JP2008513028A - マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の二色リアルタイム／エンドポイント定量化 - Google Patents

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の二色リアルタイム／エンドポイント定量化 Download PDF

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Abstract

本発明は、２つのサンプルの間で、標的ポリヌクレオチド配列（特に、ｍｉＲＮＡのような小さい標的ポリヌクレオチド）を検出するための方法、試薬、キット、および組成物に関する。リンカープローブの対は、標的ポリヌクレオチドの特定の種を照会するために、２つの異なる反応において利用され得る。検出用プローブの対、標的ポリヌクレオチドに特異的な単一のフォワードプライマー、およびリバースプライマーは、２つのサンプルの間の標的ポリヌクレオチドの発現レベルの相違を照会するために、増幅反応において使用され得る。いくつかの実施形態において、複数の小さいｍｉＲＮＡは、複数のリンカープローブによって照会される。次いで、複数の照会されたｍｉＲＮＡは、複数の増幅反応において解読され得る。

Description

（分野）
本教示は、分子生物学および細胞生物学にあり、具体的には、ｍｉＲＮＡのような標的ポリヌクレオチドを検出する分野にある
（導入）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、転写後の遺伝子調節に関係する、高度に調整され、配列特異的な機構である。プロセスの最初の工程の間に、Ｄｉｃｅｒと称されるリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）ＩＩ様の酵素が、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）および複雑なヘアピン前駆体を以下へと縮小させる：１）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および２）切断について標的ｍＲＮＡを標的化し得るか、または翻訳を弱める得るマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）。
分子のｓｉＲＮＡ分類は、特徴的なジヌクレオチドの３’オーバーハングを有する２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）の二重鎖（ｄｅｐｌｕｘ）から構成されると考えられる（非特許文献１）。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉにおいて機能的中間体として作用することが示されており、具体的には、一般的には抗ウイルス性の細胞防御機構であると見なされるプロセスにおいて相補的なｍＲＮＡ標的の切断を導く（非特許文献２、非特許文献３）。標的ＲＮＡの切断は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって触媒され、ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼとして機能する（非特許文献４において概説される）。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、代表的に、より大きいステム−ループの前駆体ＲＮＡからプロセシングされる、約２２塩基長（１８〜２５塩基長）からなる一本鎖の内因性オリゴリボヌクレオチドを含む。ｍｉＲＮＡをコードすることが認められた最初の遺伝子（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｉｎ−４およびｌｅｔ−７）は、機能喪失変異に関連する発生のタイミングの欠損に基づいて同定された（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７による概説）。ｍｉＲＮＡ指示性の遺伝子調節の広さおよび重要性は、より多くのｍｉＲＮＡならびに調節の標的および機能が見出されるにつれて明らかとなる。現在まで、合計で少なくとも７００種のｍｉＲＮＡが、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（非特許文献８）、マウス、ヒト（非特許文献９）、および植物（非特許文献１０）において同定されている。それらの配列は、代表的に、異なる種の間で保存される。ｍｉＲＮＡに関して１８〜２５ヌクレオチドの大きさの範囲が、現在までに最も一般的に見出される。
大部分のｍｉＲＮＡｓの機能は、公知ではない。最近見出されたｍｉＲＮＡ機能は、ハエにおける細胞増殖、細胞死、および脂肪代謝の制御（非特許文献１１；非特許文献１２）、線虫におけるニューロンのパターン形成（非特許文献１３）、哺乳動物における造血系の分化の調節（非特許文献１４）、ならびに植物における葉および花の発育の制御（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）を含む。ｍｉＲＮＡは遺伝子調節の新しい局面を示し得るという推測が、存在する。
大部分のｍｉＲＮＡは、クローニングによって見出されている。ＡｍｂｉｏｎおよびＱＩＡＧＥＮから研究者用に市販されている少数のクローニングキットが存在するが、そのプロセスは、労力を要し、そしてあまり正確ではない。さらに、ｍｉＲＮＡの定量化に利用可能な信頼できる技術は、ほとんど存在していない（非特許文献１９）。ノーザンブロッティングが、使用されているが、その結果は、定量的ではない（非特許文献２０）。多くのｍｉＲＮＡ研究者らは、異なる組織、発生の異なる段階、または種々の化学的薬剤による処理後におけるｍｉＲＮＡのレベルをモニタリングに関心を有する。しかし、ｍｉＲＮＡの短い長さが、それらの研究を困難にしている。
Ａｍｂｒｏｓら、ＲＮＡ、２００３年、第９巻、第３号、ｐ．２７７−２７９ Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、第４１１巻、第６８３６号、ｐ．４９４−４９８ Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００１年、第１５巻、第２号、ｐ．１８８−２００ Ｂａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ、２００４年、第１１６巻、第２号、ｐ．２８１−２９７ Ｌｅｅら、Ｃｅｌｌ、１９９３年、第７５巻、第５号、ｐ．８４３−８５４ Ｒｅｉｎｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ、２０００年、第４０３巻、第６７７２号、ｐ．９０１−９０６ Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、第１８巻、ｐ．４９５−５１３ Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年、第３９１巻、第６６６９号、ｐ．８０５−８１１ Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年、第２９４巻、第５５４３号、ｐ．８５３−８５８ Ｒｅｉｎｈａｒｔら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００２年、第１６巻、第１３号、ｐ．１６１６−１６２６ Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅら、ｃｅｌｌ、２００３年、第１１３巻、第１号、ｐ．２５−３６ Ｘｕら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００３年、第１３巻、第９号、ｐ．７９０−７９５ ＪｏｈｎｓｔｏｎおよびＨｏｂｅｒｔ、Ｎａｔｕｒｅ、２００３年、第４２６巻、第６９６８号、８４５−８４９ Ｃｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年、第３０３巻、第５６５４号、ｐ．８３−８７ ＡｕｋｅｒｍａｎおよびＳａｋａｉ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２００３年、第１５巻、第１１号、ｐ．２７３０−２７４１ Ｃｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００３年、第３０３巻、第５６６６号、ｐ．２０２２−２０２５ Ｅｍｅｒｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００３年、第１３巻、第２０号、ｐ．１７６８−１７７４ Ｐａｌａｔｎｉｋら、Ｎａｔｕｒｅ、２００３年、第４２５巻、第６９５５号、ｐ．２５７−２６３ Ａｌｌａｗｉら、「Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」、ＲＮＡ、２００４年７月、第１０巻、第７号、ｐ．１１５３−６１ Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｔａｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年、第２９４巻、第５５４３号、ｐ．８５３−８５４
（概要）
本教示は、２つのサンプルの各々において小さい標的ポリヌクレオチドを定量化するための方法であって、以下を包含する方法を提供する：第１のサンプル由来の小さい標的ポリヌクレオチドおよび第１のリンカープローブを含有する第１の反応混合物を提供する工程であって、ここで上記第１のリンカープローブが、３’標的特異的部分、ステム、およびループを含み、上記３’標的特異的部分が、上記標的ポリヌクレオチドの３’末端と塩基対形成する、工程；第２のサンプル由来の小さい標的ポリヌクレオチドおよび第２のリンカープローブを含有する第２の反応混合物を提供する工程であって、ここで上記第２のリンカープローブが、３’標的特異的部分、ステム、およびループを含み、上記３’標的特異的部分が、上記標的ポリヌクレオチドの３’末端と塩基対形成し、ここで上記第１の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドが、上記第２の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドと同じ種である、工程；上記第１の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドに上記第１のリンカープローブをハイブリダイズさせて第１の標的−リンカープローブ複合体を形成させ、そして上記第２の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドに上記第２のリンカープローブをハイブリダイズさせて第２の標的−リンカープローブ複合体を形成させる工程；上記第１の標的−リンカープローブ複合体と、上記第２の標的−リンカープローブ複合体とを混ぜ合わせてプールされた反応混合物を形成する工程であって、ここで上記プールされた反応混合物が、第１の伸長反応生成物および第２の伸長反応生成物を含有する工程；上記第１の伸長反応生成物および上記第２の伸長反応生成物を、第１の検出用プローブおよび第２の検出用プローブの存在下において増幅して、増幅された第１の伸長反応生成物および増幅された第２の伸長反応生成物を形成する工程であって、ここで上記第１の検出用プローブが、上記増幅された第１の伸長反応生成物に対応し、そして第２の検出用プローブが、第２の増幅された第２の伸長反応生成物に対応する、工程；ならびに上記第１の検出用プローブと上記第２の検出用プローブとを比較することによって上記２つのサンプル中の小さい標的ポリヌクレオチドの含量を検出する工程。
いくつかの実施形態において、本教示は、第１のリンカープローブを含む反応容器、第２のリンカープローブを含む反応容器を備えるキットであって、ここで上記第１のリンカープローブおよび上記第２のリンカープローブが、同じ３’標的特異的部分および異なるサンプル同定部分を含む、キットを提供する。
いくつかの実施形態において、本教示は、小さい標的ポリヌクレオチドの第１の種にハイブリダイズした第１のリンカープローブ、および上記小さい標的ポリヌクレオチドの第２の種にハイブリダイズした第２のリンカープローブを含有する反応混合物であって、ここで上記第１のリンカープローブが、第１のサンプル同定部分を含み、そして上記第２のリンカープローブが、第２のサンプル同定部分を含む、反応混合物を提供する。
