JP2000509608A - Pcr中のハイブリダイゼーションのモニタリング - Google Patents
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- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.生物学的サンプルの標的DNA配列を分析するための方法であって、 標的配列の隣接部分にハイブリダイゼーションする2種類の核酸プローブ存在 下に標的配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅するステップであって、前記プ ローブの一方は蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光物質で標識され、前記プロー ブの他方は供与体蛍光物質で標識されて、前記標的配列と前記2種類のプローブ のハイブリダイゼーション時に前記供与体蛍光物質及び受容体蛍光物質が互いに 25ヌクレオチド以内にあるようにし、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的 核酸配列に対する熱安定性ポリメラーゼとプライマーを前記生物学的サンプルに 添加するステップと少なくとも変性温度と延長温度との間で前記生物学的サンプ ルを熱サイクルするステップとを含むステップと、 前記供与体蛍光物質によって吸収される波長の光で前記生物学的サンプルを励 起して前記蛍光エネルギー転移対からの放射を検出するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 2.生物学的サンプルの標的DNA配列を分析するための方法であって、 標的配列の隣接部分にハイブリダイゼーションする2種類の核酸プローブ存在 下に標的配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅するステップであって、前記プ ローブの一方は蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光物質で標識され、前記プロー ブの他方は供与体蛍光物質で標識されて、前記標的配列と前記2種類のプローブ のハイブリダイゼーション時に前記供与体蛍光物質及び受容体蛍光物質が互いに 25ヌクレオチド以内にあるようにし、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的 核酸配列に対する熱安定性ポリメラーゼとプライマーを前記生物学的サンプルに 添加するステップと少なくとも変性温度と延長温度との間で前記生物学的サンプ ルを熱サイクルするステップとを含むステップと、 前記供与体蛍光物質によって吸収される波長の光で前記サンプルを励起するス テップと、 前記蛍光エネルギー転移対からの温度依存性蛍光をモニタするステップと、 を含むことを特徴とする方法。 3.前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質が約0〜5ヌクレオチドの距離に あることを特徴とする請求項1又は請求項2に記載の方法。 4.前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質が約0〜2ヌクレオチドの距離に あることを特徴とする請求項3に記載の方法。 5.前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質が1ヌクレオチドの距離にあるこ とを特徴とする請求項4に記載の方法。 6.生物学的サンプルにおける標的核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅をリア ルタイムでモニタする方法であって、 (a)前記生物学的サンプルに2種類の核酸プライマーと核酸プローブの有効 量を添加し、前記プライマーの一方と前記プローブは各々受容体蛍光物質と供与 体蛍光物質を含む蛍光エネルギー転移対の1つの構成要素で標識され、前記標識 されたプローブは前記標識されたプライマーの15ヌクレオチド以内の前記標的 核酸配列の増幅されたコピーにハイブリダイゼーションするステップと、 (b)ポリメラーゼ連鎖反応により前記標的核酸配列を増幅するステップと、 (c)前記供与体蛍光物質によって吸収される選択した波長の光で前記生物学 的サンプルを照明するステップと、 (d)前記サンプルの蛍光放射を検出するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 7.前記サンプルの温度依存性蛍光をモニタするステップをさらに含むことを特 徴とする請求項6に記載の方法。 8.前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は互いから約4〜6ヌクレオチド の距離にあることを特徴とする請求項6に記載の方法。 9.生物学的サンプルの標的核酸配列を増幅する方法の改良であって、 (a)前記生物学的サンプルに核酸結合蛍光体の有効量を添加するステップと 、 (b)ポリメラーゼ連鎖反応を用い、初期の所定の温度と時間パラメータを用 いて前記生物学的サンプルを熱サイクルし、次いで (i)前記ポリメラーゼ連鎖反応中に前記蛍光体によって吸収される光の選 択した波長で前記生物学的サンプルを照明するステップと、 (ii)前記サンプルからの蛍光をモニタして前記ポリメラーゼ連鎖反応に 最適な温度及び時間パラメータを決定するステップと、 (iii)前記蛍光にしたがって前記初期温度及び時間パラメータを調節す るステップと、 を含む前記標的核酸配列を増幅するステップと、 を含むことを特徴とする改良。 10.前記蛍光体は二重鎖特異性核酸結合染料を含むことを特徴とする請求項9 に記載の方法。 11.前記蛍光体は前記標的核酸配列にハイブリダイゼーションする蛍光標識オ リゴヌクレオチド・プローブを含むことを特徴とする請求項9に記載の方法。 12.前記蛍光体はオリゴヌクレオチド・プローブの対を含み、前記プローブの 一方は蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光物質で標識され、前記プローブの他方 は供与体蛍光物質で標識されることを特徴とする請求項9に記載の方法。 13.前記供与体蛍光物質放射と前記受容体蛍光物質吸収のスペクトルが25% 未満でオーバラップし、前記受容体蛍光物質は100,000M-1cm-1以上の ピーク吸光係数を有し前記2種類のプローブのハイブリダイゼーション時に前記 供与体蛍光物質と受容体蛍光物質は互いから15ヌクレオチド以内にあることを 特徴とする請求項12に記載の方法。 14.前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセイン又受容体として Cy5又はCy5.5を含むことを特徴とする請求項13に記載の方法。 15.