JPH08298998A - 遺伝子変異の検出方法及び装置 - Google Patents
遺伝子変異の検出方法及び装置Info
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- JPH08298998A JPH08298998A JP7108379A JP10837995A JPH08298998A JP H08298998 A JPH08298998 A JP H08298998A JP 7108379 A JP7108379 A JP 7108379A JP 10837995 A JP10837995 A JP 10837995A JP H08298998 A JPH08298998 A JP H08298998A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 簡易な操作から成り、コスト的に有利かつ自
動化も容易な遺伝子変異の検出方法及び該方法を実施す
るための装置を提供する。 【構成】 変異を検出しようとする対象となるＤＮＡの
ホットスポットを挟んで、非対称ＰＣＲを行う工程と；
得られた非対称ＰＣＲ産物と、上記ＤＮＡが無変異の場
合の塩基配列に対し相補的配列を備えるオリゴヌクレオ
チドとをアニールさせる工程と；得られた二本鎖ＤＮＡ
の溶液を加熱し、温度による吸光度の変化を解析して上
記対象となるＤＮＡの変異を検出する工程とを実施する
ことにより遺伝子変異を検出する。
動化も容易な遺伝子変異の検出方法及び該方法を実施す
るための装置を提供する。 【構成】 変異を検出しようとする対象となるＤＮＡの
ホットスポットを挟んで、非対称ＰＣＲを行う工程と；
得られた非対称ＰＣＲ産物と、上記ＤＮＡが無変異の場
合の塩基配列に対し相補的配列を備えるオリゴヌクレオ
チドとをアニールさせる工程と；得られた二本鎖ＤＮＡ
の溶液を加熱し、温度による吸光度の変化を解析して上
記対象となるＤＮＡの変異を検出する工程とを実施する
ことにより遺伝子変異を検出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子変異の検出方法
及び装置に関する。
及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子変異の検出方法としては、以下の
ようなものがある。 （１）サンガー法、マキサム・ギルバート法等のＲＩ
（放射性同位元素）及び蛍光色素を用いたダイレクトシ
ーケンス法； （２）各種プローブを用いたハイブリダイゼーション
法； （３）ＰＣＲ―ＳＳＣＰ法（Orita R.M.他, Genomics,
5, 874-879, 1989）； （４）ＡＳ―ＰＣＲ法（ＭＡＳＡ法：中村祐輔他、
（財）癌研）； （５）ＲＮａｓｅ プロテクション法（Myers R.M.他,
Science, 230:1242-1246,1989 ）； （６）ＣＣＭ法（Cotton 他, １９８９年）； （７）ＤＧＧＥ法（Yal C. Sheffield他, Proc.Natl.Ac
ad.Sci. USA, Vol.86, pp232-236, 1989）。
ようなものがある。 （１）サンガー法、マキサム・ギルバート法等のＲＩ
（放射性同位元素）及び蛍光色素を用いたダイレクトシ
ーケンス法； （２）各種プローブを用いたハイブリダイゼーション
法； （３）ＰＣＲ―ＳＳＣＰ法（Orita R.M.他, Genomics,
5, 874-879, 1989）； （４）ＡＳ―ＰＣＲ法（ＭＡＳＡ法：中村祐輔他、
（財）癌研）； （５）ＲＮａｓｅ プロテクション法（Myers R.M.他,
Science, 230:1242-1246,1989 ）； （６）ＣＣＭ法（Cotton 他, １９８９年）； （７）ＤＧＧＥ法（Yal C. Sheffield他, Proc.Natl.Ac
ad.Sci. USA, Vol.86, pp232-236, 1989）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、サンガー法、
ＰＣＲ―ＳＳＣＰ法、ＡＳ―ＰＣＲ法、ＣＣＭ法、及び
ＤＧＧＥ法は、ポリアクリルアミドゲルもしくはアガロ
ースゲル等による電気泳動を行うことが必要であり、ゲ
ルの作成と泳動操作に多くの時間がかかるという欠点が
ある。また、サンガー法及びハイブリダイゼーション法
では、ＲＩを用いて標識するために、特別の管理施設が
必要である。さらに、ＡＳ―ＰＣＲ法では、複数のホッ
トスポットをスクリーニングすることができない。加え
て、上記いずれの方法も手順が複雑であり、自動化に不
