KR100479789B1

KR100479789B1 - Pcr하는동안에하이브리드반응의모니터방법

Info

Publication number: KR100479789B1
Application number: KR10-1998-0709495A
Authority: KR
Inventors: 칼 티. 위터; 커크 엠. 리리; 랜디 피. 라스센
Original assignee: 유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션
Priority date: 1996-06-04
Filing date: 1997-06-04
Publication date: 2005-07-07
Also published as: KR20000015939A

Abstract

폴리메라제 연쇄 반응동안에 하이브리드를 모니터하는 방법에 대해 상술하고 있다. 이들 방법은 신속한 열 처리 변환과정 및 이중 쇄 DNA 염료 또는 특정 하이브리드 프로브를 이용하여 이루어진다. 형광 공명 에너지 전달 쌍은 플로레신 및 Cy5 또는 Cy5.5로 구성된다. 증폭된 DNA를 정량화하고, 이의 순도를 결정하는 방법은 용융 곡선 및 이의 재-어닐링 곡선 분석으로 이루어진다.

Description

ＰＣＲ하는 동안에 하이브리드반응의 모니터 방법

관련 출원

1997년 3월 17일자로 출원된 미국 출원 08/818,267은 Factor V Leiden 돌연변이를 감지하는 방법에 대한 것으로 이는 1996년 6월 4일자 출원된 08/658,993(발명의 명칭; PCR 과정을 모니터 하는 방법 및 시스템)의 연속출원이고, 이는 1995년 10월 2일자 출원된 미국 출원 08/537,612(발명의 명칭; 생물학적 시료의 신속한 열 처리 과정을 하는 방법)의 연속출원이고, 이는 1994년 1월 10일자 출원된 미국 출원 08/179,969(발명의 명칭; 신속한 열 처리 과정 장치; 현재 미국 특허 등록 5,455,175)의 연속출원이고, 이는 1992년 1월 2일자 출원된 미국 출원 07/815,966(발명의 명칭; 신속한 열 처리 장치; 현재 포기됨)의 연속출원이고, 이는 1990년 6월 4일자 출원된 미국 출원 08/534,029(발명의 명칭; 자동화된 PCR 장치)의 연속출원이며, 이는 전부 참고문헌으로 첨부한 바 있다. 1997년 6월 4일자 RO/US에 출원한 PCT 출원 PCT/US97.....(발명의 명칭; 생물학적 공정을 실행하고 모니터 하는 방법 및 시스템 [출원인; University of Utah Research Foundarion][발명자; Carl T. Wittwer, Kirk M. Ririe, Randy P. Rasmussen, David R. Hillyard] 또한 참고문헌으로 첨부를 한다.

본 발명은 폴리메라제 사슬 연쇄 반응과 연합한 하이브리드 반응의 결과를 형광 시그날로 관찰하는 것에 관계한다. 좀 더 구체적으로는, 본 발명은 PCR 하는 동안에 또는 PCR 직후에 형광물질로 하이브리드 반응을 관찰하는 것에 연관이 되는데, 이는 생성물의 확인, 서열 변화 감지 및 정량적인 것에 대한 정보를 이용한다.

폴리메라제 사슬 연쇄 반응(PCR)은 분자 생물학에서 가장 기초적인 것으로 임상 실험실에서 제일먼저 실행하는 분자 기술이다. 이와 같이 PCR의 유용성 및 대중성에도 불구하고, 현재 PCR의 이해가 상당히 진보되지 않은 상태이다. 성공적으로 증폭을 시키기 위한 적절한 조건에 대해서는 시행착오과정으로 확립할 수 있고, 최적의 조건은 실험에 의해 이루어진다. 당업자라도 이 공정의 이해 또는 예상 가설의 이해하지 않고도 강력한 기술을 이용할 수 있다.

PCR은 샘플의 온도 과정에 의해 이루어지는 것인데, DNA를 변성시키고(분리); 특정 프라이머에 부착시키고(어닐링); 복제(연장)가 일어나도록 한다. PCR의 한 과정은 통상 2 내지 8분이 소요되는데, 30회 변환 과정의 증폭을 위해서는 1 내지 4시간이 요구된다. 대부분의 PCR 기구에서 샘플 온도 반응은 변성 및 어닐링에 요구되는 시간과 비교를 할 때 매우 느리다. PCR에서 물리적인 반응(변성 및 어닐링)과 효소적인 반응(연장)은 매우 신속하게 일어난다. PCR 증폭 시간은 1시간에서 15분 이내로 줄일 수 있다. 참고문헌 미국 출원 08/537,612(1995년 10월 2일자 출원)에서는 신속한 과정 시스템에 대해 상술하고 있다. 신속한 변환 과정 기술은 모세관 튜브와 같은 샘플을 포함하는 용기의 용적에 비해 표면적이 큰 용기에서 샘플의 신속한 온도 반응 및 온도 상동성에 의해 가능하다. 추가 정보는 C.T. Witter, G.B. Reed, K.M. Ririe, Rapid cycle DNA amplification in K.B. Mullis. F. Ferre R.A. Gibbs. The polymerase chain reaction. Birkhauser. Boston. 174-181(1994). 개선된 온도 상동성으로 PCR에서의 온도 및 시간에 대한 요구가 더 명확하고 더 이해를 하기 쉽도록 한다. 또한 개선된 온도 상동성으로 증폭하는 동안에 PCR을 모니터하는데 이용되는 임의 분석학적 기술의 정확성을 증가시킨다.

형광측정은 감응성이 있고, 분자생물학에서 많은 부분에 이용을 할 수 있는 다용도 기술이다. 수년간 에티디움 브롬화물을 이용하여 겔 전기영동에 의해 분리된 핵산의 크기별 분포를 볼 수 있었다. 겔은 통상 UV 광에 투명하고, 이중 쇄의 핵산이 붉은 형광으로 관찰된다. 특히, 에티디움 브롬화물은 흔히 증폭이 완료된 후에 PCR 산물을 분석하는데 이용된다. 또한, EPA 0 640 828 A1(Higuchi & Watson)에서는 증폭하는 동안에 에티디움 브롬화물을 이용하여 각 변환 과정에서의 형광을 측정하여 이중 쇄 DNA의 양을 모니터 한다. 형광 강도는 온도에 역반응으로 상승되고 감소되는데, 어닐링/연장 온도(50℃)에서는 최대가 되고, 변성 온도(94℃)에서는 최저가 된다. 최대 형광을 각 변환 과정에서 얻어 이로써 DNA의 양을 측정한다. Higuchi & Watson 출원에서는 형광을 이용하여 하이브리드 반응을 모니터 하는 것에 대해서는 언급이 없고, 하이브리드 반응 범위를 따르는 상이한 온도 범위에서 형광을 얻는 것에 대해서도 언급이 없다. 또한, Higuchi & Watson은 PCR 생성물의 확인 또는 정량화를 위해 온도에 따른 PCR 산물의 하이브리드 반응을 이용한다고 제시하지 못하였다.

그러나, Higuchi & Watson 출원에서는 미국 특허 5,210,015(Gelfand)에서 상술된 것과 같이 특정 DNA 폴리메라제의 5'-엑소뉴클레아제 활성에 의해 하이브리드하였을 때, 형광을 발생시키는 이중-라벨된 프로브 시스템을 포함하는 다른 형광단(fluorophore)을 이용한다고 명시하고 있다. 이들 프로브에서 관찰되는 형광은 두 개의 형광단사이에 프로브의 가수분해에 따라 달라진다. PCR 생성물의 양은 각 변환 과정에서의 형광을 측정하여 결정을 한다. 이들 프로브의 하이브리드 반응은 가수분해가 필수적인 것으로 보이나, 하이브리드 반응이 아닌 프로브의 가수분해로 인하여 주로 형광 시그날이 발생되는데, 이때 양쪽 단부에 형광 염료를 가지는 올리고뉴클레오티드는 PCR 생성물의 감지 및 핵산의 하이브리드을 감지하는데 유용한 수냉(quenched) 프로브 시스템을 제공한다(K.J. Livak et al., 4PCR Meth. Appl. 357-362(1995)). PCR 생성물에 서열의 변화를 확인하는데 온도에 따른 형광을 가지는 프로브 하이브리드 반응을 준수한다는 내용은 없었다.

확인용으로 상보 쇄 핵산의 특정한 하이브리드 반응이 많은 상이한 포맷으로 개발되었다. 예를 들면, 제한 효소로 절단한 후에, 게놈 DNA를 크기별로 분류를 하고 서던 블랏팅을 이용하여 프로브에 하이브리드시킨다. 또 다른 예를 들면, 한 개 염기 돌연변이는 대립형질-특이적인 올리고뉴클레오티드와 "점 블랏"에 의해 감지할 수 있다. 일반적으로, 한 개 온도에서 필수적인 구별을 위해서는 하이브리드 반응을 수분 내지 수 시간 동안 실시한다. 또는, 형광 기술을 이용하여 온도를 변화시키면서 하이브리드 반응의 정도를 동적으로 모니터 한다. 예를 들면, 형광 용융 곡선을 이용하여 하이브리드 반응을 모니터한다(L.E. Morrison & L.M. Stols, 용액에서 DNA 하이브리드 반응의 역학적인 측정 및 감응성이 있는 형광을 이용한 열역학적인 측정, 32 Biochemistry 3095-3104, 1993). 온도 스캔 비율은 형광 측정 큐벳의 높은 열 부피로 인하여 통상 시간당 10℃ 또는 그 이하로 한다.

현재의 하이브리드반응을 모니터하는 방법은 상당한 시간을 요한다. 하이브리드 반응이 몇 시간이 아닌 수초 내에 이루어진다면, 비록 빠른 PCR 변환 과정동안에라도 PCR 증폭하는 동안에 하이브리드 반응을 모니터할 수 있다. PCR 동안에 하이브리드 반응을 모니터 하는 것은 많은 부분에서 이용을 할 수 있는데(이후에 상세히 설명을 함), 예를 들면, 생성물의 확인 및 정량, 서열의 변화 감지, 형광 피이드백에 의해 온도 변환 과정의 자동 제어 등을 포함한다.

전술한 것과 같이, 선행기술은 온도 변환 과정을 매우 느리게 경험적으로 실행을 하였다. 하이브리드 반응을 이용하여 PCR 생성물의 분석이 필요하면, 추가 시간을 소요하는 단계가 있어야 한다. 따라서, PCR 동안에 하이브리드 반응을 모니터 하는 방법과 반응이 일어나는 동안에 즉, 샘플의 조작 없이 온도 변환 과정동안에 또는 직후에 반응을 분석하는 방법을 본 기술분야에 제공을 하는 것은 당 분야에 상당한 진보를 한 것이다. PCR 동안에 하이브리드 반응을 모니터함으로써, PCR 작업을 할 수 있는 기초 원리를 따르고, 이를 이용하여 증폭하는 동안에 반응을 분석하고 최적화할 수 있다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 PCR 동안에 하이브리드 반응 생성물을 모니터 하는 이중쇄-특이적인 DNA 염료를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 형광 용융 곡선을 이용하여 PCR-증폭된 생성물을 확인하는 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 이중-쇄 특이적인 DNA 염료로 PCR 정량화의 감응성을 개선하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 이중 쇄-특이적인 DNA 염료로 감지된 비-특이적인 증폭을 교정하기 위해 용융 곡선에 의한 PCR에 의해 증폭된 특정 생성물의 양을 결정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 이중 쇄-특이적인 염료와 상이한 PCR 생성물 관련 양을 결정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 이중-쇄 특이적인 DNA 염료 존재89하에, 생성물의 재-어닐링 역학으로 생성물을 정량화하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 프라이머/프로브 하이브리드 반응을 모니터하기 위해 신규의 공명 에너지 전달 쌍을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 공명 에너지 전달 쌍을 이용하여 생성물에 프로브를 다시 어닐링시켜 생성물을 정량화하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PCR 증폭하는 동안 각 변환 과정에서 프로브의 하이브리드으로 인한 형광에 따라 시작 주형 복제 수를 결정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 PCR 프라이머의 내부에 하이브리드되는 두 개의 라벨된 프로브간에 공명 에너지 전달에 의해 PCR 생성물의 상동 감지에 대한 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PCR 프라이머의 내부에 하이브리드되는 한 개의 라벨된 프로브와 한 개의 라벨된 프라이머간에 공명 에너지 전달에 의해 PCR 생성물의 상동 감지에 대한 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 공명 에너지 전달 및 프로브 용융 곡선에 의해 PCR 프라이머의 내부에 서열 변화를 감지하는 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 프로브 용융 곡선에 의해 상이한 PCR 생성물의 관련 양을 정량화하는 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 변환 과정 수에 대해 형광을 나타낸 곡선으로 시작 주형 복제 수를 결정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PCR을 신속하게 실행을 하고, 지속적으로 반응을 모니터하고, 반응이 진행되는 동안에 반응 변수를 조절하는 방법 및 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 합성 핵산 유사체 또는 유도체, 가령, 펩티드 핵산(PNA) 등을 핵산 프라이머에 대체하는 것을 제공하는데 단, 이 대체물은 형광 화합물로 라벨되어야 한다.

이와 같은 목적과 본 발명의 장점은 상세한 설명 및 청구범위에서 이해를 할 수 있을 것이다.

본 발명은 특히, 선행기술에 비해 PCR 증폭 및 분석에 요구되는 전체 시간을 감소시키면서 동시에 증폭 조건을 최적화하여 반응의 질을 상당히 증가시킬 수 있다.

본 발명은 DNA 증폭에 대한 지속적인 형광 모니터를 하는 방법 및 이용 방법을 제공한다. 필요한 기구는 여러 가지 형광 기술에 의해 지속적으로 DNA 증폭을 모니터하기 위해 신속한 온도 변환 과정을 제공하는 구조를 가진 광학 요소들을 복합시킨다. 한 가지 구체예로써, 형광은 한 가지 샘플 또는 모든 샘플이 동시에 신속한 열 처리 과정을 거칠 수 있는 회전하는 컨베이어에 있는 다수의 샘플로부터 지속적으로 얻을 수 있다. 또한, 연합된 기구에 대한 정보는 전술한 미국 출원에서 찾을 수 있다.

본 발명의 한 특징에 따르면, DNA 증폭하는 동안에 형광은 1) 이중 쇄-특이적인 염료 SYBR Green 1; 2) 하이브리드 반응 프로브가 있는 Cy5^TM 또는 Cy5.5^TM으로 형광물질의 공명 에너지 전달에 의해 모니터할 수 있다. 한 번의 변환 과정에서 수득되는 형광 데어터를 이용하면 시작 주형 복제 수를 정량화할 수 있다.

또한, 한 번의 변환 과정에서 형광을 측정하는 것과는 대조적으로, 본 발명의 구체예에서는 각 변환 과정을 통하여 지속적으로 온도, 시간, 형광을 모니터 하여, 3차원 쇄를 만들 수 있다. 이와 같은 3-차원 쇄는 시간에 대한 온도 비율, 시간에 대한 형광, 온도에 대한 형광 곡선도 정리할 수 있다. 하이브리드 반응 프로브에서 온도에 대한 형광 곡선을 이용하면 생성물에 있는 서열 변화를 감지할 수 있다. 이와 같은 서열 변화는 돌연변이 또는 다형성에서는 자연적인 것이나 PCR을 정량화하는 만들어지는 또 다른 주형에서는 인공적인 것이다.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 이중 쇄-특이적인 DNA에 특이적인 염료를 이용하여 형광을 모니터하여, PCR 동안에 생성물 용융 곡선을 얻을 수 있다. 생성물의 분해 온도동안에 열 사이클러(cycler)를 가열할 때, 온도에 대한 형광을 플롯 하면 PCR 생성물의 용융 곡선을 얻을 수 있다. 이와 같은 DNA 용융 곡선의 모양 및 위치는 GC/AT 비율, 길이, 서열에 대한 함수로써, 이를 이용하면 용융 온도에서 2℃이하로 분리되는 증폭 생성물을 구별할 수 있다. 프라이머 이량체를 포함하는 원하지 않는 생성물가운데에서 원하는 생성물을 분리해낼 수 있다. 용융 곡선을 분석하면 정량적인 PCR 범위를 연장시키고, 다수의 증폭에서 상이한 생성물을 분리해낼 수 있다. 이중 쇄 염료를 이용하여, 각 변환 과정 내에 생성물의 변성, 다시 어닐링, 연장 등을 할 수 있다. 형광을 지속적으로 모니터 하면, 용융 곡선을 얻을 수 있고, 온도 변환 과정동안에 생성물의 어닐링 곡선을 얻을 수 있다.

본 발명은 30분 이내에, 적절하게는 15분 이내에, 가장 적절하게는 10분 이내에 형광을 모니터 함으로써 증폭 및 분석을 복합한 신속한 과정의 PCR을 위한 시약 및 방법을 제공한다.

생물학적 시료에서 표적 DNA 서열을 분석하는 방법은 다음과 같다;

- 표적 서열의 인접 부분에 하이브리드할 수 있는 두 개의 핵산 프로브 존재 하에, 폴리메라제 연쇄 반응법에 의해 표적 서열을 증폭시키고, 이때 두 개의 프로브중 한 개는 수용 형광단으로 라벨링하고, 나머지 프로브는 형광 에너지 전달 쌍의 제공 형광단으로 라벨링하여 표적 서열과 두 개의 프로브가 하이브리드하는 동안에 제공 형광단과 수용 형광단은 서로 25개 뉴클레오티드안에 있고, 폴리메라제 연쇄 반응은 생물학적 시료에 표적이 되는 핵산 서열에 대한 프라이머와 열에 안정한 폴리메라제를 첨가하고, 변성 온도와 연장 온도사이에서 시료에 열처리를 변환하는 것으로 구성되고;

- 제공 형광단에 의해 흡수되는 파장에서 빛으로 생물학적 시료를 여기시키고, 형광단 에너지 전달 쌍으로부터 발생되는 빛을 감지하는 것으로 구성된다.

생물학적 시료의 표적 DNA 서열을 분석하는 방법은 다음과 같다;

- 제공 형광단에 의해 흡수되는 파장에서 빛으로 생물학적 시료를 여기시키고, 형광단 에너지 전달 쌍으로부터 발생되는 빛을 감지하고; 그리고

- 형광 에너지 전달 쌍으로부터 온도에 따른 형광을 모니터하는 것으로 구성된다.

생물학적 시료에서 표적 핵산의 폴리메라제 연쇄 반응 증폭의 실제 시간을 모니터하는 방법은 다음과 같다;

a) 두 가지 핵산 프라이머와 핵산 프로브 효과량을 생물학적 시료에 첨가하고, 이때 프라이머중 하나와 프로브는 수용 형광단과 제공 형광단으로 구성된 형광 에너지 전달 쌍의 한 개 구성원으로 각각 라벨링하고, 이때 라벨된 프로브는 라벨된 프라이머의 15개 뉴클레오티드내에 표적 핵산 서열의 증폭된 복제본에 하이브리드하고;

b) 폴리메라제 연쇄 반응법에 의해 표적 핵산 서열을 증폭시키고;

c) 제공 형광단이 흡수하는 선택된 파장의 빛을 생물학적 시료에 조사하고; 그리고

d) 시료의 형광 방출을 감지하는 것으로 구성된다.

생물학적 시료의 표적이 되는 핵산 서열을 증폭시키는 개선된 방법은 다음과 같다;

a) 핵산에 결합을 하는 형광물질 전제의 효과량을 생물학적 시료에 첨가하고;

b) 폴리메라제 연쇄 반응을 이용하여 표적 핵산을 증폭시키는데, 이는 시작 결정된 온도와 시간 변수를 이용하여, 생물학적 시료에 열처리 변환 과정을 거치게 하고, 그 다음

(i) 폴리메라제 연쇄 반응동안에 형광물질 전체가 흡수하는 선택된 파장의 빛을 생물학적 시료에 비추고;

(ii) 샘플에서 방출되는 형광을 모니터하여, 폴리메라제 연쇄 반응의 시간 변수와 적절한 온도를 결정하고;

(iii) 형광에 따른 초기 온도와 시간 변수를 조정하는 것으로 구성된다.

한 구체예에서, 형광물질 전체는 이중 쇄에 특이적인 핵산 결합 염료로 구성되고, 또 다른 구체예에서는 형광물질 전체는 표적이 되는 핵산 서열에 하이브리드할 수 있는 형광 라벨된 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성된다.

생물학적 시료의 표적이 되는 핵산 서열을 감지하는 방법은 다음과 같다;

a) 표적 핵산 서열에 하이브리드되는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브 효과량을 생물학적 시료에 첨가를 하고, 프로브중 하나는 수용 형광단으로 라벨링하고, 다른 프로브는 형광 에너지 전달 쌍의 제공 형광단으로 라벨링하고, 제공 형광단의 방출 스펙트럼과 수용 형광단의 흡수 스펙트럼의 겹치는 정도는 25%이하이고, 수용 형광단은 100,000M^-1㎝^-1의 흡광계수를 가지고, 두 개의 프로브가 하이브리드할 때, 제공 형광단과 수용 형광단은 서로 25개 뉴클레오티드범위내에 있고;

b) 제공 형광단이 흡수하는 선택된 파장의 빛을 생물학적 시료에 조사하고;

c) 생물학적 시료로부터 발생되는 형광을 측정하는 것으로 구성된다.

공명 에너지 전달 쌍을 예로 들면 제공자로는 플로레신, 수용자로는 Cy5 또는 Cy5.5로 구성된다.

생물학적 시료에서 표적이 되는 핵산 서열의 폴리메라제 연쇄 반응을 모니터하는 방법은 다음과 같다;

- 표적 서열의 인접 부분에 하이브리드할 수 있는 두 개의 핵산 프로브 존재 하에, 폴리메라제 연쇄 반응 법에 의해 표적 서열을 증폭시키고, 이때 두 개의 프로브중 한 개는 수용 형광단으로 라벨링하고, 나머지 프로브는 형광 에너지 전달 쌍의 제공 형광단으로 라벨링하여 표적 서열과 두 개의 프로브가 하이브리드하는 동안에 제공 형광단과 수용 형광단은 서로 25개 뉴클레오티드안에 있고, 폴리메라제 연쇄 반응은 생물학적 시료에 표적이 되는 핵산 서열에 대한 프라이머와 열에 안정한 폴리메라제를 첨가하고, 변성 온도와 연장 온도사이에서 시료에 열처리를 변환하는 것으로 구성되고;

- 형광 에너지 전달 쌍에서 나오는 온도에 따른 형광을 모니터 하는 것으로 구성된다.

생물학적 시료에서 표적 핵산의 폴리메라제 연쇄 반응 증폭의 실제 시간을 모니터 하는 방법은 다음과 같다;

- SYBR^TM Green I 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 표적 서열을 증폭시키고, 폴리메라제 연쇄 반응은 생물학적 시료에 표적이 되는 핵산 서열에 대한 프라이머와 열에 안정한 폴리메라제를 첨가하고, 변성 온도와 연장 온도사이에서 시료에 열처리를 변환하는 것으로 구성되고;

- SYBR^TM Green I가 흡수하는 파장에서 빛으로 생물학적 시료를 여기시키고, 형광단 에너지 전달 쌍으로부터 발생되는 빛을 감지하고; 그리고

- SYBR^TM Green I으로부터 나오는 온도에 따른 형광을 모니터하는 것으로 구성된다. 적절하게는 모니터 단계는 증폭된 표적 서열의 용융 프로파일을 결정하는 것으로 구성된다.

- 두 개의 핵산 프라이머와 핵산 프로브 효과량을 생물학적 시료에 첨가하고, 이때 두 개의 프라이머중 한 개와 프로브는 각각 수용 형광단과 제공 형광단으로 구성된 형광 에너지 전달 쌍의 한 개 구성원으로 각각 라벨링하고, 이때 라벨된 프로브는 라벨된 프라이머의 15개 뉴클레오티드내에 표적 핵산 서열의 증폭된 복제본에 하이브리드하고;

c) 제공 형광단이 흡수하는 선택된 파장의 빛을 생물학적 시료에 조사하고, 시료의 형광 방출을 감지하는 것으로 구성된다. 또 다른 한 구체예에서, 방법에는 시료의 온도에 따른 형광을 모니터하는데, 적절하게는 증폭된 표적 서열의 융융 프로파일을 결정함으로써 모니터하는 단계로 구성된다.

제 2 핵산 서열과 비교를 할 때, 제 1 핵산에서 선택된 위치에 차이를 감지하는 방법은 다음과 같다;

a) 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 증폭이 되도록 형태를 갖춘 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 제 1 핵산의 선택된 단편 및 이에 상응하는 제 2 핵산 서열을 제공하는데, 이때 선택된 단편 및 이에 상응하는 단편은 각각 선택된 위치로 구성되어, 증폭된 생성물에는 선택된 위치의 복사체를 포함하고;

b) 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하는데, 프로브중 한 개는 수용 형광단으로 라벨링되고, 다른 프로브는 형광 공명 에너지 전달 쌍중 제공 형광단으로 라벨링하여, 증폭된 생성물에 두 개의 프로브가 하이브리드될 때, 제공자와 수용자는 공명 에너지 전달 관계에 있고, 이때 프로브중 한 개는 증폭된 생성물에 하이브리드하도록 되어 프로브중 한 개는 선택된 위치로 연장되고, 제 1 핵산 서열에 다른 점이 있는 경우, 용융 프로파일을 나타내고, 이는 제 2 핵산 서열의 용융 프로파일과 구별이 되며;

c) 효과량의 프로브 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 제 1 핵산의 선택된 부분과 이에 상응하는 제 2 핵산 부분을 증폭시켜, 선택된 부분 및 이에 상응하는 부분을 증폭시키고, 이 부분은 공명 에너지 전달 관계에 있는 형광 공명 에너지 전달 쌍에 하이브리드되는 두 개의 프로브를 가지고;

d) 증폭된 단편 및 이에 상응하는 단편 그리고 이에 하이브리드될 프로브에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 형광 공명 에너지 전달 쌍에 의해 형광을 유도하고;

e) 온도에 따른 형광 방출을 측정하여, 증폭된 제 1 핵산의 선택된 부분에서 용융되는 프로브중 하나의 제 1 용융 프로파일과 제 1 핵산의 부분에 상응하는 제 2 핵산의 증폭된 부분에서 용융되는 프로브중 하나의 제 2 용융 프로파일을 결정하고; 그리고

f) 제 1 용융 프로파일과 제 2 용융 프로파일을 비교하여, 차이가 있는 경우에는 시료 핵산에 차이가 있다는 것을 나타낸다.