生物学的サンプルの標的核酸配列を検出するための方法であって、 (a)前記生物学的サンプルに前記標的核酸配列とハイブリダイゼーションす るオリゴヌクレオチド・プローブ対の有効量を添加し、前記プローブの一方は蛍 光エネルギー転移対の受容体蛍光物質で標識され、前記プローブの他方は供与体 蛍光物質で標識され、前記供与体蛍光物質の放射スペクトルと前記受容体蛍光物 質の吸収スペクトルが25%未満でオーバラップし、前記受容体蛍光物質は10 0,000M-1cm-1以上のピーク吸光係数を有し前記2種類のプローブのハイ ブリダイゼーション時に前記供与体蛍光物質と受容体蛍光物質が互いの25ヌク レオチド以内にあるようにするステップと、 (b)前記供与体蛍光物質によって吸収される光の選択した波長で前記生物学 的サンプルを照明するステップと、 (c)前記生物学的サンプルの放射を検出するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 16.前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセインを含むことを特 徴とする請求項15に記載の方法。 17.前記共鳴エネルギー転移対は受容体としてCy5又はCy5.5を含むこ とを特徴とする請求項16に記載の方法。 18.前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は前記2種類のプローブの前記 標的核酸配列とのハイブリダイゼーション時に互いに約0〜5ヌクレオチド以内 にあることを特徴とする請求項15に記載の方法。 19.前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は互いの約0〜2ヌクレオチド 以内にあることを特徴とする請求項18に記載の方法。 20.前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は互いの1ヌクレオチド以内に あることを特徴とする請求項19に記載の方法。 21.フルオレセインで標識した第1のプローブとCy5又はCy5.5で標識 した第2のプローブを含むことを特徴とする蛍光エネルギー転移対。 22.生物学的サンプルにおける標的核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅をリ アルタイムでモニタする方法であって、 標的配列の隣接部分にハイブリダイゼーションする2種類の核酸プローブ存在 下に標的配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅するステップであって、前記プ ローブの一方は蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光物質で標識され、前記プロー ブの他方は供与体蛍光物質で標識されて、前記標的配列と前記2種類のプローブ のハイブリダイゼーション時に前記供与体蛍光物質及び受容体蛍光物質が互いに 25ヌクレオチド以内にあるようにし、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的 核酸配列に対する熱安定性ポリメラーゼとプライマーを前記生物学的サンプルに 添加するステップと少なくとも変性温度と延長温度との間で前記生物学的サンプ ルを熱サイクルするステップとを含むステップと、 前記供与体蛍光物質によって吸収される波長の光で前記生物学的サンプルを励 起して前記生物学的サンプルからの放射を検出するステップと、 前記蛍光エネルギー転移対からの温度依存性蛍光をモニタするステップと、 を含むことを特徴とする方法。 23.前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセイン又受容体として Cy5又はCy5.5を含むことを特徴とする請求項22に記載の方法。 24.前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は互いの約0〜5ヌクレオチド 以内にあることを特徴とする請求項22に記載の方法。 25.前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は互いの約0〜2ヌクレオチド 以内にあることを特徴とする請求項24に記載の方法。 26.前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は互いの1ヌクレオチド以内に あることを特徴とする請求項25に記載の方法。 27.前記モニタするステップは前記標的配列から溶解する前記プローブの溶解 プロファイルを決定するステップを含むことを特徴とする請求項22に記載の方 法。 28.生物学的サンプルにおける標的核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅をリ アルタイムでモニタする方法であって、 SYBRTMグリーンI存在下にポリメラーゼ連鎖反応により前記標的配列を増 幅し、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的核酸配列に対する熱安定性ポリメ ラーゼとプライマーを前記生物学的サンプルに添加するステップと少なくとも変 性温度と延長温度の間で前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップとを含 むステップと、 SYBRTMグリーンIにより吸収される波長の光で前記生物学的サンプルを励 起して前記生物学的サンプルからの放射を検出するステップと、 前記SYBRTMグリーンIからの温度依存性蛍光をモニタするステップと、 を含むことを特徴とする方法。 29.前記モニタするステップは前記増幅した標的配列の溶解プロファイルを決 定するステップを含むことを特徴とする請求項28に記載の方法。 30.生物学的サンプルの標的DNA配列を分析するための方法であって、 (a)2種類の核酸プライマーと核酸プローブの有効量を前記生物学的サンプ ルに添加し、前記プライマーの一方と前記プローブは互いに受容体蛍光物質と供 与体蛍光物質を含む蛍光エネルギー転移対の一方の構成要素で標識され、前記標 識されたプローブが前記標識されたプライマーの15ヌクレオチド以内の前記標 的核酸配列の増幅コピーとハイブリダイゼーションするステップと、 (b)ポリメラーゼ連鎖反応により前記標的核酸配列を増幅するステップと、 (c)前記供与体蛍光物質によって吸収される選択した波長の光で前記生物学 的サンプルを照明して前記サンプルの蛍光放射を検出するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 31.前記サンプルの温度依存性蛍光をモニタするステップをさらに含むことを 特徴とする請求項30に記載の方法。 32.前記モニタするステップは前記増幅した標的配列の溶解プロファイルを決 定するステップを含むことを特徴とする請求項31に記載の方法。 33.前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセインを又受容体とし てCy5又はCy5.5を含むことを特徴とする請求項30に記載の方法。 34.前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は互いから約4〜6ヌクレオチ ド以内にあることを特徴とする請求項30に記載の方法。 35.