向きである。したがって、本発明の目的は、簡易な操作
から成り、コスト的に有利かつ自動化も容易な遺伝子変
異の検出方法及び該方法を実施するための装置を提供す
ることにある。
ＰＣＲ―ＳＳＣＰ法、ＡＳ―ＰＣＲ法、ＣＣＭ法、及び
ＤＧＧＥ法は、ポリアクリルアミドゲルもしくはアガロ
ースゲル等による電気泳動を行うことが必要であり、ゲ
ルの作成と泳動操作に多くの時間がかかるという欠点が
ある。また、サンガー法及びハイブリダイゼーション法
では、ＲＩを用いて標識するために、特別の管理施設が
必要である。さらに、ＡＳ―ＰＣＲ法では、複数のホッ
トスポットをスクリーニングすることができない。加え
て、上記いずれの方法も手順が複雑であり、自動化に不
向きである。したがって、本発明の目的は、簡易な操作
から成り、コスト的に有利かつ自動化も容易な遺伝子変
異の検出方法及び該方法を実施するための装置を提供す
ることにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、請求項１記載の発明は、遺伝子変異の検出方法であ
って、変異を検出しようとする対象となるＤＮＡのホッ
トスポットを挟んで、非対称ＰＣＲを行う工程と；得ら
れた非対称ＰＣＲ産物と、上記ＤＮＡが無変異の場合の
塩基配列に対し相補的配列を備えるオリゴヌクレオチド
とをアニールさせる工程と；得られた二本鎖ＤＮＡを加
熱し、温度による吸光度の変化を解析して上記対象とな
るＤＮＡの変異を検出する工程とを含むことを特徴とす
る。
に、請求項１記載の発明は、遺伝子変異の検出方法であ
って、変異を検出しようとする対象となるＤＮＡのホッ
トスポットを挟んで、非対称ＰＣＲを行う工程と；得ら
れた非対称ＰＣＲ産物と、上記ＤＮＡが無変異の場合の
塩基配列に対し相補的配列を備えるオリゴヌクレオチド
とをアニールさせる工程と；得られた二本鎖ＤＮＡを加
熱し、温度による吸光度の変化を解析して上記対象とな
るＤＮＡの変異を検出する工程とを含むことを特徴とす
る。
【０００５】請求項２記載の発明は、請求項１のＤＮＡ
の変異を検出する工程に用いられる検出装置であって、
吸光度を計測するためのＵＶコントローラと、サンプル
用キュベットと、変異検出操作を制御するためのＣＰＵ
とを具備することを特徴とする。
の変異を検出する工程に用いられる検出装置であって、
吸光度を計測するためのＵＶコントローラと、サンプル
用キュベットと、変異検出操作を制御するためのＣＰＵ
とを具備することを特徴とする。
【０００６】遺伝子変異の検出方法の概要 本発明にかかる遺伝子変異の検出方法は、より詳細には
以下のような手順に従う。 （１）変異を検出しようとする対象となるＤＮＡのホッ
トスポットを挟んで、非対称ＰＣＲ（Asymmetric Polym
erase Chain Reaction）を行い、一本鎖の非対称ＰＣＲ
産物（ＤＮＡ）を得る。ただし、本発明では、ポリアク
リルアミドゲル等によるゲル電気泳動は行わない。 （２）この一本鎖ＤＮＡを所定温度条件、例えば９５℃
で５分間程度（通常、９０〜９６℃、４〜１０分間）変
性させた後、氷冷する。 （３）得られたＤＮＡ溶液から吸光度に影響するプライ
マ、ｄＮＴＰ及び塩をフィルタを用いて除去する。 （４）上記変異を検出しようとするＤＮＡに対し、相補
的塩基配列を持つように予め設計し合成したオリゴヌク
レオチドをＤＮＡ溶液に適量加え、このオリゴヌクレオ
チドと変異を検出しようとする対象となるＤＮＡとをア
ニールさせる。得られる二本鎖ＤＮＡは、上記非対称Ｐ
ＣＲ産物に変異があればヘテロ二本鎖ＤＮＡとなり、正
常であればホモ二本鎖ＤＮＡとなる。 （５）得られた二本鎖ＤＮＡを加熱し、温度による吸光
度の変化を解析する。ヘテロ二本鎖ＤＮＡとホモ二本鎖
ＤＮＡとは、解離温度（二本鎖間の水素結合が切れて一
本鎖ＤＮＡとなる温度）が異なる。一塩基異なるだで
も、水素結合の状態が異なり、相互の鎖の結合力が異な
って来るためである。 本発明では、アニールさせたＤＮＡを含む上記溶液を低
温から徐々に高温に加熱し、温度による吸光度［一般的
には、ＵＶ（ultraviolet ）によるＯＤ（optical dens
ity ）値］の変化を計測する。基本的には、温度上昇に
伴ってＯＤ値も上昇するが、ヘテロ二本鎖はホモ二本鎖
に比較して解離温度が低いために、低い温度で解離を始
める。それに伴ってＯＤ値も上昇する。本発明では、正
常な二本鎖ＤＮＡと予め変異箇所の分かっている二本鎖
ＤＮＡの解離曲線（温度とＯＤ値との相関曲線）との相
関データ等を予め得ておき、実測された波形曲線を最小
