DE69733282T2 - Überwachung der Hybridisierung während PCR - Google Patents

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Kirk M. Ririe
Randy P. Rasmussen
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    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Description

  • Diese Europäische Anmeldung ist eine Teilanmeldung der EP 97931089 .
  • Die Erfindung betrifft allgemein das Monitoring von Fluoreszenzsignalen, die bei einer Hybridisierung in Verbindung mit einer Polymerase-Kettenreaktion entstehen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere das Monitoring einer Hybridisierung mittels Fluoreszenz während und/oder unmittelbar nach der PCR und die Verwendung dieser Informationen zur Produktbestimmung, zum Nachweis einer Sequenzänderung und zur Quantifizierung.
  • Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist für die Molekularbiologie von grundlegender Bedeutung und stellt die erste praktische molekulare Methode für klinische Laborarbeit dar. Trotz ihrer Nützlichkeit und Beliebtheit macht man mit dem derzeitigen Verständnis der PCR keine großen Fortschritte. Geeignete Bedingungen für eine erfolgreiche Amplifikation müssen durch Ausprobieren herausgefunden werden und eine Optimierung erfolgt empirisch. Sogar Fachleute müssen eine leistungsstarke Methode verwenden, ohne die Theorie für ihren Ablauf zu verstehen oder vorhersagen zu können.
  • Die PCR erfolgt dadurch, dass eine Probe verschiedene Temperaturzyklen durchläuft, wodurch die DNA denaturiert (aufgetrennt) wird, sich spezifische Primer anlagern (Annealing oder Assoziation) und eine Replikation erfolgt (Extension oder Verlängerung). Ein PCR-Zyklus dauert üblicherweise 2 bis 8 min, so dass eine 30 Zyklen lange Amplifikation 1 bis 4 Stunden benötigt. Das Ansprechen der Proben auf die Temperatur ist bei den meisten PCR-Geräten im Vergleich zu der für die Denaturierung, das Annealing und die Extension benötigte Zeit sehr langsam. Die physikalischen (Denaturierung und Annealing) und enzymatischen (Extension) Reaktionen bei der PCR laufen sehr schnell ab. Die Amplifikationszeiten bei der PCR können von einigen Stunden auf weniger als 15 min gesenkt werden.
  • Schnelle Thermocycling-Techniken werden durch das schnelle Ansprechen auf die Temperatur und eine Temperaturhomogenität ermöglicht, die in Probenbehältern mit hohem Verhältnis von Oberfläche/Volumen möglich sind, beispielsweise Kapillarröhrchen, Für weitere Informationen siehe auch: C.T. Wittwer, G.B. Reed und K.M. Ririe, Rapid cycle DNA amplification, in K.B. Mullis, F. Ferre und R.A. Gibbs, The polymerase chain reaction, Birkhauser, Boston, 174-181 (1994). Eine bessere Temperaturhomogenität ermöglicht, dass Zeit- und Temperaturerfordernisse der PCR besser definiert und verstanden werden können. Eine bessere Temperaturhomogenität erhöht auch die Genauigkeit jeder analytischen Methode, die zum Monitoring der PCR bei der Amplifikation verwendet wird.
  • Die Fluorimetrie ist eine empfindliche und vielseitige Methode mit vielen Anwendungsmöglichkeiten in der Molekularbiologie. Viele Jahre lang wurde Ethidiumbromid verwendet, um die Größenverteilung von durch Gelelektrophorese aufgetrennten Nukleinsäuren sichtbar zu machen. Das Gel wird gewöhnlich mit Ultraviolettlicht durchleuchtet und die rote Fluoreszenz der doppelsträngigen Nukleinsäure beobachtet. Im Einzelnen wird Ethidiumbromid gewöhnlich verwendet, um die PCR-Produkte nach Beendigung der Amplifikation zu analysieren. Die EP 0 640 828 A1 von Higuchi & Watson offenbart zudem die Verwendung von Ethidiumbromid bei der Amplifikation zum Monitoring der Menge doppelsträngiger DNA, indem die Fluoreszenz bei jedem Zyklus gemessen wird. Es wurde festgestellt, dass die Fluoreszenz umgekehrt zur Temperatur ansteigt und abfällt und bei der Annealing/Extensionstemperatur (50°C) am stärksten und bei der Denaturierungstemperatur (94°C) am schwächsten war. Die bei jedem Zyklus aufgenommene maximale Fluoreszenz diente als Maß für die DNA-Menge. Die Anmeldung von Higuchi & Watson lehrt keine Verwendung von Fluoreszenz zum Monitoring von Hybridisierungen und sie schlägt auch keine Fluoreszenzerfassung über verschiedene Temperaturen vor, um das Ausmaß der Hybridisierung zu verfolgen. Außerdem machen Higuchi & Watson keine Angaben oder Vorschläge, wie man die Temperaturabhängigkeit der Hybridisierung von PCR-Produkten ausnützen könnte, um PCR-Produkt zu identifizieren oder zu quantifizieren.
  • In der Anmeldung von Higuchi & Watson wird jedoch die Verwendung anderer Fluorophore, einschließlich zweifachmarkierter Sondensysteme, erwähnt, die Fluoreszenz erzeugen, wenn sie durch die 5'-Exonukleaseaktivität bestimmter DNA-Polymerasen hydrolysiert werden, wie in dem U.S. Patent-Nr. 5,210,015 von Gelfand et al. offenbart ist. Die bei diesen Sonden beobachtete Fluoreszenz hängt in erster Linie von der Hydrolyse der Sonden zwischen den beiden Fluorophoren ab. Die Menge an PCR-Produkt wird durch Erfassung der Fluoreszenz einmal pro Zyklus abgeschätzt. Obwohl eine Hybridisierung der Sonden für das Auftreten einer Hydrolyse notwendig zu sein scheint, kommt das Fluoreszenzsignal in erster Linie durch die Hydrolyse der Sonden zustande und nicht durch die Hybridisierung, wobei eine Oligonukleotidsonde mit Fluoreszenzfarbstoffen an gegenüberliegenden Enden ein zum Nachweis des PCR-Produkts und der Nukleinsäurehybridisierung nützliches, gequenchtes Sondensystem liefert, K.J. Livak et al., 4 PCR Meth. Appl. 357-362 (1995). Es findet sich kein Vorschlag, die Temperaturabhängigkeit der Sondenhybridisierung mittels Fluoreszenz zu verfolgen, um Änderungen in der Sequenz der PCR-Produkte zu identifizieren.
  • Die spezifische Hybridisierung einer Nukleinsäure an einen komplementären Strang zu Identifizierungszwecken wurde in vielen verschiedenen Formaten genutzt. Beispielsweise kann genomische DNA nach dem Verdau mit Restriktionsenzymen, nach Größe aufgetrennt und durch Southern Blotting mit Sonden hybridisiert werden. Als weiteres Beispiel können einzelne Basenmutationen durch "Dot Blots" mit allelspezifischen Oligonukleotiden nachgewiesen werden. Um die notwendige Trennschärfe zu erreichen, wird eine Hybridisierung üblicherweise über Minuten bis Stunden bei einer einzelnen Temperatur durchgeführt. Abwechselnd kann das Ausmaß der Hybridisierung während der Temperaturwechsel dynamisch mit Fluoreszenzmethoden verfolgt werden. Beispielsweise wurden Fluoreszenzschmelzkurven zum Monitoring der Hybridisierung verwendet. L.E. Morrison & L.M. Stols, Sensitive fluorescence-based thermodynamic and kinetic measurements of DNA hybridization in solution, 32 Biochemistry 3095-3104, 1993. Die Geschwindigkeit des Temperaturscans beträgt gewöhnlich 10°C/Stunde oder weniger, zum Teil wegen der großen thermischen Masse der Fluorimeterküvette.
  • Die augenblicklichen Verfahren zum Monitoring der Hybridisierung brauchen viel Zeit. Falls das Monitoring einer Hybridisierung innerhalb von Sekunden anstatt von Stunden erfolgen könnte, könnte das Monitoring der Hybridisierung während der PCR-Amplifikation und sogar bei einer PCR mit schnellem Thermocycling erfolgen. Die zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten für ein Monitoring der Hybridisierung während der PCR, wie sie hier umfassend offenbart sind, beinhalten Produktidentifizierung und -quantifizierung, Nachweis von Sequenzänderungen und automatische Kontrolle der Parameter für das Thermocycling durch Fluoreszenz-Feedback.
  • Wie oben beschrieben, werden die Temperaturzyklen im Stand der Technik langsam und empirisch durchgeführt. Wenn eine Analyse der PCR-Produkte durch Hybridisierung notwendig ist, werden zusätzliche zeitintensive Schritte nötig. Es wäre daher ein großer Fortschritt auf diesem Gebiet, Verfahren zum Monitoring der Hybridisierung während einer PCR bereitstellen zu können und die Reaktion ohne Probenmanipulation zu analysieren, während sie stattfindet, d.h. während oder unmittelbar nach dem Thermocycling. Durch ein Monitoring der Hybridisierung während der PCR können die grundlegenden Prinzipien, die den Ablauf einer PCR ermöglichen, verfolgt und zur Analyse und Optimierung der Reaktion bei der Amplifikation verwendet werden.
  • Die EP 0 640 828 A offenbart eine Vorrichtung zum gleichzeitigen Monitoring mehrerer Nukleinsäurereaktionen. Sie verwendet einen Thermocycler und einen Sensor zum Nachweis von Licht, das von Vertiefungen im Thermocycler emittiert wird.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoff zum Monitoring von Produkthybridisierung während einer PCR bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein System zur Identifizierung von mit PCR amplifizierten Produkten mit Hilfe ihrer Fluoreszenzschmelzkurven bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verbesserung der Empfindlichkeit der PCR-Quantifizierung mit doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffen bereitzustellen.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, die Menge an spezifischem Produkt, das durch PCR amplifiziert wurde, mittels Schmelzkurven zu bestimmen, um auf unspezifische Amplifikation, die mit dem doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoff erfasst wurde, zu korrigieren.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur relativen Quantifizierung verschiedener PCR-Produkte mit doppelstrangspezifischen Farbstoffen zur Verfügung zu stellen.
  • Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Produktquantifizierung mit Hilfe der Reassoziationskinetik (Reannealing-Kinetik) des Produkts in Gegenwart eines doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffs bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung der anfänglichen Kopienzahl des Templats bereitzustellen, indem man die Fluoreszenz einer Hybridisierungssonde oder von Hybridisierungssonden in jedem Zyklus während der PCR-Amplifikation verfolgt.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein System zur relativen Quantifizierung verschiedener PCR-Produkte mit Hilfe von Sondenschmelzkurven bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Verfahren zur Bestimmung der anfänglichen Kopienzahl des Templats mit Hilfe einer Kurvenanpassung der Messkurve von Fluoreszenz gegen Zyklenzahl bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein System und ein Verfahren zur schnellen Durchführung einer PCR und zum gleichzeitigen kontinuierlichen Monitoring der Reaktion und zum Anpassen der Reaktionsparameter während der laufenden Reaktion bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die Nukleinsäuresonden durch synthetische Nukleinsäureanaloga oder -derivate, z.B. Peptidnukleinsäuren (PNA), zu ersetzen, vorausgesetzt, dass diese auch mit fluoreszierenden Verbindungen markiert werden können.
  • Diese und andere Aufgeben und Vorteile der Erfindung ergeben sich deutlicher aus der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen oder lassen sich bei der Ausführung der Erfindung feststellen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Echtzeit-Monitoring der Amplifikation einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe bereit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    Amplifizieren der Targetsequenz durch Polymerase-Kettenreaktion in Gegenwart einer Menge SYBRTM Green I, wobei die Polymerase-Kettenreaktion die Schritte Hinzufügen von SYBRTM Green I, einer thermostabilen Polymerase und von Primern für die Target-Nukleinsäuresequenz zu der biologischen Probe zur Bildung einer Amplifikationsmischung und Thermocycling der Amplifikationsmischung zwischen wenigstens einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur über eine Vielzahl von Amplifikationszyklen umfasst; und
    entweder Bestrahlen der Mischung mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge bei wenigstens einem Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Nachweisen einer Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I nach Probenbestrahlung, wobei die Fluoreszenzemission mit der Menge amplifizierter Target-Nukleinsäure in der Probe in Beziehung steht,
    oder Bestrahlen der Probe mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge im Anschluß an wenigstens einen Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Monitoring der Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I in der Probe als Funktion der Probentemperatur zum Erstellen einer Schmelzkurve für die amplifizierte Targetsequenz.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine PCR-Reaktionsmischung zur Amplifikation der Target-Nukleotidsequenz bereit, wobei die Mischung umfasst: eine DNA-Probe, die die Oligonukleotidprimer für die Targetsequenz in einer zur PCR-Amplifikation ausreichenden Menge enthält, eine thermostabile Polymerase und SYBRTM Green I in einer Menge, die ein Fluoreszenzsignal liefern kann, das die Konzentration der Targetsequenz in der Mischung anzeigt.
  • Die Erfindung ist vorzugsweise gekennzeichnet durch Bestrahlen der Mischung mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge bei wenigstens einem Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Nachweisen einer Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I nach Probenbestrahlung, wobei die Fluoreszenzemission mit der Menge amplifizierter Target-Nukleinsäure in der Probe in Beziehung steht, und ferner gekennzeichnet durch Bestrahlen der Probe mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge im Anschluß an wenigstens einen Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Monitoring der Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I in der Probe als Funktion der Probentemperatur zum Erstellen einer Schmelzkurve für die amplifizierte Targetsequenz.
  • Das Verfahren kann zur Bestimmung einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe während der Amplifikation mit einem schnellen Temperaturwechselprofil verwendet werden.
  • Das Temperaturwechselprofil hat vorzugsweise eine Dauer von weniger als 2 Minuten. Die Probe wird bestrahlt und die Fluoreszenz wird zum Erstellen einer Schmelzkurve erfasst, wenn die Temperatur ansteigt.
  • Die vorliegende Erfindung verringert gegenüber den Methoden des Standes der Technik insbesondere die Gesamtzeit, die für die PCR-Amplifikation und die Analyse benötigt wird, wobei sie gleichzeitig die Möglichkeit bietet, die Qualität der Reaktion durch Optimierung der Amplifikationsbedingungen erheblich zu steigern.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Anwendungsmöglichkeiten zum kontinuierlichen Fluoreszenz-Monitoring einer DNA-Amplifikation bereit. Die benötigte Apparatur kombiniert optische Komponenten mit Elementen für ein schnelles Thermocycling zum kontinuierlichen Monitoring der DNA-Amplifikation mit Hilfe einer Vielzahl verschiedener Fluoreszenzmethoden. In einer veranschaulichenden Ausführungsform wird die Fluoreszenz kontinuierlich von einer einzelnen Probe oder abwechselnd von mehreren Proben auf einem rotierenden Karussell erfasst, wobei alle Proben gleichzeitig einem schnellen Thermocycling unterzogen werden. Weitere Informationen über die zugehörige Geräteausstattung sind in den oben angegebenen US-Patentanmeldungen zu finden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgte das Fluoreszenz-Monitoring während der DNA-Amplifikation mit dem doppelstrangspezifischen Farbstoff SYBR Green I. Die einmal pro Zyklus erfassten Fluoreszenzdaten ermöglichen eine Quantifizierung der anfänglichen Kopienzahl des Templats.