第2の核酸と比較して第1の核酸における選択した配座での相違を検出す る方法であって、 (a)ポリメラーゼ連鎖反応により前記第1の核酸の選択したセグメントと前 記第2の核酸のこれに対応するセグメントとを増幅するように構成したオリゴヌ クレオチド・プローブの対を提供し、前記選択したセグメントとこれに対応する セグメントは各々が前記選択した配座を含み、前記選択した配座のコピーを含む 増幅生成物を得るステップと、 (b)オリゴヌクレオチド・プローブの対を提供し、 前記プローブの一方は蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光物質で、また前記プ ローブの他方は供与体蛍光物質で標識して、前記供与体蛍光物質と受容体蛍光物 質が前記2種類のプローブと前記増幅生成物とのハイブリダイゼーション時に共 鳴エネルギー転移関係になるようにし、前記プローブの一方は前記増幅生成物に ハイブリダイゼーションするように構成して前記一方のプローブが前記選択した 配座にまたがり前記第1の核酸において前記第2の核酸の溶解プロファイルから 識別可能な相違が存在する場合に溶解プロファイルを示すようにするステップと 、 (c)前記第1の核酸の選択したセグメントと前記第2の核酸の対応するセグ メントとを有効量のプローブの存在下においてポリメラーゼ連鎖反応により増幅 して増幅された選択セグメントと増幅された対応セグメントとを得て、少なくと もこれらの一部分が共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネルギー転移対に よりこれらにハイブリダイゼーションされた両方のプローブを有するようにする ステップと、 (d)前記プローブをハイブリダイゼーションした前記増幅した選択セグメン ト及び前記増幅した対応セグメントを、蛍光共鳴エネルギー転移対によって蛍光 が顕在化するように選択した波長の光で照明するステップと、 (e)温度の関数として蛍光放射を測定し前記第1の核酸の増幅された選択セ グメントから溶解する前記プローブの一方の第1の溶解プロファイルと前記第2 の核酸の増幅された対応セグメントから溶解する前記プローブの一方の第2の溶 解プロファイルを決定するステップと、 (f)前記第1の溶解プロファイルを前記第2の溶解プロファイルと比較し、 これらの相違が前記サンプル核酸における相違の存在を示すようにするステップ と、 を含むことを特徴とする方法。 36.前記共鳴エネルギー転移対が供与体としてフルオレセインを又受容体とし てCy5及びCy5.5から構成されるグループから選択した構成要素を含むこ とを特徴とする請求項35に記載の方法。 37.前記供与体と前記受容体がプローブに結合され、両方のプローブが前記増 幅した選択セグメント又は前記増幅した対応セグメントにハイブリダイゼーショ ンした場合前記供与体と前記受容体が約25ヌクレオチド残基以上離れないよう にすることを特徴とする請求項35に記載の方法。 38.前記供与体と前記受容体がプローブに結合され、前記プローブが前記増幅 した選択セグメント又は前記増幅した対応セグメントにハイブリダイゼーション した場合前記供与体と前記受容体が約0〜5ヌクレオチド残基だけ離れるように することを特徴とする請求項37に記載の方法。 39.前記共鳴エネルギー転移供与体と前記共鳴エネルギー転移受容体が前記プ ローブに結合され、前記プローブが前記増幅した選択セグメント又は前記増幅し た対応セグメントにハイブリダイゼーションした場合前記供与体と前記受容体が 約0〜2ヌクレオチド残基だけ離れるようにすることを特徴とする請求項38に 記載の方法。 40.前記共鳴エネルギー転移供与体と前記共鳴エネルギー転移受容体が前記プ ローブに結合され、前記プローブが前記増幅した選択セグメント又は前記増幅し た対応セグメントにハイブリダイゼーションした場合前記受容体と前記供与体が 1ヌクレオチド残基だけ離れるようにすることを特徴とする請求項39に記載の 方法。 41.第2の核酸と比較して第1の核酸における選択した配座での相違を検出す る方法であって、 (a)ポリメラーゼ連鎖反応により前記第1の核酸の選択したセグメントと前 記第2の核酸の対応するセグメントとを増幅するように構成したオリゴヌクレオ チド・プローブの対を提供し、前記選択したセグメントとこれに対応するセグメ ントは各々が前記選択した配座を含み、前記選択した配座のコピーを含む増幅生 成物を得るステップと、 (b)オリゴヌクレオチド・プローブを提供し、前記プライマーの一方と前記 プローブが各々供与体蛍光物質と受容体蛍光物質を含む蛍光エネルギー転移対の 一方の構成要素で標識され、前記標識したプローブと標識したプライマーを前記 増幅生成物にハイブリダイゼーションして前記供与体と前記受容体が共鳴エネル ギー転移関係にあるようにし、前記プローブは前記増幅生成物とハイブリダイゼ ーションするように構成して前記プローブが前記選択した配座にまたがり前記第 1の核酸において前記第2の核酸の溶解プロファイルから識別可能な相違が存在 する場合溶解プロファイルを示すようにするステップと、 (c)有効量のプライマーとプローブの存在かにおいてポリメラーゼ連鎖反応 により前記第1の核酸の選択セグメントと前記第2の核酸のこれに対応するセグ メントとを増幅して増幅された選択セグメントと増幅された対応セグメントとを 得て、少なくともこれらの一部が共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネル ギー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションされた前記標識プライマー及 びプローブを両方とも有するようにするステップと、 (d)前記標識プライマー及びプローブがハイブリダイゼーションしている前 記増幅した選択セグメントと前記増幅した対応セグメントを選択した波長の光で 照明して蛍光共鳴エネルギー転移対による蛍光を顕在化するステップと、 (e)温度の関数として蛍光放射を測定して第1の核酸の前記増幅選択セグメ ントから前記一方のプローブ溶解の第1の溶解プロファイルと第2の核酸の前記 増幅対応セグメトから前記一方のプローブ溶解の第2の溶解プロファイルにおい て決定するステップと、 (f)前記第1の溶解プロファイルを前記第2の溶解プロファイルと比較し、 ここでの相違が前記サンプル核酸における相違の存在を示すようにするステップ と、 を含むことを特徴とする方法。 42.前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセインを又受容体とし てCy5及びCy5.5から構成されるグループから選択した構成要素を含むこ とを特徴とする請求項41に記載の方法。 43.前記供与体と前記受容体が前記標識したプライマー及びプローブに結合さ れ、前記標識したプローブ及びプライマーが前記増幅した選択セグメント又は前 記増幅した対応セグメントにハイブリダイゼーションする場合に前記供与体と前 記受容体が約15ヌクレオチド残基以上離れないようにすることを特徴とする請 求項41に記載の方法。 44.前記供与体と前記受容体が前記標識したプライマー及びプローブに結合さ れ、前記標識したプローブ及びプライマーが前記増幅した選択セグメント又は前 記増幅した対応セグメントにハイブリダイゼーションする場合に前記供与体と前 記受容体が約4〜6ヌクレオチド残基だけ離れるようにすることを特徴とする請 求項43に記載の方法。 45.