JP2007512031A - 重亜硫酸塩処理の改良された方法 - Google Patents
重亜硫酸塩処理の改良された方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007512031A JP2007512031A JP2006541879A JP2006541879A JP2007512031A JP 2007512031 A JP2007512031 A JP 2007512031A JP 2006541879 A JP2006541879 A JP 2006541879A JP 2006541879 A JP2006541879 A JP 2006541879A JP 2007512031 A JP2007512031 A JP 2007512031A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- dna
- guanidinium
- bisulfite
- hydrogen sulfite
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Description
本発明は、
a)核酸を含有する溶液を提供する工程、
b)亜硫酸水素グアニジニウムを提供する工程ならびにグアニジニウムおよび亜硫酸イオンを含有する溶液を調製する工程、
c)工程a)およびb)の溶液を混合する工程、
d)核酸ならびにグアニジニウムおよび亜硫酸イオンを含有する、工程c)で得られた溶液をインキュベートし、それによって核酸を脱アミノ化する工程、
e)脱アミノ化された核酸をアルカリ性条件下でインキュベートし、それによって脱アミノ化された核酸を脱スルホン化する工程、
f)脱アミノ化された核酸を単離する工程
を含む、核酸中のシトシン塩基をウラシル塩基に変換する方法に関する。
本発明は、
a)核酸を含有する、溶液、好ましくは試料を提供する工程、
b)亜硫酸水素グアニジニウムを提供する工程ならびにグアニジニウムおよび亜硫酸イオンを含有する溶液を調製する工程、
c)工程a)とb)の溶液とを、または好ましくは工程a)の試料と工程b)の溶液とを混合する工程、
d)核酸ならびにグアニジニウムおよび亜硫酸イオンを含有する工程c)で得られた溶液をインキュベートし、それによって核酸を脱アミノ化する工程、
e)脱アミノ化された核酸をアルカリ性条件下でインキュベートし、それによって脱アミノ化した核酸を脱スルホン化する工程、
f)脱アミノ化された核酸を単離する工程
を含む、核酸中のシトシン塩基をウラシル塩基に変換する方法に関する。
a)亜硫酸水素グアニジニウムを提供する工程ならびにグアニジニウムおよび亜硫酸イオンを含有する溶液を調製する工程、
b)工程a)の溶液を、核酸を含有する溶液、好ましくは試料と混合する工程、
c)核酸ならびにグアニジニウムおよび亜硫酸イオンを含有する、工程b)で得られた溶液をインキュベートし、それによって核酸を脱アミノ化する工程、
d)脱アミノ化された核酸をアルカリ性条件下でインキュベートし、それによって脱アミノ化された核酸を脱スルホン化する工程、
e)脱アミノ化された核酸を単離する工程
を含む方法が提供される。
1 亜硫酸水素グアニジニウムの生成
130 g(722 mmol)のグアニジン・炭酸塩(Fluka 50930)を、室温で700 mlの水に溶解させた。pH2〜3が測定されるまで数時間、SO2の流れをこの溶液にバブリングした。黄色の溶液を凍結乾燥した。無色の産物の収量は184 gであった。
2.1.1 実験計画:
2つのオリゴヌクレオチドから形成された二本鎖核酸(「GSTP1 ds」)を、種々のモル濃度で、二亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素グアニジニウムで処理する。この手順の後、GSTP1 dsを脱スルホン化および脱塩する。精製されたGSTP1 dsをHPLCによって解析する(図2〜4参照)。二本鎖核酸(「GSTP1 ds」)を形成している2つのオリゴヌクレオチドは以下に記載されており、配列番号:1および2の配列を有する。
2.1.2.1 オリゴヌクレオチド
オリゴ1:5’-GGG ACT CCA GGG CGC CCC TC-3’(配列番号:1)
分子量=6079,97 Da
1OD=5,04 nmol
オリゴ2:5'-GAG GGG CGC CCT GGA GTC CC-3’(配列番号:2)
分子量=6159,99 Da
1OD=4,83 nmol
5 nmol(分子量12239.96 Da)のGSTP1 dsを、200μlの重亜硫酸塩試薬(1〜2 M、pH 5.5)と混合し、数分間(30分〜60分)、80℃でインキュベートする。
5 nmol(分子量12239.96 Da)のGSTP1 dsを200 ulの重亜硫酸塩試薬(1〜2 M、pH 5.5)と混合し、数分間(30分〜60分)、80℃でインキュベートする。
200μlの脱アミノ化GSTP1 dsを、500μlの2 N KOHと混合し、30分室温で放置する。その後、Sephadex G-25M(Pharmacia、コード番号17-0851-01、ロット番号QG 11018、ベッド容積9 ml)上で、水でゲル濾過を行う。溶媒を除去し、残渣を200μlの水に溶解する。40μlをHPLCに用いる。
カラム:プレカラムを有するDionex DNAPac PA-100SEL、4x250mm
製品番号SP3816 通し番号0440
溶媒A:0.01 M NaOH中に0.2 M NaCl
溶媒B:0.01 M NaOH中に1 M NaCl