제 2 핵산에 비교하여 제 1 핵산에 선택된 위치에 차이를 감지하는 방법은 다음과 같다;

b) 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하는데, 프라이머중 하나와 프로브는 각각 제공 형광단과 수용 형광단으로 구성된 형광 에너지 전달 쌍의 한 개 요소로 라벨링하고, 라벨된 프로브와 라벨된 프라이머는 증폭된 생성물에 하이브리드되어, 제공자와 수용자는 공명 에너지 전달 관계에 있고, 이때 프로브는 증폭된 생성물에 하이브리드하도록 되어, 프로브는 선택된 위치로 연장되고, 제 1 핵산 서열에 다른 점이 있는 경우, 용융 프로파일을 나타내고, 이는 제 2 핵산 서열의 용융 프로파일과 구별이 되며;

c) 효과량의 프라이머와 프로브 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 제 1 핵산의 선택된 부분과 이에 상응하는 제 2 핵산 부분을 증폭시켜, 선택된 부분 및 이에 상응하는 부분을 증폭시키고, 이 부분은 공명 에너지 전달 관계에 있는 형광 공명 에너지 전달 쌍에 하이브리드되는 라벨된 프라이머와 프로브를 가지고;

d) 증폭된 단편 및 이에 상응하는 단편 그리고 이에 하이브리드될 프로브 및 라벨된 프라이머에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 형광 공명 에너지 전달 쌍에 의해 형광을 유도하고;

개체의 게놈에서 선택된 위치에 이형접합성을 감지하는 방법은 다음과 같은데 이때, 게놈은 돌연변이 대립형질과 이에 상응하는 기준 대립형질로 구성되고, 각각은 선택된 위치로 구성된다;

a) 개체로부터 시료 게놈 DNA를 얻고;

b) 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 증폭이 되도록 형태를 갖춘 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 돌연변이 대립형질유전자의 제 1 선택된 단편 및 이에 상응하는 기준 대립형질 유전자의 제 2 단편을 제공하는데, 이때 선택된 단편 및 이에 상응하는 단편은 각각 선택된 위치로 구성되어;

c) 올리고뉴클레오티드 프로브 한 쌍을 제공하는데, 프로브중 하나는 수용 형광단으로 라벨링하고, 나머지 프로브는 형광 에너지 전달 쌍의 제공 형광단으로 라벨링하여, 증폭된 제 1 단편과 제2 단편에 두 개의 프로브를 하이브리드하면, 프로브중 하나는 선택된 위치로 연장되고, 제 1 핵산 서열에 다른 점이 있는 경우, 용융 프로파일을 나타내고, 이는 제 2 핵산 서열의 용융 프로파일과 구별이 되며;

d) 효과량의 프로브 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 샘플 게놈 DNA의 제 1 선택된 부분과 이에 상응하는 제 2 부분을 증폭시켜, 선택된 부분 및 이에 상응하는 부분을 증폭시키고, 이 부분은 공명 에너지 전달 관계에 있는 형광 공명 에너지 전달 쌍에 하이브리드되는 라벨된 두 개의 프로브를 가지고;

e) 증폭된 제 1 단편 및 이에 상응하는 제 2 단편 그리고 이에 하이브리드될 프로브에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 형광 공명 에너지 전달 쌍에 의해 형광을 유도하고;

f) 온도에 따른 형광 방출을 측정하여, 증폭된 제 1 선택된 부분에서 용융되는 프로브중 하나의 제 1 용융 프로파일과 제 1 부분에 상응하는 제 2 증폭된 부분에서 용융되는 프로브중 하나의 제 2 용융 프로파일을 결정하고; 그리고

g) 제 1 용융 프로파일과 제 2 용융 프로파일을 비교하여, 차이가 있는 경우에는 시료 게놈 DNA에 이형접합성을 나타내는 것을 나타낸다.

a) 개체로부터 시료 게놈 DNA를 얻고;

c) 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하는데, 프라이머중 하나와 프로브는 각각 제공 형광단과 수용 형광단으로 구성된 형광 에너지 전달 쌍중의 한 구성요소로 라벨링하고, 라벨된 프로브와 라벨된 프라이머는 증폭된 제 1 단편과 제2 단편에 두 개의 프로브를 하이브리드하면, 프로브중 하나는 선택된 위치로 연장되고, 제 1 핵산 서열에 다른 점이 있는 경우, 용융 프로파일을 나타내고, 이는 제 2 핵산 서열의 용융 프로파일과 구별이 되며;

d) 효과량의 프로브와 프라이머 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 샘플 게놈 DNA의 제 1 선택된 부분과 이에 상응하는 제 2 부분을 증폭시켜, 선택된 부분 및 이에 상응하는 부분을 증폭시키고, 이 부분은 공명 에너지 전달 관계에 있는 형광 공명 에너지 전달 쌍에 하이브리드되는 라벨된 프라이머와 프로브를 가지고;

e) 증폭된 제 1 단편 및 이에 상응하는 제 2 단편 그리고 이에 하이브리드될 라벨된 프라이머와 프로브에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 형광 공명 에너지 전달 쌍에 의해 형광을 유도하고;

f) 온도에 따른 형광 방출을 측정하여, 증폭된 제 1 선택된 부분에서 용융되는 프로브의 제 1 용융 프로파일과 제 1 부분에 상응하는 제 2 증폭된 부분에서 용융되는 프로브의 제 2 용융 프로파일을 결정하고; 그리고

폴리메라제 연쇄 반응 혼합물에서 폴리메라제 연쇄 반응의 완료를 결정하는 방법은 다음과 같은데, 이때 혼합물은 (1) 핵산, 핵산 또는 폴리메라제 연쇄 반응으로 증폭된 핵산으로 두 개의 별개 상보쇄로 구성되고; (2) 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 핵산의 선택된 부분을 증폭시켜, 증폭된 생성물을 만들 수 있도록 된 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머; (3) 폴리메라제 연쇄 반응을 촉매하는 DNA 폴리메라제로 구성되고;

(a) 혼합물에 (1)와 (2)를 첨가하는데, 이때 (1)은 형광 공명 에너지 전달 쌍의 공명 에너지 전달 제공자 또는 공명 에너지 전달 수용자로 라벨된 올리고뉴클레오티드 프로브 효과량이 되고, 이때 프로브는 선택된 온도와 1가 이온 강도 하에 증폭된 생성물에 하이브리드할 수 있도록 되어 있고; (2)는 제공자 또는 수용자로 라벨된 기준 올리고뉴클레오티드 효과량이 되며, 이때 조건은 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드간에 하나는 제공자로 라벨링되고, 다른 하나는 수용자로 라벨링하는 것이고, 이때 기준 올리고뉴클레오티드는 선택된 온도와 1가 이온강도하에 증폭된 생성물에 하이브리드할 수 있도록 되어 있어, 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드 모두가 증폭된 생성물에 하이브리드될 때. 제공자와 수용자는 공명 에너지 전달 관계에 있으며;

(b) 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 핵산의 선택된 단편이 증폭시켜, 증폭된 생성물을 얻는데 이때, 생성물은 공명 에너지 전달 관계에 있는 형광 공명 에너지 전달 쌍에 하이브리드된 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드를 가지고;

(c) 하이브리드된 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드를 가지는 증폭된 생성물에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 형광공명 에너지 전달 쌍에 의해 형광을 유도하고, 발생되는 형광을 모니터하고, 반응이 종료되었음을 나타내는 형광 발생이 평탄역상에 도달하였을 때 변환과정을 결정하는 것으로 구성된다.

(a) 혼합물에 핵산-결합 형광 염료 효과량을 첨가하고;

(b) 혼합물에서 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 핵산의 선택된 단편을 증폭시키고, 이때 핵산에 결합하는 형광 염료를 첨가하면, 증폭된 생성물에 핵산 결합 형광 염료가 결합하게 되고; 그리고

(c) 핵산에 결합하는 형광 염료가 결합된 증폭된 생성물에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 형광공명 에너지 전달 쌍에 의해 형광을 유도하고, 발생되는 형광을 모니터하고, 반응이 종료되었음을 나타내는 형광 발생이 평탄역상에 도달하였을 때 변환과정을 결정하는 것으로 구성된다. 바람직하게는 핵산-결합 형광 염료는 SYBR^TM Green-1, 에티디움 브롬화물, 피코 그린, 아크리딘 오렌지, 티아졸 오렌지, YO-PRO-1, 크로모마이신 A3에서 선택하는데, 가장 적절한 것이 SYBR^TM Green-1이다.

이중 쇄-특이적인 형광 염료로 구성된 폴리메라제 연쇄 반응 혼합물의 어닐링, 연장, 변성 상으로 구성된 폴리메라제 연쇄 반응의 온도 변환과정 변수를 조절하는 방법은 다음과 같은데, 이때 변수는 어닐링 상의 기간, 변성 상의 기간, 변환과정 횟수로 구성된다;

(a) 선택된 파장의 빛을 반응물에 조사하여, 형광 염료에 의해 형광을 유도하고. 변환되는 어닐링, 연장, 변성 상동안에 지속적으로 형광을 모니터하고;

(b) (i) 연장상 동안에 형광이 증가되는 것이 종료되는 기간 또는

(ii) 변성 상동안에 형광이 기저선까지 감소되는 기간 또는

(iii) 연장 상동안에 미리 선택된 수준에 형광이 도달하기 위한 변환과정의 횟수 등을 결정하고;

(c) 연장 상동안에 형광의 증가가 중지되는 시간에 따른 연장 상의 길이, 변성 상동안에 형광이 기저선까지 감소되는 시간에 따른 변성 상의 길이 또는 연장 상동안에 미리 선택한 수준에 형광이 도달하는데 필요한 변환과정의 횟수에 따른 변환과정의 수를 조절하는 것으로 구성된다.

선택된 폴리메라제 연쇄 반응 혼합물에서 증폭된 생성물의 농도를 결정하는 방법은 다음과 같다;

(a) 선택된 온도와 반응 조건에서 농도를 알고 있는 증폭된 생성물의 하이브리드 속도를 모니터하여 증폭된 생성물에 대한 이차 속도 상수를 결정하고;

(b) 농도를 모르는 증폭된 생성물에 대한 어닐링 속도를 결정하고; 그리고

(c) 어닐링 속도와 이차 속도 상수로부터 증폭된 생성물의 농도를 계산하는 것으로 구성된다. 바람직하게는, 어닐링 속도는 여러 과정의 증폭을 한 후에 결정한다. 한 구체예에서 이차 속도 상수를 결정하는 방법은 다음과 같다;

- 농도를 알고 있는 증폭된 생성물과 효과량의 이중-쇄 특이적인 형광 염료로 구성된 제 1 폴리메라제 연쇄 반응 혼합물의 온도를 증폭된 생성물의 변성 온도 이상으로 상승시켜 증폭된 생성물을 변성시키고;

- 농도를 알고 있는 증폭된 생성물과 효과량의 이중-쇄 특이적인 형광 염료로 구성된 제 1 폴리메라제 연쇄 반응 혼합물의 온도를 증폭된 생성물의 변성 온도 이하로 신속하게 낮추고, 시간에 대한 함수로써 제 1 폴리메라제 연쇄 반응 혼합물의 형광을 지속적으로 모니터하고;

- 최대 형광, 최소 형광, 최소 형광 시에 시간 등을 결정하기 위해 시간에 대해 형광을 플롯팅하고, 하기 수학식 1을 이용하여 농도를 알고 있는 증폭된 생성물에 대한 이차 속도 상수를 결정한다.

[수학식 1]

F=F_max-_maxmin0

이때, F는 형광이고, F_max는 최대 형광을 나타내고, F_min은 최소 형광을 나타내고, k는 이차 속도 상수이고, t_o는 F_min일 때 시간을 나타내고, [DNA]는 농도를 알고 있는 증폭된 생성물을 나타낸다.

경쟁성 정량적인 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 선택된 핵산의 농도를 결정하는 방법은 다음과 같다;

(a) (i) 폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 주형의 단편과 경쟁을 하는 주형의 이에 상응하는 단편을 증폭시켜 이의 증폭된 생성물을 얻도록 된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 각 효과량;

(ii) 형광 공명 에너지 전달 쌍의 공명 에너지 전달 제공자 또는 공명 에너지 전달 수용자로 라벨된 올리고뉴클레오티드 프로브 효과량, 이때 프로브는 증폭된 생성물에 하이브리드되어, 경쟁이 되는 주형의 증폭된 생성물로부터 용융되는 프로브의 용융온도와는 구별이되는 용융온도에서 선택된 주형의 증폭된 생성물로부터 프로브가 용융되고;

(iii) 제공자 또는 수용자로 라벨된 기준 올리고뉴클레오티드 효과량, 단 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드간에 하나는 제공자로 라벨되고, 다른 하나는 수용자로 라벨되며, 기준 올리고뉴클레오티드는 증폭된 생성물에 하이브리드하도록 되어, 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드가 모두 증폭된 생성물에 하이브리드될 때, 제공자와 수용자는 공명 에너지 전달 관계에 있고; 이와 같이 구성된 혼합물에서 농도를 모르는 선택된 주형과 농도를 알고 있는 경쟁이 되는 주형을 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 증폭시켜 이의 증폭된 생성물을 만들고;

(b) 반응 혼합물에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 형광 공명 에너지 전달 쌍에 의해 형광을 유도하고, 온도에 대한 함수로써 형광 방출을 결정하고, 반응 혼합물의 온도는 선택된 주형의 증폭된 생성물로부터 용융되는 프로브의 제 1 용융 곡선과 경쟁을 한 주형으로 부터 용융된 제 2 용융 곡선으로 변화되고;

(c) 제 1과 제 2 용융 곡선을 제 1과 제 2 용융 피크로 변환시켜, 이와 같은 용융 피크로부터 선택된 주형과 경쟁을 하는 주형의 상대적인 양을 결정하고; 그리고

(d) 경쟁이 되는 주형의 양, 선택된 주형과 경쟁 주형간의 상대적인 양을 근거로 하여 선택된 주형의 농도를 계산하는 것으로 구성된다.

형광 공명 에너지 전달 쌍은 형광물질과 Cy5 또는 Cy5.5로 구성된다.

폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 핵산의 농도를 결정하는 방법은 다음과 같다;

(a) (i) 폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 주형의 제 1 단편을 증폭시켜 이의 증폭된 제 1 생성물을 얻도록 된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 제 1 프라이머 각 효과량;

(ii) 폴리메라제 연쇄 반응에서 기준 주형의 제 2 선택된 단편을 증폭시켜 이의 증폭된 제 2 생성물을 얻도록 된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 제 2 프라이머 효과량;

(iii) 핵산-결합하는 형광 염료 효과량;으로 구성된 혼합물에서 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 농도를 모르는 선택된 주형과 농도를 알고 있는 기준 주형을 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 각각 증폭시켜 각각의 증폭된 생성물을 만들고;

(b) 반응 혼합물에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 핵산-결합하는 형광 염료에 의해 형광을 유도하고, 온도에 대한 함수로써 형광 방출을 지속적으로 모니터하고, 증폭된 생성물로부터 용융 곡선을 만드는데, 이때 제 1 생성물과 제 2 생성물은 다른 온도에서 용융되고;

(c) 용융 곡선을 용융 피크로 변환시켜, 이와 같은 용융 피크로부터 선택된 주형과 기준 주형의 상대적인 양을 결정하고; 그리고

(d) 기준 주형의 양, 기준 주형과 선택된 주형간의 상대적인 양을 근거로 하여 선택된 주형의 농도를 계산하는 것으로 구성된다.

양성 기준 주형을 포함하는 폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 핵산의 농도를 결정하는 방법은 다음과 같다;

(ii) 폴리메라제 연쇄 반응에서 양성 기준 주형의 제 2 선택된 단편을 증폭시켜 이의 증폭된 제 2 생성물을 얻도록 된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 제 2 프라이머 효과량;

(iii) 핵산-결합하는 형광 염료 효과량;으로 구성된 반응 혼합물을 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 선택된 주형과 양성 기준 주형을 각각 증폭시키는 조건하에 두고;

(b) 반응 혼합물에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 핵산-결합하는 형광 염료에 의해 형광을 유도하고, 온도에 대한 함수로써 방출되는 형광을 지속적으로 모니터하고, 선택된 주형이 증폭된 경우에는 증폭된 제 1 생성물의 제 1 용융 피크를 만들고, 양성 기준 주형이 증폭된 경우에는 증폭된 제 2 생성물의 제 2 용융 피크를 만들고;

이때, 제 2 용융 곡선을 얻는다는 것은 폴리메라제 연쇄 반응이 작용했다는 것을 나타내고, 제 1 용융 곡선을 얻는다는 것은 선택된 제 1 단편이 증폭되었엄을 알리는 것이도, 제 1 용융 곡선이 없다는 것은 선택된 제 1 단편이 증폭되지 않았음을 나타내는 것으로 구성된다.

개체에서 V Leiden 돌연변이를 감지하는 방법은 다음과 같은데, 이때 V Leiden 돌연변이는 야생형과 비교를 하였을 때, 인자 V Leiden 돌연변이 위치에서 한 개의 염기가 변화된 것으로 구성된다;

(a) 개체로부터 시료 게놈 DNA를 얻고;

(b) 기준으로 삼을 야생형 게놈 DNA를 얻고;

(c) 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 시료 게놈 DNA의 선택된 단편과 야생형 게놈 DNA의 단편을 증폭시키도록 된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공하고, 이때 선택된 단편은 인자 V Leiden 돌연변이 위치로 구성되어, 증폭된 생성물에는 인자 V Leiden 돌연변이 위치의 복사체를 포함하게 되고;

(d) 형광 공명 에너지 전달 쌍의 공명 에너지 전달 제공자 또는 공명 에너지 전달 수용자로 라벨된 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하는데, 이때 프로브는 증폭된 생성물에 하이브리드되어, 시료 게놈 DNA에 V Leiden 돌연변이가 있는 경우에 용융 곡선을 나타내는데, 이때 용융 곡선은 야생형 게놈 DNA의 용융 프로파일과는 구별이 되는 것이고;

(e) 공명 에너지 전달 제공자 또는 공명 에너지 전달 수용자로 라벨된 전달 올리고뉴클레오티드를 제공하는데, 단 조건은 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드간에 하나는 공명 에너지 전달 제공자로 라벨이 되고, 다른 하나는 공명 에너지 전달 수용자로 라벨이 되며; 전달 올리고뉴클레오티드는 증폭된 생성물에 하이브리드하도록 되어, 공명 에너지 전달 제공자와 공명 에너지 전달 수용자는 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드가 증폭된 생성물에 하이브리드될 때, 공명 에너지 전달 관계에 있고;

(f) 올리고뉴클레오티드 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드 효과량 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 시료 게놈 DNA의 선택된 단편과 야생형 게놈 DNA를 증폭시켜, 선택된 단편을 증폭시키는데 여기에는 공명 에너지 전달 관계에 있는 형광 공명 에너지 전달 쌍이 하이브리드된 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드를 부분적으로 가지고;

(g) 폴리메라제 연쇄 반응의 증폭 과정동안에 온도에 대한 함수로써 형광을 측정하여 시료 게놈 DNA의 증폭된 단편으로부터 용융되는 프로브의 용융 프로파일과 야생형 게놈 DNA의 증폭된 단편으로부터 용융되는 프로브의 용융 프로파일을 만들고;

(h) 야생형 게놈 DNA의 용융 프로파일에 대해 시료 게놈 DNA의 용융 프로파일을 비교하여, 차이가 있는 경우에는 시료 게놈 DNA에 인자 V Leiden 돌연변이가 존재함을 나타내는 것이다.

핵산 하이브리드 반응을 분석하는 방법은 다음과 같다;

(a) 분석을 할 핵산 시료와 핵산에 결합하는 형광물질로 구성된 혼합물을 제공하고; 그리고

(b) 초당 ≥0.1℃ 이상의 속도로 온도를 변화시키면서 형광을 모니터 하는 것으로 구성된다.

양을 모르는 핵산을 포함하는 시료에서 시작 복사체의 수를 정량화하는 방법은 다음과 같다;

(a) 표준과 핵산 결합 형광물질로 구성된 혼합물에서 농도를 알고 있는 적어도 한가지 표준을 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 증폭시키고;

(b) 변환 과정 횟수에 대한 함수로써 형광을 측정하여, 일련의 데이터 점을 얻고;

(c) 초기 핵산 농도와 과정 횟수에 대한 함수로써 형광을 설명하는 주어진 식에 데이터 점을 적용시키고;

(d) 시료와 핵산 결합 형광물질로 구성된 혼합물에 양을 모르는 핵산을 포함하는 시료를 증폭시키고, 이의 형광을 모니터하고; 그리고

(e) (c)단계에서 결정된 반응식으로부터 초기 핵산 농도를 결정하는 것으로 구성된다.

형광 공명 에너지 전달 쌍에 대해 상술하고 있는데, 이때 쌍은 방출 스펙트럼을 가지는 제공자 형광단과 흡수 스펙트럼을 가지는 수용자 형광단으로 구성되고, 100,000M^-1㎝^-1의 흡광계수를 가지고, 이때 제공자 형광단의 방출 스펙트럼과 수용자 형광단의 흡수 스펙트럼의 겹치는 정도는 25%이하이다. 한 구체예로 여기에서 설명되는 형광 공명 에너지 전달 쌍에서 제공자 형광단은 플로레신이고, 수용자 형광단은 Cy5 또는 Cy5.5이다.

생물학적 시료에서 표적 핵산 서열을 분석하는 방법은 다음과 같다;

- 핵산 결합 형광물질 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 표적 서열을 증폭시키고, 폴리메라제 연쇄 반응은 생물학적 시료에 표적이 되는 핵산 서열에 대한 프라이머와 열에 안정한 폴리메라제를 첨가하고, 변성 온도와 연장 온도사이에서 시료에 열처리를 반복하는 것으로 구성되고;

- 핵산 결합 형광 물질이 흡수하는 파장에서 빛으로 생물학적 시료를 여기시키고;

- 시료의 온도가 변화될 때, 핵산 결합 형광물질로부터 온도에 따른 형광 방출을 모니터하는 것으로 구성된다. 적절하게는 핵산 결합 형광물질은 SYBR^TM Green I와 같은 이중 쇄 핵산 결합 형광물질로 구성된다. 온도에 따른 형광 방출로 증폭된 생성물을 확인할 수 있는데, 적절하게는 용융 곡선을 분석하는 것이다. 두 개 또는 그 이상의 증폭된 생성물의 상대적인 양은 용융 곡선을 분석하여 결정한다. 예를 들면, 용융 곡선 아래에 있는 면적은 다중 가우스 함수 합의 비-선형 최소 자승 회귀분석으로 알 수 있다.

도 1a, b는 평형 PCR 전형(A)와 역학적인 PCR 전형(B)를 나타내는 그래프이다.

도 2는 형광 하이브리드를 모니터하는 시간에 대한 이용한 온도를 설명하는 것이다.

도 3은 PCR에서 신속한 온도 변환 과정의 시간에 대한 온도를 나타내는 것이다.

도 4는 30회 과정후에 네 가지 상이한 온도/시간 프로파일(A-D)와 이로써 생성된 증폭 생성물의 결과를 나타낸 것이다.

도 5a, b, c는 PCR의 형광 모니터를 하는 세 가지 상이한 방법에 대한 형광 발생 메카니즘을 설명하고 있는데; (A) 이중 쇄 DNA 염료; (B) 가수분해 프로브; (C) 하이브리드 반응 프로브.

도 6은 Cy5^TM의 1가 N-하이드록시숙시니미드 에스테르의 화학적 구조를 나타낸다.

도 7은 Cy5.5^TM의 1가 N-하이드록시숙시니미드 에스테르의 화학적 구조를 나타낸다.

도 8은 플로레신(직선)의 방출 스펙트럼과 Cy5(점선)의 여기 스펙트럼을 나타낸다.

도 9는 PCR 동안에 각 변환 과정에서 플로레신와 Cy5-라벨된 인접 하이브리드 반응 프로브간에 발생하는 공명 에너지 전달을 나타낸다.

도 10은 PCR 동안에 발생한 공명 에너지 전달 시그날에서 플로레신 프로브에 대한 Cy5의 비율을 다양하게 하였을 때 그 효과를 나타낸다.

도 11은 PCR 동안에 발생한 공명 에너지 전달 시그날에서 주어진 프로브 비율에서 대한 프로브 농도를 다양하게 하였을 때 그 효과를 나타낸다.

도 12는 PCR 동안에 발생한 공명 에너지 전달 시그날에서 라벨된 올리고뉴클레오티드간에 공간의 효과를 나타낸다.

도 13은 온도 과정에서 Taq DNA 폴리메라제(exo^-; 직선); Taq DNA 폴리메라제의 Stoffel 단편(exo^-; 점선)로 30회 변환 과정후에 바로 형광 에너지 전달에 의한 인접 프로브 하이브리드 반응에 대한 시간별 과정 및 인접 하이브리드 반응 프로브로 PCR 하는 동안에 형광 발생에서 폴리메라제 형태 등을 나타내었고; 온도는 굵은 선으로 나타내었다.

도 14는 Taq DNA 폴리메라제(exo^-; 직선); Taq DNA 폴리메라제 Stoffel 단편(exo^-; 긴 점선); KlenTaq DNA 폴리메라제(exo^-; 짧은 점선)로 증폭을 하는데 변환 횟수에 대해 형광 발생 비율을 플롯하였는데; 상측 패널은 60℃에서 20초간 유지시킨 94℃ 내지 60℃사이의 변환과정이고; 중간 패널은 60℃에서 120초간 유지시킨 94℃ 내지 60℃사이의 변환과정이고; 아래 패널은 65℃에서 75℃로 서서히 온도를 올리면선 94℃ 내지 60℃사이의 변환과정을 나타낸다.

도 15는 SYBR^TM Green I으로 모니터하였을 때 상이한 시작 주형 복사 반응 수에 대해 형광을 플롯하였는데; 이때 시작 주형 복사체의 수는 다음과 같이 정의한다;0,(△); 1,(■); 10,(―); 10²,(-) ;10³,(+) ;10⁴,(●) ;10⁵,(◇) ;10⁶,(×); 10⁷,(▲); 10⁸,(□); 10⁹,(◆).

도 16은 이중 라벨된 가수분해 프로브로 모니터하였을 때 상이한 시작 주형 복사 반응 수에 대해 형광을 플롯하였는데; 이때 시작 주형 복사체의 수는 다음과 같이 정의한다; 0,(-); 1,(▲); 10,(○); 10²,(*); 10³,(●); 10⁴,(□); 10⁵,(+); 10⁶,(■); 10⁷,(◇); 10⁸,(×); 10⁹,(◆).

도 17은 인접 하이브리드 반응 프로브로 모니터하였을 때 상이한 시작 주형 복사 반응 수에 대해 형광을 플롯하였는데; 이때 시작 주형 복사체의 수는 다음과 같이 정의한다;0,(-); 1,(▲); 10,(○); 10²,(*); 10³,(●); 10⁴,(□); 10⁵,(+); 10⁶,(■); 10⁷,(◇); 10⁸,(×); 10⁹,(◆).

도 18은 공명 에너지 전달에 의해 모니터하였을 때, 구별이 되는 두 개의 하이브리드 반응 프로브 디자인에 대해 변환 과정의 횟수에 대한 형광 비율을 나타낸 것인데; (◇)는 플로레신과 Cy5로 각각 라벨한 두 개의 하이브리드 반응 프로브이고; (◆)는 플로레신으로 라벨한 프로브와 Cy5로 라벨한 프라이머를 나타낸다.

도 19a, b, c는 PCR 동안에 세 가지 형광을 모니터하는 기술을 비교한 것으로써; 여기에서는 (A) 이중 쇄-특이적인 DNA 염료 SYBR Green I; (B) 이중 라벨된 플로레신/로다민 가수분해 프로브; (C) Cy5-라벨된 프라이머와 플로레신-라벨된 하이브리드 반응 프로브; 도 19d는 도 19a-c에서 나타낸 세 가지 모니터 기술에 대한 변수 계수를 나타낸다.

도 20은 SYBR Green I으로 모니터하였을 때 표준 증폭의 변환 과정 횟수에 대한 형광을 전형적인 로그상태로 나타내었다.

도 21은 도 20의 데이터중 20-27회에 맞춘 지수 곡선을 나타낸다.

도 22는 증폭 데이터로부터 시작 복사체의 수를 결정하게 위해 미지의 것에 맞춘 지수 곡선이다.

도 23은 인접 하이브리드 프로브로 각 변환 과정을 모니터하였을 때 다섯 가지 표준에 대한 변환 과정의 횟수에 대해 전형적인 형광을 나타내는데 이때 시작 복사체의 수는 다음과 같다; 103,(●); 104,(◇); 105,(▲); 106,(□); 107,(◆).

도 24는 도 23의 표준 데이터에 맞춘 그래프이다.

도 25는 가수분해 프로브로 각 변환 과정을 모니터하였을 때 다섯 가지 표준에 대한 변환 과정의 횟수에 대해 전형적인 형광을 나타내는데 이때 시작 복사체의 수는 다음과 같다; 1.5,(●); 15,(◇); 150,(▲); 1500,(□); 15,000,(◆).

도 26는 도 25의 표준 데이터에 맞춘 그래프이다.

도 27은 SYBR Green I으로 모니터하였을 때, 세 가지 표준 증폭에서 변환 횟수에 대한 일반적인 형광을 로그로 나타내었는데 이때: (■);(●);(▲)이다.

도 28은 도 27의 표준 데이터에 맞춘 다른 그래프를 나타낸다.

도 29a, b에서 (A)는 시간에 대한 형광을 나타낸 것이고; (B)는 시간에 대한 온도를 나타낸 것으로 이는 온도와 형광사이에 역 관계가 있음을 설명하는 것이다.

도 30은 SYBR Green I 존재하에 헤파타이티스 B 게놈의 180개 염기 쌍 단편을 증폭시키는데 시간별 온도, 시간별 형광, 온도별 형광에 대한 2D 플롯과 3D 플롯을 나타낸 것이다.

도 31은 SYBR Green I 존재 하에 사람 베타-글로빈 유전자의 536개 염기 쌍 단편을 증폭시키는데 온도별 형광을 나타낸 것이다.

도 32a, b에서, (A)에서는 가수분해 프로브에 대해 온도에 따른 형광 비율의 선형 변화를 나타낸 것이고; (B)에서는 하이브리드 반응 프로브에 대해서 온도에 대한 과격한 변화를 나타낸 것이다.

도 33은 인접 하이브리드 반응 프로브 존재하에 exo^- 폴리메라제로 증폭시킨 온도에 따른 형광 비율을 나타낸 것이다.

도 34는 인접 하이브리드 반응 프로브 존재 하에 exo^- 폴리메라제로 증폭시킨 온도에 따른 형광 비율을 나타낸 것이다.

도 35는 인접 하이브리드 반응 프로브 존재 하에 exo^- 폴리메라제로 증폭하는 동안에 온도, 시간, 형광에 대한 3차원으로 플롯한 것을 나타낸 것이다.