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のためのみのものであることを理解する。図面は、決して本教示の範囲を限定することを意図しない。
（例示的な実施形態の説明）
本教示の局面は、以下の実施例を考慮してさらに理解され得、これらの実施例は、決して本教示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書中で使用される節の見出しは、組織化の目的のためのみのものであり、そして決して記載される本発明の事柄を限定するものとして解釈されるべきではない。本願に引用される全ての文献および類似する資料としては、特許、特許出願、論文、書籍、学術論文、およびインターネットのウェブページが挙げられるが、これらに限定されず、それらは、目的に応じてその全体が参考として明白に援用される。援用された参考文献中の用語の定義が、本教示において提供される定義と異なるようである場合、本教示において提供される定義が支配する。本教示において考察される温度、濃度、時間などの前に、「約」との意味が存在し、その結果、軽微かつ実質的ではない偏差は、本明細書中の本教示の範囲内であることが認識される。本願において、単数形の使用は、特に明記されない限り、複数形を含む。例えば、「リンカープローブ（ａ ｌｉｎｋｅｒ ｐｒｏｂｅ）」は、１つより多いリンカープローブ（例えば、特定のリンカープローブ種の１つ以上のコピー、および特定のリンカープローブ型の１つ以上のバージョンであるが、これらに限定されない（例えば、第１のサンプル中の異なる標的ポリヌクレオチド種の多様性を照会する異なる第１のリンカープローブの多様性であるが、これに限定されない））が存在し得ることを意味する。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、限定することを意図しない。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示および説明のためのみのものであり、そして本発明の制限ではないことが、理解される。
（いくつかの定義）
本明細書中で使用される場合、用語「標的ポリヌクレオチド」とは、検出されることが求められるポリヌクレオチド配列をいう。標的ポリヌクレオチドは、任意の供給源から得られ得、そして任意の数の異なる組成上の成分を含み得る。例えば、標的は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、および任意の種々の小さい非翻訳ＲＮＡ（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９：１５６７−１５６９（２００５）を参照のこと）であり得、そして核酸アナログまたは他の核酸模倣物（ｍｉｍｉｃ）を含み得る。標的は、メチル化されても非メチル化されてもそれらの両方であってもよい。標的は、重硫酸塩処理され、そして非メチル化されたシトシンであり得、これはウラシルに変換され得る。さらに、「標的ポリヌクレオチド」とは、標的ポリヌクレオチド自体、およびその代わりのもの（例えば、増幅産物、およびネイティブの配列）をいい得ることが認識される。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、小さい標的ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、小さい標的ポリヌクレオチドは、２５ヌクレオチド長以下であり得る。いくつかの実施形態において、小さい標的ポリヌクレオチドは、２３ヌクレオチド塩基長以下であり得る。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、ポリ−Ａ尾部を欠く。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、例えば、法医学的サンプル中に見出され得るが、これに限定されないような分解した供給源に由来する小さいＤＮＡ分子である（例えば、Ｂｕｔｌｅｒ、２００１、Ｆｏｒｅｎｓｉｃ ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｅｈｉｎｄ ＳＴＲ Ｍａｒｋｅｒｓを参照のこと）。本教示の標的ポリヌクレオチドは、任意の多くの供給源に由来し得、これらの供給源としては、ウイルス、原核生物、真核生物（例えば、植物、真菌、および動物であるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの供給源としては、全血、組織生検、リンパ液、骨髄、羊水、毛髪、皮膚、精液、生物戦争薬剤（ｂｉｏｗａｒｆａｒｅ ａｇｅｎｔ）、肛門分泌物、膣分泌物、汗、唾液、頬のスワブ、種々の環境性サンプル（例えば、農作物（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ）、水、および土壌）、研究用サンプル（一般的に、精製したサンプル（一般的に、培養した細胞、および溶解した細胞）が挙げられ得るが、これらに限定されない。標的ポリヌクレオチドが、当該分野において公知である任意の種々の手段（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ、およびＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ６７００ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｂｏｏｍら、米国特許第５，２３４，８０９号、ｍｉｒＶａｎａ ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）など、ならびにＬａｏの米国仮特許出願「Ｐｕｒｅ ｍｉＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ」（２００５年９月１２日出願）に記載されるアプローチ）を使用し、サンプルから単離され得ることが認識される。標的ポリヌクレオチドは、分析前に切断されても、せん断されてもよく、これは、機械的な力、超音波処理、制限エンドヌクレアーゼによる切断、または当該分野において公知である任意の方法のような手順の使用を包含することが、認識される。一般的に、本教示の標的ポリヌクレオチドは、一本鎖であるが、いくつかの実施形態において、この標的ポリヌクレオチドは、二本鎖であり得、そして一本鎖は、変性から生じ得る。
本明細書中で使用される場合、用語「標的ポリヌクレオチドの３’末端領域」とは、リンカープローブの３’標的特異的部分がハイブリダイズする標的の領域をいう。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドの３’末端領域と、リンカープローブの５’末端との間にギャップが、ギャップを埋める伸長反応を伴って存在し得るが、一般的にこのようなシナリオは、二重鎖を不安定化するであろう効果に起因して、好ましくない。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ分子は、用語「ｍｉＲＮＡの３’末端領域」が使用される場合において、標的である。
本明細書中で使用される場合、用語「リンカープローブ」とは、対応する標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした場合に、その３’末端から伸長され得る３’標的特異的部分、ステム、およびループを含む分子をいう。例示的なリンカープローブは、本教示において図２Ａなどに示される。本教示のリンカープローブ、およびＰＣＲプライマーが、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、改変されたリボヌクレオチド、改変されたデオキシリボヌクレオチド、改変されたホスフェート−糖−骨格のオリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはそれらの組み合わせから構成され得ることが、認識される。種々のヌクレオチドアナログなどのいくつかの例示的な教示に関しては、Ｆａｓｍａｎ、１９８９、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｐｐ．３８５−３９４、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．、Ｌｏａｋｅｓ、Ｎ．Ａ．Ｒ．２００１、第２９巻：２４３７−２４４７、およびＰｅｌｌｅｓｔｏｒら、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００４年４月；１３（４）：５２１−５、それらにおいて引用される参考文献、ならびにこれらの概説を引用する最近の論文を参照のこと。所定の標的ポリヌクレオチド配列を照会するためのリンカープローブの選択、およびリンカープローブの回収によって所定の反応において照会する標的ポリヌクレオチド配列の回収の選択は、当該分野において一般的に公知である手順を包含し、そして最小の二次構造および三次構造を有する配列、ゲノムの他の領域との最小の配列重複性を含む標的、所望の熱力学的特性、および手近な状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）において望ましい他のパラメータを有する標的領域を選択するためのアルゴリズムの使用を包含し得ることが認識される。
本明細書中で使用される場合、用語「３’標的特異的部分」とは、標的ポリヌクレオチドに相補的であるリンカープローブの一本鎖部分をいう。３’標的特異的部分は、上記リンカープローブのステムから下流に配置される。一般的に、３’標的特異的部分は、６ヌクレオチド長と８ヌクレオチド長との間である。いくつかの実施形態において、３’標的特異的部分は、７ヌクレオチド長である。慣習的な実験が、他の長さをもたらし得ること、および８ヌクレオチドより長いか、または６ヌクレオチドより短い３’標的特異的部分もまた、本教示によって企図されることが、認識される。一般的に、３’標的特異的部分の最も３’側（３’−ｍｏｓｔ）のヌクレオチドは、フォワードプライマーの３’ヌクレオチドと、最小の相補性の重複を有するか、または全く重複を有さないべきである；これらの領域における重複は、その後の増幅反応において所望されないプライマーダイマーの増幅産物を産生し得ることが、認識される。いくつかの実施形態において、３’標的特異的部分の最も３’側のヌクレオチドと、フォワードプライマーの３’ヌクレオチドとの間の重複は、０ヌクレオチド、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、または３ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３ヌクレオチドより多くのヌクレオチドが、３’標的特異的部分の最も３’側のヌクレオチドと、フォワードプライマーの３’ヌクレオチドとの間で相補的であり得るが、一般的に、このようなシナリオは、その中に分散したさらなる非相補的なヌクレオチドを伴い得る。いくつかの実施形態において、改変された塩基（例えば、ＬＮＡ）は、上記リンカープローブのＴｍを上昇させるために３’標的特異的部分において使用され得る（例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３）、２１：２：７４−８１を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ユニバーサル塩基が、例えば、リンカープローブの、より小さいライブラリーを可能にするために使用され得る。ユニバーサル塩基はまた、未知の標的の検出を可能にするために、上記３’標的特異的部分中に使用され得る。ユニバーサル塩基のいくつかの説明に関しては、例えば、Ｌｏａｋｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１、第２９巻、第１２号、２４３７−２４４７を参照のこと。いくつかの実施形態において、改変（ＬＮＡおよびユニバーサル塩基が挙げられるが、これらに限定されない）は、逆転写の特異性を改良し得、そして検出の特異性を潜在的に向上させ得る。