勾配: 0分:50% A/50% B
25分:100% B、1 ml/分
全般
重亜硫酸塩反応が作用し、非メチル化シトシンをウラシルに変換したという事実は、非メチル化シトシンがウラシルに変換された、すなわちプライマー中の塩基アデニンが非メチル化シトシンからの重亜硫酸塩反応の産物であるウラシルの反対側にある核酸配列の領域に特異的なプライマーが用いられるポリメラーゼ連鎖反応によって証明され得る。不完全な変換の場合、プライマー中のアデニン塩基に対応しないシトシンがあることになるので、プライマーはこの領域にハイブリダイズすることができないであろう。これは、PCR産物が得られないという効果を有するであろう。
以下の実験は、LightCycler(登録商標)装置上での記載されたPCRが、重亜硫酸塩処理DNAについての評価ツールとして用いられ得ることを証明する。これは、設計されたプライマー/プローブの組み合わせが、重亜硫酸塩処理後のDNAでのみ陽性の結果をもたらすことを示す。重亜硫酸塩処理DNA(この場合重亜硫酸塩DNAは、実施例2に記載されるプロトコールに従って処理された)および未処理DNAは、同じ鋳型濃度(1回のPCRあたり20ngおよび1ng)を用いて、並行して増幅された。LightCycler(登録商標)装置上でのPCR解析
LCファストスタートDNAマスターハイブリダイゼーションプローブ1x、2mM MgCl2、順方向プライマー0.5μM、逆方向プライマー0.5μM、ドナープローブ250nM、アクセプタープローブ250nM、鋳型10μl、総PCR体積20μl。
変性10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
65℃/10秒−シグナル取得
72℃/10秒 ランプタイム20℃/秒
実験計画:
メチル化DNAを非メチル化DNAにスパイクし、変性させ、次に並行して重亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素グアニジニウムで処理する。その後、該DNAを磁性ガラス粒子を用いて脱塩し、脱スルホン化し、再度脱塩する。精製したDNAは重亜硫酸塩処理されたメチル化DNAだけを検出するリアルタイム速度論的PCRプロトコルを用いて分析する。
100μlのメチル化DNA(Serologicals Corporation, Norcross, GA, USA; Cat S7821)希釈液(50 ng/アッセイを1000ngのhDNAバックグラウンドにスパイク, Rocheカタログ1691112; 1つの方法につき5回反復)と11μlの2M NaOHを混合し、37℃で10分間インキュベートする。
111μlの変性したDNAを200μlの重亜硫酸塩試薬(2.5M重亜硫酸ナトリウム=5M亜硫酸塩溶液、125 mMヒドロキノン、pH5.5)と混合し、80℃で2時間インキュベートする。
111μlの変性したDNAを200μlの重亜硫酸塩試薬(5M亜硫酸水素グアニジニウム、pH5.5)と混合し、80℃で2時間インキュベートする。
311μlの脱アミノ化したDNAを600μlの結合バッファー(MagNAPure DNA単離キットI Rocheカタログ番号 3 003 990)および75μlの磁性ガラス粒子溶液(MagNAPure DNA単離キットI)と混合し、15分/室温で、継続的に混合しながらインキュベートする。その後、磁性ガラス粒子を1 mlの70%エタノールで3回洗浄する。結合遊離分離を磁気分離器(Rocheカタログ1641794)で行う。その後、250μlの90% EtOH/20mM NaOHをMGPに結合したDNAに加えることにより、脱スルホン化が起こる;混合物は10分間室温で混合しながらインキュベートする。その後MGPを90%エタノールで2回洗浄する。エタノール残部を除去するために、MGPをサーモミキサーで、ふたを開けて、15分/60℃で加熱する。その後、DNAを50μlの10mM Tris/0.1mM EDTA pH7.5(15分/60℃)で溶出する。10μlの溶出したDNAを、次のPCR分析に用いる。
4.1.5 マスターミックスの組成
LightCycler(登録商標)ファストスタートDNAマスターハイブリダイゼーションプローブ 1x(Roche 2239272)、3 mM MgCl2、順方向プライマー0.4μM、逆方向プライマー0.4μM、ドナープローブ200 nM、アクセプタープローブ200 nM、鋳型10μl、総PCR容積20μl。
変性 10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
62℃/10秒−シグナル取得
72℃/10秒 ランプタイム20℃/秒
実験計画:
メチル化DNAを非メチル化DNAにスパイクし、変性させ、または変性させず、次に並行して重亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素グアニジニウムで処理する。その後、該DNAを磁性ガラス粒子を用いて脱塩し、脱スルホン化し、再度脱塩する。精製したDNAは重亜硫酸塩処理されたメチル化DNAだけを検出するリアルタイム速度論的PCRプロトコルを用いて分析する。
100μlのメチル化DNA(Serologicals Corporation, Norcross, GA, USA; Cat S7821)希釈液(50 ng/アッセイを1000ngのhDNAバックグラウンドにスパイク, Rocheカタログ1691112; 1つの方法につき4回反復)と11μlの2M NaOHを混合し、37℃で10分間インキュベートする。