  • Im Gegensatz zur einmaligen Messung der Fluoreszenz pro Zyklus werden außerdem erfindungsgemäße Ausführungsformen offenbart, die Temperatur, Zeit und Fluoreszenz kontinuierlich über jeden Zyklus hinweg überwachen und so eine 3-dimensionale Spirale erzeugen. Diese 3-dimensionale Spirale kann auf Diagramme von Temperatur gegen Zeit, Fluoreszenz gegen Zeit und Fluoreszenz gegen Temperatur reduziert werden. Diagramme von Fluoreszenz gegen Temperatur mit der Fluoreszenz von Hybridisierungssonden können zum Nachweis von Sequenzänderungen im Produkt verwendet werden. Diese Sequenzänderungen können natürlichen Ursprungs sein, wie bei Mutationen oder Polymorphismen, oder künstlich, wie bei einem künstlich konstruierten alternativen Templat zur quantitativen PCR.
  • Gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt das Fluoreszenz-Monitoring zur Aufnahme von Produktschmelzkurven während der PCR durch Fluoreszenz-Monitoring mit SYBRTM Green I. Das Auftragen der Fluoreszenz als Funktion der Temperatur, wenn der Thermocycler durch die Dissoziationstemperatur des Produkts aufheizt, ergibt die Schmelzkurve des PCR-Produkts. Form und Lage dieser DNA-Schmelzkurve sind eine Funktion von GC/AT-Verhältnis, Länge und Sequenz und können zur Unterscheidung von Amplifikationsprodukten verwendet werden, deren Schmelztemperaturen sich um weniger als 2°C unterscheiden. Gewünschte Produkte lassen sich von unerwünschten Produkten, einschließlich Primerdimeren, unterscheiden. Eine Analyse der Schmelzkurven kann verwendet werden, um den dynamischen Bereich der quantitativen PCR zu erweitern und die verschiedenen Produkte bei einer Multiplex-Amplifikation zu unterscheiden. Mit dem Farbstoff können Produktdenaturierung, Reannealing und Extension innerhalb eines jeden Zyklus verfolgt werden. Ein kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring ermöglicht das Erstellen von Schmelzkurven und Annealingkurven des Produkts während der Temperaturzyklen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Reagenzien und Verfahren für eine PCR mit schnellen Zyklen und kombinierter Amplifikation und Analyse mit Hilfe von Fluoreszenz-Monitoring in weniger als dreißig Minuten, vorzugsweise weniger als fünfzehn Minuten und besonders bevorzugt weniger als zehn Minuten bereit.
  • Ein Verfahren zum Echtzeit-Monitoring einer Amplifikation einer Target-Nukleinsäuresequenz mittels Polymerase-Kettenreaktion in einer biologischen Probe umfasst das Amplifizieren der Targetsequenz durch Polymerase-Kettenreaktion in Gegenwart einer Menge SYBRTM Green I, wobei die Polymerase-Kettenreaktion die Schritte Hinzufügen von SYBRTM Green I, einer thermostabilen Polymerase und von Primern für die Target-Nukleinsäuresequenz zu der biologischen Probe zur Bildung einer Amplifikationsmischung und Thermocycling der Amplifikationsmischung zwischen wenigstens einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur über eine Vielzahl von Amplifikationszyklen umfasst; und
    entweder Bestrahlen der Mischung mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge bei wenigstens einem Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Nachweisen einer Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I nach Probenbestrahlung, wobei die Fluoreszenzemission mit der Menge amplifizierter Target-Nukleinsäure in der Probe in Beziehung steht, oder Bestrahlen der Probe mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge im Anschluß an wenigstens einen Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Monitoring der Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I in der Probe als Funktion der Probentemperatur zum Erstellen einer Schmelzkurve für die amplifizierte Targetsequenz.
  • Eine PCR-Reaktionsmischung zur Amplifikation einer Target-Nukleotidsequenz umfasst: eine DNA-Probe, die die Oligonukleotidprimer für die Targetsequenz in einer zur PCR-Amplifikation ausreichenden Menge enthält, eine thermostabile Polymerase und SYBRTM Green I in einer Menge, die ein Fluoreszenzsignal liefern kann, das die Konzentration der Targetsequenz in der Mischung anzeigt.
  • Ein Verfahren zur Analyse einer Target-DNA-Sequenz einer biologischen Probe umfasst:
    Amplifizieren der Targetsequenz durch Polymerase-Kettenreaktion in Gegenwart einer nukleinsäurebindenden fluoreszierenden Einheit, wobei die Polymerase-Kettenreaktion die Schritte Hinzufügen einer thermostabilen Polymerase und von Primern für die Target-Nukleinsäuresequenz zu der biologischen Probe und Thermocycling der biologischen Probe zwischen wenigstens einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur umfasst;
    Anregen der Probe mit Licht einer von der nukleinsäurebindenden fluoreszierenden Einheit absorbierten Wellenlänge; und
    Monitoring der temperaturabhängigen Fluoreszenz von der nukleinsäurebindenden fluoreszierenden Einheit, wenn sich die Temperatur der Probe ändert, wobei die nukleinsäurebindende fluoreszierende Einheit den doppelsträngige Nukleinsäure bindenden Fluoreszenzfarbstoff SYBRTM Green I umfasst.
  • Die temperaturabhängige Fluoreszenz kann zur Identifizierung der amplifizierten Produkte verwendet werden, vorzugsweise durch Analyse der Schmelzkurven. Die relativen Mengen von zwei oder mehreren amplifizierten Produkten können durch Analyse der Schmelzkurven bestimmt werden. Die Flächen unter den Schmelzkurven kann man beispielsweise durch eine nichtlineare Regression der Summe verschiedener Gaußkurven nach der Methode der Abweichung der kleinsten Quadrate (least-squares regression) bestimmen.
  • Kurze Beschreibung der verschiedenen Zeichnungsansichten
  • Die ursprünglichen 6-14, 16-18, 33-36 und 46-48 wurden gestrichen.
  • 1A & B zeigen Graphen, die ein Gleichgewichts-PCR-Paradigma (A) und ein kinetisches PCR-Paradigma (B) darstellen.
  • 2 veranschaulicht nützliche Abschnitte von Temperatur gegen Zeit zum Fluoreszenz-Monitoring der Hybridisierung.
  • 3 stellt ein Diagramm von Temperatur gegen Zeit dar, das beispielhaft für schnelle Temperaturwechsel bei einer PCR ist.
  • 4 zeigt die Ergebnisse vier verschiedener Temperatur-/Zeit-Profile (A-D) und ihre entsprechenden Amplifikationsprodukte nach dreißig Zyklen (Nebenkarte).
  • 5A, B & C veranschaulichen den Mechanismus der Fluoreszenzerzeugung für drei verschiedene Verfahren zum Fluoreszenz-Monitoring einer PCR: (A) Farbstoff für doppelsträngige DNA, Hybridisierungssonden.
  • 15 zeigt ein Diagramm der Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl für mehrere verschiedene anfängliche Kopierreaktionen von Templaten, die mit SYBRTM Green I verfolgt wurden: 0, (Δ); 1, (∎); 10, (–); 102, (–); 103, (+): 104, (•); 105, (⟡); 106 (x); 107,
    Figure 00090001
    ; 108 (☐) ; 109, (♦)
  • 19A-C stellen einen Vergleich von drei Methoden eines Fluoreszenz-Monitoring für PCR dar, einschließlich des doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffs SYBR Green I (A), einer zweifach markierten Fluorescein/Rhodamin-Hydrolysesonde (B), und einer Fluorescein-markierten Hybridisierungssonde mit einem Cy5-markierten Primer (C); 19D zeigt den Variationskoeffizienten für die drei in den 19A-C dargestellten Monitoringmethoden.
  • 20 zeigt ein typisches Diagramm von log Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl einer Referenzamplifikation, die mit SYBR Green I verfolgt wurde.
  • 21 zeigt die Anpassung einer exponentiellen Kurve an Zyklen 20-27 der aus 20 stammenden Daten.
  • 22 zeigt eine exponentielle Anpassung an eine unbekannte zu bestimmende anfänglichen Kopienzahl aus den Amplifikationsdaten.
  • 23 zeigt ein typisches Diagramm von Fluoreszenz gegen Zyklenzahl für fünf Standards, bei denen in jedem Zyklus ein Monitoring mit benachbarten Hybridisierungssonden erfolgte, wobei die anfänglichen Kopienzahlen wie folgt dargestellt sind: 103, (•); 104, (⟡); 105,
    Figure 00090002
    ; 106, (☐); 107, (♦).
  • 24 zeigt eine Kurvenanpassung an die Referenzdaten von 23.
  • 25 zeigt ein typisches Diagramm von Fluoreszenz gegen Zyklenzahl für fünf Standards, bei denen in jedem Zyklus ein Monitoring mit Hydrolysesonden erfolgte, wobei die anfänglichen Kopienzahlen wie folgt dargestellt sind: 1,5 (•); 15, (⟡); 150,
    Figure 00090003
    ; 1500, (☐); 15.000, (♦).
  • 26 zeigt eine Kurvenanpassung an die Referenzdaten von 25.
  • 27 zeigt ein typisches Diagramm von log Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl von drei Referenzamplifikationen, die mit SYBR Green I verfolgt wurden, wobei: (∎); (•);
    Figure 00090004
    .
  • 28 zeigt verschiedene Kurvenanpassungen an die Referenzdaten der 27.
  • 29A & B zeigen Diagramme von (A) Zeit gegen Fluoreszenz und (B) Zeit gegen Temperatur, was die inverse Beziehung zwischen Temperatur und Fluoreszenz verdeutlicht.
  • 30 stellt ein Diagramm dar, das auch als 3D-Plots dargestellte 2D-Plots von Temperatur gegen Zeit, Fluoreszenz gegen Zeit und Fluoreszenz gegen Temperatur für die Amplifikation eines 180 bp-Fragments des Hepatitis B-Genoms in Gegenwart von SYBR Green I zeigt.
  • 31 zeigt eine Projektion der Fluoreszenz gegen die Temperatur für die Amplifikation eines 536 bp-Fragments des humanen beta-Globingens in Gegenwart von SYBR Green I.
  • 32A & B stellen ein Diagramm dar, das (A) eine lineare Änderung des Fluoreszenzverhältnisses mit der Temperatur für Hydrolysesonden und (B) eine radikale Änderung mit der Temperatur für Hybridisierungssonden zeigt.
  • 37 zeigt Schmelzkurven für PCR-amplifizierte Produkte von Hepatitis B-Virus (•; 50% GC, 180 bp); beta-Globin (
    Figure 00100001
    ; 53,2% GC, 536 bp) und Prostata-spezifischem Antigen (x; 60,3% GC, 292 bp).
  • 38 zeigt Schmelzkurven für das PCR-amplifizierte Produkt von Hepatitis B-Virus bei Aufheizgeschwindigkeiten von 0,1°C bis 5,0°C.
  • 39 zeigt die Schmelzkurven für das PCR-amplifizierte Produkt von Hepatitis B-Virus bei verschiedenen Konzentrationen von SYBRTM Green I.
  • 40A & B zeigen (A) Schmelzkurven und (B) elektrophoretisch aufgetrennte Banden von Produkte eines beta-Globinfragments, das (a) ohne zugefügtes Templat, (b) mit 106 Kopien zugefügtem Templat unter niedrigstringenten Bedingungen und (c) mit 106 Kopien zugefügtem Templat unter hochstringenten Bedingungen amplifiziert wurde.
  • 41A & B zeigen (A) Schmelzkurven und (B) Schmelzpeaks von Hepatitis B-Virus-Fragment (HBV), von β-Globin sowie einer Mischung davon.
  • 42A-D zeigen (A) Diagramme der relativen Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl für PCR-amplifizierte Produkte aus verschiedenen Mengen β-Globin-Templat, (B) Schmelzpeaks und (C) Elektrophoresebanden der verschiedenen Produkte und (D) die korrigierte Fluoreszenz der Daten von (A).
  • 43A & B zeigen (A) Schmelzkurven und (B) Schmelzpeaks von PCR-amplifizierten Produkten einer Mischung aus cystischem Fibrosegen und c-erbB-2-Onkogen.
  • 44 zeigt Schmelzpeaks bei verschiedenen Zykluszahlen für das cystische Fibrosegen (CFTR) und c-erbB-2 (neu).
  • 45 zeigt einen Graphen von integrierten Schmelzpeaks der CFTR- und neu-PCR-Produkte.
  • 49 zeigt die Form der Reannealingkurven von amplifizierten β-Globin-PCR-Produkten bei verschiedenen Anfangsmengen Templat.
  • 50 zeigt die Bestimmung einer Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung zur Bestimmung der anfänglichen Templatkonzentration.
  • 51 zeigt ein Blockdiagramm zur Steuerung des Thermocyclings mit den Fluoreszenzdaten.
  • 52A & B zeigen (A) ein Diagramm von Temperatur gegen Zeit, das nach 20 Zyklen erhalten wurde, und (B) ein Diagramm von Fluoreszenz gegen Zeit, das nach 25 Zyklen erhalten wurde, wobei das Thermocycling mit den Fluoreszenzdaten gesteuert wurde.
  • In der Beschreibung und den Ansprüchen der vorliegenden Erfindung wird entsprechend den nachfolgenden Definitionen die folgende Terminologie verwendet.
  • "Nukleinsäure", "DNA" und ähnliche Bezeichnungen, wie sie hier verwendet werden, schließen auch Nukleinsäureanaloga, d.h. Analoga mit einem anderen als einem Phosphodiestergrundgerüst, ein. Beispielsweise kommen die aus dem Stand der Technik bekannten so genannten "Peptidnukleinsäuren", die Peptidbindungen anstelle von Phosphodiesterbindungen im Grundgerüst aufweisen, im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Betracht.
  • "Kontinuierliches Monitoring" und ähnliche Begriffe, wie sie hier verwendet werden, bezeichnen ein mehrmaliges Monitoring während eines PCR-Zyklus, vorzugsweise bei Temperaturwechseln, und besonders bevorzugt den Erhalt wenigstens eines Wertepunktes bei jedem Temperaturwechsel.
  • Der Begriff "Cycle-by-cycle"-Monitoring, wie hier verwendet wird, bedeutet ein einmaliges Monitoring der PCR-Reaktion pro Zyklus, vorzugsweise während der Annealing-Phase der PCR.
  • Der Begriff "wirksame Menge", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine Menge, die ausreicht, um eine ausgewählte Wirkung hervorzurufen. Eine wirksame Menge an PCR-Primern ist beispielsweise eine zur Amplifikation eines Nukleinsäurefragments durch PCR ausreichende Menge, vorausgesetzt, dass eine DNA-Polymerase, ein Puffer, ein Templat und andere Bedingungen, einschließlich Temperaturbedingungen, wie sie nach dem Stand der Technik zur Durchführung der PCR notwendig sind, vorliegen.
