las partículas de sílice magnético tienen una superficie específica de unos 100 a aproximadamente 800 m^{2}/g.

Pal, M., y cols., J. Magnetism Magnetic Materials 164(1996), 256-260 se refiere a la ferrita de níquel-zinc nanocristalina preparada por la vía del vidrio cerámico.

El procedimiento conocido de técnicas anteriores permite el enlace selectivo de ácidos nucleicos a superficies de vidrio en soluciones salinas caotrópicas y separando los ácidos nucleicos de contaminantes como la agarosa, las proteínas o residuos celulares. Para separar las partículas de vidrio de los contaminantes conforme al método anterior, se centrifugarán las partículas o bien se extraerán los fluidos a través de filtros de fibra de vidrio. No obstante, esta es una etapa limitadora que impide que el procedimiento sea utilizado para procesar grandes cantidades de
muestras.

Se ha demostrado que las partículas magnéticas recubiertas de una superficie de vidrio ofrecen ventajas considerables para aislar materiales biológicos. Si las partículas magnéticas no se han puesto en contacto con un campo magnético, la gravedad es la única fuerza que puede hacer que éstas sedimenten. Se pueden volver a suspender agitando la solución. El procedimiento de sedimentación que no utiliza un campo magnético actúa más lentamente que la inmovilización de materiales biológicos en la superficie de las partículas. Esto es especialmente cierto para los ácidos nucleicos. Las partículas magnéticas pueden ser recogidas fácilmente en un lugar específico en el fluido de muestra por medio de un imán. Luego el fluido se separa de las partículas, y por ello de los materiales biológicos inmovilizados.

El uso de partículas magnéticas para inmovilizar ácidos nucleicos después de la precipitación añadiendo sal y etanol se ha descrito en Anal. Biochem. 201, 166-169(1992) y PCT GB 91/00212. En este procedimiento, los ácidos nucleicos son aglutinados junto con las partículas magnéticas. El aglutinado se separa del disolvente original aplicando un campo magnético y realizando una etapa de lavado. Después de una etapa de lavado, los ácidos nucleicos se disuelven en una solución amortiguadora Tris. Este procedimiento tiene, sin embargo, un inconveniente. La precipitación no es selectiva para los ácidos nucleicos. Más bien lo que ocurre es que una variedad de sustancias sólidas y disueltas se aglutinan y como resultado de ello este procedimiento no puede ser utilizado para eliminar cantidades significativas de algunos inhibidores de reacciones enzimáticas específicas. También se dispone de vidrio poroso y magnético en el mercado actual, que contiene partículas magnéticas en una matriz porosa de vidrio y está cubierto de una capa que contiene estreptavidina. Este producto puede ser utilizado para aislar materiales biológicos, por ejemplo, proteínas o ácidos nucleicos, si se modifican en una etapa de preparación compleja para que puedan formar un enlace covalente con la biotina. Los adsorbentes especialmente magnetizables resultaban ser muy eficaces y adecuados para la preparación automática de las muestras. Pueden utilizarse pigmentos ferrimagnéticos y ferromagnéticos así como superparamagnéticos con esta finalidad.

Las partículas, según el experto, son materiales sólidos que tienen un diámetro pequeño. A partículas como éstas también se les denomina pigmentos.

Dichos materiales se conocen como sustancias magnéticas que son atraídas por un imán, es decir, materiales ferromagnéticos o superparamagnéticos, por ejemplo. El superparamagnetismo se considera como ventajoso y preferible en la tecnología actual (por ejemplo, US 5.928.958; US 5.925.573; EP 757 106). El vidrio o las superficies de organosilanos a menudo se tratan para ser utilizadas para reacciones de captura bioespecíficas, por ejemplo, US 5.928.958, US 5.898.071, US 5.898.071, US 5.925.573, EP 5.925.573, EP 937 497, US 4.554.088 o bien US 4.910.148. Alternativamente, las superficies de vidrio o de organosilanos se pueden tratar con varios disolventes o sales para modificar su hidrofilicidad y/o electropositividad, por ejemplo, US 5.438.127.

Sin embargo, los grupos de silanol no derivatizados de la superficie de vidrio o de silano se pueden utilizar para la adsorción con fuerzas físico-químicas puras en unas condiciones de reacción adecuadas, tal como se ha descrito en DE 195 20 964, DE 195 37 985, WO 96/41840, WO 96/41811, EP 7575 106 o bien US 5.520.899. Generalmente, los núcleos magnéticos o los agregados de núcleos magnéticos se cubren de una superficie de vidrio que se forma por un proceso sol-gel catalizado en un medio ácido o básico. Estas partículas se denominan partículas núcleo-cáscara. La cáscara o envoltura de vidrio tiene un grosor de capa típico (ver por ejemplo DE 195 20 964) donde el tamaño y la forma del pigmento, que puede contener un soporte no magnético como, por ejemplo, mica además del óxido metálico magnético, determina el tamaño y la forma de la partícula producida (ver, por ejemplo, DE 195 37 985 y WO 96/41811 correspondiente). Para obtener una actividad superficial elevada, se utiliza material de vidrio de elevada porosidad (ver, por ejemplo, EP 757 106; WO 99/26605). Además, se describen partículas magnéticas compuestas, por ejemplo, óxido férrico cubierto de silicato con una matriz de sílice inorgánica de partículas de sílice (EP 757 106) o mezclas de vidrio y gel de sílice (WO95/06652).

El problema que tiene que ser resuelto por la invención actual puede consistir en lograr partículas de vidrio magnéticas con mejores propiedades para la preparación de las muestras y para los análisis biológicos, en particular para los procesos automatizados.

Las deficiencias de las partículas de vidrio magnéticas de la tecnología actual se ven superadas por los hallazgos de la presente invención.

Un objetivo de la invención consiste en lograr una composición de partículas de vidrio magnéticas. Las partículas de vidrio magnéticas (PVMs) conforme a la presente invención son una dispersión sólida de pequeños núcleos magnéticos en vidrio. Las PVMs son comparativamente pequeñas y son básicamente esféricas. El contenido fino no magnético de una composición de PVMs es muy bajo debido al método de su preparación. El resultado de ello es que las suspensiones de PVMs sedimentan lentamente y por tanto pueden ser utilizadas para procesos en biología molecular que puedan ser automatizados. En una configuración de la invención, se dispone de composiciones y suspensiones de PVMs conforme a la presente invención. En otra configuración de la invención se dispone de un método para la composición de las PVMs. En otra configuración de la invención se dispone de un método para la purificación de ADN o ARN, en el cual se utilizan PVMs conforme a la presente invención.

Un objetivo de la presente invención consiste en lograr una composición de partículas de vidrio magnéticas que sean básicamente esféricas y tengan un diámetro pequeño y contengan al menos un objeto magnético con un diámetro entre 5 y 500 nm. Esto tiene unas consecuencias sorprendentes en la cinética de sedimentación, cuantificadas por los valores de la mitad del tiempo t_{1/2}, que es el tiempo transcurrido hasta que el 50% de las partículas hayan sedimentado de un volumen específico (ver ejemplo 6). El periodo de vida media para la sedimentación de una suspensión de 3 mg/ml de peso por volumen de la composición en isopropanol es mayor a 3 min., preferiblemente 4 min., más preferiblemente 6 min. Sin embargo, los valores más preferidos para el periodo de vida media son superiores a 10 min. o incluso a 20 min. Cuanto menor y más cercano a la esfera ideal, más largo será el tiempo en que las PVMs estén en suspensión. Esto puede explicarse por el hecho de que cuanto más se acerque a una esfera ideal, menor será la posibilidad de que dos o más partículas se adhieran y formen agregados que puedan sedimentar más rápidamente. Estos datos se muestran en el ejemplo 6 y las imágenes de microscopía electrónica de alta resolución pueden verse en la figura 4 a la figura 10. Esto tiene la ventaja de que para los procesos automatizados la intensidad de mezcla y la frecuencia de mezcla requeridas de los recipientes de almacenamiento que contienen la suspensión de PVM se reducen ya que la dosificación reiterada de un volumen específico de suspensión de PVM procedente de un volumen en exceso aspirado en una jeringa es más fácil (distribución más precisa con respecto a masa_{PVM}/volumen).

Las PVMs conforme a la presente invención son gotitas de vidrio en las cuales se dispersan objetos magnéticos no agregantes muy pequeños. Dichos objetos que se conocen como magnéticos son atraídos por un imán, es decir, por materiales ferromagnéticos o superparamagnéticos. Se prefieren materiales ferromagnéticos, en particular si todavía no han sido premagnetizados. La premagnetización en este contexto equivale a poner en contacto con un imán, lo que aumenta la remanencia. Los materiales magnéticos preferidos son el hierro o el óxido de hierro como, por ejemplo, la magnetita (Fe_{3}O_{4}) o el Fe_{2}O_{3}, preferiblemente \gamma-Fe_{2}O_{3}. En principio, se podría utilizar ferrita de bario, níquel, cobalto, aleaciones de Al-Ni-Fe-Co o bien otros materiales ferro- o ferrimagnéticos. Los objetos magnéticos pueden ser, por ejemplo, un pigmento magnético. El tamaño de los objetos magnéticos se sitúa en la escala de los nanómetros, es decir, conforme a la presente invención, el diámetro se encuentra entre 5 y 500 nm, preferiblemente, entre 10 y 200 nm, más preferiblemente, entre 15 y 50 nm. Los pigmentos magnéticos apropiados son fabricados por la compañía CERAC y tienen un diámetro medio de 23 nm y constan de \gamma-Fe_{2}O_{3} (superficie BET de 50 m^{2}/g, CERAC: P.O.Box 1178, Milwaukee, Wilconsin 53201-1178 USA; nº artículo I-2012). Las partículas de vidrio magnéticas conforme a la presente invención se caracterizan además por el hecho de que los PVMs tienen un diámetro de partícula entre 0,5 y 5 \mum, preferiblemente entre 1 y 2 \mum, determinado por microscopía electrónica de alta resolución, mientras que los objetos mecánicos tienen un diámetro entre 5 y 500 nm, preferiblemente entre 10 y 200 nm, más preferiblemente del orden de 15 a 50 nm, tal como se ha dicho antes. De ahí que, las PVMs de la presente invención se caractericen además por un cociente de diámetros del núcleo de pigmento orgánico respecto a la partícula de vidrio magnética de menos del 1 por 10, en función de lo que indique la microscopía electrónica de alta resolución. Debido a estos cocientes de diámetro así como a la ausencia de algún portador inerte eso determinaría la forma y el tamaño de las partículas, mientras que la geometría de las PVMs y el número de objetos magnéticos incorporados son determinados por las condiciones de fabricación. Las PVMs según la presente invención son microporosas pero tienen una superficie altamente estructurada y por tanto relativamente grande con más de 6 m^{2}/g. Preferiblemente, las partículas de vidrio magnéticas de acuerdo con la presente invención tienen un área superficial del orden de 5 a 100 m^{2}/g, preferiblemente de 5 a 90 m^{2}/g, más preferiblemente del orden de 10 a 50 m^{2}/g, más preferiblemente del orden de 15 a 30 m^{2}/g. Esta superficie es aproximadamente el doble del tamaño de las partículas descritas en DE 195 37 985. Esta se puede determinar mediante el método de Braunauer-Emett-Teller usando un aparato comercial automatizado (ver ejemplo 4). Para comentar este método, familiarmente llamado método BET, ver S. Braunauer. The Adsorption of Gases and Vapors, Vol.1, Princeton University Press, 1943.

Por ejemplo, la muestra EJ0096.5R-01 que tiene un interés preferencial (ver ejemplo 1 y tabla 1 a tabla 3 para un resumen de los parámetros de producción) tiene una superficie BET de 26.8525 m^{2}/g, un área de microporo de 2.3058 m^{2}/g y un diámetro de poro medio de 24.9132 nm. Esto significa que la superficie del poro es inferior al 10% de la superficie total y que la partícula de vidrio magnética es microporosa.

Un poro se entiende como una cavidad pequeña en la superficie externa de la partícula. La superficie llega tan lejos en la partícula que una línea perpendicular trazada en la cavidad por la superficie corta la partícula al menos una vez en la dirección del entorno adyacente de la partícula. Además, los poros penetran en la partícula hasta una profundidad que es mayor a un radio del poro.

La cinética de sedimentación más lenta, la mayor superficie y la forma esférica inhibidora de la agregación se manifiestan ellas mismas en el mejor rendimiento funcional como adsorbentes en el diagnóstico del ácido nucleico (ver ejemplos 3, 5 y 7) si se comparan con las solicitudes de patentes alemanas DE 198 54 973- o bien DE 198 55 259-. Este criterio puede ser cuantificado por un cambio de los ciclos umbral en los denominados análisis o ensayos TaqMan®, el cociente señal respecto a ruido y del límite de detección inferior valorado estadísticamente. Los métodos para este análisis son publicados en WO92/02638 y las correspondientes patentes americanas US 5.210.015, US 5.804.375, US 5.487.972). Los experimentos con indicadores radioactivos (ver ejemplo 5.2) indicaban que el comportamiento respecto al enlace al ADN y al ARN era el mismo si se comparaba con material de referencia ya conocido en la actualidad. Sorprendentemente, los parámetros de producción tenían una influencia en el rendimiento en los experimentos con indicadores radioactivos. Otra ventaja del tipo de PVM de la presente invención es que ninguna tensión en la capa de vidrio puede conducir a producir fisuras durante el proceso de secado y a las lesiones correspondientes en la cáscara o cobertura de vidrio debido a la estructura interna (dispersión sólida de pequeños núcleos magnéticos en una gota de vidrio). Esto puede ser investigado mediante métodos productores de imágenes (ver ejemplo 3).

Otra configuración de la presente invención es una suspensión de partículas magnéticas. Resulto obvio para el experto en la materia preparar una suspensión añadiendo un líquido a una composición de PVMs y mezclar la suspensión hasta lograr su homogeneidad. Un líquido conforme a la presente invención puede comprender algo de líquido que no influya en la estabilidad de las partículas magnéticas y que pueda ser utilizado para preparar una suspensión homogénea.

Preferiblemente se usan líquidos que son adecuados para los procesos en biología molecular, en particular los procesos de purificación del ácido desoxirribonucleico (ADN) o del ácido ribonucleico(RNA) que pueden utilizar el enlace de estas sustancias a las partículas de vidrio en ciertas condiciones. Los líquidos preferidos comprenden alcoholes o cualquier mezcla de los mismos con agua o cetonas. Los alcoholes incluirán de acuerdo con la invención, en primer lugar alcoholes primarios, secundarios o terciarios de fórmula general R-OH donde R equivale a la fórmula general -(-CH_{2})_{n}-CH_{3} con n>=0. Sin embargo, también se pueden usar otros alcoholes si son adecuados para los fines de la biología molecular, como por ejemplo el glicerol. Son particularmente adecuados el isopropanol, el etanol o las mezclas de los mismos con agua, preferiblemente una mezcla de 80 partes en volumen de isopropanol con 20 partes en volumen de agua. En otra configuración de la invención el líquido consta de cetonas como, por ejemplo, acetona. En una configuración preferida de la invención, estas suspensiones contienen entre 5 y 60 mg/ml de PVMs. En otra configuración de la invención, las PVMs se suspenden en soluciones acuosas amortiguadas que pueden contener de forma opcional un agente caotrópico en una concentración entre 2 y 8 mol/l, y preferiblemente entre 4 y 6 mol/l. Las sales caotrópicas pueden ser yoduro sódico, perclorato sódico, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidina o hidroclorito de guanidina. También son posibles otros compuestos. Un agente caotrópico conforme a la presente invención será cualquier sustancia química que altere la estructura ordenada del agua líquida y tendrá el efecto de que el ADN o el ARN se enlazarán a las PVMs según la presente invención si este agente está presente en la solución que contiene ADN o ARN. El técnico está habituado a preparar soluciones amortiguadoras o tampón acuosas adecuadas. Los sistemas tampón que se pueden utilizar para fines de biología molecular pueden hallarse, por ejemplo, en Sambrook y cols. (1989); Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Universitty Press, New York, NY; USA. Las sustancias tampón preferidas son la tris-hidroximetilamina(TRIS), fosfato, N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(2-etanosulfónico)(HEPES), sales de las mismas o bien otras sustancias adecuadas. Adicionalmente, pueden estar presentes algunas sustancias que modifiquen la fuerza iónica de la solución, como por ejemplo, NaCl, KCl o CaCl_{2}, o bien que sean agentes complejantes del catión metálico, como por ejemplo, el ácido etilen-diamina-tetracético (EDTA) o sales de los mismos. El material biológico conocido por el experto también puede estar presente. En otra configuración de la invención, la suspensión de PVMs puede contener además ADN o ARN opcionalmente, en una mezcla con proteínas, ácidos grasos, carbohidratos y otro material de origen biológico. En otra configuración de la invención, el líquido puede contener una mezcla de uno o varios constituyentes seleccionados del grupo de los alcoholes, cetonas, soluciones acuosas tamponadas, agentes caotrópicos, sustancias que modifiquen la fuerza iónica de la solución, agentes complejantes, material biológico, ADN o ARN todo con las características anteriormente descritas.

En otra configuración de la invención se dispone de un tubo o recipiente de reacción que contiene la suspensión conforme a la invención. El tubo puede ser de plástico pero puede ser parte de una estructura mayor, por ejemplo, parte de una microplaca en un formato de 96 ó 384 pocillos. En otra configuración de la invención se dispone de un recipiente de almacenamiento que contiene una composición de partículas de vidrio magnéticas o suspensiones de las mismas.