111μlの変性したDNA、または100μlの変性していないDNAを200μlの重亜硫酸塩試薬(2.5M重亜硫酸ナトリウム、125 mMヒドロキノン、pH5.5)と混合し、80℃で2時間インキュベートする。
111μlの変性したDNA、または100μlの変性していないDNAを200μlの重亜硫酸塩試薬(5M亜硫酸水素グアニジニウム、pH5.5)と混合し、80℃で2時間インキュベートする。
311μlの脱アミノ化したDNAを600μlの結合バッファー(MagNAPure DNA単離キットI、Rocheカタログ番号 3 003 990)および75μlの磁性ガラス粒子溶液(MagNAPure DNA単離キットI)と混合し、15分/室温で、継続的に混合しながらインキュベートする。その後、磁性ガラス粒子を1 mlの70%エタノールで3回洗浄する。結合遊離分離を磁気分離器(Rocheカタログ1641794)で行う。その後、250μlの90% EtOH/20mM NaOHをMGPに結合したDNAに加えることにより、脱スルホン化が起こる;混合物は10分間室温で混合しながらインキュベートする。その後MGPを90%エタノールで2回洗浄する。残留エタノールを除去するために、MGPをサーモミキサーで、ふたを開けて、15分/60℃で加熱する。その後、DNAを50μlの10mM Tris/0.1mM EDTA pH7.5(15分/60℃)で溶出する。10μlの溶出したDNAを、次のPCR分析に用いる。
5.1.5 マスターミックスの組成
LightCycler(登録商標)ファストスタートDNAマスターハイブリダイゼーションプローブ 1x(Roche 2239272)、3 mM MgCl2、順方向プライマー0.4μM、逆方向プライマー0.4μM、ドナープローブ200 nM、アクセプタープローブ200 nM、鋳型10μl、総PCR容積20μl。
変性 10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
62℃/10秒−シグナル取得
72℃/10秒 ランプタイム20℃/秒
実験計画:
メチル化DNAを非メチル化DNAにスパイクし、変性させ、次に並行して二亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素グアニジニウムで種々のモル濃度で処理する。その後、該DNAを磁性ガラス粒子を用いて脱塩し、脱スルホン化し、再度脱塩する。精製したDNAは重亜硫酸塩処理されたメチル化DNAだけを検出するリアルタイム速度論的PCRプロトコルを用いて分析する。
100μlのメチル化DNA(Serologicals Corporation, Norcross, GA, USA; Cat S7821)希釈液(50 ng/アッセイを1000ngのhDNAバックグラウンドにスパイク, Rocheカタログ1691112; 1つの方法につき4回反復)と11μlの2M NaOHを混合し、37℃で10分間インキュベートする。
111μlの変性したDNA、または100μlの変性していないDNAを200μlの重亜硫酸塩試薬(2.5M−1.5M−0.5M二亜硫酸ナトリウム、125 mMヒドロキノン、pH5.5)と混合し、80℃で2時間インキュベートする。(注釈:2.5Mの二亜硫酸ナトリウムの溶液は亜硫酸イオンに関しては5Mである)
111μlの変性したDNA、または100μlの変性していないDNAを200μlの重亜硫酸塩試薬(5M−3M−1M亜硫酸水素グアニジニウム、pH5.5)と混合し、80℃で2時間インキュベートする。
311μlの脱アミノ化したDNAを600μlの結合バッファー(MagNAPure DNA単離キットI、Rocheカタログ番号 3 003 990)および75μlの磁性ガラス粒子溶液(MagNAPure DNA単離キットI)と混合し、15分/室温で、継続的に混合しながらインキュベートする。その後、磁性ガラス粒子を1 mlの70%エタノールで3回洗浄する。結合遊離分離を磁気分離器(Rocheカタログ1641794)で行う。その後、250μlの90% EtOH/20mM NaOHをMGPに結合したDNAに加えることにより、脱スルホン化が起こる;混合物は10分間室温で混合しながらインキュベートする。その後MGPを90%エタノールで2回洗浄する。エタノール残部を除去するために、MGPをサーモミキサーで、ふたを開けて、15分/60℃で加熱した。その後、DNAを50μlの10mM Tris/0.1mM EDTA pH7.5(15分/60℃)で溶出する。10μlの溶出したDNAを、次のPCR分析に用いる。
6.1.5 マスターミックスの組成
LightCycler(登録商標)ファストスタートDNAマスターハイブリダイゼーションプローブ 1x(Roche 2239272)、3 mM MgCl2、順方向プライマー0.4μM、逆方向プライマー0.4μM、ドナープローブ200 nM、アクセプタープローブ200 nM、鋳型10μl、総PCR容積20μl。
変性 10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
62℃/10秒−シグナル取得
72℃/10秒 ランプタイム20℃/秒
実験計画
メチル化DNAを非メチル化DNAにスパイクし、溶液中で変性させ、シリカ固相(カラム)に移す(transferre)。脱アミノ化を並行して二亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素グアニジニウムで行う。その後、該DNAを脱塩し、脱スルホン化し、再度脱塩する。精製したDNAは重亜硫酸塩処理されたメチル化DNAだけを検出するリアルタイム速度論的PCRプロトコルを用いて分析する。