도 36은 인접 하이브리드 반응 프로브 존재 하에 exo^- 폴리메라제로 증폭하는 동안에 온도, 시간, 형광에 대한 3차원으로 플롯한 것을 나타낸 것이다.

도 37은 헤파타이티스 B 바이러스(●;50% GC, 180bp); 베타-글로빈(▲;53.2% GC, 536bp); 전립선 특이적인 항원(X;60.3% GC, 292bp)의 PCR 증폭된 생성물의 용융 곡선을 나타낸다.

도 38은 0.1℃ 내지 5.0℃의 가열 속도에서 헤파타이티스 B 바이러스의 PCR-증폭된 생성물의 용융 곡선을 나타낸다.

도 39는 다양한 SYBR^TM Green I 농도에서 헤파타이티스 B 바이러스의 PCR-증폭된 생성물의 용융 곡선을 나타낸다.

도 40a, b에서 (A)에서는 각기 다른 상황에서 증폭된 베타-글로빈 단편 생성물의 용융 곡선을 나타낸 것이고; (B)는 생성물의 전기영동상으로 분리된 밴드를 나타내는 것으로써; 각 조건은 다음과 같다; (a)는 주형의 첨가가 없고; (b)는 엄격성이 낮은 조건하에서 첨가된 주형의 수가 10⁶ 복사체이고; (c)는 매우 엄격한 조건하에서 첨가된 주형의 수가 10⁶ 복사체이다.

도 41a, b에서 헤파타이티스 바이러스 단편(HBV), β-글로빈 및 이의 혼합물의 용융 곡선(A)와 용융 피크(B)를 나타낸다.

도 42a-d에서 (A)는 다양한 양의 β-글로빈 주형으로부터 PCR 증폭된 생성물에 대한 변환 과정 횟수에 대한 상대적인 형광을 나타낸 것이고; (B)는 다양한 생성물의 용융 피크를 나타낸 것이고; (C)는 다양한 생성물의 전기영동 밴드를 나타낸 것이고; (D)는 (A)데이터의 교정된 형광을 나타낸 것이다.

도 43a, b에서 포낭성 섬유증 유전자와 c-erbB-2 온코진 혼합물의 PCR 증폭된 생성물의 용융 곡선(A)과 이의 용융 피크(B)를 나타낸다.

도 44에서는 포낭성 섬유증 유전자(CFTR)와 c-erbB-2 (neu)의 다양한 변환 과정 횟수에서 용융 피크를 나타낸다.

도 45에서는 CFTR과 neu PCR 생성물의 통합시킨 용융 피크의 그래프를 나타낸 것이다.

도 46a, b은 인자 V Leiden 돌연변이에 이형접합성(직선)인 사람, 인자 V Leiden 돌연변이에 동형접합성(점선)인 사람, 동형 접합성 야생형(긴 점선), DNA 없는 기준(일점 쇄선)에 대한 PCR 생성물의 용융 곡선(A)과 용융 피크(B)를 나타낸다.

도 47은 인자 V Leiden 돌연변이에 동형접합성(직선)인 시료, 인자 V Leiden 돌연변이에 이형접합성(점선)인 시료, 동형 접합성 야생형 시료(일점 쇄선)의 PCR 생성물의 40회 동안에 지속적으로 모니터한 온도에 대한 형광 비율을 나타낸 것이다.

도 48은 메틸렌테트라하이드로폴레이트 유전자에 동형접합성 돌연변이(직선), 동형 접합성 야생형(긴 점선), 이형접합성 야생형(점선), DNA 없는 기준(일점 쇄선)에 대한 용융 피크를 나타낸다.

도 49는 다양한 시작 주형의 양에서 증폭된 β-글로빈 PCR 생성물의 재 어닐링 곡선을 나타낸 것이다.

도 50은 시작 주형 농도를 결정하기 위해 이차 속도 상수를 결정하는 것을 보여준다.

도 51은 형광 자료로부터 열 처리 과정을 조절하는 블록 다이아그램을 나타낸다.

도 52a, b에서 (A)는 20회 후에 시간에 대한 온도 곡선을 나타낸 것이고; (B)는 25회 후에 시간에 대한 형광을 나타내었는데 이때 형광 데어터로부터 열 처리 과정이 조절된다.

PCR 동안에 하이브리드 반응을 모니터 하는 본 발명을 설명하기 전에, 본 발명은 여기에서 상술하고 있는 특정 형태, 공정 단계, 재료에 국한시키는 것이 아니고, 형태, 공정 단계 및 재료는 다소 다양하게 변할 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다. 또한 여기에서 기술하고 있는 기술적인 용어는 본 구체예를 설명하기 위함이고, 이에 제한을 두고자 함은 아니고, 본 발명의 범위는 청구범위 및 이의 등가범위에 국한됨을 인지해야 할 것이다.

명세서 및 특허청구범위에서 이용된 것과 같이, "a", "an", "the"와 같은 단수 및 부정관사에는 다른 언급이 없는 한 복수 개념을 포함한다.

본 발명을 설명함에 있어, 다음의 용어는 하기의 정의에 따라 이용된 것이다.

여기에서 사용하는 바와 같이, "핵산", "DNA" 및 이와 유사한 용어에는 핵산 유사체, 예를 들면 포스포디에스테르 골격이외의 구조를 가지는 유사체도 포함한다. 예를 들면, 소위 당분야에 공지된 골격에 포스포디에스테르 결합대신에 펩티드 결합을 가지는 "펩티드 핵산"도 본 발명의 범위에 속한다.

여기에서 사용하는 바와 같이, "지속적인 모니터" 또는 이와 유사한 용어는 PCR 과정동안에 여러 차례 모니터 하는 것을 말하는데, 적절하게는 온도 전이 동안에 그리고 가장 적절하게는 각 온도 전이에서 적어도 한 개의 데이터 점을 포함하는 것이다.

여기에서 사용하는 바와 같이,"cycle-by-cycle"란 각 과정에서 한 번 PCR 반응을 모니터 하는 것을 말하는데 적절하게는 PCR의 어닐링 상 동안에 모니터 하는 것을 말한다.

여기에서 사용하는 바와 같이, "형광 공명 에너지 전달 관계" 및 이와 유사한 용어는 제공 형광단으로 라벨된 올리고뉴클레오티드와 수용 형광단으로 라벨된 또 다른 올리고뉴클레오티드를 표적 핵산에 인접 하이브리드 반응하여, 제공 형광단이 공명 에너지를 수용 형광단에 전달하여, 수용 형광단이 측정 가능한 형광을 방출하는 것을 말한다. 제공 형광단과 수용 형광단이 상당 거리 떨어져 있으면, 제공 형광단이 수용 형광단에 공명 에너지를 전달할 수 없고 따라서 수용 형광단이 측정할 수 있을 정도의 형광을 만들지 않고, 따라서, 제공 형광단과 수용 형광단은 공명 에너지 전달 관계에 있지 않는 것이다. 바람직하게는, 두 개의 라벨된 올리고뉴클레오티드가 모두 프로브이고, PCR 프라이머 기능을 하지 않으면(프로브-프로브), 제공 형광단과 수용 형광단은 0-25개 뉴클레오티드내에 있고, 적절하게는 0-5개 뉴클레오티드내에 있고, 가장 적절하게는 0-2개 뉴클레오티드에 있다. 특히 적절한 공간 거리는 1개 뉴클레오티드이다. 라벨된 올리고뉴클레오티드중 한 개가 PCR 프라이머(프로브-프라이머) 기능을 하는 경우에, 제공 형광단과 수용 형광단은 적절하게는 0-15개 뉴클레오티드범위에 있고, 더욱 바람직하게는 약 4-6개 뉴클레오티드 범위에 있다.

여기에서 사용하는 바와 같이, "효과량"이란 선택된 효과를 내는데 충분한 양을 말한다. 예를 들면, PCR 프라이머 효과량은 PCR에 의해 핵산 단편이 증폭되기에 충분한 양을 말하는데, 단 DNA 폴리메라제, 완충액, 주형 및 PCR을 실행하는데 필수적인 당 분야에 공지된 온도 조건을 포함하는 다른 조건이 제공된다는 전제하를 두고 있다.

PCR은 주형의 변성 및 프라이머 어닐링를 요구한다. 이와 같은 하이브리드 반응 전이는 온도에 따라 달라진다. 증폭을 시키는 PCR 온도 과정은 고온에서 축적된 생성물을 변성시키고, 더 낮은 온도에서는 생성물에 프라이머를 어닐링시킨다. 생성물의 변성과 프라이머 어닐링의 전이 온도는 주로 GC 함량과 이 길이에 따라 달라진다. 프로브가 PCR 생성물의 내부에 하이브리드하도록 만든 경우에 프라이머의 용융 온도 또한 GC 함량, 길이, 표적에 상보성 정도에 따라 달라진다. PCR에 적합성이 있는 형광 프로브는 증폭하는 동안에 하이브리드 반응을 모니터할 수 있다.

본 발명에 따르면, 신속한 과정(1996년 6월 4일자 출원된 미국 특허 출원 No. 08/658,993, 1996년 6월 4일자 "PCR 공정을 모니터하는 시스템 및 이 방법"; 1995년 10월 2일자 출원된 미국 출원 08/537,612 "생물학적 시료를 신속하게 열 처리하는 방법에 상세하게 설명됨)과 연관하여 적절히 이용하였을 때, PCR의 역학적인 전형이 적절하다. 세 가지 시간대(도 1a)에서 세 가지 다른 온도에서 발생하는 세 가지 반응(변성, 어닐링, 연장)으로 PCR을 생각하는 대신에, PCR의 역학적인 전형이 더 유용하다(도 1b). 역학적인 전형으로 시간에 대한 온도 곡선은 겹치는 반응간에 지속적인 전이로 구성된다. 변성 및 어닐링이 너무 빨라서 특정 온도에서 유지 시간이 불필요하다는 것이다. 연장은 다양한 속도에서 광역의 온도범위에서 일어난다. 완전히 분석을 하려면 모든 온도에서 모든 관련 속도 상수에 대한 지식을 알아야 한다. 모든 반응의 속도 상수을 알고 있다면, "PCR의 물리화학적인 설명"을 할 수 있을 것이다. 이와 같은 속도를 결정하는데에는 정확한 시료의 온도 조절을 요구하고, 이는 온도 변환 과정동안에 반응을 모니터 하여 상당히 간단하게 할 수 있다.

도 2에서는 형광 하이브리드 반응을 모니터하기 위한 시간에 대한 유용한 온도를 설명하고 있다. 변성으로 서서히 온도를 증가시키는 동안에 생성물의 용융 곡선을 얻을 수 있다. 변성 후에 일정한 온돌 매우 천천히 온도를 낮추면, 선택적으로 생성물, 프로브 또는 프라이머 어닐링이 이어진다. 프로브의 Tm 근처의 온도를 서서히 증가시키면 프로브의 용융 곡선을 얻을 수 있다. 도 2에서 나타낸 구체예는 바로 실제 시간을 나타내는 온도 과정 동안에 모든 분석을 제공한다. 온도 과정동안에 프라이머, 프로브 또는 생성물의 하이브리드를 지속적으로 모니터하기 위해 증폭 용액의 일부분에 형광 프로브를 포함한다.

여기에 포함하는 형광 하이브리드 반응 기술은 신속한 과정에 근거를 두고 있는데, 이의 장점은 신속하고 특이성이 있다는 것이다.

도 3에서는 신속한 PCR 과정동안에 시료의 온도 프로파일을 나타낸 것이다. 이 도면에서 변성 및 어닐링에서 온도가 "스파이크"(그래프상의 삐죽한 끝모양)로 나타나는데, 이는 PCR 동안에 통상적인 온도 변환과정의 넓고 평탄하게 나타나는 것과는 반대되는 것(예를 들면, 도 1a)이다. 도 4에서 보면, 신속한 온도 과정은 통상적인 온도 과정과는 대조적인데, 이때 30회 증폭 과정이 15분 이내에 종료되고, 생성된 PCR 생성물에는 많은 소수의 부산물을 포함한다. 따라서, 신속한 과정에서 증폭에 요구되는 시간을 약 10배정도로 줄일 수 있고, 특이성은 개선시킬 수 있다.

실시예 1

도 4에서는 30회 과정 후에 네 가지 상이한 온도/시간 프로파일(A-D)과 이의 증폭 생성물의 결과를 나타낸다. 도 4에서 프로파일 A와 B는 선행기술의 마이크로퓨즈 튜브를 이용하여 기존의 히팅 블록(heating block)에서 수득한 것이다. 도 4에서 볼 수 있는 것과 같이, 온도간에 전이가 느리고, 프로파일 A와 B에는 비-특이적인 밴드가 많이 나타난다. 프로파일 B에서는 각 온도에서 각 시료가 유지되는 시간을 제한하여 비-특이적인 밴드의 일부를 제거됨을 알 수 있는데(프로파일 A와 대조), 이는 시간이 짧을수록 더 바람직한 결과를 얻는다는 것을 나타낸다.

프로파일 C와 D는 신속한 온도 싸이클러(cycler)를 이용하여 얻은 것이다. 도 4에서 볼 수 있는 것과 같이, 증폭은 특이적이고, 60초 연장 시간(C)에서도 수득율이 최고로 나타나고, 10초 연장 시간(D)에서도 전체적으로 만족할만한 결과가 나타났다.

사람의 게놈 DNA에서 얻은 β-글로빈 536bp 단편을 증폭시키기 위한 최적의 시간 및 온도를 또한 결정한다. 변성(93℃)과 어닐링(55℃)을 1초 이내에 실행하는 경우에 증폭 수득율과 생성물의 특이성이 최적으로 나타났다. 변성시간 또는 어닐링 시간을 더 길게 하였을 경우에는 장점이 없었다. 77℃에서 연장 시간을 늘릴 경우에 수득율이 증가되었으나, 10-20초보다 더 길에 연장시간을 변화하였을 경우에는 거의 차이가 없었다. 이와 같이 기대이상의 결과에서 DNA를 증폭시키는데 이용된 기존의 장치로는 반응의 물리적 그리고 효소적인 요구사항을 최적화 시키는데 필수적인 조건을 최대화할 수 없다는 것을 알 수 있다.

추가 정보는 C.T. Wittwer et al., Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis delta F(508) Locus, 39 Clinical Chemistry 804 (1993) and C.T. Wittwer et al., Rapid DNA Amplification, THE POLYMERASE CHAIN REACTION 174(1994)에서 얻을 수 있을 것이고, 이들은 참고문헌으로 첨부한다. 형광을 얻는데 이용된 기구와 신속한 온도변환을 위한 장치는 미국 출원 No. 08/537,612에서 알 수 있다.

초기에 언급한 것과 같이, 폴리메라제 연쇄 반응은 신속하게 실행하여야 한다. 신속한 열 전달을 실행하는데 추가하여, 본 발명에 따른 DNA 증폭을 형광으로 지속적으로 모니터하기 위해서는 광학적으로 깨끗한 모세관 튜브를 이용해야 한다.

형광 프로브를 이용하면, DNA 증폭을 감지할 수 있다. 유용한 프로브로는 이중 쇄-DNA 특이적인 염료 및 서열-특이적인 프로브를 포함한다. DNA 증폭에 관한 세 가지 다른 형광 기술을 도 5에 비교하였다. 도 5a에서는 형광은 이중-쇄 특이적인 DNA 염료로 감지하였을 때, PCR 생성물의 하이브리드반응에 따라 달라진다는 것을 알 수 있다. 도 5b에서는 5'-엑소뉴클레아제 퀸칭 프로브의 가수분해에 따라 달라지는데 이는 전술한 바 있다. 도 5c에서는 두 개의 인접한 프로브에 있는 형광단간에 공명 에너지 전달에 기초한 하이브리드 반응 과정의 다이아그램을 나타낸 것이다. 도 5a의 방법은 서열 특이적인 것은 아니고, 생성물 특이성은 본 발명의 특징 중에 하나인 용융 곡선으로 결정할 수 있다. 도 5b와 5c는 모두 서열 특이적이다. 그러나, 하이브리드 반응 방법은 본 발명의 또 다른 특징인 용융 곡선으로 분석할 수 있다.

도 5b에서 나타낸 것과 같이 프로브의 가수분해와 연관된 반응 및 도 5c의 하이브리드 프로브와 연관된 반응에서 형광을 모니터할 때, 제공 형광단과 수용 형광단 모두에서 방출되는 형광을 측정하는 것이 유익하다. 실제, 가수분해 프로브에서 방출되는 형광의 대부분은 제공 형광단에서 나오는 것이고, 하이브리드 프로브에서 방출되는 형광의 대부분은 수용 형광단에서 나오는 것이다.

이중 쇄-특이적인 DNA 염료 선택; 당업자는 형광 기술에 에티디움 브롬화물을 친숙하게 사용하였을 것이다. 증폭하는 동안에 이중-쇄 특이적인 플로레신 염료가 존재하는 경우에, 이중 쇄의 생성물이 많이 만들어질수록 일반적으로 플로레신는 증가된다(R. Higuchi et al., Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences, 10 Bio/Technology 413-417(1992)). 삽입물질인 YO-PRO-1을 이용하여 헤파타이티스 C RNA의 형광 PCR 검사를 한 것은 본 기술분야에 공지의 것이다(T. Ishiguro et al.,에 의해 형광 삽입체 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 헤파타이티스 C 바이러스 RNA의 상동성 정량 검사를 한 것이다, 229 Anal. Biochem. 207-213 (1995)). 당업자에서 공지된 SYBR^TM Green I(Molecular Probes of Eugene, Oregon,에서 구할 수 있음)은 이중-쇄-특이적인 염료로 적절하다. 이와 같은 염료의 분자 구조는 상업상 비밀이나, 제조업자는 겔에서 DNA를 감지하는데에는 더 감응성이 있는 이중-쇄 특이적인 염료로써 이를 권하고 있다. 그러나, SYBR^TM Green I은 열에 불안정하고 따라서, 통상적인 방법 즉, 반응 혼합물의 온도를 연장 시간동안에는 용융 온도에서 유지해야하는 상황 등의 PCR 반응에서 형광을 모니터하는데에는 유용하지 못하다. 이와 같은 열에 불안정한 성질로 인하여, 연장 시간동안에 용융 온도를 유지하지 않을 경우에 SYBR^TM Green I을 이용하여 PCR 반응을 모니터할 수 있다는 것을 발견한 것은 예상하지 못한 것으로 예를 들면, 전술한 역한 전형에 따라 신속한 변환 과정으로 PCR을 실행하는 경우를 말한다.

실시예 2

상이한 이중-쇄 특이적인 DNA 염료를 이용하여, 10,000 주형 복사체로부터 사람 β-글로빈 유전자의 PCO3/PCO4 프라이머쌍에서 110개 염기 쌍 단편이 증폭되는 것을 모니터 함으로써 비교를 한다. 당 분야에 공지인 표준 포스포아미데이트 화학물질 즉, Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus(Piscataway, New Jersey)를 이용하여 프라이머를 합성한다. 사람의 β-글로빈 프라이머 PC03/PC04(110 염기쌍)에 대해서는 C.T. Wittwer et al., "온풍으로 모세관에서 자동화된 폴리메라제 연쇄 반응" 17 Nucl. Acids. Res. 4353-4357 (1989),에서 상술하고 있고 이는 참고문헌으로 첨부한다. DNA 증폭은 실시예에서 다른 언급이 없는 한, 다음의 조건하에서 실행한다; 50mM Tris, pH 8.5(25℃), 3mM MgCl₂, 500㎍/㎖ 소 혈청 알부민, 50μM의 각 프라이머, 0.2mM 데옥시뉴클레오시드 3인산염, 시료 5㎕당 Taq 폴리메라제. 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전시켜(D.M. Wallace, "핵산의 소규모 및 대규모 페놀 추출 및 에탄올 침전법" 152 Methods in Enzymology 33-48 (1987), Centricon 30 마이크로농축기(Amicon, Danvers, Massachusetts)를 통하여 반복적으로 세척하여 프라이머를 제거하여, 생성물을 정제하고, 정제된 증폭 생성물은 DNA 주형으로 이용한다. 260㎚에서 흡수도를 측정하여 주형의 농도를 결정한다. 주형의 A(260):A(280) 비율은 7이상이다.

SYBR^TM Green I(Molecular Probes, Eugene, Oregon)을 1:10,000 희석비로 이용하고, 에티디움 브롬화물은 5㎕/㎖이고, 아크리딘 오렌지는 3㎕/㎖이다. 이와 같은 농도는 각 염료를 이용한 증폭동안데 관찰되는 형광 시그날을 최대화하기 위해 최적 농도로 결장한 것이다. xenon arc로부터 450㎚-490㎚ 인터페이스 필터를 통하여 여기시키고, 단 에티디움 브롬화물은 520-550㎚에서 여기시킨다. SYBR^TM Green I의 경우에, 520-550에서 방출을 모니터한다. 580-620㎚를 통하여 에티디움 브롬화물 형광을 관찰한다. 아크리딘 오렌지 시그날은 그린(520-550㎚)에 대한 적색(>610㎚) 형광의 비율로 얻는다. 증폭시키기 전에 시료의 형광은 60℃에서 35회(최대 94℃, 60℃에서 20초)후의 형광과 비교를 한다. 형광은 SYBR^TM Green I의 경우에 5.3배 증가되었고, 에티디움 브롬화물의 경우에는 1.7배 증가되었다. 별도의 실험으로, SYBR^TM Green I에서 나오는 형광은 70℃에서 30분 이상 안정하다. 또한 가시광선으로도 여기할 수 있어 편리하고, 에티디움 브롬화물보다 돌연변이 유발 물질이 더 적은 것이다. 모든 경우에서 배경 형광은 주로 프라이머로 인한 것이다.

SYBR^TM Green I은 PCR을 형광으로 모니터하는 경우에 바람직한 이중-쇄 특이적인 염료인데, 그 이유는 감응성이 뛰어나고, 이중 쇄와 일중쇄 핵산간에 분별력이 훨씬 크기 때문이다. SYBR^TM Green I은 임의 증폭에 이용할 수 있고, 비용도 저렴하다. 또한, 생성물 특이성은 용융 곡선을 분석하여 얻을 수 있다.

하이브리드 프로브용 공명 에너지 전달 염료의 선택; 두 개의 형광단이 물리적으로 근접하고, 한 개의 형광단에서 나오는 방출 스펙트럼이 다른 형광단의 여기 스펙트럼과 겹친다면, 형광 공명 에너지 전달은 2개의 형광단사이에서 발생할 수 있다. 최근의 많은 문헌에서 형광 공명 에너지 전달에 대한 서두 이론을 볼 수 있다. 공명 에너지 전달 속도는 다음과 같은 수학식으로 나타낼 수 있다;

[수학식 2]

공명 에너지 전달 속도=(8.785E-5)(t^-1)(k^-2)(n^-4)(q_D)(R^-6)(J_DA)

이때,

t = 수용체가 없을 때 제공체의 여기된 상태의 수명

k² = 제공자와 수용자간에 정위 인자

n = 중재 매체에 가시광의 굴절 지수

q_D = 수용체가 없을 때 제공체의 양자 효과

R = 제공체와 수용체간의 거리(Å)

J_DA = 모든 겹치는 파장에서 W에 대해 적분(F_D)(e_A)(W⁴)

이때, F_D = 제공체의 피크 정상화된 형광 스펙트럼

e_A = 수용체(M^-1㎝^-1)의 몰 흡수 계수

W = 파장(㎚)

임의 주어진 제공체와 수용체의 경우에, 공명 에너지 전달이 50%되는 거리를 계산할 수 있고, 이를 R₀로 정의한다. 공명 에너지 전달 속도는 제공체와 수용체간의 거리의 6번째 멱에 따라 달라지기 때문에, 공명 에너지 전달은 R₀로부터 R이 변화됨에 따라 신속하게 변화된다. 2R₀에서, 매우 적은 공명 에너지 전달이 이루어지고, 0.5R₀에서는 전달 효울이 거의 완전하다(단, 다른 우세한 여기를 제거하는 형태(즉 상쇄에 의한 제거)가 없는 조건). 많은 상이한 제공체와 수용체 쌍에 대한 R₀값을 측정하는데 이는 22 내지 72Å사이에서 다양하다.

이중 나선 DNA의 경우에, 약 34Å의 거리로 10개 염기가 떨어져 있다. 제공체와 수용체 형광단으로 DNA 염기를 라벨링함으로써, 공명 에너지 전달을 이용하면, 분광광도의 규정에따라 DNA의 이중 나선의 형태를 관찰하고, 4가지 방식의 DNA 결합 구조를 분석할 수 있다. 공명 에너지 전달을 이용하면, 하이브리드 반응을 모니터할 수 있다. 라벨된 올리고뉴클레오티드를 라벨된 주형 쇄에 하이브리드하는 경우에, R은 R₀이상에서부터 R₀이하로 되고, 공명 에너지 전달이 급격히 증가된다. 또는, 공명 에너지 전달에서 유사한 변화를 주기 위해, 2개의 라벨된 프로브를 동일한 주형 쇄에 하이브리드시킬 수 있다.

하이브리드 반응을 모니터하는데 실제 공명 에너지 전달을 이용하는 것은 요구되는 감응성 및 얼마나 많은 시간이 이용되는지에 따라 달라진다. 1nM 라벨된 프로브오 경쟁적인 하이브리드 반응을 이용하면, PCR-증폭된 DNA는 40℃에서 15분후에 감지된다. 각 증폭과정에서 PCR 생성물을 편리하게 정량화할 수 있다. 또한, 프로브의 하이브리드 정도는 온도 과정내에서 모니터할 수 있다(B. Young & M. Anderson, Quantitative analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach 47-71, (B. Hames, S. Higgins eds., 1985)). 프로브의 농도가 표적의 농도보다 훨씬 큰 경우에, 하이브리드 반응 속도는 프로브 농도에 역비례한다. 예를 들면, 프로브 농도를 배로 늘리면, 하이브리드 반응 시간은 절단으로 감소된다. PCR 동안에 cycle-by-cycle 모니터를 하고자하는데 필수적인 요건이 프로브의 농도가 높아야 하는 것으로 그 이유는 하이브리드 반응 부위가 폴리메라제 연장에 의해 차단되기 전에 일어나기 때문이다.

PCR 동안에 하이브리드 반응을 모니터하는데 요구되는 높은 프로브 농도는 독특한 특징을 가지는 공명 에너지 전달 쌍을 요구한다. 빛에 의한 제공자(D)와 수용자(A)의 여기를 고려해야 한다. 직접적으로 여기된 형광단(D)와(A)의 수는 여기 파장에서 각 형광단의 여기 계수에 비례하거나 또는 다음과 같이 표현을 할 수 있다.

직접 여기된 D 분자의 수 = (K)(e_D)

직접 여기된 A 분자의 수 = (K)(e_A)

이때, K는 비례 상수이다.

형광, 공명 에너지 전달 및 열 퀸칭으로 요약된 다른 공정에 의해 제공자의 탈-여기(de-excitation)가 일어날 수 있다. p_F=공명 에너지 전달 확률이고, p_TD= 제공자의 열 퀸칭 확률인 경우에, 제공자의 형광 확률은 다음과 같이 나타낼 수 있다 ; 1-p_F-p_TD

그리고, 형광 제공 분자의 수는 다음과 같이 나타낸다; (K)(e_D)(1-p_F-p_TD)

제공자 방출 윈도우(예를 들면, 밴드패스 필터 윈도우)에서 제공자 방출을 감지하는 확률이 p_DD라면, 관찰된 제공체 방출의 수는 다음과 같이 나타낼 수 있다; (p_DD)(K)(e_D)(1-p_F-p_TD)

여기된 수용체 형광단의 수는 이와 같은 직접 여기된 것과 공명 에너지 전달에 의해 여기된 것의 합이다; (K)(e_A)+(K)(e_D)(p_F)

p_IA= 수용체의 열 퀸칭 확률이라면, 수용체 형광 확률은 다음과 같다; 1-p_IA

그리고, 형광 수용체 분자의 수는 다음과 같이 나타낼 수 있다; [(K)(e_A)+(K)(e_D)(p_F)][1-(p_TA)]

수용체 방출 윈도우에서 수용체 방출을 감지하는 확률을 p_AA라 한다면, 관찰된 수용체 방출의 수는 다음과 같다; (p_AA)[(K)(e_A)+(K)(e_D)(p_F)][1-(p_TA)]

마지막으로, 수용체 방출 윈도우에서 제공체 방출 확률이 p_DA 라면, 수용체 방출 윈도우에서 관측된 방출(D와 A 모두)의 수는 다음과 같다;

(p_AA)[(K)(e_A)+(K)(e_D)(p_F)][1-(p_TA)]+(p_DA)(K)(e_D)(1-p_F-p_TD)

형광이 상대적인 것이고, K는 모든 경우에 존재하기 때문에, 만약 K를 빼고, 다시 정리한다면, 제공체 윈도우에서 관측된 강도는 [(제공체 여기)-(에너지 전달)]에 비례를 할 것이고;

1) (e_D)(p_DD)(1-p_TD)-(e_D)(p_DD)(p_F)

그리고, 수용체 윈도우에서 관찰된 강도는 (수용체 여기) + (에너지 전달) - (수용체 윈도우에서 제공체 방출)에 비례한다;

2) (e_A)(p_AA)(1-p_TA)+(e_D)(p_DD)(p_F)(1-p_TA)+(e_D)(p_DA)(1-p_TD-p_F)

공명 에너지 전달이 증가할 때, 제공체 시그날은 감소되고, 수용체 시그날은 증가된다. 시그날 변화율은 각 윈도우에 배경 빛 강도에 따라 달라진다. 프로브의 농도가 높으면, 이와 같은 배경의 빛 강도가 높다. PCR 동안에, 모니터할 필요가 있는 표적(생성물)의 농도를 다양하게 하면, 표적 농도에 제공체 농도를 맞추는 것이 불가능하다. 과량의 제공체 분자는 제공체와 수용체 윈도우 모두에서 배경의 빛 강도에 기여하게 되고 부분적으로는 에너지 전달 현상을 차단한다. 수용체 윈도우의 배경 빛은 수용체 윈도우에 있는 제공체 방출에서도 나오고, 수용체의 직접적인 여기에 의해서도 나온다. 이와 같은 배경은 e_A와 p_DA를 낮게 하면 최소화할 수 있다.