En otra configuración de la invención se dispone de un estuche de piezas que comprende un recipiente de almacenamiento que contiene las partículas de vidrio magnéticas o una suspensión de las mismas según la presente invención. El estuche puede ser utilizado para la purificación del ADN o ARN. Dichos estuches, conocidos en la actualidad, comprenden además material de plástico que se puede utilizar durante el procedimiento de purificación como, por ejemplo, microplacas de valoración en el formato de 96 ó 384 pocillos o bien simplemente tubos de ensayo fabricados por Eppendorf, Hamburg, Alemania. El estuche puede constar además de una solución de lavado que sea adecuada para la etapa de lavado de las partículas de vidrio magnéticas cuando el ADN o el ARN formen un enlace con ellas. A menudo la solución de lavado se encuentra como una solución madre que tiene que diluirse antes de ser empleada. El estuche puede constar además de un eluyente, es decir, una solución o un tampón (por ejemplo, TE, Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) o bien agua pura para eluir el ADN o el ARN enlazados a las partículas de vidrio magnéticas. Además otros reactivos pueden estar presentes y ser utilizados para el proceso de purificación de un ácido nucleico, por ejemplo ADN o ARN. En una configuración de la invención el estuche de las piezas conforme a la presente invención se utiliza para la purificación de un ácido nucleico.

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En una configuración de la invención se puede usar la composición de PVMs para preparar una suspensión tal como se ha descrito.

En otra configuración de la invención las suspensiones conforme a la presente invención se pueden utilizar para la purificación de ácidos nucleicos, es decir ARN o ADN de mezclas complejas con otras sustancias biológicas que las contengan. Por lo que también se pueden purificar mezclas de distintos ácidos nucleicos, incluso mezclas que contienen un ácido nucleico de interés en un nivel bajo. El efecto de purificación es el resultado del comportamiento del ADN o del ARN para enlazarse a las partículas de vidrio magnéticas en unas ciertas condiciones, por ejemplo, en presencia de cierta concentración de un agente caotrópico. Preferiblemente, las PVMs enlazadas al ADN o ARN se lavan al menos una vez, preferiblemente con una mezcla de 70 partes en volumen de etanol con 30 partes en volumen de agua ("70% de etanol"). Después, las condiciones se invierten, por ejemplo, la concentración de agente caotrópico se reduce para eluir el ADN o el ARN enlazado a las PVMs. Preferiblemente, esto se lleva a cabo triturando las partículas de vidrio magnético, por ejemplo, mediante una fuerza de gravedad o usando un imán, y volviéndolas a suspender en una solución sin o bien con una mínima cantidad de agente caotrópico. Alternativamente, la solución puede ser diluida con una solución sin o bien con una cantidad mínima de agente caotrópico. El ADN o ARN purificado se utilizarán para otras reacciones.

Otro objetivo de la invención consiste en disponer de un método de producción para las PVMs conforme a la presente invención. Un vidrio conforme a la presente invención resulta ser un material amorfo que contiene silicio. El vidrio puede contener otros materiales como Ba_{2}O_{3}(0-20%), CaO (0-20%), BaO(0-10%), K_{2}O(0-20%), Na_{2}O(0-20%), MgO(0-18%), Pb_{2}O_{3}(0-15%). El vidrio puede contener también un porcentaje inferior (0-5%) de una serie de otros óxidos como el Mn_{2}O_{3}, TiO_{2}, As_{2}O_{3}, Fe_{2}O_{3}, CuO, CoO, etc.

Se prefieren especialmente los vidrios que se forman usando el proceso sol gel descrito en WO 96/41811 y luego secados y comprimidos. Los principios básicos de este proceso son conocidos y han sido descritos, por ejemplo, en C.J.Brinker, G.W. Scherer "Sol Gel Science- The Physics and Chemistry of Sol Gel Processing", Academic Press Inc. 1990, Sol-Gel Optics, Processing and Applications, Lisa C. Klein, Ed. Kluwer Academic Publishers 1994, p. 450 ff., y en DE-A-1941191, DE-A-3719339, DE-A-4117041, DE-A-4217432 y WO 96/41811.

En principio, en el proceso gel-sol, los alcóxidos de componentes que forman la red, por ejemplo, SiO_{2}, B_{2}O_{3}, Al_{2}O_{3}, TiO_{2}, ZrO_{2}, GeO_{2} se combinan con óxidos y sales de otros componentes, por ejemplo, en una solución de alcoholes y luego se solubilizan. La ecuación siguiente describe el procedimiento para fabricar un vidrio de silicato de boro aluminio sódico:

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1

El agua se añade para empezar el proceso de hidrólisis de los componentes de partida. La reacción evoluciona de un modo bastante rápido porque los iones alcalinos tienen un efecto catalítico en la velocidad de hidrólisis del éster de ácido silícico. Una vez se forma el gel puede secarse y densificarse (o condensarse) por medio de un proceso térmico para formar vidrio.

En una configuración de la invención la matriz de vidrio se fabrica mediante la síntesis sol-gel catalizada en un medio ácido o básico tal como muestran esquemáticamente las figuras 1 y 2 y se describen con detalle en el ejemplo 1. Aquí se utilizan sistemas coloidales donde al principio se dispersan los constituyentes sólidos en la fase líquida (=sol) y después se conectan unos con otros como un modelo alveolar o de panal (=gel). La composición del vidrio (código EJ) se calcula a partir de la cantidad de eductos y equivale al 70,67% molar de SiO_{2}, 14,33% molar de B_{2}O_{3}, 5,00% molar de Al_{2}O_{3}, 4,00% molar de K_{2}O, 2,00% molar de CaO, 4,00% molar de ZnO. La composición del vidrio (código RN) era del 74,00% molar de SiO_{2}, 15,00% molar de B_{2}O_{3}, 5,00% molar de Al_{2}O_{3}, 4,00% molar de K_{2}O, 2,00% molar de CaO. La composición del vidrio (código EP) era de 73,61% molar de SiO_{2}, 14,93% molar de B_{2}O_{3}, 5,21% molar de Al_{2}O_{3}, 4,17% molar de K_{2}O, 2,08% molar de CaO.

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La reacción puede describirse del modo siguiente:

O bien catalizada por ácido, por ejemplo:

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\quad: BCl_{3} + 3 H_{2}O \rightarrow B(OH)_{3} + 3H^{(+)}Cl^{(-)}

\quad: AlCl_{3} + 3 H_{2}O \rightarrow Al(OH)_{3} + 3H^{(+)}Cl^{(-)}

\quad: SiCl_{4} + 4 H_{2}O \rightarrow Si(OH)_{4} + 4H^{(+)}Cl^{(-)}

\quad: Na^{(+)}NO_{3}{}^{(-)} + H_{2}O \rightarrow Na^{(+)}OH^{(-)} + H^{(+)}NO_{3}{}^{(-)}

\quad: K^{(+)(-)}OOCCH_{3} + H_{2}O \rightarrow K^{(+)}OH^{(-)} + H^{(+)(-)}OOCCH_{3}

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O catalizada por una solución alcalina, p.ej:

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\quad: K^{(+)(-)}OCH_{2}CH_{3} + H_{2}O \rightarrow K^{(+)}OH^{(-)} + HOCH_{2}CH_{3}

\quad: Na^{(+)(-)}OCH_{3} + H_{2}O \rightarrow Na^{(+)}OH^{(-)} + HOCH_{3}

\quad: Al^{(3+)}[^{(-)}OCH_{2}CH_{2}CH_{3}]_{3} + 3 H_{2}O \rightarrow Al(OH)_{3} + 3 HOCH_{2}CH_{2}CH_{3}

\quad: B(OCH_{2}CH_{3})_{3} + 3 H_{2}O \rightarrow B(OH)_{3} + 3 HOCH_{2}CH_{3}

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Los hidróxidos condensan en los correspondientes óxidos que forman una red tridimensional, la matriz de vidrio amorfo de SiO_{2}/B_{2}O_{3}/Al_{2}O_{3} con iones metálicos que ocupan lugares intersticiales. Además de los iones metálicos alcalinos y alcalinotérreos capturados, pueden incorporarse a la matriz como iones de metales de transición, por ejemplo, Zn^{2+} y Zr^{2+} como agentes modificadores de la red.

2

En otra configuración de la invención, el vidrio puede fabricarse con métodos tecnológicos actuales mezclando material bruto SiO_{2} y carbonatos de metales alcalinos o alcalinotérreos Na_{2}CO_{3}, K_{2}CO_{3} o CaCO_{3}.

La reacción se puede describir del modo siguiente:

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\quad: Na_{2}CO_{3} + SiO_{2} \rightarrow Na_{2}SiO_{3} (=Na_{2}O'SiO_{2}) + CO_{2}{}^{\shortuparrow}

\quad: K_{2}CO_{3} + SiO_{2} \rightarrow K_{2}SiO_{3} (=K_{2}O'SiO_{2}) + CO_{2}{}^{\shortuparrow}

\quad: CaCO_{3} + SiO_{2} \rightarrow CaSiO_{3} (=CaO'SiO_{2}) + CO_{2}{}^{\shortuparrow}

\vskip1.000000\baselineskip

Sin embargo en la mayoría de casos, no se trata de una matriz de silicato puro sino que de una matriz de silicato de borato-aluminato, por ejemplo, respecto al elemento que forma parte de la red (una parte de SiO_{2} es sustituida por B_{2}O_{3} y Al_{2}O_{3}).

El cociente sol : pigmento tiene un efecto considerable en el rendimiento de las partículas aportadas por esta invención. Resulta esencial para el proceso que el sol (coloide líquido) pueda ser todavía bombeado y pulverizado.

Para crear un polvo se pulveriza preferiblemente la suspensión a través de una tobera de doble fluido tal como se ha descrito en la figura 1 y en el ejemplo 1.3. Los sistemas apropiados para el secado por pulverizado son fabricados por Nubilosa Molekularzerstaubung, Ladisch GMBH & Co. KG, Konstanz, Germany, por ejemplo, el "Labor-Zerstäubungstrockner (tipo LTK)" o por Büchi AG; Uster, Switzerland, por ejemplo, la Mini Spray Dryer (tipo B-191).

Debido a que las proporciones de los diámetros de los núcleos magnéticos respecto a la envoltura de vidrio son inferiores a 1 a 10, preferiblemente entre 1:10 y 1:1000, la geometría y el número de núcleos magnéticos incorporados de sus soportes inertes no determina la forma y el tamaño de las partículas sino que las condiciones de fabricación, en particular las condiciones durante el secado por pulverización.

En otras palabras, la elección de presión, temperatura de entrada, temperatura de salida y velocidad de flujo durante el procedimiento de secado por pulverización son los grados de libertad que determinarán la distribución del tamaño, la forma de las gotas de vidrio y por ello modificarán las PVMs.

Al aumentar la presión de pulverización, la distribución del tamaño varia al campo de las submicras. La temperatura reducida del proceso de secado por pulverización conducirá a una evaporación más lenta del disolvente y con ello la forma de las PVMs serán más próximas a las de una esfera ideal, es decir, el ratio de los radios en el plano xy- y xz llegará a ser de aproximadamente 1. El ratio de los radios variará entre 0,8 y 1,2, preferiblemente entre 0,9 y 1,1.

En una configuración preferida de la invención las toberas se calientan. La temperatura de entrada se sitúa entre 120ºC y 500ºC, preferiblemente entre 170ºC y 230ºC o 150ºC y 230ºC, más preferiblemente entre 150ºC y 200ºC o 190ºC y 210ºC o bien a 200ºC o algo menos. La temperatura de salida depende del punto de ebullición del sol y por ello del disolvente, y puede ser igual o ligeramente menor, es decir, menor de 10ºC del punto de ebullición del disolvente. Si se utiliza etanol como disolvente, se encuentra entre 50ºC y 300ºC, preferiblemente 70ºC y 150ºC, más preferiblemente entre 80ºC y 110ºC. La temperatura óptima se encuentra entre 90ºC y 100ºC. La presión de la tobera es superior a 3 bar, y se regula preferiblemente entre 4 y 6 bar. El experto apreciará el hecho de que los parámetros exactos dependan del sistema de secado por pulverización utilizado. Sin embargo, puede trasladar los conocimientos de la presente invención a cualquier otro secado por pulverización y descubrir los parámetros teniendo en cuenta la información de esta invención. Las fórmulas tal como se describen en Masters: Spray Drying Handbook, Fifth edition, John Wiley & Sons, 1991, New York pueden mostrar el camino para averiguar que parámetros tienen que elegirse para otra configuración. Preferiblemente, el experto consultará los manuales de su sistema de secado por pulverización o bien entrará en contacto con el servicio técnico del fabricante del sistema de secado por pulverización.

Para optimizar el rendimiento, la densificación o la temperatura de sinterizado deberían ser lo más elevadas posible, es decir, ligeramente inferiores al punto de fusión. Sin embargo, si éste es demasiado elevado, las partículas se pegarán y formarán aglomerados que tendrán que ser tamizados. Si es demasiado bajo, las PVMs no se densificarán de forma óptima. El tratamiento adicional de las partículas a una temperatura demasiado elevada dará lugar a una pérdida de las propiedades magnéticas. Deberían evitarse pues temperaturas demasiado elevadas. Las temperaturas exactas dependen de la composición del vidrio pero pueden situarse entre 400ºC y 1200ºC. En el caso de una composición de vidrio EJ la temperatura de sinterizado se sitúa entre 720ºC y 770ºC, preferiblemente alrededor de 750ºC. La habilidad del experto consiste en averiguar las temperaturas para cada composición de vidrio teniendo en cuenta la teoría de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, el polvo de PVM secado por pulverización puede ser tratado tal como se muestra en la figura 2 y descrito en el ejemplo 1.4. Preferiblemente, el polvo se calentará durante 1 hora a 200ºC, opcionalmente se enfría a temperatura ambiente y se calienta a 750ºC (densificación o temperatura de sinterizado) en una atmósfera de nitrógeno con una velocidad de calentamiento de 1 K/min y se mantiene a esa temperatura durante 1 hora. Luego el horno se enfría a 150ºC u se calienta de nuevo a 200ºC durante una hora al aire. Después de enfriarse a temperatura ambiente, el polvo se transfiere a un tamiz (50 \mum) y se tamiza durante 30 min. La muestra tamizada o filtrada se embotella y esteriliza a 200ºC durante 4 horas y luego se enfría a 80ºC. A continuación se retiran los frascos de vidrio del horno, se cubren con una lámina estéril y se cierran.

Sorprendentemente, las partículas magnéticas sobre las que informa la invención son especialmente adecuadas para aislar materiales biológicos de las muestras. Además, el material del núcleo es una fuente natural y por tanto causa pocos trastornos ecológicos. Además, las partículas conforme a la invención son baratas y fáciles de fabricar.

Otro objetivo de la invención es un procedimiento para aislar material biológico poniendo una muestra que contiene el material biológico en un líquido en contacto con las partículas magnéticas conforme a la invención en unas condiciones en las cuales el material biológico forma un enlace con la superficie de las partículas y separando el material biológico del líquido. Según la invención, el término "en un líquido" significa que el líquido puede ser añadido a la muestra antes de que se añadan las partículas magnéticas. Sin embargo, también comprenderá la situación en la que la propia muestra tenga una viscosidad baja y sea propiamente un líquido de manera que no tenga que añadirse líquido o tampón adicional a la muestra para la preparación de la muestra, lo que se puede hacer añadiendo agentes sólidos antes de añadir las partículas magnéticas. El orden de la adición de reactivos puede variar según los requisitos del proceso.

Los materiales biológicos se entiende que son materiales con una base molecular o particular. Incluyen, en particular, células como virus o bacterias, así como células aisladas de organismos multicelulares, por ejemplo, células humanas y animales como los leucocitos, y compuestos de bajo y alto peso molecular inmunológicamente activos como los haptenos, antígenos, anticuerpos y ácidos nucleicos. Se prefieren en particular ácidos nucleicos como el ADN o ARN. En una configuración de la invención, se purifican mezclas de ácidos nucleicos específicos, en los cuales el(los) ácido nucleico diana o específico puede ser un componente minoritario en términos de concentración (o puede estar presente en poca abundancia). De acuerdo con la presente invención, un ácido nucleico diana será el ácido nucleico de interés, es decir, un ácido nucleico que se investigará como si su presencia indica una cierta situación o enfermedad de un humano o de un animal. Por ejemplo, la presencia de una secuencia vírica (por ejemplo, del virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C o virus de inmunodeficiencia humana) indica que el individuo correspondiente está infectado por el virus específico. Por consiguiente, esta secuencia vírica sería la secuencia diana u objetivo. Otras secuencias diana son secuencias que son indicativas de una predisposición de un individuo a una cierta enfermedad como, por ejemplo, una enfermedad hereditaria como la anemia drepanocítica o ciertos tipos de cáncer. Estos ejemplos reflejan la invención pero no la delimitan.

Las muestras conforme a la invención incluyen muestras clínicas como sangre, suero, orina, fluido cerebral, esputo, heces, muestras de biopsias y muestras de médula ósea. La muestra puede ser también de un tipo usado para el análisis ambiental, el análisis de alimentos o la investigación en biología molecular, por ejemplo, de cultivos bacterianos, lisados de bacteriófagos y productos de procedimientos de amplificación como el PCR.

El procedimiento descrito puede ser usado para aislar material biológico nativo o modificado. El material biológico nativo consiste en material cuya estructura no ha cambiado de forma irreversible en comparación con los materiales biológicos de aparición natural. Esto no significa que otros componentes de la muestra no puedan ser modificados. Los materiales biológicos modificados incluyen materiales que no se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, ácidos nucleicos que son modificados al adherirles grupos que son reactivos, detectables o capaces de inmovilización. Un ejemplo de esto son los ácidos nucleicos biotinilados.