100μlのメチル化DNA(Serologicals Corporation, Norcross, GA, USA; Cat S7821)希釈液(50 ng/アッセイを1000ngのhDNAバックグラウンドにスパイク, Rocheカタログ1691112; 1つの方法につき3回反復)と11μlの2M NaOHを混合し、37℃で15分間インキュベートする。
111μlの変性したDNAを300μlの重亜硫酸塩試薬(2.5M重亜硫酸ナトリウム=溶液内で5Mの亜硫酸塩、pH5.5)および100μlのエタノールと混合し、シリカカラム(ハイピュアテンプレートプレパレーションキットより, Roche, 1796828)に載せる;インキュベーションは50℃で一晩とする。
111μlの変性したDNAを300μlの重亜硫酸塩試薬(5M亜硫酸水素グアニジニウム、pH5.5)および100μlのエタノールと混合し、シリカカラム(ハイピュアテンプレートプレパレーションキットより, Roche, 1796828)に載せる;インキュベーションは50℃で一晩とする。
一晩のインキュベーションの後、カラムを1分/8000rpmで遠心分離し(Eppendorf卓上遠心機)、500μlの70%エタノールで2回洗浄する。500μlの試薬(38% エタノール/100mM EDTA/200mM NaOH)を加え、インキュベーションを20分間、室温で行うことにより、脱スルホン化を行う。短時間遠心分離した後、カラムをそれぞれ500μlの90%エタノールで2回洗浄する。全てのエタノールを除去するために、カラムを20秒間14000rpmで遠心分離する。100μlの前もって加温した(70℃)PCRグレードの水を加えることにより、結合したDNAを溶出する。カラムを再度遠心分離し、上清を次のPCR分析に用いる。
7.1.5 マスターミックスの組成
LightCycler(登録商標)ファストスタートDNAマスターハイブリダイゼーションプローブ 1x(Roche 2239272)、3 mM MgCl2、順方向プライマー0.4μM、逆方向プライマー0.4μM、ドナープローブ200 nM、アクセプタープローブ200 nM、鋳型10μl、総PCR容積20μl。
変性 10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
62℃/10秒−シグナル取得
72℃/10秒 ランプタイム20℃/秒
実験計画
臨床試料をDNAの前精製なしで、直接重亜硫酸塩試薬(亜硫酸水素グアニジニウムまたは重亜硫酸ナトリウム)と接触させる。インキュベーションの後、変換されたDNAの処理をいつもどおり磁性ガラス粒子を用いて行なう。精製したDNAは重亜硫酸塩処理されたDNAだけを検出するリアルタイム速度論的PCRプロトコルを用いて分析する。
200μlの通常のヒト血清または0.2μgのヌクレオソームDNAでスパイクした通常のヒト血清(それぞれ3回反復)を50μlのプロテイナーゼK(Roche)および600μlのBIS試薬(6M亜硫酸水素グアニジニウムまたは5M重亜硫酸ナトリウムのいずれか)と混合する;pHを5M NaOHで5.5に調節する。ついで混合物をサーモミキサーで2時間、80℃でインキュベートする。
その後6mgの磁性ガラス粒子((MagNAPure DNA単離キットI Rocheカタログ番号 3 003 990)の入った600μlのイソプロパノールを加え、溶液を完全に混合し、15分/室温で継続的に混合しながらインキュベートする。その後、磁性ガラス粒子を1mlの70%エタノールで3回洗浄する。結合遊離分離を磁気分離器(Rocheカタログ1641794)で行う。その後、250μlの90% EtOH/20mM NaOHをMGPに結合したDNAに加えることにより、脱スルホン化が起こる;混合物は10分間室温で混合しながらインキュベートする。その後MGPを90%エタノールで2回洗浄する。エタノール残部を除去するために、MGPをサーモミキサーで、ふたを開けて、15分/60℃で加熱した。その後、DNAを50μlの10mM Tris/0.1mM EDTA pH7.5で溶出する(15分/60℃)。10μlの溶出したDNAを、次のPCR分析に用いる。
8.1.3 マスターミックスの組成
LightCycler(登録商標)ファストスタートDNAマスターハイブリダイゼーションプローブ 1x(Roche 2239272)、2 mM MgCl2、順方向プライマー0.5μM、逆方向プライマー0.5μM、ドナープローブ300 nM、アクセプタープローブ300 nM、鋳型10μl、総PCR容積20μl。
変性 10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
62℃/10秒−シグナル取得
72℃/10秒 ランプタイム20℃/秒
実験計画
50ngのヒトゲノムDNA Roche 1691112を200μlの通常の、陰性の(negative)血清にスパイクする。ついでハイピュアテンプレートプレパレーションキット(Roche 1796828)を用い、推奨された結合バッファーか、または結合バッファーとして5M亜硫酸水素グアニジニウム(pH5.5)もしくは5M重亜硫酸ナトリウム(pH5.5)のいずれかでDNAを単離する(それぞれ3回反復)。ついで精製したDNAをβグロビンDNAを検出するLCコントロールキット(Roche 2015102)を用い、リアルタイム速度論的PCRにて定量する。
Claims (14)
- a)核酸を含有する溶液を提供する工程、