핵산을 감지하는데 흔히 이용되는 플로레신/로다민 플로레신 에너지 전달 쌍은 높은 배경 형광을 가진다. 직접적인 수용체 여기(e_A, ca. 10% e_MAX)와 수용체 방출을 감지하는데 이용되는 파장에서 제공체의 여기(p_DA, ca. 20% peak emission)는 높다. 이와 같은 쌍을 이용하면, 프로브의 농도가 표적 농도에 근접하고, 하이브리드 반응을 완료할 수 있도록 충분한 시간이 있는 경우에 하이브리드 반응을 모니터할 수 있다. 상당히 높은 프로브 농도를 요구하고, PCR에서 주형의 농도가 지속적으로 변화되기 때문에 지속적으로 PCR을 모니터하는데 한쌍의 형광단을 이용하는 것이 유익한 것은 아니다.

하이브리드 반응에 의한 PCR 동안에 생성물 농도를 모니터하는 것은 과거에는 불가능하였는데, 그 이유는 수용 가능한 공명 에너지 전달 쌍을 발견하지 못했기 때문이다. 하이브리드 반응에 직접적인 "비-경쟁성" 감지에 공명 에너지 전달을 이용하려는 시도는 거의 없었다. 예를 들면, 미국 특허 5,565,322에서는 "수용체에의해 재방출시에 관찰되는 에너지 전달 효과는 상대적으로 낮다고 언급하고 있다". 수초 내에 상당한 하이브리드 반응을 일으키는데 충분한 프로브 농도에서, 배경 형광은 너무 높다.

플로레신는 가장 흔히 이용되는 형광단이다. 이의 여기 계수와 양자 계수는 높기 때문에, 이는 현미경, 면역검사, 유동 세포측정 등에 광범위하게 이용된다. 통상적으로 이용되는 공명 에너지 전달 쌍의 제공체는 로다민이다. Cy5는 흔한 적색-방출 형광단으로 매우 높은 여기 계수를 가진다. Cy5의 N-하이드록시숙시니미드 에스테르의 구조는 도 6에 나타내었고, 이와 연관된 염료 Cy5.5의 구조는 도 7에 나타내었다. 이들 염료는 유동 세포측정과 자동 형광 서열화기(이는 Amersham, Pittsburg, PA에서 구할 수 있음)에 흔히 이용되는 인도디카르보시아닌 염료이다. 플로레신과 Cy5는 올리고뉴클레오티드에 직접, 자동적으로 결합하는 아미데이트로 이용할 수 있다. 그러나, Cy5가 플로레신과 함께 공명 에너지 전달 쌍으로 이용되었다는 보고는 없었다. 직관적으로, 플로레신 방출과 Cy5 흡수는 공명 에너지 전달을 위해 충분히 겹쳐지지 않을 것이라고 생각할 수 있다. 도 8에는 올리고뉴클레오티드에 부착된 Cy5의 흡수 스펙트럼과 플로레신의 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다. 곡선아래 면적으로 표준화시켰을 때, 스펙트럼이 겹치는 부분은 19%이다. 기구에서 광학성문을 선택하면 스펙트럼의 적외선 부분/자외선 부분에서 작업하는 것이 유익하다. 조사(照射)를 위해서는 레어져 다이오드를 이용할 수 있고, 포토다이오드는 우수한 감응성을 가지도, 대부분의 물질은 관련 스펙트럼 부분에서 최소한의 자가 형광을 가진다.

스펙트럼의 겹침이 적어도, 플로레신과 Cy5 또는 Cy5.5는 PCR 동안에 하이브리드 반응을 모니터하기 위한 우수한 공명 에너지 전달 쌍이라는 것을 발견하였다.

실시예 3

실시예 2의 과정에 따라, 사람의 게놈 DNA 50ng으로부터 110bp β-글로빈 단편을 증폭시키는데, 반응은 10㎕ 반응물에서 다음의 내부 프로브 각0.2μM, CAAACAGACACCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA-플로레신(서열 3), Cy5-GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA G-p(서열 18)과 0.8 U KlenTaql 폴리메라제(Taq 폴리메라제의 5'-엑소뉴클레아제가 결핍된 변이체; 미국 특허 5,436,149)을 이용한다. 프로브는 동일 쇄에서 프라이머의 내부에 하이브리드되고, 임의 중간에 끼어드는 염기없이 바로 인접한다.

프로브와 프라이머는 Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus(Piscataway, New Jersey)를 이용하여 당 분야에 공지된 것과 같은 표준 포스포로다민 화학방법에의해 합성된다. 최종 트리틸-ON이 있는 플로레신-라벨된 CPG 카세트(Glen Research. Sterling, VA)에서 3'-플로레신-라벨된 프로브를 합성하여 C18 역상 HPLC 정제를 지원한다. 나중에 용출되는 피크를 모아서, PolyPack(Glen Research)에서 트리틸(trityl) 기를 제거한다. 플로레신-라벨된 올리고는 50% 아세토니트릴로 용출하고, 다시 C18 역상 HPLC에 의해 정제한다. 3'단부(Glen Research)에 화학적인 포스포릴화반응 물질로 5'-Cy5-라벨된 프로브를 합성하고, 트리틸-OFF 합성동안에 5'단부에 Cy5 아미데이트(Pharmacia)를 첨가한다. 실패한 서열은 C18 역상HPLC에 의해 제거한다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 염료와 올리고의 흡수도를 이용하여 프로브의 순도를 점검한다.

4 x 250 ㎜ Hypersil ODS 컬럼(Hewlett Packard)에서 0.1M 트리에탄올아민 아세테이트 이동상 및 1㎖/min에서 아세토니트릴 농도차를 이용하여 HPLC를 실행한다. 용출물은 흡수도(A₂₆₀)와 형광(플로레신의 경우 490㎚에서 여기, 520㎚에서 방출, Cy5의 경우에 650㎚에서 여기, 670㎚에서 방출)에 대해 모니터한다. 트리틸화된 그리고 플로레신-라벨된 올리고뉴클레오티드는 10-20% 아세토니트릴 농도차를 두고 용출을 하고, Cy5-라벨된 올리고뉴클레오티드는 10-40% 아세토니트릴 농도차를 이용하여 용출시킨다.

온도 과정은 가는 형광 신속한 온도 싸이클러에서 94℃에서 0초(프로그램된 근접 속도는 초당 20℃), 60℃에서 20초(근접 속도는 초당 20℃), 75℃에서 0초(근접 속도는 초당 1℃)이다. 온도 변환과정동안에, 각 과정에 어닐링/연장 단편의 단부에서 플로레신과 Cy5 형광을 얻을 수 있다. 증폭 26회 변환 과정을 시작할 즘에 플로레신 형광은 감소되고, Cy5 형광은 증가되는 공명 에너지 전달을 관찰할 수 있다(도 9). 일반적으로, 플로레신 형광에 대한 Cy5의 형광 비율을 관찰하는 것이 바람직하다.

플로레신/Cy5 쌍을 이용하면 기대이상의 좋은 결과를 얻는 것에 대해 적어도 부분적으로는 이론적으로 설명을 할 수 있다. 겹치는 정수, J_DA는 스펙트럼의 겹침과 수용체의 여기 계수(Cy5는 650㎚에서 여기 계수가 250,000M^-1㎝^-1을 가진다)에 따라 달라지고, 파장의 제 4 멱(power)에 따라 달라진다. 이들 인자들 모두 비록 스펙트럼의 겹쳐짐이 낮지만, Cy5의 높은 J_DA를 선호한다. 최근에는, 피코에리틴(phycoerythrin)과 Cy7이 비록 스펙트럼의 겹쳐짐이 적지만, 면역형광을 위한 효과적인 순차 프로브가 될 수 있다는 것이다. 후자의 예로는, 하이브리드 반응 프로브에 라벨로써 플로레신과 Cy5.5의 용도를 설명한다. 형광 공명 에너지 전달을 이용하면 상호작용을 하는 염료가 매우 낮은 스펙트럼 겹침을 가지더라도 핵산 하이브리드 반응을 모니터할 수 있다. 하이브리드 반응을 모니터하기 위한 공명 에너지 전달 쌍으로 플로레신과 Cy5, Cy5.5 및 다른 적외선 또는 자외선 방출 염료를 이용한다는 것에 대해서 기존 기술에서는 알지 못하였다. 플로레신은 먼 적외선 및 자외선 염료를 여기시키는데 이용되는 600㎚, 700㎚ 및 이를 넘는 선까지 벗어나는 긴 방출 "꼬리"를 가진다. 에너지 전달 속도는 부분에 따라 달라지는데, 단 형광단간에 제6멱 거리에 의해 영향을 받을 수도 있다. 공명 에너지 전달 염료가 근접하도록 프로브를 만들면, 전달 속도는 크다. 플로레신/Cy5, 플로레신/Cy5.5 및 이와 유사한 쌍을 이용하면, 충돌하여 퀸칭되는 것에 비해 공명 에너지 전달이 우세하고, 형광단이 간섭 염기없이 인접하는 프로브에 부착되어 있는 경우와 같은 상기 실시예에서와 같이 형광단이 인접한 경우에, 다른 형태의 에너지는 손실된다.

공명 에너지 전달이 최대인 경우와 최소인 경우에 제공체와 수용체 인도우에서 빛의 강도의 비율이 변화되는 것을 관찰함으로써 하이브리드 반응 프로브가 공명 에너지 전달 쌍으로 유용한지에 대해 판단할 수 있다. 최소 및 최대 전달을 수득하는 한 가지 방법은 동일한 올리고뉴클레오티드에 두 가지 형광단을 부착시키고, 포스포디에스테라제로 처리하기 전과 처리 후에 형광 비율을 측정한다.

실시예 4

표준 포스포아미데이트 화학에 의해 이중-라벨된 플로레신/Cy5 프로브 Cy5-CTGCCG-F-TACT GCCCTGTGGG GCAAGGp(서열 19)를 합성하는데, 이때 p는 말단 3'-포스페이트(화학적 포스포릴화 시약, Glen Research)를 나타내고, F는 아미다이트(amidite)로써 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 골격과 함께 유도된 플로레신 잔기로 고유 3-탄소 중간뉴클레오티드 포스포디에스테르 거리를 유지시키고(Clon Tech, Palo Alto, CA); Cy5는 아미다이트(Pharmacia)로 첨가된다. 0.1M 트리스, pH 8.0에서 Cy5에 대한 플로레신 형광의 비율은 포스포디에스테라제(Sigma, St. Louis, MO)로 소모성 가수분해전후에서 얻을 수 있다. 형광 비율에서 변화는 가수분해후에 220배가 되었다. Perkin Elmer(Foster City, CA)로부터 이중-라벨된 플로레신/로다민 프로브, F-ATGCCCT*CCC CCATGCCATC CTGCGTp(서열 20)을 구입하였는데, 이때 F는 플로레신이고, * 는 아미노-링커에 의해 변형된 T 잔기에 부착되는 로다민이다. 포스포디에스테라제로 가수분해 후에 형광 비율의 변화(플로레신에 대한 로다민 비율)는 22배가 된다.

플로레신/Cy5 쌍의 시그날은 플로레신/로다민 쌍의 시그날보다는 10배 강하다.

실시예 5

PCR 동안에 플로레신과 Cy5-라벨된 인접 하이브리드 프로브의 비율, 농도 및 거리의 영향에 대해 연구하였다. 실시예 3의 β-글로빈 위치와 프로브 쌍의 증폭을 이용하고 플로레신에 대한 Cy5의 형광 비율에서 최대 변화를 관찰하였다. Cy5에 대한 플로레신-라벨된 프로브의 비율이 2:1(도 10)인 경우에 최대 시그날이 발생하였다. 2:1 비율에서, 형광 프로브의 농도가 0.2μM이고 Cy-5-라벨된 프로브의 농도가 0.4μM에서 가장 좋은 시그날이 발생하였다(도 11). PCR 동안에 인접한 하이브리드 프로브간에 끼어드는 가장 적절한 염기의 수를 결장한다. 길이는 동일하나 이들의 하이브리드 위치가 약간씩 이동하는 몇 가지 프로브를 실시예 3의 과정에 따라 합성을 하고, 이들을 β-글로빈 표적에 하이브리드시켰을 때, 0,1,2,3,4,6개 염기가 프로브간에 남아 있었다. 한 개의 염기가 끼어 있을 때 PCR 동안에 최대 시그날이 발생하였다(도 12). 15개 또는 25개 염기정도의 거리에서도 일부 공명 에너지 전달이 감지되었지만, 0-5개 염기사이에서 전달이 더 잘 된다.

Heller et al.,(미국 특허 4,996,143)에서는 형광단간에 뉴클레오티드의 수가 4에서 0 단위로 감소될 때 에너지 전달 효과가 감소되었다는 것을 발견하였다고 기록하고 있다. 대조적으로 플로레신/Cy5 쌍을 이용하였을 경우에 최대 에너지 전달은 0-2개의 사이에 끼인 뉴클레오티드에서 나타났다는 것이다.

하이브리드 반응 프로브 방법 ; 표적에 인접하게 하이브리드되는 2개의 프로브를 합성하고, 각 프로브는 공명 에너지 전달 쌍의 한 개 형광단으로 라벨을 하는 경우에 하이브리드 반응이 일어나면, 공명 에너지 전달이 증가된다(도 5c). 플로레신/로다민 쌍이 핵산을 감지하는데 가장 흔히 이용되는 것이다.

본 발명의 한 특징은 PCR 생성물을 감지하기 위한 서열-특이적인 상동성 하이브리드 방법을 제공하는 것이다. 어떻게 이를 얻는지에 대해서는 명백하지는 않다. 증폭하는 동안에 하이브리드 프로브를 이용한다는 것은 비-논리적이다. 프로브 하이브리드반응과 폴리메라제 연장과정 모두가 발생하는 것은 아닌 것으로 보인다. 서열 특이적인 형광을 얻기위해서는 프로브를 하이브리드해야 하지만, 폴리메라제가 프라이머 연장을 완료하고 지수적으로 DNA를 증폭시키기 위해서는 프로브를 하이브리드할 필요는 없다.

이 문제의 한 가지 해결 방법은 이중-라벨된 한 개 프로브를 이용하고, 연장하는 동안에 프로브를 절단하기 위해서 통상 열에 안정한 DNA 폴리메라제의 5'-엑소뉴클레아제 활성을 이용하여 2 형광단을 분리한다. 이 경우에, 형광 시그날은 인접 하이브리드반응에 의해 형광단의 접근이 아닌(도 5c) 프로브 가수분해시에 공명 에너지 전달 쌍의 분리로 인한 것(도 5b)이다. 그러나, 이중-라벨된 프로브는 수작업으로 적어도 한 개의 형광단을 올리고에 추가하고 통상 상당한 정제과정을 요하기 때문에 만들기가 어렵다. 프로브가 비싸기 때문에, 두 개의 이중-라벨된 프로브는 표적의 경쟁적인 정량화 또는 돌연변이 감지에 필수적이다. 또한, 관찰되는 형광은 임의 주어진 과정에서 존재하는 생성물의 양에 의존하는 것이 아니라 가수분해되는 누적된 프로브의 양에 따라 달라진다. 이는 PCR 평탄부분에 도달한 후에도 형광이 지속적으로 증가되게 되는 것이다. 마지막으로 가장 중요한 것은, 프로브 가수분해는 폴리메라제 연장동안에 항상 일어나는 것이 아닌데 이는 잘 이해되지 않는 것이다. 예를 들면, 실시예 4의 이중-라벨된 플로레신/Cy5 프로브는 프라이머에 인접하여 있을 때, PCR 동안에 가수분해가 거의 안되는 것으로 나타난다. 또한, 말단 라벨을 포함하는 몇 가지 이중-라벨된 플로레신/Cy5를 만들고 이들 모두는 증폭하는 동안에 가수분해가 잘 안되고 시그날 발생도 약한 것으로 나타났다.

인접 하이브리드 프로브와 PCR 생성물의 상동성 감지로 5'-엑소뉴클레아제 시스템의 많은 문제를 해결할 수 있다. 인접 하이브리드 프로브를 합성하는 것은 상대적으로 간단한데, 그 이유는 플로레신과 Cy5 모두의 아미다이트가 자동 합성동안에 직접 결합을 시킬 수 있고, 한 개 프로브에 이중 라벨링이 요구되지 않기 때문이다. 가수분해가 아닌 하이브리드로 인한 형광 때문에, 프로브 형광의 온도 의존성을 이용하여 돌연변이 감지 및 정량화를 할 수 있다. 그러나, PCR 생성물의 상동 감지를 위한 인접 하이브리드 프로브를 이용하는 것에 대해 기존에 언급된 바는 없었다. 놀라운 것은 프로브에 의해 차단된 지역을 통한 폴리메라제 연장에 의해 시그날 발생 및 증폭을 위한 하이브리드 반응이 일어날 수 있다는 것이다.

실시예 6

실시예 3에서 설명한 것과 같이, 인접 플로레신-과 Cy5-라벨된 프로브를 이용하여 게놈 DNA로부터 110bp β-글로빈 단편을 증폭시켰다. 10㎕ 반응에 0.4 U (Taq) 또는 0.8 U(Stoffel 단편, Perkin Elmer, or KlenTaq1) 효소를 이용하였다. 다른 언급이 없는 한, 온도 변환 과정은 94℃에서 0초(프로그램된 근접 속도는 초당 20℃), 60℃에서 20초(근접 속도는 초당 20℃), 75℃에서 0초(근접 속도는 초당 1℃)이다. 도 13에서는 30회 온도 변환 과정 동안에 주형이 증폭된 직후에, 2개의 인접 하이브리드 프로브에 의해 발생되는 형광을 나타내었다. 94℃에서 간단하게 변성시킨 후에, 온도를 60℃로 낮추면 형광은 약 20초간 증가된다. 5' 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 고유 Taq 폴리메라제를 이용하는 것 보다 엑소뉴클레아제 결손된 폴리메라제(Stoffel 단편)를 이용하는 경우에 시그날의 크기가 더 크다. 약 20초 후에, 폴리메라제를 대체시키거나 또는 프로브가 가수분해되면 형광은 감소된다. 폴리메라제가 5'-엑소뉴클레아제 활성을 가지고 있을 때(Taq DNA 폴리메라제), 이 활성이 부족한 것(Stoffel 단편)보다는 형광 감소가 상대적으로 약간 더 빠르다.

도 14(상측 패널)에서 볼 수 있는 것과 같이, 온도 변환 과정은 60℃에서 20초간 유지시키면서, 94℃와 60℃사이에서 일어난다. 형광이 최대인 20초 종료즘에 형광을 얻을 수 있다. Taq(exo^-)를 이용하면 양호한 증폭을 할 수 있으나, Stoffel 단편(exo⁺)을 이용하면 양호한 증폭을 얻을 수 없는데, 이는 형광 발생 및 아가로즈 겔(겔은 나타내지 않음)로 증명된다. 그러나, 60℃에서 유지하는 시간을 20초에서 120초로 증가시키면(도 14의 중간 패널), exo^-폴리메라제 증폭이 잘 된다. exo- 폴리메라제로 프로브 대체하는 속도를 늦출 경우, exo^-폴리메라제를 이용하는 경우보다 효과적인 증폭을 하는데 60℃에서 유지되는 시간이 더 길어진다. 온도를 60℃에서 75℃로 서서히 증가시키면, exo^-폴리메라제가 요구하는 시간을 감소시킬 수 있다(도 14의 아래 패널). 프로브에 도달하면, 폴리메라제는 중지시킨다. 그러나, 프로브 용융 온도에서는 프로브는 주형에서 용융되어 나오고, 폴리메라제는 방해를 하지 않기 때문에 쇄의 중합반응을 완성시킨다. 프로브가 용융된 후에 온도를 너무 빨리 올리지 않는 한 중합반응은 완성된다. 도 14(아래 패널)에서는 한 개의 exo^-폴리메라제(Taq)와 두 개의 exo^-폴리메라제(Stoffel 단편과 KlenTaql)를 나타낸다.

엑소뉴클레아제 활성이 있는 경우에, 프로브의 일부는 각 온도 변환 과정에서 가수분해되는데 이는 방대한 증폭시의 형광이 감소되는 것으로 알 수 있다. 이는 도 13과 14(중간패널 및 아래 패널)에서 알 수 있는데, exo^-폴리메라제로는 일어나지 않는다. 형광은 방대한 증폭시에도 안정적이기 때문에 KlenTaq1과 같으 exo^-폴리메라제가 적절하다.

PCR을 모니터하기 위해 인접 하이브리드 프로브 이용의 성공 여부는 몇 가지 인자에 달려있다. 인접 하이브리드 프로브간에 사이 염기가 0 내지 2인 경우에 공명 에너지 전달이 최대가 된다. 프로브 하이브리드 지역을 통하여 프라이머가 연장하기 전에 프로브에 하이브리드되는 쇄 단편을 증가시키기 위해서는 프로브의 용융 온도가 프라이머의 용융 온도보다 높아야 한다(바람직하게는 >5℃).

Cycle-by-Cycle 형광 ; DNA 증폭을 분석하는 통상적인 종점인 겔 전기영동은 생성물의 크기를 확인하고, 순도를 측정한다. 그러나, 증폭은 처음에는 확률적이고, 그 다음은 지수적으로 증가되고, 최종적으로는 정체되기 때문에, 종점 분석으로 정량화하는데에는 한계가 있다. 본 발명의 한 특징에는 하이브리드 프로브와 함께 시작 주형 복사체의 수를 정량화하는 cycle-by-cycle 모니터법을 포함한다. 당업자가 아는 바와 같이, DNA가 증폭하는 동안에 여러 시료의 변환과정당 1회 모니터하는 것이 가장 정확한 정량화 방법이다. Cycle-by-cycle 모니터 방법은 각 변환과정의 연장 상 또는 어닐링/연장 복합상 동안에 형광을 포착하고, 형광과 생성물의 농도에 대한 관계를 정립하는 것이다.

실시예 7

세 가지 다른 기술을 이용하여 Cycle-by-cycle 모니터 방법을 실행한다. (i) 이중 쇄-특이적인 염료 SYBR^TM Green I; (ii) 이중-라벨된 가수분해 프로브의 엑소뉴클레아제 절단 후에 로다민에 의한 형광 퀸칭의 감소 및 (iii) 인접 하이브리드 프로브에 의한 플로레신에서 Cy5로의 공명 에너지 전달에 의해 형광을 모니터 한다. 증폭 시약 및 조건은 실시예 2에서 상술하였다. 사람의 β-글로빈 프라이머 RS42/KM29(536개 염기쌍) 및 PC03/PC04(110개 염기쌍)에 대해서는 Wittwer et al., "뜨거운 공기를 이용한 모세관에서의 자동 폴리메라제 연쇄 반응" 17 Nucl. Acids. Res. 4353-4357 (1989))에 상술하고 있고, 여기에 참고문헌으로 첨부되었다. β-글로빈의 온도 변환 과정은 최고 95℃, 최저 61℃, 72℃에서 15초, 온도간의 평균 변화는 초당 5.2℃이다. β-글로빈 프라이머와 플로레신/로다민 이중 프로브는 Perkin Elmer(no. N808-0230)에서 구입할 수 있다. β-악틴의 온도 변환 과정은 최고 94℃, 60℃에서 15초, 온도간의 평균 변화는 초당 6.2℃이다. 실시예 3에서 설명을 한 것과 같이 한 개 라벨된 프로브, 5'-CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA-플로레신-3'(서열 3)과 5'-Cy5-AAGTCTGCCG TTACTGCCCT GTGGGGCAAGp(서열 4)를 합성하였다. 이들 인접 프로브는 동일 DNA 쇄에 있는 PC03/PC04 β-글로빈 프라이머쌍의 내부에 하이브리드하고, 한 개 염기쌍에 의해 분리되어 있다. 온도 변환 과정은 최고 94℃, 59℃에서 20초, 온도간의 평균 변화는 초당 7.0℃이다. 하이브리드 프로브(β-악틴 및 β-글로빈)는 각 0.2μM을 이용하였다.

여러 시료를 SYBR^TM Green I으로 각 온도 변환 과정에서 모니터할 경우, 시작 주형은 농도 10⁷-10⁸ 범위에서 구별할 수 있다(도 15). 이중-쇄 특이적인 염료로 SYBR^TM Green I을 이용한 β-글로빈 유전자의 536bp 단편을 증폭시킨다. 각 시료에서 얻은 최대 형광 비율로 데어터를 표준화시키면, 10개 복사체로부터 100개의 시작 복사체가 명백하게 분리된다. 그러나, 1개와 10개 복사체간에 차이는 거의 없기 때문에, 시료당 0과 1개 평균 복사체간에는 차이가 없다.

대조적으로, 서열-특이적인 프로브는 유사한 역학 범위를 가지지만, 음성 기준으로부터 한 개의 시작 주형 복사체도 구별할 수 있는 것으로 보인다. 5'-엑소뉴클레아제 프로브(β-악틴 단편, 도 16)로 시그날 발생은 DNA 합성에 따라 달라지고 뿐만 아니라 이중-라벨된 프로브의 형광단간에 하이브리드와 가수분해를 요구한다. 이와 같은 가수분해는 퀸칭을 감소시키고, 플로센신에 대한 로다민의 형광 비율을 증가시킨다. 이중 쇄 염료로부터 발생되는 형광은 과도한 변환과정에서는 변화가 없지만(도 15), 엑소뉴클레아제 프로브로부터 발생되는 시그날은 각 변환과정에서 지속적으로 증가된다(도 16). 최종 생성물이 합성되지 않더라도 프로브 하이브리드와 가수분해는 계속 일어난다. 주형 복사체의 수가 10³이하로 감소되면, 시그날 강도는 감소되나, 음성 기준 시그날이 안정적이기 때문에, 복사체수가 작아도 정량화할 수 있다.

도 17에서는 인접 하이브리드 프로브를 이용하여 증폭을 모니터하고, 이는 Cy5에 대한 플로레신 형광 비율로 나타내었다. 형광 비율에 변화는 대개 공명 에너지 전달로 인한 Cy5 형광이 증가되기 때문이다(도 9). 이중-라벨된 가수분해 프로브와는 대조적으로, 폴리메라제에 엑소뉴클레아제 활성이 포함된 경우에, 하이브리드 프로브의 형광 시그날은 복사체 수가 많은 경우에 감소된다.

PCR 동안에 하이브리드의 공명 에너지 전달을 위한 두 가지 다른 방법을 이용하여 본 발명의 실행가능성을 설명할 것이다. 첫 번째 방법은 두 개의 인접 하이브리드 프로브를 이용하는데, 한 개는 3'에 플로레신이 라벨되어 있고, 다른 하나는 5'에 Cy5가 라벨되어 있다. PCR 동안에 생성물이 축적될 때, 각 변환과정동안에 프로브는 서로의 다음에 하이브리드된다. 라벨된 프라이머는 증폭되는 동안에 PCR 생성물에 결합되고, 단지 한 개의 하이브리드반응만 있으면 된다.

