JP4435174B2 - 重亜硫酸塩処理の改良された方法 - Google Patents
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Description
本発明は、
a)核酸を含有する溶液を提供する工程、
b)亜硫酸水素グアニジニウムを提供する工程ならびにグアニジニウムおよび亜硫酸イオンを含有する溶液を調製する工程、
c)工程a)およびb)の溶液を混合する工程、
d)核酸ならびにグアニジニウムおよび亜硫酸イオンを含有する、工程c)で得られた溶液をインキュベートし、それによって核酸を脱アミノ化する工程、
e)脱アミノ化された核酸をアルカリ性条件下でインキュベートし、それによって脱アミノ化された核酸を脱スルホン化する工程、
f)脱アミノ化された核酸を単離する工程
を含む、核酸中のシトシン塩基をウラシル塩基に変換する方法に関する。
本発明は、
a)核酸を含有する、溶液、好ましくは試料を提供する工程、
b)亜硫酸水素グアニジニウムを提供する工程ならびにグアニジニウムおよび亜硫酸イオンを含有する溶液を調製する工程、
c)工程a)とb)の溶液とを、または好ましくは工程a)の試料と工程b)の溶液とを混合する工程、
d)核酸ならびにグアニジニウムおよび亜硫酸イオンを含有する工程c)で得られた溶液をインキュベートし、それによって核酸を脱アミノ化する工程、
e)脱アミノ化された核酸をアルカリ性条件下でインキュベートし、それによって脱アミノ化した核酸を脱スルホン化する工程、
f)脱アミノ化された核酸を単離する工程
を含む、核酸中のシトシン塩基をウラシル塩基に変換する方法に関する。
a)亜硫酸水素グアニジニウムを提供する工程ならびにグアニジニウムおよび亜硫酸イオンを含有する溶液を調製する工程、
b)工程a)の溶液を、核酸を含有する溶液、好ましくは試料と混合する工程、
c)核酸ならびにグアニジニウムおよび亜硫酸イオンを含有する、工程b)で得られた溶液をインキュベートし、それによって核酸を脱アミノ化する工程、
d)脱アミノ化された核酸をアルカリ性条件下でインキュベートし、それによって脱アミノ化された核酸を脱スルホン化する工程、
e)脱アミノ化された核酸を単離する工程
を含む方法が提供される。
1 亜硫酸水素グアニジニウムの生成
130 g(722 mmol)のグアニジン・炭酸塩(Fluka 50930)を、室温で700 mlの水に溶解させた。pH2〜3が測定されるまで数時間、SO2の流れをこの溶液にバブリングした。黄色の溶液を凍結乾燥した。無色の産物の収量は184 gであった。
2.1.1 実験計画:
2つのオリゴヌクレオチドから形成された二本鎖核酸(「GSTP1 ds」)を、種々のモル濃度で、二亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素グアニジニウムで処理する。この手順の後、GSTP1 dsを脱スルホン化および脱塩する。精製されたGSTP1 dsをHPLCによって解析する(図2〜4参照)。二本鎖核酸(「GSTP1 ds」)を形成している2つのオリゴヌクレオチドは以下に記載されており、配列番号:1および2の配列を有する。
2.1.2.1 オリゴヌクレオチド
オリゴ1:5’-GGG ACT CCA GGG CGC CCC TC-3’(配列番号:1)
分子量=6079,97 Da
1OD=5,04 nmol
オリゴ2:5'-GAG GGG CGC CCT GGA GTC CC-3’(配列番号:2)
分子量=6159,99 Da
1OD=4,83 nmol
5 nmol(分子量12239.96 Da)のGSTP1 dsを、200μlの重亜硫酸塩試薬(1〜2 M、pH 5.5)と混合し、数分間(30分〜60分)、80℃でインキュベートする。
5 nmol(分子量12239.96 Da)のGSTP1 dsを200 ulの重亜硫酸塩試薬(1〜2 M、pH 5.5)と混合し、数分間(30分〜60分)、80℃でインキュベートする。
200μlの脱アミノ化GSTP1 dsを、500μlの2 N KOHと混合し、30分室温で放置する。その後、Sephadex G-25M(Pharmacia、コード番号17-0851-01、ロット番号QG 11018、ベッド容積9 ml)上で、水でゲル濾過を行う。溶媒を除去し、残渣を200μlの水に溶解する。40μlをHPLCに用いる。
カラム:プレカラムを有するDionex DNAPac PA-100SEL、4x250mm
製品番号SP3816 通し番号0440
溶媒A:0.01 M NaOH中に0.2 M NaCl
溶媒B:0.01 M NaOH中に1 M NaCl
勾配: 0分:50% A/50% B
25分:100% B、1 ml/分
全般