本明細書中で使用される場合、用語「ステム」とは、上記３’標的特異的部分と上記ループとの間にあるリンカープローブの二本鎖領域をいう。一般的に、ステムは、６ヌクレオチド長と２０ヌクレオチド長との間（すなわち、合計で１２〜４０個の別個のヌクレオチドに対して、６〜２０個のヌクレオチドの相補的な対）である。いくつかの実施形態において、ステムは、８〜ヌクレオチド長〜１４ヌクレオチド長である。当業者は、６ヌクレオチドより短いステムおよび２０ヌクレオチドより長いステムが、慣習的な方法論の過程において、過度な実験を伴わずに同定され得ること、ならびにこのような、より短いステムおよびより長いステムが、本教示によって企図されることを認識する。いくつかの実施形態において、ステムは、ジップコード（ｚｉｐｃｏｄｅ）のような同定部分を含み得る。
本明細書中で使用される場合、用語「ループ」とは、本教示において図２Ａなどに示されるような、ステムの２つの相補鎖の間に位置するリンカープローブの領域をいう。代表的に、このループは、一本鎖ヌクレオチドを含むが、他の部分（改変されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、Ｃ１８のようなＣａｒｂｏｎスペーサー、および／またはＰＥＧ（ポリエチレングリコール））もまた、可能である。一般的に、このループは、４ヌクレオチド長と２０ヌクレオチド長との間である。いくつかの実施形態において、このループは、１４ヌクレオチド長と１８ヌクレオチド長との間である。いくつかの実施形態において、このループは、１６ヌクレオチド長である。当業者は、４ヌクレオチドより短いループおよび２０ヌクレオチドより長いループが、慣習的な方法論の過程において、過度な実験を伴わずに同定され得ること、ならびにこのような、より短いループおよびより長いループが、本教示によって企図されることを認識する。いくつかの実施形態において、このループは、リバースＰＣＲプライマー部分を含み得る。
本明細書中で使用される場合、用語「同定部分」とは、特定のリンカープローブ種を同定し、そしてその結果が標的ポリヌクレオチド配列の起源のサンプルを決定するために使用され得る部分をいい、そしてジップコード、既知の数の核酸塩基、およびそれらの組み合わせが挙げられる種々の識別可能な部分をいい得る。いくつかの実施形態において、同定部分、または同定部分相補体は、検出用プローブにハイブリダイズし得、それによって、解読反応において標的ポリヌクレオチド配列を検出し得る。用語「同定部分相補体」とは、代表的に、核酸塩基の少なくとも１つの配列を含み、その核酸塩基の配列が、それらの対応する同定部分と少なくとも実質的に相補的であり、そしてそれらの対応する同定部分とハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをいう。代表的に、同定部分およびそれらの対応する同定部分相補体は、内部の自己ハイブリダイゼーション；異なる同定部分の種、反応組成物中のヌクレオチド配列（ｇＤＮＡが挙げられるが、これに限定されない）、同定部分相補体の異なる種、またはプローブの標的特異的部分などとの、交差ハイブリダイゼーションを最小にするように選択されるが、同定部分とその対応する同定部分相補体との間の容易なハイブリダイゼーションに従うべきである。同定部分の配列および同定部分相補体の配列は、任意の適切な方法によって選択され得、この方法は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１２０１４およびＷＯ９６／４１０１１ならびに欧州公開番号ＥＰ ７９９，８９７に記載されるようなコンピューターアルゴリズム；ならびにＳａｎｔａＬｕｃｉａ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４６０−６５（１９９８））のアルゴリズムおよびパラメータであるが、これらに限定されない。同定部分の説明は、とりわけ、米国特許第６，３０９，８２９号（その中で「タグセグメント」と称される）；同第６，４５１，５２５号（その中で「タグセグメント」と称される）；同第６，３０９，８２９号（その中で「タグセグメント」と称される）；同第５，９８１，１７６号（その中で「グリッド（ｇｒｉｄ）オリゴヌクレオチド」と称される）；同第５，９３５，７９３号（その中で「識別子タグ（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ｔａｇ）」と称される）；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／９２５７９（その中で「アドレス可能な担体（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｓｕｐｐｏｒｔ）に特異的な配列」と称される）に見出される。いくつかの実施形態において、上記リンカープローブのステム、上記リンカープローブのループ、またはそれらの組み合わせは、同定部分を含み得、そして上記検出用プローブは、対応する同定部分にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態において、上記検出用プローブは、上記標的ポリヌクレオチドに対応する同定部分および配列の両方とハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの同定部分（同定部分相補体の二重鎖）は、互いに１０℃以下のΔＴｍ範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）の内に納まる融解温度を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの同定部分（同定部分相補体の二重鎖）は、互いに５℃以下のΔＴｍ範囲の内に納まる融解温度を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの同定部分（同定部分相補体の二重鎖）は、互いに２℃以下のΔＴｍ範囲の内に納まる融解温度を有する。
本明細書中で使用される場合、用語「伸長反応」とは、リンカープローブの上記３’標的特異的部分が伸長して、標的ポリヌクレオチドに相補的な鎖を有する伸長反応生成物が形成される延長反応をいう。いくつかの実施形態において、上記標的ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ分子であり、そして上記伸長反応は、逆転写酵素を含む逆転写反応である。いくつかの実施形態において、上記伸長反応は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａに由来するポリメラーゼを含む逆転写反応である。いくつかの実施形態において、上記伸長反応は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号Ｎ８０８−０１９２、およびＮ８０８−００９８）から市販されているようなｒＴｔｈポリメラーゼを含み得る。いくつかの実施形態において、上記標的ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡ分子であり、従って逆転写特性をも備えるポリメラーゼの使用により、本教示のいくつかの実施形態が、第１の逆転写反応、およびその後の増幅反応を包含し、それによって、本質的に単一の反応における２つの反応の統合を可能にし得ることが、認識される。いくつかの実施形態において、上記標的ポリヌクレオチドは、小さいＤＮＡ分子であり、そして上記伸長反応は、ポリメラーゼを含み、そしてＤＮＡの第２の鎖の合成をもたらす。いくつかの実施形態において、上記伸長反応およびその後の増幅反応の統合が、本教示によってさらに企図される。
本明細書中で使用される場合、用語「プライマー部分」とは、プライマーが任意の種々の当該分野において公知であるプライマーヌクレオチド伸長反応（例えば、ＰＣＲ）のためにアニールし得る際の鋳型として、直接機能し得るか、またはその相補体の効力によって機能し得るポリヌクレオチド配列の領域をいう。２つのプライマー部分が単一のポリヌクレオチド上に存在する場合に、この２つのプライマー部分の方向は、一般的には異なることが、当業者により認識される。例えば、一方のＰＣＲプライマーは、第１のプライマー部分に直接ハイブリダイズし得るが、他方のＰＣＲプライマーは、第２のプライマー部分の相補体にハイブリダイズし得る。さらに、本明細書中で使用される場合、「ユニバーサル」プライマーおよびプライマー部分は、一般的に、特定のアッセイおよび宿主ゲノムに対してできる限り固有であるように選択され、そのアッセイの特異性が確保される。
本明細書中で使用される場合、用語「フォワードプライマー」とは、伸長反応生成物部分および尾（ｔａｉｌ）部分を含むプライマーをいう。上記フォワードプライマーの伸長反応生成物部分は、伸長反応生成物にハイブリダイズする。一般に、上記フォワードプライマーの伸長反応生成物部分は、９ヌクレオチド長と１９ヌクレオチド長との間である。いくつかの実施形態において、上記フォワードプライマーの伸長反応生成物部分は、１６ヌクレオチドである。上記尾部分は、上記伸長反応生成物部分から上流に配置され、そして上記伸長反応生成物と相補的ではない；しかし、増幅のラウンド後において、上記尾部分は、増幅産物の相補的な配列にハイブリダイズし得る。一般に、上記フォワードプライマーの尾部分は、５ヌクレオチド長と８ヌクレオチド長との間である。いくつかの実施形態において、上記フォワードプライマーの尾部分は、６ヌクレオチド長である。当業者は、フォワードプライマーの尾部分の、５ヌクレオチドより短い長さおよび８ヌクレオチドより長い長さが、慣習的な方法論の過程において、過度な実験を伴わずに同定され得ること、ならびにこのような、より短いフォワードプライマーの尾部分の長さおよびより長いフォワードプライマーの尾部分の長さが、本教示によって企図されることを認識する。さらに、当業者は、９ヌクレオチド長より短い上記フォワードプライマーの伸長反応生成物部分の長さおよび１９ヌクレオチド長より長い上記フォワードプライマーの伸長反応生成物部分の長さが、慣習的な方法論の過程において、過度な実験を伴わずに同定され得ること、ならびにこのような、より短いフォワードプライマーの伸長反応生成物部分およびより長いフォワードプライマーの伸長反応生成物部分が、本教示によって企図されることを認識する。
本明細書中で使用される場合、用語「リバースプライマー」とは、伸長した場合に上記標的ポリヌクレオチドに相補的な鎖を形成するプライマーをいう。いくつかの実施形態において、上記リバースプライマーは、上記リンカープローブのループの領域と一致する。上記伸長反応の後、上記フォワードプライマーは伸長されて、第２の鎖生成物を形成し得る。上記リバースプライマーは、この第２の鎖生成物とハイブリダイズし、そして伸長されて増幅反応を継続し得る。いくつかの実施形態において、上記リバースプライマーは、上記リンカープローブのループの領域、上記リンカープローブのステムの領域、上記標的ポリヌクレオチドの領域、またはそれらの組み合わせと一致する。一般に、上記リバースプライマーは、１３ヌクレオチド長と１６ヌクレオチド長との間である。いくつかの実施形態において、上記リバースプライマーは、１４ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、上記リバースプライマーは、非相補的な尾部領域をさらに含み得るが、このような尾部は、必ずしも必要とされない。いくつかの実施形態において、上記リバースプライマーは、「ユニバーサルリバースプライマー」であり、このユニバーサルリバースプライマーは、上記リバースプライマーの配列が異なる標的ポリヌクレオチドを照会する複数の異なる反応において使用され得るが、それにもかかわらず上記リバースプライマーは同じ配列であることを示す。