個人のゲノムの選択された配位でのヘテロ接合を検出する方法であって、 前記ゲノムは突然変異性対立遺伝子とこれに対応する基準対立遺伝子とを含み、 その各々が選択された配位を含み、 (a)前記個人からサンプルとなるゲノムDNAを採得するステップと、 (b)ポリメラーゼ連鎖反応により前記突然変異対立遺伝子の第1の選択した セグメントと前記これに対応する基準対立遺伝子の第2の選択したセグメントを 増幅するように構成されたオリゴヌクレオチド・プライマーの対を提供し、前記 第1と第2の選択されたセグメントとの両方ともが前記選択された配位を含むス テップと、 (c)オリゴヌクレオチド・プローブの対を提供し、前記プローブの一方は受 容体蛍光物質で標識し前記プローブの他方は蛍光共鳴エネルギー転移対の供与体 蛍光物質で標識して前記増幅した第1と第2の選択セグメントと前記2種類のプ ローブのハイブリダイゼーション時に前記プローブの一方は前記選択された配位 にまたがり前記増幅された第2の選択セグメントによる第2の溶解プロファイル から識別可能な前記増幅された第1の選択セグメントによる第1の溶解プロファ イルを示すようにするステップと、 (d)ポリメラーゼ連鎖反応により有効量のプローブの存在下でサンプル・ゲ ノムDNAの前記第1と第2の選択ヤグメントを増幅して増幅された第1と第2 の選択セグメントを得るようにし、少なくともその一部分が共鳴エネルギー転移 関係にある蛍光共鳴エネルギー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションさ れたプローブを両方とも有するようにするステップと、 (e)前記標識したプライマーとプローブがハイブリダイゼーションされてい る前記増幅した第1と第2の選択セグメントを選択した波長の光で照明して前記 供与体及び受容体による蛍光を顕在化するステップと、 (f)温度の関数として蛍光放射を測定して、前記増幅した第1の選択セグメ ントから溶解する前記一方のプローブの第1の溶解プロファイルと前記増幅した 第2の選択セグメントから溶解する前記一方のプローブの第2の溶解プロファイ ルとを決定するステップと、 (g)前記第1の溶解プロファイルと前記第2の溶解プロファイルとを比較し 、識別可能な溶解プロファイルが前記サンプル・ゲノムDNAのヘテロ接合性を 表わすようにするステップと、 を含むことを特徴とする方法。 46.前記蛍光共鳴エネルギー転移対が、供与体としてフルオレセインを又受容 体としてCy5又はCy5.5を含むことを特徴とする請求項45に記載の方法 。 47.前記供与体と前記受容体が前記プローブに結合され前記プローブと基準オ リゴヌクレオチドが前記増幅された第1の選択セグメント又は前記増幅された第 2の選択セグメントにハイブリダイゼーションされる場合前記供与体と前記受容 体が25ヌクレオチド残基以上に離れないようにすることを特徴とする請求項4 5に記載の方法。 48.前記供与体と前記受容体が前記プローブに結合され前記プローブが前記増 幅された第1の選択セグメント又は前記増幅された第2の選択セグメントにハイ ブリダイゼーションされる場合前記供与体と前記受容体が約0〜5ヌクレオチド 残基だけ離れるようにすることを特徴とする請求項47に記載の方法。 49.前記供与体と前記受容体が前記プローブに結合され前記プローブが前記増 幅された第1の選択セグメント又は前記増幅された第2の選択セグメントにハイ ブリダイゼーションされる場合前記供与体と前記受容体が約0〜2ヌクレオチド 残基だけ離れるようにすることを特徴とする請求項48に記載の方法。 50.前記供与体と前記受容体が前記プローブに結合され前記プローブが前記増 幅された第1の選択セグメント又は前記増幅された第2の選択セグメントにハイ ブリダイゼーションされる場合前記供与体と前記受容体が1ヌクレオチド残基だ け離れるようにすることを特徴とする請求項49に記載の方法。 51.個人のゲノムにおいて選択された配座でのヘテロ接合性を検出する方法で あって、前記ゲノムは突然変異性対立遺伝子とこれに対応する基準対立遺伝子と を含み、その各々が選択された配座を含み、 (a)前記個人からサンプルとなるゲノムDNAを採得するステップと、 (b)ポリメラーゼ連鎖反応により前記突然変異対立遺伝子の第1の選択した セグメントと前記これに対応する基準対立遺伝子の第2の選択したセグメントを 増幅するように構成されたオリゴヌクレオチド・プライマーの対を提供し、前記 第1と第2の選択されたセグメントとの両方ともが前記選択された配座を含むス テップと、 (c)オリゴヌクレオチド・プローブの対を提供し、前記プライマーの一方と 前記プローブが各々供与体蛍光物質と受容体蛍光物質とを含む蛍光エネルギー転 移対の一方の構成要素で標識され、前記標識されたプローブと標識されたプライ マーが前記増幅された第1と第2の選択セグメントにハイブリダイゼーションし て前記プローブの一方が前記選択した配座にまたがり前記増幅された第2の選択 セグメントによる第2の溶解プロファイルから識別可能な前記増幅された第1の 選択セグメントによる第1の溶解プロファイルを示すようにするステップと、 (d)ポリメラーゼ連鎖反応により有効量のプローブ及びプライマーの存在下 でサンプル・ゲノムDNAの前記第1と第2の選択セグメントを増幅して増幅さ れた第1と第2の選択セグメントを得るようにし、少なくともその一部分が両方 とも共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネルギー転移対によりこれらにハ イブリダイゼーションされたプローブを有するステップと、 (e)選択した波長の光によりハイブリダイゼーションされたプローブを有す る前記増幅された第1と第2の選択セグメントを照明して、前記供与体と受容体 による蛍光を顕在化するステップと、 (f)温度の関数として蛍光放射を測定して、前記増幅した第1の選択セグメ ントから溶解する前記一方のプローブの第1の溶解プロファイルと前記増幅した 第2の選択セグメントから溶解する前記一方のプローブの第2の溶解プロファイ ルとを決定するステップと、 (g)前記第1の溶解プロファイルと前記第2の溶解プロファイルとを比較し て、識別可能な溶解プロファイルが前記サンプル・ゲノムDNAのヘテロ接合性 を表わすようにするステップと、 を含むことを特徴とする方法。 52.前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセインを又受容体とし てCy5又はCy5.5を含むことを特徴とする請求項51に記載の方法。 53.前記供与体と前記受容体が前記標識プライマー及びプローブに結合され、 前記標識プライマー及びプローブが前記増幅された第1の選択セグメント又は前 記増幅された第2の選択セグメントにハイブリダイゼーションする場合前記供与 体と前記受容体が約15ヌクレオチド残基以上離れないようにすることを特徴と する請求項51に記載の方法。 54.前記供与体と前記受容体が前記標識プライマー及びプローブに結合され、 前記標識プライマーとプローブが前記増幅された第1の選択セグメント又は前記 増幅された第2の選択セグメントにハイブリダイゼーションされる場合前記供与 体と前記受容体が4〜6ヌクレオチド残基だけ離れるようにすることを特徴とす る請求項53に記載の方法。 55.