En ciertos casos, la muestra se puede utilizar sin tratamiento previo en el procedimiento de aislamiento conforme a la invención. Sin embargo, en muchos casos, la muestra debería ser descompuesta usando un método apropiado, que liberara el material biológico contenido en la muestra. Los procedimientos para la destrucción o descomposición de las muestras son conocidos y pueden ser de naturaleza química, enzimática o física. También se puede usar una combinación de todos ellos. Por ejemplo, la lisis puede realizarse usando ultrasonidos, presión alta, fuerzas de cizallamiento, álcalis, detergentes o soluciones salinas caotrópicas, o bien por medio de proteinazas o lipasas. Con respecto al procedimiento de lisis para obtener los ácidos nucleicos, se hace especial referencia a Sambrook y cols.: Molecular Cloning, A laboratory Manual, 2nd Addition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY y Ausubel y cols.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY.

Además del material biológico que ha de ser aislado, la muestra puede contener también otros componentes en un líquido como residuos celulares, proteínas, sales y otras sustancias que no tienen que ser aisladas. Esta muestra, que contiene preferiblemente el material biológico en forma nativa, se pone en contacto con las partículas en unas condiciones en las que el material biológico objetivo forma un enlace covalente con la superficie de las partículas. Las condiciones para ello dependen del tipo de material biológico implicado, pero son básicamente conocidas. También dependen del método por el cual el material biológico se enlaza a la superficie. Si se utilizan interacciones inmunológicas para el enlace, por ejemplo, deben seleccionarse las condiciones que sean adecuadas para la formación de complejos inmunológicos. Si se utilizan ácidos nucleicos modificados, el enlace puede tener lugar a través de los grupos de ácidos nucleicos que representan la modificación, por ejemplo, la biotina a través del enlace con superficies revestidas de estreptavidina. No obstante, con los ácidos nucleicos en particular es preferible un enlace directo de los ácidos nucleicos con el vidrio porque entre otras razones los ácidos nucleicos no tienen que ser modificados e incluso los ácidos nucleicos nativos pueden ser enlazados. El procedimiento para enlazar ácidos nucleicos nativos a partículas de vidrio puede ser análogo al procedimiento descrito en el método anterior. Se lleva a cabo preferiblemente en presencia de sales caotrópicas con una concentración entre 2 y 8 mol/l, y preferiblemente entre 4 y 6 mol/l. Las sales caotrópicas pueden ser el yoduro sódico, perclorato de sodio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio o bien hidroclorito de guanidinio. También son posibles otros compuestos. Para poner la muestra en contacto con las partículas, la muestra se mezcla con las partículas y se incuba durante un periodo de tiempo suficiente para que se produzca el enlace. Los expertos están familiarizados con la duración de la etapa de incubación desde los procedimientos para realizar el tratamiento con partículas no magnéticas. Esta etapa puede ser optimizada determinando la cantidad de material biológico inmovilizado en la superficie en momentos distintos. Los tiempos de incubación entre 10 segundos y 30 minutos pueden ser apropiados para los ácidos
nucleicos.

Dependiendo del tamaño y del tipo de partículas magnéticas, las partículas o bien se separan del fluido durante el propio periodo de incubación o la suspensión se mantiene intacta durante un periodo más largo de tiempo. Si las partículas son de un tamaño superior, las partículas se separarán lentamente del fluido durante el periodo de incubación.

La inmovilización no se efectúa a través de la precipitación reduciendo la solubilidad de los materiales que van a ser inmovilizados. Sino que la inmovilización se basa en las interacciones bioespecíficas (moléculas de captura) o en la adsorción. Esta impide que los contaminantes sean incluidos de forma no específica.

Después de la incubación, el material biológico se separa del líquido. Esto se consigue en general separando el material enlazado a las partículas magnéticas aplicando un campo magnético. Por ejemplo, las partículas magnéticas pueden ser empujadas a la pared del recipiente en el que se realiza la incubación. Ahora puede retirarse el líquido que contiene el contenido de muestra que no estaba enlazado a las partículas. El procedimiento de retirada empleado depende del tipo de recipiente en el que se lleve a cabo la incubación. Las etapas adecuadas incluyen la extracción del líquido por medio del pipeteo o de la aspiración.

Las partículas magnéticas pueden ser luego purificadas una o más veces usando una solución de lavado si se desea. Se utiliza una solución de lavado que no haga que el material biológico sea liberado de la superficie de partículas sino que elimine los contaminantes no deseados lo más profundamente posible. Esta etapa de lavado tiene lugar preferiblemente incubando la solución de lavado con las partículas. Las partículas se vuelven a suspender durante esta etapa mediante la agitación o aplicación de un campo magnético que no sea idéntico al primer campo magnético. La solución de lavado contaminada se separa preferiblemente como la muestra en la etapa descrita antes para enlazar el material biológico.

Después de la etapa de lavado, las partículas magnéticas pueden ser secadas ligeramente al vacío o bien puede dejarse evaporar el fluido. También puede llevarse a cabo una etapa de pretratamiento usando acetona. Si se desea, el material biológico purificado de este modo se podrá separar de las partículas magnéticas. Esta etapa depende también de la forma en que el material biológico estuviera ligado a las partículas magnéticas. Si el material biológico son ácidos nucleicos nativos y las partículas magnéticas son partículas revestidas de vidrio, los ácidos nucleicos podrán ser retirados de las partículas conforme a la invención usando un tampón de elución que tenga un contenido bajo en sal. Las soluciones tampón de esta naturaleza se conocen de DE 3724442 y Analytical Biochemistry 175, 196-201(1988). Las soluciones tampón de elución con un contenido salino bajo son particularmente soluciones amortiguadoras con un contenido inferior a 0,2 mol/l. En una configuración especialmente preferida, el tampón de elución contiene Tris. En otra configuración especial, el tampón de elución es agua desmineralizada.

En otra configuración, el procedimiento de purificación y aislamiento descritos se realizan después de que las células (por ejemplo, partículas víricas o células procarióticas o eucarióticas) se separen inmunomagnéticamente de un líquido o tejido corporal. En esta etapa, la muestra es inmovilizada, por ejemplo, agitando con partículas magnéticas frente a las cuales un anticuerpo se inmoviliza frente a un antígeno en la célula. Estas partículas pueden ser partículas conforme a la invención o partículas disponibles en el comercio (por ejemplo, MACS Microbeads de Miltenyl Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany). Una vez aplicado un campo magnético, se realizan una o más etapas de lavado usando una solución salina. Se obtienen partículas a las que se enlazan las células deseadas. Las células enlazadas se suspenden de nuevo en una solución salina tampón. En una configuración preferida, esta solución salina tampón es una solución salina caotrópica de manera que los ácidos nucleicos contenidos en la célula son liberados de las
células.

Un método especialmente preferido para aislar ácidos nucleicos de muestras que contienen células se consigue combinando el aislamiento de las células anteriormente descrito con el aislamiento de los ácidos nucleicos también descrito. La ventaja de esta configuración es su simplicidad (método de tubo único), elevada sensibilidad (especialmente importante en microbiología y oncología médica) y la facilidad con que se puede automatizar.

Los materiales biológicos aislados usando el procedimiento conforme a la invención pueden ser utilizados ahora además como necesarios. Por ejemplo, pueden ser utilizados como un sustrato para varias reacciones enzimáticas. Cuando los ácidos nucleicos están implicados, pueden ser utilizados para establecer secuencias, para el etiquetado radioactivo o no radioactivo, para la amplificación de una o más de las secuencias que ellos contienen, trascripción, hibridación con ácidos nucleicos de muestras marcadas, conversión o enlace. Una ventaja del método conforme a la invención es que es muy fácil separar el material biológico del fluido. En el método anterior, se usaba una etapa de centrifugación para separar las partículas de vidrio de los contaminantes, o bien, cuando el material biológico se enlaza a los filtros de fibra de vidrio, el fluido es extraído a través de los filtros. Esta es una etapa limitadora que dificulta tratar grandes cantidades de muestra. Los materiales biológicos pueden separarse de los contaminantes de un modo eficaz usando las partículas conforme a la invención. En particular, se pueden eliminar en un grado considerable los inhibidores de ciertas reacciones enzimáticas de acuerdo con la invención.

En la configuración preferida, las partículas conforme a la invención se añaden a la mezcla de lisis. Después de un periodo adecuado de tiempo para la adsorción, que puede ser optimizado por agitación mecánica - las partículas se separan del líquido que las rodea y que contiene unos componentes celulares adicionales que no tienen que ser detectados. Esto se realiza preferiblemente aplicando un campo magnético colocando un imán frente a la pared del recipiente.

Para eliminar cualquier contaminante todavía presente, se lleva a cabo una etapa de lavado con un fluido que no haga que los ácidos nucleicos que van a ser determinados sean eliminados de la superficie de vidrio. Se añade una solución tampón de elución que presenta unas condiciones reactivas en virtud de las cuales los ácidos nucleicos se separan de la superficie de vidrio. Estas condiciones son en particular una solución poco salina. Dependiendo del uso previsto de los ácidos nucleicos, el fluido puede separarse de las partículas y ser tratado. Esta etapa de separación se lleva a cabo preferiblemente a través de la aplicación de un campo magnético de manera que las partículas se separan del eluido.

Una configuración preferida de la presente invención consiste en usar las PVMs de la presente invención en métodos automatizables, como por ejemplo, los descritos en WO 99/16781. Un método automatizable significa que las etapas del método son adecuadas para ser llevadas a cabo con un aparato o máquina capaz de funcionar con o sin control externo o influencia por parte del ser humano. Un método automatizado equivale a que las etapas del método se llevan a cabo con un aparato o máquina capaz de funcionar con poco o sin control externo o influencia por parte del ser humano. Únicamente las etapas de preparación para el método tienen que realizarse manualmente, por ejemplo, se tienen que llenar los recipientes de almacenamiento y colocarlos en su sitio, la elección de las muestras tiene que ser realizada por un ser humano y otras etapas bien conocidas por el especialista en el tema, por ejemplo, el funcionamiento del ordenador de control. El aparato o la máquina puede añadir líquidos automáticamente, mezclar muestras o llevar a cabo las etapas de incubación a unas temperaturas específicas. Habitualmente, dicha máquina o aparato es un robot controlado por un ordenador que realiza un programa en el cual se especifican cada una de las etapas y de los mandos. Los métodos automáticos preferidos son aquellos que se llevan a cabo en un formato de rendimiento elevado, lo que significa que los métodos y el aparato o máquina usados se optimizan para un rendimiento elevado de las muestras en un tiempo corto.

En otra configuración, las PVMs conforme a la presente invención se utilizan en un proceso semiautomático lo que significa que algunas etapas de reacción pueden realizarse manualmente. En una configuración preferida de la invención, se coge una suspensión que contiene las PVMs conforme a la presente invención de un recipiente de almacenamiento y se añaden volúmenes parciales a los diferentes frascos de reacción. Los frascos de reacción pueden ser tubos de ensayo hechos de plástico en un formato de microplacas que contienen 96 ó 384 pocillos o una cantidad superior donde se puede llevar a cabo una reacción. Sin embargo, estos frascos pueden estar hechos de otro material, por ejemplo, de acero.

Una configuración preferida de la invención son los métodos de purificación seguidos de una etapa de detección o de unos métodos de purificación seguidos de una etapa de amplificación y detección. El ácido nucleico objetivo o los ácidos nucleicos de interés pueden encontrarse en una matriz de ácidos nucleicos no definidos, y pueden incluso ser un componente minoritario en dicha mezcla de ácidos nucleicos específicos. Los métodos adecuados de detección del ADN son conocidos por el experto en este campo y se han descrito en manuales estándar como Sambrook y cols.: Molecular Cloning, A laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Habour, NY and Ausubel y cols.:Current protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY. Pueden existir también otras etapas de purificación antes de que la etapa de detección del ADN se lleve a cabo, por ejemplo, como una etapa de precipitación. Los métodos de detección pueden incluir pero no se limitan al enlace o intercalado de colorantes específicos como el bromuro de etidio que se intercala en el ADN de doble cadena y modifica su fluorescencia después de ello. El ADN purificado puede separarse también mediante métodos electroforéticos después de una descomposición restringida y ser visualizado. Existen también análisis basados en pruebas que utilizan una hibridación de oligonucleótidos a secuencias específicas y posterior detección del híbrido. También es posible establecer la secuencia del ADN después de etapas conocidas por el técnico. Métodos más recientes aplican una diversidad de secuencias de ADN al chip de silicona al cual se unen muestras específicas y aportan una señal en caso de un enlace de secuencias complementario.

Los métodos preferidos conforme a la invención son los métodos de amplificación como la reacción en cadena de la ligasa y la reacción en cadena de la polimerasa que amplifican secuencias diana de un modo específico hasta cantidades detectables. Los métodos de detección que se prefieren en especial son el método TaqMan® sobre el que se informa en WO 92/02638 y las patentes americanas correspondientes US 5.210.015, US 5.804.375, US 5.487.972. Este método utiliza la actividad de la exonucleasa de una polimerasa para generar una señal. De un modo detallado, el ácido nucleico es detectado mediante un proceso que comprende la puesta en contacto de la muestra con un oligonucleótido que contiene una secuencia complementaria a una región de la misma cadena de secuencia del ácido nucleico objetivo o diana, pero que no incluye la secuencia del ácido nucleico definida por el primer oligonucleótido, para crear una mezcla de duplos durante las condiciones de hibridación, donde los duplos comprenden el ácido nucleico definido recocido junto al primer oligonucleótido y al oligonucleótido marcado de manera que el extremo 3' del primer oligonucleótido es adyacente al extremo 5' del oligonucleótido marcado. Luego esta mezcla se trata con una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla que tiene una actividad 5'\rightarrow3' nucleasa en unas condiciones suficientes como para permitir que la actividad 5'\rightarrow3'nucleasa de la polimerasa separe el oligonucleótido marcado, recocido y libere los fragmentos marcados; y se detecte y/o mida la señal generada por la hidrólisis del oligonucleótido marcado. La tecnología TaqMan® elimina la necesidad de que se forme y se haga detectable un complejo de reacción ligado a una fase sólida.

En términos más generales, se revela un procedimiento para la purificación de material biológico seguido de una etapa de detección en el que la reacción de amplificación y/o detección es una valoración multiplex de fase en solución homogénea para la detección simultánea de múltiples objetivos (ver ejemplos 7.2).

En otra configuración de la invención, el procedimiento de purificación descrito se combina con un método de amplificación que utiliza uno de los métodos descritos a continuación, preferiblemente el uso de oligonucleótidos bloqueantes. Un problema asociado a menudo con la amplificación en particular de grandes cantidades de ácido nucleico es la actividad de las polimerasas termoestables a temperaturas inferiores (temperatura ambiente hasta 40ºC). A esta temperatura los oligonucleótidos de la capa aislante a menudo se enlazan de forma no específica uno con otro al ácido nucleico de fondo y pueden ser extendidos por la polimerasa. Esto ocasiona un descenso de los componentes de reacción y conduce asimismo a un nivel superior de señal de fondo y consecuentemente a una sensibilidad reducida. Puede conducir a resultados falsos positivos. Para evitar una actividad poco específica de las polimerasas se han descrito varios métodos, como "hot-start"-PCR(Chou y cols., 1992, Nucl. Acid Res 20, 1717.1723), de polimerasas modificadas covalentemente (por ejemplo, AmpliTaq Gold, Perkin Elmer) o bien anticuerpos (Scalice y cols., J).

Immunol. Methods, 172, 147-163, 1994) y oligonucleótidos (Dang and Jayasena, JMB 264, 268-278, 1996; US 5.763; US 5.693.502). Conforme a la presente invención los oligonucleótidos de bloqueo serán oligonucleótidos capaces de bloquear el centro activo de las polimerasas hasta dicha temperatura. Estos oligonucleótidos pueden ser, por ejemplo, un aptámero tal como se ha descrito en el ejemplo 7.2.2.1.3.

En otra configuración de la invención los aptámeros (ver, por ejemplo, en el ejemplo 7.2.2.1.3) y las capas aislantes modificadas solas (ver por ejemplo, en el ejemplo 7.2.2.1.3) se pueden usar en una reacción de amplificación y los métodos de detección conectados a ellos. Esto tiene los efectos ventajosos y se puede considerar como propiamente una invención que aporta resultados superiores. En una configuración preferida de la invención la base nucleica 3'-terminal, preferiblemente una adenina se modifica con un residuo de p-(t-butil)benzilo. Otras modificaciones, que incluyen las de la posición 3'-1 se han descrito en EP 866 071 A2, al que se hace aquí referencia.

En otra configuración de la invención para la purificación de material biológico seguida de una etapa de detección resulta que tienen lugar al menos 5 ciclos de la reacción en cadena de la polimerasa, la temperatura de recocido es inferior a 8ºC, preferiblemente menor de 3ºC por encima de la temperatura de disociación del complejo de polimerasa-aptámero.

Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar las configuraciones de la invención.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Esquema de flujo para la producción por síntesis & secado por pulverización del sol.

Figura 2: Esquema de flujo para la preparación de las PVMs brutas.

Figura 3: Representación esquemática del secador de pulverización fabricado por Nubilosa. Los detalles se describen en el texto bajo el ejemplo 1.3.

Figura 4: Imagen de microscopía electrónica con barrido de alta resolución de las PVMs con pigmento BM de Merck.

Figura 5: Imagen de microscopía electrónica con barrido de alta resolución de las PVMs con pigmento CERAC.

Figura 6: Imagen de microscopía electrónica con barrido de alta resolución de las PVMs con pigmento MMB de Merck.

Figura 7: Imagen de microscopía electrónica con barrido de alta resolución de las PVMs con pigmento Strem.