b)亜硫酸水素グアニジニウムを提供する工程ならびにグアニジニウムおよび亜硫酸イオンを含有する溶液を調製する工程、
c)工程a)およびb)の溶液を混合する工程、
d)核酸ならびにグアニジニウムおよび亜硫酸イオンを含有する工程c)で得られた溶液をインキュベートし、それによって核酸を脱アミノ化する工程、
e)脱アミノ化された核酸をアルカリ性条件下でインキュベートし、それによって脱アミノ化した核酸を脱スルホン化する工程、
f)脱アミノ化された核酸を単離する工程
を含む、核酸中のシトシン塩基をウラシル塩基に変換する方法。 - グアニジニウムイオンおよび亜硫酸イオンの濃度が0.1〜8 M、好ましくは2〜8 Mであることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 工程b)およびc)における溶液のpHが酸性の範囲、好ましくは4.5〜6.5であることを特徴とする、請求項1〜2いずれか記載の方法。
- 工程d)およびe)におけるインキュベーション温度が0℃〜90℃、好ましくは18℃〜90℃であることを特徴とする、請求項1〜3いずれか記載の方法。
- 工程d)におけるインキュベーション時間が30分〜48時間、好ましくは24時間であることを特徴とする、請求項1〜4いずれか記載の方法。
- 工程e)が、アルカリ性溶液または緩衝液、好ましくは、水酸化物、好ましくは水酸化ナトリウムを含有する溶液、またはエタノール、塩化ナトリウムおよび水酸化ナトリウムを含有する溶液、好ましくは38%(容積/容積)エタノール、100 mM NaCl、200 mM NaOHを含有する溶液を加えることによって行われることを特徴とする、請求項1〜5いずれか記載の方法。
- 工程e)におけるインキュベーション温度が0℃〜90℃、好ましくは18℃〜90℃であることを特徴とする、請求項1〜6いずれか記載の方法。
- 工程e)におけるインキュベーション時間が5分〜60分であることを特徴とする、請求項1〜7いずれか記載の方法。
- 核酸を化学的に修飾するための亜硫酸水素グアニジニウムの使用。
- 核酸中のシトシン塩基がウラシル塩基に変換される、請求項9記載の使用。
- グアニジニウムおよび亜硫酸イオンを含有する溶液を調製するための、亜硫酸水素グアニジニウムの使用。
- 該溶液が核酸中のシトシン塩基をウラシル塩基に変換するために用いられる、請求項1記載の使用。
- 亜硫酸水素グアニジニウムを含むキット。
- 重亜硫酸イオン存在下で核酸中のシトシン塩基がウラシル塩基に変換される反応のための、請求項13記載のキットの使用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP03027754 | 2003-12-02 | ||
PCT/EP2004/013627 WO2005054502A1 (en) | 2003-12-02 | 2004-12-01 | Improved method for bisulfite treatment |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007512031A true JP2007512031A (ja) | 2007-05-17 |
JP4435174B2 JP4435174B2 (ja) | 2010-03-17 |
Family
ID=34639272
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006541879A Expired - Fee Related JP4435174B2 (ja) | 2003-12-02 | 2004-12-01 | 重亜硫酸塩処理の改良された方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7501240B2 (ja) |
EP (1) | EP1692315A1 (ja) |
JP (1) | JP4435174B2 (ja) |
CA (1) | CA2547743C (ja) |
WO (1) | WO2005054502A1 (ja) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9394332B2 (en) * | 2002-08-29 | 2016-07-19 | Epigenomics Ag | Method for bisulfite treatment |
EP1641936B1 (en) * | 2003-06-17 | 2010-08-04 | Human Genetic Signatures PTY Ltd. | Methods for genome amplification |
DE602004018801D1 (de) * | 2003-09-04 | 2009-02-12 | Human Genetic Signatures Pty | Nukleinsäurenachweistest |
JP4435174B2 (ja) | 2003-12-02 | 2010-03-17 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 重亜硫酸塩処理の改良された方法 |
US8168777B2 (en) | 2004-04-29 | 2012-05-01 | Human Genetic Signatures Pty. Ltd. | Bisulphite reagent treatment of nucleic acid |