실시예 8

Cy5-라벨된 프라이머와 플로레신-라벨된 하이브리드 프로브간에 공명 에너지 전달에 의해 PCR의 Cycle-by-cycle 모니터를 한다. 이는 인접 Cy5/플로레신 하이브리드 프로브를 이용한 모니터 결과와 비교를 하였다. Cy5-라벨된 프라이머는 CAACTTCATC CACGT^*TCACC(서열 21)이고, 이때 T^*는 Cy5가 부착된 변형된 T 염기이고, 이에 상응하는 프로브는 GTCTGCCGTT ACTGCCCTGT GGGGCAA-플로레신(서열 22)이다. 인접 하이브리드 프로브는 CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT CC-플로레신(서열 23)와 Cy5-GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAAp(서열 24)이다. 실시예 3에 따라 하이브리드 프로브를 합성하는데 각 0.2μM을 이용하였다. 두 단계로 Cy5-라벨된 프라이머를 합성하였다. 자동 합성을 이용하여 원하는 T 위치에 아미노-변형물질 C6dT(Glen Research)을 결합시킨다. 그 다음, Cy5 1가 N-하이드록시숙시니미드 에스테르(도 6)를 제조업자(Amersham)의 지시에 따라 손으로 아미노 링커에 결합시킨다. 실시예 3에서 설명하는 것과 같이, HPLC 정제를 한다.

PCO4를 이용하는 대신에 Cy5-라벨된 프라이머(0.5μM)를 이용하여, 실시예 3에서 설명하는 것과 같이 사람의 게놈 DNA에서 110개 염기쌍의 β-글로빈 단편을 증폭시키는데, 단 실시예 3과 다른 점은 10㎕에 이용된 효소는 0.4U Taq 폴리메라제를 이용한 것이다. 또한 인접 하이브리드 프로브로도 동일한 β-글로빈 단편의 증폭을 모니터할 수 있다. 온도 변환 과정은 94℃에서 0초, 60℃에서 20초간 실행한다. 어닐링/연장부의 종료시에 각 변환 과정에서 1회 형광을 모니터한다. 두 가지 방법에서, Cy5로 형광 에너지의 전달이 하이브리드반응과 함께 증가되고, 이를 Cy5 형광에 대해 플로레신 형광 비율로 나타내었다(도 18).

추가 실험으로, Cy5-라벨과 플로레신 라벨을 분리하는 염기의 수를 다양하게 하였다. 시그날은 형광단간의 거리가 15개 염기까지는 감지할 수는 있으나, 최상의 형광 공명 에너지 전달은 형광단간에 거리가 약 4-6개 염기에서 관찰되었다.

가수분해 프로브와는 대조적으로, 하이브리드 프로브에서 나오는 형광 시그날은 누적되는 것이 아니고, 각 어닐링 상동안에 새로 발생하였다. 하이브리드 반응은 가상 1차 공정이기 때문에, 형광은 생성물의 농도를 바로 나타내는 척도가 된다. 프로브의 농도가 생성물의 것보다 휠씬 높기 때문에, 프로브에 하이브리드되는 생성물의 분취는 생성물의 농도와는 무관하다. 이와 같은 특징은 라벨된 프라이머와 함께 1회 하이브리드 반응을 이용하여도 정량화를 위한 생성물의 누적을 잘 모니터할 수 있다. cycle-by-cycle 모니터 방법동안에 상이한 형광 기술의 고유 변수는 정량화에 중요하다.

실시예 9

세 가지 각각 다른 형광 모니터 방법을 이용하여 실시예 2에 따른 DNA 증폭을 실행하였다. KM29와 PCO4 프라이머로 부터 사람의 β-글로빈 단편 205개 염기쌍을 증폭시키는데 SYBR^TM Green I을 1:10,000 희석하여 이용하였다. 가수분해 프로브와 조건은 실시예 7에서 명시하고 있다. 하이브리드 프로브인 TCTGCCGTTA CTGCCCTGTG GGGCAAG-플로레신(서열 5)를 KM29와 함께 이용하고, Cy5-라벨된 프라이머 CAACTTCATCCACGTT^*CACC(서열 6) 이때,T^*는 Cy5-라벨된 T 염기로 실시예 8에서와 같이 합성을 할 수 있다. 모든 증폭은 15,000 주형 복사체(사람 게놈 DNA/10㎕ 50ng)로 10개 복제단위(replicate)에서 실행한다. 온도 변환 과정은 31초로 길다(최대 94℃, 60℃에서 20초간, 온도간 평균 변화율은 초당 6.2℃). 어닐링/연장 상의 15 내지 20초사이에 각 시료에서 형광을 수득할 수 있다.

도 19에서는 PCR에서 형광을 모니터하는 세 가지 기술을 비교할 수 있다. 형광 프로브는 dsDNA dye SYBR^TM Green I(도 19a), 이중 라벨된 플로레신/로다민 가수분해 프로브(도 19b), Cy5-라벨된 프라이머와 함께 플로레신-라벨된 하이브리드 프로브이다. 모든 프로브는 약 20회 변환과정에서 발생하는 형광을 감지하는데 동일한 감응성을 가진다. 연장된 증폭과 함께, 가수분해 프로브의 경우 시그날은 계속증되고, SYBR^TM Green I의 경우에는 비등하고, 하이브리드 프로브의 경우에는 약간 감소된다. 도 19d에서는 세 가지 형광 모니터 기술의 정확성을 비교하였다. 각 점에 대한 평균 +/- 표준 편차를 플롯팅하였다. 각 데이터는 기저선 위의 형광(변환과정 11-15의 평균)의 변수 계수(표준 편차/평균)으로 플롯팅된다.

가수분해 프로브의 형광 비율에서 변화가 하이브리드 프로브에서 수득한 것보다 클지라도(도 19b, 19c), 가수분해 프로브에서 얻은 형광의 변수 계수가 더 크다(도 19d). 즉,비록 절대적인 시그날 수준은 더 낮더라도, 하이브리드 프로브 방법으로 인한 형광이 가수분해 프로브를 이용하는 것보다 더욱 정확하다. 이는 사용이 더 많은 이중-라벨된 가수분해 프로브보다도 하이브리드 프로브의 예상치못한 장점이 된다.

시작 주형 복사체 수의 정량화 방법 ; 정량적인 PCR은 생의학적 연구 및 임상 실험에서 매우 중요한 기술이 되었다. 정량화 과정은 흔히 복사체 수를 알 고 있는 표적 서열을 포함하는 시료의 표준 곡선으로 실행하는 것을 포함한다. 모르는 시료의 복사체 수는 알고 있는 값들 사이에 외삽법을 통하여 결정을 할 수 있다. 존재하는 DNA의 양에 비례하는 시그날을 제공하는 형광, 방사능활성 또는 임의 다른 방법을 이용한 cycle-by-cycle 완전한 증폭 곡선을 모니터하였을 때, 많은 데이터 점을 분석하는데 이용을 하고, 표준 또는 모르는 것을 나타내는 값을 선택하는 것은 분명하지는 않다. 선행 기술에서는 시그날의 "한계치"를 선택하고, 그 다음 표준 또는 미지의 시료가 한계치에 교차할 때 변환과정의 수를 대표값으로 이용한다(Higuchi & Watson, EPA 0 640 828 A1). 이와 같은 과정은 증폭 곡선에서 이용할 수 있는 소량의 데이터를 이용한다. 또한, 한계치 값이 매우 주관적이고, 이는 정확한 또는 부정확한 편향이 될 수 있다. 증폭 곡선에 있는 데이터에 비-선형 곡선 적용 기술을 이용하여 객관적으로 더 많은 데어터를 이용할 수 있다. 적절하게는 기초 공정의 인자를 모델화하여 증폭 곡선의 모양을 설명할 수 있는 식을 찾을 수 있다.

많은 여러 가지 식을 이용하여 증폭 동안에 생성되는 데이터를 적용할 수 있다. 일반적으로 DNA 증폭은 로그 선형 부분을 가지고, 이 부분에서의 데이터는 DNA 증폭에서 기대되는 것과 같은 지수적인 증가를 나타내는 식에 적용시킬 수 있을 것이다. DNA 증폭의 로그-선형 부분은 다음의 식으로 표현할 수 있다.

[수학식 3]

y=A^*[DNA]^*(1+E)ⁿ

이때, A는 시그날 유닛을 DNA 유닛으로 전환하는 스케일링 인자이고; [DNA]는 반응에서 DNA의 출발 농도이고; E는 반응의 효과이고; n은 변환과정의 수이다.

정량화 과정은 다음과 같다; (1) 변수 A와 E를 만들기 위해 이 식에 공지의 표준을 적용시키고; (2) 표준으로부터 얻은 A와 E 값을 이용하여 식에 모르는 시료를 적용시키고, [DNA]를 플로팅시킨다. 이 기술은 더 많은 데이터를 이용하고, 데이터의 일부분, 선형 부분 즉, 정보성이 큰 부분을 이용한다. 도 20, 21, 22에서는 이와 같은 방법의 예를 나타내었다. 표준 곡선과 "미지"의 사람 게놈 DNA 표준을 이용하여, 정제된 PCR 생성물 10-배 희석물을 증폭시킨다. 도 20에서는 사용자 또는 소프트웨어를 이용하여 로그-선형 부분을 용이하게 확인할 수 있다는 것을 보여준다. 도 21에서는 수학식 3을 104 복사체 표준에 적용시키는 것을 보여준다. 도 22에서는 A와 E에 대한 몇 가지 표준으로부터의 평균 치를 이용하고, 이를 [DNA]에 적용시킨다. 게놈 DNA의 한 개 복사체 유전자에 대한 이론치(15,000복사체)에 매우 근접한 값 16,700을 얻는다.

증폭 곡선에 있는 모든 데이터를 이용하는 것에는 배경 수준과 평탄역 값을 포함한다. 복사체 수가 많을 경우에는 평탄역은 정보를 제공하지 못하는 것이고, 복사체 수가 적을 경우에는 시작 복사체 수에 비례할 수 있다. 배경 수준은 시그날이 상당히 증가하는 것을 나타내는 제 1 점을 결정하는데 유용하다. 이때, DNA 증폭 곡선의 모양에 관계하는 모든 인자를 아는 것은 아니기 때문에 한 가지 방식으로 곡선의 모양을 설명한다. 도 23에서는 DNA 주형 농도의 5차 크기 범위를 감지하기 위해 형광 하이브리드 프로브를 이용한 증폭 곡선을 나타낸다. 각 곡선은 다음의 식에 적용시킨다.

[수학식 4]

y=((as^*x+ab)-(ds^*x+db))/(1-(x/c)＾b)+(ds^*x+db)

이때, "as"는 기울기선의 배경을 나타내고; "ab"는 배경선의 y 절편을 나타내고; "ds"는 정체선의 기울기를 나타내고; "db"는 기울기선의 y 절편을 나타내고; "c"는 반응의 배경으로부터 평탄부까지의 절반 정도에 있을 때, 복사체의 수를 나타내고(A₅₀); "b"는 증폭의 로그-선형 부분의 기울기를 나타낸다.

이 식이 이와 같은 증폭 데이터에 매우 적합하고, 도 24에서는 A₅₀값이 7차 크기를 지나 시작 복사체 수 로그와 연관이 있다는 것을 나타낸다. 도 25에서는 5차 크기 범위에서 DNA 주형을 감지하기 위한 가수분해 프로브를 이용한 증폭으로부터 얻은 데이터를 동일한 식에 적용시킨 것을 나타낸다. 이 식은 이와 같은 증폭데이터에 매우 적합하고, 도 26에서는 A₅₀값이 시작 복사체 수 로그와 상관관계가 있다는 것을 나타낸다. 이는 식이 하이브리드 프로브 증폭 곡선의 가파른 평탄부와 가수분해 프로브 곡선의 지속적으로 증가하는 "평탄부" 모두에 잘 적용이 되기 때문에 전체 곡선 적용 방식의 유연성을 설명한다.

전체 곡선 적용이 이 식에만 국한되는 것은 아니다. 도 27에서는 다음의 수학식 5에 적용되는 세 가지 농도의 증폭을 나타낸다;

[수학식 5]

y=(((as^*x+ab)-(dmax^*x/dd+x))/(1+(x/c)＾b))+(dmax^*x/dd+x)

이때, 식은 처음 6개 변수 식과 유사하나, 단 평탄부는 직선보다는 쌍곡선으로 정위된다. 도 28에서는 이 식의 A₅₀가 시작 복사체의 수와 상관관계가 있다는 것을 나타낸다.

A₅₀을 이 실시예에서 이용하는데, 특정 기술이 증폭 곡선의 아래 또는 위에서 더욱 확고하다면, 배경과 평탄부간에 수준을 선택할 수 있다. 예를 들면, 시작 복사체 수와 A₅₀ ,A₄₀ ,A₃₀ ,A₂₀ ,A₁₀ 사이에 최상의 상관관계를 평가하기 위해 일련의 증폭 표준 곡선을 평가한다. 알고 있는 시작 복사체 수와 가장 연관관계가 있는 증폭 수준을 결장한다. 이는 다른 감지 시스템과는 약간 다를 것이다. 도 19에서는 다양한 감지 시스템의 변수 계수를 나타낸다. 최상의 예측인 증폭 수준은 가장 낮은 변수 계수를 가진 수준일 것이다.

DNA 증폭 반응 자체를 잘 이해를 하고 있기 때문에, 물리적인 공정을 반영하는 변수를 가지는 다른 식을 이용할 수 있다. DNA 증폭 곡선의 평탄부는 다른 반응에서 다른 원인을 가진다. 이는 나중의 변환과정에서 프라이머가 생성물과 재시 어닐링하는데 경쟁을 할 수 없기 때문이다. 이와 같은 효과는 반응(다시 어닐링하는 속도는 생성물의 농도 제곱에 비례함)에서 생성물의 농도 제곱에 따라 변화되는 변수로 포착을 할 수 있다. 평탄부의 또 다른 원인은 프라이머의 고갈이다. 프라이머 제한 반응은 특징적인 모양을 가지는데, 이는 인지할 수 있을 정도의 매우 가파른 평탄부를 가진다. 프라이머 제한 반응 적용에는 이와 같은 가파른 상단을 한정하는 변수를 포함한다. 효소 제한 반응은 이에 따라 적용할 수 있는 매우 둥근 평탄부를 가진다. 중량을 재는 인자를 고안할 수 있는데, 이는 주어진 시스템에서 공지의 변수 계수를 반영하여, 무거울수록 더 신뢰성이 있는 데이터 점을 가진다. 증폭 프로파일에 더 많은 점을 적용시켜, 시작 복사체 수를 더 정확한, 더 확고한 평가치를 얻을 수 있다. 이와 같은 하나이상의 적용 변수들을 이용하면 모르는 시료에서 시작 복사체의 수를 평가할 수 있다.

PCR을 지속적으로 형광 모니터하는 방법 ; 본 발명의 각 PCR 온도 변환 과정안에 여러 회 모니터하는 지속적인 모니터방법의 특징을 논의하기로 한다. PCR 동안에 형광을 모니터하는 것은 일정 온도에서 각 과정에 1회 이루어지나, 본 발명은 PCR 과정을 통하여 지속적인 모니터의 장점을 제공한다. 도 29a와 29b에서는 SYB^TM Green I의 온도와 형광에 대한 역관계를 설명하고 있다. 이는 온도 과정동안에 혼동 효과로써 통상 일정한 연장 온도에서 과정당 1회 형광을 고려하면 이를 제거할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 온도 변환동안에 형광을 모니터하는 것이 매우 유익한 것이다. 본 발명이전에는 각 변화과정내에서 형광을 지속적으로 모니터를 하지 않았다(이는 각 과정에 1회 모니터하는 것에 반대되는 것이다). 본 발명에 따르면, 시간, 온도, 형광등은 매 초, 매 200msec, 100msec 또는 더 큰 빈도에서 얻을 수 있다. 이와 같은 데이터는 기존에 이용한 방식으로는 얻을 수 없었던 생성물 변성, 다시 어닐링, 연장 및 프로브 어닐링 및 신속한 변화과정 동안에 용융 등의 상세한 정보가 된다.

실시예 10

프라이머 5'-CGTGGTGGACTTCTCTCAAT-3'(서열 1)과

5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3'(서열 2)(Genbank sequence HVHEPB)을 이용하여, 정제된 PCR 생성물 10⁶ 복사체로부터 헤파타이트스 B 표면 항원 유전자의 180염기쌍을 증폭시켰다. 실시예 2의 증폭 조건을 준수하는데, 단 반응에는 1:20,000희석된 SYBR^TM Green I과 2mM MgCl₂를 포함하는 것이 다른 점이다. 각 온도 변환과정은 다음과 같다; 27초간(최고 92℃, 최저 59℃, 70℃에서 5초간, 온도간의 평균 변화율은 초당 3.0℃)이다. 매 200msec마다 시간, 온도, 형광 2채널을 얻고, 이를 지속적으로 플롯팅하는데; 반복과정 수에 대한 형광, 온도에 대한 형광 그래프에 플롯한다. 도 30에서는 10 내지 34회 과정을 통한 온도, 시간, 형광을 3차원으로 나타낸 것이다. 이와 같은 3차운 곡선은 도 30의 2차 그래프인 시간에 대한 온도 그래프, 시간에 대한 형광 그래프 및 온도에 대한 형광 그래프로부터 투영하여 만든 것이다. 도 30의 시간에 대한 온도 그래프는 각 과정에서 반복하고, 이는 도 3에서 제공한 동일한 정보를 필수적으로 제공한다. 형광이 온도에 대해 역으로 변화되기 때문에, 도 30에 나타낸 초기 과정에서의 시간에 대한 형광 곡선은 시간에 대한 온도 그래프(도 29)에 눈금을 매긴 거울 상이된다. 생성물이 누적되면, 이중 쇄 생성물에서 모든 온도에서 형광이 증가되었다. 그러나, 변성 온도에서 단일 쇄 DNA가 있기 때문에, 형광이 기저수준으로 되돌아간다. 도 30에 나타낸 이중 쇄 염료의 온도에 대한 형광은 시간축에서 제거하고 DNA 증폭하는 동안에 thom이 상태에 따라 온도가 달라진다는 것을 나타낸다.

실시예 11

5㎕ 용적에 25ng 게놈 DNA와 SYBR^TM Green I 1:10,000 희석물로부터 사람 β-글로빈 유전자의 536 염기쌍 단편을 증폭시켰다. 각 온도 변환과정은 다음과 같다; 28초간(최고 95℃, 최저 61℃, 72℃에서 15초간, 온도간의 평균 변화율은 초당 5.2℃)이다. 다른 조건은 도 30에서 설명한 것과 동일하다. 변환과정 15-40를 하였다. 도 31에 나타낸 것과 같은 온도에 대한 형광를 플롯팅하면 PCR 동안에 생성물의 쇄 상태에 따라 온도가 달라진다는 것을 알 수 있다. 초기 과정은 거의 동일한 것으로 낮은 온도에서는 형광이 비-선형으로 증가되었다. 증폭이 진행되면, 온도과정이 어닐링과 변성 온도간에 루프를 만드는 것처럼 보인다. 시료를 가열하면, 형광은 변성이 일어날 때까지 높다. 시료를 냉각하면, 형광은 증가되어 생성물이 다시 어닐링되었다는 것을 나타낸다. 온도가 연장하는 동안에 일정하면, 형광이 증가하는 것이 추가 DNA 합성과 상관관계가 있다.

본 명세서로부터 이해를 할 수 있겠지만, 변환과정내에 지속적인 모니터를 하면 선행기술에서 제공하지 못한 DNA 증폭 메카니즘에 식견을 제공한다. 본 발명을 이용하면, 거의 이해할 수 없었던 DNA 증폭에 대해 많은 면을 이해할 수 있다. 예를 들면, 신속한 변환가정 증폭은 생성물을 1초이내에서 변성시키는 것을 요구하면 반면, 기존기술에서는 변성하는데 10초에서 1분이 소요되었다. 본 발명에 따른 이중 쇄 염료로 실제 시간 형광을 모니터하여 생성물의 용융을 관찰하면(도 30, 31) 변성시간이 짧은 것이 휠씬 효과적이라는 것을 알 수 있다. 또 다른 예를 보면, "평탄역 효과"의 많은 원인에 대해 제시하였으나, 다른 방안들간을 구별하는데 이용될 수 있는 데이터는 거의 없다. 선행 기술의 느린 온도 사이클러로 생성물을 다시 어닐링하는 것은 다소 비용이 많이 들고 이는 바람직하지 못한 효과가 더 크다. 생성물의 재어닐링이 "평탄역 효과"의 주요원인인 것으로 보인다.

인제는 서열 특이적인 프로브의 지속적인 모니터에 대해 생각을 해보아야 한다. 설명을 통하여 인지를 하겠지만, 변환과정내에 지속적인 모니터하여 프로브 형광의 성질을 확인할 수 있다.

실시예 12

실시예 7에서와 같이, 이중-라벨된 가수분해 프로브(β-악틴)과 인접 하이브리드 프로브(β-글로빈)으로 매 200msec마다 증폭을 지속적으로 모니터한다. 도 32a에서 볼 수 있는 것과 같이, 반응의 변환과정 20-45을 가수분해 프로브로 모니터하였다. 가수분해 프로브는 온도에 따른 형광 비율이 선형으로 변화되는 것으로 나타났고, 프로브 더 많이 가수분해되면 형광이 나란히 증가되었다. 대조적으로 하이브리드 프로브의 형광 비율은 온도에 따라 상당히 과격하게 변화된다(도 32b, 변환과정 20-40). 어닐링/연장 상동안에, 프로브는 단일 쇄 생성물에 하이브리드되고, 형광 비율(Cy5/플로레신)이 증가되었다. 생성물의 변성 온도를 가열시키는 동안에, 프로브는 70℃정도에서 분리되고, 형광 비율은 배경 수준으로 감소된다.

실시예 13

10㎕ 용적에서 게놈 DNA 50ng으로부터 β-글로빈 단편 110bp를 증폭시켰다. 실시예 3의 증폭 조건 및 인접 하이브리드 프로브와 0.4U Taq 폴리메라제 또는 0.8U KlenTaq1으로 실시하였다. 매 100msec마다 형광을 모니터하였따. KlenTaq1(도 33)과 Taq(도 34)를 이용한 온도에 따른 형광을 나타낸 그래프에서는 70℃ 정도에서 프로브의 용융을 설명한다. KlenTaq1을 이용한 경우에 최대 시그날은 Taq을 이용한 경우의 시그날보다 큰데 그 이유는 Taq의 엑소뉴클레아제 활성으로 인한 것이다. Taq를 이용한 나중의 과정에서는 고유 프로브의 농도가 감소함에 따라 각 변환과정의 형광이 증가하기 시작하였다. 도 35(KlenTaq1)와 도 36(Taq)에서는 온도, 시간, 형광의 3차원 플롯을 나타내었다.

본 발명의 (1) 각 온도변환과정내에서 지속적으로 형광을 모니터하는 것과 (2) 온도 및 시간에 따른 하이브리드을 분석하는 것을 복합하면 다른 것으로는 얻을 수 없는 장점을 제공한다. 도 2에서는 과정을 통한 지속적인 모니터방법에 의해서 기존에는 얻을 수 없었던 정보를 얻는다는 것을 나타낸다. 변환과정의 생성물 용융동안에 지속적으로 형광을 모니터하는 것으로 해당 과정동안에 존재하는 DNA의 순도, 확인, 정량 등에 대한 정보를 얻을 수 있다.

PCR 반응이 연장 온도로부터 변성 온도로 가열할 때, 시료에 있는 임의 DNA는 단일 쇄로 용융된다. 이와 같은 변성은 SYBR^TM Green I의 형광이 떨어질 때 관찰된다. 작은 PCR 생성물의 경우에 좁은 온도범위에서 용융 전이가 일어나고, 용융 온도 범위의 중간 점을 Tm이라 한다. 겔 전기영동에의한 크기 분류와 비슷하게, 용융 피크 분석은 DNA의 기초 특징을 측정할 수 있고, 이를 이용하여 증폭된 생성물을 확인할 수 있다. 겔 전기영동과는 달리, 용융 곡선 분석은 길이는 동일하나 GC/AT 비율이 다른 생성물을 구별할 수 있다. 또한, 길이 및 GC 함령이 동일하나 GC 분포가 상이한(가령, 동일하게 분포되어있는 것과 단부에 GC가 몰려있는 것) 두 가지 생성물은 용융 곡선이 상당히 다르다.

PCR 생성물이 용융되는 온도는 상당한 범위까지 다양하다. 당 분야에 공지의 실험식을 이용하여, DNA의 용융 온도(Tm)에서 GC의 영향을 예측하는데, GC 0%인 이중나선은 100% GC 이중나선의 용융 온도보다 41℃ 낮은 온도에서 용융된다. 동일한 GC 함량을 가지는 경우에는 40개 염기쌍 프라이머 이량체가 1000bp 생성물보다 12℃ 아래에서 용융된다. 따라서, PCR 생성물의 Tm 범위는 적어도 50℃정도가 된다. 이와 같이 상당히 넓은 범위로 인하여 대부분의 PCR 생성물은 용융 곡선으로 구별할 수 있다. 따라서, 용융 곡선 분석과 함께 PCR의 형광을 모니터한 것을 복합하면, PCR 생성물의 증폭, 감지 및 구별을 동시에 할 수 있다.

실시예 14

SYBR^TM Green I에 대한 광학과 24-시료 열 변환 사이클러가 있는 소량 형광계에서 세 가지 다른 PCR 생성물의 DNA 용융 곡선을 얻는다(LightCycler LC24, Idaho Technology, Idaho Falls, Idaho). 헤파타이티스 B 표면 항원 유전자의 180개 염기쌍을 증폭시키는데 이용된 프라이머는 5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3'(서열 1)와 5'-AGAAGATGAGGCATAGCAGC-3'(서열 2)이다. 292bp의 전립선 특이적인 항원(PSA) 유전자 증폭을 위한 프라이머는 5'-CTGTCCGTGA CGTGGATT-3'(서열 7)과 5'-AAGTCCTCCG AGTATAGC-3'(서열 8)이다. 실시예 7에서와 같이 536bp 염기쌍의 사람 β-글로빈 유전자 증폭시켰다. 증폭된 생성물은 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전, Centricon 30 소형 원심분리기(Amicon of Danvers, Massachusetts)를 통하여 반복세척하여 정제한다 주형의 농도는 260㎚에서 흡수도를 특정하고, 이는 A(260)/A(280) 비율이 1.7이상이 된다.

50mM Tris, pH 8.5, 2mM MgCl₂, 250㎍/㎖ 소 혈청 알부민에 포함된 정제된 DNA 50ng과 5㎕ 용적을 혼성 유리/플라스틱 반응 용기의 개방된 플라스틱 저장기에 피펫팅하고, 저속으로 원심분리하여, 모세 유리관의 팁부분에 시료를 위치시키고, 플라스틱 마개로 봉한다. 초당 0.1 내지 10.0도의 변화율로 95℃까지 선형 온도 전이 하는 동안 0.25 내지 2.0초간에 시그날을 통합하여, 용융 곡선을 위한 형광 데이터를 얻는다. 형광을 지속적으로 얻고, 이는 LabView 프로그램 환경(National Instrument, Austin, TX)에서 온도에 대한 형광플롯으로 나타낸다. 도 37에서는 세 가지 정제된 PCR 생성물의 용융 곡선을 나타낸다.

도 37에서 세 가지 생성물의 Tm은 단지 6도 범위에 있고, 곡선중 두 개는 2도정도에 의해 분리되어 있다. Tm에서 길이에 걸쳐 GC 비율이 중요하다는 것은 길이가 536bp인 β-글로빈 단편보다 길이가 더 짧은 292bp PSA 생성물이 더 높은 온도에서 용융된다는 것으로 설명될 수 있다. 평형을 얻기 위해 분당 0.5℃ 비율로 용융 곡선을 얻을 수 있다. 또한, 가열 속도를 감소시키면 용융 곡선이 더 낮은 온도쪽으로 전이되고, 더 가파르게된다(도 38, 헤파타이티스 B 단편). 그러나, 도 37의 용융 곡선은 초당 0.2℃의 가열 속도(분당 12℃)로 하였을 때에도 얻을 수 있고, Tm이 2℃ 또는 그 이하정도로 다른 생성물을 구별할 수 있다.

PCR 생성물의 표면 Tm은 이중 쇄-특이적인 DNA 염료 농고에도 영향을 받는다(도 39, 헤파타이티스 B 단편). 염료의 농도가 높을수록 DNA 이중쇄의 안정성이 증가되고, 관찰되는 Tm도 증가된다.

SYBR^TM Green I을 이용한 용융 곡선을 모니터하기 위한 적절한 조건은 가열 속도가 초당 0.1-0.5℃이고, SYBR Green I이 1:7,000 내지 1:30,000 희석비를 이용하는 것이다. 이와 같은 조건으로 2℃ 정도 Tm이 다른 생성물을 용이하게 분별할 수 있다.