２乗法等によって解析し、変異の有無ばかりではなく、
いかなる部位の変異がどの程度含まれているかも判定で
きる。
以下のような手順に従う。 （１）変異を検出しようとする対象となるＤＮＡのホッ
トスポットを挟んで、非対称ＰＣＲ（Asymmetric Polym
erase Chain Reaction）を行い、一本鎖の非対称ＰＣＲ
産物（ＤＮＡ）を得る。ただし、本発明では、ポリアク
リルアミドゲル等によるゲル電気泳動は行わない。 （２）この一本鎖ＤＮＡを所定温度条件、例えば９５℃
で５分間程度（通常、９０〜９６℃、４〜１０分間）変
性させた後、氷冷する。 （３）得られたＤＮＡ溶液から吸光度に影響するプライ
マ、ｄＮＴＰ及び塩をフィルタを用いて除去する。 （４）上記変異を検出しようとするＤＮＡに対し、相補
的塩基配列を持つように予め設計し合成したオリゴヌク
レオチドをＤＮＡ溶液に適量加え、このオリゴヌクレオ
チドと変異を検出しようとする対象となるＤＮＡとをア
ニールさせる。得られる二本鎖ＤＮＡは、上記非対称Ｐ
ＣＲ産物に変異があればヘテロ二本鎖ＤＮＡとなり、正
常であればホモ二本鎖ＤＮＡとなる。 （５）得られた二本鎖ＤＮＡを加熱し、温度による吸光
度の変化を解析する。ヘテロ二本鎖ＤＮＡとホモ二本鎖
ＤＮＡとは、解離温度（二本鎖間の水素結合が切れて一
本鎖ＤＮＡとなる温度）が異なる。一塩基異なるだで
も、水素結合の状態が異なり、相互の鎖の結合力が異な
って来るためである。 本発明では、アニールさせたＤＮＡを含む上記溶液を低
温から徐々に高温に加熱し、温度による吸光度［一般的
には、ＵＶ（ultraviolet ）によるＯＤ（optical dens
ity ）値］の変化を計測する。基本的には、温度上昇に
伴ってＯＤ値も上昇するが、ヘテロ二本鎖はホモ二本鎖
に比較して解離温度が低いために、低い温度で解離を始
める。それに伴ってＯＤ値も上昇する。本発明では、正
常な二本鎖ＤＮＡと予め変異箇所の分かっている二本鎖
ＤＮＡの解離曲線（温度とＯＤ値との相関曲線）との相
関データ等を予め得ておき、実測された波形曲線を最小
２乗法等によって解析し、変異の有無ばかりではなく、
いかなる部位の変異がどの程度含まれているかも判定で
きる。
【０００７】本発明によれば、ガン遺伝子、ガン抑制遺
伝子を初め多くの遺伝子のホットスポットに変異がある
かどうかを調べることができる。また、正常ＤＮＡの各
種変異パターンを予め準備することにより、点突然変異
（point mutation）のみならず、欠失（deletion）、挿
入（insertion ）といった変異様式についても適用可能
である。したがって、遺伝子の段階的変異を診断してガ
ンの早期発見等に応用することができる。本発明では、
ポリアクリルアミドゲル等を用いたゲル電気泳動の操作
は不要である。よって、ゲルの作成と固まるまでの待ち
時間、さらに電気泳動自体に要する時間が不要となり作
業効率が良い。また、ゲル、ＲＩ及び蛍光色素等も不要
となり、コスト削減に寄与できる。上述した各工程は、
特定の遺伝子に特異的に限定して適用可能なものではな
い。すなわち、本発明は、特定の遺伝子のみならず、ど
の遺伝子でも適用可能である。
伝子を初め多くの遺伝子のホットスポットに変異がある
かどうかを調べることができる。また、正常ＤＮＡの各
種変異パターンを予め準備することにより、点突然変異
（point mutation）のみならず、欠失（deletion）、挿
入（insertion ）といった変異様式についても適用可能
である。したがって、遺伝子の段階的変異を診断してガ
ンの早期発見等に応用することができる。本発明では、
ポリアクリルアミドゲル等を用いたゲル電気泳動の操作
は不要である。よって、ゲルの作成と固まるまでの待ち
時間、さらに電気泳動自体に要する時間が不要となり作
業効率が良い。また、ゲル、ＲＩ及び蛍光色素等も不要
となり、コスト削減に寄与できる。上述した各工程は、
特定の遺伝子に特異的に限定して適用可能なものではな
い。すなわち、本発明は、特定の遺伝子のみならず、ど
の遺伝子でも適用可能である。
【０００８】図４に、GTP 加水分解因子をコードするK-
ras 遺伝子のエキソン部分４０１を示す。このエキソン
４０１のコドン１２及びコドン１３がホットスポットに
相当する。後述する試験例では、このコドンを変異させ
て試験を行った。この図に示すようにＰＣＲ操作を行う
際は、ホットスポットを挟んで正方向のプライマー４０
２と逆方向のプライマー４０３を用意し、適当なサイク
ルで増幅を行う。４０４は、上記エキソン４０１のう
ち、ホットスポットを含む１２の塩基で構成された合成