本明細書中で使用される場合、用語「上流」は、分子生物学におけるその慣習上の意味を持ち、そして「下流」領域の５’側にあるポリヌクレオチドの領域の位置をいう。それに対応して、用語「下流」とは、「上流」領域の３’側にあるポリヌクレオチドの領域の位置をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション」とは、二重鎖、三重鎖、または他の高次構造の形成を生じる、１つの核酸と別の核酸との相補的な塩基対を形成する相互作用をいい、そして本明細書中で、「アニーリング」と交換可能に使用される。代表的に、一次相互作用は、ワトソン／クリックおよびフーグスティン型の水素結合によって塩基特異的（例えば、Ａ／ＴおよびＧ／Ｃ）である。塩基スタッキングおよび疎水性相互作用もまた、二重鎖安定性に寄与し得る。検出用プローブおよびプライマーを、相補的および実質的に相補的な標的配列にハイブリダイズさせるための条件は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．（１９８５）ならびにＪ．ＷｅｔｍｕｒおよびＮ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９以下参照（１９６８）に記載されるように周知である。一般に、このようなアニーリングが起こるか否かは、とりわけ、ポリヌクレオチドの長さおよび相補性、ｐＨ、温度、一価カチオンおよび二価カチオンの存在、ハイブリダイズする領域中のＧヌクレオチドおよびＣヌクレオチドの割合、媒体の粘性、ならびに変性剤の存在によって影響を受ける。このような可変性は、ハイブリダイゼーションに必要な時間に影響する。従って、好ましいアニーリング条件は、特定の用途に依存する。しかし、このような条件は、過度の実験を伴わずに、当業者によって慣用的に決定され得る。相補性が完全である必要はない（標的配列と本教示の一本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションをあまり妨げない、少数の塩基対ミスマッチが存在し得る）ことが、認識される。しかし、最低限にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションが起こり得ないほど塩基対ミスマッチの数が多い場合、その配列は、一般に、相補的な標的配列ではない。従って、本明細書中で相補性は、上記プローブまたはプライマーが本教示の目的を達成するために選択した反応条件下においてハイブリダイズするように、標的配列に十分に相補的であることが意味される。
本明細書中で使用される場合、用語「増幅する」とは、標的ポリヌクレオチド、標的ポリヌクレオチドを代理するもの、またはそれらの組み合わせの少なくとも一部が、代表的には鋳型依存性の様式で複製される任意の手段をいい、これらの手段としては、線形的かまたは指数関数的のいずれかで核酸配列を増幅する広範な技術が挙げられるが、これらに限定されない。増幅する工程を行なうための例示的な手順としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。本教示において使用され得るさらなる技術の説明は、とりわけ、以下において見出され得る：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版、；Ａｕｓｂｅｌら；ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｂｏｏｋ、Ｃｈａｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）、Ｍｓｕｉｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３４：５０１−０７（１９９６）；Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｒ．Ｒａｐｌｅｙ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００２）；Ａｂｒａｍｓｏｎら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９３年２月；４（１）：４１−７、米国特許第６，０２７，９９８号；同第６，６０５，４５１号、Ｂａｒａｎｙら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３１２５６；Ｗｅｎｚら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／９２５７９；Ｄａｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２９（１）：１５２−１６２（１９９５）、Ｅｈｒｌｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６４３−５０（１９９１）；ｌｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｆａｖｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：５６１−６４（２０００）；ならびにＲａｂｅｎａｕら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２８：９７−１０２（２０００）；Ｂｅｌｇｒａｄｅｒ、Ｂａｒａｎｙ、およびＬｕｂｉｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ、Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１９９５（ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｇｅｎｅｔｉｃｉｄｐｒｏｃ／ｕｓｓｙｍｐ６ｐｒｏｃ／ｂｌｅｇｒａｄ．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブ上で入手可能）；ＬＣＲ Ｋｉｔ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ、Ｃａｔ．＃２００５２０、Ｒｅｖ．＃０５０００２、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、２００２；Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８８−９３（１９９１）；ＢｉおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２９２４−２９５１（１９９７）；Ｚｉｒｖｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２７：ｅ４０ｉ−ｖｉｉｉ（１９９９）；Ｄｅａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：５２６１−６６（２００２）；ＢａｒａｎｙおよびＧｅｌｆａｎｄ、Ｇｅｎｅ １０９：１−１１（１９９１）；Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２０：１６９１−９６（１９９２）；Ｐｏｌｓｔｒａら、ＢＭＣ Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．２：１８−（２００２）；Ｌａｇｅら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００３年２月；１３（２）：２９４−３０７、ならびにＬａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４１：１０７７−８０（１９８８）、Ｄｅｍｉｄｏｖ，Ｖ．、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．２００２年１１月；２（６）：５４２−８．、Ｃｏｏｋら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３年５月；５３（２）：１６５−７４、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１年２月；１２（１）：２１−７、米国特許第５，８３０，７１１号、同第６，０２７，８８９号、同第５，６８６，２４３号、公開されたＰ．Ｃ．Ｔ．出願ＷＯ００５６９２７Ａ３、および公開されたＰ．Ｃ．Ｔ．出願ＷＯ９８０３６７３Ａ１。いくつかの実施形態において、新しく形成された核酸二重鎖は、最初に変性されないが、その後の１つ以上の工程においてそれらの二本鎖形態で使用される。伸長反応は、増幅する技術であり、この技術は、鋳型にアニールされるリンカープローブを、増幅する手段（例えば、ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素）を使用して５’方向から３’方向で伸長する工程を包含する。いくつかの実施形態に従って、適切な緩衝液、塩、ｐＨ、温度、およびヌクレオチド三リン酸（それらのアナログおよび誘導体を含む）によって（すなわち、適切な条件下において）、ポリメラーゼは、アニールされたリンカープローブの３’末端にて開始して、鋳型鎖に相補的なヌクレオチドを取り込んで、相補鎖を生成する。いくつかの実施形態において、伸長のために使用されるポリメラーゼは、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くか、または実質的に欠く。本教示のいくつかの実施形態において、非慣習的なヌクレオチド塩基は、上記増幅反応産物中に導入され得、そしてこの産物は、この産物がその後の増幅について鋳型として機能できないようにするために、酵素的手段（例えば、グリコシラーゼ）および／または物理化学的手段によって処理される。いくつかの実施形態において、ウラシルは、反応混合物において核酸塩基として含まれ得、それによって、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼの使用による先のウラシル含有産物の持ち越しを除染するその後の反応を可能にする（例えば、公開されたＰ．Ｃ．Ｔ．出願ＷＯ９２０１８１４Ａ２）。本教示のいくつかの実施形態において、任意の種々の技術が、例えば、Ｒａｄｓｔｒｏｍら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４年２月；２６（２）：１３３−４６に記載されるように、増幅の成功を容易にするために、増幅の前に利用され得る。いくつかの実施形態において、増幅は、例えば、米国特許第６，１５３，４２５号および同第６，６４９，３７８号に記載されるような、サンプルの調製および検出を包含する自己完結した統合型のアプローチにおいて達成され得る。可逆的に改変された酵素（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号に記載されるものが挙げられるが、これに限定されない）もまた、本開示の教示の範囲内である。本教示はまた、種々のウラシルベースの除染ストラテジーを企図し、ここで例えば、ウラシルは、増幅反応に組み込まれ得、次いで持ち越し産物は、種々のグリコシラーゼ処理によって除去される（例えば、米国特許第５，５３６，６４９号、およびＡｎｄｅｒｓｅｎらの米国仮特許出願６０／５８４６８２を参照のこと）。当業者は、所望の酵素的活性を有する任意のタンパク質が本開示の方法およびキットにおいて使用され得ることを理解する。逆転写酵素を含むＤＮＡポリメラーゼ、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼなどの説明は、とりわけ、Ｔｗｙｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９９；Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｇｕｉｄｅ、ｒｅｖ．０９２２９８、Ｐｒｏｍｅｇａ、１９９８；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃｓ；およびＡｕｓｂｅｌらにおいて見出され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「検出用プローブ」とは、増幅反応（代表的に、定量的ＰＣＲ分析またはリアルタイムＰＣＲ分析、およびエンドポイント分析のための）において使用される分子をいう。このような検出用プローブは、標的ポリヌクレオチドの増幅をモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態において、増幅反応において存在する検出用プローブは、生成されたアンプリコンの量を時間の関数としてモニタリングするのに適切である。