Figura 8: Imagen de microscopía electrónica con barrido de alta resolución de las PVMs con pigmento FA de Basf.

Figura 9: Imagen de microscopía electrónica con barrido de alta resolución de las PVMs con pigmento CE-HQ de Basf.

Figura 10: Imagen de microscopía electrónica con barrido de alta resolución de las PVMs con pigmento CE-SU de Basf.

Figura 11: Influencia del pigmento de núcleo magnético o del secador pulverizador en el aislamiento del ARN (secador pulverizador: Büchi(B) o Nubilosa(N)).

Figura 12: Influencia del parámetro "Presión de pulverización" en el aislamiento del ADN o del ARN.

Figura 13: Influencia de los distintos parámetros de producción de PVMs en el aislamiento del ARN (presión de pulverización, (L= aire, N= nitrógeno), temperatura de entrada (E) o temperatura de salida(A).

Figura 14a,b: Comportamiento en la sedimentación de diferentes PVMs en medios de suspensión distintos.

Figura 15: Imagen de HREM de la muestra EJ0096.5R-01; PVM con pigmento CERAC.

Figura 16: Imagen de HREM de EJ0100.5R-01, pulverizada a una presión baja y a una temperatura elevada, que consiste principalmente de partículas deformadas de la escala \mu.

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1 Ejemplo 1

Producción de partículas de vidrio magnéticas

Típicamente, los materiales en bruto como SiO_{2} y los carbonatos alcalinos y alcalinotérreos (Na_{2}CO_{3}, K_{2}CO_{3}, CaCO_{3}) se funden juntos. Tipo de reacción:

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Sin embargo, en la mayoría de casos se usa una matriz de silicato, borato y aluminato, por ejemplo, pertinente a los constituyentes de la matriz. El SiO_{2} es sustituido parcialmente por B_{2}O_{3} y Al_{2}O_{3}. Alternativamente, el vidrio puede ser sintetizado a través de una reacción sol-gel. Tipo de reacción:

Reacción sol-gel catalizada por ácidos, por ejemplo

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\quad: BCl_{3} + 3 H_{2}O \rightarrow B(OH)_{3} + 3H^{(+)}Cl^{(-)}

\quad: AlCl_{3} + 3 H_{2}O \rightarrow Al(OH)_{3} + 3H^{(+)}Cl^{(-)}

\quad: SiCl_{4} + 4 H_{2}O \rightarrow Si(OH)_{4} + 4H^{(+)}Cl^{(-)}

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O catalizada por bases, como en nuestro caso, por ejemplo

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\quad: Na^{(+)(-)}OCH_{3} + H_{2}O \rightarrow Na^{(+)}OH^{(-)} + HOCH_{3}

{}\hskip9.9cm\Downarrow

\vskip1.000000\baselineskip

Ventaja: los alcoholes se evaporan fácilmente durante el secado por pulverización; idealmente no se produce recristalización de sales en la superficie.

Por consiguiente, los alcoholatos se convierten en hidróxidos, que dan lugar a los óxidos correspondientes por eliminación de agua. Estos forman luego una matriz de vidrio amorfo tridimensional que consiste en SiO_{2}/B_{2}O_{3}/Al_{2}O_{3} en la cual ciertos ingredientes de óxidos metálicos se encuentran como separadores del enlace en la matriz, por ejemplo,

3

30

Para los experimentos que aquí se describen, el componente de vidrio se producía a través de una síntesis del sol-gel catalizada por una base. La composición del vidrio utilizada en todos los experimentos era la siguiente (a menos que se indique lo contrario):

70,67% molar de SiO_{2}, 14,33% molar de B_{2}O_{3}, 5,00% molar de Al_{2}O_{3}, 4,00% molar de K_{2}O, 2,00% molar de CaO, 4,00% molar de ZnO (calculado para la masa de eductos especiales que entran en reacción)

1.1 Descripción de los pigmentos magnéticos investigados

Se han investigado diferentes tipos de pigmentos magnéticos y se resumen en la tabla 1.

1.2 Producción del sol de revestimiento (composición EJ)

Los eductos se añaden siguiendo el orden y la cantidad siguientes al recipiente calentable y en continua agitación:

Tetraetoxisilano (TEOS)	10700 ml
Borato de trietilo (TEB)	3305 ml
K-metanolato 25% (P/V) en metanol	1601 ml
Etanol	11292 ml
Isopropanolato de aluminio	1385 g
Calcio	54,4 g
Acetato de zinc	498 g

A continuación se cierra el recipiente. El sol (coloide líquido) se calienta a 70ºC y se agita durante la noche (15 h). La temperatura se regula a través de un termosensor que se sumerge en el líquido.

Luego el sol se calienta a 90ºC y la mezcla de alcohol/agua (etanol: 3781 ml, H_{2}O: 1512 ml) se añade a una velocidad de 5000 ml/h. El recipiente se enfría a 20ºC después de la adición completa de dicha mezcla.

1.3 Secado por atomización

La temperatura de entrada de la secadora de atomización se regula a 200ºC. La presión de la tobera se regula en 6 bar y la tobera se enfría durante 3 min. con etanol. Luego la manguera se conecta a la salida del recipiente de vidrio y el sol que contiene pigmento es bombeado a una velocidad de 110 ml/min a la tobera de dos fluidos (diámetro de la abertura: 2 mm; proveedor: Nubilosa, tipo 1B1VVS1) de la secadora de atomización a través de un dispositivo de ultrasonidos (200 W). El sistema de secado por atomización se muestra esquemáticamente en la figura 3. Las partículas que se forman en los dos primeros minutos se eliminan. Después del atomizado completo del sol se coge el recipiente bajo la ciclona (AVO, ver figura 3) con las partículas y las partículas se tratan seguidamente tal como se ha descrito en las siguientes etapas.

El sol que contiene el pigmento se agita en un recipiente de agitación para impedir la sedimentación de las partículas suspendidas. El sol se traslada del recipiente a la tobera usando una bomba (SP). El nitrógeno calentado mediante un calentador eléctrico (EWT) se utiliza como gas de secado. El pigmento revestido se traslada de la cámara de secado (T) a la ciclona (ZY). El polvo seco puede ser eliminado del recipiente (AVO) bajo la ciclona. Mediante un filtro (SF) se extraen partículas muy finas del nitrógeno. El secador de atomización se utiliza con sobrepresión para impedir una entrada de aire en el secador. El flujo de gas es producido por el soplador de gas (AV).

1.4 Posterior tratamiento del polvo secado por atomización

El polvo se traslada a una cubeta de cerámica y se calienta en un horno a 200ºC a una velocidad de calentamiento de 1 K/min. La temperatura se mantiene a 200ºC durante una hora y luego el horno se enfría a temperatura ambiente. La cubeta se traslada a un horno a temperatura atmosférica con un volumen de 27 l que se lava con 60 l de nitrógeno por hora. El horno se calienta a 750ºC con una velocidad de calentamiento de 1 K/min y se mantiene a esa temperatura durante 1 hora. Luego el horno se enfría a 150ºC y se lava con 60l de aire por hora. El horno se calienta a 200ºC con una velocidad de calentamiento de 2 K/min y se mantiene a esa temperatura durante 1 hora y se enfría luego a temperatura ambiente. El polvo se traslada a una criba (50 \mum) y se tamiza durante 30 min. Después, la muestra tamizada se coloca en recipientes de cristal, que son esterilizados sin taparse en una estufa u horno que se calienta a 200ºC a una velocidad de calentamiento de 1 K/min, se mantiene a esa temperatura durante 4 horas y luego se enfría a 80ºC. Seguidamente, los recipientes de vidrio se extraen del horno, se cubre con una lámina estéril y se cierran con una tapa.

Un resumen de los parámetros importantes del proceso se presenta en las tablas 2 y 3 y en la tabla 3 aparecen las muestras individuales fabricadas con algunos datos. Cada muestra tiene un código específico. Las dos primeras letras describen la química de vidrio usada (ver a continuación) y los cuatro números siguientes equivalen al proceso de producción (ver tabla 2). El número siguiente describe el pigmento usado (ver tabla 1). La letra R significa que el contenido fino no se ha extraído, mientras que E significa que el contenido fino se ha extraído con etanol. Los últimos dos números describen el número del lote. La composición del vidrio (código EJ) según se ha calculado a partir de la cantidad de eductos era del 70,67% molar en SiO_{2}, 14,33% molar en B_{2}O_{3}, 5,00% molar de Al_{2}O_{3}, 4,00% molar de K_{2}O, 2,00% molar de CaO, 4,00% molar de ZnO. La composición del vidrio (código RN) era de un 74% molar en SiO_{2}, 15% molar en B_{2}O_{3}, 5,00% molar de Al_{2}O_{3}, 4,00% molar de K_{2}O, 2,00% molar de CaO. La composición del vidrio (código EP) era de un 73,61% molar en SiO_{2}, 14,93% molar en B_{2}O_{3}, 5,21% molar de Al_{2}O_{3}, 4,17% molar de K_{2}O, 2,08% molar de CaO.

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2 Ejemplo 2

Microscopía electrónica de barrido de alta resolución

Para obtener información acerca de la superficie, el tamaño y la forma de las PVMs realizamos investigaciones con un microscopio electrónico de barrido de alta resolución fabricado por la compañía JEOL (JSM). Las muestras se esparcían en el soporte de muestras con un adhesivo por doble cara conductor de la electricidad y metalizado por bombardeo iónico con oro durante 36 s con una corriente de 30 mA. Para la formación de imágenes de la superficie, se visualizaban los electrones secundarios emitidos (topografía) así como los electrones retrodispersados (contraste del número de orden). El voltaje electrónico primario utilizado era de 10 kV (electrones secundarios) o de 25 kV (electrones retrodispersados).

La figura 4 muestra las PVCs con mica recubiertas de óxido férrico como pigmento magnético (BM). La fisura en la envoltura de vidrio puede verse claramente y resulta del secado por atomización de las partículas cuando la capa empieza a contraerse sobre un sustrato que no se contrae (fisuras del secado). Además, se puede ver un gran número de partículas esféricas que no contienen una de las partículas magnéticas más grandes (10-60 \mum). Estas esferas sin núcleo magnético (contenido fino no magnético) pueden ser eliminadas en un campo magnético, pueden ser transferidas a la reacción en cadena de la polimerasa y crear interferencias en ella.

Las partículas con pigmento CERAC (ver figura 5) no presentan fisuras, ya que el pigmento para imanes (tamaño de partículas medio 23 nm) no causa fuerzas de tensión en la capa de manera que no se crean fisuras durante el proceso de secado por atomización. Además, también se incorporan partículas pequeñas de CERAC al contenido fino de manera que no aparecen partículas no magnéticas en el mismo. Las partículas son básicamente más pequeñas que las partículas con mica que se pueden observar en estas figuras con el mismo aumento. Las PVMs con los otros pigmentos magnéticos se muestran con el mismo grado de aumento en las figuras 6 a 10.

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3 Ejemplo 3

Investigaciones físicas de las PVMs

Para permitir una evaluación de las PVMs previa a las pruebas funcionales efectuadas actualmente se realizaron unas mediciones físicas con las PVMs. Resultó interesante aprender algo sobre la solubilidad del hierro en agua, la fuerza magnética, el contenido en material fina y la densidad. A continuación se describen los experimentos y los resultados presentados.

3.1 Mediciones de extinción

Para verificar si se han eliminado los finos, 1000 mg del polvo tamizado y tratado a una temperatura se pesan en un tubo de centrifugación de 50 ml (Sarstedt), se añaden 40 ml de agua y se dispersan agitando. Luego, el tubo se sumerge en un baño de ultrasonidos (Sonorex RK 102H; 120/240 W) con la altura total de llenado y se coloca en un separador magnético (Roche Diagnostics GMBH RD nr. 1858 025). Al cabo de 3,5 min. de separación magnética, se extrae el líquido del recipiente con una pipeta de vidrio pasteur a la altura de la marca de 15 ml en el lado opuesto del imán y se llena una cubeta de cuarzo de 5 mm (tipo 110-QS, Hellma). La extinción del sobrenadante se mide en un espectrómetro de UV-VIS-INF (Hitachi U-3000) frente a una cubeta correspondiente llena de agua desionizada. El margen de medición era de 200 hasta 1100 nm en etapas de 1 nm para investigar este margen de longitud de onda para las bandas de absorción de eventuales impurezas. Se tomaba como referencia la extinción a una longitud de onda de 280 nm y 400 nm.

3.2 Mediciones de la densidad

Para las mediciones de densidad se utiliza un picnómetro de gas (AccuPyc 1330, Fa. Micromeritics). Como gas se usa el helio 6.0. El dispositivo se calibra con el estándar suministrado (perlas de acero con un volumen conocido). Además, la muestra se seca durante al menos 1 hora a 150ºC y luego se coloca en un recipiente de medida y se pesa. Después de colocar el recipiente de medición en el picnómetro de gas, se utilizan 10 ciclos de lavado y 5 ciclos de medición para determinar el valor medio y la desviación estándar.

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3.3 Determinación de la solubilidad del hierro

La solubilidad del hierro de las muestras revestidas y tratadas a una temperatura se determina con Espectroscopia de Emisión Atómica-Plasma acoplado inductivamente (JY 24, compañía ISA). Por lo tanto, 1 g de muestra se transfiere a un tubo de polipropileno de 50 ml, se llena con agua destilada y se mantiene a una temperatura de 60ºC durante 20 horas. Luego, las muestras se filtran con un filtro de jeringa de 0,2 \mum y se mide el filtrado. Se realizan cuatro determinaciones individuales a una longitud de onda de 259,940 nm y se calcula un valor medio a partir de ellas.

3.4 Medición de la fuerza magnética

Para la medición de la fuerza magnética se pesa un tubo de pesadas PP (Company Licefa, art. Nr. V2-3) completamente lleno de PVMs. Con la ayuda de un esténcil, este recipiente de muestra se coloca en el centro del tubo LDPE (Company Kartell, TS 735) cargado de latón de manera que se puede cerrar la tapa del tubo. El recipiente se coloca en el centro de una balanza (exactitud de detección 0,1 g) con la ayuda de otro esténcil. Después de equilibrar la balanza, un tapón de plástico que contiene un imán en forma de cilindro (diámetro:30 mm; altura: 113,5 mm; material: samario-cobalto 2/17) se coloca en la escala.

Con ello, las PVMs de la escala son atraídas por la gravedad disminuyendo su peso. Después del ajuste del equilibrio (1,5 min.) se determina la pérdida de peso de la muestra y se normaliza el valor para 250 mg de PVM.

3.5 Resultados

Los resultados de la caracterización física de las PVMs con composición EJ y los diferentes pigmentos se resumen en la tabla 3. Puede observarse que los valores de extinción son muy bajos cuando se utiliza pigmento CERAC. Esto puede explicarse por la ausencia de un contenido en finos no magnético debido a que el pequeño pigmento CERAC (23 nm) se puede incorporar a cada partícula de vidrio magnética. La fuerza magnética está sometida a fuertes fluctuaciones, sin embargo, se ve influida positivamente por el uso de pigmentos CERAC. Las PVMs CERAC tienen una fuga comparativamente elevada de hierro al agua. No obstante, incluso valores diez veces más elevados no mostraban efecto alguno en el proceso de la reacción de la polimerasa en cadena.

Resumiendo, puede decirse que las propiedades físicas no presentan diferencias significativas entre los distintos pigmentos pero las PVMs CERAC tienen un contenido muy escaso en finos.

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4 Ejemplo 4

Influencia del pigmento del núcleo magnético y de la secadora por atomización en la superficie BET

Las superficies se determinaban usando un dispositivo de Micromeritics (tipo ASAP 2400). La medición se realizaba a una temperatura del nitrógeno líquido. Se usaba nitrógeno 5.0 como gas medidor y helio 4.6 como gas inerte. Habitualmente se utilizaban 5 g de muestra para una medición.

La superficie de las PVMs tiene un papel obvio para el aislamiento del ADN y del ARN. Cuanto mayor es la superficie más ADN puede ser enlazada por la misma masa de PVMs. También es posible utilizar menos PVMs y obtener el mismo rendimiento. Esto tiene el efecto de que el volumen entre granos es menor, lo que significa que puede introducirse menos alcohol que contaminante en la reacción de PCR (reacción de la polimerasa en cadena). Los datos para las superficies de BET medidas para algunos ejemplos se resumen en la tabla 4. Cuando se comparan las superficies de las muestras producidas en la gran secadora por atomización, debería observarse que las muestras con pigmentos pequeños (BASF FA, STREM y CERAC) tienen superficies relativamente grandes, mientras que los grandes pigmentos de Merck tienen superficies pequeñas. Esto puede deberse al hecho de que grandes partículas magnéticas causan grandes PVMs mientras que las partículas magnéticas pequeñas se incorporan a las gotitas esféricas durante el proceso de secado por atomización y tienen por ello superficies similares en unas condiciones de atomización similares. Las partículas CE-SU de BASF tienen una distribución del tamaño entre las pequeñas (BASF FA, STREM y CERAC) y las grandes partículas de Merck. En contraste con las partículas de Merck, no poseen una superficie estructurada de manera que estas partículas tienen una superficie de vidrio muy lisa. Esto da lugar a una superficie menor. Una presión elevada se utilizaba con la secadora de atomización más pequeña y la tobera de esta secadora es bastante más pequeña que la de la secadora por atomización más grande. Esto da lugar a partículas más pequeñas donde la superficie aumenta notablemente. Esto coincide con los resultados del ejemplo 5.2.1.

Cualquier influencia del pigmento magnético o de la presión de atomización en los resultados de otras investigaciones físicas no puede ser reconocida a excepción de la influencia anteriormente mencionada sobre la formación de fisuras y el contenido de finos. Sin embargo, solamente las mediciones de la superficie reflejan una conexión directa con los resultados de las investigaciones funcionales. Otros resultados de la investigación física no muestran esta correlación directa.