(1)核酸、ただし前記核酸又はそのポリメラーゼ連鎖反応増幅した生成 物が2種類の異なった相補鎖から構成され、(2)前記核酸の選択したセグメン トをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅して増幅生成物を得るように構成された 2種類のオリゴヌクレオチド・プローブ、(3)前記ポリメラーゼ連鎖反応を触 媒するためのDNAポリメラーゼを含むポリメラーゼ連鎖反応混合物においてポ リメラーゼ連鎖反応の完了を決定する方法であって、 (a)前記混合物に(1)蛍光共鳴エネルギー転移対の共鳴エネルギー転移供 与体又は共鳴エネルギー転移受容体で標識され、選択された温度条件と単価イオ ン強度で前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするように構成された有効量 のオリゴヌクレオチド・プライマーと、(2)前記供与体又は前記受容体で標識 され、前記プローブと基準オリゴヌクレオチドの間で一方が前記供与体で標識さ れ他方が前記受容体で標識され、前記基準オリゴヌクレオチドは前記選択された 温度及び単価イオン強度の条件下で前記増幅生成物にハイブリダイゼーションす るように構成されて前記プローブと前記基準オリゴヌクレオチドが両方とも前記 増幅生成物にハイブリダイゼーションする場合前記供与体及び前記受容体が共鳴 エネルギー転移関係にあるようにする有効量の基準オリゴヌクレオチドとを添加 するステップと、 (b)前記核酸の選択セグメントをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅して前 記増幅生成物を得るようにし、少なくともその一部分は共鳴エネルギー転移関係 にある蛍光共鳴エネルギー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションされた 前記プローブと前記基準オリゴヌクレオチドの両方を有するようにするステップ と、 (c)選択した波長の光でハイブリダイゼーションされたプローブと基準オリ ゴヌクレオチドとを有する前記増幅生成物を照明して前記蛍光共鳴エネルギー対 による蛍光を顕在化させ、蛍光放射をモニタして、前記蛍光放射が前記反応の完 了を表わすプラトー・フェーズに達した時点でサイクルを決定するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 56.前記蛍光共鳴エネルギー転移対はフルオレセインと、Cy5及びCy5. 5から構成されるグループから選択した構成要素であることを特徴とする請求項 55に記載の方法。 57.(1)核酸、ただし前記核酸又はそのポリメラーゼ連鎖反応増幅した生成 物が2種類の異なった相補鎖から構成され、(2)前記核酸の選択したセグメン トをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅して増幅生成物を得るように構成された 2種類のオリゴヌクレオチド・プライマー、(3)前記ポリメラーゼ連鎖反応を 触媒するためのDNAポリメラーゼを含むポリメラーゼ連鎖反応混合物における ポリメラーゼ連鎖反応の完了を決定する方法は、 (a)前記混合物に有効量の核酸結合蛍光染料を添加するステップと、 (b)前記核酸結合蛍光染料が添加された前記混合物でポリメラーゼ連鎖反応 により前記選択した核酸セグメントを増幅して核酸結合蛍光染料が結合した前記 増幅生成物を得るステップと、 (c)核酸結合蛍光染料が結合している増幅生成物に選択した波長の光を照明 してここからの蛍光を顕在化し、蛍光放射をモニタして、前記蛍光放射が前記反 応の完了を表わすプラトー・フェーズに達した時点でサイクルを決定するステッ プと、 を含むことを特徴とする方法。 58.前記核酸結合蛍光染料はSYBRTMグリーンI、臭化エチジウム、ピコグ リーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、YO−PRO−1、ク ロモマイシンA3から構成されるグループから選択される構成要素とすることを 特徴とする請求項57に記載の方法。 59.前記核酸結合蛍光染料はSYBRTMグリーンIであることを特徴とする請 求項58に記載の方法。 60.二重鎖特異性蛍光染料を含むポリメラーゼ連鎖反応混合物のアニーリング 、延長、変性フェーズの反復サイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応の温度サイク ル・パラメータを制御する方法であって、前記パラメータは前記アニーリング・ フェーズの持続時間と、前記変性フェーズの持続時間と、サイクル数とを含み、 (a)選択した波長の光で前記反応を照明して前記蛍光染料からの蛍光を顕在 化させ前記反復アニーリング、拡張、変性フェーズの間に蛍光を連続モニタする ステップと、 (b)少なくとも、 (i)前記拡張フェーズの間に蛍光が増加を停止する持続時間、又は (ii)前記変性フェーズの間に前記蛍光が基線レベルまで減少する持続時 間、又は (iii)前記拡張フェーズの間に前記蛍光が所定のレベルに達した回数 を決定するステップと、 (c)前記拡張フェーズの間に蛍光が増加を停止する時間の長さに基づいた前 記拡張フェーズの長さ、前記変性フェーズの間に蛍光が前記基線レベルまで減少 した時間の長さに基づいた前記変性フェーズの長さ、又は前記拡張フェーズの間 に蛍光が前記所定レベルに達したサイクル数に基づくサイクル数を調節するステ ップと、 を含むことを特徴とする方法。 61.前記核酸結合蛍光染料はSYBRTMグリーンI、臭化エチジウム、ピコグ リーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、YO−PRO−1、ク ロモマイシンA3から構成されるグループから選択される構成要素とすることを 特徴とする請求項60に記載の方法。 62.前記核酸結合蛍光染料はSYBRTMグリーンIであることを特徴とする請 求項61に記載の方法。 63.選択したポリメラーゼ連鎖反応混合物における増幅生成物の濃度を決定す る方法であって、 (a)前記増幅生成物の既知の濃度のハイブリダイゼーションのレートをモニ タすることにより選択した温度と反応条件での前記増幅生成物での2次速度定数 を決定するステップと、 (b)前記増幅生成物の未知の濃度でのアニーリング速度を決定するステップ と、 (c)前記アニーリング速度と前記2次速度定数から前記増幅生成物の濃度を 計算するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 64.前記アニーリング速度は多数サイクルの増幅後に決定されることを特徴と する請求項63に記載の方法。 65.前記二次速度定数を決定するステップは、 既知の濃度の前記増幅生成物と有効量の二重鎖特異性蛍光染料とを含む第1の ポリメラーゼ連鎖反応混合物の温度を、前記増幅生成物の変性温度以上に上昇し て変性増幅生成物を得るステップと、 前記既知の量の変性増幅生成物を含む前記第1のポリメラーゼ連鎖反応混合物 の温度を、前記増幅生成物の変性温度以下の選択した温度まで急冷すると同時に 時間の関数として前記第1のポリメラーゼ連鎖反応混合物の蛍光を連続モニタす るステップと、 極大蛍光、極小蛍光、極小蛍光の時間、及び増幅生成物の既知の濃度での2次 速度定数を決定するため、式: ただしFは蛍光、Fmaxは極大蛍光、Fminは極小蛍光、kは2次速度定数、t0 はFminでの時間、[DNA]は前記増幅生成物の既知の濃度とする から時間の関数として蛍光をプロットするステップと、 を含むことを特徴とする請求項63に記載の方法。 66.前記核酸結合蛍光染料はSYBRTMグリーンI、臭化エチジウム、ピコグ リーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、YO−PRO−1、ク ロモマイシンA3から構成されるグループから選択される構成要素とすることを 特徴とする請求項65に記載の方法。 