このような検出用プローブとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：本明細書中に記載される５’−エキソヌクレアーゼアッセイ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））プローブ（米国特許第５，５３８，８４８号もまた参照のこと）、種々のステムループ分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号、および５，９２５，５１７号、ならびにＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８を参照のこと）、ステムのないビーコンもしくは直鎖状ビーコン（例えば、ＷＯ９９／２１８８１を参照のこと）、ＰＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｅａｃｏｎｓＴＭ（例えば、米国特許第６，３５５，４２１号および同第６，５９３，０９１号を参照のこと）、直鎖状ＰＮＡビーコン（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａら、２００１、ＳＰＩＥ ４２６４：５３−５８を参照のこと）、非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照のこと）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（登録商標）／Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）プローブ（米国特許第６，５４８，２５０号）、ステムループおよび二重鎖のＳｃｏｒｐｉｏｎＴＭプローブ（Ｓｏｌｉｎａｓら、２００１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２９：Ｅ９６および米国特許第６，５８９，７４３号）、バルジループプローブ（米国特許第６，５９０，０９１号）、偽ノット（ｐｓｅｕｄｏ ｋｎｏｔ）プローブ（米国特許第６，５８９，２５０号）、サイクリコン（米国特許第６，３８３，７５２号）、ＭＧＢ ＥｃｌｉｐｓｅＴＭプローブ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘアピンプローブ（米国特許第６，５９６，４９０号）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）点灯プローブ、自己集合ナノ粒子プローブ、ならびに、例えば米国特許第６，４８５，９０１号；Ｍｈｌａｎｇａら、２００１、Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４６３−４７１；Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７：８０４−８０７；Ｉｓａｃｓｓｏｎら、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ．１４：３２１−３２８；Ｓｖａｎｖｉｋら、２０００、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１：２６−３５；Ｗｏｌｆｆｓら、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７６６：７６９−７７１；Ｔｓｏｕｒｋａｓら、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３０：４２０８−４２１５；Ｒｉｃｃｅｌｌｉら、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３０：４０８８−４０９３；Ｚｈａｎｇら、２００２、Ｓｈａｎｇｈａｉ．３４：３２９−３３２；Ｍａｘｗｅｌｌら、２００２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９６０６−９６１２；Ｂｒｏｕｄｅら、２００２、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：２４９−５６；Ｈｕａｎｇら、２００２、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１５：１１８−１２６；およびＹｕら、２００１、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１４：１１１５５−１１１６１に記載されるフェロセン修飾プローブ。検出用プローブはまた、クエンチャーを含み得、このクエンチャーとしては、ブラックホール（ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ）クエンチャー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（ＩＤＴ）、ＱＳＹクエンチャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ならびにＤａｂｓｙｌおよびＤａｂｃｅｌのスルホネート／カルボキシレートＱｕｅｎｃｈｅｒ（Ｅｐｏｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。検出用プローブはまた、２つのプローブを含み得、ここで例えば、蛍光（ｆｌｕｏｒ）が、一方のプローブ上にあり、そしてクエンチャーは、他方のプローブ上にあり、標的に対する上記２つのプローブの同時のハイブリダイゼーションは、シグナルを消光するか、またはその標的に対するハイブリダイゼーションは、蛍光の変化によってシグナルのサインを変化させる。検出プローブはまた、カルボキシレート基の代わりにＳＯ３を有するフルオレセイン色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホラミダイト形態、ＣＹ ５のホスホラミダイト形態（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍから市販されている）を含む。いくつかの実施形態において、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、およびＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）のようなインターカレートする標識が使用され、それによって、検出用プローブの非存在下における増幅産物の、リアルタイム、またはエンドポイントでの可視化を可能にする。いくつかの実施形態において、リアルタイムの可視化は、インターカレートする検出用プローブおよび利用され得る配列ベースの検出用プローブの両方を含み得る。いくつかの実施形態において、上記検出用プローブは、上記増幅反応において相補的な配列にハイブリダイズしなかった場合に、少なくとも部分的に消光され、そして上記増幅反応において相補的な配列にハイブリダイズした場合に、少なくとも部分的に消光されない。いくつかの実施形態において、本教示の検出用プローブは、６３〜６９℃のＴｍを有するが、本教示によって導かれて、慣用的な実験が他のＴｍを有する検出用プローブを生じ得ることが、認識される。いくつかの実施形態において、プローブは、所望の熱力学的特性をさらに提供するために、種々の改変（例えば、副溝（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）結合剤）（例えば、米国特許第６，４８６，３０８号を参照のこと）をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、検出用プローブは、同定部分または同定部分相補体に対応し得る。いくつかの実施形態において、上記同定部分または同定部分相補体、および対応する検出用プローブは、２つのヌクレオチドのみが変化し得る。例えば、サンプルＡをコードする第１の同定部分は、２つのヌクレオチド塩基のみがサンプルＢをコードする第２の同定部分と異なり得る。それに対応して、上記２つの検出用プローブは、２つのヌクレオチド塩基のみが互いに異なり得る。このような構成は、上記２つの検出用プローブの活性の間の望まれないバリエーションを最小化し得、従って上記２つのサンプルの間で所与の標的ポリヌクレオチドの間の発現レベルの相違を正確に定量化する能力を改良する。いくつかの実施形態において、上記検出用プローブは、わずかに単一のヌクレオチドによって互いに異なり得る。いくつかの実施形態において、上記検出用プローブは、３つのヌクレオチドが異なり得る。いくつかの実施形態において、上記検出用プローブは、４つのヌクレオチドが異なり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「対応する」とは、この用語が言及するエレメントの間の特定の関係をいう。「対応する」のいくつかの非限定的な例としては、以下が挙げられる：リンカープローブは、標的ポリヌクレオチドと一致し得、そしてその逆もまた同様である；フォワードプライマーは、標的ポリヌクレオチドと一致し得、そしてその逆もまた同様である；リンカープローブは、所与の標的ポリヌクレオチドに対するフォワードプライマーと一致し得、そしてその逆もまた同様である；上記リンカープローブの３’標的特異的部分は、標的ポリヌクレオチドの３’領域と一致し得、そしてその逆もまた同様である；検出用プローブは、標的ポリヌクレオチドの特定の領域と一致し得、そしてその逆もまた同様である；検出用プローブは、特定の同定部分と一致し得、そしてその逆もまた同様である。いくつかの場合において、対応するエレメントは、相補的であり得る。いくつかの場合において、対応するエレメントは、互いに相補的ではないが、一方のエレメントは、他方のエレメントの相補体に相補的であり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「またはそれらの組み合わせ」とは、この用語に先行する列挙された品目の全ての順列および組み合わせをいう。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組み合わせ」は、以下の少なくとも１つを含むことを意図する：Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣ、および順序が特定の文脈において重要である場合にはまた、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、またはＣＡＢ。この例を突き詰めると、１つ以上の品目または用語の反復を含む組み合わせ（ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなど）が、明白に含まれる。当業者は、代表的には、その文脈から明らかでない限り、あらゆる組み合わせにおいて品目または用語の数に制限が存在しないことを、理解する。
本明細書中で使用される場合、一般に、用語「反応容器」とは、反応が本教示に従って起こり得る任意の容器をいう。いくつかの実施形態において、反応容器は、エッペンドルフチューブ、および現代的な分子生物学の実験室での一般的な実施におけるそのような他の容器であり得る。いくつかの実施形態において、反応容器は、マイクロタイタープレート中のウェル、スライドガラス上のスポット、または遺伝子発現用のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ（かつてのＭｉｃｒｏＣａｒｄＴＭ）中のウェルであり得る。例えば、複数の反応容器が、同一の支持体上に備わり得る。いくつかの実施形態において、例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ ａｎｄ Ｆｌｕｉｄｇｍから入手可能なラボ−オン−ア−チップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）のようなデバイスは、反応容器を提供し得る。いくつかの実施形態において、Ｗｅｎｚらの米国仮特許出願１１／０５９、８２４に記載されるような種々の微小流体アプローチ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ）が、利用され得る。種々の反応容器は、当該分野において利用可能であり、そして本教示の範囲内であることが、認識される。