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5 Ejemplo 5

Estudios de enlaces a través una identificación o trazado radioactivo

Existen varios métodos para la evaluación de las PVMs con respecto a su adaptabilidad para la extracción de ácidos nucleicos. La determinación de la extinción a 260 nm antes y después de la purificación no es muy sensible y no refleja la situación cuando se extraen pequeñas cantidades del ácido nucleico definido u objetivo del material clínico. Los resultados de los métodos de evaluación funcionales que se basan en un método para la amplificación de ácidos nucleicos, como por ejemplo, por PCR, RT-PCR, NASBA o algo similar, a menudo no son suficientemente convincentes. Además, estos métodos que son adecuados para la determinación de un número pequeño de copias del genoma objetivo, son susceptibles a trastornos por las sustancias del material de prueba o del proceso de preparación de la muestra. Los estudios de enlaces radioactivos son un método analítico apropiado que permite analizar el proceso de preparación de muestras paso por paso. Los datos del rendimiento no son datos absolutos pero siempre se refieren al rendimiento de una partícula de referencia.

5.1 Protocolo experimental

En primer lugar, el ADN o ARN marcado radiactivamente se sintetiza enzimáticamente en una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) o bien en un proceso de transcripción in vitro en presencia de desoxinucleósidos ^{32}P-marcados o bien trifosfatos de nucleósidos. Luego el ADN o ARN se separa de los trifosfatos de nucleósido libres, se determina el contenido y se prepara una dilución definida.

Una pequeña cantidad de ADN o ARN marcada se añade a cada muestra antes del examen. Durante la preparación de la muestra, todos los ácidos nucleicos se enlazan a las PVMs en presencia de agentes caotrópicos. Las PVMs se granulan ejerciendo fuerzas magnéticas y se descarta el sobrenadante. Los gránulos se lavan y los ácidos nucleicos enlazados son eluidos a una temperatura elevada invirtiendo las condiciones de reacción, es decir, añadiendo una solución amortiguadora de la elución poco salina. Después del enlace y de la etapa de lavado, una parte alícuota del sobrenadante de partículas se sitúa en un filtro. El eluido así como las PVMs redispersadas en agua se colocan en un filtro y se secan. AL final, los filtros se miden en un contador Beta y se calcula una distribución para cada preparación de muestras.

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5.1.1 Preparación de ADN marcado radiactivamente 5.1.1.1 A.1.1 Reactivos

-: Sistema PCR High Fidelity Expand (Roche Molecular Biochemicals nº cat. 732641)

-: Mezcla dNTP (Roche Molecular Biochemicals nº cat. 1277049)

-: Deoxicitidina 5'-alfa-P32 trifosfato dCTP 3000 Ci/mmol (Amersham Cat.nº PB 10205)

-: \lambda-ADN (Roche nº cat.1029053) concentración 1 ng/ml

-: Radiotrazador capa aislante 1 (SEQ ID NO 1) concentración 5,3 OD_{260}/ml de radiotrazador capa aislante 2 (SEQ ID NO 2) concentración 5,2 OD_{260}/ml

-: QIA Quick PCR estuche de purificación (Qiagen nº cat. 28104)

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5.1.1.2 Reacción

-: 29,5 \mul de agua doblemente destilada

-: 5 \mul de solución tampón Expand High Fidelity

-: 2,5 \mul de mezcla NTP diluida 1:10 con agua doblemente destilada

-: 1 \mul de radiotrazador capa aislante 1 (SEQ ID NO 1)

-: 1 \mul de radiotrazador capa aislante 2 (SEQ ID NO 2)

-: 0,3 \mul de ^{32}P-dCTP

-: 10 \mul de \lambda-ADN

-: 0,75 \mul Mezcla enzimática Expand High Fidelity

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5.1.1.3 Amplificación

-: 2 min. 94ºC

-: 10 ciclos (10 seg. 94ºC/30 seg. 60ºC/60 seg. 72ºC)

-: 20 ciclos (10 seg. 94ºC/20 seg. 60ºC/72ºC + 10 seg. 72ºC extensión por ciclo)

-: 7 min. 72ºC

-: 4ºC

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5.1.1.4 Purificación

-: según el protocolo de Purificación de QIA Quick PCR (Qiagen)

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5.1.1.5 Dilución

: Dilución de ADN 1:10 en agua doblemente destilada y medición en el contador Beta.

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5.1.2 A.2. Preparación de ARN etiquetado radiactivamente 5.1.2.1 - Reactivos

-: Estuche de transcripción SP6/T7 (Roche Molecular Biochemicals nº cat. 999644)

-: Trifosfato de uridina 5'-alfa-P32 UTP 3000 Ci/mmol(Amersham cat.nr. PB 10203)

-: Plásmido pBKBH10S, linealizado con EcoRI a 100 \mug/ml

-: Estuche de aislamiento de ARN muy puro (Roche Molecular Biochemicals Cat.nr. 1828665)

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5.1.2.2 - Reacción

-: 2 \mul 10 x solución tampón

-: 3 \mul mezcla NTP (AGC)

-: 1 \mul de UTP (1:50 con agua doblemente destilada)

-: 5 \mul ^{32} P-UTP

-: 7 \mul plásmido linealizado

-: 1 \mul de inhibidor de ARNasa (Roche Molecular Biochemicals Cat. Nr. 802808)

-: 1 \mul T7 ARN-polimerasa

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5.1.2.3 Transcripción y digestión de ADNasa

-: 20 min de incubación a 37ºC

-: Adición de 2 \mul de ADNasa, libre de ARNasa

-: 10 min de incubación a 37ºC

-: Adición de 178 \mul de agua doblemente destilada

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5.1.2.4 - Purificación

-: conforme al Protocolo de aislamiento del ARN altamente puro (Roche Molecular Biochemicals)

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5.1.2.5 - Dilución:

: Dilución de ARN 1:30 en agua doblemente destilada y medición en el contador Beta

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5.1.3 - Preparación de muestras radiactivas 5.1.3.1 - Reactivos

-: plasma negativo

-: concentración de proteinasa K 20 mg/ml (por ejemplo, Roche Id nr. 1942387)

-: Poli-A-ARN (por ejemplo, Roche Id nr.108626) concentración de 1 mg/ml; diluida 1:1000 (volumen/ratio de volumen) con tampón de descomposición

-: tampón de descomposición (50 mM Tris pH 7,0 15%(v/v) polidocanol, isotiocianato de guanidina 5M, 1 mM DTT)

-: PVM (con composición de vidrio EJ y diferentes pigmentos para el núcleo (BM, MMB, CERAC, STREM, BASF-FA, BASF-CE) suspendida en isopropanol a 60 mg/ml o a 6 mg/ml

-: Solución tampón de lavado (20 mM Tris pH 7,5, NaCl 20 mM, 70% (v/v) etanol)

-: Solución de elución: agua doblemente destilada

-: Material auxiliar

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5.1.3.2 - Reacción (1,5 ml de protocolo)

-: 80 \mul de proteinasa K

-: añadir 410 \mul de plasma negativo y mezclar

-: añadir 500 \mul de tampón de descomposición y mezclar

-: añadir 10 \mul de ADN o ARN etiquetado radioactivo y agitar

-: 10 min. de incubación a temperatura ambiente agitando

-: añadir 500 \mul de suspensión de PVM (concentración 6 mg/ml) y agitar

-: 20 min. de incubación a temperatura ambiente agitando

-: separación durante 2 min. en separador magnético (Dynal)

-: desechar sobrenadante y poner 300 \mul en un filtro

-: añadir 750 \mul de tampón de lavado, vórtice, separación de 2 min.

-: desechar sobrenadante, colocar eventualmente 375 \mul de sobrenadante en un filtro

-: repetir el proceso de lavado dos veces

-: añadir 100 \mul de solución de elución, incubar 5 min. a 80ºC en un termoagitador

-: separar durante 2 min. en un soporte magnético, colocar sobrenadante en un filtro

-: añadir 100 \mul de solución de elución, volver a suspender y colocar PVMs en un filtro

-: secar filtros durante 60 min. a 75ºC en una estufa de secado

-: trasladar filtros a los tubos de escintilación, añadir 5 ml de solución de escintilación y medir en el contador beta

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5.1.3.3 - Protocolo experimental (1 ml de protocolo)

-: 25 \mul de proteinasa K

-: añadir 415 \mul de plasma negativo y mezclar

-: añadir 500 \mul de tampón de descomposición y mezclar

-: añadir 10 \mul de ADN o ARN etiquetado radioactivo y agitar

-: 5 min. de incubación a temperatura ambiente agitando

-: añadir 50 \mul de suspensión de PVM (concentración 60 mg/ml) y agitar

-: 20 min. de incubación a temperatura ambiente agitando

-: separación durante 2 min. en separador magnético (Dynal)

-: desechar sobrenadante y poner 300 \mul en un filtro

-: añadir 700 \mul de tampón de lavado, vórtice, separación de 2 min.

-: desechar sobrenadante, colocar eventualmente 350 \mul de sobrenadante en un filtro

-: repetir el proceso de lavado dos veces

-: añadir 120 \mul de solución de elución, incubar 10 min. a 80ºC en un termoagitador

-: secar filtros durante 60 min. a 75ºC en una estufa de secado

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5.2 Resultados de los experimentos de trazado radiactivo 5.2.1 Influencia del pigmento de núcleo magnético o de la secadora de atomización en el aislamiento del ARN

Se caracterizaron diferentes tipos de PVM, que se fabricaban usando química de vidrio EJ y varios núcleos en la escala de nanómetros o micrómetros (MMB, CERAC, etc.) en distintos secadores de atomización (Büchi o Nubilosa) con respecto a su comportamiento en la extracción de ácido nucleico con el método de trazado radiactivo según el ejemplo 5.1.3.2. El parámetro del ARN resultó ser el más sensible en el transcurso de los estudios y fue elegido por ello como parámetro. La figura 11 muestra como el BASF-CE no es adecuado como material del núcleo porque solamente pueden hallarse pequeñas cantidades de ARN enlazado en el eluido. Las partículas de EJ/CERAC que se atomizaban en el sistema Büchi a 6 bar mostraban el rendimiento del EJ/MMB de referencia que se pulverizaba en el sistema de Nubilosa.

5.2.2 Influencia de la presión de atomización de los parámetros en el aislamiento del ADN o ARN

Los distintos tipos de PVM fabricados con el sistema Nubilosa con diferentes presiones de atomización se comparan según el apartado 5.1.3.3. Las partículas de referencia son EJ/MMB MGP. Se investigan las propiedades de enlace del ADN y del ARN. Mientras que el parámetro de ADN no presenta dependencia de la presión de atomización, el parámetro de ARN presenta unas diferencias significativas en cuanto a funcionamiento. El funcionamiento de las partículas EJ/CERAC fabricadas con una presión de atomización de 1,5 bar con el sistema de Nubilosa es inferior al de referencia. Existe un rendimiento inferior en la serie dependiendo de la presión de atomización que oscilaba entre 1,5 y 3,4 bar (\sim30%). Las partículas que son atomizadas con 4,3 bar alcanzaban un 90% del rendimiento de las partículas que son pulverizadas a 1,5 bar (ver figura 12).

Los experimentos demuestran que existe una conexión directa entre los parámetros del proceso para la producción de las PVMs y el funcionamiento en la prueba. Debería destacarse que un incremento en la presión de atomización conduce a un rendimiento inferior en la prueba, pero a partir de una cierta presión de atomización las propiedades de las partículas mejoran lo que conduce a un mejor rendimiento.

5.2.3 Influencia de los distintos parámetros de producción de PVM en el aislamiento del ARN o del ADN

Estos experimentos deberían llevar al resultado siempre que una variación de la presión de atomización condujera a unas PVMs con un mejor rendimiento.

Por lo tanto, las PVMs se fabrican en el sistema de Nubilosa a una presión de 1,5 bar, 4,3 bar y 6 bar usando nitrógeno como gas atomizador.

Con el fin de obtener un proceso de secado cuidadoso, se reducen además las temperaturas de entrada y salida de la secadora de atomización. La influencia de estos factores en el aislamiento del ARN se investiga según el apartado 5.1.3.3 usando PVM EJ/MMB como referencia.

Los resultados (ver figura 13) muestran el efecto sorprendente de una reducción dramática del rendimiento que es causada por el descenso de la temperatura de atomización y no podía haberse previsto. Ha sido posible conseguir el rendimiento de la calidad de referencia mediante el incremento de la presión de atomización. En armonía con una estabilidad superior de la suspensión, estas partículas son por tanto superiores a las de referencia.

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6 Ejemplo 6

Analítica de sedimentación de las partículas de vidrio magnéticas 6.1 Protocolo experimental

Un modelo de espectrofotómetro Uvikon 930 fabricado mediante instrumentos Kontron se utiliza para la evaluación del proceso de sedimentación de las partículas de vidrio metálicas. Este espectrofotómetro se modifica para conseguir un ajuste variable de la cubeta a lo largo de la escala gráfica. Para las mediciones la cubeta se coloca en una posición en la cual el rayo de medición con una longitud de onda de 650 nm atraviesa la cubeta en una posición que es 2/3 de la altura de llenado (posición de escala 7.5). Se utilizan macrocubetas fabricadas a partir de poliestireno que tienen un volumen de 4 ml y una longitud de recorrido de 1 cm. Antes de las mediciones, se efectúa la calibración en un procedimiento de un rayo frente a un medio de suspensión puro. Las muestras de PVMs se dispersan hasta la homogeneidad en un medio de suspensión, típicamente en un porcentaje de masa/volumen de 3 mg/ml, y se miden inmediatamente.
El cambio de la extinción con el tiempo es controlado de forma continuada a dicha longitud de onda de 650 nm.

La cantidad física utilizada para la comparación de la velocidad de sedimentación de diferentes muestras es la vida media (t_{1/2}) en un medio de suspensión en particular. Este es el periodo de tiempo hasta que la extinción de la suspensión en la tercera parte superior de la cubeta es la mitad del valor al principio de la medición. El descenso de la extinción viene producido por la sedimentación de las partículas y eliminación concomitante de la tercera parte superior del volumen de prueba.

El dispositivo anteriormente descrito permite además la instalación de un imán debajo de la cubeta. Con ello se puede determinar la velocidad de la separación magnética

6.2 Resultados de la analítica de sedimentación

6.2.1 Experimento 1

Varios tipos de PVMs con diferentes núcleos del orden de los nano- o micrómetros producidos con la química del vidrio EJ se investigan espectrofotométricamente para su sedimentación y separación, es decir, con y sin imán bajo la cubeta. En este caso masa/volumen es 6 mg/ml. El medio de suspensión es una mezcla 1:1 de isopropanol y tampón de descomposición. Las partículas del tipo CERAC presentan una clara ventaja en la estabilidad de la suspensión pero ningún inconveniente para la separación magnética (ver también la figura 14).

6.2.2 Experimento 2

La sedimentación de las diferentes PVMs del tipo CERAC fabricadas con química de vidrio EJ se analiza en el isopropanol puro.

Parámetros de producción importantes

EJ0100.5R-01 - presión de atomización de 1,5 bar, 230ºC temperatura de entrada, sistema de Nubilosa

EJ0108.5R-01 - presión de atomización de 4,3 bar, 230ºC temperatura de entrada, sistema de Nubilosa

EJ0096.5R-01 - presión de atomización de 6,0 bar, 150ºC temperatura de entrada, sistema Büchi

EJOO96.5R-01 aparece en la figura 15. Estas perlas son básicamente esféricas, con una superficie muy estructurada y un tamaño de predominantemente 0,5-5 \mum. La muestra de EJ0100.5R-01, atomizada a una presión baja y a una temperatura elevada, consta principalmente de partículas de formadas de escala \mu (ver figura 16, que muestra un equivalente funcional al EJ0100.5R). Concluyendo, las partículas como la EJ0096.5R-01 presentan un retardo significativo de la sedimentación, que es más ventajoso para los traslados de líquido de las suspensiones de PVMs (ver figura 14b). Los resultados se resumen en.

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7 Ejemplo 7

Prueba funcional con PCR 7.1 Análisis funcionales heterogéneos: amplificación con PCR en un Perkin Elmer GeneAmp 9600® y detección con una prueba de enlace bioespecífico con una muestra de detección marcada con luminiscencia sobre un Elecsys 1010® modificado 7.1.1. Consideraciones generales

Las partículas del virus en la muestra (por ejemplo, plasma) se descomponen en presencia de proteasa y concentraciones elevadas de sal caotrópica así como de detergente. Luego se añade el adsorbente de las partículas (=PVM) para que tenga lugar la adsorción físico-química de los ácidos nucleicos liberados en la superficie de vidrio, seguida de la separación magnética y el lavado de las perlas cargadas, es decir la separación libre/enlazada. Finalmente, se realiza la disociación de los ácidos nucleicos enlazados de las perlas (=elución) en unas condiciones de reacción invertidas en cuando a la adsorción, es decir, con solución tampón poco salina o incluso con agua destilada. Una parte alícuota del eluido se mezcla luego con una parte alícuota de la mezcla principal de PCR para iniciar la amplificación de los ácidos nucleicos recuperados en el eluido. La reacción se caracteriza por la ecuación

N_{1} = N_{0} \ x \ (1+E)^{n},

Con

N_{0}= número de moléculas al inicio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

N_{1}= número de moléculas al final de la reacción en cadena de la polimerasa

E = eficacia de la amplificación = 0\leqE\leq1

n = número de ciclos de reacción = típicamente 20\leqn\leq35

Después de la PCR con al menos una capa aislante biotinilada, una parte alícuota del amplificado que lleva biotina se mezcla con el tampón de hibridación y la muestra de detección. Después de la incubación, se añaden perlas revestidas de estreptavidina y se realiza otra incubación. Finalmente, se lavan las perlas, se añade el tampón señalizador y se mide la intensidad de la señal luminiscente que se correlaciona con la masa de ácido nucleico amplificada enlazada y por tanto con la carga vírica de la muestra de plasma.