67.前記核酸結合蛍光染料はSYBRTMグリーンIであることを特徴とする請 求項66に記載の方法。 68. 競合的定量ポリメラーゼ連鎖反応による選択した核酸テンプレートの濃 度を決定する方法であって、 (a)(i)ポリメラーゼ連鎖反応において前記選択したテンプレートの選択 したセグメントと相補的テンプレートのこれに対応する選択したセグメントを増 幅してこれらの増幅生成物を得るように構成したオリゴヌクレオチド・プライマ ーの対の各々の有効量と、 (ii)蛍光共鳴エネルギー転移対の共鳴エネルギー転移供与体又は共鳴エ ネルギー転移受容体で標識された有効量のオリゴヌクレオチド・プローブであっ て、前記プローブが前記競合的テンプレートの増幅生成物から溶解する溶解温度 から識別可能な溶解温度での前記選択したテンプレートの増幅生成物から溶解す るように前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするように構成されている前 記プローブと、 (iii)前記プローブと転移オリゴヌクレオチドの間で一方が前記供与体 により標識され他方が前記受容体により標識されているとして、前記供与体又は 前記受容体で標識された有効量の基準オリゴヌクレオチドであって、前記基準オ リゴヌクレオチドは前記プローブと前記基準オリゴヌクレオチドの両方が前記増 幅生成物にハイブリダイゼーションする場合に前記供与体と前記受容体が共鳴エ ネルギー転移関係になるように前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするよ う構成されたオリゴヌクレオチドと、 を含む反応混合物において、 ポリメラーゼ連鎖反応により、未知の量の選択したテンプレートと既知の量の 前記競合的テンプレートを増幅して前記増幅生成物を得るステップと、 (b)前記反応混合物を選択した波長の光で照明して蛍光共鳴エネルギー転移 対による蛍光を顕在化させ、反応混合物の温度が変化して前記選択したテンプレ ートの前記増幅生成物から溶解する前記プローブの第1の溶解曲線と前記競合的 テンプレートから溶解する前記プローブの第2の溶解曲線とを得る場合に温度の 関数として蛍光放射を決定するステップと、 (c)前記第1と第2の溶解曲線から第1と第2の溶解溶解ピークに変換して 当該溶解ピークから前記選択したテンプレートと前記競合的テンプレートの相対 量を決定するステップと、 (d)前記既知の量の前記競合的テンプレートと、前記選択したテンプレート 及び競合的テンプレートの相対量とに基づいて前記選択したテンプレートの濃度 を計算するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 69.前記基準オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド・プライマーの対の一 方であることを特徴とする請求項68に記載の方法。 70.前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセイン又受容体として Cy5又はCy5.5を含むことを特徴とする請求項69に記載の方法。 71.前記供与体と前記受容体は前記プローブ及び基準オリゴヌクレオチドに結 合され、前記プローブと基準ヌクレオチドが前記増幅ヤグメントにハイブリダイ ゼーションした場合に前記供与体と前記受容体が約25ヌクレオチド残基以上離 れないようにすることを特徴とする請求項69に記載の方法。 72.前記供与体と前記受容体は前記プローブ及び基準オリゴヌクレオチドに結 合され、前記プローブと基準ヌクレオチドが前記増幅セグメントにハイブリダイ ゼーションした場合に前記供与体と前記受容体が約0〜5ヌクレオチド残基だけ 離れるようにすることを特徴とする請求項71に記載の方法。 73.前記供与体と前記受容体は前記プローブ及び基準オリゴヌクレオチドに結 合され、前記プローブとトランスファヌクレオチドが前記増幅セグメントにハイ ブリダイゼーションした場合に前記供与体と前記受容体が約0〜2ヌクレオチド 残基だけ離れるようにすることを特徴とする請求項72に記載の方法。 74.前記供与体と前記受容体は前記プローブ及び基準オリゴヌクレオチドに結 合され、前記プローブとトランスファヌクレオチドが前記増幅セグメントにハイ ブリダイゼーションした場合に前記供与体と前記受容体が1ヌクレオチド残基だ け離れるようにすることを特徴とする請求項73に記載の方法。 75.前記基準ヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチド・プライマーの一方では ないことを特徴とする請求項68に記載の方法。 76.前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセイン又受容体として Cy5又はCy5.5を含むことを特徴とする請求項75に記載の方法。 77.前記供与体と前記受容体は前記プローブ及び基準オリゴヌクレオチドに結 合され、前記プローブと基準ヌクレオチドが前記増幅セグメントにハイブリダイ ゼーションした場合に前記供与体と前記受容体が約15ヌクレオチド残基以上離 れないようにすることを特徴とする請求項76に記載の方法。 78.前記供与体と前記受容体は前記プローブ及び基準オリゴヌクレオチドに結 合され、前記プローブと基準ヌクレオチドが前記増幅セグメントにハイブリダイ ゼーションした場合に前記供与体と前記受容体が約4〜6ヌクレオチド残基だけ 離れるようにすることを特徴とする請求項77に記載の方法。 79.フルオレセインとCy5からなることを特徴とする蛍光共鳴エネルギー転 移対。 80.フルオレセインとCy5.5からなることを特徴とする蛍光共鳴エネルギ ー転移対。 81. ポリメラーゼ連鎖反応において選択した核酸テンプレートの濃度を決定 する方法であって、 (a)(i)ポリメラーゼ連鎖反応において前記選択したテンプレートの選択 した第1のセグメントを増幅して増幅した第1の生成物を得るように構成された 第1の対のオリゴヌクレオチド・プライマーの各々の有効量と、 (ii)ポリメラーゼ連鎖反応において基準テンプレートの選択した第2の セグメントを増幅して増幅した第2の生成物を得るように構成された第2の対の オリゴヌクレオチド・プライマーの各々の有効量と、 (iii)核酸結合蛍光染料の有効量と、 を含む反応混合物において、 ポリメラーゼ連鎖反応により、未知の量の前記選択したテンプレートを増幅し て前記増幅した第1の生成物を得る及び既知の量の前記基準テンプレートを増幅 して前記増幅した第2の生成物を得るステップと、 (b)選択した波長の光で前記反応混合物を照明して核酸結合蛍光染料による 蛍光を顕在化させ、温度の関数として放射された蛍光を連続的にモニタして第1 の生成物と第2の生成物が異なる温度で溶解するような前記増幅生成物の溶解曲 線を得るステップと、 (c)前記溶解曲線を溶解溶解ピークに変換して当該溶解ピークから前記選択 したテンプレートと前記基準テンプレートの相対量を決定するステップと、 (d)前記既知の量の前記基準テンプレートと選択したテンプレート及び基準 テンプレートの相対量とに基づいて前記選択したテンプレートの濃度を計算する ステップと、 を含むことを特徴とする方法。 82.