本明細書中で使用される場合、用語「検出」とは、標的ポリヌクレオチドの存在および／または含量および／または正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を決定する任意の種々の方法をいう。供与体部分とシグナル部分を利用するいくつかの実施形態において、特定のエネルギー転移蛍光染料を使用することができる。供与体（供与体部分）と受容体（シグナル部分）との対の特定の非限定的な例は、例えば、米国特許第５，８６３，７２７号、同第５，８００，９９６号、および同第５，９４５，５２６号に例示される。供与体と受容体とのいくつかの組み合わせを使用することは、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）とも呼ばれている。いくつかの実施形態において、シグナル伝達プローブとして使用され得るフルオロフォアとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ローダミン、シアニン３（Ｃｙ ３）、シアニン５（Ｃｙ ５）、フルオレセイン、ＶｉｃＴＭ、ＬｉｚＴＭ、ＴａｍｒａＴＭ、５−ＦａｍＴＭ、６−ＦａｍＴＭ、およびテキサスレッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（ＶｉｃＴＭ、ＬｉｚＴＭ、ＴａｍｒａＴＭ、５−ＦａｍＴＭ、および６−ＦａｍＴＭは、全てＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ．から入手可能である）。いくつかの実施形態において、励起光への応答における蛍光シグナルを与える検出用プローブの量は、代表的に、増幅反応において生成される核酸の量と関係がある。従って、いくつかの実施形態において、蛍光シグナルの量は、増幅反応においてもたらされる生成物の量に関連する。従って、このような実施形態において、蛍光指示薬からの蛍光シグナルの強度を測定することによって、増幅産物の量を測定し得る。いくつかの実施形態に従って、内部標準を用いて、蛍光シグナルにより示される増幅産物を定量し得る。例えば、米国特許第５，７３６，３３３号を参照のこと。蛍光指示薬を含有する組成物を用いた熱サイクリング反応の実施、特定の波長の光線の放射、蛍光色素の強度の読み取り、および各サイクル後の蛍光の強度の呈示を行い得るデバイスが開発されている。サーマルサイクラー、光線放射器、および蛍光シグナル検出器を備えるデバイスが、例えば、米国特許第５，９２８，９０７号；同第６，０１５，６７４号；および同第６，１７４，６７０号において記載されており、そしてこれらには、以下が含まれるが、これらに限定されない：ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７３００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。いくつかの実施形態において、これらの各々の機能は、別々のデバイスによって実施され得る。例えば、増幅のためにＱ−βレプリカーゼ反応を用いる場合、この反応は、サーマルサイクラーで行われなくてもよいが、特定の波長で放射される光線、蛍光シグナルの検出、ならびに増幅産物の量の算出および呈示を含み得る。いくつかの実施形態において、熱サイクリングデバイスと蛍光検出デバイスとの組み合わせが、サンプル中での標的核酸配列の正確な定量のために使用され得る。いくつかの実施形態において、蛍光シグナルは、１つ以上の熱サイクルの間および／または後に検出され、そして呈示され得、従って、反応が「リアルタイム」で生じるにつれて増幅産物をモニタリングすることを可能にする。いくつかの実施形態において、どの程度の標的核酸配列が増幅前にサンプル中に存在したかを算出するために、増幅産物の量および増幅サイクルの数を使用し得る。いくつかの実施形態において、単に、サンプル中の標的核酸配列の存在を示すために十分な所定数のサイクル後に、増幅産物の量をモニタリングし得る。当業者は、任意の所与のサンプル型、プライマー配列、および反応条件について、所与の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するために、何回のサイクルが十分であるかを容易に決定し得る。本明細書中で使用される場合、標的の存在を決定する工程は、その標的を同定する工程、および必要に応じて、その標的を定量化する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、増幅産物は、所与の数のサイクルが完了するとすぐに、ポジティブまたはネガティブとしてスコア付けされ得る。いくつかの実施形態において、結果は、データベースに対して、電子的に直接伝達されて、表にまとめられ得る。従って、いくつかの実施形態において、このような機器が使用される場合に、必要な時間および労働力を少なくして、多数のサンプルが処理および分析され得る。いくつかの実施形態において、異なる検出用プローブは、異なる標的ポリヌクレオチド間を識別し得る。このようなプローブの非限定的な例は、５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ分子）であり、ここで蛍光分子は、オリゴヌクレオチド連結エレメントを介して蛍光消光分子に付着されている。いくつかの実施形態において、５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブのオリゴヌクレオチド連結エレメントは、同定部分またはその相補体の特定の配列に結合する。いくつかの実施形態において、異なる５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブ（各々、異なる波長で蛍光する）が、同じ増幅反応内の異なる増幅産物の間を識別し得る。例えば、いくつかの実施形態において、２つの異なる波長（ＷＬＡおよびＷＬＢ）で蛍光し、そして２つの異なる伸長反応生成物（それぞれ、Ａ’およびＢ’）の２つの異なるステム領域に対して特異的である、２つの異なる５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブを使用し得る。増幅産物Ａ’は、標的核酸配列Ａがサンプル中にある場合に形成され、そして増幅産物Ｂ’は、標的核酸配列Ｂがサンプル中にある場合に形成される。いくつかの実施形態において、増幅産物Ａ’および／またはＢ’は、適切な標的核酸配列がサンプル中に存在しなくても形成し得るが、このような増幅は、適切な標的核酸配列がサンプル中にある場合よりも少ない程度に、測定可能に生じる。増幅後、検出されるシグナルの波長およびそれらの強度に基づいて、どの特異的標的核酸配列がサンプル中に存在するかを決定し得る。従って、波長ＷＬＡのみの適切な検出可能なシグナル値が検出される場合、サンプルが標的核酸配列Ａを含むが、標的核酸配列Ｂを含まないことが分かる。波長ＷＬＡおよびＷＬＢの両方の適切な検出可能なシグナル値が検出される場合、サンプルが標的核酸配列Ａおよび標的核酸配列Ｂの両方を含むことが分かる。いくつかの実施形態において、検出は、任意の種々の移動度依存性の分析技術によって生じ得、この分析技術は、異なる分析物種の間の移動の差次的な速度に基づく。例示的な移動度依存性の分析技術としては、電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析、沈降（例えば、勾配遠心分離）、流動分画、多段階抽出技術などが挙げられる。いくつかの実施形態において、移動度プローブは、増幅産物にハイブリダイズされ得、そして標的ポリヌクレオチドの同一性は、例えば、Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍらの公開されたＰ．Ｃ．Ｔ．出願ＷＯ０４／４６３４４、およびＷｅｎｚらのＷＯ０１／９２５７９に記載されるように、溶離した移動度プローブの移動度依存性の分析技術を介して決定される。いくつかの実施形態において、検出は、種々のマイクロアレイおよび関連するソフトウェア（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ １７００ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを備えたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍおよびとりわけ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、およびＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な他の市販されているアレイシステム）によって達成され得る（Ｇｅｒｒｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：２５１−６２、１９９９；Ｄｅ Ｂｅｌｌｉｓら、Ｍｉｎｅｒｖａ Ｂｉｏｔｅｃ １４：２４７−５２、２００２；およびＳｔｅａｒｓら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１４０−４５（補遺、２００３を含む）も参照のこと）。検出が、標識されたプライマーの一部としてかもしくは増幅の間の標識されたｄＮＴＰの取り込みに起因するかのいずれかで反応生成物中に取り込まれるレポーター群または、反応生成物に付着したレポーター群（例えば、レポーター群を含むハイブリダイゼーションタグの相補体、または反応生成物に不可欠であるかもしくは反応生成物に付着するリンカーアームを介するが、これらに限定されない）を含み得ることがまた、認識される。例えば、質量分析を使用した未標識の反応生成物の検出もまた、本教示の範囲内である。
（例示的な実施形態）
図１は、本教示に従った特定の方法の概要を示す。ここで、第１のサンプル（Ａ）および第２のサンプル（Ｂ）は、別個の反応容器中に示される。上記第１の反応容器は、サンプルＡ由来の標的ポリヌクレオチド（例えば、マイクロＲＮＡ）を含み得、そして第２の反応は、サンプルＢ由来のマイクロＲＮＡを含み得る。例えば、サンプルＡは、野生型の生物学的供給源に由来し得、そしてサンプルＢは、変異型の生物学的供給源に由来し得る。処理（例えば、サンプルＡ中のマイクロＲＮＡを伸長生成物に変換し、そしてサンプルＢ中のマイクロＲＮＡを伸長生成物に変換する逆転写反応）の後、上記２つのサンプルは１つに混合されて、単一の反応容器がＡ＋Ｂを含み得る。次いで例えば、微小流体カード上でのリアルタイムＰＣＲ、またはエンドポイントＰＣＲを行い、次いでハイブリダイゼーションアレイを実施することによる検出を使用して解読反応の収集を行い得、上記２つのサンプルの間のマイクロＲＮＡの発現レベルを比較し得る。
図２Ａは、本教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物を示す。ここで、３’標的特異的部分（３）、ステム（４）、およびループ（５）を例示する第１のリンカープローブ（１）が、示される。また、３’標的特異的部分（６）、ステム（７）、およびループ（８）を例示する第２のリンカープローブ（２）が、示される。注目すべきは、第１のリンカープローブのステム（４）は、実線で示され、一方、第２のリンカープローブのステム（７）は、破線で示され、第１のリンカープローブのステム（４）の配列は、第２のリンカープローブのステム（７）の配列と異なることである。従って、これらのステムの配列は、ジップコードと見なされ得る。従って、サンプルＡの正体は、例えば、上記第１のリンカープローブのステム中に配置される第１のジップコード配列によってコードされ得、そしてサンプルＢの正体は、上記第２のリンカープローブのステム中に配置される第２のジップコード配列によってコードされ得る。上記第１のリンカープローブのループおよび上記第２のリンカープローブのループは、ユニバーサルリバースプライマーをコードし得る同じ配列を含み得る。
図２Ｂ（最上部）において、サンプルＡ由来のｍｉＲＮＡは、第１の反応容器中の第１のリンカープローブ（１）にハイブリダイズされ、そしてサンプルＢに由来するｍｉＲＮＡは、第２の反応容器中の第２のリンカープローブ（２）にハイブリダイズされる。サンプルＡ由来のｍｉＲＮＡの種は、サンプルＢ由来のｍｉＲＮＡの種と同じものと見なされ得る。従って、上記第１のリンカープローブの３’標的特異的部分の配列（ＴＴＣＡＣＡＣとして示される）は、第２のリンカープローブの３’標的特異的部分（ＴＴＣＡＣＡＣとして示される）と同じものである。上記第１の反応容器中のｍｉＲＮＡに対する第１のリンカープローブのハイブリダイゼーションおよび上記第２の反応容器中のｍｉＲＮＡに対する第２のリンカープローブのハイブリダイゼーションの後、１つ以上の下流の反応が、行われ得る。例えば、本教示のいくつかの実施形態において、上記リンカープローブは、連結反応においてｍｉＲＮＡ分子に対して連結される（中央）。次いでその連結産物は、伸長反応に供され、ここで酵素（例えば、ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素）が利用されて、標的ポリヌクレオチドに相補的な鎖を形成するために上記リンカープローブの３’末端を伸長する。いくつかの実施形態において、上記リンカープローブは、上記ｍｉＲＮＡ分子に連結されず、そして伸長反応は、ハイブリダイズしたリンカープローブ／ｍｉＲＮＡ複合体上で行なわれる。上記２つの反応容器の各々における伸長反応生成物の生成の後、その次の加熱工程は、その分子のＲＮＡ成分を分解し、インタクトな核酸の新しく合成された鎖を残し得る（最下部）。
