JPH09510614A

JPH09510614A - Ｄｎａメルトメーターおよびその使用方法

Info

Publication number: JPH09510614A
Application number: JP7524831A
Authority: JP
Inventors: マイアン，アレック
Original assignee: ガメラ・バイオサイエンス・コーポレイション
Priority date: 1994-03-24
Filing date: 1995-03-24
Publication date: 1997-10-28
Also published as: AU2128195A; US5683657A; KR970702375A; CA2186340A1; WO1995025815A1; EP0752009A1; AU695606B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＤＮＡのサイズ決定、定量、プロービング、および配列決定技術を効率的、精密かつ確実に自動的に行うためのＤＮＡメルトメーターと名付けた装置、および病理学的ならびに病的状態を速やかに診断するために該装置を臨床的および診断的に応用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡメルトメーターおよびその使用方法発明の背景１．発明の分野本発明は、医学的診断、遺伝子医学、特にこれらの分野に関連する分子生物学的方法に関する。特に、本発明は病気に関連する遺伝的多型性、病的生物、細胞および組織に関するＤＮＡ断片をサイズ決定し、定量し、プローブし、および配列決定する方法および装置を提供する。具体的には本発明は、ＤＮＡサイズ決定、定量、プロービングおよび配列決定の、有効な、正確な、信頼できる自動的実施のための、ＤＮＡメルトメーター（meltometer）と名付けられる装置、および病的および病気状態の迅速な診断のための臨床的および診断的利用に該装置を用いる方法を提供する。２．関連技術の要約遺伝医学および診断の分野において、様々な病気の状態は特殊な核酸の存在により特徴づけられる。例えば遺伝的な病気では、或る特別な変異体遺伝子が個体のゲノムＤＮＡ中に存在する。そのような特殊な変異体遺伝子の発現の減少または発現しないこと、または変異体の非機能的な遺伝子産物、または機能の変化し若しくは損なわれた遺伝子産物の発現は、個体における明白な病気を起こし、または寄与する（Ｓcriver等、1989、Ｔhe Ｍetabolic Ｂasis of Ｉnherited Ｄi sease 、ＭcＧraw−Ｈill、ニューヨーク）。感染性の病気において、病気を起こす生物からの核酸の存在は直接の症状がない場合でも病気の切迫したまたは結局の発生の存在を示す。一つの重要な例は、その感染が後天性免疫不全症候群の発症のしばしば前であるヒト免疫不全ウイルスによる感染である。起源が遺伝的でない病気の第２のカテゴリーはいわゆる環境により誘起される病気である。そのような病気は、細胞および組織への環境の毒素および他の傷害の毒素的、抗原的または栄養の作用により起こされる。結果として生ずる分子病理学は、影響を受けた細胞および組織における遺伝子発現パターンの変化の検出により同定し得る。従って、そのような指標となる核酸の具体的な検出は医者にとって重要な診断手段としての可能性を有する。過去１０年間にわたってヒト遺伝子の研究は大きい進歩を遂げ、１００以上のヒトの病気において遺伝的損傷が病気と関連して同定された（Ａntonarakis、19 89、Ｎ．Ｅngl．Ｊ．Ｍed．320:153-163）。これらの病気に関連するＤＮＡ多型性の発見とキャラクタリゼーションに用いられる技術は以下のものを含む：（１）特にポリメラーゼチエインリアクションを用いる、特別な核酸配列のインビトロでの増幅；（２）ゲル電気泳動を用いる核酸フラグメントの分離とサイズ決定；（３）様々な膜に結合した核酸の特異的なハイブリダイゼーション（いわゆる「サザーン」および「ノーザン」ハイブリダイゼーション）による、そのような多様なフラグメントの間の特殊な核酸断片の検出；および（４）分解的、またはよりしばしば合成的配列決定法によるヌクレオチド配列の決定（これらの技術の詳細についてはＳambrook等、1990、Ｍolecular Ｃloning；ＡＬaboratory Ｍa nnual 、第２版、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress、Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨークを参照）。これらの技術が研究室で強固となるのと同じ程度に、これらの技術の臨床試験への移転は困難であることが分かった。特に日常的な臨床および診断への利用に対するこれらの技術の自動化および標準化は遅れている。これは、これらの技術の全てが最終のキャラタリゼーション段階としてアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動を必要とするという事実に部分的にはよる。電気泳動は研究装置として有効だが、扱いにくく、自動化が困難で、行うのに熟練した人を必要とする。