El experto en la materia puede añadir también 1 ml de protocolo manualmente

7.1.2 Protocolo experimental 7.1.2.1 Reactivos 7.1.2.1.1 Preparación de muestras

Proteinasa K, líquido en acetato de Ca/glicerina, 20 mg/ml poly-A-ARN, 1 mg/ml, el nivel de uso es una dilución 1:1000 en un tampón de descomposición, que consta de:

-: Tampón tris, 50 mmol/l, pH 7,0 (1,0 & protocolo del extractor, respectivamente) o bien 4,0 (1,5 ml de protocolo)

-: Polidocanol, 15% (v/v)(1,0 & protocolo del extractor, respectivamente) o bien Triton X-100 20% (v/v)(1,5 ml de protocolo)

-: Isotiocianato de guanidina, 5 mol/l

-: 1 mmol/l DTT

-: partículas de vidrio magnéticas(PVM) del tipo EJ/BM o EJ/CERAC suspendidas en isopropanol (99,8% pureza) a 60 mg/ml

-: solución tampón de lavado que consiste en

-: Tampón tris, 20 mmol/l, pH 7,5

-: 60% de etanol/eq(1,0 & protocolo del extractor, respectivamente) o 70% (1,5 ml de protocolo)

-: NaCl, 20 mmol/l

: Eluyente = agua destilada dos veces

Amplificación/Mezcla principal:

-: Tampón de PCR, que consta de un medio amortiguador

: RT-PCR(virus de inmunodeficiencia humana(HIV), virus de hepatitis C (HCV): 250 mmol/l de Bicina/KOH pH 8,2 557 mmol/l Acetato de potasio, 40% de glicerina

: HBV-PCR (virus de la hepatitis B(HBV)):20 mmol/l Tris-HCl pH 8,3; 100 mmol/l KCl, 0,012% Brj 35= 2 x concentrado

: Cationes metálicos, MgCl_{2}(HBV-PCR) 3 mmol/l o MnCl_{2}, (RT-PCR)2,5 mmol/l(HCV) y 1,25 mmol/l(HIV)

: Trifosfato de deoxinucleósido (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, dUTP)

: Capa aislante de avance específica del analito

: Capa aislante invertida específica del analito

: Uracil-N-glucosidasa (UNG)

: DNA-polimerasa (Taq ó T-polimerasa para HBV ó HIV/HCV, respectivamente) H_{2}O desmineralizada (grado de biología molecular) para el ajuste del volumen a 100 \mul

: Reactivo de interrupción para UNG después de la amplificación

: - N-lauroilsarcosina (por ej. Roche Id. Nr. 133895), 1% p/v); 5 \mul por 100 \mul de amplificado

: Tampón de hibridación (p.ej. Roche Id. Nr. 1930273)

Muestras de detección marcadas con quimioluminiscencia:

: HCV(Roche BMO 28.140336), materia de trabajo =8,0 nmol/l

: HIV(Roche BMO 28.540948), materia de trabajo =7,8 nmol/l

: HBV(Roche BMO 28.540917), materia de trabajo =9,2 nmol/l

: Perlas de ECL cubiertas de SA (p.ej. Roche Id.nr. 1865943-001)

: Solución desnaturalizante (p.ej. Roche Id. Nr. 1930257)

: Procell (por ejemplo, Roche Id.Nr. 1717685)

: CleanCell (por ejemplo Roche Id.Nr. 1717642)

7.1.2.1.3 Capas aislantes y muestras Aislante:

	HIV-avance:	SEQ ID NO 3
	HIV-invertido:	SEQ ID NO 4

	HCV-avance:	SEQ ID NO 5
	HCV-invertido:	SEQ ID NO 6

	HBV-avance:	SEQ ID NO 7
	HBV-invertido:	SEQ ID NO 8

\vskip1.000000\baselineskip

Muestras de detección:

	HIV:	SEQ ID NO 9
	HCV:	SEQ ID NO 10
	HBV:	SEW ID NO 11

7.1.2.2 Condiciones de reacción y método de análisis Preparación de la muestra

\ding{226}: 1,0 ml protocolo manual;\rightarrow usado para el experimento 1, ver ejemplo 7.3.1

: añadir 25 \mul de proteinasa K a 425 \mul de muestra de plasma, agitación vorticial,

: añadir 500 \mul de tampón de lisis, incubar 5 min a temperatura ambiente con agitación mecánica (1330 rpm en agitador Eppendorf),

: añadir 50 \mul de MGP suspendida en isopropanol (concentración 60 mg/ml), agitación vorticial e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador de rodillos,

: separación magnética usando un separador magnético Dynal (2 min);

: eliminar la fracción no ligada mediante aspiración, y añadir 700 \mul de tampón de lavado, agitación vorticial, separar, aspirar;

: repetir el procedimiento de lavado otras 4 veces,

: añadir 120 \mul de DEPC-agua, agitación vorticial y eluir durante 10 minutos a 80ºC en un Eppendorf Thermomixer a 1300 rpm con los recipientes sin tapar,

: separar las perlas del sobrenadante acuoso (=eluir) con un separador magnético Dynal (2 minutos),

: congelar el eluido hasta posterior uso.

\ding{226}: protocolo automatizado o bien extractor incorporado;\rightarrow usado para los experimentos 2 y 3 (ver ejemplo 7.3.2 y ejemplo 7.3.3)

: Básicamente el mismo método y el mismo reactivo que los mencionados. Además, se añade un control interno de ARN (IC, ver a continuación) a todas y cada una de las muestras, se termostata el proceso de extracción a aproximadamente 40ºC y se ajustan los volúmenes a un volumen total de 2 ml de mezcla de lisis, es decir,

: 50 \mul de IC

: 50 \mul de proteinasa K

: 850 \mul de muestra

: 1000 \mul de tampón de lisis

: 100 \mul de suspensión de MGP

: 2200 \mul de tampón de lavado para 5 etapas de lavado respectivamente

: 125 \mul de eluyente

\ding{226}: 1,5 ml de protocolo manual; \rightarrow usado para el experimento 4 (ver ejemplo 7.3.4)

: añadir 80 \mul de proteinasa K a 420 \mul de muestra de plasma, agitación vorticial,

: añadir 500 \mul de tampón de lisis, incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación mecánica (1300 rpm en agitador Eppendorf),

: añadir 500 \mul de MGP suspendido en isopropanol (concentración 6 mg/ml), agitación vorticial, e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en un mezclador de rodillos,

: separación magnética usando un separador magnético Dynal (2 min);

: retirar la fracción no ligada a través de aspiración, y añadir 700 \mul de tampón de lavado, agitación vorticial, separar, aspirar; repetir el proceso de lavado otras 4 veces,

: añadir 100 ml de DEPC-agua, cerrar las cubetas, agitación vorticial y eluir durante 15 minutos a 80ºC en un Eppendorf Thermomixer a 1300 rpm,

: separar las perlas del sobrenadante acuoso (=eluir) con separador magnético Dynal (2 min),

: congelar el eluido hasta uso posterior.

Amplificación

Volumen de reacción total = 100 \mul para todas las valoraciones

HBV: volumen eluido para PCR = 20 \mul

	Solución madre	concentración final en PCR/\mul
Agua(grado PCR)		4 \mul
ADN-mezcla patrón	2-x	1-x/50 \mul
MgCl_{2}	25 mM	3,0 mM/12 \mul
Aislante SEQ ID NO 7	5 \muM	0,2 \muM/4 \mul
Aislante SEQ ID NO 8	5 \muM	0,4 \muM/8 \mul
UNG	1 U/\mul	2U/2 \mul

\vskip1.000000\baselineskip

HCV: Volumen eluido para PCR = 40 \mul

	Solución madre	concentración final en PCR/\mul
Agua(grado PCR)		18 \mul
Tampón bicina RT 5x	5-x	1-x/20 \mul
MnOAc	25 mM	2,5 mM/10 \mul
Mezcla DNTP (dUTP/	30 mM	0,6 mM
DATP/dCTP/dGTP)	10 mM	0,2 mM/2 \mul
Aislante SEQ ID NO 5	10 \muM	300 nM/3 \mul
Aislante SEQ ID NO 6	10 \muM	300 nM/3 \mul
UNG	1 U/\mul	2 U/2 \mul
Polimerasa T	5,5 U/\mul	10 U/2 \mul

\vskip1.000000\baselineskip

HIV: Volumen eluido para PCR = 40 \mul

	Solución madre	concentración final en PCR/\mul
Agua(grado PCR)		20 \mul
Tampón bicina RT 5x	5-x	1-x/20 \mul
MnOAc	25 mM	1,25 mM/5 \mul
Mezcla DNTP (dUTP/DATP/
dCTP/dGTP)	10 mM	0,2 mM/2 \mul
Aislante SEQ ID NO 3	5 \muM	0,2 \muM/4 \mul
Aislante SEQ ID NO 4	5 \muM	0,2 \muM/4 \mul
UNG	1 U/\mul	2 U/2 \mul
Polimerasa T	5,5 U/\mul	15 U/3 \mul

Después del PCR, el UNG se ve bloqueado por la adición de una concentración de laurilsarcosina del 1% del nivel de uso.

Los perfiles de termociclado son los siguientes:

HBV: etapa UNG	1x	10 min	37ºC
\hskip1cm PCR	35x	30 seg	92ºC
		30 seg	55ºC
		40 seg	72ºC

HCV: etapa UNG	1x	10 min	37ºC
\hskip1cm Desnaturalización de la	1x	30 min	60ºC
\hskip1cm etapa de la transcriptasa		1 min	95ºC
\hskip1cm invertida
\hskip1cm PCR	2x	10 seg	95ºC
		20 seg	60ºC
	33x	15 seg	90ºC
		20 seg	60ºC
\hskip1cm Incubación complementaria		7 min	72ºC

HIV: etapa UNG	1x	10 min	37ºC
\hskip1cm Etapa de transcriptasa invertida	1x	30 min	60ºC
\hskip1cm PCR	4x	10 seg	95ºC
		10 seg	55ºC
		10 seg	72ºC
	31x	10 seg	95ºC
		10 seg	60ºC
		10 seg	72ºC

\vskip1.000000\baselineskip

Detección en el Elecsys 1010® modificado

Reactivo	Volumen	Tiempo incubación
	(HBV,HCV,HIV)	(HBV,HCV,HIV)
Producto PCR	10 \mul
Solución desnaturalizante	35 \mul	5 min
Muestra de detección	120 \mul	30 min
Perlas SA	35 \mul	10 min

7.2 Valoraciones funcionales homogéneas: Tecnología de valoración de la 5'-nucleasa en una Cobas Taqman® 7.1.1 Consideraciones generales

La lisis de las partículas víricas así como la adsorción, purificación y elución de los ácidos nucleicos extraídos de las muestras se llevan a cabo tal como se ha descrito antes (ver ejemplo 7.1.2). De nuevo, la amplificación de las moléculas diana se describe por medio de la ecuación N_{i} = N_{0}x(1+E)^{n}, con

N_{0}= número de moléculas al inicio de la reacción en cadena de la polimerasa

N_{i}= número de moléculas al final de la reacción en cadena de la polimerasa

E = eficacia de la amplificación =0<E<1

n = número de ciclos de reacción = típicamente 40<n<60 en este caso.

Sin embargo, con la tecnología de la 5'-nucleasa las reacciones de amplificación y detección, respectivamente, se encuentra interrelacionadas y tienen lugar en la fase de solución, es decir, sin inmovilización de la fase sólida y en las correspondientes etapas de lavado (=PCR homogéneo). Con esta finalidad, se añaden muestras de detección con 2 modificaciones químicas especiales a la mezcla patrón PCR. Una de estas modificaciones es un grupo indicador fluorogénico (R, por ejemplo, un derivado de 6-carboxi-fluoresceína) unido a la estructura de la muestra por un enlace covalente, siendo el otro un colorante (por ejemplo, un derivado de polimetina-cianina) capaz de absorber la luz fluorescente del indicador y de extinguirla (agente de extinción). El elemento de extinción se encuentra normalmente unido a la estructura de la muestra por el extremo 5', mientras que el grupo indicador se sitúa en la secuencia oligo, separado del elemento de extinción por una serie de bloques de nucleótidos. Estas muestras se unen al ácido nucleico diana o de referencia (hebra transcrita o hebra complementaria) cerca del extremo 3' de una capa aislante (avance o invertida). Tan pronto como la capa aislante ha formado un híbrido y el ADN-polimerasa se une al híbrido capa aislante: elemento diana, se inicia la elongación. Debido a la actividad en la 5'-nucleasa del enzima, simultáneamente a la síntesis de la rama complementaria, la muestra queda segmentada tan pronto como la polimerasa alcanza el lugar de enlace de la muestra, los elementos indicador y de extinción se separan y la luz fluorescente puede medirse. Este proceso se repite con cada ciclo y se acumula más y más indicador fluorescente en solución hasta el agotamiento del reactivo al final de la reacción. Así que en un gráfico señal respecto a tiempo, se generan unas curvas de crecimiento sigmoidal. Cuanto mayor es N_{0} más pronto llega la curva de señal al nivel de ruido.

El punto en el eje del tiempo, en el que la señal fluorescente puede distinguirse de forma significativa de la señal de fondo se denomina ciclo liminar (ct). ct es una medida de la sensibilidad de la valoración: cuanto menor es el valor ct, más sensible es la valoración. Los valores ct se pueden calcular por medio de diferentes operaciones matemáticas, por ejemplo, métodos discriminatorios (intensidad de la señal de fondo media multiplicada por un factor constante da lugar a una intensidad de la señal límite o umbral que distingue lo positivo de lo negativo) o bien métodos donde la localización del valor máximo de la primera diferenciación de la curva señal respecto a tiempo (es decir, el perfil de inclinación), o bien la localización del valor máximo de la segunda diferenciación del eje tiempo, se calculan y definen como ct.

Esta tecnología de amplificación/detección permite el control a tiempo real del PCR y el tratamiento con tubo cerrado, es decir, en contraste con los métodos estándar, los tubos de PCR se mantienen cerrados después de Pipetear el eluido y la mezcla patrón que reduce eficazmente los riesgos de contaminación.

Además, si uno utiliza equipos de aislantes y de muestras para diferentes especies víricas (y, por consiguiente, diferentes moléculas de analito y secuencias diana) combinadas en una mezcla patrón, es posible llevar a cabo múltiples reacciones de amplificación/detección, simultáneamente, dependiendo de la carga vírica del individuo que se inspecciona. Esta es la base de las llamadas valoraciones múltiples.

Y lo que es más, debido a la naturaleza genética de la preparación de muestras a base de MGP, todos los ácidos nucleicos presentes en la muestra son extraídos por medio de la adsorción físico-química a la superficie de partículas, independiente de las características de la secuencia. Esto incluirá también el ADN humano (hDNA), liberado de las células sanguíneas destruidas, por ejemplo los leucocitos, cuya valoración diferirá ampliamente según el estado fisiológico o patológico del donante individual de muestra sanguínea. Por ejemplo, en los casos de enfermedades autoinmunitarias como SLE, los niveles de hDNA pueden elevarse sustancialmente. Así, el hDNA y uno o más ácidos nucleicos patógenos presentes en una muestra determinada constituyen una mezcla de varios ácidos nucleicos de diferentes especificidades de secuencia que son extraídos a la vez. Ellos constituyen una matriz de polinucleótidos que son extraídos sin discriminación alguna, a lo que sigue una amplificación específica de la secuencia y la detección de los ácidos nucleicos diana a través de la interacción con capas aislantes y muestras específicas en unas condiciones de reacción apropiadas.

Dado un nivel patológico de 4000 ng/ml de hDNA en plasma en el caso de SLE, y una carga vírica baja de 50 copias de ARN genómico vírico por ml de plasma y 10.000 nucleótidos por ARN genómico. Con aproximadamente 325 dalton (1 dalton = 1,66 x 10^{-24}g) por nucleótido, 50 copias o 500000 nucleótidos de ARN diana constituyen aproximadamente 2,7 x 10^{-7} ng por ml de plasma, lo que da lugar a una abundancia relativa de ácido nucleico diana: no diana de aproximadamente 1:10^{12}. Con el fin de controlar todo el proceso, puede añadirse a las muestras un ácido nucleico artificial, preferiblemente empaquetado (armado) en una partícula vírica modificada, que se extrae y amplifica simultáneamente al ácido nucleico diana natural. Este control interno (CI) distingue una región de enlace de muestra única para una muestra de detección IC, que difiere de las muestras específicas de referencia por poseer un grupo indicador diferente con unas características de emisión diferenciables. Por consiguiente, la señal CI puede discernir de la señal de referencia, y puesto que la señal CI se sabe que está presente en la muestra, funciona como agente de control. Así el etiquetado o marcaje múltiple amplía la utilidad de la tecnología de valoración múltiple. El control interno (CI) se describe en WO98/00547.