オリゴヌクレオチドである。これは無変異の野生型のも
のである。４０５は、上記エキソン４０１のうち、ホッ
トスポットを含む１２の塩基で構成された合成オリゴヌ
クレオチドである。これはコドン１２の第二塩基をアデ
ニン（Ａ）で置き換えた、変異型のものである。４０６
は、合成オリゴヌクレオチド４０４と相補的配列の合成
オリゴヌクレオチドである。４０７は、合成オリゴヌク
レオチド４０５と相補的配列の合成オリゴヌクレオチド
である。シトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置き代わって
いる。図５から図８は、これら合成オリゴヌクレオチド
を使って解離曲線を得た結果を示している。図５は、合
成オリゴヌクレオチド４０４と４０６の場合、図６は、
合成オリゴヌクレオチド４０５と４０７の場合、図７
は、合成オリゴヌクレオチド４０４と４０７の場合、図
８は、合成オリゴヌクレオチド４０５と４０６の場合で
ある。図５と図６がホモ２本鎖ＤＮＡの結果を示し、図
７と図８とがヘテロ２本鎖ＤＮＡの結果である。
ras 遺伝子のエキソン部分４０１を示す。このエキソン
４０１のコドン１２及びコドン１３がホットスポットに
相当する。後述する試験例では、このコドンを変異させ
て試験を行った。この図に示すようにＰＣＲ操作を行う
際は、ホットスポットを挟んで正方向のプライマー４０
２と逆方向のプライマー４０３を用意し、適当なサイク
ルで増幅を行う。４０４は、上記エキソン４０１のう
ち、ホットスポットを含む１２の塩基で構成された合成
オリゴヌクレオチドである。これは無変異の野生型のも
のである。４０５は、上記エキソン４０１のうち、ホッ
トスポットを含む１２の塩基で構成された合成オリゴヌ
クレオチドである。これはコドン１２の第二塩基をアデ
ニン（Ａ）で置き換えた、変異型のものである。４０６
は、合成オリゴヌクレオチド４０４と相補的配列の合成
オリゴヌクレオチドである。４０７は、合成オリゴヌク
レオチド４０５と相補的配列の合成オリゴヌクレオチド
である。シトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置き代わって
いる。図５から図８は、これら合成オリゴヌクレオチド
を使って解離曲線を得た結果を示している。図５は、合
成オリゴヌクレオチド４０４と４０６の場合、図６は、
合成オリゴヌクレオチド４０５と４０７の場合、図７
は、合成オリゴヌクレオチド４０４と４０７の場合、図
８は、合成オリゴヌクレオチド４０５と４０６の場合で
ある。図５と図６がホモ２本鎖ＤＮＡの結果を示し、図
７と図８とがヘテロ２本鎖ＤＮＡの結果である。
【０００９】ホモ２本鎖は計測領域内でシグモイド曲線
を描いている。図５と図６を比べ、正常なホモ２本鎖と
変異のあるホモ２本鎖での差は殆どない。それに対し、
ヘテロ２本鎖は、図７ではリニアに近い曲線であり、図
９も弧を描いている。どちらにしても、ヘテロ２本鎖で
は低温領域での勾配が大きい。つまり、融解温度が低い
ためにまだ部分的解離が残っているためと考えられる。
また、この場合、配列が異なるとコンフォメーション
（２次構造）の差から、そのパターンも異なる。以上か
ら、パターン解析により変異の解析が可能となる。一般
の解析では、正常なアンチセンス側の合成オリゴヌクレ
オチド(Reverse１）を加えるために、変異のないＤＮＡ
は図５となり、変異のあるＤＮＡは図８となる。ここで
用いたＤＮＡは１２ベースの完全な２本鎖ＤＮＡである
が、１本鎖のＰＣＲ産物の長さは４０ベースある。合成
ＤＮＡをアニールさせると、両末端に合わせて２８ベー
スの１本鎖部位ができる。これがノイズ源になる。この
ノイズを除去する必要があるときには、１本鎖ＤＮＡだ
けを消化する酵素（例:Mung BeanNuclease)を使用する
ことも可能である。
を描いている。図５と図６を比べ、正常なホモ２本鎖と
変異のあるホモ２本鎖での差は殆どない。それに対し、
ヘテロ２本鎖は、図７ではリニアに近い曲線であり、図
９も弧を描いている。どちらにしても、ヘテロ２本鎖で
は低温領域での勾配が大きい。つまり、融解温度が低い
ためにまだ部分的解離が残っているためと考えられる。
また、この場合、配列が異なるとコンフォメーション
（２次構造）の差から、そのパターンも異なる。以上か
ら、パターン解析により変異の解析が可能となる。一般
の解析では、正常なアンチセンス側の合成オリゴヌクレ
オチド(Reverse１）を加えるために、変異のないＤＮＡ
は図５となり、変異のあるＤＮＡは図８となる。ここで
用いたＤＮＡは１２ベースの完全な２本鎖ＤＮＡである