DK1794173T3 (da) * | 2004-09-10 | 2010-10-25 | Human Genetic Signatures Pty | Amplifikationsblokker indeholdende interkalaterende nukleinsyrer (INA) indeholdende interkalaterende pseudonukleotider (IPN) |
EP1828411B1 (en) * | 2004-12-03 | 2012-11-07 | Human Genetic Signatures PTY Ltd | Methods for simplifying microbial nucleic acids by chemical modification of cytosines |
JP2008524990A (ja) * | 2004-12-23 | 2008-07-17 | ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド | ヒトパピローマウイルスの検出 |
CN101203618B (zh) * | 2005-05-26 | 2013-03-13 | 人类遗传标记控股有限公司 | 使用含有非常规碱基的引物的等温链置换扩增 |
CA2621932A1 (en) * | 2005-09-14 | 2007-03-22 | Human Genetic Signatures Pty Ltd | Assay for hpv and methylated genomic dna targets to screen for cervical cancer |
EP1963352B1 (en) * | 2005-12-14 | 2010-09-08 | Roche Diagnostics GmbH | New method for bisulfite treatment |
WO2007123553A1 (en) * | 2006-04-24 | 2007-11-01 | Xiyu Jia | Methods for detection of methylated dna |
US20080050738A1 (en) * | 2006-05-31 | 2008-02-28 | Human Genetic Signatures Pty Ltd. | Detection of target nucleic acid |
JP2008212009A (ja) * | 2007-02-28 | 2008-09-18 | Sysmex Corp | Dnaメチル化検出用試料の調製方法 |
JP2010521142A (ja) * | 2007-03-16 | 2010-06-24 | ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド | 遺伝子発現アッセイ |
WO2009067743A1 (en) | 2007-11-27 | 2009-06-04 | Human Genetic Signatures Pty Ltd | Enzymes for amplification and copying bisulphite modified nucleic acids |
JP2011505845A (ja) * | 2007-12-20 | 2011-03-03 | ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド | 核酸増幅に伴う汚染物質の排除 |
EP2105465A1 (en) * | 2008-03-27 | 2009-09-30 | Greene, Tweed Of Delaware, Inc. | Inert Substrate-Bonded Perfluoroelastomer Components and Related Methods |
US9732375B2 (en) | 2011-09-07 | 2017-08-15 | Human Genetic Signatures Pty. Ltd. | Molecular detection assay using direct treatment with a bisulphite reagent |
EP2809811B1 (en) * | 2012-01-30 | 2018-04-11 | Exact Sciences Development Company, LLC | Modification of dna on magnetic beads |
Family Cites Families (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK171161B1 (da) | 1985-03-28 | 1996-07-08 | Hoffmann La Roche | Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
IE61148B1 (en) | 1988-03-10 | 1994-10-05 | Ici Plc | Method of detecting nucleotide sequences |
US5130238A (en) | 1988-06-24 | 1992-07-14 | Cangene Corporation | Enhanced nucleic acid amplification process |
ATE138106T1 (de) | 1988-07-20 | 1996-06-15 | David Segev | Verfahren zur amplifizierung und zum nachweis von nukleinsäuresequenzen |