さらにゲル電気泳動技術は典型的には、エチジウブロマイド（突然変異誘発性である）およびアクリルアミド（神経毒性）等の有害な薬品、放射活性および／または高圧（４０００Ｖまで）または紫外線照射の使用などの有害な条件の使用を必要とする。さらにゲルで分離された特殊なＤＮＡ断片の可視化は、写真装置、暗室、Ｘ線フイルム現像装置を通常必要として、これらすべてはこれらの技術を非経済的なものとし、これらの分析を信頼をもって行うのに必要な熟練のレベルを上げる。従って、現在利用できる電気泳動方法を行うのに必要であるより、分子生物学的な技術でずっと熟練性を要しない技術によって用いることのできる、ゲル電気泳動に対する、簡単な、強固な、そして容易に自動化される代替物に対する臨床診断における必要性がある。分子生物学の技術内でさえ、ヒトゲノムプロジェクト（Ｏlson等、1989、Ｓcience、245：1434−1435）を含む或る領域の進行中の重要な研究は、現在利用できる、電気泳動をベースとした核酸のサイズ分離方法を用いて消費される時間量によって、その進展が達成される速度が制限される。これらの方法の代替物の有利な特徴は、従来のように訓練された臨床試験室の技術者にとって、早い「実施」時間、使用の容易さ、大きい処理量、自動化された操作を含む。発明の概要本発明は、「ゲルを用いない」核酸の検出およびキャラクタリゼーションシステムを提供し、ゲル電気泳動を使用することなく核酸をサイズ決定し、定量し、プローブし、配列決定するための装置、および該装置を用いる方法よりなる。本発明は、ＤＮＡメルトメーターと名付けられる、単一の、使用の容易な、自動化可能な装置による核酸検出を提供する。そのメルトメーターは組み合わされた次の部分からなる：約１５℃および９５−１００℃の間の任意の温度に正確に、信頼可能に、そして早く調節できる温度調節チャンバー；温度調節チャンバー中の温度を調節するための温度調節チャンバーと熱接触させた、加熱用要素および冷却用または凍結ユニットを含む温度調節器；および２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを検出するための、すなわち２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの熱変性の結果と生じた一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するための検出器よりなる。場合によりおよび有利には、該メルトメーターは、データを処理する装置およびインターフェースをも含み、それによりデータプロセッサーが装置の他の部分の動作をコントロールし、装置の作動により作られたデータを記録し、貯える。メルトメーターの部品には、温度調節チャンバーを通して液体の緩衝溶液を移動させるためのポンプをも場合により含み、温度調節チャンバーを通り、検出器を通過して緩衝液の流れを起こすよう好ましくは配置する。本発明の装置のそのような態様においては、温度調節チャンバーは第一の開口部と第二の開口部を有利には有し、それにより緩衝液は第一開口部を通ってチャンバーに流入し、第二開口部を通ってチャンバーから流出し、第二開口部は検出器に接続され、または取り付けられる。本発明により提供される装置および方法は、（ａ）長さで約５０〜約５００塩基対の範囲の核酸をサイズ決定する；（ｂ）特殊なＤＮＡフラグメントの、単独でか、またはヘテロロガスＤＮＡ断片混合物中の量を定量する；（ｃ）配列特異的な核酸プローブへのハイブリダイゼーションによる、多数の非特異的ヌクレオチド配列の中の、核酸の特異なヌクレオチド配列を検出する；および（ｃ）約２０〜約１００のヌクレオチドの長さの範囲の伸長（extended）核酸シークエンシングオリゴヌクレオチドのネスト化（nested）セットを検出するのに有用である。各伸長オリゴヌクレオチドはその３'伸長部分にポリメラーゼチェイン終了化合物を有し、それによって核酸のゲルを用いないヌクレオチド配列決定を提供する。本発明は次の技術的な考慮に基づく。従来核酸は、それらの物理的大きさに基づきゲル電気泳動によりキャラクタライズされており、その最も重要なパラメーターは長さである。物理的大きさは別として、２重鎖核酸に特徴的な他の性質は、その２つの相補鎖が互いに分離する温度である。融点Ｔｍと名付けられるこの性質は、核酸分子の５０％がその成分の１本鎖に解離した温度として定義される。ある小さい（約６００塩基対未満）核酸の融点は２つの要因によることが知られている：フラグメントの大きさ（すなわち長さ）およびフラグメントの配列および塩基組成。核酸が長いほどそれはより多くの水素結合した塩基対を有し、そのため分離するのにより大きい熱エネルギーを必要とするので、大きさはＴｍに寄与する。塩基組成効果は、Ｇ−Ｃ塩基対は、それらが塩基対間のより多きい鎖間水素結合を共有するのでＡ−Ｔ塩基対より安定であるという事実による。塩基配列効果は、２本鎖コンホメーションを安定化させる方法で各鎖内部で塩基が互いに相互作用するという事実による。知られた長さおよび塩基組成のＤＮＡ２本鎖のＴｍを予言する様々な式の使用が当業者によく知られている。