前記核酸結合蛍光染料はSYBRTMグリーンI、臭化エチジウム、ピコグ リーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、YO−PRO−1、ク ロモマイシンA3から構成されるグループから選択されることを特徴とする請求 項81に記載の方法。 83.前記核酸結合蛍光染料はSYBRTMグリーンIであることを特徴とする請 求項82に記載の方法。 84.陽性対照テンプレートも含むポリメラーゼ連鎖反応において選択したテン プレートの増幅をモニタする方法であって、 (a)(i)ポリメラーゼ連鎖反応において前記選択したテンプレートの選択 した第1のセグメントを増幅して増幅された第1の生成物を得るように構成され た第1の対のオリゴヌクレオチド・プライマーの各々の有効量と、 (ii)ポリメラーゼ連鎖反応において、陽性対照テンプレートの選択され た第2のセグメントを増幅して増幅された第2の生成物を得るように構成された 第2の対のオリゴヌクレオチド・プライマーの各々の有効量と、 (iii)有効量の核酸結合蛍光染料と、 を含む反応混合物において、 前記選択したテンプレートと前記陽性対照テンプレートをポリメラーゼ連鎖反 応によって増幅するための条件に前記選択したテンプレートと前記陽性対照テン プレートをさらすステップと、 (b)前記反応混合物を選択した波長の光で照明して核酸結合蛍光染料による 蛍光を顕在化し、前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクル中に温度の関数とし て放射される蛍光を連続的にモニタして前記選択したテンプレートが増幅される 場合前記増幅された第1の生成物の第1の溶解ピークを、また前記陽性対照テン プレートが増幅される場合前記増幅された第2の生成物の第2の溶解ピークを取 得するステップとを含み、 前記第2の溶解曲線の取得はポリメラーゼ連鎖反応が作用したことを表わし、 前記第1の溶解曲線の取得は前記選択した第1のセグメントが増幅可能であるこ とを表わし、前記第1の溶解曲線が欠如していることは前記選択した第1のセグ メントが増幅不可能であることを表わす ことを特徴とする方法。 85.前記核酸結合蛍光染料はSYBRTMグリーンI、臭化エチジウム、ピコグ リーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、YO−PRO−1、ク ロモマイシンA3から構成されるグループから選択されることを特徴とする請求 項84に記載の方法。 86.前記核酸結合蛍光染料がSYBRTMグリーンIであることを特徴とする請 求項85に記載の方法。 87. 個人の第V因子ライデン変異を検出する方法であって、第V因子ライデ ン変異は野生型と比較して第V因子ライデン変異配座での単一塩基変化で構成さ れ、 (a)前記個人からサンプル・ゲノムDNAを採得するステップと、 (b)対照として野生型ゲノムDNAを提供するステップと、 (c)前記サンプル・ゲノムDNAと前記野生型ゲノムDNAの選択したセグ メントをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように構成されたオリゴヌクレ オチド・プライマーの対を提供し、前記選択したセグメントは第V因子ライデン 変異配座を含み、第V因子ライデン変異配座のコピーを含む増幅生成物を得るス テップと、 (d)蛍光共鳴エネルギー転移対の共鳴エネルギー転移供与体又は共鳴エネル ギー転移受容体で標識されたオリゴヌクレオチド・プローブを提供し、前記プロ ーブは前記増幅された生成物にハイブリダイゼーションするように構成されて前 記プローブが前記変異配座にまたがり前記サンプル・ゲノムDNAに前記野生型 ゲノムDNAの溶解プロファイルから区別できる第V因子ライデン変異が存在す る場合溶解プロファイルを示すステップと、 (e)共鳴エネルギー転移供与体又は共鳴エネルギー転移受容体で標識された 転移オリゴヌクレオチドを提供し、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドの間 で一方が共鳴エネルギー転移供与体で標識され他方が共鳴エネルギー転移受容体 で標識されているとして、前記転移オリゴヌクレオチドは前記増幅生成物にハイ ブリダイゼーションするように構成して前記プローブと前記転移オリゴヌクレオ チドの両方が前記増幅生成物にハイブリダイゼーションする場合に共鳴エネルギ ー転移供与体と共鳴エネルギー転移受容体が共鳴エネルギー転移関係にあるよう にするステップと、 (f)有効量のオリゴヌクレオチド・プローブと転移オリゴヌクレオチドの存 在下でサンプル・ゲノムDNAと野生型ゲノムDNAの前記選択したセグメント をポリメラーゼ連鎖反応により増幅して、増幅された選択セグメントを得るよう にし、少なくともその一部分は共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネルギ ー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションされた前記プローブと前記転移 オリゴヌクレオチドの両方を有するようにするステップと、 (g)前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの間の温度の関数として蛍光 を測定してサンプル・ゲノムDNAの前記増幅セグメントから溶解する前記プロ ーブの溶解プロファイルと前記野生型ゲノムDNAの増幅セグメントから溶解す る前記プローブの溶解プロファイルとを取得するステップと、 (h)前記サンプル・ゲノムDNAについての前記溶解プロファイルを前記野 生型ゲノムDNAについての前記溶解プロファイルと比較し、これらの差が前記 サンプル・ゲノムDNAにおける第V因子ライデン変異の存在を表わすステップ と、 を含むことを特徴とする方法。 88.前記転移オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド・プライマーの対の一 方であることを特徴とする請求項87に記載の方法。 89.前記共鳴エネルギー転移対はフルオレセインとCy5又はCy5.5を含 むことを特徴とする請求項88に記載の方法。 90.前記オリゴヌクレオチド・プライマーが配列ID no:11及び配列ID no :12であることを特徴とする請求項89に記載の方法。 91.配列ID no:11はCy5又はCy5.5で標識されることを特徴とする 請求項90に記載の方法。 92.前記オリゴヌクレオチド・プローブが配列ID no:13であることを特徴 とする請求項90に記載の方法。 93.配列ID no:13がフルオレセインで標識されることを特徴とする請求項 90に記載の方法。 94.前記共鳴エネルギー転移供与体及び共鳴エネルギー転移受容体がヌクレオ チド残基に結合されて、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドが前記増幅セグ メントにハイブリダイゼーションされる場合約15ヌクレオチド残基以上離れな いようにすることを特徴とする請求項87に記載の方法。 95.前記共鳴エネルギー転移供与体及び共鳴エネルギー転移受容体がヌクレオ チド残基に結合されて、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドが前記増幅セグ メントにハイブリダイゼーションされる場合約4〜6ヌクレオチド残基だけ離れ るようにすることを特徴とする請求項94に記載の方法。 