AU640626B2 (en) | 1988-11-21 | 1993-09-02 | Dynal As | Nucleic acid probes |
US5639611A (en) | 1988-12-12 | 1997-06-17 | City Of Hope | Allele specific polymerase chain reaction |
US5234809A (en) | 1989-03-23 | 1993-08-10 | Akzo N.V. | Process for isolating nucleic acid |
NL8900725A (nl) | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
US5137806A (en) | 1989-12-11 | 1992-08-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the detection of sequences in selected DNA molecules |
CA2035010C (en) | 1990-01-26 | 1996-12-10 | Keith C. Backman | Method of amplifying target nucleic acids applicable to both polymerase and ligase chain reactions |
US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
US5552277A (en) | 1994-07-19 | 1996-09-03 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Genetic diagnosis of prostate cancer |
DE19520398B4 (de) | 1995-06-08 | 2009-04-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetisches Pigment |
US5786146A (en) | 1996-06-03 | 1998-07-28 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids |
US6174670B1 (en) | 1996-06-04 | 2001-01-16 | University Of Utah Research Foundation | Monitoring amplification of DNA during PCR |
DE19743518A1 (de) | 1997-10-01 | 1999-04-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Automatisierbare universell anwendbare Probenvorbereitungsmethode |
DE59912604D1 (de) | 1998-02-04 | 2005-11-03 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur isolierung und aufreinigung von nucleinsäuren |
PT1144620E (pt) | 1998-11-30 | 2004-01-30 | Roche Diagnostics Gmbh | Perticulas magneticas para a purificacao de acidos nucleicos |
SE9804469L (sv) | 1998-12-21 | 2000-06-22 | Volvo Ab | Anordning vid ett motorfordon |
US6331393B1 (en) | 1999-05-14 | 2001-12-18 | University Of Southern California | Process for high-throughput DNA methylation analysis |
CZ20021608A3 (cs) | 1999-11-17 | 2003-06-18 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetické skleněné částice, metody jejich přípravy a použití |
DE10029915B4 (de) | 2000-06-19 | 2005-06-16 | Epigenomics Ag | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen |
DE10050942B4 (de) * | 2000-10-10 | 2005-11-17 | Epigenomics Ag | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen |
EP1394172A1 (en) | 2002-08-29 | 2004-03-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Improved method for bisulfite treatment |