  • Eine PCR erfordert wiederholtes Denaturieren von Templat und Annealing von Primern. Diese Hybridisierungsvorgänge sind temperaturabhängig. Die Temperaturzyklen der PCR, die die Amplifikation treiben, denaturieren abwechselnd bei hoher Temperatur das sich akkumulierende Produkt und bewirken bei einer niedrigeren Temperatur das Annealing von Primern an das Produkt. Die Übergangstemperaturen von Produktdenaturierung und Primer-Annealing hängen in erster Linie vom GC-Gehalt und von der Länge ab. Wenn eine Sonde konstruiert wird, um innen an das PCR-Produkt zu hybridisieren, hängt die Schmelztemperatur der Sonde auch vom GC-Gehalt, der Länge und dem Grad der Komplementarität mit dem Target ab. Mit PCR-kompatiblen Fluoreszenzsonden lässt sich die Hybridisierung während der Amplifikation verfolgen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung, die vorzugsweise in Verbindung mit schnellen Thermocycling eingesetzt wird (vollständig beschrieben in der oben angegebenen U.S. Serien-Nr. 08/658,993, eingereicht am 4. Juni 1996, mit dem Titel "System And Method For Monitoring PCR Processes", und der U.S. Seriennummer 08/537,612, eingereicht am 2. Oktober 1995, mit dem Titel "Method For Rapid Thermal Cycling of Biological Samples"), ist ein kinetisches Paradigma für die PCR zweckdienlich. Anstatt sich PCR als drei Reaktionen (Denaturierung, Annealing, Extension) vorzustellen, die bei drei verschiedenen Temperaturen über drei Zeiträume ablaufen (1A), ist ein kinetisches Paradigma für die PCR nützlicher (1B). Mit einem kinetischen Paradigma besteht die Kurve von Temperatur gegen Zeit aus kontinuierlichen Wechseln zwischen sich überlagernden Reaktionen. Denaturierung und Annealing erfolgen so schnell, dass keine Haltedauer bei einer bestimmten Temperatur notwendig ist. Die Extension erfolgt mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten über einen Bereich von Temperaturen. Eine vollständige Analyse würde die Kenntnis aller relevanten Geschwindigkeitskonstanten über alle Temperaturen erfordern. Wenn die Geschwindigkeitskonstanten aller Reaktionen bekannt wären, könnte eine "physikochemische Beschreibung der PCR" entwickelt werden. Die Bestimmung dieser Geschwindigkeiten würde eine genaue Kontrolle der Probentemperatur erfordern und wird durch ein Monitoring der Reaktion bei den Temperaturwechseln stark vereinfacht.
  • 2 veranschaulicht nützliche Abschnitte von Temperatur gegen Zeit zum Fluoreszenz-Monitoring der Hybridisierung. Die Produktschmelzkurven werden während eines langsamen Temperaturanstiegs bis zur Denaturierung erhalten. Durch ein schnelles Absenken der Temperatur nach der Denaturierung auf eine konstante Temperatur können gegebenenfalls Produkt-, Sonden- oder Primerannealing verfolgt werden. Die Sondenschmelzkurven werden durch langsames Aufheizen durch die Temperaturen um den Sonden-Tm hindurch erhalten. Die in 2 dargestellte Ausführungsform liefert die gesamte Analyse während des Thermocycling in sofortiger Echtzeitdarstellung. Die Fluoreszenzsonden bilden Teil der Amplifikationslösung zum kontinuierlichen Monitoring von Primer-, Sonden- oder Produkthybridisierung während des Thermocycling.
  • Die hier enthaltenen Fluoreszenzhybridisierungsmethoden basieren auf schnellem Thermocycling, wobei dessen Vorteile in Geschwindigkeit und Spezifität liegen.
  • Das Temperaturprofil einer Probe bei einer PCR mit schnellem Thermocycling ist in 3 gezeigt. Denaturierung und Annealing zeigen sich im Gegensatz zu den breiten Plateaus des herkömmlichen Thermocycling der PCR in diesen Figuren als Temperaturspitzen („Spikes"), z.B. 1A. Schnelles Thermocycling steht dem herkömmlichen Thermocycling in 4 gegenüber, wo gezeigt ist, dass 30 Amplifikationszyklen in 15 Minuten abgeschlossen sein können und die entsprechenden PCR-Produkte viel weniger Nebenprodukte enthalten. Daher werden bei schnellem Thermocycling die zur Amplifikation benötigten Zeiten um ungefähr das 10-fache gesenkt und die Spezifität verbessert.
  • Beispiel 1
  • 4 zeigt die Ergebnisse vier verschiedener Temperatur/Zeit-Profile (A-D) und ihre entsprechenden Amplifikationsprodukte nach dreißig Zyklen (A-D). Die Profile A und B in 4 wurden mit einer im Stand der Technik gebräuchlichen Heizblockvorrichtung mit einem im Stand der Technik gebräuchlichen Mikrofugenröhrchen erhalten. Wie in 4 zu sehen ist, erfolgen die Wechsel zwischen den Temperaturen langsam, und in den Profilen A und B zeigen sich viele unspezifische Banden. Profil B zeigt eine Verbesserung bei der Eliminierung einiger der unspezifischen Banden (im Gegensatz zu Profil A), indem die Zeit, für die jede Probe bei jeder Temperatur bleibt, begrenzt wird, was anzeigt, dass kürzere Zeiten bessere Ergebnisse liefern.
  • Profile C und D wurden mit einem schellen Thermocycler erhalten. Wie in 4 zu sehen ist, ist die Amplifikation spezifisch und obwohl die Ausbeute bei Elongationszeiten von 60 Sekunden maximale ist (C), ist sie bei Elongationszeiten von 10 Sekunden noch völlig ausreichend (D).
  • Die optimalen Zeiten und Temperaturen für die Amplifikation eines 536 bp-Fragments von beta-Globin aus humaner genomischer DNA wurden ebenfalls bestimmt. Die Amplifikationsausbeuten und die Produktspezifität waren optimal, wenn die Denaturierung (93°C) und das Annealing (55°C) weniger als 1 Sekunde dauerten. Es gab keinen Vorteil bei längeren Denaturierungs- oder Annealingzeiten. Die Ausbeute stieg bei längeren Elongationszeiten bei 77°C an, aber es wurde kaum eine Veränderung bei Elongationszeiten von länger als 10-20 Sekunden festgestellt. Diese unerwarteten Ergebnisse zeigen, dass die Bedingungen, die zur Optimierung der physikalischen und enzymatischen Erfordernisse der Reaktion benötigt werden, bei den früher verfügbaren Vorrichtungen zur DNA-Amplifikation nicht maximal sind.
  • Weitere Informationen lassen sich erhalten aus: C.T. Wittwer et al., Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis delta F(508) Locus, 39 Clinical Chemistry 804 (1993) und C.T. Wittwer et al., Rapid DNA Amplification, THE POLYMERASE CHAIN REACTION 174 (1999). Die zur Fluoreszenzerfassung und zum schnellen Thermocycling verwendete Apparatur ist in der Serien-Nr. 08/537,612, supra, vollständig offenbart.
  • Wie oben angegeben, kann die Polymerase-Kettenreaktion schnell durchgeführt werden. Neben der Möglichkeit einer schnellen Wärmeübertragung erlaubt die Verwendung optisch reiner Kapillarröhrchen ein kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring der DNA-Amplifikation gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Fluoreszenzsonden können zum Nachweis und zum Monitoring von DNA-Amplifikation verwendet werden. Geeignete Sonden beinhalten für doppelsträngige DNA spezifische Farbstoffe und sequenzspezifische Sonden.
  • In 5A hängt die Fluoreszenz von der Hybridisierung des PCR-Produkts ab, wie mit einem doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoff nachgewiesen wurde.
  • Das Verfahren von 5A, einem Aspekt der vorliegenden Erfindung, ist nicht sequenzspezifisch, wenngleich die Produktspezifität durch Schmelzkurven bestimmt werden kann.
  • Auswahl des doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffs. Der Fachmann ist mit der Verwendung von Ethidiumbromid bei Fluoreszenzmethoden vertraut. Wenn während der Amplifikation ein doppelstrangspezifischer Fluoreszenzfarbstoff vorhanden ist, nimmt die Fluoreszenz im Allgemeinen zu, wenn mehr doppelsträngiges Produkt gebildet wird, siehe R. Higuchi et al., Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences, 10 Bio/Technology 413-417 (1992). Ein PCR-Fluoreszenzassay für Hepatitis C-RNA mit einem interkalierenden Farbstoff YO-PRO-1 ist im Stand der Technik ebenfalls bekannt. Siehe T. Ishiguro et al., Homogeneous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalater, 229 Anal. Biochem. 207-213 (1995). Die Verwendung von SYBRTM Green I, das dem Fachmann allgemein bekannt ist und von Molecular Probes, Eugene, Oregon, erhältlich ist, als doppelstrangspezifischem Farbstoff wird bevorzugt. Die Molekülstruktur dieses Farbstoffs ist ein Geschäftsgeheimnis, aber der Hersteller empfiehlt es als einen empfindlicheren doppelstrangspezifischen Farbstoff zum DNA-Nachweis auf Gelen. SYBRTM Green I ist jedoch hitzelabil und daher nicht zum Fluoreszenz-Monitoring von PCR gemäß den herkömmlichen Verfahren geeignet, bei denen die Temperatur der Reaktionsmischung für längere Zeit auf Schmelztemperatur gehalten wird. Aufgrund der Hitzelabilität war es überraschend zu entdecken, dass SYBRTM Green I zum Monitoring von PCR-Reaktionen verwendet werden kann, wenn die Schmelztemperaturen nicht für längere Zeit beibehalten werden, d.h. wenn die PCR mit schnellem Thermocycling gemäß dem oben beschriebenen kinetischen Paradigma durchgeführt wird.
  • Beispiel 2
  • Verschiedene doppelstrangspezifische DNA-Farbstoffe wurden durch Monitoring der Amplifikation eines 110 bp-Fragments ausgehend vom PCO3/PCO4-Primerpaar des humanen beta-Glonbingens mit 10.000 Templatkopien verglichen. Die Primer wurden mit der standardmäßigen Phosphoramiditchemie, wie sie im Stand der Technik bekannt ist, nämlich unter Verwendung des Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, New Jersey), synthetisiert. Die humanen beta-Globinprimer PCO3/PCO4 (110 Basenpaare) sind bei C.T. Wittwer et al., Automated polymerase chain reaction in capillary tubes with hot air, 17 Nucl. Acids. Res. 4353-4357 (1989) beschrieben, worauf hier vollinhaltlich Bezug genommen wird. Die DNA-Amplifikation wurde in 50 mM Tris, pH 8,5 (25°C), 3 mM MgCl2, 500 μg/ml Rinderserumalbumin, 0,5 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem Desoxynukleosidtriphosphat und 0,2 U Taq-Polymerase pro 5 μl Probe durchgeführt, soweit in den folgenden Beispielen nicht anders angegeben. Das gereinigte Amplifikationsprodukt wurde als DNA-Templat verwendet und durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung erhalten, siehe D.M. Wallace, Large- and small-scale phenol extractions and precipitation of nucleic acids, 152 Methods in Enzymology 33-48 (1987), gefolgt von Abtrennen der Primer durch wiederholtes Waschen durch einen Centricon 30 Mikroconcentrator (Amicon, Danvers, Massachusetts). Die Templatkonzentrationen wurden durch Extinktion bei 260 nm bestimmt. Die A(260):A(280)-Verhältnisse der Template waren größer als 1,7.
  • SYBRTM Green I (Molecular Probes, Eugene, Oregon) wurde in einer Verdünnung von 1:10.000, Ethidiumbromid mit 5 μg/ml und Acridinorange mit 3 μg/ml verwendet. Diese Konzentrationen wurden als optimale Konzentrationen zur Maximierung des bei der Amplifikation für jeden Farbstoff beobachteten Fluoreszenzsignals bestimmt. Die Anregung erfolgte über einen 450-490 nm Interferenzfilter mit einer Xenonlichtbogenquelle, außer bei Ethidiumbromid, bei dem die Anregung bei 520-550 nm erfolgte. Für SYBRTM Green I erfolgte das Monitoring der Emission bei 520-550 nm. Die Ethidiumbromidfluoreszenz wurde durch einen 580-620 nm Bandfilter beobachtet. Das Signal von Acridinorange wurde als Verhältnis von grüner (520-550 nm) zu roter (> 610 nm) Fluoreszenz angenommen. Die Fluoreszenz der Probe vor der Amplifikation wurde mit der Fluoreszenz nach 35 Zyklen (94°C Max., 60°C für 20 sec) bei 60°C verglichen. Der Fluoreszenzanstieg betrug das 5,3-fache für SYBRTM Green I, das 1,7-fache für Ethidiumbromid und das 1,2-fache für Acridinorange. Bei getrennten Experimenten war die Fluoreszenz von SYBRTM Green I für mehr als 30 min bei 70°C stabil. Es wird auch bequem mit sichtbarem Licht angeregt und soll weniger mutagen sein als Ethidiumbromid. In allen Fällen stammte die Background-Fluoreszenz in erster Linie von den Primern.
  • SYBRTM Green I ist der doppelstrangspezifische Farbstoff für das erfindungsgemäße Fluoreszenz-Monitoring von PCR, in erster Linie wegen seiner der überragenden Empfindlichkeit, die von einer größeren Trennschärfe zwischen doppelsträngiger und einzelsträngiger Nukleinsäure herrührt. SYBRTM Green I kann bei jeder Amplifikation verwendet werden und ist nicht teuer. Außerdem lässt sich die Produktspezifität durch Analyse der Schmelzkurven erhalten, wie nun gleich beschrieben wird.
  • Cycle-by-cycle-Fluoreszenz. Eine übliche Endpunktanalyse der DNA-Amplifikation durch Gelelektrophorese identifiziert die Produktgröße und schätzt die Reinheit ab. Da jedoch die Amplifikation zunächst stochastisch, dann exponentiell und schließlich stagnierend erfolgt, ist der Nutzen der Endpunktanalyse zur Quantifizierung begrenzt. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet ein Cycle-by-cycle-Monitoring zur Quantifizierung der anfänglichen Kopienzahl des Templats mit Hybridisierungssonden. Wie für einen Fachmann ersichtlich ist, ist ein einmaliges Monitoring. mehrerer Proben pro Zyklus (Once-per-cycle Monitoring) während der DNA-Amplifikation ein leistungsstarkes quantitatives Werkzeug. Ein Cycle-by-cycle-Monitoring wird erreicht, indem man die Fluoreszenz bei der Extension oder der kombinierten Annealing/Extensionsphase eines jeden Zyklus erfasst und die Fluoreszenz mit der Produktkonzentration in Beziehung setzt.
  • Beispiel 3
  • Das Cycle-by-cycle-Monitoring der PCR wurde mit drei verschiedenen Fluoreszenzmethoden durchgeführt. Das Fluoreszenz-Monitoring erfolgte durch (i) den doppelstrangspezifischen Farbstoff SYBRTM Green I, (ii) ein Absenken des Fluorescein-Quenchings durch Rhodamin nach Exonukleasespaltung einer zweifach markierten Hydrolysesonde und (iii) Resonanzenergietransfer von Fluorescein auf Cy5 durch benachbarte Hybridisierungssonden. Die Erfindung beinhaltet jedoch nur das Fluoreszenz-Monitoring durch den doppelstrangspezifischen Farbstoff SYBRTM Green I.
  • Die Amplifikationsreagenzien und -bedingungen entsprachen denen von Beispiel 2. Die humanen beta-Globinprimer RS42/KM29 (536 Basenpaare) und PCO3/PCO4 (110 Basenpaare) sind bei C.T. Wittwer et al., Automated polymerase chain reaction in capillary tubes with hot air, 17 Nucl. Acids. Res. 4353-4357 (1989) beschrieben, worauf hier nun vollinhaltlich Bezug genommen wird. Das Thermocycling für beta-Globin erfolgte bei 95°C Maximum, 61°C Minimum, 15 sec bei 72°C und einer Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen von 5,2°C/sec. Die beta-Actinprimer und die Fluorescein/Rhodamin-Zweifachsonde wurden von Perkin Elmer (Nr. N808-0230) erhalten. Das Thermocycling für beta-Actin erfolgte bei 94°C Maximum, 60°C für 15 sec mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen von 6,2°C/s. Die einfach markierten Sonden 5'-CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA-Fluorescein-3' (SEQ ID NO: 3) und 5'-Cy5-AAGTCTGCCG TTACTGCCCT GTGGGGCARGp (SEQ ID NO: 4) wurden analog zu Beispiel 3 synthetisiert. Diese benachbarten Sonden hybridisieren auf dem gleichen DNA-Strang innen an das PCO3/PCO4-beta-Globin-Primerpaar und sind durch ein Basenpaar getrennt. Das Thermocycling erfolgte bei 94°C Maximum, 59°C für 20 sec, mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen von 7,0°C/sec. Die Hybridisierungssonden (beta-Actin und beta-Globin) wurden jeweils mit 0,2 μM eingesetzt.
  • Wenn mehrere Proben einmal pro Zyklus mit SYBRTM Green I einem Monitoring unterzogen werden, lässt sich ein Bereich von 107-108 an anfänglicher Templatkonzentration unterscheiden, wie in 15 dargestellt. Diese Amplifikation stammt von einem 536 bp-Fragment des beta- Globingens mit SYBRTM Green I als doppelstrangspezifischem Farbstoff. Wenn die Daten als Prozent maximale Fluoreszenz jeder Probe normiert wurden, waren hundert anfängliche Kopien eindeutig von zehn Kopien getrennt. Der Unterschied zwischen einer und zehn Kopien war jedoch nur marginal und es ließ sich kein Unterschied zwischen null und durchschnittlich einer Kopie pro Probe feststellen.
  • Das Fluoreszenzsignal von den Hybridisierungssonden ist nicht kumulativ und tritt bei jeder Annealingphase neu auf. Die Fluoreszenz ist ein direktes Maß für die Produktkonzentration, da die Hybridisierung eine Reaktion pseudo-erster Ordnung ist. Weil die Konzentration der Sonde viel höher als die des Produkts ist, ist der an die Sonde hybridisierte Anteil des Produkts von der Produktkonzentration unabhängig. Diese Eigenschaften zeigen an, dass die Verwendung einer einzelnen Hybridisierungssonde zusammen mit einem markierten Primer zu einem besseren Monitoring der Produktakkumulation zu Quantifizierungszwecken führt. Die inhärente Varianz der verschiedenen Fluoreszenzmethoden bei einem Cycle-by-Cycle-Monitoring ist für eine Quantifizierung ebenfalls wichtig.
  • Beispiel 4
  • Die DNA-Amplifikation erfolgte gemäß Beispiel 2 für jedes der drei verschiedenen Verfahren zum Fluoreszenz-Monitoring. SYBRTM Green I wurde in einer Verdünnung von 1:10.000 bei der Amplifikation eines 205 bp langen humanen beta-Globinfragments von den Primern KM29 und PCO4 verwendet. Die Hydrolysesonde und -bedingungen entsprechen den in Beispiel 7 beschriebenen. Die Hybridisierungssonde, TCTGCCGTTA CTGCCCTGTG GGGCAAG-Fluorescein (SEQ ID NO: 5) wurde mit KM29 und dem wie in Beispiel 8 synthetisierten Cy5-markierten Primer CAACTTCATCCACGTT*CACC (SEQ ID NO: 6), wobei T* eine Cy5-markierte T-Base war, verwendet. Alle Amplifikationen wurden in zehnfacher Ausführung mit 15.000 Templatkopien (50 ng humane genomische DNA/10 μl) durchgeführt. Die Temperaturzyklen waren 31 sec lang (94°C Maximum, 60°C für 20 s, Durchschnittgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen 6,2°C/sec). Die Fluoreszenz wurde für jede Probe zwischen Sekunden 15 und 20 der Annealing/Extensionssphase erfasst.
  • 19A ermöglicht einen Vergleich der drei Methoden zum Fluoreszenz-Monitoring einer PCR. Die Fluoreszenzsonden sind der dsDNA-Farbstoff SYBRTM Green I (19A), eine zweifach markierte Fluorescein/Rhodamin-Hydrolysesonde (19B) und eine Fluoresceinmarkierte Hybridisierungssonde mit einem Cy5-markierten Primer (19C). Alle Sonden wiesen fast die gleiche Empfindlichkeit auf, wobei nachweisbare Fluoreszenz etwa um den Zyklus 20 herum auftrat. Bei längerer Amplifikation nahm das Signal bei der Hydrolysesonde kontinuierlich zu, war bei SYBRTM Green I auf einem Niveau und nahm bei der Hybridisierungssonde leicht ab.
  • Die Genauigkeit der drei Methoden zum Fluoreszenz-Monitoring wird in 19D verglichen. Die mittleren +/– -Standardabweichungen sind für jeden Punkt aufgetragen. Die Daten sind als Variationskoeffizient (Standardabweichung/Mittelwert) des Fluoreszenzverhältnisses oberhalb der Grundlinie aufgetragen (genommen als Mittelwert der Zyklen 11-15).
  • Obwohl die Änderung im Fluoreszenzverhältnis bei der Hydrolysesonde größer ist als die bei der Hybridisierungssonde (19B und 19C), ist der Variationskoeffizient der Fluoreszenz bei den Hydrolysesonden größer (19D). Das heißt, dass die Fluoreszenz, die bei dem Verfahren mit Hybridisierungsonden resultiert, genauer ist als bei Verwendung einer Hydrolysesonde, auch wenn die absoluten Signalstärken niedriger sind. Dies stellt einen unerwarteten Vorteil der Hybridisierungssonden gegenüber den üblicheren zweifach markierten Hydrolysesonden dar.
  • Quantifizierung der anfänglichen Kopienzahl des Templats. Die quantitative PCR ist sowohl in der biomedizinischen Forschung als auch in der klinischen Laborarbeit zu einer wichtigen Methode geworden. Das Quantifizierungsverfahren beinhaltet oft die Aufnahme einer Eichkurve von Proben, die eine bekannte Kopienzahl der Targetsequenz enthalten, ein. Die Kopienzahl einer unbekannten Probe wird durch Extrapolation zwischen den bekannten Werten ermittelt. Wenn das Cycle-by-cycle-Monitoring einer vollständige Amplifikationskurve mit Fluoreszenz, Radioaktivität oder einem anderen Verfahren erfolgt, das ein zur vorhandenen DNA-Menge proportionales Signal liefert, stehen viele Datenpunkte für eine Analyse zur Verfügung und es ist nicht klar, welcher Wert einen Standard oder eine Unbekannte darstellen soll. Der Stand der Technik wählt einen "Schwellenwert" für das Signal und verwendet dann die Zyklenzahl, bei der der Standard oder die Unbekannte den Schwellenwert schneidet, als repräsentativen Wert (siehe Higuchi & Watson, EPA 0 640 282 A1). Dieser Ansatz verwendet eine sehr kleine Menge der in einer Amplifikationskurve verfügbaren Daten. Außerdem ist die Zuordnung des Schwellenwerts sehr subjektiv und unterliegt einer bewußten oder unbewußten Verzerrung. Mehr verfügbare Daten könnten objektiv durch Anwendung von Methoden zur Anpassung nichtlinearer Kurven auf die Daten in einer Amplifikationskurve verwendet werden. Vorzugsweise könnte man Gleichungen finden, die die Form der Amplifikationskurven durch Modellieren der Faktoren des zugrundeliegenden Verfahrens beschreiben.
  • Eine Vielzahl verschiedener Gleichungen könnte zur Anpassung der bei einer Amplifikation erzeugten Daten verwendet werden. DNA-Amplifikationen weisen üblicherweise einen log-linearen Abschnitt auf und die Daten in diesem Abschnitt können an eine Gleichung angepasst werden, die einen exponentiellen Anstieg beschreiben, wie er bei einer DNA-Amplifikation erwartet wird. Der log-lineare Teil einer DNA-Amplifikation kann durch die Gleichung y = A·[DNA]·(1+E)n beschrieben werden, wobei A ein Skalierungsfaktor ist, der Signaleinheiten in DNA-Einheiten umrechnet; [DNA] die Anfangskonzentration der DNA in der Reaktion ist; E die Effizienz der Reaktion; und n die Zyklenzahl ist.
  • Ein Quantifizierungsverfahren sollte beinhalten: (1) Anpassen der bekannten Standards an die Gleichung und fließen lassen der Parameter A und E, und (2) Anpassen der unbekannten Proben an die Gleichung mit den Werten für A und E aus den Standards und fließen lassen von [DNA]. Diese Methode verwendet viel mehr Daten und nützt den Teil der Daten, den log-linearen Teil, der wahrscheinlich am informativsten ist. Die 20, 21 und 22 zeigen ein Beispiel für diesen Ansatz. Zehnfach-Verdünnungen eines gereinigten PCR-Produkts wurden als Eichkurve amplifiziert und es wurde ein "unbekannter" humaner genomischer DNA-Standard verwendet. 20 zeigt, dass der log-lineare Teil leicht entweder durch den Benutzer oder die Software identifiziert werden kann. 21 zeigt eine Anpassung der Gleichung y = A·[DNA]·(1+E)n an den 104-Kopien-Standard. 22 verwendet Durchschnittswerte von verschiedenen Standards für A und E und passt [DNA] an. Der angepasste Wert von 16.700 liegt sehr nahe am theoretischen Wert eines Gens mit einer einzigen Kopie in der genomischen DNA (15.000 Kopien).
  • Die Verwendung aller Daten für eine Amplifikationskurve sollte das Ausmaß des Hintergrundrauschens und den Plateau-Wert beinhalten. Während das Plateau bei hoher Kopienzahl nicht informativ ist, ist es bei niedriger Kopienzahl häufig zur anfänglichen Kopienzahl proportional. Das Ausmaß des Hintergrundrauschens sollte zur Bestimmung des ersten Punkts nützlich sein, der einen deutlichen Anstieg des Signals zeigt. Zu diesem Zeitpunkt sind alle Faktoren, die an der Form einer DNA-Amplifikationskurve beteiligt sind, unbekannt, so dass ein Ansatz dahingeht, die Form der Kurve zu beschreiben. 23 zeigt Amplifikationskurven bei Verwendung von Fluoreszenzhybridisierungssonden zum Nachweis eines Bereichs von DNA-Templatkonzentrationen von fünf Größenordnungen. Jede Kurve ist an die Gleichung y = ((as·x+ab)–(ds·x+db))/(1+(x/c)^b)+(ds·x+db)angepasst, wobei "as" der Background der Böschungslinie ist, "ab" der y-Abschnitt der Backgroundlinie ist, "ds" die Steigung der Plateaulinie ist, "db" der y-Abschnitt der Böschungslinie ist, "c" die Zyklenzahl ist, bei der die Reaktion auf halbem Wege zwischen Background und Plateau (A50) ist und "b" die Steigung des log-linearen Teils der Amplifikation ist.
  • Diese Gleichung ergibt gute Anpassungen an diese Amplifikationsdaten und 24 zeigt, dass der A50-Wert über sieben Größenordnungen gut mit dem log der anfänglichen Kopienzahl korreliert. 25 zeigt die gleiche Anpassung der Gleichung an die Daten von Amplifikationen, bei denen eine Hydrolysesonde zum Nachweis des DNA-Templates über einen Bereich von 5 Größenordnungen verwendet wurde. Diese Gleichung ergibt gute Anpassungen an diese Amplifikationsdaten und die 26 zeigt, dass der A50-Wert gut mit dem log der anfänglichen Kopienzahl korreliert. Dies zeigt die Flexibilität des Ansatzes einer vollständigen Kurvenanpassung, da die Gleichung gute Anpassungen sowohl an die scharfen Plateaus der Kurven für die Amplifikation mit Hybridisierungssonden als auch an die stetig ansteigenden „Plateaus" der Kurven für die Hydrolysesonden ergab.
  • Vollständige Kurvenanpassungen sind nicht auf diese Gleichung beschränkt. 27 zeigt eine Amplifikation von drei Konzentrationen DNA-Templat, die an die Gleichung: y = (((as·x+ab)–(dmax·x/dd+x))/(1+(x/c)^b))+(dmax·x/dd+x) angepasst ist, die den ersten 6-Parameter-Gleichungen ähnelt, außer dass das Plateau durch eine hyperbolische Kurve und nicht durch eine Gerade definiert ist. 28 zeigt, dass der A50-Wert für diese Gleichung gut mit der anfänglichen Kopienzahl korreliert.
  • Während der A50-Wert bei diesen Beispielen verwendet wurde, sollte eine Ebene zwischen dem Background und dem Plateau gewählt werden, wenn eine bestimmte Methode im Amplifikationsprofil stärker niedriger oder höher ist. Beispielsweise wird eine Reihe von Amplifikationseichkurven für die beste Korrelation zwischen der anfänglichen Kopienzahl und dem A50, dem A40, dem A30, dem A20 und dem A10 ausgewertet. Die Amplifikationsstärke, die am besten mit der bekannten anfänglichen Kopienzahl korreliert, wird bestimmt. Dies ist für verschiedene Nachweissysteme unterschiedlich. 19 zeigt den Variationskoeffizienten für verschiedene Nachweissysteme. Die Amplifikationsstärke, die die beste Vorhersage liefert, ist vermutlich die Stärke mit dem niedrigsten Variationskoeffizienten.
  • Wenn man die DNA-Amplifikationsreaktion selbst besser versteht, könnten andere Gleichungen mit Parametern verwendet werden, die physikalische Prozesse wiedergeben. Das Plateau der DNA-Amplifikationskurve hat bei verschiedenen Reaktionen verschiedene Ursachen. Es ist häufig darauf zurückzuführen, dass die Primer nicht in der Lage sind, mit dem Reannealing der Produkte in den letzten Zyklen zu konkurrieren. Dieser Effekt könnte mit einem Parameter erfasst werden, der vom Quadrat der Produktkonzentration in der Reaktion abhängt (da die Reannealinggeschwindigkeit proportional zum Quadrat der Produktkonzentration ist). Eine andere Ursache für das Plateau kann die Verarmung an Primern sein. Primer-limitierte Reaktionen weisen eine charakteristische Form auf, sie zeigen ein sehr scharfes, klar zu erkennendes Plateau. Anpassungen von primer-limitierten Reaktionen beinhalten Parameter, die diese scharfe Obergrenze definieren. Enzym-limitierte Reaktionen weisen ein sehr abgerundetes Plateau auf, das entsprechend angepasst werden kann. Man kann sich Gewichtungsfaktoren ausdenken, die die bekannten Variations koeffizienten für ein gegebenes System wiedergeben, so dass die verlässlicheren Datenpunkte schwerer gewichtet werden. Indem man mehr Punkte in einem Amplifikationsprofil anpasst, kann man genauere und zuverlässigere Schätzungen der anfänglichen Kopienzahl erhalten. Ein oder mehrere Parameter dieser Anpassungen können verwendet werden, um die anfängliche Kopienzahl unbekannter Proben zu schätzen.
  • Kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring von PCR. Das erfindungsgemäße Merkmal des kontinuierlichen Monitorings, das heißt des mehrmaligen Monitorings in jedem PCR-Zyklus, soll nachfolgend erörtert werden. Obwohl ein Fluoreszenz-Monitoring bei einer PCR auch einmal pro Zyklus bei einer konstanten Temperatur erfolgen kann, bietet die vorliegende Erfindung den wichtigen Vorteil, dass sie ein kontinuierliches Monitoring über einen ganzen PCR-Zyklus vorsieht. Die Temperatur ist von Bedeutung, da sich die Fluoreszenz ändert, wenn sich die Temperatur ändert. Die 29A & B zeigen die inverse Beziehung zwischen Temperatur und Fluoreszenz für SYBRTM Green I. Dies ist ein beim Thermocycling verwirrender Effekt, der gewöhnlich eliminiert wird, indem man die Fluoreszenz einmal pro Zyklus bei konstanter Extensionstemperatur betrachtet. Erfindungsgemäß ist jedoch ein Fluoreszenz-Monitoring bei Temperaturwechseln sehr informativ. Vor der vorliegenden Erfindung wurde nicht bei jedem Zyklus ein kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring durchgeführt, sondern ein einmaliges Fluoreszenz-Monitoring pro Zyklus. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Zeit, Temperatur und Fluoreszenz jede sec, alle 200 ms, alle 100 ms oder sogar mit noch größerer Häufigkeit erfasst. Die entsprechenden Daten können feine Details der Produktdenaturierung, des Reannealing und der Extension, und des Sonden-Annealing und -Aufschmelzens bei einem schnellen Thermocycling aufdecken, die mit den vorher verfügbaren Verfahren nicht verfügbar waren.
  • Beispiel 5
  • Ein 180 bp-Fragment des Gens für das Hepatitis B-Oberflächenantigen wurde ausgehend von 106 Kopien des gereinigten PCR-Produkts mit den Primern 5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3' (SEQ ID NO: 1) und 5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3' (SEQ ID NO: 2) (Genbank-Sequenz HVHEPB) amplifiziert. Man folgte den Amplifikationsbedingungen von Beispiel 2 mit der Ausnahme, dass die Reaktion eine 1:20.000-Verdünnung an SYBRTM Green I und 2 mM MgCl2 enthielt. Jeder Temperaturzyklus dauerte 27 sec (92°C Maximum, 59°C Minimum, 5 sec bei 70°C, Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen 3,0°C/sec). Zeit, Temperatur und 2 Fluoreszenzkanäle wurden alle 200 ms erfasst und kontinuierlich als Diagramme von Fluoreszenz gegen Zyklenzahl und Fluoreszenz gegen Temperatur dargestellt. 30 zeigt eine 3D-Kurve für Temperatur, Zeit und Fluoreszenz für die Zyklen 10 bis 39. Diese 3D-Kurve ist in 30 auch in Form von 2D-Plots von Temperatur gegen Zeit, Fluoreszenz gegen Zeit und Fluoreszenz gegen Temperatur projiziert. Die Projektion von Temperatur gegen Zeit in 30 wiederholt jeden Zyklus und liefert im Wesentlichen die gleichen Informationen, wie sie in 3 angegeben sind. Weil die Fluoreszenz sich umgekehrt zur Temperatur ändert, ist die in 30 gezeigte Projektion von Fluoreszenz gegen Zeit in frühen Zyklen ein maßstabsgetreues Spiegelbild des Diagramms von Temperatur gegen Zeit (siehe 29). Wenn Produkt akkumuliert, nimmt die Fluoreszenz bei allen Temperaturen bei doppelsträngigem Produkt zu. Bei den Denaturierungstemperaturen fällt die Fluoreszenz jedoch auf die Basislinie zurück, da nur einzelsträngige DNA vorhanden ist. Die in 30 gezeigte Projektion von Fluoreszenz gegen Temperatur der Doppelstrang-Farbstoffe eliminiert die Zeitachse und zeigt die Temperaturabhängigkeit des Strangstatus bei der DNA-Amplifikation.
  • Beispiel 6
  • Ein 536 bp-Fragment des humanen beta-Globingens wurde ausgehend von 25 ng genomischer DNA und einer 1:10.000-Verdünnung von SYBRTM Green I in einem Volumen von 5 μl amplifiziert. Jeder Temperaturzyklus dauerte 28 sec (95°C Maximum, 61°C Minimum, 15 sec bei 72°C mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen von 5,2°C/sec). Andere Bedingungen entsprechen den in 30 beschriebenen. Die Zyklen 15-40 sind dargestellt. Die Temperaturabhängigkeit des Strangstatus des Produkts bei der PCR zeigt sich aus den Diagrammen von Fluoreszenz gegen Temperatur, wie in 31 gezeigt. Die dargestellten frühen Zyklen erscheinen identisch und zeigen einen nichtlinearen Anstieg der Fluoreszenz bei niedrigeren Temperaturen. Bei fortschreitender Amplifikation erscheinen die Temperaturzyklen als aufsteigende Schleifen zwischen Annealing- und Denaturierungstemperatur. Wenn die Probe erhitzt wird, ist die Fluoreszenz bis zur Denaturierung hoch. Wenn die Probe abkühlt, nimmt die Fluoreszenz zu, was ein Reannealing des Produkts widerspiegelt. Wenn die Temperatur bei der Extension konstant ist, korreliert die zunehmende Fluoreszenz mit weiterer DNA-Synthese.
  • Wie sich aus dem Verständnis dieser Offenbarung ergibt, kann ein kontinuierliches Monitoring innerhalb eines Zyklus einen Einblick in die Mechanismen der DNA-Amplifikation bieten, den es zuvor im Stand der Technik nicht gab. Mit der vorliegenden Erfindung sind viele Aspekte der DNA-Amplifikation erkennbar, die vorher schlecht zu verstehen waren. Eine Amplifikation mit schnellem Thermocycling soll das Produkt beispielsweise in weniger als einer Sekunde denaturieren, während der Stand der Technik zehn Sekunden bis eine Minute für die Denaturierung braucht. Die Beobachtung des Aufschmelzens des Produkts durch Echtzeit-Fluoreszenz-Monitoring mit Doppelstrangfarbstoffen gemäß der vorliegenden Erfindung (30 und 31) zeigt, dass die Anwendung kürzerer Denaturierungszeiten effektiv ist. Als anderes Beispiel ist zu nennen, dass für den bekannten „Plateau-Effekt" viele Gründe vorgeschlagen wurden, aber nur wenige Daten zur Verfügung stehen, um zwischen diesen Alternativen zu unterscheiden. Wie in 31 gezeigt erfolgt das Reannealing des Produkts sehr schnell. Tatsächlich reassoziiert bei späteren Amplifikationszyklen beim Abkühlen in jedem Zyklus der größte Teil des Produkts, bevor die Annealingtemperatur der Primer erreicht wird. In einer Apparatur zum raschen Thermocycling erfolgt dies mit Abkühlgeschwindigkeiten von 5-10°C/sec. Das Reannealing des Produkts mit langsameren, im Stand der Technik gebräuchlichen Thermocyclern ist höher und dieser unerwünschte Effekt größer. Reannealing des Produkts scheint ein Hauptgrund und vielleicht der einzige Grund für den „Plateau-Effekt" zu sein.
  • Nachfolgend wird ein kontinuierliches Monitoring sequenzspezifischer Sonden betrachtet. Wie sich aus dieser Offenbarung ergibt, kann ein kontinuierliches Monitoring innerhalb eines Zyklus die Art der Sondenfluoreszenz identifizieren.
  • Beispiel 7
  • Analog zu Beispiel 3 wurde alle 200 msec ein kontinuierliches Monitoring der Amplifikation mit einer zweifach markierten Hydrolysesonde (beta-Actin) und benachbarten Hybridisierungssonden (beta-Globin) durchgeführt. In 32A sind die Zyklen 20-45 einer Reaktion gezeigt, die mit der Hydrolysesonde verfolgt wurde. Die Hydrolysesonden zeigen eine lineare Änderung des Fluoreszenzverhältnisses mit der Temperatur und eine parallele Zunahme bei der Fluoreszenz, wenn mehr Sonde hydrolysiert wird. Im Gegensatz dazu ändert sich das Fluoreszenzverhältnis von Hybridisierungssonden drastisch mit der Temperatur (32B, Zyklen 20-90). Während der Annealing/Extensionsphase hybridisieren die Sonden an einzelsträngiges Produkt und das Fluoreszenzverhältnis (Cy5/Fluorescein) nimmt zu. Beim Aufheizen auf Temperaturen zum Denaturieren des Produkts dissoziieren die Sonden bei etwa 70°C, wodurch das Fluoreszenzverhältnis auf Backgroundniveau zurückgeht.
  • Die erfindungsgemäße Kombination aus (1) kontinuierlichem Fluoreszenz-Monitoring innerhalb jedes Temperaturzyklus und (2) Analyse der Temperatur- und Zeitabhängigkeit der Hybridisierung bietet Vorteile, die ansonsten nicht zu erhalten sind. 2 zeigt, dass durch kontinuierliches Monitoring über einen Zyklus hinweg Informationen extrahiert werden können, die vorher nicht erhältlich waren. Ein kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring während der Phase des Zyklus, in der das Produkt aufgeschmolzen wird, liefert nützliche Informationen über Reinheit, Identität und Menge der bei dem Zyklus vorhandenen DNA.
  • Wenn eine PCR-Reaktion von der Extensionstemperatur auf die Denaturierungstemperatur aufgeheizt wird, wird jede DNA in der Probe in Einzelstränge aufgeschmolzen. Diese Denaturierung kann als Abfall der Fluoreszenz von SYBRTM Green I beobachtet werden. Für kleine PCR-Produkte erfolgt der Vorgang des Aufschmelzens innerhalb eines engen Temperaturbereichs und der Mittelpunkt dieses Schmelzbereichs wird als Tm bezeichnet. Ähnlich der Größenauftrennung durch Gelelektrophorese misst eine Schmelzpeak-Analyse eine grundlegende Eigenschaft der DNA und kann verwendet werden, um amplifizierte Produkts zu identifizieren. Anders als bei der Gelelektrophorese kann die Analyse der Schmelzkurven Produkte mit gleicher Länge aber unterschiedlichem GC/AT-Verhältnis unterscheiden. Zudem hätten zwei Produkte mit gleicher Länge und gleichem GC-Gehalt aber unterschiedlicher GC-Verteilung (beispielsweise gleichverteilt gegenüber einem GC-Clamp an einem Ende) sehr unterschiedliche Schmelzkurven.
  • Die Temperatur, bei der PCR-Produkte schmelzen, variiert über einen großen Bereich. Die Verwendung von im Stand der Technik bekannten empirischen Formeln zum Effekt des GC-Gehalts auf die Schmelztemperatur (Tm) der DNA sagt voraus, dass eine Duplex mit 0% GC um 41°C tiefer als eine Duplex mit 100% GC schmelzen würde. Bei gleichem GC-Gehalt würde ein 40 bp-Primerdimer 12°C unter einem 1000 bp-Produkt schmelzen. Der Tm-Bereich für mögliche PCR-Produkte umfasst daher mindestens 50°C. Dieser breite Bereich ermöglicht eine Unterscheidung der meisten PCR-Produkte aufgrund ihrer Schmelzkurven. Daher bietet eine Kombination aus Fluoreszenz-Monitoring von PCR und Schmelzkurvenanalyse gleichzeitig Amplifikation, Nachweis und Unterscheidung von PCR-Produkten.
  • Beispiel 8
  • Die DNA-Schmelzkurven für drei verschiedene PCR-Produkte wurden an einem Mikrovolumenfluorimeter aufgenommen, das mit einem 24-Proben-Thermocycler mit einem optischen System für SYBRTM Green I-Fluoreszenz (LightCycler LC24, Idaho Technology, Idaho Falls, Idaho) ausgestattet war. Die Primer für die Amplifikation des 180 bp langen Gens für das Hepatitis B-Oberflächenantigen waren 5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3' (SEQ ID NO: 1) und 5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3' (SEQ ID NO: 2). Die Primer für die Amplifikation des 292 bp langen Gens für das Prostata-spezifische Antigen (PSA) waren 5'-CTGTCCGTGA CGTGGATT-3' (SEQ ID NO: 7) und 5'-AAGTCCTCCG AGTATAGC-3' (SEQ ID NO: 8). Die Amplifikation des 536 bp langen humanen beta-Globingens wurde analog zu Beispiel 3 durchgeführt und die PCR wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte wurden durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt, gefolgt von wiederholtem Waschen durch einen Centricon 30-Microconcentrator (erhältlich bei Amicon, Danvers, Massachusetts). Die Templatkonzentrationen wurden durch Extinktion bei 260 nm bestimmt und wiesen A(260)/A(280)-Verhältnisse von mehr als 1,7 auf.
  • Fünfzig ng gereinigte DNA in 50 mM Tris, pH 8,5, 2 mM MgCl2 und 250 μg/ml Rinderserumalbumin und ein 5 μl-Volumen wurden in das offene Plastikreservoir von Verbundglas/Plastik-Reaktionsröhrchen pipettiert, zum Sammeln der Probe an der Glaskapillarspitze bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und innen mit einem Plastikstöpsel verschlossen. Die Fluoreszenzdaten für die Schmelzkurven wurden durch Integrieren des Signals über 0,25-2,0 Sekunden bei einem linearen Temperaturwechsel auf 95°C mit 0,1-10,0°C/Sekunde erfasst. Die Fluoreszenz wurde kontinuierlich erfasst und als Diagramm von Fluoreszenz gegen Temperatur in der LabView-Programmierumgebung dargestellt (National Instrument, Austin, TX). 37 zeigt die Schmelzkurven der drei gereinigten PCR-Produkte.
  • Die Tm-Werte der drei Produkte in 37 umfassen nur 6°C und zwei der Kurven unterscheiden sich nur um 2°C. Dieser kleine Unterschied reicht aus, um eine leichte Unterscheidung der Produkte zu ermöglichen. Die Bedeutung des Prozentsatzes an GC über die Länge für die Tm wird durch das 292 bp-PSA-Produkt veranschaulicht, das gegenüber dem längeren 536 bp-beta-Globinfragment bei einer höheren Temperatur schmilzt. Schmelzkurven werden häufig bei einer Geschwindigkeit von 0,5°C/Minute erhalten, um das Gleichgewicht sicherzustellen. Wenn die Aufheizgeschwindigkeit abnimmt, verschiebt sich die Schmelzkurven zudem zu tieferen Temperaturen und wird schärfer (38; Hepatitis B-Fragment). Es sei jedoch zu beachten, dass die Schmelzkurven der 37 bei einer Aufheizgeschwindigkeit von 0,2°C/sec (12°C/Minute) erhalten wurden und zwischen Produkten unterscheiden lassen, die sich in der Tm um 2°C oder weniger unterscheiden.
  • Die apparente Tm der PCR-Produkte hängt auch von der Konzentration des doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffs ab (39, Hepatitis B-Fragment). Höhere Farbstoffkonzentrationen erhöhen die Stabilität der DNA-Duplex und die beobachtete Tm.
  • Für ein Monitoring der Schmelzkurven mit SYBRTM Green I sind die bevorzugten Bedingungen eine 1:7.000-1:30.000-fache Verdünnung von SYBRTM Green I und Aufheizgeschwindigkeiten von 0,1-0,5°C/Sekunde. Diese Bedingungen ermöglichen eine leichte Unterscheidung von Produkten, die sich in der Tm um 2°C unterscheiden.
  • Eine genauere Temperaturkontrolle und Software zur Schmelzpeak-Analyse wird den nachweisbaren Unterschied in der Tm auf den Bruchteil eines Grads verringern. Dies wird die Unterscheidung der meisten PCR-Produkte ermöglichen. Nicht alle Produkte können jedoch über die Tm unterschieden werden, genauso wie es möglich ist, Elektrophoreseergebnisse aufgrund der Comigration von zwei oder mehreren Produkten falsch zu interpretieren, ist es möglich, dass ein Teil der Produkte, die im erwarteten Bereich schmelzen, nicht die angestrebten Produkte darstellen. Wenn jedoch im Bereich des erwarteten Produkts keine DNA schmilzt, lässt sich daraus der Schluss ziehen, dass kein erwartetes Produkt vorliegt.
  • Eine andere Form der Produktunterscheidung, die mit einer Schmelzkurvenanalyse verfügbar wird, sind die markanten Muster beim Domänenschmelzen, die man bei längeren PCR-Produkten sieht. Während kurze Produkte (<300 bp) normalerweise in einem Umwandlungsvorgang schmelzen, können längere Produkte interne Schmelzdomänen haben, die den Schmelzkurven ein komplexes, markantes Aussehen verleihen. Diese komplexen Schmelzkurven können als „Fingerprint" zur Identifizierung des Produkts verwendet werden.
  • Die Analyse von Schmelzkurven kann verwendet werden, um angestrebtes Produkt von unspezifischen Produkten wie Primerdimeren, zu unterscheiden. Primerdimere schmelzen über einen breiten Bereich niedriger Temperaturen, sehr verschieden von den scharfen Schmelzkurven spezifischer PCR-Amplifikationsprodukte. Längere heterogene Produkte, die beim Durchlaufen vieler Zyklen bei niedrigstringenten Bedingungen für ein Annealing entstehen, weisen im Vergleich mit reinem PCR-Produkt niedrigere und breitere Schmelzkurven auf.
  • Beispiel 9
  • Die Amplifikation des 536-beta-Globingenfragments wurde analog Beispiel 3 mit einer 1:30.000-Verdünnung von SYBRTM Green I durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Bedingungen variiert wurden. Bei Reaktion A (40) wurde kein Templat zugegeben und die Reaktion wurde 0 sec bei 94°C, 0 sec bei 60°C und 10 sec bei 72°C 30 Zyklen lang einem Thermocycling unterzogen, was kleine, unspezifische Amplifikationsprodukte lieferte. Bei B zeigte die Amplifikation von 106 anfänglichen Kopien des gereinigten Templats bei niedrigstringenten Bedingungen (94°C für 0 sec, 50°C für 0 sec und 72°C für 10 sec) über 55 Zyklen bei der Gelelektrophorese einen breiten Größenbereich für die Amplifikationsprodukte und ein Schmelzen über einen weiten Temperaturbereich. Bei C wurden 106 anfängliche Kopien gereinigtes Templat 0 sec bei 94°C, 0 sec bei 60°C und 10 sec bei 72°C 30mal einem Thermocycling unterzogen und es zeigt sich eine einzelne klare Bande und ein Schmelzen mit einem scharfen Übergang. Die Geschwindigkeit des Temperaturwechsels betrug 0,2°C/sec. Ein Hind III-Verdau von λ-Phagen-DNA (M) wird als Marker verwendet.
  • 40 zeigt, wie genau Schmelzkurven die Spezifität einer PCR-Reaktion wiedergeben. Die scharfe Schmelzkurve C bei hoher Temperatur entspricht einer einzelnen Bande auf einem Gel. Die breite Schmelzkurve A bei niedriger Temperatur entstammt der Analyse einer Kontrolle ohne Templat, die nur Primerdimere zeigt. Eine Überamplifikation des Produkts bei C ergibt eine dazwischen liegende Schmelzkurve B, die von dem spezifischen Produkt noch deutlich zu unterscheiden ist.
  • Die zum Beispiel in 37 zu sehenden Schmelzkurven können besser quantifiziert werden, wenn man zuerst die Ableitung von Fluoreszenz (F) gegen die Temperatur (T) nimmt. Diese Ableitung wird als dF/dT gegen T dargstellt und überführt die Schmelzkurven in Schmelzpeaks.
  • Beispiel 10
  • Die gereinigten Hepatitis B- und beta-Globin-Genfragmente aus Beispiel 8 wurden einzeln und zusammen bei einer Temperaturwechselgeschwindigkeit von 0,2°C/sec und den weiteren in Beispiel 8 (41) spezifizierten Bedingungen aufgeschmolzen. Die etwas subjektive Bestimmung von Tm aus den Schmelzkurven (oben) ergibt sich leicht durch unmittelbare Betrachtung der Schmelzpeaks (unten). Die Fläche unter den Schmelzpeaks kann auch durch Integration der Fläche unter den Kurven quantifiziert werden. Die Baseline der Fluoreszenz wurde zuerst vom Diagramm –dF/dT gegen T subtrahiert, in der Annahme, dass sich die Höhe der Baseline mit der Fläche unter der Kurve ändert. Dann wurden die Peaks mit dem Mittelwert, der Standardabweichung und der Höhe der Peaks als Anpassungsparameter durch nichtlineare Regression nach der Methode der Abweichung der kleinsten Quadrate für Gaußkurven angepasst. Die Fläche unter jeder Gaußkurve wurde als Peakfläche genommen. Alle Berechnungen erfolgten in der LabView-Programmierumgebung (National Instruments, Austin, TX). 41 zeigt beispielhaft eine Umrechnung der Schmelzkurven in Schmelzpeaks. Der Code für diese Berechnungen ist als Anhang A beigefügt.
  • Die Fähigkeit, ein spezifisches Produkt von einem Primerdimer und andere Reaktionsartefakten zu unterscheiden, verbessert die Verwendung von doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffen bei der Quantifizierung niedriger anfänglicher Kopienzahlen. Relativ große anfängliche Kopienzahlen des Templats wurden mit Ethidiumbromid quantifiziert (Higuchi & Watson, supra). Bei niedrigen anfänglichen Kopienzahlen stören jedoch Background-Amplifikation der Primerdimere und andere Amplifikationsartefakte das spezifische Amplifikationssignal. Mit der Fähigkeit der vorliegenden Erfindung, spezifische Produkte von unspezifischen Produkten zu unterscheiden, können doppelstrangspezifische DNA-Farbstoffe zur Quantifizierung niedriger anfänglicher Kopienzahlen des Templats verwendet werden. Dieser Vorteil ergibt sich aus der Einfachheit der Anwendung dieser Farbstoffe. Die doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffe können bei jeder Amplifikation verwendet werden und es sind keine kundenspezifisch fluoreszenzmarkierten Oligonukleotide notwendig. Die Quantifizierung sehr geringer Kopienzahlen mit doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffen erfordert eine sehr gute Amplifikationsspezifität oder, wie mit der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt, ein Mittel, um zwischen dem gewünschten Produkt von einer unspezifischen Amplifikation zu unterscheiden.
  • Beispiel 11
  • Der erfindungsgemäße Ansatz für eine Reinheitsbestimmung des Produkts wurde verwendet, um die quantitativen PCR basierend auf einem Once-per-cycle-Monitoring der Fluoreszenz doppelstrangspezifischer DNA-Farbstoffe zu verbessern. Die Fluoreszenz wurde einmal pro Zyklus nach Extension des Produkts mit Polymerase für eine Reihe von Reaktionen erfasst, die sich in der anfänglichen Konzentration des gereinigten beta-Globin-Templats unterschieden (siehe 42A). Das beta-Globin-Templat und die Amplifikationsbedingungen waren analog zu Beispiel 3. Der log-lineare Anstieg über die Background- Fluoreszenz begann bei einer Zyklenzahl, die von der anfänglichen Templatkonzentration abhing. Die Diagramme für die fünf Reaktionen über einen Bereich von 106 bis 102 Kopien pro Reaktion waren durch etwa vier Zyklen getrennt. Die Probe mit durchschnittlich 102 Kopien pro Reaktion zeigte eine Abnahme der Reaktionseffizienz und Reaktionen mit anfänglichen Kopienzahlen unter 100 ergaben weniger brauchbare Fluoreszenzprofile. Die Fluoreszenzprofile für die Reaktionen mit (durchschnittlich) 10 und 1 Kopie(n) stiegen in umgekehrter Reihenfolge an und die negative Kontrolle zeigte nach etwa 30 Zyklen eine Amplifikation. Dies ist auf eine Amplifikation von Primerdimeren und auf andere unspezifische Amplifikationsprodukte zurückzuführen, die sich mit einem Once-per-cycle-Fluoreszenz-Monitoring des doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffs nicht von dem vorgesehenen Produkt unterscheiden lassen.
  • Für jede Probe wurden die Schmelzpeaks aufgenommen (42AB) und es stellte sich heraus, dass sie gut mit den Elektrophoreseergebnissen korrelierten (42C). Die Reaktion mit null und durchschnittlich einer Templatkopie lieferte keine wahrnehmbare Elektrophoresebande an der für 536 Basenpaare erwarteten Position. Die Reaktionen mit 10 und 100 anfänglichen Templatkopien zeigten schwache Elektrophoresebanden. Dies stimmte gut mit der Schmelzpeak-Analyse überein, die im Bereich des angestrebten Produkts (90-92°C) für die Reaktionen mit null und einer anfänglichen Kopie kein Aufschmelzen von DNA zeigte und für 10 und 100 Kopien in diesem Temperaturbereich kleine Peaks zeigte. Starke Elektrophoresebanden für die Reaktionen mit 103-106 anfänglichen Kopien korrelieren gut mit großen Schmelzpeaks im erwarteten Bereich von 90-92°C.
  • Das Verhältnis an angestrebtem Produkt zu Gesamtprodukt, das durch Integrieren über die Schmelzpeaks bestimmt wurde, reichte von 0,28 für 105 Kopien bis 0,0002 für null anfängliche Templatkopien. Jeder Fluoreszenzwert in 41A wurde mit dem passenden Verhältnis multipliziert, um das korrigierte Diagramm zu erhalten (in 42D als „korrigierte Fluoreszenz" bezeichnet). Diese Vorgehensweise erweiterte den effektiven dynamischen Quantifizierungsbereich auf zwischen 10 und 1 anfängliche Templatkopien.
  • Schmelzpeaks können zwischen spezifischen Produkten und unspezifischen Produkten unterscheiden (40) und sie können zwischen zwei gereinigten, miteinander vermischten PCR-Produkten unterscheiden (41), so dass sie auch geeignet sein sollten, um zwei spezifische Produkte, die zusammen in einem einzelnen Reaktionsröhrchen amplifiziert wurden, voneinander zu unterscheiden. Die durch ein erfindungsgemäßes kontinuierliches Monitoring von PCR-Reaktionen erhaltenen Schmelzkurven sind bei einer Multiplex-PCR nützlich.
  • Beispiel 12
  • In diesem Beispiel wurden zwei Genfragmente gleichzeitig aus genomischer DNA amplifiziert und einem Fluoreszenz-Monitoring mit SYBRTM Green unterzogen. Bei jedem Amplifikationszyklus denaturieren verschiedene Amplifikationsprodukte bei Schmelztemperaturen, die von der Länge des Produkts, dem GC-Verhältnis und anderen dem Fachmann bekannten Faktoren abhängen. Die Temperatur, bei der jedes Produkt schmilzt, kann mit dem doppelstrangspezifischen Farbstoff, SYBRTM Green I verfolgt werden. Ein 81 bp-Fragment aus dem cystischen Fibrosegen wurde mit den hier als SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15 beschriebenen Primern amplifiziert, zusammen mit einem 98 bp-Fragment des c-erbB-2 (HER2/neu)-Onkogens, das mit den hier als SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 beschriebenen Primern amplifiziert wurde.
  • Die Amplifikationsreaktionen bestanden aus 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 3 mM MgCl2, 500 μg/ml Rinderserumalbumin, 200 μM von jedem dNTP und 0,5 μM cystische Fibrose-Primer, 0,3 μM HER2/neu-Primer, eine 1:30.000-Verdünnung von SYBRTM Green I, 1 U AmpliTaq Gold DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Foster City, CA) und 50 ng humaner genomischer DNA in 10 μl.
  • Nach 30 Minuten Aktivierung der Polymerase bei 95°C wurden die Proben 0 Sekunden bei 94°C (Steigung = 20), 0 Sekunden bei 55°C (Steigung = 20) und 10 Sekunden bei 70°C (Steigung = 29) 35 Zyklen lang einem Thermocycling unterzogen. Die Proben wurden auf 70°C abgekühlt und die Fluoreszenz wurde während eines Anstiegs mit 0,2°C/sec auf 94°C kontinuierlich erfasst. Die Schmelzkurven (43) zeigten deutlich zwei unterschiedliche Produkte, die bei 78°C (CFTR) und 89°C (neu) schmolzen. Die beiden Produkte unterscheiden sich in ihrem Tm um ungefähr 10°C und sind leicht voneinander zu unterscheiden.
  • Eine Multiplex-Amplifikation eignet sich für Fälle, bei denen eine interne Kontrolle bei der Amplifikation nötig ist. Beispielsweise sind mit einer PCR viele Translokationen nachweisbar, indem man auf beiden Seiten des „Breakpoint" Primer plaziert. Wenn keine Amplifikation stattfindet, liegt keine Translokation vor, falls die DNA intakt ist und nicht ein Inhibitor vorhanden ist. Diese Möglichkeiten können ausgeschlossen werden, indem man einen positiven Kontrolllokus in der gleichen Reaktionsmischung amplifiziert. Solche Kontrollamplifikationen werden am besten als interne Kontrollen mit gleichzeitig Amplifikation und Nachweis durchgeführt.
  • Beispiel 13
  • Bei diesem Beispiel wurde entsprechend Beispiels 12 verfahren, mit der Ausnahme, dass die Proben nach 30 Minuten Aktivierung der Polymerase bei 95°C 20 Zyklen 0 Sekunden bei 94°C (Steigung = 20), 0 Sekunden bei 55°C (Steigung = 20) und 10 Sekunden bei 70°C (Steigung = 20) und anschließend 15 Zyklen 0 Sekunden bei 94°C (Steigung = 1), 0 Sekunden bei 55°C (Steigung = 20) und 20 Sekunden bei 70°C (Steigung = 20) einem Thermocycling unterzogen wurden. Für die Zyklen 26-31 wurde die Fluoreszenz für jeden Wechsel von 1°C/sec von 70°C bis 94°C kontinuierlich erfasst. Die Schmelzkurven wurden in Schmelzpeaks umgerechnet und dargestellt (44).
  • Es ist anzumerken, dass die Amplifikationseffizienz des CFTR-Fragments größer zu sein scheint als die des neu-Fragments. Die Amplifikazionseffizienz kann durch die Integration der Daten für die Schmelzpeaks wie in Beispiel 10 genau bestimmt werden.
  • Diese Art quantitativer Daten in Bezug auf eine Kontrolle hat viele Anwendungsmöglichkeiten. Beispielsweise werden manche Onkogene wie HER2/neu in vielen Tumoren in vivo amplifiziert. Das heißt, dass die Gene in genomischer DNA, manchmal viele male, repliziert werden. Oft hängt das klinische Verhalten des Tumors vom Ausmaß der Onkogenreplikation ab. Die Amplifikation des Onkogens und eines Kontrolltemplats ermöglicht eine quantitative Bestimmung der relativen Kopienzahl. Ein weiteres Beispiel ist die Quantifizierung der Virusbelastung eines Patienten, der mit HIV oder Hepatitis C infiziert ist, die bei der Prognose und Therapie von Bedeutung ist. Durch Verwendung eines Kontrolltemplats und durch ein Monitoring der Amplifikationseffizienz sowohl der Kontrolltemplate als auch der natürlichen Template bei der Amplifikation, lässt sich eine genaue Quantifizierung der anfänglichen Kopienzahl des Templats erreichen.
  • Das erfindungsgemäße Merkmal der Verwendung von Schmelzkurven zur relativen Quantifizierung soll nachfolgend erörtert werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung stellt eine quantitative PCR eine zusätzliche Verwendungsmöglichkeit für die Schmelzkurven dar. 42 zeigte, dass eine Korrelation zwischen der Fläche unter dem Schmelzpeak und der Menge an spezifischem Produkt bestand. Eine relative Quantifizierung zweier PCR-Produkte sollte möglich sein, wenn die beiden Produkte mit ähnlicher Effizienz amplifiziert würden (oder wenn die unterschiedlichen Effizienzen bekannt wären und ausgeglichen werden könnten). Die relative Quantifizierung der beiden Produkte durch Integration über die Schmelzpeakflächen (siehe Beispiel 10) stellt einen Aspekt der vorliegenden Erfindung dar.
  • Beispiel 14
  • Die Fragmente der Gene für cystische Fibrose und HER-2-neu aus Beispiel 12 wurden amplifiziert, analog zu Beispiel 2 gereinigt und auf 175 μg/ml eingestellt. Die Proben wurden in verschiedenen Verhältnissen (insgesamt 8 μl) vermischt und zu Puffer (1 μl) und SYBRTM Green I (1 μl) gegeben. Die Endkonzentrationen betrugen 50 mM Tris, pH 8,3, 3 mM MgCl2, 250 μg/ml Rinderserumalbumin und eine 1:30.000-Verdünnung von SYBRTM Green I. Die Schmelzkurven wurden bei 0,2°C/s aufgenommen, die Background-Fluoreszenz subtrahiert und die Peaks wie in Beispiel 10 beschrieben integriert. Die Ergebnisse sind in 45 dargestellt. Es zeigte sich eine ausgezeichnete Korrelation zwischen den relativen Flächen unter den Schmelzpeaks und den relativen Mengen der beiden Produkte.
  • Eine relative Quantifizierung von zwei PCR-Produkten ist für viele quantitative PCR-Anwendungen von Bedeutung. Eine Multiplex-Amplifikation von zwei oder mehr Produkten, denen eine Integration der Flächen unter den Schmelzpeaks folgt, ist auf diesem Gebiet sehr nützlich. mRNA wird oft bezogen auf die Menge an mRNA eines Housekeeping-Gens quantifiziert.
  • Eine andere wichtige Anwendung der relativen Quantifizierung ist bei einer kompetitiven quantitativen PCR gegeben. Üblicherweise wird ein Kompetitor synthetisiert, der die gleichen Primerstellen aufweist, sich aber in der Länge von der Original-Targetsequenz unterscheidet. Bekannte Mengen des Kompetitors werden in eine unbekannte Probe gemischt und es wird eine relative Quantifizierung durchgeführt. Es können Kompetitoren hergestellt werden, die sich von der Targetsequenz in ihrer Tm und nicht in der Länge unterscheiden. Die relativen Mengen der Produkte können durch Vergleich der Flächen unter ihren Schmelzpeaks quantifiziert werden. Wenn die Menge eines der Produkte bekannt ist, lässt sich die Menge des ursprünglichen Targets erhalten. Das Schmelzpeakverfahren ist erheblich einfacher als die derzeit gebräuchlichen Verfahren, die das Laufen lassen von mehreren Röhrchen für jede unbekannte Probe und ein mehrmaliges Ziehen von Röhrchen bei verschiedenen Zykluszahlen bei der Reaktion beinhalten, um den log-linearen Teil der Reaktion zu finden. Dann müssen die relativen Mengen der beiden Produkte bestimmt werden. Üblicherweise erfolgt dies, indem man eines der dNTPs mit einem Radioisotop markiert und anschließend nach Agarosegelelektrophorese die Menge an Marker quantifiziert, die in jede Bande eingebaut ist. Im Vergleich dazu ermöglicht die vorliegende Erfindung ein kontinuierliches Monitoring der Reaktion, so dass der log lineare Teil der Amplifikation leicht bestimmt werden kann. Die relative Quantifizierung kann durch Integration der Schmelzpeaks schnell durchgeführt werden. Ein Ganztagesprozeß wird auf weniger als eine Stunde reduziert.
  • Aus der vorhergehenden Diskussion ergibt sich, dass Fluoreszenz-Monitoring bei DNA-Amplifikation eine außergewöhnlich leistungsstarke analytische Methode ist. Wenn sequenzspezifischer Nachweis und Quantifizierung erwünscht sind, können Resonanzenergietransfersonden anstelle von doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffen verwendet werden. Die Tm der Hybridisierungssonden verschiebt sich bei einem einzelnen Basen-Mismatch um etwa 4-8°C. Wenn eine Hybridisierungssonde an der Stelle einer Mutation plaziert wird, sind einzelne Basenmutationen als Verschiebung der Schmelztemperatur der Sonde nachweisbar.
  • Absolute Produktkonzentration durch Reassoziationskinetik des Produkts. Bestimmungen der Produktkonzentration werden mit der vorliegenden Erfindung ebenfalls vorteilhaft durchgeführt. Ein kontinuierliches Monitoring der Bildung doppelsträngiger DNA ermöglicht bei jedem Amplifikationszyklus eine DNA-Quantifizierung durch eine Reassoziationskinetik. Die Probentemperatur wird schnell von der Denaturierungstemperatur abgesenkt und bei einer niedrigeren Temperatur konstant gehalten, die noch hoch genug ist, um ein Primer-Annealing zu verhindern (2). Die Geschwindigkeit der Reassoziation des Produkts folgt einer Kinetik zweiter Ordnung (siehe B. Young & M. Anderson, Quantitative analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach 47-71, B. Hames & S. Higgins, Hrsg., (1985)).
  • Für jedes gegebene PCR-Produkt und jede gegebene Temperatur kann eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung gemessen werden. Wenn die Geschwindigkeitskonstante bekannt ist, kann jede unbekannte DNA-Konzentration aus den experimentellen Reassoziationsdaten bestimmt werden. Das Abkühlen erfolgt nie unmittelbar und ein gewisses Reannealing tritt immer auf, bevor eine konstante Temperatur erreicht wird. Ein schnelles Abkühlen maximiert die Menge der Daten, die für eine Bestimmung der Geschwindigkeitskonstante und der DNA-Konzentration zur Verfügung stehen. Die Methode erfordert ein reines PCR-Produkt, dies kann aber durch Schmelzkurven, die bei der vorliegenden Erfindung ebenfalls während des Thermocyclings erhalten werden, sichergestellt werden. Dieses erfindungsgemäße Verfahren zur Quantifizierung ist in vorteilhafter Weise unabhängig von jeder Schwankung der Signalintensität zwischen den Proben.
  • Beispiel 15
  • Ein 536 bp-Fragment des beta-Globingens wurde aus humaner genomischer DNA amplifiziert (Beispiel 3) und gereinigt (siehe Beispiel 2).
  • Verschiedene Mengen der gereinigten DNA wurden mit einer 1:30.000-Verdünnung von SYBRTM Green I in 5 μl 50 mM Tris, pH 8,3 und 3 mM MgCl2 vermischt. Die Proben wurden bei 94°C denaturiert und anschließend schnell auf 85°C abgekühlt. Das Fluoreszenz-Monitoring bei 520-550 nm erfolgte zeitlich bei 85°C. Wenn verschiedene DNA-Konzentrationen getestet wurden, war die Form der Reassoziationskurve für die DNA-Konzentration charakteristisch (siehe 49). Für jedes gegebene PCR-Produkt und jede gegebene Temperatur kann eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung bestimmt werden. 50 zeigt die Bestimmung einer Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung für die Reassoziation für 100 ng des 536 bp-Fragments in 5 μl bei 85°C. Die Kurve wurde durch nichtlineare Regression nach der Methode der Abweichung der kleinsten Quadrate mit Fmax, Fmin, t0 und k als Fließparametern angepasst, wobei die in 50 gezeigte Geschwindigkeitsgleichung zweiter Ordnung verwendet wurde. Analyseprogramme für diese Art von Kurvenanpassung sind im Stand der Technik allgemein bekannt (beispielsweise die benutzerdefinierte Kurvenanpassung von Delta Graph, DeltaPoint, Inc., Monteray, CA). Wenn die Geschwindigkeitskonstante bekannt ist, kann eine unbekannte DNA-Konzentration aus den experimentellen Reassoziationsdaten bestimmt werden.
  • Mit der definierten Geschwindigkeitskonstanten (k) werden die DNA-Konzentrationen in unbekannten Proben bestimmt. Die Kurven von Fluoreszenz gegen Zeit unbekannter Proben werden durch nichtlineare Regression nach der Methode der Abweichung der kleinsten Quadrate, vorzugsweise bei Thermocycling in Echtzeit (beispielsweise mit dem nichtlinearen Levenberg-Marquardt-Verfahren, das in der LabView-Programmierumgebung, National Instruments, Austin, TX, beschrieben ist) angepasst. Bei dieser Anpassung Sind Fmax, Fmin, t0 und [DNA] die Fließparameter und k ist konstant.
  • Da einige Fluoreszenzfarbstoffe konzentrationsabhängig das Reannealing beeinflussen, wird die Annahme einer Kinetik zweiter Ordnung für die Reassoziation des Produkts durch Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten bei verschiedenen Konzentrationen einer Standard-DNA überprüft. Die Beziehung ist definiert und bei Bedarf wird eine alternative Formel zur Anpassung inkorporiert.
  • Die Annealinggeschwindigkeiten für die Sonden benutzt, um die Produktkonzentration zu bestimmen, ähnlich dem oben beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der Produktkonzentration durch Produktreassoziation. Die Schritte werden wie folgt zusammengefasst: (1) Wählen der für das System geeigneten Geschwindigkeitsgleichung (2) Laufen lassen bekannter DNA-Standards, um die Geschwindigkeitskonstanten zu bestimmen, (3) Überprüfen der Gültigkeit der Geschwindigkeitsgleichung durch Vergleich verschiedener Geschwindigkeitskonstanten, die sich von verschiedenen Verdünnungen ableiten, und (4) Verwendung der Geschwindigkeitskonstanten zur Bestimmung der DNA-Konzentration von Unbekannten aus deren Daten für das Sondenannealing.
  • Fluoreszenz-Feedback zur Steuerung des Thermocycling. Im Gegensatz zur Endpunkt- und Cycle-by-cycle-Analyse kann Fluoreszenz-Monitoring mit der vorliegenden Erfindung auch über jeden Temperaturzyklus hinweg erfolgen. Kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring kann zur Steuerung der Parameter des Thermocycling genutzt werden. Die vorliegende Erfindung nutzt ein Fluoreszenz-Feedback zur Echtzeitsteuerung und Optimierung der Amplifikation. Kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring von PCR-Proben, die einen doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoff oder fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsonden enthalten, kann für ein Monitoring von Hybridisierung und Aufschmelzen während einzelner Amplifikationszyklen verwendet werden. Diese Informationen können von den Algorithmen zur Temperatursteuerung in der Thermocycling-Apparatur verwendet werden, um die Bedingungen für das Thermocycling zu verbessern und für den Benutzer maßzuschneidern. Eine herkömmliche PCR wird durchgeführt, indem man vor der Amplifikation alle Cyclingparameter programmiert. Bei einem kontinuierlichen Monitoring kann eine Bestimmung der Erfordernisse für das Thermocycling während der Amplifikation erfolgen, basierend auf einer kontinuierlichen Beobachtung des Annealing, der Extension und der Denaturierung. Die potentiellen Vorteile einer Verwendung von Hybridisierungsinformationen zur Kontrolle des Thermocycling beinhalten:
    • 1. Sicherstellung einer vollständigen Denaturierung des PCR-Produkts in jedem Zyklus und gleichzeitig: a. Minimieren der Exposition von übermäßig hohen Denaturierungstemperaturen um so eine durch Hitze induzierte Schädigung der Amplifikationsprodukte und der Polymerase zu vermeiden. Begrenzen der Dauer, für die das Produkt den Denaturierungstemperaturen ausgesetzt ist, ist besonders nützlich bei der Amplifikation langer Produkte. b. Erhöhen der Reaktionsspezifität durch Minimierung der Denaturierungstemperatur. Dies selektiert gegen Produkte mit einer Tm, die höher ist als die des angestrebten Amplifikationsprodukts.
    • 2. Maximieren der Amplifikationseffizienz durch Sicherstellen einer für das Primerannealing bei jedem Zyklus ausreichenden Zeit und gleichzeitig: a. Minimieren der Zeitdauer, die zur Amplifikation erforderlich ist, indem man das Primerannealing nicht länger als nötig erlaubt, um eine bestimmte Effizienz zu erreichen. b. Verbesserung der Reaktionsspezifität durch Minimieren der Zeitdauer bei Annealingtemperatur.
    • 3. Maximieren der Amplifikationseffizienz durch Sicherstellen einer für die Extension bei jedem Zyklus ausreichenden Zeit und gleichzeitig: a. Minimieren der Zeitdauer, die zur Amplifikation erforderlich ist, indem man nicht mehr Zeit als nötig erlaubt, um die Produktextension abzuschließen. b. Verbesserung der Reaktionsspezifität, indem man gegen Produkte selektioniert, die länger sind als das angestrebte Amplifikationsprodukt. Diese würden mehr als die zugeteilte Zeit brauchen, um die Produktextension abzuschließen.
    • 4. Initiieren von Änderungen beim Thermocycling in Abhängigkeit von der erhaltenen Fluoreszenzstärke oder der momentanen Amplifikationseffizienz. Beispielsweise können Überamplifikation und unspezifische Reaktionsprodukte minimiert werden, indem man das Thermocycling beendet, wenn die Effizienz auf einen bestimmten Wert fällt. Als weiteres Beispiel können die Temperaturwechsel modifiziert werden, um langsamere Temperaturanstiege zur Aufnahme von Schmelzkurven zu initiieren, wenn die Fluoreszenz nachweisbar wird. Dies spart Zeit, weil die langsameren Anstiege nicht bei früheren Zyklen verwendet werden müssen. Andere wünschenswerte Veränderungen werden bei der weiteren Ausführung der Erfindung deutlich.
  • Die Steuerung basiert auf einer Abschätzung der Reaktionsparameter aus den Fluoreszenzdaten. Die originären Fluoreszenzdaten werden entweder als Änderung der Fluoreszenz mit der Zeit (temperaturspezifische Geschwindigkeiten von Denaturierung, Annealing und Extension), als Änderung der Fluoreszenz mit der Temperatur (Produkt- oder Sonden-Tm) oder als Änderung in der Stärke der Amplifikation (Amplifikationsausbeute und -effizienz) erhalten. Diese Geschwindigkeiten, Tm und ihre ersten und zweiten Ableitungen werden verwendet, um die optimalen Reaktionsparameter zu bestimmen, welche Temperatur und Zeit für die Denaturierung, Temperatur und Zeit für das Primerannealing, Temperatur und Zeit für das Sondenannealing, Temperatur und Zeit für die enzymatische Extension und die Zyklenzahl umfassen.
  • Doppelstrangspezifische DNA-Farbstoffe werden zur Kontrolle der Denaturierung, zur Kontrolle der Extension und zur Initiierung von Änderungen im Thermocycling bei einer bestimmten Amplifikationshöhe oder – effizienz verwendet.
  • Beispiel 16
  • Ein kommerziell erhältlicher Thermocycler zum Fluoreszenz-Monitoring (LC24 LightCycler, Idaho Technology Inc., Idaho Falls, Idaho) wurde so modifiziert, dass die Software nicht länger mit Temperatur/Zeit-Sollwerten programmiert ist, sondern auf die Erfassung der Fluoreszenzwerte programmiert ist, um diese Werte anschließend zur Steuerung des Thermocyclers zu verwenden.
  • Wie im Funktionalen Blockdiagramm (51) dargestellt ist, kommuniziert das Lauf-Zeit-Programm über serielle und DAQ-Board-Schnittstellen mit dem LightCycler. Dies ermöglicht einen Zugriff auf entweder Temperatur- oder Fluoreszenzdaten auf höchster Ebene und kann auch von der Board-Level-Software zur Temperatursteuerung verwendet werden. In der vorliegenden Ausführungsform des Geräts werden jedoch nur die Temperaturdaten auf der Controller-Hardware-Ebene in die digitale Form umgewandelt. Die Fluoreszenzdaten werden in analoger Form durch die Schnittstelle des Boards zur digitalen Erfassung geschickt, mit dem Lauf-Zeit-Programm analysiert und über die serielle Schnittstelle zur Board-Level-Software zurückgeschickt.
  • Steuerung des Aufschmelzens von Produkt:
  • Für das angestrebte PCR-Produkt wurde ein Schmelzpeak aufgenommen und für die Probe, die den Reaktionscocktail enthielt, wurde bei der Temperatur, bei der das Produkt vollständig geschmolzen war, eine Baseline-Fluoreszenz erfasst.
  • Jeder Zyklus der Reaktion verwendete dann diesen Fluoreszenzwert als Sollwert. Die Annäherung an die Denaturierung des Produkts erfolgte in zwei Stufen, um die durch die Notwendigkeit begründete Zeitverzögerung zu umgehen, den Fluoreszenzwert zur Analyse zu einem entfernten Computer zu senden und anschließend die Anweisung, dass der Wert erreicht worden war, zurückzusenden. Mit jedem Schritt zum Schmelzen des Produkts wurde die Temperatur erhöht, bis die Fluoreszenz einen Zwischenwert erreichte, dann wurde die Heizstärke so reduziert, dass eine Temperaturanstiegsgeschwindigkeit von ungefähr 3°C/sec dem Computer die Zeit ließ, die Fluoreszenz zu analysieren und dem Thermocycler das Signal zu geben, dass eine Produktdenaturierung stattgefunden hatte.
  • Das resultierende Temperatur/Zeit-Diagramm (52) zeigt einen charakteristischen Anstieg der Schmelztemperatur nach Zyklus 20, wenn die Konzentration des Amplifikationsprodukts ansteigt. Die Tm des Produkts ist eine Funktion der Produktkonzentration.
  • Produkt-Annealing/Extension:
  • Das Fluoreszenz-Monitoring erfolgte bei einer längeren Haltezeit bei einer kombinierten Annealing/Extensionstemperatur und diese Information wurde verwendet um sicherzustellen, dass eine ausreichende, aber nicht übermäßige Zeit für die Produktextension erlaubt worden war. Das Fluoreszenz-Monitoring erfolgte in Abständen von 10 Sekunden, wenn die Fluoreszenz höher als ein einstellbares Verhältnis (üblicherweise 1,00-1,05) anstieg, und dann wurde der Annealing/Extensionsschritt fortgesetzt. Ansonsten wurde der nächste Schritt zum Schmelzen des Produkts initiiert. Das Intervall von 10 Sekunden wurde gewählt, um bei der kombinierten Annealing/Extensionstemperatur ein Minimum von 20 Sekunden zu haben.
  • Das resultierende Fluoreszenz/Zeit-Diagramm (52) zeigt einen charakteristischen Anstieg in der Verweilzeit bei der kombinierten Annealing/Extensionstemperatur, wenn die Konzentration des Amplifikationsprodukts zunimmt. Da die Primerkonzentration und die Polymerase limitierend werden, wird bei jedem Zyklus mehr Zeit zur Beendigung der Produktextension benötigt.
  • Amplifikationsplateau:
  • Am Ende jedes Annealing/Extensionsschritts wurde der Fluoreszenzwert erfasst und gespeichert. Wenn dieser Wert auf das 1,2-fache des niedrigsten Fluoreszenzwerts am Ende eines Zyklus angestiegen war und danach unterhalb eines vom Benutzer einstellbaren Verhältnisses (üblicherweise 1,00-1,02) aufgehört hatte, zu steigen, wurde das Thermocycling beendet. Dazu wurde ein Schritt zur Erfassung der Schmelzkurven initiiert, indem ein langsamer Temperaturanstieg von 0,1-0,2°C/Sekunde über die Produkt-Tm hinweg eingegeben und ein kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring der Probe durchgeführt wurde.
  • Das resultierende Fluoreszenz/Zeit-Diagramm (52) zeigt, dass das Verhältnis der Cycle-by-cycle-Zunahme der Fluoreszenz nach 25 Amplifikationszyklen unter 1,00 fiel und die Reaktion beendet war.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Nachweis des Amplifikationsplateaus verwendet, um in einem Versuch mit mehreren Proben bei einem für jede Probe optimalen Temperaturzyklus für jede Probe hochaulösende Schmelzkurven zu erfassen. Wenn eine Probe ihr Amplifikationsplateau erreicht, wird für diese Probe eine Schmelzkurve aufgenommen, anschließend wird das reguläre Thermocycling wieder aufgenommen, bis eine andere Reaktion ihr Amplifikationsplateau erreicht.
  • Zusammenfassung. Aus der vorhergehenden Diskussion wird deutlich, dass kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring bei der DNA-Amplifikation zum Monitoring von Hybridisierung eine außergewöhnlich leistungsstarke analytische Methode ist. Mit den hier beschriebenen Verfahren und abhängig von der Zahl der zu Anfang vorhandenen Templatkopien, kann man in fünf bis zwanzig Minuten nach Beginn des Thermocycling eine Identifizierung und Quantifizierung des Produkts erreichen. Die vorliegende Erfindung bietet verschiedene Vorteile, die im Stand der Technik bislang nicht möglich waren. Die vorliegende Erfindung stellt beispielsweise Verfahren mit Einfarbenfluoreszenz zum Monitoring der Produktreinheit, zur relativen Quantifizierung mit Multiplex-PCR oder kompetitiver PCR, zur absoluten Produktquantifizierung mittels Reassoziationskinetik bereit, und ein verbessertes Verfahren zur Quantifizierung von anfänglichem Templat durch Diagramme von Fluoreszenz gegen Zyklenzahl.
  • Die folgende Tabelle beschreibt doppelstrangspezifische DNA-Farbstoffe, die sich zum kontinuierlichen Monitoring von PCR eignen. Die Fluoreszenz doppelstrangspezifischer DNA-Farbstoffe hängt vom Strangstatus der DNA ab. Zusammenfassung von Fluoreszenzsonden zum kontinuierlichen Monitoring von PCR
    Hybridisierung dsDNA-Farbstoff
    Mechanismus Strangstatus
    Sondensynthese Unnötig
    Spezifität Produkt-Tm
    Schmelzanalyse Ja
    Mehrfarbenanalyse Nein
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Zeit, Temperatur und Fluoreszenz 1-10mal pro sec erfasst und bei den Temperaturwechseln werden Feindetails von Produkt- und/oder Sondenhybridisierung beobachtet. Mit dem doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoff SYBRTMGreen I wird die Produkthybridisierung bezogen auf die Temperatur verwendet, um Produkte mit Hilfe der Schmelzkurven zu bestimmen. Zudem erreicht man eine relative Quantifizierung von Produkt durch Multiplex-Amplifikation zweier oder mehrerer verschiedener Produkte, die sich in der Tm unterscheiden. Ferner führt man eine kompetitive PCR durch, indem man die Sequenz innen in den gemeinsamen Primern so ändert, dass zwei oder mehr Produkte verschiedene Tm aufweisen. Eine absolute Produktquantifizierung erhält man durch schnelles Abkühlen des denaturierten Produkts und Beobachten der Reassoziations kinetik. Die Empfindlichkeit der Quantifizierung von anfänglichem Templat mit Diagrammen von Fluoreszenz gegen Zyklenzahl wird durch Analyse der Produktschmelzkurven zur Kontrolle auf unspezifische Amplifikation und durch Algorithmen zur Kurvenanpassung erhöht. Schließlich erhält man ein unmittelbares Fluoreszenz-Feedback zur Steuerung von Denaturierungsbedingungen, Elongationszeiten und der Produktausbeute durch Monitoring des Strangstatus des Produkts mit doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffen.
  • Wenn eine Mulitplex-Analyse in einer PCR-Reaktion erwünscht ist, ist es üblich, zur Identifizierung mehrerer Produkte verschiedene Fluoreszenzmarker mit unterscheidbaren Emissionsspektren zu verwenden. Die Analyse wird durch die begrenzte Zahl verfügbarer Fluorophore und die überlappenden Emissionsspektren der verfügbaren Fluorophore kompliziert (siehe HM Shapiro, supra). Die Analyse der Produkt- oder Sondenhybridisierung mit Hilfe von Schmelzkurven stellt ein weiteres Verfahren zur Unterscheidung multipler PCR-Produkte dar. Durch Verfolgen der Hybridisierung bei Temperaturwechseln kann die Anzahl an Sonden und/oder Spektralfarben, die zur Unterscheidung multipler Produkte notwendig sind, minimiert werden.
  • Der Programmiercode für Schmelzkurvenanalysen und anderen Analysen ist auf den nächsten Seiten zu finden.
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  • NICHTLINEARE LEV-MAR-ANPASSUNG:
  • Dieses VI verwendet den Levenberg-Marquardt-Algorithmus zur Bestimmung der least square-Gruppe der Koeffizienten, die am besten mit der Gruppe der Eingabe-Datenpunkte (X,Y) übereinstimmen, wie durch eine nichtlineare Funktion Y = F(X,A) ausgedrückt wird, wo A die beste Gruppe der Koeffizienten kennzeichnet. Dieses VI erzeugt auch die beste Kurvenanpassung Y = F(X,A).
  • Der Benutzer muß ein Sub-VI „TARGET FNC & DERIV NONLIN" öffnen und seine/ihre nichtlineare Funktion F(X,A) in Formelschreibweise eingeben. Wenn der Benutzer eine Formelberechnung für das Ableitungsverfahren auswählt, muß er/sie die partielle Ableitung von F(X,A) unter ebensolcher Berücksichtigung von A einfügen.
  • Eingaben:
    • X: experimentelle Datenpunkte
    • Y: experimentelle Datenpunkte
    • Standardabweichung: Standardabweichung von allen experimentellen Daten. Falls keine Kenntnis des Parameters vorliegt, ist er auszulassen.
    • Anfängliche, geschätzte Koeffizienten: Ihre geschätzten Koeffizienten. Wenn sich diese zu weit von den gewünschten Koeffizienten entfernt befinden, wird VI eventuell nicht die geeigneten Koeffizienten und die beste Kurvenanpassung liefern.
    • Max. Iteration: Der Algorithmus wird die max. Iteration versuchen. Falls sie bei Erreichen der max. Iteration nicht konvergiert, zeigt VI einen Fehler an. Ableitung: Es gibt zwei Wege, die partielle Ableitung von F(X,A) unter Berücksichtigung des Koeffizienten A zu berechnen. Wenn man die numerische Berechnung auswählt, wird VI das numerische Verfahren zu deren internen Berechnung verwenden. Wenn man die Formelberechnung auswählt, muß man die Ableitungsformel in das Sub-VI TARGET FNC & DERIV NONLIN eingeben. Die Formelberechnung ist genauer als die numerische Berechnung.
  • Ausgaben:
    • Beste, geschätzte Koeffizienten: Die least-square-Koeffizienten.
    • Beste Anpassung: die beste Anpassung der Kurve F(X,A).
    • Covarianz: Covarianzmatrix der besten, geschätzten Koeffizienten. MSE. MSE = 1/N·SUM[Y(I)–F(X(I),A))/STD(I)]^2); (STD: Standardabweichung)
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (6)

  1. Verfahren zum Echtzeit-Monitoring der Amplifikation einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Amplifizieren der Targetsequenz durch Polymerase-Kettenreaktion in Gegenwart einer Menge SYBRTM Green I, wobei die Polymerase-Kettenreaktion die Schritte Hinzufügen von SYBRTM Green I, einer thermostabilen Polymerase und von Primern für die Target-Nukleinsäuresequenz zu der biologischen Probe zur Bildung einer Amplifikationsmischung und Thermocycling der Amplifikationsmischung zwischen wenigstens einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur über eine Vielzahl von Amplifikationszyklen umfasst; und entweder Bestrahlen der Mischung mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge bei wenigstens einem Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Nachweisen einer Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I nach Probenbestrahlung, wobei die Fluoreszenzemission mit der Menge amplifizierter Target-Nukleinsäure in der Probe in Beziehung steht, oder Bestrahlen der Probe mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge im Anschluß an wenigstens einen Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Monitoring der Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I in der Probe als Funktion der Probentemperatur zum Erstellen einer Schmelzkurve für die amplifizierte Targetsequenz.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Bestrahlen der Mischung mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge bei wenigstens einem Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Nachweisen einer Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I nach Probenbestrahlung, wobei die Fluoreszenzemission mit der Menge amplifizierter Target-Nukleinsäure in der Probe in Beziehung steht, und ferner gekennzeichnet durch Bestrahlen der Probe mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge im Anschluß an wenigstens einen Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Monitoring der Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I in der Probe als Funktion der Probentemperatur zum Erstellen einer Schmelzkurve für die amplifizierte Targetsequenz.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zum Nachweis einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe bei einer Amplifikation mit einem schnellen Temperaturwechselprofil.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei jeder Zyklus des schnellen Temperaturwechselprofils eine Dauer von weniger als 2 Minuten besitzt.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Probe zum Erstellen einer Schmelzkurve bestrahlt wird und die Fluoreszenz nachgewiesen wird, wenn die Temperatur erhöht wird.
  6. PCR-Reaktionsmischung zur Amplifikation einer Target-Nukleotidsequenz, wobei die Mischung umfasst: eine DNA-Probe, die die Oligonukleotidprimer für die Targetsequenz in einer zur PCR-Amplifikation ausreichenden Menge enthält, eine thermostabile Polymerase und SYBRTM Green I in einer Menge, die ein Fluoreszenzsignal liefern kann, das die Konzentration der Targetsequenz in der Mischung anzeigt.
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