図２Ｃに示される通り、第１のリンカープローブ（１）を有するサンプルＡ由来の伸長生成物、および第２のリンカープローブ（２）を有するサンプルＢ由来の伸長生成物は、１つに混合され得、そしてリアルタイムＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎＴＭ）が行われ得る。ここで、上記ＰＣＲにおける第１の検出用プローブは、フルオロフォア（ｆｌｏｒｏｐｈｏｒｅ）Ｖｉｃを示す標識（Ｖ）、およびクエンチャー（Ｑ）を有する実線として表される。この第１の検出用プローブは、サンプルＡ由来のｍｉＲＮＡ伸長生成物を照会するように設計される。さらに、上記ＰＣＲにおける第２の検出用プローブは、フルオロフォアＦａｍを示す標識（Ｆ）、およびクエンチャー（Ｑ）有する破線として示される。この第２の検出用プローブは、サンプルＢ由来のｍｉＲＮＡ伸長生成物を照会するように設計される。ｍｉＲＮＡ特異的なフォワードプライマーおよびユニバーサルリバースプライマーは、上記ＰＣＲに含まれる。従って、単一のプライマー対が使用されて、サンプルＡ由来のｍｉＲＮＡおよびサンプルＢ由来のｍｉＲＮＡが増幅され得る。上記第１の検出用プローブと上記第２の検出用プローブとの間のシグナルにおける相違を使用して、上記リアルタイムＰＣＲでのサンプルＡとサンプルＢとの間のｍｉＲＮＡの発現レベルにおける相違が定量化され得る。
上記ループは、本教示のいくつかの実施形態において、上記リバースプライマーに対応し得ることが、認識される。いくつかの実施形態において、上記検出用プローブは、上記増幅産物中の標的ポリヌクレオチドの３’末端領域に対応する、上記増幅産物の領域と一致し得、そして上記増幅産物中の標的ポリヌクレオチドの３’末端領域から上流の領域と一致し得、そして上記増幅産物中のリンカープローブのステムと一致し得る。いくつかの実施形態において、上記ステムの上流領域、および上記ループは、上記リバースプライマーに対応し得る。いくつかの実施形態において、上記検出用プローブは、上記増幅産物中のリンカープローブのステムと一致し得る。いくつかの実施形態において、上記ステムの上流領域、および上記ループは、上記リバースプライマーに対応し得る。これらの組成物の異なる機能領域を実現するための種々の関連したストラテジーが、本教示の観点から可能であること、およびこのような誘導体が、当業者にとって過度の実験を伴わない慣用的なものであることが、認識される。さらに、リンカープローブの例示的な設計の特徴は、Ｃｈｅｎらの米国非仮出願１０／９４７，４６０の図２に見出され得る。
本教示のいくつかの実施形態において、図２に示される通り、リアルタイムアッセイよりもむしろ、エンドポイントアッセイが、行われ得る。例えば、Ｆａｍ／ＶｉｃのＲｎ値の比は、サンプルＢと比較した場合のサンプルＡにおけるｍｉＲＮＡの相対的な豊富さを決定し得る。
図３において、２つのサンプル中のｍｉＲＮＡを照会するためのアプローチは、マイクロアレイの読み出しによって示される。図３Ａに示される通り、上部のリンカープローブのステムは、ジップコード１をコードし得るのに対して、下部のリンカープローブのステムは、ジップコードＮをコードし得る。従って、複数の異なるｍｉＲＮＡ種１〜Ｎは、複数の異なるジップコード１〜Ｎによってコードされ得る。さらに、第１の複数のｍｉＲＮＡ起源（Ａ）のサンプルは、各フォワードプライマーの尾部中のユニバーサルプライマーＡ部分によってコードされ得、そして第２の複数のｍｉＲＮＡ起源（Ｂ）のサンプルは、各フォワードプライマーの尾部中のユニバーサルプライマーＢ部分によってコードされ得る。この状況において、サンプルＡに対するコード化ＰＣＲ（ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＰＣＲ）は、サンプルＢに対するコード化ＰＣＲが行なわれる反応容器とは別の反応容器中で行なわれる。各コード化ＰＣＲは、それらの適切なユニバーサル尾部を有する複数の標的特異的なフォワードプライマーを含み、同じく上記リンカープローブのループ中にコードされたリバースプライマーを含む。次いで二次ＰＣＲが、行われ得、ここでサンプルＡとサンプルとが１つに混合される。識別可能な標識（Ｆ１−フルオロフォア１）によって標識されたユニバーサルプライマーＡは、サンプルＡに由来する標的を伸長し、そして識別可能な異なる標識（Ｆ２−フルオロフォア２）によって標識されたユニバーサルプライマーは、サンプルＢに由来する標的を伸長する。類似するＴｍの特徴およびプライマーＡとプライマーＢとの交差ハイブリダイゼーションを最低限にすることを保証するための手段は、反応の特異性を保存するために行なわれる。次いで、得られた混合型の標識されたＰＣＲアンプリコンは、解読用のマイクロアレイにハイブリダイズされ得る。ここで、そのマイクロアレイは、対応する相補的なジップコード配列を有するスポットを含む。従って、所与のスポットは、標的ポリヌクレオチドの所与の種に対するハイブリダイゼーションをもたらす。Ｆ１〜Ｆ２のシグナルの比は、上記２つのサンプルの間の所与の標的ポリヌクレオチドについての発現レベルにおける相違の尺度を提供する。
本教示はまた、リンカープローブ以外の構成を比較する反応を企図する。例えば、いくつかの実施形態において、粘着末端を有する２つのハイブリダイズした分子が、利用され得、ここで例えば、重複する３’粘着末端は、標的ポリヌクレオチドの３’末端領域とハイブリダイズする。本教示において利用され得る２つの分子の構成のいくつかの説明は、Ｃｈｅｎら、米国非仮出願１０／９８２，６１９に見出され得る。本明細書中の本教示の観点から考えて、当業者は、１０／９８２，６１９のアプローチがまた、標的ポリヌクレオチドより長い伸長反応生成物を生じるために利用され得ることを認識する。より長いこれらの生成物は、例えば、上記反応生成物に導入されるさらなるヌクレオチドの利点を採ることによって、検出用プローブを用いて検出され得る。
しかし、一般に、本教示のループ構造は、標的ポリヌクレオチド−リンカープローブ二重鎖のＴｍを上昇させる。任意の特定の理論に制限されずに、この上昇したＴｍは、塩基スタッキング効果に起因し得るらしい。また、本教示のリンカープローブの特徴は、上記伸長反応および／またはその後の増幅反応（例えばＰＣＲ）の間の非特異的なプライミングを最小化し得る。さらに、本教示のリンカープローブは、ｍｉＲＮＡの成熟形態と前駆形態とを良好に区別し得る。
具体的には、本教示は、上記リンカープローブが、標的ポリヌクレオチドに連結される実施形態、および例えば、Ｃｈｅｎら、米国非仮出願１０／９４７，４６０に記載されるような、上記リンカープローブが、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされるが、標的ポリヌクレオチドに連結されない実施形態を企図する。
本教示はまた、コード化反応スキームおよび解読反応スキームを企図し、例えば、Ａｎｄｅｒｓｅｎら、米国非仮出願１１／０９０，８３０およびＬａｏら、米国仮特許出願１１／０９０，４６８に記載されるように、ここで第１のコード化伸長反応の後に、第２の解読する増幅反応が続く。
本教示はまた、例えば、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら、米国特許第６，２７０，９６７号に記載されるような、多重増幅ストラテジーにおいて異なる分子の数を最小化する、種々のストラテジーを企図する。
単一工程アッセイの背景、および小さいプライマー組成物の背景において本教示のリンカープローブを使用するためのさらなるストラテジーは、ＬａｏおよびＳｔｒａｕｓの出願された米国非仮出願１０／９４４，１５３、ならびにＥｌｆａｉｔｏｕｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２００４、３０（２）：１５０−１５６に見出され得る。
本教示が癌の診断および幹細胞の分化に関する新規の生物マーカーを発見するために利用され得る種々の背景は、Ｂｌｏｃｈらの米国仮特許出願６０／６８６，２７４に見出され得る。
（キット）
特定の実施形態において、本教示はまた、特定の方法を実行することを促進するように設計されたキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、本方法を実施するのに使用される２つ以上の構成要素を組み合わせることによって目的の方法の実行を促進するように機能する．いくつかの実施形態において、キットは、最終消費者による測定に対する必要性を最小限にするために、予め測定された単位量で構成要素を含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、本教示の１つ以上の方法を実行するための説明書を備え得る。特定の実施形態において、上記キットの構成要素は、互いに組み合わせて機能するように最適化される。
例えば、本教示は、逆転写酵素、第１の反応容器中の第１のリンカープローブ、および第２の反応容器中のおよび第２のリンカープローブを備えるキットを提供し、ここでこの第１のリンカープローブは、ステム、ループ、および３’標的特異的部分を含み、この３’標的特異的部分は、ｍｉＲＮＡに対応し、そしてこのステムは、第１のサンプルの起源の正体をコードする第１の同定部分（例えば、ジップコード）をコードし、そしてここでこの第２のリンカープローブは、ステム、ループ、および３’標的特異的部分を含み、この３’標的特異的部分は、ｍｉＲＮＡに対応し、そしてこのステムは、第２のサンプルの起源の正体をコードする第２の同定部分（例えば、ジップコード）をコードする。いくつかの実施形態において、上記キットは、ＤＮＡポリメラーゼを備え得る。いくつかの実施形態において、上記キットは、プライマー対を備え得る。いくつかの実施形態において、上記キットは、ｍｉＲＮＡに特異的なフォワードプライマー、およびユニバーサルリバースプライマーをさらに備え得、ここでこのユニバーサルリバースプライマーは、上記リンカープローブのループのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、上記キットは、複数のプライマー対を備え得、ここで各プライマー対は、複数の反応容器のうちの１つの反応容器中にある。いくつかの実施形態において、上記キットは、第１の検出用プローブおよび第２の検出用プローブを備え得る。いくつかの実施形態において、上記第１の検出用プローブは、増幅産物中の第１のリンカープローブのステム中の第１の同定部分のヌクレオチド、または増幅産物中の第１のリンカープローブのステムの相補体のヌクレオチドを含み、そしてこの第１の検出用プローブは、増幅産物中のｍｉＲＮＡの３’末端領域のヌクレオチド、または増幅産物中のｍｉＲＮＡ相補体の３’末端領域のヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記第２の検出用プローブは、増幅産物中の第２のリンカープローブのステム中の第２の同定部分のヌクレオチド、または増幅産物中の第２のリンカープローブのステムの相補体のヌクレオチドを含み、そしてこの第２の検出用プローブは、増幅産物中のｍｉＲＮＡの３’末端領域のヌクレオチド、または増幅産物中のｍｉＲＮＡ相補体の３’末端領域のヌクレオチドをさらに含む。
本教示は、ハイブリダイズするための手段、連結のための手段、伸長するための手段、増幅するための手段、検出するための手段、またはそれらの組み合わせを備えるキットをさらに企図する。
本教示は、これらの例示的な実施形態に関して記載されているが、当業者は、これらの例示的な実施形態の多くのバリエーションおよび改変が過度な実験を伴わずに可能であることを容易に理解する。全てのこのようなバリエーションおよび改変は、本教示の範囲内である。本教示の局面は、以下の実施例を考慮してさらに理解され得、この実施例は、決して本教示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
シングルプレックス（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｌｅｘ）反応を脳サンプルおよび肝臓サンプル由来のマウスｍｉＲＮＡの収集物に対して行い、ｍｉＲＮＡ標的ポリヌクレオチドの発現レベルを比較することができる。