が、１本鎖のＰＣＲ産物の長さは４０ベースある。合成
ＤＮＡをアニールさせると、両末端に合わせて２８ベー
スの１本鎖部位ができる。これがノイズ源になる。この
ノイズを除去する必要があるときには、１本鎖ＤＮＡだ
けを消化する酵素（例:Mung BeanNuclease)を使用する
ことも可能である。
【００１０】ＤＮＡの変異検出装置 本発明にかかる上記検出方法において、変異を検出する
工程に用いられる装置は少なくとも以下の要素を含む。 （１）吸光度を計測するためのＵＶコントローラ； （２）サンプル用キュベット； （３）変異検出解析操作を制御するためのＣＰＵボー
ド。上記装置では、壁面にヒータ、内面に熱電対（サー
ミスタ）を備えたサンプル用キュベット内のサンプルの
温度を、サンプルのＴM （解離温度）を中央に挟む温度
域で加熱する。この際、単位時間当たりの温度変化が均
一となるようにする。吸光度は、通常、２６０ｎｍにお
いてＵＶコントローラで計測を行う。この計測のための
サンプリングは温度変化と同期させる。得られた計測デ
ータからＣＰＵボードで温度と吸光度の二次元グラフを
作成し、曲線のパターン解析を行う。ＣＰＵボードで
は、パターン解析によって得られた遺伝子変異の情報を
デスプレイ装置に表示し、メモリ内にストックする。
工程に用いられる装置は少なくとも以下の要素を含む。 （１）吸光度を計測するためのＵＶコントローラ； （２）サンプル用キュベット； （３）変異検出解析操作を制御するためのＣＰＵボー
ド。上記装置では、壁面にヒータ、内面に熱電対（サー
ミスタ）を備えたサンプル用キュベット内のサンプルの
温度を、サンプルのＴM （解離温度）を中央に挟む温度
域で加熱する。この際、単位時間当たりの温度変化が均
一となるようにする。吸光度は、通常、２６０ｎｍにお
いてＵＶコントローラで計測を行う。この計測のための
サンプリングは温度変化と同期させる。得られた計測デ
ータからＣＰＵボードで温度と吸光度の二次元グラフを
作成し、曲線のパターン解析を行う。ＣＰＵボードで
は、パターン解析によって得られた遺伝子変異の情報を
デスプレイ装置に表示し、メモリ内にストックする。
【００１１】サンプル用キュベット 本発明で使用されるサンプル用キュベットは、通常の角
形キュベットを勿論使用することができる。しかし、本
発明では、少量のサンプルでも良く、さらに自動化を念
頭に置いて、改良したキュベットを用いることもでき
る。改良型のキュベットは、横置型のもので、横方向に
延長する細径の溶液収容部と、溶液収納部の両端から上
方向に延びる細径の溶液注入部及び排出部とを備える。
形キュベットを勿論使用することができる。しかし、本
発明では、少量のサンプルでも良く、さらに自動化を念
頭に置いて、改良したキュベットを用いることもでき
る。改良型のキュベットは、横置型のもので、横方向に
延長する細径の溶液収容部と、溶液収納部の両端から上
方向に延びる細径の溶液注入部及び排出部とを備える。
【００１２】
【実施例】以下に添付図面を参照しながら、本発明を説
明する。図１は、本発明にかかるＤＮＡの変異検出装置
の実施例を示す。図において、１はＵＶコントローラ、
２はサンプル用キュベット、３はＣＰＵボードである。
ＵＶコントローラ１は、２６０ｎｍの光源（図示せず）
をコントロールしてデテクタ（図示せず）によって、透
過する光を検出する。計測されたデータは、ＣＰＵボー
ド３に転送される。ＣＰＵボードは３、ヒータ４をコン
トロールし、ヒータ４は加熱部５がサンプル用キュベッ
ト２の壁面に内蔵されている。サンプル用キュベット２
の溶液を内蔵する収容室６の内面にはサーミスタ（熱電
対）７の関知端が配設され、温度データをＣＰＵボード
３に転送する。キュベット２内の温度は、サンプルのＴ
M を中央挟むように１５℃から７５℃まで上げていく。
単位時間当たりの温度変化が均一となり、かつ、サンプ
リングと温度変化とを同期させるようにする。８はレフ
ァレンス用キュベットである。これはオフセット補正用
のキュベットである。このキュベット８内には、通常、
サンプル希釈用の水を入れる。得られた計測データから
ＣＰＵボード３で温度と吸収度の二次元グラフを作成
し、曲線のパターン解析を行う。ＣＰＵボード３では、
パターン解析によって得られた遺伝子変異の情報をデス
プレイ装置（図示せず）に表示し、メモリ内にストック
する。正常な二本鎖ＤＮＡと予め変異箇所の分かってい
る二本鎖ＤＮＡの解離曲線（温度とＯＤ値との相関曲
線）の相関データ等を予めＣＰＵボード３内に得てお
き、実測された波形曲線を最小２乗法等によって解析
し、変異の有無を判定することができる。また、いかな