좀더 정확한 온도 조절 및 용융 피크 분석용 소프트웨어를 이용하면, Tm에서 감지할 수 있는 차이를 몇 분수로도 감소시킬 수 있다. 그러나, 모든 생성물을 Tm에 의해 구별할 수 있는 것은 아니고, 두 개 이상의 생성물이 같이 이동하여 전기영동 결과를 잘못 해석할 수도 있기 때문에, 예측 범위 내에 용융되는 생성물의 일부는 원하는 생성물이 아닐 수 있다. 그러나, 예측 범위에 용융된 DNA가 없는 경우에는 예측 생성물이 존재하지 않는다고 결론을 내릴 수 있다.

용융 곡선 분석으로 이용할 수 있는 생성물을 구별하는 또 다른 형태는 긴 PCR 생성물에서 볼 수 있는 특이적인 도메인 용융 패턴이다. 통상 짧은 생성물(300bp이하)은 한 개의 전이에서 용융되지만, 긴 생성물은 복합적이고, 독특한 모양의 용융 곡선을 생성물의 증폭을 위한 핑거프린트로 이용한다.

용융 곡선 분석을 이용하여 프라이머 이량체와 같은 비-특이적인 생성물로부터 원하는 생성물을 분별할 수 있다. 프라이머 이량체는 광역의 저온에서 용융되어; 특정 PCR 증폭 생성물의 가파른 용융 곡선과는 상당히 다르다. 저온 어닐링에서 많은 과정을 거쳐 발생된 이형성이 큰 생성물은 순수 PCR 생성물의 것과 비교를 하면 낮고 넓은 용융 곡선을 가진다.

실시예 15

536 β-글로빈 단편은 실시예 7에서 기술된 것에 따라, 1:30,000 희석된 SYBR^TM Green I으로 증폭을 하는데, 단 조건을 변화시킨다. 반응 A(도 40)에서, 주형을 첨가하지 않고, 반응은 94℃에서 0초, 60℃에서 0초, 72℃에서 10초간 30회를 하여 작은 비-특이적인 증폭 생성물을 만든다. 반응 B에서는 낮은 엄격성(94℃에서 0초, 50℃에서 0초, 72℃에서 10초)에서 정제된 주형 10⁶ 시작 복사체를 증폭시키면 겔 전기영동에서 넓은 범위의 증폭 생성물이 나타나고, 넓은 온도 범위에서 용융된다. 반응 C에서, 정제된 주형 10⁶ 시작 복사체를 94℃에서 0초, 60℃에서 0초, 72℃에서 10초간을 30회 반복 실시하면, 한 개의 옅은 밴드가 나타나고, 급한 전이에서 용융된다. 온도 전이율은 초당 0.2℃이다. λ파아지 DNA(M)을 HindIII 처리한 것을 표식으로 이용한다.

도 40에서는 용융 곡선이 어떻게 PCR 반응의 특이성을 정확하게 반영하는지를 나타낸다. 가파른, 높은 온도의 용융 곡선 C는 겔에서 한 개 밴드에 상응한다. 낮은 온도의 넓은 용융 곡선 A는 주형 기준이 없는 분석시에 나오는 것으로 프라이머 이량체만을 나타낸다. C에서 생성물의 과증폭으로 인하여 용융 곡선 B에 중간에 포함되나, 특정 생성물에서는 분명하게 구별할 수 잇는 것이다.

도 37에서 볼 수 있는 용융 곡선은 온도(T)에 대한 형광(F)을 유도하여 정량화한 것이다. 이와 같은 유도는 -dF/dT vs T로 나타낼 수 있고 이는 용융 곡선을 용융 피크로 변환할 수 있다.

실시예 16

실시예 14의 정제된 헤파타이티스 B와 β-글로빈 유전자 단편을 개별적으로 용융시키고, 초당 0.2℃로 온도전이를 시키고 다른 조건은 실시예 14의 것(도 41)과 동일하다. 용융 곡선(상단)으로부터 Tm을 다소 객관적으로 결정은 용융 피크(아래)로부터 읽을 수 있다. 용융 피크아래 면적은 곡선 아래 면적을 적분하여 정량할 수 있다. -dF/dT vs T 플롯으로부터 우선 기저 형광을 얻을 수 있고 이는 곡선 아래 면적에 따라 기저치 크기가 변화된다는 것을 알 수 있다. 그 다음 평균, 표준편차, 피크의 높이 등을 적용 변수로 하여 가우스 함수의 비-선형 최소 자승 회귀분석으로 피크를 적용시킬 수 있다. 피크 면적으로 각 가우스 아래 면적을 얻는다. 모든 계산은 LabView 프로그램 환경(National Instruments, Austin, TX)을 이용하여 실행한다. 도 41에서는 용융 곡선을 용융 피크로 변환시키는 예를 나타낸 것이다. 이들 계산을 위한 코드는 별첨 A에 나타내었다.

프라이머 이량체와 다른 반응물로부터 특정 생성물을 구별하는 능력으로 시작 복제수가 적은 정량방법에서 이중 쇄 특이적인 DNA 염료 이용이 개선되었다. 상대적으로 많은 시작 주형 복사물의 수는 에티디움 브롬화물을 이용하면 정량화할 수 있다(Higuchi & Watson, supra). 그러나, 시작 복사물의 수가 적을 경우에, 프라이머 이량체와 다른 증폭 생성물의 배경 증폭이 특이적인 증폭 시그날을 간섭한다. 본 발명의 비-특이적인 인공생성물로부터 특정 생성물을 구별하는 능력을 이용하여, 이중 쇄-특이적인 DNA 염료를 이용하면 시작 복사체의 수가 적은 것도 정량화할 수 있다. 이는 이들 염료를 이용하는 것이 간단하기 때문에 장점이 된다. 임의 증폭에서 이중 쇄-특이적인 DNA 염료를 이용할 수 있는데, 전통적인 형광 라벨된 올리고뉴클레오티드가 필요하지 않게 된다. 이중 쇄 특이적인 DNA 염료를 이용하면 매우 적은 복사체 수를 정량화하는데 매우 우수한 증폭 특이성을 요구하는데, 이는 본 발명에 의해 제공되는 것과 같이, 비-특이적인 증으로부터 원하는 생성물을 구별한다는 것을 말한다.

실시예 17

생성물의 순도를 결정하는 본 발명의 방법을 이용하여 이중 쇄 특이적인 DNA 염료의 형광을 변환과정당 1회 모니터하는 것을 근거로 하는 PCR 정량화를 개선시킨다. 일련의 반응을 위한 생성물의 폴리메라제 연장을 정제된 β-글로빈 주형의 초기 농도를 다양하게 한 후에(도 42a), 각 반복과정에서 1회 형광을 얻는다. 실시예 7에서 설명한 것과 같이 β-글로빈 주형 및 증폭 조건을 제공한다. 배경 형광 이상으로 로그-선형 증가는 시작 주형 농도에 따라 반복 변환 과정 회수에서 시작된다. 반응당 10⁶ 내지 10² 복사체 범위의 5개 반응의 플롯은 약 4개 과정으로 분리된다. 반응당 평균 10² 복사체를 가지는 시료에서는 반응 효과가 감소되었고, 시작 복사체의 수가 100개 이하인 반응은 이용할 수 없는 형광 프로파일을 제공한다. 10개와 1(평균) 복사체를 포함하는 반응의 형광 프로파일은 역순서로 발생하고, 음성 기준은 약 30회 후에 증폭을 나타낸다. 이는 프라이머 이량체의 증폭 및 이중 쇄 특이적인 DNA 특이적인 염료의 일회 cycle-by-cycle 형광 모니터에 의해 원하는 생성물로부터 다른 비-특이적인 증폭 생성물을 구별할 수 없기 때문이다.

각 시료에 대해 용융 피크를 얻고(도 42 b), 이는 전기영동 결과와 연관이 있다는 것을 알았다(도 42c). 0개 및 1개 평균 시작 주형 복사체를 포함하는 반응은 예상되는 536bp 위치에 구별할 수 있는 전기영동 밴드를 만들지 못하였다. 10개와 100개 시작 주형 복사체를 가지는 반응은 약한 전기영동 밴드를 나타낸다. 이는 용융 피크 분석과 잘 일치하고, 0개 복사체와 1개 시작 복사체를 포함하는 반응의 원하는 생성물의 범위(90-92℃)에서는 DNA 용융이 없고, 이 온도에서의 작은 피크는 10개와 100개 복사체 범위가 된다. 10³-10⁶ 시작 복사체를 포함하는 반응의 강한 전기영동 밴드는 예측되는 90-92℃ 범위에서 큰 용융 피크와 연관이 있다.

용융 피크 적분을 통하여, 전체 생성물에 대한 원하는 생성물의 비율은 10⁵ 복사체의 경우 0.28에서 시작 복사체의 수가 0인 경우 0.0002까지 이다. 도 41a에서 각 형광 값에 적절한 비율을 곱하면 정확한 플롯을 얻을 수 있다(도 42d에서 "보정된 형광"이라고 명함). 이 과정은 정량화의 효과적인 범위를 시작 주형 복사체의 수가 10개 내지 1개로 연장시켰다.

용융 피크로 비-특이적인 생성물(도 40)으로부터 특정 생성물을 구별할 수 있고, 두 개의 정제된 PCR 생성물을 함께 혼합한 것도 구별할 수 있어(도 41), 한 개의 반응 튜브에서 함께 증폭된 두 개의 특이적인 생성물을 구별하는데 유용하다. 본 발명에 따른 PCR 반응을 지속적으로 모니터함으로써 얻은 용융 곡선은 다중 PCR에 유용하다.

실시예 18

실시예에서, 게놈 DNA로부터 두 개의 유전자 단편을 동시에 증폭시켜, SYBR^TM Green I 형광으로 모니터하였다. 각 증폭 과정동안에 상이한 증폭 생성물이 용융 온도에서 변성되는데, 생성물의 길이, GC 비율 및 당분야에 공지된 다른 인자들에따라 달라진다. 각 생성물이 용융되는 온도는 이중 쇄-특이적인 염료, SYBR^TM Green I으로 모니터한다. 포낭성 섬유증 유전자로부터 81개 염기쌍 단편은 서열 14와 서열 15의 프라이머를 이용하여 증폭하고, 서열 16과 서열 17에서 설명한 프라이머를 이용하여 c-erB-2(HER2/neu) 온코진의 98개 염기쌍을 함께 증폭시켰다.

증폭 반응은 다음과 같이 실행한다; 총 10㎕에서 50mM Tris-HCl, pH 8.3, 3mM MgCl₂, 500㎍/㎖ 소 혈청 알부민, 200μM 각 dNTP, 0.5μM 담낭성 섬유증 프라이머, 0.3μM HER2/neu 프라이머, 1:30,000 희석된 SYBR^TM Green I, 1U AmpliTaq Gold DNA 폴리메라제(Perkin Elmer, Foster City, CA), 50ng 사람 게놈 DNA을 포함한다.

95℃에서 30분간 폴리메라제를 활성화시킨 후에, 시료는 94℃에서 0초(기울기는 20), 55℃에서 0초(기울기는 20), 70℃에서 10초(기울기는 20)를 35회 반복한다. 시료는 70℃로 냉각시키고, 형광은 0.2℃/sec로 94℃까지 지속적으로 얻는다. 용융 곡선(도 43)에서는 78℃(CFTR)와 88℃(neu)에서 두 개의 뚜렷한 생성물이 나타난다는 것을 나타낸다. 두 개의 생성물은 Tm이 약 10℃ 정도 차이가 있고 이는 쉽게 구별을 할 수 있다.

증폭하는 동안에 내부 제어가 필요한 경우에는 다중 증폭이 유용하다. 예를 들면, 구분점의 양단에 프라이머를 위치시켜 PCR에 의해 많은 전치를 감지할 수 있다. 증폭이 일어나지 않는다면, DNA가 고유의 것이고 방해물질이 없는 한 전치가 없다는 것을 나타낸다. 동일한 반응 혼합물에 있는 양성 조절 위치를 증폭함으로써 이와 같은 가능성을 배제할 수 있다. 증폭과 감지를 동시에 내부 조절을 하여 증폭을 최상으로 조절할 수 있다.

실시예 19

본 실시예에서는 실시예 18의 과정을 따르는데 단 30분간 95℃에서 폴리메라제를 활성화시킨 후에, 시료는 94℃에서 0초(기울기는 20), 55℃에서 0초(기울기는 20), 70℃에서 10초(기울기는 20)를 20회 반복한 후에, 94℃에서 0초(기울기는 1), 55℃에서 0초(기울기는 20), 70℃에서 20초(기울기는 20)를 15회 반복한다. 26-31회 과정동안에 70℃에서 94℃로 초당 1℃씩 변환하는 동안에 지속적으로 형광을 얻는다. 용융 곡선은 용융 피크로 전환하고, 이를 나타낸다(도 44). CFTR 단편의 증폭 효과는 neu 단편의 증폭보다는 큰 것으로 보인다. 증폭 효과는 실시예 16에서와 같은 용융 피크 데이터를 적분하여 결정한다.

기준을 참고로 하는 이와 같은 종류의 정량적인 데이터는 많이 응용을 할 수 있다. 예를 들면, HER2/neu와 같은 특정 온코진을 많은 종양에서 in vivo로 증폭할 수 있다. 즉, 게놈 DNA에 유전자가 복제되는데 어떤 경우에는 여러층으로 복제된다. 온코진과 기준 주형의 증폭으로 관련 복사체의 수를 정량적으로 측정할 수 있다. 추가 실시예에서, HIV 또는 헤파타이티스 C에 감염된 환자에 있는 바이러스의 양은 예후 및 치료에 중요하다. 기준 주형을 이용하고, 증폭하는 동안에 기준과 천연 주형 모두의 증폭 효과를 모니터하여, 시작 주형 복사체 수를 정확하게 정량화할 수 있다.

상대적인 정량화를 위한 용융 곡선을 이용하는 본 발명의 특징을 설명할 것이다. 본 발명에 따르면, 용융 곡선의 추가 용도는 PCR을 정량화하는 것이다. 도 42에서는 용융 피크의 아래 면적과 특이적인 생성물간의 상관관계를 나타낸다. 구 가지 생성물이 유사한 효과를 가지고 증폭된다면(또는 상이한 효과를 알고, 이를 보상할 수 있다면), 두 가지 PCR 생성물의 상대적인 정량화가 가능하다. 용융 피크 면적을 적분하여(실시예 16을 참고) 두 가지 생성물의 상대적인 양을 정량하는 것이 본 발명의 한 특징이다.

실시예 20

실시예 18의 담낭성 섬유증과 HER-2-neu 유전자 단편을 증폭하고, 실시예 2에서와 같이 정제하고 이를 175㎍/㎖로 적정하였다. 시료는 다양한 비율(총 8㎕)로 혼합하고, 완충액(1㎕)과 SYBR^TM Green I(1㎕)에 혼합한다. 최종 농도는 50mM Tris, pH 8.3, 3mM MgCl₂, 250㎍/㎖ 소 혈청 알부민, 1:30,000 희석된 SYBR^TM Green I이 된다. 초당 0.2℃에서 용융 곡선을 얻고, 배경 형광를 제거하고, 실시예 16에서 상술한 것과 같이 피크를 적분하였다. 그 결과는 도 45에 나타내었다. 두 가지 생성물의 용융 피크 아래 상대적인 면적과 상대적인 양간에는 뛰어난 상관관계가 있다.

많은 정량적인 PCR 응용에서 두 가지 PCR 생성물의 상대적인 정량은 상당히 중요하다. 두 개 이상의 생성물의 다중 증폭 및 용융 피크아래 면적을 적분하는 것은 이 분야에 매우 유용하다. 가정 유전자의 mRNA의 양에 대해 mRNA를 정량화한다.

상대적인 정량화의 또 다른 중요한 용도는 경쟁적인 PCR 정량화에 있다. 일반적으로 동일한 프라임 부위를 가지나 원래 표적이 되는 서열의 길이와는 다른 경쟁물질을 합성한다. 양을 알고 있는 경쟁물질을 양을 모르는 시료에 타고, 상대적인 정량화를 실행한다. 길이보다는 Tm이 표적 서열과는 다른 경쟁물질을 만든다. 이들의 용융 피크아래 면적을 비교함으로써 생성물의 상대적인 양을 정량화한다. 생성물중 한 가지의 양을 알고 있기 때문에, 원래 표적이 되는 물질의 양을 얻을 수 있다. 용융 피크 방법을 이용하면, 현재 각각의 양을 모르는 시료에 대해 다수의 튜브를 사용하고, 반응 동안에 다양한 반복 과정에서 튜브를 당겨 반응의 로그-선형 부분을 찾는 등의 현재 이용하는 방법보다 휠씬 쉽게 할 수 있다. 두 가지 생성물의 상대적인 양을 결정해야한다. 통상 이는 방사능동위원소로 dNTPs중 하나에 라벨링하여 아가로즈 겔 전기영동후에 각 밴드에 결합된 라벨의 양을 파악하여 이루어진다. 비교를 위해, 본 발명은 반응을 지속적으로 모니터 하여, 증폭의 로그-선형 부분을 쉽게 확인할 수 있게 한다. 용융 피크를 적분하여 상대적인 정량화를 신속하게 할 수 있다. 하루 종일 걸리는 공정을 한 시간으로 줄일 수 있다.

전술한 내용으로부터, DNA 증폭하는 동안에 형광을 모니터하는 것은 상당히 분석학적으로 뛰어난 기술이라는 것을 알 수 있을 것이다. 서열-특이적인 감지와 정량화를 원하는 경우에는, 이중 쇄 특이적인 DNA 염료를 이용하는 대신에 공명 에너지 전달 프로브를 이용한다. 한 개의 염기가 잘못 짝을 이룬 경우(mismatch가 있을 때), 하이브리드 프로브의 Tm은 4-8℃ 이동된다. 하이브리드 프로브가 돌연변이 부위에 있는 경우에 프로브 용융 온도의 변이로써 한 개의 염기 돌연변이를 감지할 수 있다.

실시예 21

인자 V Leiden 돌연변이는 아미노산 잔기 506(R506Q)에서 아르기닌 잔기가 글루타민 잔기로 치환된(G →A) 한 개의 염기가 변화된 돌연변이다(R.M. Bertina et al., Mutation in Blood Coagulation Factor V Associated with Resistance to Activated Protein C, 369 Nature 64-67 (1994) and J. Voorberg et al., Association of Idiopathic Venous Thromboembolism with a Single Point-Mutaion at Arg⁵⁰⁶ of Factor V, 343 Lancet 1535-36(1994)). 여기에서 사용된 바와 같이, "인자 V Leiden 돌연변이"란 야생형의 구아닌 염기가 인자 V Leiden 돌연변이에서는 아데닌 염기로 치환된 인자 V 유전자에 뉴클레오티드 위치를 말한다. 서열 9에서는 야생형 인자 V Leiden 유전자를 나타내고, 서열 10에서는 각 경우에서 31위치에 관련 뉴클레오티드를 가진 인자 V Leiden 유전자의 상응하는 위치를 나타낸다. 인자 V 유전자의 완전한 뉴클레오티드 서열은 R.J. Jenny et al., Complete cDNA and Derived Amino Acid Sequence of Human Factor V, 84 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 4846-50 (1987)에 설명을 하고 있고, 서열은 Genbank locus HUMF10에서 구할 수 있다. 돌연변이 인자 V 단백질에서 아미노산 변화는 이와 같은 응혈 인자가 분해에 저항성을 가지도록 하여 응혈 및 혈전증이 증가되는 경향을 가진다. 유전적인 혈전기우병(전우병)의 가장 흔한 원인이기 때문에, 이와 같은 돌연변이는 임상 분자유전학 실험실에서 실행되는 통상적인 실험실 테스트의 표적이 된다.

인자 V Leiden 돌연변이용 분석을 위한 표준 방법은 PCR에 의해 유전자 다편을 증폭시키고, 증폭된 생성물을 야생형 서열은 절단하지만 돌연변이 서열은 절단하지 않는 엔도뉴클레아제로 처리하고, 겔 전기영동에 의해 절단된 야생형과 절단안된 돌연변이 생성물을 분리한다(R.M. Bertina et al., supra.). 이는 한정된 돌연변이를 분석하는데 당분야에 공지의 방법이다. 이와 같은 테스트는 통상적으로 약 4시간이 소요되는데, 구체적으로는 PCR 증폭(2시간), 효소 절단(1시간) 및 전기영동(1시간)으로 이루어진다. 증폭후의 단계는 시료 튜브를 개방하고, 효소를 첨가하고, 절단된 시료를 전기영동 장치로 옮기는 것으로 구성된다. 증폭 후 처리 과정은 최종 생성물의 오염 위험을 증가시키고, 시료에 잘못 라벨링을 하는 등의 수작업에 상당한 주의를 요한다. 점 돌연변이를 증폭시키고 동시에 분석하는 방법에서는 이와 같은 문제점을 배제한다.

동일한 기구에서 30분 이내에 인자 V Leiden 돌연변이를 완전하게 증폭시키고 분석하는 방법은 돌연변이 위치를 포함하는 사람 게놈 DNA의 일부분을 비대칭적으로 증폭시키고, 증폭된 DNA의 용융 곡선을 얻고 이를 분석하는 것으로 구성된다. 공지의 방법에 따라 가령, J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed., 1989)에 따라 게놈 DNA를 준비한다. 적절하게는 상기 설명한 것과 같이 형광 하이브리드 프로브를 이용하는 공명 에너지 전달 방법에 의해 용융 곡선을 얻는다. 이와 같은 검사는 상동접합성 야생형, 상동접합성 돌연변이 및 이형접합성 유전자형간에 쉽게 구별할 수 있도록 한다. 적절한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 플로레신으로 3'에 라벨을 하고, 공명 에너지 전달을 위해 Cy5-라벨된 프라이머의 부근에 증폭된 DNA에 하이브리드하도록 만든다. 이 방법은 임의 다른 정의된 돌연변이에 적용시킬 수 있다.

프로브 올리고뉴클레오티드는 그 길이가 약 15-40 뉴클레오티드 잔기가 적절하다. 프로브는 약 10개 뉴클레오티드 잔기는 최소한 포함해야 한다. 그러나, 이와 같은 짧은 뉴클레오티드는 특이성이 낮고, 용융 온도가 낮고, 배경이 증가한다는 단점을 가진다. 40개 잔기이상의 올리고뉴클레오티드를 이용할 수도 있지만, 이는 필요이상으로 가격이 비싸다. 따라서, 프로브 올리고뉴클레오티드의 크기에 제한을 두는 것은 기능성에 중점을 둔 것이기 때문이다. 프로브 올리고뉴클레오티드는 돌연변이를 잴 수는 있지만, 돌연변이는 프로브의 5' 또는 3' 말단 뉴클레오티드 잔기에 상응하지 않는 것이 바람직하다. 본 발명은 용융 곡선에 근거를 두기 때문에, 말단에 염기쌍의 부족이 내부 위치에 부족한 것보다는 용융 곡선에 영향이 적다는 것을 알고 있어, 돌연변이이 내부 위치에 발생하도록 프로브를 고안한다.

선택된 돌연변이 위치를 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 길이는 적절하게는 약 15 내지 30개 잔기가 된다. 적절한 범위보다 짧은 프라이머를 이용할 수는 있지만, 원하는 정도의 특이성을 가지지는 못한다. 유사하게, 적절한 범위를 넘는 프라이머도 이용할 수는 있지만, 필요이상으로 가격이 비싸다. 따라서, PCR 프라이머의 크기에 제한을 두는 것은 기능성에 중점을 두었기 때문이다.

공명 에너지 전달 쌍간에 거리는 본 발명의 적절한 기능을 위해 중요하다. 공명 에너지 전달 쌍간에 최적의 거리는 약 5개 뉴클레오티드 정도가 된다. 거리는 약 10-15개 뉴클레오티드 까지 기능을 할 수는 있지만, 약 2 내지 8개 뉴클레오티드 정도의 거리가 바람직하다. 인접 뉴클레오티드에 공명 에너지 전달 쌍을 가지는 것이 반드시 유익한 것은 아닌데, 그 이유는 DNA 이중 나선에서의 위치가 공명 에너지 전달 쌍간의 거리에 영향을 주기 때문이다.

본 실시예에서, PCR 증폭은 다음과 같은 구성으로 된 10㎕ 반응 혼합물에서 실시한다; 50mM Tris, pH 8.3, 3mM MgCl₂, 500㎍/㎖ 소 혈청 알부민, 200μM 각 dNTP, 0.5μM Cy5-라벨된 프라이머(서열 11), 0.2μM 라벨안된 반대 프라이머(서열 12), 0.1μM 플로레신-라벨된 프로브(서열 13), 0.4 U Taq 폴리메라제, 50ng 사람 게놈 DNA. 네 가지 다른 DNA 시료를 테스트 하였다; 인자 V Leiden 돌연변이에 상동접합자인 개체의 사람 게놈 DNA; 이형접합자인 개체의 사람 게놈 DNA; 야생형 인자 V 대립유전자에 상동접합자인 개체의 사람 게놈 DNA; DNA가 없는 음성 기준. Cy5-라벨된 프라이머, 플로레신-라벨된 프로브, 돌연변이 위치(*로 표시)위 방향은 다음과 같다;

라벨 안된 반대 프라이머의 서열은 TGTTATCACACTGGTGCTAA(서열 12)이고, 증폭된 생성물은 길이가 186bp이다. 실시예 8에서와 같이 Cy5-라벨된 프라이머를 얻는다. 온도 변환 과정은 다음과 같다; 94℃에서 0초(기울기=20), 50℃에서 10초 (기울기=20), 72℃에서 0초(기울기=1)를 50회 한다. 비록 50℃와 94℃ 범위에서 초당 1℃ 변환속도로 각 변환과정 동안을 모니터하면 분명하게 유전자형을 확인은 할 수 있지만(도 47), 느린 온도 변환 속도(초당 0.2℃-도 46)로 증폭 종료 즘에 최상의 용융 곡선을 얻는다. 온도와 온도에 대한 마이너스 형광 변화(-dF/dT vs T)를 플롯하면 용융 곡선을 가장 쉽게 볼 수 있다. 이와 같은 방식으로 원래의 형광 데이터로부터 모든 가능한 유전자형을 쉽게 확인할 수 있다.

Cy5 라벨에 근접하게 프라이머 3'-단부가 있을수록, 공명 에너지 전달 시그날이 커진다. 그러나, 3'-단부에는 반드시 폴리메라제 연장을 위한 자유 3'-하이드록실 기를 가지고 있어야 하고, 3'-단부 너무 가까이에(또는 3' 또는 두 번째 염기에) Cy5가 있으면, 폴리메라제의 부착을 방해하여, 폴리메라제에 의한 연장을 방해하게 된다. 3'-플로레신 프로브는 가능한 한 프라이머에 근접하게 하이브리드를 해야하고(1-3개 염기 점도가 겹쳐지는 것은 허용할 수 있다), 돌연변이 부위 프로브의 중앙 부근에 있어야 한다. 하이브리드된 형광단간에 5개 염기가 있고, 23-mer 프로브의 염기 8에 돌연변이가 있으면 용융 곡선은 돌연변이와 야생형 서열간에 8℃의 용융 곡선 이동이 있다(도 46).

한 개의 라벨된 프로브와 한 개의 라벨된 프라이머를 이용하는 대신에 2개 라벨된 프로브를 이용하여 프로브 용융에 의한 돌연변이를 감지할 수 있다. 본 구체예에서, 한 개 프로브는 Cy5로 5'라벨을 하고, 다른 프로브는 플로레신으로 3'라벨을 한다. 이들 두 개 형광 프로브는 아미다이트로부터 바로 합성을 할 수 있고, 프라이머/프로브 시스템에 있는 경우에는 손으로 작업하는 단계가 필요없다. 돌연변이 위치를 플로세신-라벨된 프로브의 중앙 근처에 위치하도록 플로레신-라벨된 프로브를 만든다. 돌연변이 위치에 걸치는 플로레신-라벨된 프로브보다 Cy-5 라벨된 프로브가 높은 온도(5℃ 이상)에서 용융 되도록, Cy5-라벨된 프로브 길이를 조절한다. 플로레신으로 인한 배경이 Cy5로 인한 배경보다 다소 문제가 있기 때문에, Cy5-라벨된 프로브의 농도는 플로레신-라벨된 프로브의 농도보다는 약 2-5배 높게하는 것이 바람직하다. 두 개의 프로브는 게놈 DNA의 동일한 쇄에 하이브리드해야 하고, 공명 에너지 전달 쌍은 약 0개 내지 5개 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어야 한다. 또는, 돌연변이 위치에 걸치는 프로브에 Cy5로 라벨을 할 수 있고, 다른 프로브에 플로레신으로 라벨을 할 수 있다.