7.1.2 Protocolo experimental 7.1.2.1 Reactivos 7.1.2.1.1 Preparación de la muestra

Ver antes (ejemplo 7.1.2 \rightarrow protocolo automatizado en extractor incorporado)

7.2.2.1.2 Valoración de la 5'-nucleasa, reactivos y condiciones de reacción

Reactivo	Concentración de	Concentración final	Adición
	la solución madre	en la prueba	(\mul/reacción)
Mn(OAc)_{2} pH 6,5	50 Mm	3 mM	5,75
DNTPs			2,50
(dG,dA,dC)	100 mM	300 \muM
(dT)		50 \muM
(dU)		500 \muM
DEPC-H_{2}O		-	9,50
Glicerina	80%	5,64% en total	3,50
		2,8% añadido*
K Oac pH 7,5	2M	100 mM	5,00
Tricina pH 8,3	1M	50 mM	5,00
DMSO	80%	5,0%	6,25
Aislante SEQ ID NO 12	50 \muM	150 nM	0,30
Aislante SEQ ID NO 13	50 \muM	150 nM	0,30
Aislante SEQ ID NO 14	50 \muM	400 nM	0,80
Aislante SEQ ID NO 15	50 \muM	150 nM	0,30
Aislante SEQ ID NO 16	50 \muM	400 nM	0,80
Aislante SEQ ID NO 17	50 \muM	150 nM	0,30
Aislante SEQ ID NO 18	50 \muM	150 nM	0,30
Muestra SEQ ID NO 19	50 \muM	100 nM	0,20
Muestra SEQ ID NO 20	50 \muM	100 nM	0,20
Muestra SEQ ID NO 21	50 \muM	100 nM	0,20
Muestra SEQ ID NO 22	50 \muM	100 nM	0,20
UNG	2,4 U/\mul	10 U	4,20
Z05	10 U/\mul	40 U	4,00
Aptámero SEQ ID NO 23	50,4 \muM	200 nM	0,40
* \begin{minipage}[t]{155mm} El resto de glicerina se añade a través de los enzimas Z05 (una muteína de la T-ADN-polimerasa) y UNG (uracil-N-glucosidasa).\end{minipage}

\vskip1.000000\baselineskip

El perfil de termociclado múltiple frecuente para todos los parámetros es el siguiente:

Etapa UNG	45ºC - 10 min
Desnaturalización	94ºC - 30 seg
Transcripción invertida	58ºC - 30 min
PCR	95ºC-20 seg/59ºC-50 seg 5x
	91ºC-15 seg/52ºC-50 seg 55x

\vskip1.000000\baselineskip

7.2.2.1.3 Secuencias Capa aislante:

	VIH avance:	SEQ ID NO 12
	VIH avance:	SEQ ID NO 13
	VIH inverso:	SEQ ID NO 14
	HCV avance:	SEQ ID NO 15
	HCV inverso:	SEQ ID NO 16
	HBV avance:	SEQ ID NO 17
	HBV inverso:	SEQ ID NO 18

Muestras:

	VIH :	SEQ ID NO 19
	HCV :	SEQ ID NO 20
	HBV :	SEQ ID NO 21
	IC:	SEQ ID NO 23

Temperatura de fusión del complejo de ADN polimerasa-aptámero = 51,7ºC(= 50% de disociación)

Terminología de las derivatizaciones químicas

Algunos de los oligonucleótidos se derivatizan con Cy5 que es un pentametina-di-indocarbocianina acoplado a un conector de alquilfosfatidilo (Pharmacia Biotech Cy5-N-etil-fosforamidita) y que funciona como un elemento de extinción (Q); \lambda_{EX}=630 nm, \lambda_{EM}=665 nm. Algunos de los oligonucleótidos se derivatizan con FAM que es la 6-carboxi-fluoresceína acoplada a una 2-(amino-ciclohexil)-propano-1,3-diol-conector (Biogenex CF-FAM-fosforamidita) y que funciona como indicador para elementos de referencia (R); \lambda_{EX}=485 nm, \lambda_{EM}=515 nm. Algunos de los oligonucleótidos forman derivados con hexacloro-6-carboxi-fluoresceína acoplada a un 2-(amino-ciclohexil)-propano-1,3-diol-conector (Biogenex CX-HEX-fosforamidita) y que funciona como indicador del control interno (R); \lambda_{EX}=530 nm, \lambda_{EM}=585 nm

7.2.2.1.4 Condiciones de reacción

Las condiciones de reacción se describen en los resultados de los experimentos (ver ejemplo 7.3).

7.2.2.1.5 Otros materiales

- plasma de virus negativo(matriz 0, plasma simple o pool de plasma), p.ej. plasma de citrato o plasma de EDTA

- plasma de virus positivo o sobrenadantes del cultivo que contiene virus, que se pueden usar para ajustar ciertas valoraciones de virus mezclando con la matriz 0 en proporciones apropiadas.

- Alternativamente: transcripciones in vitro con las secuencias de referencia a investigar

- ADN de placenta humana (a. genómico, Sigma, cat. nr. D4642; b. fragmentado, Sigma cat. Nr. D3287), que se añade a las muestras para simular condiciones patológicas que conducen a la liberación de sustancias intracelulares y por consiguiente a niveles elevados de ADN/ARN en la sangre, por ejemplo, la enfermedad autoinmunitaria como SLE o la hemólisis.

7.3 Resultados de las pruebas funcionales

7.3.1 Experimento 1

Diferentes muestras de MGP del tipo EJ/CERAC se analizan con los métodos descritos en 7.1. La variable de ensayo era la presión de pulverizado:

EJ0100.5R - 1,5 bar

EJ0106.5R - 2,5 bar

EJ0107.5R - 3,5 bar

EJ0108.5R - 4,3 bar

Podía demostrarse que aumentando la presión de pulverizado, es decir cambiando hacia un diámetro de perla medio más pequeño, el enlace no específico (USB) disminuye mientras que se mantiene inalterada la generación de la señal altamente específica que da lugar a unas proporciones o ratios elevados de señal-ruido.

El ajuste de la valoración vírica 0,5xGG es aproximadamente 100 sgu/ml (sgu = unidades generadoras de señales) en el caso del HBV, y aproximadamente de 150 sgu/ml en el caso del VIH. Los datos se resumen en la tabla 7.

7.3.2 Experimento 2

Dos variantes de los tipos EJ/MMB y EJ/CERAC, respectivamente, se comparan funcionalmente usando el método tal como se describe en el ejemplo 7.2 junto con muestras de plasma individuales (PL) y en conjunto(MP). La EJ0047.2R(MMB) y EJ0100.5R(CERAC) se pulverizan en unas condiciones estándar, es decir 1,5 bar, 230ºC temperatura de entrada y aproximadamente 110ºC temperatura de salida. EJ0102.2R(MMB) y EJ0108.5R(CERAC) son variantes de desarrollo con respecto a las condiciones de pulverizado (la temperatura de entrada disminuía a 200ºC(MMB)), y la presión de pulverizado aumentaba a 4,3 bar (CERAC). Los resultados se recogen en la tabla 8 y muestran el potencial de las partículas de núcleos nano CERAC para obtener una sensibilidad superior tal como queda claro en los ejemplos debido al ciclo liminar prematuro y/o a unas diferencias de señal superiores (señal de saturación menos nivel de ruido, S-N).

7.3.3 Experimento 3

Varias preparaciones MGP del tipo EJ/MMB y EJ/CERAC (ver tabla 9) se comparan funcionalmente usando el método tal como se ha descrito en el ejemplo 7.2. Los resultados se resumen en la tabla 10 y muestran el potencial de las partículas tipo EJ0096.5R-01 para obtener una sensibilidad superior como se refleja en los ejemplos en el ciclo liminar prematuro o en un ratio superior independientemente de la valoración en particular.

7.3.4 Experimento 4

Varias preparaciones MGP del tipo EJ/MMB y EJ/CERAC se comparan funcionalmente usando el método tal como se ha descrito en el ejemplo 7.1 donde la incubación por adsorción se realiza con o sin agitación. Debido a ello, la velocidad de sedimentación resulta decisiva, es decir, cuanto mayor es la velocidad de sedimentación mayor es el número de partículas que son retiradas de la interacción con el analito en el precipitado que se forma. En contraste con ello, si la velocidad de sedimentación es inferior entonces el intervalo de tiempo es mayor, en el cual las moléculas de analito del líquido pueden adsorberse a la superficie del adsorbente. Los resultados se resumen en la tabla 11 (EJ0047.2R se usaba como una referencia), que demuestra que sin agitación mecánica la pérdida de rendimiento es máxima (>40%) con el tipo MMB (difiere considerablemente de las características de esta invención), y mínima o prácticamente nula con el tipo CERAC (más cerca de las características de la invención de esta serie).

Para poder evaluar la funcionalidad de los diferentes tipos de MGP, se calculaba un índice de rendimiento para cada tipo del modo siguiente:

-: Los eluidos de varios lotes para cada tipo de MGP y cada nivel de valoración, respectivamente, se recogen en 1 mezcla de eluido.

-: Fuera de cada mezcla de eluido, se realizaban 3 amplificaciones para cada valoración (HIV,HCV,HBV).

-: Cada amplificado se medía de forma unívoca en el Elecsys 1010® odificado.

-: Las señales se promedian para cada tipo de MGP, valoración y nivel de valoración.

-: Se calculan los factores señal-ruido (S/N) para cada tipo de MGP y valoración, respectivamente, es decir, valoración baja (positivo débil) o bien matriz O(negativo) y valoración elevada sobre la matriz O.

-: Los factores S/N se normalizan respecto al tipo de referencia de MGP en ese momento.

-: Cálculo de la suma de factores S/N normalizados para cada tipo de MGP, acumulados de todas las valoraciones y de los niveles de valoración; factores S/N para el margen de valoración bajo se pesan 2 veces con respecto a los del nivel de valoración alto para pronunciar los aspectos de sensibilidad.

-: A la suma resultante se asigna un índice de rendimiento para cada tipo de MGP investigado.

7.3.5 Experimento 5

Se utilizaban diferentes tipos de MGP para extraer HCV en los transcritos in vitro que se diluían en distintos niveles de diluyente que contenían 10 mmol/l de Tris, pH 80, EDTA 1 mM, 20 \mug/ml de poli-A-RNA y un 0,05% de NaN_{3}, y se añadían al conjunto del plasma.

El ADN de fondo humano (hBG-DNA) se añadía a 0 ó 4000 ng/ml en la muestra, respectivamente. Sorprendentemente, es posible reducir la interferencia causada por hBG-DNA por medio de la selección de perlas, tal como demuestran los datos presentados en la tabla 12.

7.3.6 Experimento 6

Varios tipos de MGP se utilizaban para tratar las muestras de plasma positivo. El ADN de fondo humano (hBG-DNA) se añadía a la muestra en una concentración de 0 ó 4000 ng/ml, respectivamente. De nuevo, se observa un impacto significativo del tamaño de la perla y de la geometría de la perla. La preparación EJ0096.5R de MGP que representa la calidad de MGP de acuerdo con la presente invención muestra unas ventajas muy bien definidas tanto en términos de variación mínima de los valores ct, y reduce la pérdida de la generación específica de la señal (S-N), tal como indican los datos presentados en la tabla 13.

TABLA 1

4

TABLA 2

5

TABLA 3

6

TABLA 4

Lote	Superficie BET (m^{2}/g)	Observaciones
EJ0096.5R-01	26,85	Cerac, pequeña secadora de atomización, 6 bar
EJ0100.5R-01	8,95	Cerac, gran secadora de atomización, 1,5 bar
EJ0101.4R-01	8,47	BASF FA, gran secadora de atomización, 1,5 bar
RN0005.2E-01	3,54	MERCK MMB, gran secadora de atomización, 1,5 bar
RN0009.1E-01	3,25	MERCK BM, gran secadora de atomización, 1,5 bar
EJ0099.9R	0,74	BASF CE-SU, gran secadora de atomización, 6 bar
EJ0100.7R	8,53	STREM, gran secadora de atomización, 1,5 bar

TABLA 5

Tipo	Tamaño de los	Constitución	Forma	T_{1/2} sedimentación	T_{1/2} separación
PVM	núcleos aislados			(min)	(seg)
MMB	3-15 \mum	Agregada	Placas	3,9	14
CERAC	23 nm	Singular	Perlas	\may{2}10	16
STREM	300-500 nm	Agregada	Perlas	4,8	10
BASF-FA	200-300 nm	Agregada	Agujas	4,6	12a

TABLA 6

Muestra de PVM	T_{0,9} (valor del 90%) de	T_{1/2} (valor del 50%)
	sedimentación (min)	de sedimentación (min)
EJ0100.5R-01	0,35	2,78
EJ0108.5R-01	0,62	7,58
EJ0096.5R-01	1,39	19,85

TABLA 7

PVM	USB(recuentos)-0-matriz	SB(recuentos)-0,5xGG
	HIV	HBV	HIV	HBV
EJ0100.5R-01	4997	2277	20380	80292
EJ0100.5R-02	6100	3590	22036	53417
EJ0100.5R-03	4856	2270	19791	65109
EJ0106.5R-01	4427	2263	19030	75128
EJ0107.5R-01	3940	2261	19255	68285
EJ0108.5R-01	3429	2217	20048	80426

TABLA 8

		HBV		HCV
Muestra	MGP lote#	C	S-N	Ct	S-N
MP2	EJ0047.2	40,49	19,88	41,68	12,6
MP2	EJ100.5	40,96	21,80	43,08	12,74
MP2	EJ0102.2	41,93	21,39	44,74	10,10
MP2	EJ0108.5	40,09	22,01	47,36	10,61
Pl.1/2	EJ0047.2	41.03	18,14	-	-
Pl.1/2	EJ100.5	40,12	19,31	-	-
Pl.1/2	EJ0102.2	41,81	22,80	44,69	14,30
Pl.1/2	EJ0108.5	39,93	21,77	43,27	12,58
Pl.4/5	EJ0047.2	46,33	12,83	39,54	18,30
Pl.4/5	EJ100.5	40,82	15,12	38,24	21,48
Pl.4/5	EJ0102.2	42,49	19,65	39,24	19,05
Pl.4/5	EJ0108.5	47,33	9,51	39,47	17,81
Pl.6/8	EJ0047.2	41.08	20,83	49,44	9,46
Pl.6/8	EJ100.5	40,68	23,16	48,98	10,31
Pl.6/8	EJ0102.2	40,50	22,49	54,50	6,50
Pl.6/8	EJ0108.5	38,79	18,60	50,41	8,61
Pl.6/8	EJ0047.2	44,16	17,26	41,40	10,59
Pl.6/8	EJ100.5	42,97	18,59	41.01	11,33
Pl.6/8	EJ0102.2	44,49	12,41	42,18	11,32
Pl.6/8	EJ0108.5	41,24	18,73	41,46	10,80
Estadística de recuento: Que tipo tiene la mejor puntuación?
"muestras estándar"	"variantes de desarrollo"	total: mejor tipo por
		valoración de muestra
MMB:CERAC	MMB:CERAC	MMB:CERAC
Ct S-N	Ct S-N	Ct S-N
2:7 0:9	3:7 5:5	1:9 3:7
(1 comparación no pudo evaluarse)

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 9

PVM	Descripción
EJ0096.5R	\begin{minipage}[t]{110mm} Presión de atomización de 6,0 bar, temperatura de entrada 150^{o}C, equipo de laboratorio Büchi. Esta preparación se acerca mucho a las características conforme a la invención, ver figura 15.\end{minipage}
EJ0111.5R	\begin{minipage}[t]{110mm} Presión de atomización de 1,5 bar, temperatura de entrada 230^{o}C, equipo de laboratorio Nubilosa\end{minipage}
EP0119.5R	\begin{minipage}[t]{110mm} Presión de atomización de 1,5 bar, temperatura de entrada 230^{o}C, equipo de laboratorio Nubilosa, composición de vidrio alterada sin acetato de Zn, K-metanolato sustituido por acetato de K, con idéntica estequiometría\end{minipage}
EJ108.5R	\begin{minipage}[t]{110mm} Presión de atomización de 4,3 bar, temperatura de entrada 230^{o}C, equipo de laboratorio Nubilosa\end{minipage}

TABLA 10

Valores Ct(HBV) Cálculo de ct a través del máximo de la primera diferenciación

Parámetro HBV
Valoración	Lote MGP	Lote MGP	Lote MGP	Lote MGP
(sgu/ml)	EJ0111.5R-02	EJ0119.5R	EJ0096.5R	EJ0108.5R
	AVG	AVG	AVG	AVG
NK	-	-	-	-
100	46,1	44,1(6/6)	43,4	44,2
40	47,6	46,5(7/8)	45,5(7/8)	46,7(6/7)
20	50,6(6/8)	46,1(6/8)	46,8(7/8)	50,0(4/8)
10	47,6(5/8)	50,1(5/8)	46,8(4/8)	47,7(3/7)
5	51,2(3/8)	48,6(4/8)	47,8(5/8)	49,7(4/7)
hit rate	75%	74%	77,5%	67,5%

\vskip1.000000\baselineskip

Cálculo de ct a través de la fórmula límite o discriminatoria

Parámetro HBV
Valoración	Lote MGP	Lote MGP	Lote MGP	Lote MGP
(sgu/ml)	EJ0111.5R-02	EJ0119.5R	EJ0096.5R	EJ0108.5R
	AVG	AVG	AVG	AVG
NK	-	-	-	-
100	44,2	41,7(6/6)	41,5	41,9
40	45,5	44,1(7/8)	42,7(6/8)	45,0(6/7)
20	47,7(6/8)	43,5(6/8)	44,3(7/8)	47,2(6/8)
10	45,5(5/8)	47,7(5/8)	44,4(6/8)	45,6(3/8)
5	49,3(3/8)	45,7(4/8)	45,4(4/8)	46,6(4/7)
hit rate	75%	74%	77,5%	71%

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Valores Ct(HCV) Cálculo de ct a través del máximo de la primera diferenciación