る部位の変異がどの程度含まれているかも判定できる。
なお、上記ＵＶコントローラ１は、当業者にとって容易
に入手可能な公知のマイクロプロセッサを含むことがで
き、ＣＰＵボード３も同様である。
明する。図１は、本発明にかかるＤＮＡの変異検出装置
の実施例を示す。図において、１はＵＶコントローラ、
２はサンプル用キュベット、３はＣＰＵボードである。
ＵＶコントローラ１は、２６０ｎｍの光源（図示せず）
をコントロールしてデテクタ（図示せず）によって、透
過する光を検出する。計測されたデータは、ＣＰＵボー
ド３に転送される。ＣＰＵボードは３、ヒータ４をコン
トロールし、ヒータ４は加熱部５がサンプル用キュベッ
ト２の壁面に内蔵されている。サンプル用キュベット２
の溶液を内蔵する収容室６の内面にはサーミスタ（熱電
対）７の関知端が配設され、温度データをＣＰＵボード
３に転送する。キュベット２内の温度は、サンプルのＴ
M を中央挟むように１５℃から７５℃まで上げていく。
単位時間当たりの温度変化が均一となり、かつ、サンプ
リングと温度変化とを同期させるようにする。８はレフ
ァレンス用キュベットである。これはオフセット補正用
のキュベットである。このキュベット８内には、通常、
サンプル希釈用の水を入れる。得られた計測データから
ＣＰＵボード３で温度と吸収度の二次元グラフを作成
し、曲線のパターン解析を行う。ＣＰＵボード３では、
パターン解析によって得られた遺伝子変異の情報をデス
プレイ装置（図示せず）に表示し、メモリ内にストック
する。正常な二本鎖ＤＮＡと予め変異箇所の分かってい
る二本鎖ＤＮＡの解離曲線（温度とＯＤ値との相関曲
線）の相関データ等を予めＣＰＵボード３内に得てお
き、実測された波形曲線を最小２乗法等によって解析
し、変異の有無を判定することができる。また、いかな
る部位の変異がどの程度含まれているかも判定できる。
なお、上記ＵＶコントローラ１は、当業者にとって容易
に入手可能な公知のマイクロプロセッサを含むことがで
き、ＣＰＵボード３も同様である。
【００１３】上記において、サンプル用キュベット２
は、石英製の通常使用されている角形セル、すなわち、
図２に２１として示すものを採用することができる。し
かし、この他にも２２のロート形断面の収容部（室）を
有するもの、２３の細径のカラム状の収容部を有するも
の等も使用することができる。キュベット２３は、少量
のサンプルに適している。なお、図中ＵＶとして示した
矢印は、光源からの光の入射方向を示す。
は、石英製の通常使用されている角形セル、すなわち、
図２に２１として示すものを採用することができる。し
かし、この他にも２２のロート形断面の収容部（室）を
有するもの、２３の細径のカラム状の収容部を有するも
の等も使用することができる。キュベット２３は、少量
のサンプルに適している。なお、図中ＵＶとして示した
矢印は、光源からの光の入射方向を示す。
【００１４】さらに、本実施例では、図３に示すキュベ
ット２４を用いることも可能である。このキュベット２
４は、横置型のもので、横方向に延長する細径の溶液収
容部２４１と、溶液収容部２４１の両端から上方向に延
びる細径の溶液注入部２４２及び排出部２４３とを備え
る。溶液収容部２４１の両端面は光軸に対し垂直な平面
を構成するようにする。このキュベット２４は、サンプ
ル量が少なくてすむ。入射光の光軸の調製を容易とする
ため入射側に集光レンズを設けることもできる。なお、
光量を検出してチューニングする方法（オートチューニ
ング法）を採用することもできる。
ット２４を用いることも可能である。このキュベット２
４は、横置型のもので、横方向に延長する細径の溶液収
容部２４１と、溶液収容部２４１の両端から上方向に延
びる細径の溶液注入部２４２及び排出部２４３とを備え
る。溶液収容部２４１の両端面は光軸に対し垂直な平面
を構成するようにする。このキュベット２４は、サンプ
ル量が少なくてすむ。入射光の光軸の調製を容易とする
ため入射側に集光レンズを設けることもできる。なお、
光量を検出してチューニングする方法（オートチューニ
ング法）を採用することもできる。
【００１５】試験例 ＧＴＰ加水分解因子をコードするK-ras 遺伝子に関する
試験例： （１）上記遺伝子（エキソン部分が図４の４０１と同一
の塩基配列を持つ）の正常なもの、コドン１２の第１塩
基がアデニン塩基、チミン塩基に変異したもの、コドン
１２の第２塩基がアデニン塩基、チミン塩基に変異した
もの、コドン１３の第２塩基がアデニン塩基に変異した
ものについて、ホットスポットを挟んで、非対称ＰＣＲ