EP1443052A1 (en) | 2003-01-29 | 2004-08-04 | Roche Diagnostics GmbH | Improved method for bisulfite treatment of nucleic acid |
US7368239B2 (en) * | 2003-08-29 | 2008-05-06 | Applera Corporation | Method and materials for polyamine catalyzed bisulfite conversion of cytosine to uracil |
US7371526B2 (en) * | 2003-08-29 | 2008-05-13 | Applera Corporation | Method and materials for bisulfite conversion of cytosine to uracil |
JP4435174B2 (ja) | 2003-12-02 | 2010-03-17 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 重亜硫酸塩処理の改良された方法 |
-
2004
- 2004-12-01 JP JP2006541879A patent/JP4435174B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-12-01 WO PCT/EP2004/013627 patent/WO2005054502A1/en active Application Filing
- 2004-12-01 EP EP04819642A patent/EP1692315A1/en not_active Withdrawn
- 2004-12-01 CA CA2547743A patent/CA2547743C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-12-01 US US10/573,215 patent/US7501240B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4435174B2 (ja) | 2010-03-17 |
US7501240B2 (en) | 2009-03-10 |
EP1692315A1 (en) | 2006-08-23 |
CA2547743A1 (en) | 2005-06-16 |
US20070190530A1 (en) | 2007-08-16 |
CA2547743C (en) | 2011-06-28 |
WO2005054502A1 (en) | 2005-06-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4435174B2 (ja) | 重亜硫酸塩処理の改良された方法 | |
US7413855B2 (en) | Method for bisulfite treatment | |
US8137937B2 (en) | Method for bisulfite treatment | |
JP5310059B2 (ja) | 亜硫酸水素塩処理のための改善された方法 | |
JP2009022268A (ja) | 前立腺がんを検出する方法 | |
EP1764419B1 (en) | Detecting gene methylation for diagnosis of a proliferative disorder | |
JP4642078B2 (ja) | Dna汚染除去方法 | |
JP2008206511A (ja) | 前立腺癌の特徴付け | |
JP2007125014A (ja) | 遺伝子メチル化検査法対照物 | |
EP1443052A1 (en) | Improved method for bisulfite treatment of nucleic acid | |
JP2008212009A (ja) | Dnaメチル化検出用試料の調製方法 | |
JP4359497B2 (ja) | 核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット及びこれを用いた癌の検査方法 | |
JP2007259750A (ja) | Dnaのメチル化を検出するために用いられる検出用試料の調製方法、dnaのメチル化を検出する方法、試料処理液及びキット |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090501 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090722 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090729 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091029 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091209 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091222 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130108 Year of fee payment: 3 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |