JP2008513028A - マイクロRNA(miRNA)の二色リアルタイム/エンドポイント定量化 - Google Patents
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Abstract
Description
本教示は、分子生物学および細胞生物学にあり、具体的には、miRNAのような標的ポリヌクレオチドを検出する分野にある
RNA干渉(RNAi)は、転写後の遺伝子調節に関係する、高度に調整され、配列特異的な機構である。プロセスの最初の工程の間に、Dicerと称されるリボヌクレアーゼ(RNase)II様の酵素が、長い二本鎖RNA(dsRNA)および複雑なヘアピン前駆体を以下へと縮小させる:1)メッセンジャーRNA(mRNA)を分解する低分子干渉RNA(siRNA)、および2)切断について標的mRNAを標的化し得るか、または翻訳を弱める得るマイクロRNA(miRNA)。
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本教示は、2つのサンプルの各々において小さい標的ポリヌクレオチドを定量化するための方法であって、以下を包含する方法を提供する:第1のサンプル由来の小さい標的ポリヌクレオチドおよび第1のリンカープローブを含有する第1の反応混合物を提供する工程であって、ここで上記第1のリンカープローブが、3’標的特異的部分、ステム、およびループを含み、上記3’標的特異的部分が、上記標的ポリヌクレオチドの3’末端と塩基対形成する、工程;第2のサンプル由来の小さい標的ポリヌクレオチドおよび第2のリンカープローブを含有する第2の反応混合物を提供する工程であって、ここで上記第2のリンカープローブが、3’標的特異的部分、ステム、およびループを含み、上記3’標的特異的部分が、上記標的ポリヌクレオチドの3’末端と塩基対形成し、ここで上記第1の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドが、上記第2の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドと同じ種である、工程;上記第1の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドに上記第1のリンカープローブをハイブリダイズさせて第1の標的−リンカープローブ複合体を形成させ、そして上記第2の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドに上記第2のリンカープローブをハイブリダイズさせて第2の標的−リンカープローブ複合体を形成させる工程;上記第1の標的−リンカープローブ複合体と、上記第2の標的−リンカープローブ複合体とを混ぜ合わせてプールされた反応混合物を形成する工程であって、ここで上記プールされた反応混合物が、第1の伸長反応生成物および第2の伸長反応生成物を含有する工程;上記第1の伸長反応生成物および上記第2の伸長反応生成物を、第1の検出用プローブおよび第2の検出用プローブの存在下において増幅して、増幅された第1の伸長反応生成物および増幅された第2の伸長反応生成物を形成する工程であって、ここで上記第1の検出用プローブが、上記増幅された第1の伸長反応生成物に対応し、そして第2の検出用プローブが、第2の増幅された第2の伸長反応生成物に対応する、工程;ならびに上記第1の検出用プローブと上記第2の検出用プローブとを比較することによって上記2つのサンプル中の小さい標的ポリヌクレオチドの含量を検出する工程。
本教示の局面は、以下の実施例を考慮してさらに理解され得、これらの実施例は、決して本教示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書中で使用される節の見出しは、組織化の目的のためのみのものであり、そして決して記載される本発明の事柄を限定するものとして解釈されるべきではない。本願に引用される全ての文献および類似する資料としては、特許、特許出願、論文、書籍、学術論文、およびインターネットのウェブページが挙げられるが、これらに限定されず、それらは、目的に応じてその全体が参考として明白に援用される。援用された参考文献中の用語の定義が、本教示において提供される定義と異なるようである場合、本教示において提供される定義が支配する。本教示において考察される温度、濃度、時間などの前に、「約」との意味が存在し、その結果、軽微かつ実質的ではない偏差は、本明細書中の本教示の範囲内であることが認識される。本願において、単数形の使用は、特に明記されない限り、複数形を含む。例えば、「リンカープローブ(a linker probe)」は、1つより多いリンカープローブ(例えば、特定のリンカープローブ種の1つ以上のコピー、および特定のリンカープローブ型の1つ以上のバージョンであるが、これらに限定されない(例えば、第1のサンプル中の異なる標的ポリヌクレオチド種の多様性を照会する異なる第1のリンカープローブの多様性であるが、これに限定されない))が存在し得ることを意味する。また、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含んでいる(comprising)」、「含む(contain)」、「含む(contains)」、「含んでいる(containing)」、「含む(include)」、「含む(includes)」、および「含んでいる(including)」は、限定することを意図しない。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示および説明のためのみのものであり、そして本発明の制限ではないことが、理解される。
本明細書中で使用される場合、用語「標的ポリヌクレオチド」とは、検出されることが求められるポリヌクレオチド配列をいう。標的ポリヌクレオチドは、任意の供給源から得られ得、そして任意の数の異なる組成上の成分を含み得る。例えば、標的は、核酸(例えば、DNAまたはRNA)、トランスファーRNA、siRNA、および任意の種々の小さい非翻訳RNA(例えば、Science、309:1567−1569(2005)を参照のこと)であり得、そして核酸アナログまたは他の核酸模倣物(mimic)を含み得る。標的は、メチル化されても非メチル化されてもそれらの両方であってもよい。標的は、重硫酸塩処理され、そして非メチル化されたシトシンであり得、これはウラシルに変換され得る。さらに、「標的ポリヌクレオチド」とは、標的ポリヌクレオチド自体、およびその代わりのもの(例えば、増幅産物、およびネイティブの配列)をいい得ることが認識される。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、miRNA分子である。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、小さい標的ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、小さい標的ポリヌクレオチドは、25ヌクレオチド長以下であり得る。いくつかの実施形態において、小さい標的ポリヌクレオチドは、23ヌクレオチド塩基長以下であり得る。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、ポリ−A尾部を欠く。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、例えば、法医学的サンプル中に見出され得るが、これに限定されないような分解した供給源に由来する小さいDNA分子である(例えば、Butler、2001、Forensic DNA Typing:Biology and Technology Behind STR Markersを参照のこと)。本教示の標的ポリヌクレオチドは、任意の多くの供給源に由来し得、これらの供給源としては、ウイルス、原核生物、真核生物(例えば、植物、真菌、および動物であるが、これらに限定されない)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの供給源としては、全血、組織生検、リンパ液、骨髄、羊水、毛髪、皮膚、精液、生物戦争薬剤(biowarfare agent)、肛門分泌物、膣分泌物、汗、唾液、頬のスワブ、種々の環境性サンプル(例えば、農作物(agricultural)、水、および土壌)、研究用サンプル(一般的に、精製したサンプル(一般的に、培養した細胞、および溶解した細胞)が挙げられ得るが、これらに限定されない。標的ポリヌクレオチドが、当該分野において公知である任意の種々の手段(例えば、Applied Biosystems ABI PrismTM6100 Nucleic Acid PrepStation、およびABI PrismTM6700 Automated Nucleic Acid Workstation(Boomら、米国特許第5,234,809号、mirVana RNA単離キット(Ambion)など、ならびにLaoの米国仮特許出願「Pure miRNA Sample Preparation Method」(2005年9月12日出願)に記載されるアプローチ)を使用し、サンプルから単離され得ることが認識される。標的ポリヌクレオチドは、分析前に切断されても、せん断されてもよく、これは、機械的な力、超音波処理、制限エンドヌクレアーゼによる切断、または当該分野において公知である任意の方法のような手順の使用を包含することが、認識される。一般的に、本教示の標的ポリヌクレオチドは、一本鎖であるが、いくつかの実施形態において、この標的ポリヌクレオチドは、二本鎖であり得、そして一本鎖は、変性から生じ得る。
図1は、本教示に従った特定の方法の概要を示す。ここで、第1のサンプル(A)および第2のサンプル(B)は、別個の反応容器中に示される。上記第1の反応容器は、サンプルA由来の標的ポリヌクレオチド(例えば、マイクロRNA)を含み得、そして第2の反応は、サンプルB由来のマイクロRNAを含み得る。例えば、サンプルAは、野生型の生物学的供給源に由来し得、そしてサンプルBは、変異型の生物学的供給源に由来し得る。処理(例えば、サンプルA中のマイクロRNAを伸長生成物に変換し、そしてサンプルB中のマイクロRNAを伸長生成物に変換する逆転写反応)の後、上記2つのサンプルは1つに混合されて、単一の反応容器がA+Bを含み得る。次いで例えば、微小流体カード上でのリアルタイムPCR、またはエンドポイントPCRを行い、次いでハイブリダイゼーションアレイを実施することによる検出を使用して解読反応の収集を行い得、上記2つのサンプルの間のマイクロRNAの発現レベルを比較し得る。
特定の実施形態において、本教示はまた、特定の方法を実行することを促進するように設計されたキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、本方法を実施するのに使用される2つ以上の構成要素を組み合わせることによって目的の方法の実行を促進するように機能する.いくつかの実施形態において、キットは、最終消費者による測定に対する必要性を最小限にするために、予め測定された単位量で構成要素を含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、本教示の1つ以上の方法を実行するための説明書を備え得る。特定の実施形態において、上記キットの構成要素は、互いに組み合わせて機能するように最適化される。
Claims (26)
- 2つのサンプルの各々において小さい標的ポリヌクレオチドを定量化するための方法であって、以下:
第1のサンプル由来の小さい標的ポリヌクレオチドおよび第1のリンカープローブを含有する第1の反応混合物を提供する工程であって、
ここで該第1のリンカープローブが、3’標的特異的部分、ステム、およびループを含み、該3’標的特異的部分が、該標的ポリヌクレオチドの3’末端と塩基対形成する、
工程;
第2のサンプル由来の小さい標的ポリヌクレオチドおよび第2のリンカープローブを含有する第2の反応混合物を提供する工程であって、
ここで該第2のリンカープローブが、3’標的特異的部分、ステム、ループを含み、該3’標的特異的部分が、該標的ポリヌクレオチドの3’末端と塩基対形成し、
ここで該第1の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドが、該第2の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドと同じ種である、
工程;
該第1の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドに該第1のリンカープローブをハイブリダイズして第1の標的−リンカープローブ複合体を形成し、そして該第2の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドに該第2のリンカープローブをハイブリダイズして第2の標的−リンカープローブ複合体を形成する工程;
該第1の標的−リンカープローブ複合体と、該第2の標的−リンカープローブ複合体とを混ぜ合わせてプールされた反応混合物を形成する工程であって、ここで該プールされた反応混合物が、第1の伸長反応生成物および第2の伸長反応生成物を含有する工程;
該第1の伸長反応生成物および該第2の伸長反応生成物を、第1の検出用プローブおよび第2の検出用プローブの存在下において増幅して、増幅された第1の伸長反応生成物および増幅された第2の伸長反応生成物を形成する工程であって、ここで該第1の検出用プローブが、該増幅された第1の伸長反応生成物に対応し、そして該第2の検出用プローブが、該第2の増幅された第2の伸長反応生成物に対応する、工程;ならびに
該第1の検出用プローブと該第2の検出用プローブとを比較することによって該2つのサンプル中の小さい標的ポリヌクレオチドの含量を検出する工程、
を包含する方法。 - 前記第1のリンカープローブのステムが、第1のサンプル同定部分を含み、そして前記第2のリンカープローブのステムが、第2のサンプル同定部分を含み、そして前記第1の検出用プローブが、前記増幅反応の間に、前記増幅された第1の伸長反応生成物の対応するサンプル同定部分にハイブリダイズし、そして前記第2の検出用プローブが、該増幅反応の間に、前記増幅された第2の伸長反応生成物の対応するサンプル同定部分にハイブリダイズする、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の検出用プローブおよび前記第2の検出用プローブの少なくとも1つが、前記増幅反応の間に、前記小さい標的ポリヌクレオチドに対応する配列に、さらにハイブリダイズする、請求項2に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、以下:
前記第1の反応混合物中の前記第1のリンカープローブを伸長して第1の伸長反応生成物を形成する工程;
前記第2の反応混合物中の前記第2のリンカープローブを伸長して第2の伸長生成物を形成する工程;および
該第1の伸長反応生成物と該第2の伸長生成物とを混ぜ合わせる工程、
を包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、以下:
前記第1の反応混合物と前記第2の反応混合物とを混ぜ合わせる工程;および
伸長反応を行う工程、
を包含する、方法。 - 前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項1に記載の方法。
- 前記小さい標的ポリヌクレオチドが、マイクロRNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記検出用プローブの少なくとも1つが、ペプチド核酸(PNA)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記検出用プローブの少なくとも1つが、5’−ヌクレアーゼ切断可能プローブである、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のリンカープローブおよび/または前記第2のリンカープローブの自己相補的なステムが、12ヌクレオチド〜16ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のリンカープローブの標的特異的部分、前記第2のリンカープローブの標的特異的部分、またはそれらの両方が、6ヌクレオチド〜8ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ループが、ユニバーサルリバースプライマー部分をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ループが、14ヌクレオチド〜18ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、以下:
前記第1の反応混合物が、複数の異なる小さい標的ポリヌクレオチド種に対応する、複数の異なるリンカープローブを含有し;
前記第2の伸長反応混合物が、複数の異なる小さい標的ポリヌクレオチド種に対応する、複数の異なるリンカープローブを含有し;
前記プールされた反応混合物のプールされた伸長反応生成物が、その後、複数の増幅反応に細分され;
各増幅反応が、プライマー対、前記第1のサンプルに対応する第1の検出用プローブ、および前記第2のサンプルに対応する第2の検出用プローブを含み;
小さい標的ポリヌクレオチドが、各増幅反応において検出される、
方法。 - 少なくとも1つのプライマー対が、小さい標的ポリヌクレオチドに対応するフォワードプライマー、前記リンカープローブのループのユニバーサルリバースプライマー部分に対応するユニバーサルリバースプライマーを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記検出する工程が、エンドポイント分析を包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記検出する工程が、リアルタイム分析を包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記リアルタイム分析が、リアルタイムサーマルサイクラー上で行われる、請求項17に記載の方法。
- キットであって、以下:
第1のリンカープローブを含む反応容器;
第2のリンカープローブを含む反応容器;
を備え、ここで該第1のリンカープローブおよび該第2のリンカープローブが、同じ3’標的特異的部分および異なるサンプル同定部分を含む、キット。 - 請求項19に記載のキットであって、逆転写酵素を含む反応容器をさらに備える、キット。
- 請求項19に記載のキットであって、DNAポリメラーゼを含む反応容器をさらに備える、キット。
- 請求項21に記載のキットであって、プライマー対、第1の検出用プローブ、および第2の検出用プローブをさらに備え、ここで該プライマー対、該第1の検出用プローブ、および該第2の検出用プローブが、同じ反応容器中に存在する、キット。
- 前記プライマー対が、以下:
小さい標的ポリヌクレオチドに特異的なフォワードプライマー;および
ユニバーサルリバースプライマーであって、ここで該ユニバーサルリバースプライマーが、前記第1のリンカープローブのループおよび前記第2のリンカープローブのループにコードされる、ユニバーサルリバースプライマー、
を含む、請求項22に記載のキット。 - 反応混合物であって、以下:
小さい標的ポリヌクレオチドの第1の種にハイブリダイズした第1のリンカープローブ、および該小さい標的ポリヌクレオチドの第2の種にハイブリダイズした第2のリンカープローブ、
を含有し、ここで該第1のリンカープローブが、第1のサンプル同定部分を含み、そして該第2のリンカープローブが、第2のサンプル同定部分を含む、反応混合物。 - 請求項24に記載の反応混合物であって、逆転写酵素をさらに含有する、反応混合物。
- 請求項24に記載の反応混合物であって、前記小さい標的ポリヌクレオチドに特異的なフォワードプライマー、およびリバースプライマーをさらに含有し、ここで該リバースプライマーが、前記第1のリンカープローブのループおよび前記第2のリンカープローブのループにコードされ、そして該リバースプライマーをコードする該第1のリンカープローブの該ループの配列が、該リバースプライマーをコードする該第2のリンカープローブの該ループの配列と同じである、反応混合物。
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