重亜硫酸塩反応が作用し、非メチル化シトシンをウラシルに変換したという事実は、非メチル化シトシンがウラシルに変換された、すなわちプライマー中の塩基アデニンが非メチル化シトシンからの重亜硫酸塩反応の産物であるウラシルの反対側にある核酸配列の領域に特異的なプライマーが用いられるポリメラーゼ連鎖反応によって証明され得る。不完全な変換の場合、プライマー中のアデニン塩基に対応しないシトシンがあることになるので、プライマーはこの領域にハイブリダイズすることができないであろう。これは、PCR産物が得られないという効果を有するであろう。
以下の実験は、LightCycler(登録商標)装置上での記載されたPCRが、重亜硫酸塩処理DNAについての評価ツールとして用いられ得ることを証明する。これは、設計されたプライマー/プローブの組み合わせが、重亜硫酸塩処理後のDNAでのみ陽性の結果をもたらすことを示す。重亜硫酸塩処理DNA(この場合重亜硫酸塩DNAは、実施例2に記載されるプロトコールに従って処理された)および未処理DNAは、同じ鋳型濃度(1回のPCRあたり20ngおよび1ng)を用いて、並行して増幅された。LightCycler(登録商標)装置上でのPCR解析
LCファストスタートDNAマスターハイブリダイゼーションプローブ1x、2mM MgCl2、順方向プライマー0.5μM、逆方向プライマー0.5μM、ドナープローブ250nM、アクセプタープローブ250nM、鋳型10μl、総PCR体積20μl。
変性10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
65℃/10秒−シグナル取得
72℃/10秒 ランプタイム20℃/秒
実験計画:
メチル化DNAを非メチル化DNAにスパイクし、変性させ、次に並行して重亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素グアニジニウムで処理する。その後、該DNAを磁性ガラス粒子を用いて脱塩し、脱スルホン化し、再度脱塩する。精製したDNAは重亜硫酸塩処理されたメチル化DNAだけを検出するリアルタイム速度論的PCRプロトコルを用いて分析する。
100μlのメチル化DNA(Serologicals Corporation, Norcross, GA, USA; Cat S7821)希釈液(50 ng/アッセイを1000ngのhDNAバックグラウンドにスパイク, Rocheカタログ1691112; 1つの方法につき5回反復)と11μlの2M NaOHを混合し、37℃で10分間インキュベートする。
111μlの変性したDNAを200μlの重亜硫酸塩試薬(2.5M重亜硫酸ナトリウム=5M亜硫酸塩溶液、125 mMヒドロキノン、pH5.5)と混合し、80℃で2時間インキュベートする。
111μlの変性したDNAを200μlの重亜硫酸塩試薬(5M亜硫酸水素グアニジニウム、pH5.5)と混合し、80℃で2時間インキュベートする。
311μlの脱アミノ化したDNAを600μlの結合バッファー(MagNAPure DNA単離キットI Rocheカタログ番号 3 003 990)および75μlの磁性ガラス粒子溶液(MagNAPure DNA単離キットI)と混合し、15分/室温で、継続的に混合しながらインキュベートする。その後、磁性ガラス粒子を1 mlの70%エタノールで3回洗浄する。結合遊離分離を磁気分離器(Rocheカタログ1641794)で行う。その後、250μlの90% EtOH/20mM NaOHをMGPに結合したDNAに加えることにより、脱スルホン化が起こる;混合物は10分間室温で混合しながらインキュベートする。その後MGPを90%エタノールで2回洗浄する。エタノール残部を除去するために、MGPをサーモミキサーで、ふたを開けて、15分/60℃で加熱する。その後、DNAを50μlの10mM Tris/0.1mM EDTA pH7.5(15分/60℃)で溶出する。10μlの溶出したDNAを、次のPCR分析に用いる。
4.1.5 マスターミックスの組成
LightCycler(登録商標)ファストスタートDNAマスターハイブリダイゼーションプローブ 1x(Roche 2239272)、3 mM MgCl2、順方向プライマー0.4μM、逆方向プライマー0.4μM、ドナープローブ200 nM、アクセプタープローブ200 nM、鋳型10μl、総PCR容積20μl。
変性 10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
62℃/10秒−シグナル取得
72℃/10秒 ランプタイム20℃/秒
実験計画:
メチル化DNAを非メチル化DNAにスパイクし、変性させ、または変性させず、次に並行して重亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素グアニジニウムで処理する。その後、該DNAを磁性ガラス粒子を用いて脱塩し、脱スルホン化し、再度脱塩する。精製したDNAは重亜硫酸塩処理されたメチル化DNAだけを検出するリアルタイム速度論的PCRプロトコルを用いて分析する。