인자 V Leiden 돌연변이를 감지하기 위해 여기에 상술하고 있는 특정 프로브와 프라이머는 단순히 설명을 하기 위함이고, 당업자는 실험없이도 여기에서 제시하는 원리와 안내에 따라 돌연변이를 감지하기 위한 다른 프로브와 프라이머를 고안할 수 있을 것이다. 또한 본 발명은 게놈 DNA에 있는 단일 염기에 돌연변이를 감지하는 거세 대해 설명을 하고 있지만, cDNA에 있는 돌연변이를 감지하는데에도 동일한 원리를 적용시킬 수 있다는 것을 인지할 것이다. DNA를 준비하는 것은 상당한 공정 단계와 시간을 요한다는 것은 공지된 바이고, 따라서 시간 및 비용이 절감되기 때문에 게놈 DNA를 이용하는 것이 바람직하다. 또한 동일한 기술을 이용하여 돌연변이 또는 다형성이 있을 때, 용융 온도가 변화되도록 하이브리드 프로브를 만들면, 삽입 또는 결손을 감지할 수 있다. 본 발명을 이용하여, 야생형에 대해 돌연변이에 하이브리드될 때 용융 온도가 변화되도록 프로브를 만들면 임의 공지의 돌연변이를 감지할 수 있다.

절술한 실시예에서 플로레신 및 Cy5를 공명 에너지 전달 라벨로 이용하였지만, Cy5.5와 같은 다른 수용체들도 플로레신과 함께 이용을 할 수 있다.

실시예 22

실시예 21의 인자 V 위치를 증폭시키는데 단, 프라이머는 Cy5 대신에 Cy5.5로 라벨을 한다. Cy5.5 방출은 683㎚ 롱 패스 이색 필터와 683-703㎚ 밴드패스 건섭 필터를 통하여 Cy5.5 방출을 관찰한다. 약 30회때에는 Cy5.5에 대한 플로레신의 비율이 배경이상으로 증가되고, 비대칭 증폭 50외때에는 비율이 거의 두 배가 된다. 야생형 DNA로 증폭시켰을 때, 프로브의 Tm은 용융 피크로 판단하였을 때, 65-66℃이다.

단일 염기 돌연변이를 감지하는 또 다른 실시예에 대해 설명을 한다.

실시예 23

메틸렌테트라하이드로폴레이트 환원효소(MTHER) 유전자(C₆₇₇T)에서 알라닌이 발린 잔기로 변환되어 열에 불안정한 효소가 되는 흔한 점 돌연변이이다. 이와 같은 돌연변이는 MTHFR 활성을 감소시키며 호호시스테인 혈장 수준을 상승시켜, 본 기술분야에 공지된 바와 같이 초기 맥관 질환 및 혈전증 등의 위험인자에 복합되어 있다. 프라이머중 하나는 Cy5로 라벨된 Cy5-(TGAAGGAGAAGGTGTCT^*GCGGGA)(서열 25)이고, 이때 T^*는 Cy5에연결된 변형된 T 잔기(정제 및 헙성에 대한 실시예 9를 촘고)이다. 프로브 서열은 플로레신이 라벨된 플로레신-CCTCGGCTAAATAGTAGTGCGTCGA(서열 26)이고, 다른 프라이머는 AGGACGGTGCGGTGAGAGTG(서열 27)이다. MTHER 유전자의 198bp 단편은 다음과 같은 조건에서 증폭된다; 50mM Tris, pH 8.3, 2mM MgCl₂, 500㎍/㎖ 소 혈청 알부민, 0.2mM 각 dNTP, 0.5μM Cy5-라벨된 프라이머, 0.1μM 반대 프라이머, 0.1μM 플로레신-라벨된 프로브, 10㎕당 0.4 U Taq DNA 폴리메라제 10㎕에 50ng 사람 게놈 DNA. 각 온도 변환과정은 30초 동안인데 이는 94℃에서 변성하고, 60℃에서 어닐링/연장 복합단계로 구성된다. 단계간의 온도 전이율은 초당 20℃이다. 60회 후에, 다음과 같이 용융 곡선을 얻을 수 있다; 초당 0.5℃로 50-60℃, 초당 0.1℃로 65-75℃, 초당 0.5℃로 75-94℃로 가열을 한다. 기저치를 빼고, 용융 피크로 전환한 후에, 모든 가능한 유전자형을 쉽게 구별할 수 있다(도 48).

하이브리드 프로브의 분별력을 이용하면 다중 또는 복합 PCR에 상당한 장점을 제공한다. 예를 들면, 한 개의 내부 염기 변화를 가지도록 인공 주형을 만들고, 실시예 21과 23에서와 같이 염기 변화를 커버할 수 있도록 하이브리드 프로브를 만든다. 실시예 16에서와 같이 용융 피크를 얻고 이를 적분하여, 경쟁물과 천연 주형의 상대적인 증폭을 결정한다. 또는, 상이한 온도에서 상이한 표적이 연속적으로 용융되는 다중 감지 프로브를 이용하는 경우에, 동일한 분석으로 상대적인 양을 얻을 수 있다. 일반적으로, 이중-쇄-특이적인 DNA 염료에 대해 기존의 임의 정량화 기술을 이용하여 하이브리드 프로브와 함계 특정 서열를 만든다.

생성물의 재-어닐링 역학을 이용하여 생성물의 절대 농도를 측정 ; 본 발명을 이용하여 생성물의 농도를 유익하게 결정할 수 있다. 이중 쇄 DNA 형성을 지속적으로 모니터하여, 재-어닐링 역학으로 임의 증폭 과정에서 DNA를 정량화할 수 있다. 시료의 온도를 변성 온도로부터 갑자기 떨어지게 하고, 프라이머 어닐링을 방지할 수 있는 충분한 온도의 낮은 온도에서 유지시킨다(도 2). 생성물 재-어닐링의 속도는 2차 반응 속도이다(B. Young & M. Anderson, Quantitative analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach 47-71 (B. Hames & S. Higgins, eds., (1985)). 임의 주어진 PCR 생성물 및 온도에서, 2차속도 상수를 측정할 수 있다. 일단 속도 상수를 알면, 실험을 통한 재-어닐링 데이터로부터 임의 농도를 모르는 DNA의 농도를 알 수 있다. 냉각은 순간적인 것이 아니고, 일정 온도에 도달하기 전에 일부 재-어닐링이 발생할 수도 있다. 신속하게 냉각하면속도 상수 및 DNA 농도 결정에 이용할 수 있는 데이터의 양을 최대로 할 수 있다. 이 기술에는 순수 정제된 PCR 생성물을 요구하나, 이는 본 발명을 이용한 온도 변환 과정동안에 수득한 용융 곡선에 의해 이를 확실하게 할 수 있다.

본 발명의 정량화 방법은 시료간에 임의적인 시그날 강도의 변화에 무관하다는 장점이 있다.

실시예 24

사람 게놈 DNA(실시예 7)과 정제된 DNA(실시예 2)로부터 β-글로빈 536bp 단편을 증폭시켰다. 상이한 양의 정제된 DNA를 5㎕ 50mM Tris, pH 8.3, 3mM MgCl₂에 있는 1:30,000 희석된 SYBR^TM Green I에 혼합시킨다. 시료는 94℃에서 변성시키고, 신속하게 85℃로 냉각시킨다. 520-550㎚에서의 형광을 85℃에서 모니터한다. 농도가 다른 여러 가지 DNA를 테스트하는 경우에, 재-어닐링 곡선의 모양은 DNA 농도에 따른 특징을 가진다(도 49). 임의 주어진 PCR 생성물 및 온도에서 2차 반응 속도 상수를 결정한다. 도 50에서는 85℃에서 5㎕에 있는 536bp 단편 100ng에 대한 2차 재-어닐링 속도 상수를 결정하는 것을 나타낸다. 곡선은 도 50에 나타낸 2차 반응 식을 이용하여, 플로오팅 변수로 F_max, F_min, t₀, k와 함께 비-선형 최소 자승 회귀분석으로 만든다. 이와 같은 곡선을 만드는 분석 프로그램은 당 분야에 공지되어 있다(the user defined curve fit of Delta Graph. DeltaPoint, Inc, Monteray, CA). 일단 속도 상수를 알면, 실험에 의한 재-어닐링 데이터로부터 농도를 모르는 DNA의 농도를 결정할 수 있다.

정의된 속도 상수(k)로, 모르는 시료에 DNA 농도를 결정한다. 실제 시간에서 온도변환 과정동안에 비-선형 최소 자승 회귀분석을 이용하여 모르는 시료의 시간에 대한 형광 곡선을 만든다(예를 들면, in the LabView programming environment, National Instruments, Austin, TX에서 설명하는 비-선형 Levenberg-Marquardt 방법). 곡선을 만드는데, F_max, F_min, t₀와 [DNA]는 플로오팅 변수이고, k는 상수이다.

일부 형광 염료가 농도에 따른 방식으로 재-어닐링에 영향을 주기 때문에, 생성물의 재-어닐링의 2차 반응 속도 가설은 농도가 다른 표준 DNA에서 속도 상수를 결정하여 점검할 수 있다. 관계를 정의하고, 필요에 따라 또 다른 적용 식을 결합시킬 수 있다.

본 발명의 범위내에는 또는 생성물의 농도를 결정하는데 프로브 어닐링 속도를 이용한다. 형광 공명 에너지 전달 속도는 프라이머 어닐링 온도보다는 높은 프로브 어닐링 온도로 온도를 떨어뜨린 후에 이어진다(도 2). 프라이머로 라벨한 것과 한 개는 프로브로 라벨된 증폭의 경우에, 어닐링 속도(및 형광 발생 속도)는 2차 함수이다. 두 가지 라벨된 프로브를 이용하는 경우에, 형광 발생 속도는 3차 함수이다. 이들 두 가지 배열은 도 18에 나타내었다. 프로브의 농도가 생성물의 농도 보다 클 때, 가능성을 설명하는데에는 모의 1차 식 및 모의 2차 식을 이용하는 것이 적합하다. 이와 같은 다른 조건에 맞는 적절한 속도 식은 당 분야에 공지되어 있다(Young, B. and Anderson, M., supra). 본 발명의 목적을 위해, 선행 기술에서 제시하는 적절한 반응 속도 식은 필요에 따라서는 실험적으로 테스트하고, 교정하는 것이 바람직하다.

프로브 어닐링 속도를 이용하여 생성물 농도를 결정할 때, 가능한 간섭 효과에는 생성물 재-어닐링(분지 이동으로 프라이머 치환) 및 프라이머 어닐링 및 프로브를 통한 연장을 포함한다. 프로브의 Tm이 프라이머의 Tm보다 높은 경우에 이를 최소화할 수 있고, 프라이머 어닐링을 최소화하기 위해 프로브 어닐링 온도를 선택한다. 도 13에서는 연장이 일어나더라도, 형광은 약 20초간 증가된다는 것을 나타낸다. 이 기간동안에, 형광은 생성물 농도에 따라 증가된다.

프로브 어닐링 속도를 이용하여 생성물 재어닐링에 의한 생성물의 농도를 결정하는 전술한 방법과 유사하게 생성물의 농도를 결정한다. 그 방법을 요약하면 다음과 같다; (1) 시스템에 적합한 적절한 반응 식을 선택하고; (2) 속도 상수를 결정하기 위해 공지의 DNA를 이용하여 실시하고; (3) 다른 농도에서 유도한 상이한 속도 상수를 비교하여 속도 반응식의 유효성을 점검하고; (4) 속도 상수를 이용하여 이들의 프로브 어닐링 데이터를 이용하여 농도를 모르는 DNA 농도를 결정한다.

온도 변환 과정을 제어하기 위한 형광 피이드백 방법 ; 종점 cycle-by-cycle 분석과는 대조적으로, 본 발명은 각 온도 변한 과정을 통하여 형광을 모니터할 수 있다. 지속적으로 형광을 모니터하여 온도 변환과정 변수를 조절할 수 있다. 본 발명은 실제 시간 조절 및 증폭을 최적하시키기 위해 형광 피이드백을 이용한다. 이중-쇄-특이적인 DNA 염료 또는 형광 라벨된 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 PCR 시료에 지속적으로 형광을 모니터하는 방법을 이용하여, 개별 증폭 과정동안에 하이브리드와 용융을 모니터한다. 이와 같은 정보는 온도 사이클러 기구내에 온도 제어 알고리즘에 이용하여 열 변환 과정 조건을 개선하고, 요건에 맞게 만든다. 증폭시키기 전에 모든 변환과정 변수를 프로그램하여 통상적인 PCR을 실행한다. 지속적으로 모니터하면서, 증폭하는 동안에 어닐링, 연장, 변성 등을 지속적으로 관찰한 것에 근거하여 온도 변환과정의 요구사항을 결정한다. 온도과정을 제어하기 위한 하이브리드 정보를 이용하는 장점은 다음과 같다;

1. 각 온도변환과정동안에 PCR 생성물을 완전하게 변성시킬 수 있는데,

이때, a) 상당히 높은 변성 온도에 노출을 최소화시켜, 증폭 생성물 및 폴리메라제에 열에 의한 손상을 피하게 한다. 변성 온도에 노출되는 시간을 제한하는 것은 긴 생성물을 증폭하는데에는 특히 유용하다.

b) 변성 온도를 최소화시켜 반응 특이성을 증가시킨다. 이는 원하는 증폭 생성물보다 높은 Tm을 가진 생성물에 반하는 선택이다.

2. 각 온도변환과정에 프라이머 어닐링에 적절한 시간을 확인하여 증폭 효과를 최대화시키는데,

이때, a) 프라이머 어닐링의 특정 효과에 도달하는데 필요한 것보다 더 긴 시간을 허용하지 않음으로써 증폭에 필요한 시간을 최소로 하고;

b) 어닐링 온도에서 시간을 최소화시켜 반응 특이성을 강화시킨다.

3. 각 온도 변환 과정동안에 생성물의 연장에 필요한 시간을 확인하여 증폭 효과를 최대로 하는데

이때, a) 생성물 연장을 완료하는데 필요한 시간을 초과하는 것을 허용하지 않아 증폭에 필요한 시간의 양을 최소화시키고;

b) 원하는 증폭 생성물보다 더 긴 생성물에 대비하여 선택을 함으로써 반응 특이성을 강화시킨다. 이와 같은 것들은 생성물의 연장을 완성하기 위해 할당된 시간보다 더 많은 시간을 요구한다.

4. 초기 열 변환 과정은 수득된 형광 또는 현재 증폭 효율에 따라 변화된다. 예를 들면, 과-증폭 및 비특이적인 반응 상성물은 효과를 특정 수준으로 감소시켰을 때, 열 처리 과정을 종료시켜 최소화할 수 있다. 또 다른 예로써, 온도 과정을 변형시켜 형광이 감지되기 시작할 때 용융 곡선을 얻기위한 느린 온도 램프를 개시한다. 이는 시간을 절감시키는데 그 이유는 초기 변환과정에서는 느린 램프를 이용할 필요가 없기 때문이다. 본 발명의 실행에서 다른 바람직한 변화를 알 수 있을 것이다.

형광 데이터로부터 나오는 반응 변수를 평가하여 제어할 수 있다. 고유 형광 데이터는 시간에 따른 형광의 변화(변성, 어닐링, 연장의 온도 특이적인 속도), 온도에 따른 형광의 변화(생성물 또는 프로브의 Tm) 또는 증폭정도의 변화(증폭 스득율 및 효과)등으로 얻을 수 있다. 이들 속도, Tm 및 제 1 유도체 및 제2 유도체를 이용하면 최적 반응 변수를 얻을 수 있는데, 여기에는 변성 온도, 시간, 프라이머 어닐링 온도 및 시간, 프로브 어닐링 온도 및 시간, 효소 연장 온도 및 시간, 변환과정의 횟수 등을 포함한다.

이중-쇄-특이적인 DNA 염료를 이용하여 변성 및 연장을 제어하고, 특정 증폭 수준 또는 효과에서 열 변화과정의 변화를 시작한다. 공명 에너지 전달 염료를 이용하여 어닐링을 제어할 수 있다.

실시예 25

시판되는 형광 모니터용 열 변환과정기(LC24 LightCycler, Idaho Technology Inc., Idaho Fails, Idaho)를 변형시켜, 소프트웨어에 온도/시간 세트포인트가 프로그램되어 있지 않도록 하고, 형광 값을 얻도록 프로그램하여, 열 변환과정 제어용으로 이들 값을 이용한다.

Functional Block Diagram(도 51)에서 설명하는 것과 같이, Run-Time Program은 시리얼과 LightCycler가 있는 DAQ-board interfaces와 통신한다. 이로써 온도 또는 형광에 높은 수준으로 접근할 수 있고, 어느 것이든 온도 제어를 위한 Board-level Software를 이용한다. 그러나, 본 발명의 구체예에서는 온도 데이터만을 Controller Hardware level에서 디지탈 형식으로 변환시킨다.

생성물 용융 조절

원하는 PCR 생성물에서 용융 피크를 얻고, 기저 형광은 생성물이 완전하게 용융된 온도에서 반응 칵테일을 포함하는 시료에서 얻는다.

그 다음 각 반응의 온도변환과정은 표적으로 이와 같은 형광 값을 이용한다. 시간-정체를 피하기 위해, 생성물 변성에 접근하는 것은 두 단계로 이루어지는데 그 이유는 분석을 위한 멀리 떨어진 컴퓨터에 형광 값을 보내고 이 값이 는데 필요한 시간이 정체되는 것이다. 각 생성물의 용융 단계에서, 형광이 중간 값에 도달할 때까지 온도가 증가되고, 가열력은 감소되어, 약 초당 3℃의 온도 램프 속도는 컴퓨터 시간에 형광을 분석하고, 생성물 변성이 일어난 열 사이클러에 시그날을 보낸다.

생성된 온도/시간 플롯에서는 증폭 생성물의 농도가 증가될 때 변환과정 20회 후에 용융 온도가 증가되는 특징을 나타낸다. 생성물 Tm은 생성물 농도에 대한 함수이다.

생성물 어닐링/연장

어닐링/연장 온도서 연장동안에, 형광을 모니터하고, 이 정보를 이용하여, 적절한 그러나 생성물의 연장에 허용되는 시간을 초과하지는 않는 시간을 확인한다. 10초 간격으로 형광을 모니터하는데, 설정할 수 있는 비율(일반적으로 1.00-1.05)이상으로 형광이 증가되면, 어닐링/연장 단계를 지속한다. 그렇지않으면, 그 다음 생성물 용융 단계를 개시한다. 간격을 10초로하면, 어닐링/연장 복합온도에서 최소 20초를 제공한다.

생성 형광/시간 플롯(도 52)에서는 증폭 생성물이 증가될 때 어닐링/연장 복합 온도에서 잔류 시간이 증가되는 특징을 가진다. 프라이머 농도와 폴리메라제 를 제한하기 때문에, 각 반복과정에서 생성물의 연장을 완료하기 위해서는 더 많은 시간을 필요로 한다.

증폭 평탄부

각 어닐링/연장 단계 종류시에, 형광 값을 얻고 이를 보관한다. 이 값이 최저 과정의 종료시의 형광 값의 1.2배로 증가되고 사용자의 설정가능한 비율(일반적으로 1.00-1.02)이하로 증가되는 것이 갑자기 멈추면, 열 변환과정은 종료된다. 도는, 용융 곡선 수득 단계는 생성물의 Tm을 통하여 초당 0.1-0.2℃의 느린 온도 램프로 들어가, 시료의 형광을 지속적으로 모니터하여 개시한다.

생성 형광/시간 플롯(도 52)에서는 32회 증폭 과정 후에, cycle-by-cycle 형광 증가 비율이 1.00이하가 되고 반응이 종료된다는 것을 나타낸다.

본 발명의 한 구체예에서, 증폭 평탄부 감지를 이용하면, 각 시료의 최적 온도 변환과정에서 실시한 다중 시료에 있는 각 시료의 고-해상도 용융 곡선을 얻을 수 있다. 시료가 이의 증폭 평탄부에 도달하였을 때, 해당 시료에 대한 용융-곡선을 얻고, 그 다음 또 다른 반응이 그의 증폭 평탄부에 도달할 때까지, 규칙적인 온도 과정을 다시 시작한다.

본 발명은 실제 시간 모니터와 연장과는 별개의 어닐링을조절할 수 있다. 프라이머중 한 개는 Cy5가 3'단부에 라벨되어 있고, 연장은 일어나지 않는다. 그러나, 라벨된 프라이머(1-10%)를 라벨안된 프라이머(90-99%)와 혼합한다면, 증폭 효과는 약간 감소하나 이중-쇄 특이적인 염료에서 Cy5로의 형광 에너지 전달로 어닐링이 관찰될 수 있다. 최저 Tm(본 기술분야에 공지된 가장 인접한 이웃 열역학에 의해 결정함)을 가지는 프라이머는 Cy5로 라벨하고, SYBR^TM Green I은 이중-쇄-특이적인 염료로 포함될 수 있다. 또는 프라이머 어닐링은 등가의 상보적인 올리고뉴클레오티드로 간접적으로 모니터할 수 있다. 최저 용융 프라이머로써 같은 길이와 Tm의 올리고뉴클레오티드는 증폭된 서열에 상보성이 없도록 한다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 Cy5로 5'라벨된 것이고 이의 상보적인 것은 플로레신 또는 다른 공명 에너지 전달 쌍의 것으로 3'라벨된다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드의 하이브리드 다음에 공명 에너지 전달이 이어진다. 한 개 프로브의 농도는 Tm가 가장 낮은 프라이머의 것과 같도록 하고, 다른 프로브의 농도는 더 낮게 하여, 생성물에 프라이머가 어닐링되는 모의-1차-반응에 근접하는 모의-1차-역학을 얻는다. 어닐링의 효과를 모니터하고, 이를 이용하여 어닐링 온도 및 시간을 이 방법들중 한 가지 방법으로 조절한다.

또한 형광 피이드백 제어로 전체적으로 온도 및 시간 세트포인트를 대체하는 것도 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들면, 세 가지 시료를 피이드백 능력이 있는 형광 온도 사이클러에 넣는다. 시료는 다음과 같다;

1. 증폭된 생성물과 SYBR^TM Green I을 포함하는 비-반응 시료;

2. 전술한 최저 Tm 프라이머와 농도가 동일한 Tm을 가지는 상보적으로 형광이 라벨된 프라이머를 포함하는 비-반응 시료;

3. 증폭될 시료와 SYBR^TM Green I.

각 증폭과정으로, 온도를 증가시켰을 때, 시료 1을 모니터하여 생성물의 변성을 확인한다. 용융 곡선은 실제 시간으로 결정하고 시료가 변성되었을 때, 어닐링 단계로 전이가 시작된다. 프라이머 어닐링은 시료 2에 있는 두 개의 상보적인 프라이머의 하이브리드를 통하여 간접적으로 모니터한다. 프라이머중 한 개은 플로레신으로 3'라벨을 하고, 다른 하나는 Cy5 또는 유사한 염료를 이용하여 5'에 라벨을 한다. 시료 2에서 670㎚/540㎚에서 형광 비율이 증가되면 프라이머 하이브리드를 나타낼 때까지 온도를 감소시킨다. 이들이 하이브리드될 때 형광단간에 공명 에너지 전달로 인하여 이 비율이 증가된다. 실시예 25에서 설명을 한 것과 같이 실제 시료의 형광을 모니터하면, 생성물의 연장이 이어진다.

요약 : 전술한 논의로 부터, 하이브리드를 모니터하기 위해 DNA 증폭하는 동안에 지속적으로 형광을 모니터하는 것은 상당한 분석 기술이 된다. 여기에서 설명을 하는 방법을 이용하고, 존재하는 초기 주형 복사체의 수에 따라서, 생성물 확인 및 정량화는 온도 과정이 시작된 후에 5 내지 20분이내에서 얻을 수 있다. 본 발명은 본 기술 분야에서 이용할 수 없는 몇 가지 장점을 가진다. 예를 들면, 본 발명은 생성물의 순도를 모니터하는데 단색 형광 방법을 이용하고, 다중 PCR 또는 경쟁 PCR에서의 관련 정량화, 재-어닐링 역학에 의한 절대적인 생성물의 정량화 및 반복과정 수에 대한 형광을 플롯하여 시작 주형의 정량화를 개선하는 등을 제공한다. 본 발명 또한 서열 변화 감지를 위한 이중 색, 서열 특이적인 방법, 다중 PCR 또는 경쟁 PCR에 의한 관련 정량화, 프로브 어닐링 역학에 의한 생성물의 정량화 및 반복과정 수에 대한 형광으로 시작 주형의 정량화 등을 제공한다.

다음의 표는 지속적으로 PCR을 모니터하는데 유용한 이중-쇄 특이적인 DNA 염료, 가수분해 프로브, 하이브리드 프로브를 비교한 것이다. 이중-쇄 특이적인 DNA 염료의 형광은 DNA의 쇄 상태에 따라 달라진다. 이중-라벨된 가수분해 프로브는 퀸칭되고, 프로브가 하이브리드되면, 고유 제공체 형광이 증가된다. 하이브리드에 2개의 형광단이 서로 근접할 때 하이브리드 프로브는 증가된 공명 에너지 전달에 따라 달라진다.

[표 1]

PCR을 지속적으로 모니터하기 위한 형광 프로브 요약

	형광 프로브
	dsDNA 염료	가수분해	하이브리드
메카니즘	쇄 상태	퀸칭	전달
프로브 합성	불필요	어려움	간단
특이성	생성물 Tm	서열	서열
용융 분석	Yes	No	Yes
다중 칼러 분석	No	Yes	Yes

본 발명에 따르면, 시간, 온도 및 형광은 매 초다마 1-10회 얻을 수 있고, 온도 과정동안에 생성물 또는 프로브 하이브리드의 상세한 특징을 관찰한다. 이중-쇄-특이적인 DNA 염료로, 온도에 대한 생성물의 하이브리드를 이용하여, 용융 곡선에 의해 생성물을 확인한다. 또한, Tm이 다른 두 개 이상의 생성물의 다중 증폭에 의해 상대적인 생성물 정량화를 할 수 있다. 또한, 두 개이상의 생성물이 상이한 Tm를 가지면 공통 프라이머에 서열 내부에 변화를 주어 경쟁적인 PCR을 실행한다. 변성된 생성물을 신속하게 냉각하고, 재-어닐링 역학을 관찰하여 생성물을 절대적으로 정량화할 수 있다. 생성물 용융 곡선을 분석하여 반복 과정 수에 대한 형광을 플롯한 것으로 시작 주형의 감응성이 증가되어, 비특이적인 증폭과 곡선 피팅 알로리즘을 조절할 수 있다. 마지막으로, 변성 조건, 연장 시간, 생성물 수득율을 조절하기 위한 즉각적인 피이드백은 이중-쇄 특이적인 DNA 염료와 생성물의 쇄 상태를 모니터하여 수득할 수 있다.

온도 변환과정 동안에 형광으로 프로브 하이브리드를 모니터하는 능력이 강력한 도구가 될 수 있다. 본 발명은 PCR 동안에 서열-특이적인 감지 및 정량화를 위한 프로브 하이브리드(가수분해가 아님)에 따른 이중-색 형광 방법을 제공한다. 하이브리드 프로브의 어닐링 역학 및 용융은 형과단간에 엑소뉴클레아제 가수분해에 의존하는 프로브로는 이용할 수 없는 정보를 제공한다. 서열-특이적인 프로브 하이브리드를 지속적으로 모니터하는 것은 공명 에너지 전달에 의한 온도 변화에 따른다. 프로브 용융은 생성물의 서열 및 이에 상보적인 서열에 의해 결정된 특징적인 온도에서 발생된다. 본 발명은 두 가지 과정으로 설명을 하는데; (1) 두 가지 인접 하이브리드 프로브; (2) 라벨된 프라이머에 결합되는 단일 쇄 PCR 프로브에 하이브리드되는 한 개 라벨된 프로브. 서열-특이적인 프로브의 용융 온도는 PCR 동안에 생성물을 확인하고 구별한다. 단일 염기 돌연변이를 포함하는 DNA 다형성 또는 돌연변이를 프로브 Tm 이동에 의해 감지된다. 또한, 상이한 온도에서 각 생성물로부터 용융된 한 개 이상의 프로브와 적어도 다른 두 개의 상이한 생성물의 다중 증폭에 의해 상대적인 생성물의 증폭을 얻는다. 또한, 프라이머의 내부 서열을 변경하여 경쟁적인 PCR을 실행하는데, 한 개 이상의 프로브는 상이한 Tm에서 경쟁물질 및 고유 주형에 하이브리드된다. 또는, 상이한 형광단 가령, Cy5 또는 Cy5.5와 같은 것으로 라벨된 프로브의 여러 가지 색을 분석하여 상대적인 또는 경쟁적인 PCR을 실행한다. 생성물의 절대 농도는 프로브 어닐링 역학 분석에 의해 결정한다. 곡선을 만드는 알로리즘으로 변환 과정 수에 대한 형광을 플롯하여 시작 주형 복사체의 수를 결정한다.