96.前記転移オリゴヌクレオチドは前記オリゴヌクレオチド・プライマーの一 方ではないことを特徴とする請求項86に記載の方法。 97.前記共鳴エネルギー転移対はフルオレセインとCy5又はCy5.5を含 むことを特徴とする請求項96に記載の方法。 98.前記オリゴヌクレオチド・プライマーが配列ID no:11と配列ID no: 12であることを特徴とする請求項97に記載の方法。 99.前記オリゴヌクレオチド・プローブが配列ID no:13であることを特徴 とする請求項98に記載の方法。 100.配列ID no:13がフルオレセインで標識されることを特徴とする請求 項99に記載の方法。 101.前記転移オリゴヌクレオチドがCy5又はCy5.5で標識されること を特徴とする請求項100に記載の方法。 102.前記共鳴エネルギー転移供与体及び前記共鳴エネルギー転移受容体がヌ クレオチド残基に結合され、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドが前記増幅 セグメントにハイブリダイゼーションされる場合に25ヌクレオチド残基以上離 れないようにすることを特徴とする請求項101に記載の方法。 103.前記共鳴エネルギー転移供与体及び前記共鳴エネルギー転移受容体がヌ クレオチド残基に結合され、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドが前記増幅 セグメントにハイブリダイゼーションされる場合に約0〜5ヌクレオチド残基以 上離れないようにすることを特徴とする請求項102に記載の方法。 104.前記共鳴エネルギー転移供与体及び前記共鳴エネルギー転移受容体がヌ クレオチド残基に結合され、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドが前記増幅 セグメントにハイブリダイゼーションされる場合に約0〜2ヌクレオチド残基以 上離れないようにすることを特徴とする請求項103に記載の方法。 105.前記共鳴エネルギー転移供与体及び前記共鳴エネルギー転移受容体がヌ クレオチド残基に結合され、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドが前記増幅 セグメントにハイブリダイゼーションされる場合に1ヌクレオチド残基だけ離れ るようにすることを特徴とする請求項104に記載の方法。 106.溶解プロファイルにおける相違が少なくとも約2℃の熱溶解温度におけ る相違を表わすことを特徴とする請求項87に記載の方法。 107.配列ID no:11のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド。 108.配列ID no:12のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド。 109.配列ID no:13のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド。 110. 核酸ハイブリダイゼーションを分析するための方法であって、 (a)分析すべき核酸サンプルと核酸結合蛍光体とを含む混合物を提供するス テップと、 (b)温度を≧毎秒0.1℃の速度で変化させながら蛍光をモニタするステッ プと、 を含むことを特徴とする方法。 111.前記核酸結合蛍光染料がSYBRTMグリーンIであることを特徴とする 請求項110に記載の方法。 112.前記核酸結合蛍光体はオリゴヌクレオチド・プローブの対を含み、前記 プローブの一方が蛍光共鳴エネルギー転移対の供与体で標識され前記プローブの 他方が受容体で標識されることを特徴とする請求項110に記載の方法。 113.前記プローブの一方がポリメラーゼ連鎖反応増幅用のプライマーである ことを特徴とする請求項112に記載の方法。 114. 未知の量の核酸を含むサンプルの初期コピー数を定量する方法であっ て、 (a)ポリメラーゼ連鎖反応により既知の濃度の少なくとも一つの標準を、前 記標準と核酸結合蛍光体とを含む混合物中で増幅するステップと、 (b)サイクル数の関数として蛍光を測定して一組のデータ点を得るステップ と、 (c)初期核酸濃度とサイクル数の関数として蛍光を記述する任意の所定の式 に前記データ点を当てはめるステップと、 (d)前記サンプルと前記核酸結合蛍光体とを含む混合物中で未知の量の核酸 を含む前記サンプルを増幅してこれの蛍光をモニタするステップと、 (e)ステップ(c)で求めた式から初期核酸濃度を決定するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 115.前記核酸結合蛍光染料がSYBRTMグリーンIであることを特徴とする 請求項114に記載の方法。 116.前記核酸結合蛍光体はオリゴヌクレオチド・プローブの対を含み、その 一方が蛍光共鳴エネルギー転移対の供与体で標識され他方が受容体で標識される ことを特徴とする請求項114に記載の方法。 117.前記プローブの一方が増幅用プライマーであることを特徴とする請求項 116に記載の方法。 118.放射スペクトルを有する供与体蛍光物質と吸収スペクトルを有し消光係 数が100,000M-1cm-1より大きい受容体蛍光物質とを含み、前記供与体 蛍光物質の放射スペクトルと前記受容体蛍光物質の吸収スペクトルが25%以下 でオーバラップすることを特徴とする蛍光共鳴エネルギー転移対。 119.前記供与体蛍光物質がフルオレセインであり前記受容体蛍光物質がCy 5又はCy5.5であることを特徴とする蛍光共鳴エネルギー転移対。 120. 生物学的サンプルの標的DNA配列を分析するための方法であって、 核酸結合蛍光体の存在下にポリメラーゼ連鎖反応によって前記標的配列を増幅 し、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的とされる核酸配列に対する熱安定性 ポリメラーゼ及びプライマーを前記生物学的サンプルに添加して少なくとも変性 温度と延長温度の間で前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップを含むス テップと、 前記核酸結合蛍光体により吸収される波長の光によって前記サンプルを励起す るステップと、 前記サンプルの温度が変化する際に前記核酸結合蛍光体からの温度依存性蛍光 をモニタするステップと、 を含むことを特徴とする方法。 121.前記核酸結合蛍光体は二重鎖核酸結合蛍光染料を含むことを特徴とする 請求項120に記載の方法。 122.前記二重鎖核酸結合蛍光染料がSYBRTMグリーンIであることを特徴 とする請求項121に記載の方法。 123.前記温度依存性蛍光を用いて前記増幅生成物を同定することを特徴とす る請求項122に記載の方法。 124.前記増幅生成物が溶解曲線の分析によって同定されることを特徴とする 請求項123に記載の方法。 125.2種類又はそれ以上の増幅生成物の相対量を溶解曲線の分析によって求 めることを特徴とする請求項124に記載の方法。 126.溶解曲線より下の領域が多重ガウス曲線の和の非線形最小自乗法回帰で 見付けられることを特徴とする請求項124に記載の方法。
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