100μlのメチル化DNA(Serologicals Corporation, Norcross, GA, USA; Cat S7821)希釈液(50 ng/アッセイを1000ngのhDNAバックグラウンドにスパイク, Rocheカタログ1691112; 1つの方法につき4回反復)と11μlの2M NaOHを混合し、37℃で10分間インキュベートする。
111μlの変性したDNA、または100μlの変性していないDNAを200μlの重亜硫酸塩試薬(2.5M重亜硫酸ナトリウム、125 mMヒドロキノン、pH5.5)と混合し、80℃で2時間インキュベートする。
111μlの変性したDNA、または100μlの変性していないDNAを200μlの重亜硫酸塩試薬(5M亜硫酸水素グアニジニウム、pH5.5)と混合し、80℃で2時間インキュベートする。
311μlの脱アミノ化したDNAを600μlの結合バッファー(MagNAPure DNA単離キットI、Rocheカタログ番号 3 003 990)および75μlの磁性ガラス粒子溶液(MagNAPure DNA単離キットI)と混合し、15分/室温で、継続的に混合しながらインキュベートする。その後、磁性ガラス粒子を1 mlの70%エタノールで3回洗浄する。結合遊離分離を磁気分離器(Rocheカタログ1641794)で行う。その後、250μlの90% EtOH/20mM NaOHをMGPに結合したDNAに加えることにより、脱スルホン化が起こる;混合物は10分間室温で混合しながらインキュベートする。その後MGPを90%エタノールで2回洗浄する。残留エタノールを除去するために、MGPをサーモミキサーで、ふたを開けて、15分/60℃で加熱する。その後、DNAを50μlの10mM Tris/0.1mM EDTA pH7.5(15分/60℃)で溶出する。10μlの溶出したDNAを、次のPCR分析に用いる。
5.1.5 マスターミックスの組成
LightCycler(登録商標)ファストスタートDNAマスターハイブリダイゼーションプローブ 1x(Roche 2239272)、3 mM MgCl2、順方向プライマー0.4μM、逆方向プライマー0.4μM、ドナープローブ200 nM、アクセプタープローブ200 nM、鋳型10μl、総PCR容積20μl。
変性 10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
62℃/10秒−シグナル取得
72℃/10秒 ランプタイム20℃/秒
実験計画:
メチル化DNAを非メチル化DNAにスパイクし、変性させ、次に並行して二亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素グアニジニウムで種々のモル濃度で処理する。その後、該DNAを磁性ガラス粒子を用いて脱塩し、脱スルホン化し、再度脱塩する。精製したDNAは重亜硫酸塩処理されたメチル化DNAだけを検出するリアルタイム速度論的PCRプロトコルを用いて分析する。
100μlのメチル化DNA(Serologicals Corporation, Norcross, GA, USA; Cat S7821)希釈液(50 ng/アッセイを1000ngのhDNAバックグラウンドにスパイク, Rocheカタログ1691112; 1つの方法につき4回反復)と11μlの2M NaOHを混合し、37℃で10分間インキュベートする。
111μlの変性したDNA、または100μlの変性していないDNAを200μlの重亜硫酸塩試薬(2.5M−1.5M−0.5M二亜硫酸ナトリウム、125 mMヒドロキノン、pH5.5)と混合し、80℃で2時間インキュベートする。(注釈:2.5Mの二亜硫酸ナトリウムの溶液は亜硫酸イオンに関しては5Mである)
111μlの変性したDNA、または100μlの変性していないDNAを200μlの重亜硫酸塩試薬(5M−3M−1M亜硫酸水素グアニジニウム、pH5.5)と混合し、80℃で2時間インキュベートする。
311μlの脱アミノ化したDNAを600μlの結合バッファー(MagNAPure DNA単離キットI、Rocheカタログ番号 3 003 990)および75μlの磁性ガラス粒子溶液(MagNAPure DNA単離キットI)と混合し、15分/室温で、継続的に混合しながらインキュベートする。その後、磁性ガラス粒子を1 mlの70%エタノールで3回洗浄する。結合遊離分離を磁気分離器(Rocheカタログ1641794)で行う。その後、250μlの90% EtOH/20mM NaOHをMGPに結合したDNAに加えることにより、脱スルホン化が起こる;混合物は10分間室温で混合しながらインキュベートする。その後MGPを90%エタノールで2回洗浄する。エタノール残部を除去するために、MGPをサーモミキサーで、ふたを開けて、15分/60℃で加熱した。その後、DNAを50μlの10mM Tris/0.1mM EDTA pH7.5(15分/60℃)で溶出する。10μlの溶出したDNAを、次のPCR分析に用いる。