（Asymmetric Polymerase Chain Reaction）を行い、一
本鎖の非対称ＰＣＲ産物（ＤＮＡ）を６種類得た。この
非対称ＰＣＲは、以下のＰＣＲ反応液を調製して行っ
た。 ＰＣＲ反応液（１００μｌ） テンプレートＤＮＡ １００ｎｇ プライマー（Forward PM) ５ｐｍｏｌ／μｌを４μｌ (Reverse PM) １ｐｍｏｌ／μｌを１μｌ １０ｍＭｄＮＴＰ ４μｌ １０×buffer １０μｌ ２５ｎＭ Mgcl2 ６μｌ Ｔａｑ ２．５units(０．５μｌ） ＤＷ（精製水） ｘ ─────────────────────────────── （１００μｌ） 反応サイクル （変性９５℃ ３０″、アニーリング５２℃ ３０″、
伸長７２℃ ３０″）上記サイクルを４０回、サーマル
サイクラで行なった。 （２）上記一本鎖ＤＮＡを９５℃で１０分間程度変性さ
せた後、氷冷した。 （３）サンプルの塩濃度を一様にするため、得られたＤ
ＮＡ溶液をフィルター［分画分子量１００００の遠心濾
過チューブ（ウルトラフリーＧ３ＧＣ: 日本ミリポア工
業（株））］で脱塩し、さらに吸光度に影響するプライ
マ、ｄＮＴＰを除去した。 （４）上記変異ＤＮＡに対し、相補的塩基配列を持つ正
常な配列のＤＮＡを前記ＤＮＡ溶液に等量モル加え、相
互にアニールさせた。得られた二本鎖ＤＮＡは、ヘテロ
二本鎖ＤＮＡである。 （５）得られた二本鎖ＤＮＡを加熱し、図１の装置によ
って温度による吸光度の変化を解析した。正常な二本鎖
ＤＮＡについて、同様な解析を行った。 （６）正常なホモ二本鎖ＤＮＡのなす曲線は、５種類の
変異ＤＮＡを含むヘテロ二本鎖のなす曲線と明確に区別
された。
試験例： （１）上記遺伝子（エキソン部分が図４の４０１と同一
の塩基配列を持つ）の正常なもの、コドン１２の第１塩
基がアデニン塩基、チミン塩基に変異したもの、コドン
１２の第２塩基がアデニン塩基、チミン塩基に変異した
もの、コドン１３の第２塩基がアデニン塩基に変異した
ものについて、ホットスポットを挟んで、非対称ＰＣＲ
（Asymmetric Polymerase Chain Reaction）を行い、一
本鎖の非対称ＰＣＲ産物（ＤＮＡ）を６種類得た。この
非対称ＰＣＲは、以下のＰＣＲ反応液を調製して行っ
た。 ＰＣＲ反応液（１００μｌ） テンプレートＤＮＡ １００ｎｇ プライマー（Forward PM) ５ｐｍｏｌ／μｌを４μｌ (Reverse PM) １ｐｍｏｌ／μｌを１μｌ １０ｍＭｄＮＴＰ ４μｌ １０×buffer １０μｌ ２５ｎＭ Mgcl2 ６μｌ Ｔａｑ ２．５units(０．５μｌ） ＤＷ（精製水） ｘ ─────────────────────────────── （１００μｌ） 反応サイクル （変性９５℃ ３０″、アニーリング５２℃ ３０″、
伸長７２℃ ３０″）上記サイクルを４０回、サーマル
サイクラで行なった。 （２）上記一本鎖ＤＮＡを９５℃で１０分間程度変性さ
せた後、氷冷した。 （３）サンプルの塩濃度を一様にするため、得られたＤ
ＮＡ溶液をフィルター［分画分子量１００００の遠心濾
過チューブ（ウルトラフリーＧ３ＧＣ: 日本ミリポア工
業（株））］で脱塩し、さらに吸光度に影響するプライ
マ、ｄＮＴＰを除去した。 （４）上記変異ＤＮＡに対し、相補的塩基配列を持つ正
常な配列のＤＮＡを前記ＤＮＡ溶液に等量モル加え、相
互にアニールさせた。得られた二本鎖ＤＮＡは、ヘテロ
二本鎖ＤＮＡである。 （５）得られた二本鎖ＤＮＡを加熱し、図１の装置によ
って温度による吸光度の変化を解析した。正常な二本鎖
ＤＮＡについて、同様な解析を行った。 （６）正常なホモ二本鎖ＤＮＡのなす曲線は、５種類の
変異ＤＮＡを含むヘテロ二本鎖のなす曲線と明確に区別
された。
【００１６】以上、実施例及び試験例につき説明した
が、本発明は上記形態にのみ限定されるものではなく、
各構成要素の形状等に種々の変更を加えることが可能で
ある。
が、本発明は上記形態にのみ限定されるものではなく、
各構成要素の形状等に種々の変更を加えることが可能で
ある。
【００１７】
【発明の効果】以上の説明から明かなように、本発明に
よれば、簡易な操作から成り、コスト的に有利かつ自動
化も容易な遺伝子変異の検出方法及び該方法を実施する
ための装置が提供される。
よれば、簡易な操作から成り、コスト的に有利かつ自動
化も容易な遺伝子変異の検出方法及び該方法を実施する
ための装置が提供される。
【図１】本発明にかかる遺伝子の変異検出方法で使用す
ることのできる変異検出装置の実施例を説明する概念図
である。
ることのできる変異検出装置の実施例を説明する概念図
である。