最初に、以下を含む２つの並行した６μｌの反応を準備する：１μｌのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ品番４３４０４４４）、０．５μｌのｄＨ２Ｏ、０．２５μｌの２Ｍ ＫＣＩ、０．０５μｌのｄＮＴＰ（各２５ｍＭ）、１μｌの１０×ＲＴ緩衝液、０．２５μｌのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１０単位／μｌ）、および２．２μｌのｄＨ２Ｏ。次に、２μｌの第１のリンカープローブ（０．２５μＭ）およびＲＮＡサンプル（２μｌの０．２５μｇ／μｌマウス肝臓全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、製品番号７８１０））を、第１の反応に添加し、そして、２μｌの第２のリンカープローブ（０．２５μＭ）およびＲＮＡサンプル（２μｌの０．２５μｇ／μｌマウス脳全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、製品番号７８１２））を、第２の反応に添加する。次に、各反応を、混合し、軽くスピンし、そして氷上に５分間おいた。その後、各反応を、４２℃にて３０分間インキュベートし、次いで８５℃にて５分間インキュベートし、次いで４℃に保つ。その後、これらの反応を、１つに混合し、そしてＰＣＲ増幅の前に３０μｌのｄＨ２Ｏを添加することによって４倍に希釈する。
その後、１０μｌのＰＣＲ増幅を、準備する：２μｌの希釈した逆転写反応産物、１．３μｌの１０μＭ ｍｉＲＮＡ特異的Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ、０．７μｌの１０μＭ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ、０．２μｌの第１のＴａｑＭａｎ検出用プローブ、０．２μｌの第２のＴａｑＭａｎ検出用プローブ、０．２μｌのｄＮＴＰ（各２５ｍＭ）、０．６μｌのｄＨ２Ｏ、５μｌの２×ＴａｑＭａｎマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＮＧを含まない）。この反応を、１０分間の９５℃の工程によって開始する。その後、各々、１５秒間の９５℃、および１分間の６０℃を含むサイクルを、４０回行う。第２のＴａｑＭａｎ検出用プローブからのシグナルに対する第１のＴａｑｍａｎ検出用プローブからのシグナルの比較は、目的のマイクロＲＮＡについての発現レベルにおける相違の尺度を与える。
種々のプライマーおよび本教示に適用できるプローブについての例示的な設計は、表２を含めて、米国非仮出願１０／９４７，４６０に見出され得る。
本開示の教示は、種々の適用、方法、キット、および組成物を参照して記載されているが、種々の変化および改変は、本明細書中の教示から逸脱することなくなされることが認識される。上記の実施例は、本開示の教示を十分に例示するために提供され、そして本明細書中の教示の範囲を限定することを意図しない。
図１は、本教示のいくつかの実施形態に従った概要を示す。 図２は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った種々の方法において使用されるような種々の組成物の特定の局面を示す。 図３は、本発明のいくつかの実施形態に従った特定の方法を示す。

Claims (26)

  1. ２つのサンプルの各々において小さい標的ポリヌクレオチドを定量化するための方法であって、以下：
    第１のサンプル由来の小さい標的ポリヌクレオチドおよび第１のリンカープローブを含有する第１の反応混合物を提供する工程であって、
    ここで該第１のリンカープローブが、３’標的特異的部分、ステム、およびループを含み、該３’標的特異的部分が、該標的ポリヌクレオチドの３’末端と塩基対形成する、
    工程；
    第２のサンプル由来の小さい標的ポリヌクレオチドおよび第２のリンカープローブを含有する第２の反応混合物を提供する工程であって、
    ここで該第２のリンカープローブが、３’標的特異的部分、ステム、ループを含み、該３’標的特異的部分が、該標的ポリヌクレオチドの３’末端と塩基対形成し、
    ここで該第１の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドが、該第２の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドと同じ種である、
    工程；
    該第１の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドに該第１のリンカープローブをハイブリダイズして第１の標的−リンカープローブ複合体を形成し、そして該第２の反応混合物中の小さい標的ポリヌクレオチドに該第２のリンカープローブをハイブリダイズして第２の標的−リンカープローブ複合体を形成する工程；
    該第１の標的−リンカープローブ複合体と、該第２の標的−リンカープローブ複合体とを混ぜ合わせてプールされた反応混合物を形成する工程であって、ここで該プールされた反応混合物が、第１の伸長反応生成物および第２の伸長反応生成物を含有する工程；
    該第１の伸長反応生成物および該第２の伸長反応生成物を、第１の検出用プローブおよび第２の検出用プローブの存在下において増幅して、増幅された第１の伸長反応生成物および増幅された第２の伸長反応生成物を形成する工程であって、ここで該第１の検出用プローブが、該増幅された第１の伸長反応生成物に対応し、そして該第２の検出用プローブが、該第２の増幅された第２の伸長反応生成物に対応する、工程；ならびに
    該第１の検出用プローブと該第２の検出用プローブとを比較することによって該２つのサンプル中の小さい標的ポリヌクレオチドの含量を検出する工程、
    を包含する方法。
  2. 前記第１のリンカープローブのステムが、第１のサンプル同定部分を含み、そして前記第２のリンカープローブのステムが、第２のサンプル同定部分を含み、そして前記第１の検出用プローブが、前記増幅反応の間に、前記増幅された第１の伸長反応生成物の対応するサンプル同定部分にハイブリダイズし、そして前記第２の検出用プローブが、該増幅反応の間に、前記増幅された第２の伸長反応生成物の対応するサンプル同定部分にハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の検出用プローブおよび前記第２の検出用プローブの少なくとも１つが、前記増幅反応の間に、前記小さい標的ポリヌクレオチドに対応する配列に、さらにハイブリダイズする、請求項２に記載の方法。
  4. 請求項１に記載の方法であって、以下：
    前記第１の反応混合物中の前記第１のリンカープローブを伸長して第１の伸長反応生成物を形成する工程；
    前記第２の反応混合物中の前記第２のリンカープローブを伸長して第２の伸長生成物を形成する工程；および
    該第１の伸長反応生成物と該第２の伸長生成物とを混ぜ合わせる工程、
    を包含する、方法。
  5. 請求項１に記載の方法であって、以下：
    前記第１の反応混合物と前記第２の反応混合物とを混ぜ合わせる工程；および
    伸長反応を行う工程、
    を包含する、方法。
  6. 前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記小さい標的ポリヌクレオチドが、マイクロＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  8. 前記検出用プローブの少なくとも１つが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記検出用プローブの少なくとも１つが、５’−ヌクレアーゼ切断可能プローブである、請求項１に記載の方法。
  10. 前記第１のリンカープローブおよび／または前記第２のリンカープローブの自己相補的なステムが、１２ヌクレオチド〜１６ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記第１のリンカープローブの標的特異的部分、前記第２のリンカープローブの標的特異的部分、またはそれらの両方が、６ヌクレオチド〜８ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記ループが、ユニバーサルリバースプライマー部分をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  13. 前記ループが、１４ヌクレオチド〜１８ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  14. 請求項１に記載の方法であって、以下：
    前記第１の反応混合物が、複数の異なる小さい標的ポリヌクレオチド種に対応する、複数の異なるリンカープローブを含有し；
    前記第２の伸長反応混合物が、複数の異なる小さい標的ポリヌクレオチド種に対応する、複数の異なるリンカープローブを含有し；
    前記プールされた反応混合物のプールされた伸長反応生成物が、その後、複数の増幅反応に細分され；
    各増幅反応が、プライマー対、前記第１のサンプルに対応する第１の検出用プローブ、および前記第２のサンプルに対応する第２の検出用プローブを含み；
    小さい標的ポリヌクレオチドが、各増幅反応において検出される、
    方法。
  15. 少なくとも１つのプライマー対が、小さい標的ポリヌクレオチドに対応するフォワードプライマー、前記リンカープローブのループのユニバーサルリバースプライマー部分に対応するユニバーサルリバースプライマーを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記検出する工程が、エンドポイント分析を包含する、請求項１に記載の方法。
  17. 前記検出する工程が、リアルタイム分析を包含する、請求項１に記載の方法。
  18. 前記リアルタイム分析が、リアルタイムサーマルサイクラー上で行われる、請求項１７に記載の方法。
  19. キットであって、以下：
    第１のリンカープローブを含む反応容器；
    第２のリンカープローブを含む反応容器；
    を備え、ここで該第１のリンカープローブおよび該第２のリンカープローブが、同じ３’標的特異的部分および異なるサンプル同定部分を含む、キット。
  20. 請求項１９に記載のキットであって、逆転写酵素を含む反応容器をさらに備える、キット。
  21. 請求項１９に記載のキットであって、ＤＮＡポリメラーゼを含む反応容器をさらに備える、キット。
  22. 請求項２１に記載のキットであって、プライマー対、第１の検出用プローブ、および第２の検出用プローブをさらに備え、ここで該プライマー対、該第１の検出用プローブ、および該第２の検出用プローブが、同じ反応容器中に存在する、キット。
  23. 前記プライマー対が、以下：
    小さい標的ポリヌクレオチドに特異的なフォワードプライマー；および
    ユニバーサルリバースプライマーであって、ここで該ユニバーサルリバースプライマーが、前記第１のリンカープローブのループおよび前記第２のリンカープローブのループにコードされる、ユニバーサルリバースプライマー、
    を含む、請求項２２に記載のキット。
  24. 反応混合物であって、以下：
    小さい標的ポリヌクレオチドの第１の種にハイブリダイズした第１のリンカープローブ、および該小さい標的ポリヌクレオチドの第２の種にハイブリダイズした第２のリンカープローブ、
    を含有し、ここで該第１のリンカープローブが、第１のサンプル同定部分を含み、そして該第２のリンカープローブが、第２のサンプル同定部分を含む、反応混合物。
  25. 請求項２４に記載の反応混合物であって、逆転写酵素をさらに含有する、反応混合物。
  26. 請求項２４に記載の反応混合物であって、前記小さい標的ポリヌクレオチドに特異的なフォワードプライマー、およびリバースプライマーをさらに含有し、ここで該リバースプライマーが、前記第１のリンカープローブのループおよび前記第２のリンカープローブのループにコードされ、そして該リバースプライマーをコードする該第１のリンカープローブの該ループの配列が、該リバースプライマーをコードする該第２のリンカープローブの該ループの配列と同じである、反応混合物。
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