Parámetro HCV
Valoración	Lote MGP	Lote MGP	Lote MGP	Lote MGP
(IU/ml)	EJ0111.5R-02	EJ0119.5R	EJ0096.5R	EJ0108.5R
	AVG	AVG	AVG	AVG
NK	-	-	-
400	42,7	42,5(7/8)	41,8	42,6(7/7)
80	44,4(7/8)	44,1(6/6)	44,2(7/8)	44,2(7/7)
60	45,1	44,7(7/7)	44,4(6/7)	45,1(6/6)
40	46,2(7/8)	45,8(7/7)	43,9(5/7)	44,5(7/7)
20	46,5(5/8)	46,3(7/7)	45,0(6/8)	47,4(4/8)
hit rate	90%	97%	84%	88,5%

\newpage

TABLA 10 (continuación)

Cálculo de ct a través de la fórmula límite o discriminatoria

Parámetro HCV
Valoración	Lote MGP	Lote MGP	Lote MGP	Lote MGP
(IU/ml)	EJ0111.5R-02	EJ0119.5R	EJ0096.5R	EJ0108.5R
	AVG	AVG	AVG	AVG
NK	-	-	-	-
400	41,8	41,6(7/8)	40,9	41,7(7/7)
80	44,6(7/7)	44,0(6/6)	43,4(7/8)	44,5(7/7)
60	44,7	45,3(7/7)	45,1(6/7)	44,3(5/6)
40	47,9(7/8)	46,1(7/7)	44,7(4/7)	47,5(7/7)
20	49,6(5/8)	47,2(7/7)	45,3(5/8)	47,4(4/8)
hit rate	90%	97%	79%	86%

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Valores Ct(HIV) Cálculo de ct a través del máximo de la primera diferenciación

Parámetro HIV
Valoración	Lote MGP	Lote MGP	Lote MGP	Lote MGP
(sgu/ml)	EJ0111.5R-02	EJ0119.5R	EJ0096.5R	EJ0108.5R
	AVG	AVG	AVG	AVG
NK	-	-	-	-
30	43.2(6/8)	46,9(3/8)	43,9(3/7)	41,9(1/7)
60	42,7(4/7)	42,6(4/7)	42,8 (7/7)	42,4(2/7)
150	42,4(5/7)	42,0	41,7(6/6)	42,6(6/8)
300	41,9(5/5)	41,0(5/5)	41,5(6/6)	41,3(6/6)
600	41,6(7/7)	40,8(6/6)	40,8(5/5)	41,5
hit rate	79%	76%	87%	64,0%

\vskip1.000000\baselineskip

Cálculo de ct a través de la fórmula límite o discriminatoria

Parámetro HIV
Valoración	Lote MGP	Lote MGP	Lote MGP	Lote MGP
(IU/ml)	EJ0111.5R-02	EJ0119.5R	EJ0096.5R	EJ0108.5R
	AVG	AVG	AVG	AVG
NK	-	-	-	-
30	44,3(1/8)	47,3(2/8)	46,8(1/7)	-(0/7)
60	50,3(3/7)	54,1(1/7)	51,4(4/7)	-(0/7)
150	47,4(5/7)	43,7(5/8)	45,5(5/7)	52,2(2/8)
300	42,2(5/5)	44,8(5/5)	41,6(4/6)	46,5(6/6)
600	41,2(7/7)	41,3(5/6)	41,1(5/5)	42,5
hit rate	62%	53%	59%	44%

TABLA 11

Tipo MGP	HIV 1		HCV	\rightarrow	HBV		Indice	Relación de
							rendimiento	índices de
								funcionamiento
	60	600	480	4800	40	400	Acumulado/	Sin/con
	sgu/neg	sgu/neg	sgu/neg	sgu/neg	sgu/neg	sgu/neg	pesado/	agitación
							normalizado
EJ0047.2R	100	100	100	100	100	100	900	- - -
(referencia)
EJ0096.5R	55	34	44	74	146	112	709	-
EJ0096.7R	47	47	18	8	116	107	523	-
EJ0097.4R	32	54	29	47	169	132	692	-
RN0045.5R	85	64	76	63	7	84	545	-
RN0046.7R	109	80	43	40	121	135	803	-
RN0045.4R	48	93	112	128	136	96	908	-
EJ0047.2R	24	24	52	49	93	122	534	0,59
(referenc.)
EJ0096.5R	28	23	47	88	102	154	619	0,87
EJ0096.7R	34	23	38	14	99	70	449	0,86
EJ0097.4R	33	36	20	18	101	94	456	0,66
RN0045.5R	53	74	60	25	107	72	610	1,12
RN0046.7R	141	90	16	8	32	40	518	0,64
RN0045.4R	55	113	25	146	78	101	675	0,74

TABLA 12

Partículas	Valoración	\DeltahADN	\Deltact	\DeltaS-N
	HCV(IVT-ARN)
RN0009.1E= grandes laminillas
(3-60 \mum)	1000 cp/PCR	4000 ng/ml	+2	-6,1
EJ0100.5R= bolas deformadas
(aprox. 1-12 \mu)			-1	-3,2
EJ0108.5R= bolas deformadas*
(aprox. 1-4 \mu)			\pm0	-1,2

* variante de elevada presión, ver secciones 7.2.4.2 \textamp 7.3.1, respectivamente.
\begin{minipage}[t]{155mm} Nota: (+)\Delta ct = menos sensible (es decir, tendencia hacia resultados falsos negativos); (-)\Delta ct = más sensible (tendencia hacia resultados falsos positivos?) (-)\Delta S-N = generación de la señal menos específica = interferencia negativa\end{minipage}

TABLA 13

Partículas	Valoración	\DeltahADN	\Deltact	\DeltaS-N
	(ARN genómico extraído)
EJ0096.5R= objetivo de	200 IU/muestra	4000 ng/ml	-0,95	-8,5
diseño*
EJ0127.5R= estándar			-3,08	-13,89
EJ0129.5R= variante p			-2,30	-12,62
EJ0130.5R= variante p			-2,62	-10,57
EJ0131.5R= variante p			-2,46	-12,41
* = margen de 0,5-5 \mu; >50% subescala \mu; área de gran superficie (27 m^{2}/g BET); perlas perfectamente esféricas
variante p = secado por atomización a una presión elevada (ver apartado 7.3.1)

<110> Roche Diagnostics GMBH

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Partículas de vidrio magnéticas, método para su preparación y usos de las mismas

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 52960AEP engl AB

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP99122853.7

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1999-11-17

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: capa aislante sintética de oligonucleótidos

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagggcaaa actcagctca ccg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgagttcg tgtccgtaca act

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (VIH avance)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización de biotina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agttggagga catcaagcag ccatgcaaat

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (VIH invertido)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización de biotina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgctatgtca gttccccttg gttctct

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (HCV avance)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagaaagcg tctagccatg gcgt

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (HCV invertido)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización de biotina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgcaagca ccctatcagg cagt

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (HBV avance)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagtgtgga ttcgcact

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (HBV invertido)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización de biotina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgagatcttc tgcgacgc

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Muestra de oligonucleótido sintético (VIH)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización de rutenio 3+-(trisbipiridilo)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcaatgagg aagctgcaga

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Muestra de oligonucleótido sintético (HCV)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización de rutenio 3+-(trisbipiridilo)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcgtgcagc ctccaggacc c

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización de rutenio 3+-(trisbipiridilo)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaccaccaa atgcccct

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Capa aislante de oligonucleótido sintético (VIH)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (29)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización con residuo de p-(t-butil)benzilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtgggggga catcaagcag ccatgcaaa

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización con residuo de p-(t-butil)bencilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtactagta gttcctgcta tgtcacttcc

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización con residuo de p-(t-butil)bencilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaagcaccc tatcaggcag taccacaa

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización con residuo de p-(t-butil)bencilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaagtcaga aggcaaaaaa gagagtaa

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización con residuo de p-(t-butil)bencilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacctctgcc taatcatctc ttgttca

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización con una pentametina-di-indocarbocianina a través de un conector de alquilfosfatidilo (Pharmacia Biotech Cy5-N-etil-fosforamidita)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo equivocado

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N representa un conector 2-(amino-ciclohexil)-propano-1,3-diol derivatizado con 6-carboxi-fluoresceina (Biogen-ex CX-FAM-fosforamidita).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización con un grupo fosfato 3'-terminal

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctgcagctn tcctcattga tggtatcttt ta

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo equivocado

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N representa un conector 2-(amino-ciclohexil)-propano-1,3-diol derivatizado con 6-carboxi-fluoresceína (Biogen-ex CX-FAM-fosforamidita).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización con un grupo fosfato 3'-terminal

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggtgtactc accgnttccg cagaccacta tg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización con una pentametina-di-indocarbo-cianina a través de un conector de alquilfosfatidilo (Pharmacia Biotech Cy5-N-etil-fosforamidita)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo equivocado

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización con un grupo fosfato 3'-terminal

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagctgtg ccttggntgg ctttggggca tgg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo equivocado

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización con un grupo fosfato 3'-terminal

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggactcagt cctntggtca tctcaccttc t

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético (aptámero)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (46)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> derivatización con un grupo fosfato 3'-terminal

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatcatctc agaacattct tagcgttttg ttcttgtgta tgatcg

\hfill

Claims

1. Método para la producción de un compuesto de partículas de vidrio magnéticas que comprende las etapas de

a): suspensión de objetos magnéticos con un diámetro entre 5 y 500 nm en un sol,

b): secado por atomización de la suspensión en una secadora por atomización de dos boquillas, y

c): sinterizado del polvo secado por atomización.

2. Método conforme a la reivindicación 1 que se caracteriza porque la temperatura de entrada de la secadora por atomización de dos boquillas se encuentra entre 120ºC y 500ºC, la temperatura de salida se elige conforme al punto de ebullición del sol y la presión de atomización es de cómo mínimo 3 bar.

3. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que se caracteriza porque la temperatura de entrada de la secadora por atomización de doble boquilla se encuentra entre 170ºC y 230ºC, preferiblemente entre 190ºC y 210ºC.

4. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza porque la presión de atomización se sitúa entre 4 y 6 bar.

5. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se caracteriza porque el sol contiene etanol como disolvente.

6. Método conforme a la reivindicación 5, que se caracteriza porque la temperatura de salida se encuentra entre 50ºC y 300ºC.

7. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, que se caracteriza porque la temperatura de salida se sitúa entre 90ºC y 100ºC.

8. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que se caracteriza porque la temperatura de sinterizado se encuentra entre 400ºC y 1200ºC, preferiblemente entre 720ºC y 770ºC.

9. Partículas de vidrio magnéticas que se obtienen según un proceso reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Composición de partículas de vidrio magnéticas que se obtienen mediante un proceso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que contiene al menos un objeto magnético con un diámetro medio entre 5 y 500 nm, que se caracteriza porque el periodo de vida media para la sedimentación de una suspensión de 3 mg/ml de peso por volumen de la composición en isopropanol es mayor de 3 min.

11. Composición conforme a la reivindicación 10 que se caracteriza porque el objeto magnético tiene un diámetro medio entre 10 y 200 nm, preferiblemente entre 15 y 50 nm.

12. Composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, que se caracteriza porque el periodo de vida media es superior a 6 min.

13. Composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que se caracteriza porque el objeto magnético tiene un diámetro medio de 23 nm.

14. Composición conforme a la reivindicación 10 o 13, que se caracteriza porque el ratio del diámetro del cuerpo magnético respecto a la envoltura de vidrio es menor de 1:10.

15. Composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, que se caracteriza porque las partículas de vidrio magnéticas tienen un diámetro medio entre 0,5 y 5 \mum.

16. Composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, que se caracteriza porque las partículas de vidrio magnéticas son microporosas.

17. Composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, que se caracteriza porque la superficie de los poros de las partículas de vidrio magnéticas es inferior al 10% de la superficie total.

18. Composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, que se caracteriza porque el objeto magnético es superparamagnético.

19. Composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18, que se caracteriza porque el objeto magnético es ferrimagnético o ferromagnético.

20. Composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19, que se caracteriza porque el objeto magnético consta de hierro o bien óxido de hierro.

21. Composición conforme a la reivindicación 20, que se caracteriza porque el óxido de hierro es Fe_{3}O_{4} o bien \gamma-Fe_{2}O_{3}.

22. Composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 21, que se caracteriza porque las partículas de vidrio magnéticas tienen un área superficial superior a 4 m^{2}/g.

23. Composición conforme a la reivindicación 22, que se caracteriza porque las partículas de vidrio magnéticas tienen un área superficial entre 5 y 100 m^{2}/g, preferiblemente del orden de 10 a 50 m^{2}/g, más preferiblemente entre 15 y 30 m^{2}/g.

24. Composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 23, que se caracteriza porque las partículas de vidrio magnéticas son básicamente esféricas.

25. Suspensión que contiene una composición de partículas de vidrio magnéticas en un líquido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 24.

26. Suspensión conforme a la reivindicación 25, que se caracteriza porque el líquido consta de un alcohol.

27. Suspensión conforme a la reivindicación 26, que se caracteriza porque el alcohol es isopropanol o etanol.

28. Suspensión conforme a la reivindicación 25, que se caracteriza porque el líquido es una solución acuosa tampón.

29. Suspensión conforme a la reivindicación 28, que se caracteriza porque la suspensión contiene además ADN o ARN

30. Suspensión conforme a cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, que se caracteriza porque la suspensión contiene además un agente caotrópico.

31. Suspensión conforme a la reivindicación 30, que se caracteriza porque el agente caotrópico está presente en una concentración entre 2 y 8 mol/l, y preferiblemente entre 4 y 6 mol/l.

32. Suspensión conforme a cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31, que se caracteriza porque la suspensión contiene 5 a 60 mg/ml de un compuesto conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10-24.

33. Un tubo que contiene una composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 24 o bien una suspensión conforme a cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32.

34. Un estuche de piezas que contiene un tubo conforme a la reivindicación 33.

35. Un estuche de piezas conforme a la reivindicación 34 que contiene además una solución de lavado o eluyente.

36. Un estuche de piezas conforme a cualquiera de las reivindicaciones 34 a 35 que comprende además reactivos adecuados para la purificación de un ácido nucleico.

37. Uso de una composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 24 para la preparación de una suspensión.

38. Uso de una suspensión conforme a cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32 para la purificación de ácidos nucleicos.

39. Uso de un estuche de piezas conforme a cualquiera de las reivindicaciones 34 a 35 para la purificación de ácidos nucleicos.

40. Procedimiento para aislar un material biológico que comprende

a): poner una muestra que contiene el material biológico en un líquido en contacto con una composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 24, las partículas de vidrio magnéticas conforme a la reivindicación 9 o bien una suspensión conforme a cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32 en unas condiciones en las cuales el material biológico enlaza directamente con la superficie de vidrio, y

b): separar el material biológico del líquido.

41. Procedimiento conforme a la reivindicación 40, que se caracteriza porque el material biológico es un ácido nucleico.

42. Procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 40 a 41, que se caracteriza porque la separación se realiza con ayuda de un imán.

43. Procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42, que se caracteriza porque las partículas magnéticas no son premagnetizadas cuando se ponen en contacto con la muestra.

44. Procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43, que se caracteriza porque el procedimiento es automatizado.

45. Procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 40 a 44, que se caracteriza porque el procedimiento está en un formato de gran capacidad.

46. Procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 40 a 45, que se caracteriza porque durante el procedimiento se coge una suspensión conforme a cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28 de un recipiente de almacenamiento y se añaden volúmenes parciales de la suspensión a diferentes recipientes de reacción.

47. Procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 40 a 46, que se caracteriza porque el ácido nucleico se detecta después de la purificación.

48. Procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 46 a 47, que se caracteriza porque el ácido nucleico se detecta después de una etapa de amplificación.

49. Procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 40 a 48, que se caracteriza porque el ácido nucleico se detecta mediante un proceso que comprende:

a): puesta en contacto de la muestra con un oligonucleótido que contiene una secuencia complementaria a una región del ácido nucleico objetivo y con un oligonucleótido marcado que contiene una secuencia complementaria a una segunda región de la misma rama de secuencia del ácido nucleico, pero no incluye la secuencia de ácido nucleico definida por el primer oligonucleótido, para crear una mezcla de duplos durante las condiciones de hibridación, donde los duplos comprenden el ácido nucleico definido recocido al primer oligonucleótido y al oligonucleótido marcado de manera que el extremo 3' del primer oligonucleótido sea adyacente al extremo 5' del oligonucleótido marcado;

b): mantenimiento de la mezcla de la etapa a) con una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla que tiene una actividad 5'\rightarrow3' nucleasa en unas condiciones suficientes para permitir que la actividad 5'\rightarrow3' nucleasa de la polimerasa parta el oligonucleótido marcado, recocido, y libere los fragmentos marcados; y

c): detección y/o medición de la señal generada por la hidrólisis del nucleótido marcado.

50. Procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 48 a 49 que se caracteriza porque la detección se realiza en presencia de un oligonucleótido bloqueante.

51. Procedimiento conforme a la reivindicación 50 que se caracteriza porque el oligonucleótido bloqueante es un aptámero.

52. Procedimiento conforme a la reivindicación 51 que se caracteriza porque el aptámero tiene la secuencia SEQ ID NO:23.

53. Procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 50 a 52 que se caracteriza porque la reacción de amplificación y detección se lleva a cabo en un formato de análisis múltiple de una fase de solución homogénea para la detección simultánea de múltiples objetivos.

54. Procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 51 a 53 que se caracteriza porque para como mínimo 5 ciclos de la reacción en cadena de la polimerasa, la temperatura de recocido es inferior a 8ºC, preferiblemente menor de 3ºC por encima de la temperatura de disociación del complejo de polimerasa-aptámero.