6.1.5 マスターミックスの組成
LightCycler(登録商標)ファストスタートDNAマスターハイブリダイゼーションプローブ 1x(Roche 2239272)、3 mM MgCl2、順方向プライマー0.4μM、逆方向プライマー0.4μM、ドナープローブ200 nM、アクセプタープローブ200 nM、鋳型10μl、総PCR容積20μl。
変性 10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
62℃/10秒−シグナル取得
72℃/10秒 ランプタイム20℃/秒
実験計画
メチル化DNAを非メチル化DNAにスパイクし、溶液中で変性させ、シリカ固相(カラム)に移す(transferre)。脱アミノ化を並行して二亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素グアニジニウムで行う。その後、該DNAを脱塩し、脱スルホン化し、再度脱塩する。精製したDNAは重亜硫酸塩処理されたメチル化DNAだけを検出するリアルタイム速度論的PCRプロトコルを用いて分析する。
100μlのメチル化DNA(Serologicals Corporation, Norcross, GA, USA; Cat S7821)希釈液(50 ng/アッセイを1000ngのhDNAバックグラウンドにスパイク, Rocheカタログ1691112; 1つの方法につき3回反復)と11μlの2M NaOHを混合し、37℃で15分間インキュベートする。
111μlの変性したDNAを300μlの重亜硫酸塩試薬(2.5M重亜硫酸ナトリウム=溶液内で5Mの亜硫酸塩、pH5.5)および100μlのエタノールと混合し、シリカカラム(ハイピュアテンプレートプレパレーションキットより, Roche, 1796828)に載せる;インキュベーションは50℃で一晩とする。
111μlの変性したDNAを300μlの重亜硫酸塩試薬(5M亜硫酸水素グアニジニウム、pH5.5)および100μlのエタノールと混合し、シリカカラム(ハイピュアテンプレートプレパレーションキットより, Roche, 1796828)に載せる;インキュベーションは50℃で一晩とする。
一晩のインキュベーションの後、カラムを1分/8000rpmで遠心分離し(Eppendorf卓上遠心機)、500μlの70%エタノールで2回洗浄する。500μlの試薬(38% エタノール/100mM EDTA/200mM NaOH)を加え、インキュベーションを20分間、室温で行うことにより、脱スルホン化を行う。短時間遠心分離した後、カラムをそれぞれ500μlの90%エタノールで2回洗浄する。全てのエタノールを除去するために、カラムを20秒間14000rpmで遠心分離する。100μlの前もって加温した(70℃)PCRグレードの水を加えることにより、結合したDNAを溶出する。カラムを再度遠心分離し、上清を次のPCR分析に用いる。
7.1.5 マスターミックスの組成
LightCycler(登録商標)ファストスタートDNAマスターハイブリダイゼーションプローブ 1x(Roche 2239272)、3 mM MgCl2、順方向プライマー0.4μM、逆方向プライマー0.4μM、ドナープローブ200 nM、アクセプタープローブ200 nM、鋳型10μl、総PCR容積20μl。
変性 10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
62℃/10秒−シグナル取得
72℃/10秒 ランプタイム20℃/秒
実験計画
臨床試料をDNAの前精製なしで、直接重亜硫酸塩試薬(亜硫酸水素グアニジニウムまたは重亜硫酸ナトリウム)と接触させる。インキュベーションの後、変換されたDNAの処理をいつもどおり磁性ガラス粒子を用いて行なう。精製したDNAは重亜硫酸塩処理されたDNAだけを検出するリアルタイム速度論的PCRプロトコルを用いて分析する。
200μlの通常のヒト血清または0.2μgのヌクレオソームDNAでスパイクした通常のヒト血清(それぞれ3回反復)を50μlのプロテイナーゼK(Roche)および600μlのBIS試薬(6M亜硫酸水素グアニジニウムまたは5M重亜硫酸ナトリウムのいずれか)と混合する;pHを5M NaOHで5.5に調節する。ついで混合物をサーモミキサーで2時間、80℃でインキュベートする。
その後6mgの磁性ガラス粒子((MagNAPure DNA単離キットI Rocheカタログ番号 3 003 990)の入った600μlのイソプロパノールを加え、溶液を完全に混合し、15分/室温で継続的に混合しながらインキュベートする。その後、磁性ガラス粒子を1mlの70%エタノールで3回洗浄する。結合遊離分離を磁気分離器(Rocheカタログ1641794)で行う。その後、250μlの90% EtOH/20mM NaOHをMGPに結合したDNAに加えることにより、脱スルホン化が起こる;混合物は10分間室温で混合しながらインキュベートする。その後MGPを90%エタノールで2回洗浄する。エタノール残部を除去するために、MGPをサーモミキサーで、ふたを開けて、15分/60℃で加熱した。その後、DNAを50μlの10mM Tris/0.1mM EDTA pH7.5で溶出する(15分/60℃)。10μlの溶出したDNAを、次のPCR分析に用いる。
8.1.3 マスターミックスの組成
LightCycler(登録商標)ファストスタートDNAマスターハイブリダイゼーションプローブ 1x(Roche 2239272)、2 mM MgCl2、順方向プライマー0.5μM、逆方向プライマー0.5μM、ドナープローブ300 nM、アクセプタープローブ300 nM、鋳型10μl、総PCR容積20μl。
変性 10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
62℃/10秒−シグナル取得
72℃/10秒 ランプタイム20℃/秒
実験計画
50ngのヒトゲノムDNA Roche 1691112を200μlの通常の、陰性の(negative)血清にスパイクする。ついでハイピュアテンプレートプレパレーションキット(Roche 1796828)を用い、推奨された結合バッファーか、または結合バッファーとして5M亜硫酸水素グアニジニウム(pH5.5)もしくは5M重亜硫酸ナトリウム(pH5.5)のいずれかでDNAを単離する(それぞれ3回反復)。ついで精製したDNAをβグロビンDNAを検出するLCコントロールキット(Roche 2015102)を用い、リアルタイム速度論的PCRにて定量する。
Claims (12)
- a)核酸を含有する溶液を提供する工程、
b)亜硫酸水素グアニジニウムを提供する工程ならびにグアニジニウムイオンおよび亜硫酸イオンを含有する溶液を調製する工程、
c)工程a)およびb)の溶液を混合する工程、
d)核酸ならびにグアニジニウムイオンおよび亜硫酸イオンを含有する工程c)で得られた溶液をインキュベートし、それによって核酸を脱アミノ化する工程、
e)脱アミノ化された核酸をアルカリ性条件下でインキュベートし、それによって脱アミノ化した核酸を脱スルホン化する工程、
f)脱アミノ化された核酸を単離する工程
を含む、核酸中のシトシン塩基をウラシル塩基に変換する方法。 - グアニジニウムイオンおよび亜硫酸イオンの濃度が0.1〜8 M、好ましくは2〜8 Mであることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 工程b)およびc)における溶液のpHが酸性の範囲、好ましくは4.5〜6.5であることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
- 工程d)およびe)におけるインキュベーション温度が0℃〜90℃、好ましくは18℃〜90℃であることを特徴とする、請求項1〜3いずれか記載の方法。
- 工程d)におけるインキュベーション時間が30分〜48時間、好ましくは24時間であることを特徴とする、請求項1〜4いずれか記載の方法。
- 工程e)が、アルカリ性溶液または緩衝液、好ましくは、水酸化物、好ましくは水酸化ナトリウムを含有する溶液、またはエタノール、塩化ナトリウムおよび水酸化ナトリウムを含有する溶液、好ましくは38%(容積/容積)エタノール、100 mM NaCl、200 mM NaOHを含有する溶液を加えることによって行われることを特徴とする、請求項1〜5いずれか記載の方法。
- 工程e)におけるインキュベーション温度が0℃〜90℃、好ましくは18℃〜90℃であることを特徴とする、請求項1〜6いずれか記載の方法。
- 工程e)におけるインキュベーション時間が5分〜60分であることを特徴とする、請求項1〜7いずれか記載の方法。
- 核酸中のシトシン塩基がウラシル塩基に変換される反応を行なうための亜硫酸水素グアニジニウムの使用。
- グアニジニウムイオンおよび亜硫酸イオンを含有する溶液を調製するための、亜硫酸水素グアニジニウムの使用であって、該溶液が核酸中のシトシン塩基をウラシル塩基に変換するために用いられる、使用。
- 核酸中のシトシン塩基がウラシル塩基に変換される反応を行なうための、亜硫酸水素グアニジニウムおよびプラスチック容器を含むキット。
- 重亜硫酸イオン存在下で核酸中のシトシン塩基がウラシル塩基に変換される反応のための、請求項11記載のキットの使用。
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