【図２】図１の実施例で使用することのできるサンプル
用キュベットを説明する斜視図である。
用キュベットを説明する斜視図である。
【図３】図１の実施例で使用することのできるサンプル
用キュベットの他の例を説明する斜視図である。
用キュベットの他の例を説明する斜視図である。
【図４】GTP 加水分解因子をコードするK-ras 遺伝子の
エキソン部分４０１を示す概念図である。
エキソン部分４０１を示す概念図である。
【図５】合成オリゴヌクレオチド４０４と４０６につい
ての解離曲線を示すグラフである。
ての解離曲線を示すグラフである。
【図６】合成オリゴヌクレオチド４０５と４０７につい
ての解離曲線を示すグラフである。
ての解離曲線を示すグラフである。
【図７】合成オリゴヌクレオチド４０４と４０７につい
ての解離曲線を示すグラフである。
ての解離曲線を示すグラフである。
【図８】合成オリゴヌクレオチド４０５と４０６につい
ての解離曲線を示すグラフである。
ての解離曲線を示すグラフである。
１ ＵＶコントローラ ２ サンプル用キュベット ３ ＣＰＵボード ４ ヒータ ７ 熱電対
Claims (2)
- 【請求項１】 変異を検出しようとする対象となるＤＮ
Ａのホットスポットを挟んで、非対称ＰＣＲを行う工程
と；得られた非対称ＰＣＲ産物と、上記ＤＮＡが無変異
の場合の塩基配列に対し相補的配列を備えるオリゴヌク
レオチドとをアニールさせる工程と；得られた二本鎖Ｄ
ＮＡの溶液を加熱し、温度による吸光度の変化を解析し
て上記対象となるＤＮＡの変異を検出する工程とを含む
ことを特徴とする遺伝子変異の検出方法。 - 【請求項２】 請求項１のＤＮＡの変異を検出する工程
に用いられる検出装置であって、吸光度を計測するため
のＵＶコントローラと、サンプル用キュベットと、変異
検出操作を制御するためのＣＰＵとを具備することを特
徴とする遺伝子変異の検出装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7108379A JPH08298998A (ja) | 1995-05-02 | 1995-05-02 | 遺伝子変異の検出方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7108379A JPH08298998A (ja) | 1995-05-02 | 1995-05-02 | 遺伝子変異の検出方法及び装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08298998A true JPH08298998A (ja) | 1996-11-19 |
Family
ID=14483287
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7108379A Pending JPH08298998A (ja) | 1995-05-02 | 1995-05-02 | 遺伝子変異の検出方法及び装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08298998A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011506926A (ja) * | 2007-12-06 | 2011-03-03 | エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ | 化学反応を実施しモニターするための一体型装置 |
-
1995
- 1995-05-02 JP JP7108379A patent/JPH08298998A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011506926A (ja) * | 2007-12-06 | 2011-03-03 | エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ | 化学反応を実施しモニターするための一体型装置 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050520 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050719 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050823 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20051216 |