한 개의 PCR 반응에서 여러 가지 반응을 원하는 경우에, 다중 생성물을 구별하기 위해 구별할 수 있는 방출 스펙트럼을 가지는 상이한 형광 라벨을 이용하여 실행한다. 이용할 수 있는 형광단 수를 제한하고 이용할 수 있는 이들 형광단의 방출 스펙트럼을 겹치면 분석이 복잡해진다. 용융 곡선과 생성물 또는 프로브 하이브리드 분석은 다중 PCR 생성물을 구별하는 또 다른 방법이 된다. 온도 변형과정동안에 하이브리드후에, 다중 생성물을 구별하기 위한 프로브의 수 또는 스펙트럼 색을 최소화한다. 본 발명은 본 발명의 특정 성질을 벗어나지 않고도 다른 특이적인 형으로 구체화할 수 있다. 여기에서 상술하는 구체예는 설명을 위함이고, 이에 제한하지 않는다. 따라서, 본 발명은 전술한 설명보다는 다음의 청구범위에 국한시킨다. 청구항에 있는 위미 및 이의 범위는 이들의 영역에 포함된다.

용융 곡선 및 다른 분석을 위한 프로그램 코드는 다음 페이지에 이어진다.

서열표 리스트

(1)일반정보

(i)출원인; 위터, 칼 티

리리 커크 엠

라스센, 랜디 피

(ii) 발명의 명칭; PCR동안에 하이브리드 모니터하는 방법

(iii) 서열의 수; 27

(iv) 통신 주소

(A) 주소: 토르프, 노스 & 웨스턴 일일피

(B) 거리 : 사우스 700 이스트 9035, 슈이트 200

(C) 도시 : 샌디

(D) 주 : 유타

(E) 나라 : USA

(F) 우편코드 : 84070

(v) 컴퓨터 판독 형태

(A)매체형태; 디스켓, 3.5인치, 1.44Mb 용량

(B)컴퓨터; 도시바 T2150CDS

(C)작동시스템; 윈도우 95

(D)소프트웨어; 워드 퍼펙트 7.0

(vi) 현재 출원 데이터

(A) 출원번호;

(B) 출원일자;

(C) 분류

(vii) 우선권 출원 데이터

(A) 출원번호; US08/658,993

(B) 출원일자; 1996년 6월 4일

(vii) 우선권 출원 데이터

(A) 출원번호; US08/818,267

(B) 출원일자; 1997년 5월 17일

(viii) 대리인 정보

(A) 이름; 알란 제이. 하워드

(B) 등록번호; 36,553

(C) 서류 번호; 8618.CIP7

(ix) 통신 정보

(A) 전화번호; (801) 566-6633

(B) 팩스번호; (801) 566-0750

(2)서열 1에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 1

[서열 1]

CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT 20

(2)서열 2에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상;선형

(xi)서열 2

[서열 2]

AGAAGATGAG GCATAGCAGC 20

(2)서열 3에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 35bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 3

[서열 3]

CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA 35

(2)서열 4에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 30bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 4

[서열 4]

AAGTCTGCCG TTACTGCCCT GTGGGGCAAG 30

(2)서열 5에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 27bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 5

[서열 5]

TCTGCCGTTA CTGCCCTGTG GGGCAAG 27

(2)서열 6에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 6

[서열 6]

CAACTTCATC CACGTNCACC 20

(2)서열 7에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 18bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 7

[서열 7]

CTGTCCGTGA CGTGGATT 18

(2)서열 8에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 18bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 8

[서열 8]

AAGTCCTCCG AGTATAGC 18

(2)서열 9에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 46bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 9

[서열 9]

TAATCTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC GAGGAATACA GGTATT 46

(2)서열 10에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 46bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 10

[서열 10]

TAATCTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AAGGAATACA GGTATT 46

(2)서열 11에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 11

[서열 11]

TAATCTGTAA GAGCAGATCC 20

(2)서열 12에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 12

[서열 12]

TGTTATCACA CTGGTGCTAA 20

(2)서열 13에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 23bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 13

[서열 13]

AATACCTGTA TTCCTCGCCT GTC 23

(2)서열 14에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 14

[서열 14]

ATGCCTGGCA CCATTAAAGA 20

(2)서열 15에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 15

[서열 15]

GCATGCTTTG ATGACGCTTC 20

(2)서열 16에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 16

[서열 16]

CGGATCTTCT GCTGCCGTCG 20

(2)서열 17에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 17

[서열 17]

CCTCTGACGT CCATCATCTC 20

(2)서열 18에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 31bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 18

[서열 18]

GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA G 31

(2)서열 19에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 26bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 19

[서열 19]

CTGCCGTACT GCCCTGTGGG GCAAGG 26

(2)서열 20에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 26bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 20

[서열 20]

ATGCCCTCCC CCATGCCATC CTGCGT 26

(2)서열 21에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 21

[서열 21]

CAACTTCATC CACGTTCACC 20

(2)서열 22에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 27bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 22

[서열 22]

GTCTGCCGTT ACTGCCCTGT GGGGCAA 27

(2)서열 23에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 32bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 23

[서열 23]

CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT CC 32

(2)서열 24에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 30bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 24

[서열 24]

GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA 30

(2)서열 25에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 23bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 25

[서열 25]

TGAAGGAGAA GGTGTCTGCG GGA 23

(2)서열 26에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 25bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 26

[서열 26]

CCTCGGCTAA ATAGTAGTGC GTCGA 25

(2)서열 27에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20bp

(B)형태;핵산

(C)가닥; 단일 쇄

(D)위상; 선형

(xi)서열 27

[서열 27]

AGGACGGTGC GGTGAGAGTG 20

Claims

생물학적 시료에서 표적 DNA 서열을 분석하는 방법에 있어서,

- 표적 서열의 인접 부분에 하이브리드할 수 있는 두 개의 핵산 프로브 존재 하에, 폴리메라제 연쇄 반응법에 의해 표적서열을 증폭시키고, 여기서 두 개의 프로브중 한 개는 형광 에너지 전달 쌍의 수용 형광단으로 라벨링하고 나머지 프로브는 형광 에너지 전달 쌍의 제공 형광단으로 라벨링하여, 표적 서열과 두 개의 프로브가 하이브리드하는 동안에 제공 형광단과 수용 형광단은 서로 25개 뉴클레오티드안에 있도록 하고, 폴리메라제 연쇄 반응은 표적 핵산 서열에 대한 프라이머와 열에 안정한 폴리메라제를 생물학적 시료에 첨가하고 변성 온도와 연장 온도사이에서 상기 생물학적 시료를 순환 열처리하는 것으로 구성되고;

- 제공 형광단에 의해 흡수되는 파장에서 빛으로 생물학적 시료를 여기시키고, 형광 에너지 전달 쌍으로부터 발생되는 방사(emission)를 감지하는 것을 특징으로 하는 방법.
생물학적 시료의 표적 핵산 서열을 증폭시키는 개선된 방법에 있어서,

a) 핵산에 결합하는 형광체의 효과량을 생물학적 시료에 첨가하고;

b) 폴리메라제 연쇄 반응을 이용하여 표적 핵산을 증폭시키고, 상기 반응은 시작 결정된 온도와 시간 변수를 활용한 생물학적 시료의 순환 열처리로 구성되고, 이후

(ⅰ) 폴리메라제 연쇄 반응동안 형광체에 의해 흡수되는 선택된 파장의 빛으로 생물학적 시료를 비추고;

(ⅱ) 샘플에서 방출되는 형광을 모니터하여, 폴리메라제 연쇄 반응을 위한 최적 시간과 온도 변수를 결정하고;

(ⅲ) 감지된 형광에 따라 폴리메라제 연쇄 반응동안 초기 온도와 시간 변수를 조정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 형광체는 이중 쇄 특이적인 핵산 결합 염료로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 형광체는 표적 핵산에 하이브리드할 수 있는 형광라벨된 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 형광체는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성되고, 상기 프로브중 하나는 형광 에너지 전달 쌍의 수용 형광단으로 라벨되고, 다른 프로브는 형광 에너지 전달 쌍의 제공 형광단으로 라벨되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 공명 에너지 전달 쌍은 제공체인 플로레신 및 수용체인 Cy5 또는 Cy5.5로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
생물학적 시료에서 표적 핵산 서열의 폴리메라제 연쇄 반응 증폭을 실시간 모니터하는 방법에 있어서,

- SYBR^TM Green I 존재하에 폴리메라제 연쇄 반응으로 표적 서열을 증폭시키고, 상기 폴리메라제 연쇄 반응은 표적 핵산 서열에 대한 프라이머와 열에 안정한 폴리메라제를 생물학적 시료에 첨가하고 변성 온도와 연장 온도사이에서 상기 생물학적 시료를 순환 열처리하는 것으로 구성되고;

- SYBR^TM Green I에 의해 흡수되는 파장에서 빛으로 생물학적 시료를 여기시키고, 생물학적 시료로부터 발생되는 방사를 감지하고;

- SYBR^TM Green I으로부터 온도에 따른 형광을 모니터하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 모니터 단계는 증폭된 표적 서열의 용융 프로파일을 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
생물학적 시료의 표적 DNA 서열을 분석하는 방법에 있어서,

(a) 두 개의 핵산 프라이머와 핵산 프로브의 효과량을 생물학적 시료에 첨가하고, 이때 두 개의 프라이머중 한 개와 프로브는 각각 수용 형광단과 제공 형광단으로 구성된 형광 에너지 전달 쌍의 한 개 구성원으로 각각 라벨링되고, 라벨된 프로브는 라벨된 프라이머의 15개 뉴클레오티드이내에서 표적 핵산 서열의 증폭된 복제본과 하이브리드형성하고;

b) 폴리메라제 연쇄 반응법으로 표적 핵산 서열을 증폭시키고;

c) 제공 형광단에 의해 흡수되는 선택된 파장의 빛을 생물학적 시료에 조사(illumination)하고, 시료의 형광 방출을 감지하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 폴리메라제 연쇄 반응의 전체 열처리 사이클 횟수는 시료로부터 형광 방출을 모니터하고, 형광 방출이 반응의 완결을 시사하는 고원기(plateau phase)에 도달하는 사이클을 측정하여 결정하고, 상기 고원기에 도달한 이후에 반응을 종결하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 에 있어서, 핵산-결합 형광체는 SYBR^TM Green-I, 에티디움 브롬화물, 피코 그린, 아크리딘 오렌지, 티아졸 오렌지, YO-PRO-1, 크로모마이신 A3에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 폴리메라제 연쇄 반응의 온도 사이클링(cycling) 변수를 조절하는 추가 단계를 포함하고, 여기서 생물학적 시료의 순환 열처리 과정은 어닐링(annealing), 연장 및 변성의 반복 단계로 구성되고, 핵산에 결합하는 형광체는 이중 쇄-특이적인 형광 염료이고, 사이클링 변수는 어닐링 단계의 지속기간, 변성단계의 지속기간, 사이클 횟수로 구성되고,

(a) 형광 염료로부터 형광을 유도하기 위해 선택된 파장의 빛으로 반웅물을 조사하고, 반복되는 어닐링, 연장, 변성 단계동안에 지속적으로 형광을 모니터하고;

(b) (i) 연장 단계 동안에 형광의 증가가 중단되는 기간,

(ii) 변성 단계동안 형광이 기저수준까지 감소하는 기간, 또는

(iii) 연장 단계동안 형광이 미리 선택된 수준에 도달하기 위한 사이클 횟수 등을 결정하고;

(c) 연장 단계동안 형광의 증가가 중지되는 시간의 길이에 따라 연장 단계의 길이를 조정하거나, 변성 단계동안 형광이 기저수준까지 감소하는 시간에 따라 변성 단계의 길이를 조정하거나, 또는 연장 단계동안 형광이 미리 선택된 수준에 도달하는데 필요한 사이클 횟수에 따라 사이클 횟수를 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 이중-쇄 특이적 형광체는 SYBR^TM Green-1, 에티디움 브롬화물, 피코 그린, 아크리딘 오렌지, 티아졸 오렌지, YO-PRO-1, 크로모마이신 A3에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
경쟁성 정량적인 폴리메라제 연쇄 반응으로 선택된 핵산의 농도를 측정하는 방법에 있어서 ,

(a) (i) 폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 주형의 단편 및 상응하는 경쟁성 주형의 단편을 증폭시켜 이들의 증폭된 생성물을 산출하기 위한 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 각각의 효과량;

(ii) 형광 공명 에너지 전달 쌍의 공명 에너지 전달 제공자 또는 공명 에너지 전달 수용자로 라벨된 올리고뉴클레오티드 프로브의 효과량, 이때 상기 프로브는 증폭된 생성물에 하이브리드되도록 배열되어, 경쟁성 주형의 증폭된 생성물로부터 프로브가 용해되는 용융온도와 상이한 용융온도에서 선택된 주형의 증폭된 생성물로부터 프로브가 용해되고;

(iii) 제공자 또는 수용자로 라벨된 기준 올리고뉴클레오티드의 효과량, 여기서, 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드간에 하나는 제공자로 라벨되고, 다른 하나는 수용자로 라벨되며, 기준 올리고뉴클레오티드는 증폭된 생성물에 하이브리드하도록 되어, 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드가 모두 증폭된 생성물에 하이브리드될 때 제공자와 수용자는 공명 에너지 전달 관계에 있고;

상기와 구성된 혼합물에서 함량을 모르는 선택된 주형과 함량을 알고 있는 경쟁성 주형을 폴리메라제 연쇄 반응으로 증폭시켜 이들의 증폭된 생성물을 만들고;

(b) 형광 공명 에너지 전달 쌍에 의한 형광을 유도하기 위하여 반응 혼합물에 선택된 파장의 빛을 조사하고 온도에 대한 함수로써 형광 방출을 결정하기 위하고, 여기서 반응 혼합물의 온도를 변화시켜 선택된 주형의 증폭된 생성물로부터 용해되는 프로브의 제 1 용융 곡선과 경쟁성 주형으로부터 용해되는 프로브의 제 2 용융 곡선을 산출하고;

(c) 제 1과 제 2 용융 곡선을 제 1과 제 2 용융 피크로 변환시켜, 이와 같은 용융 피크로부터 선택된 주형과 경쟁성 주형의 상대적인 양을 결정하고;

(d) 경쟁성 주형의 함량 및 선택된 주형과 경쟁성 주형의 상대적인 함량에 기초하여, 선택된 주형의 농도를 계산하는 것을 특징으로 하는 방법.
폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 핵산의 농도를 결정하는 방법에 있어서;

(a) (i) 폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 주형의 제 1 단편을 증폭시켜 이의 증폭된 제 1 생성물을 얻기 위한 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 제 2 프라이머의 각 효과량;

(ii) 폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 기준 주형의 제 2 단편을 증폭시켜 이의 증폭된 제 2 생성물을 얻기 위한 된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 제 2 프라이머의 각 효과량;

(iii) 핵산-결합하는 형광 염료 효과량으로 구성된 혼합물에서, 폴리메라제 연쇄 반응으로 농도를 모르는 선택된 주형 및 농도를 알고 있는 기준 주형을 각각 증폭시켜 증폭된 제 1 생성물과 증폭된 제 2 생성물을 만들고;

(b) 핵산-결합하는 형광 염료에 의해 형광을 유도하기 위하여 반응 혼합물에 선택된 파장의 빛을 조사하고, 온도에 대한 함수로써 형광 방출을 지속적으로 모니터하여 증폭된 생성물의 용융 곡선을 만드는데, 이때 제 1 생성물과 제 2 생성물은 다른 온도에서 용해되고;

(c) 용융 곡선을 용융 피크로 변환시켜, 이와 같은 용융 피크로부터 선택된 주형과 기준 주형의 상대적인 함량을 측정하고;

(d) 기준 주형의 함량 및 기준 주형과 선택된 주형의 상대적인 함량을 기초로 하여, 선택된 주형의 농도를 계산하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 핵산-결합 형광 염료는 SYBR^TM Green-1, 에티디움 브롬화물, 피코 그린, 아크리딘 오렌지, 티아졸 오렌지, YO-PRO-1, 크로모마이신 A3에서 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.
양성 기준 주형을 포함하는 폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 핵산의 농도를 결정하는 방법에 있어서,

(a) (i) 폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 주형의 제 1 단편을 증폭시켜 이의 증폭된 제 1 생성물을 얻기 위한 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 제 2 프라이머의 각 효과량;

(ii) 폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 기준 주형의 제 2 단편을 증폭시켜 이의 증폭된 제 2 생성물을 얻기 위한 된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 제 2 프라이머의 각 효과량;

(iii) 핵산-결합하는 형광 염료 효과량으로 구성된 혼합물에서, 폴리메라제 연쇄 반응으로 선택된 주형 및 양성 기준 주형 각각을 증폭 조건에 처리하고;

(b) 핵산-결합하는 형광 염료에 의한 형광을 유도하기 위하여 반응 혼합물에 선택된 파장의 빛을 조사하고 폴리메라제 연쇄 반응의 증폭 사이클동안 온도 함수로 방출 형광을 지속적으로 모니터하여, 선택된 주형이 증폭되는 경우에는 증폭된 제 1 생성물의 제 1 용융 피크를 결과하고, 양성 기준 주형이 증폭되는 경우에는 증폭된 제 2 생성물의 제 2 용융 피크를 결과하고:

여기서, 제 2 용융 곡선을 얻는다는 것은 폴리메라제 연쇄 반응이 작용했다는 것을 나타내고, 제 1 용융 곡선을 얻는다는 것은 선택된 제 1 단편이 증폭되었다는 것을 나타내고, 제 1 용융 곡선이 없다는 것은 선택된 제 1 단편이 증폭되지 않았음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 핵산-결합 형광 염료는 SYBR^TM Green-1, 에티디움 브롬화물, 피코 그린, 아크리딘 오렌지, 티아졸 오렌지, YO-PRO-1, 크로모마이신 A3에서 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.
개체에서 V Leiden 돌연변이를 감지하는 방법에 있어서, 이때 V Leiden 돌연변이는 야생형과 비교하여 인자 V Leiden 돌연변이 위치에서 한 개의 염기가 변화된 것으로 구성되고;

(a) 개체로부터 시료 게놈 DNA를 얻고;

(b) 기준으로 야생형 게놈 DNA를 얻고;

(c) 폴리메라제 연쇄 반응으로 시료 게놈 DNA의 선택된 단편 및 야생형 게놈 DNA의 단편을 증폭시키기 위한 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공하고, 여기서 선택된 단편은 인자 V Leiden 돌연변이 위치를 포함하여, 증폭된 생성물이 인자 V Leiden 돌연변이 위치의 복사본을 포함하게 되고;

(d) 형광 공명 에너지 전달 쌍의 공명 에너지 전달 제공자 또는 공명 에너지 전달 수용자로 라벨된 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하고, 여기서 상기 프로브는 증폭된 생성물에 하이브리드되도록 배열되어, 인자 V Leiden 돌연변이가 시료 게놈 DNA에 존재하는 경우에 프로브는 돌연변이 위치를 포함하고 야생형 게놈 DNA의 용융 프로파일과 상이한 용융 프로파일을 보이고;

(e) 공명 에너지 전달 제공자 또는 공명 에너지 전달 수용자로 라벨된 전달 올리고뉴클레오티드를 제공하는데, 여기서 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드간에 하나는 공명 에너지 전달 제공자로 라벨되고, 다른 하나는 공명 에너지 전달 수용자로 라벨되며, 전달 올리고뉴클레오티드는 증폭된 생성물에 하이브리드하도록 되어, 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드가 모두 증폭된 생성물에 하이브리드될 때 공명 에너지 전달 제공자와 공명 에너지 전달 수용자는 공명 에너지 전달 관계에 있고;

(f) 올리고뉴클레오티드 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드 효과량의 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응으로 시료 게놈 DNA와 야생형 게놈 DNA의 선택된 단편을 증폭시켜, 증폭된 선택된 단편을 결과하는데, 여기서 이들의 적어도 일부는 공명 에너지 전달 관계에 있는 형광 공명 에너지 전달 쌍과 하이브리드되는 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드를 보유하고;

(g) 폴리메라제 연쇄 반응의 증폭 과정동안에 온도에 대한 함수로써 형광을 측정하여 시료 게놈 DNA의 증폭된 단편으로부터 용해되는 프로브의 용융 프로파일 및 야생형 게놈 DNA의 증폭된 단편으로부터 용해되는 프로브의 용융 프로파일을 만들고;

(h) 야생형 게놈 DNA의 용융 프로파일과 시료 게놈 DNA의 용융 프로파일을 비교하고, 이들의 차이는 시료 게놈 DNA에 인자 V Leiden 돌연변이가 존재함을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
핵산 하이브리드 반응을 분석하는 방법에 있어서;

(a) 분석할 핵산 시료 및 핵산에 결합하는 형광체로 구성된 혼합물을 제공하고;

(b) 초당 ≥0.1℃ 이상의 속도로 온도를 변화시키면서 형광을 모니터하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 20 항에 있어서, 핵산 결합 형광체는 SYBR^TM Green I인 것을 특징으로 하는 방법.
제 20 항에 있어서, 핵산 결합 형광체는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성되고, 이때 프로브중 하나는 형광 공명 에너지 전달 쌍의 제공자로 라벨이 되고, 다른 하나는 수용자로 라벨되는 것을 특징으로 하는 방법.
함량을 모르는 핵산을 포함하는 시료에서 초기 복사본 수를 정량하는 방법에 있어서;

(a) 표준과 핵산 결합 형광체로 구성된 혼합물에서 농도를 알고 있는 적어도 한가지 표준을 폴리메라제 연쇄 반응으로 증폭시키고;

(b) 사이클 횟수에 대한 함수로써 형광을 측정하여, 일련의 데이터 포인트를 산출하고;

(c) 초기 핵산 농도와 사이클 횟수에 대한 함수로 형광을 설명하는 임의의 사전 결정된 수학식에 데이터 점을 적용시키고;

(d) 시료와 핵산 결합 형광체로 구성된 혼합물에 함량을 모르는 핵산을 포함하는 시료를 증폭시키고, 이의 형광을 모니터하고;

(e) (c)단계에서 결정된 수학식으로부터 초기 핵산 농도를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
생물학적 시료에서 표적 DNA 서열을 분석하는 방법에 있어서;

- 핵산 결합 형광체 존재하에 폴리메라제 연쇄 반응으로 표적 서열을 증폭시키고, 상기 폴리메라제 연쇄 반응은 표적 핵산 서열에 대한 프라이머와 열에 안정한 폴리메라제를 생물학적 시료에 첨가하고 변성 온도와 연장 온도사이에서 상기 생물학적 시료를 순환 열처리하는 것으로 구성되고;

- 핵산 결합 형광체에 의해 흡수되는 파장에서 빛으로 생물학적 시료를 여기시키고;

- 시료의 온도가 변화될 때, 핵산 결합 형광체로부터 온도에 따른 형광 방출을 모니터하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 24 항에 있어서, 핵산 결합 형광체는 이중-쇄 핵산 결합 형광 염료인 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항에 있어서, 이중 쇄 핵산 결합 형광 염료는 SYBR^TM Green I인 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 온도에 따른 형광 변화는 이용하여 증폭된 생성물을 확인하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 27 항에 있어서, 증폭된 생성물은 용융 곡선의 분석으로 확인되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항에 있어서, 두 개 이상의 증폭된 생성물의 상대적인 함량은 용융 곡선을 분석하여 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항에 있어서, 용융 곡선 아래 면적은 다중 가우스함수의 비-선형 최소 자승 회귀분석의 합으로 알 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
증폭동안 생물학적 시료에서 표적 핵산 서열을 감지하는 방법에 있어서,

표적 핵산 서열의 증폭에 적합한 열안정성 폴리메라제와 프라이머를 생물학적 시료에 첨가하고;

SYBR^TM Green I과 피코 그린에서 선택되는 형광 염료의 존재하에 폴리메라제 연쇄 반응으로 표적 핵산 서열을 증폭하고, 상기 폴리메라제 연쇄 반응은 신속한 온도 사이클링 프로파일을 활용한 복수의 증폭 사이클을 통하여 변성 온도와 연장온도사이에서 상기 생물학적 시료를 순환 열처리하는 것으로 구성되고;

증폭된 표적 핵산 서열을 포함하는 생물학적 시료를 형광 염료에 의해 흡수되는 파장에서 빛으로 조사하고;

시료에서 증폭된 핵산 서열의 함량과 관련하여 형광 염료로부터 형광 방출을 감지하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 각 증폭 사이클동안 시료는 연장 온도에서 60초이하로 유지시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 각 증폭 사이클동안 시료는 연장 온도에서 20초미만으로 유지시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 각 증폭 사이클동안 시료는 변성 온도에서 1초미만으로 유지시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 시료는 조사하고 형광은 각 증폭 사이클동안 감지하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 형광 수치는 각 증폭 사이클에서 연장 또는 통합된 어니링/연장 단계동안 달성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 온도를 증가시키면서 시료를 조사하고 형광을 감지하여, 용융 곡선을 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
생물학적 시료에서 표적 핵산 서열의 증폭을 실시간 모니터하는 방법에 있어서,

- SYBR^TM Green I 존재하에 폴리메라제 연쇄 반응으로 표적 서열을 증폭시키고, 상기 폴리메라제 연쇄 반응은 SYBR^TM Green I, 열안정성 폴리메라제 및 표적 핵산 서열에 대한 프라이머를 생물학적 시료에 첨가하여 증폭 혼합물을 만들고 복수의 증폭 사이클동안 변성 온도와 연장 온도사이에서 상기 증폭 혼합물을 순환 열처리하는 것으로 구성되고;

- 복수의 증폭 사이클의 적어도 일부에서 SYBR^TM Green I에 의해 흡수되는 파장에서 빛으로 상기 혼합물을 조사하고;

- 시료 조사이후에 SYBR^TM Green I으로부터 형광 방출을 감지하고, 상기 형광 방출은 시료에서 증폭된 표적 핵산의 함량과 연관하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 38 항에 있어서, 형광 방출은 복수의 증폭 사이클 각각의 연장 단계동안 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 38 항에 있어서, 형광 방출은 복수의 증폭 사이클 각각의 통합된 어닐링/연장 단계동안 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
생물학적 시료에서 표적 핵산 서열의 증폭을 실시간 모니터하는 방법에 있어서,

- SYBR^TM Green I 존재하에 폴리메라제 연쇄 반응으로 표적 서열을 증폭시키고, 상기 폴리메라제 연쇄 반응은 SYBR^TM Green I, 열안정성 폴리메라제 및 표적 핵산 서열에 대한 프라이머를 생물학적 시료에 첨가하여 증폭 혼합물을 만들고 SYBR^TMGreen I이 핵산 서열의 함량과 관련된 형광 신호를 만들 수 있는 능력을 계속 유지하는 조건하의 복수의 증폭 사이클동안 변성 온도와 연장 온도사이에서 상기 증폭 혼합물을 순환 열처리하는 것으로 구성되고;

- 복수의 증폭 사이클의 적어도 일부에서 SYBR^TM Green I에 의해 흡수되는 파장에서 빛으로 상기 혼합물을 조사하고;

- 상기 시료에서 SYBR^TM Green I으로부터 형광 방출을 시료 온도의 함수로 모니터하여, 증폭된 표적 서열에 대한 용융 곡선을 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
증폭동안 생물학적 시료에서 표적 핵산 서열을 감지하는 방법에 있어서,

표적 핵산 서열의 증폭에 적합한 열안정성 폴리메라제와 프라이머를 생물학적 시료에 첨가하고;

열불안정성 이중-쇄 특이적 염료의 존재하에 폴리메라제 연쇄 반응으로 표적 핵산 서열을 증폭하고, 상기 폴리메라제 연쇄 반응은 신속한 온도 사이클링 프로파일을 활용한 복수의 증폭 사이클을 통하여 변성 온도와 연장 온도사이에서 상기 생물학적 시료를 순환 열처리하는 것으로 구성되고;

증폭된 표적 핵산 서열을 포함하는 생물학적 시료를 열불안정성 이중-쇄 특이적 염료에 의해 흡수되는 파장에서 빛으로 조사하고;

시료에서 증폭된 핵산 서열의 함량과 관련하여 열분안정성 이중-쇄 특이적 염료로부터 형광 방출을 감지하는 것을 특징으로 하는 방법.