本発明は、ＤＮＡ断片の長さおよび（本発明の方法のある態様で）その塩基組成を同定するためＤＮＡ断片のＴｍを用いる装置および方法を初めて提供する。塩基組成および配列のＴｍに及ぼす影響は、イソスタビライジング化合物の使用により除去できる。これらの化合物はＧＣまたはＡＴ塩基対に特異的に結合し、塩基対間の水素結合をそれぞれ脱安定化または安定化するよう作用する。イソスタビライザーの存在する場合、ある核酸フラグメントのＴｍはその長さのみの関数となる。更にイソスタビライザーは溶融転移を鋭敏にし、それによって、例えば１ヌクレオチドだけ長さの異なる、異なった核酸フラグメントの検出の分解能を増加させる。本発明の具体的な好ましい態様は、いくつかの好ましい態様の次のより詳細な記述および特許請求の範囲から明らかとなろう。図面の簡単な説明 Fig.１はＤＮＡメルトメーターの温度調節チャンバーの構造および操作を示す。図中、１は温度調節された緩衝液の流れの方向を表し、２は固定化鎖３および検出可能標識鎖４からなる連結（tethered）ＤＮＡを表し、５は温度調節チャンバーを表し、６は検出器、７は連結ＤＮＡリテイナー(retainer)、８は熱変性された、検出可能標識された連結（tethered）１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである。 Fig.２はＤＮＡメルトメーターの自動化の例を示す。図中、５は温度調節チャンバーを表し、６は検出器である。９は温度調節チャンバー５を通過する緩衝液を流動させるためのポンプである。１０は緩衝液貯蔵室であり、１１は装置の調整操作のためのデータープロセッサーを表し、１２はコンピューターによる、装置の操作の調整と装置によって産生されたデータの集積および再生を可能にする仲介装置を表す。 Fig.３ＡおよびFig.３Ｂは、メルトメーターを用いて、４７９個の塩基対について、イソスタビライザーである塩化テトラエチルアンモニウムの存在下（Fig. ３Ｂ）および不存在下（Fig.３Ａ）でのＴm測定結果を示す。 Fig.４は、このメルトメーターを用いて、イソスタビライザーである塩化テトラエチルアンモニウムの存在下および不存在下でのネスト化または非ネスト化フラグメントのＴmおよび大きさの測定結果を示す。 Fig.５Ａ〜５ＤはＤＮＡ鋳型にハイブリダイズされ、続いて変性され、このメルトメーターを用いて検出された複合（multiplex）プローブの検出を示す。Fig .５Ａ〜５Ｃは３個（Fig.５Ａおよび５Ｂ）または４個（Fig.５Ｃ）のプローブのＴmに基づく検出を示し、Fig.５ＤはFig.５Ｃに示されたと同様に分離されたＤＮＡフラグメントの従来のゲル電気泳動を示す。図中、レーン１は１５量体、２３量体（ミスマッチ）および３０量体のＤＮＡサイズマーカーであり；レーン２は１５量体、２３量体および３０量体のＤＮＡサイズマーカーであり；レーン３−６は、１５量体（レーン３）、ミスマッチ２３量体（レーン４）、２３量体（レーン５）および３０量体（レーン６）を含有するメルトメーターピークから得られた。好ましい具体例の詳細な記載この発明は核酸フラグメント、好ましくは２本鎖ＤＮＡフラグメントのゲルを用いない大きさの測定、定量、プロービングおよび配列決定のためのＤＮＡメルトメーターと名付けられた装置を提供するものである。ＤＮＡメルトメーターは適当な条件下でＤＮＡフラグメントのＴmが本質的にＤＮＡフラグメントの長さの関数であるという原理に基づく。この発明はまた、イソスタビライジング化合物の存在下または不存在下でＤＮＡフラグメントの大きさの測定、定量、プロービングおよび配列決定の方法をも提供する。この装置は、ＤＮＡなどの２本鎖核酸の緩衝液を含むための温度調節チャンバー（Fig.１中５）−この中でＤＮＡは熱変性される−を含む。温度調節チャンバーの具体例には、熱伝導物質からなる熱遮断物内に収容された薄膜ポリプロピレン管が含まれ、この例は有利には試料の交差汚染の可能性を避けるという単一の用途に限定される。メルトメーターの温度調節チャンバー要素の別の具体例は熱伝導物質からなり、試料を挿入し、各試料測定後の試料を流し出すための少なくとも１個の開口部を有する空洞が区切られている。有利にはこのメルトメーターの温度調節チャンバーは第１および第２の開口部を有し、緩衝液、または試料含有溶液またはその他の溶液のこの室の通過を可能とする。メルトメーターの上記の具体例において、緩衝液貯蔵室（Fig.２中１０）から温度調節チャンバーを通り、検出器（Fig.１および２中６）通り越して、緩衝液を通過させるためのポンプ（Fig.２中９）を含む。ＤＮＡメルトメーターのこの具体例において有用なポンプの例は高圧液体クロマトグラフィーポンプ（ベックマンサイエンティフィックインスツルメント社製、フラートン、ＣＡ）である。別の具体例では、温度調節チャンバーは連続的かつ同時に多重測定を可能にする多数の試料ウェルが区切られている。ある種の例において、温度調節チャンバーはまた、２本鎖核酸リテイナー（Fi g.１中７）で構成される。リテイナーの例としては、これに限定されるものではないが、ラテックスビーズに連結されている（tethered）核酸フラグメントを保持するためのテフロン（商品名）フィルターである。好適に用いられる他のリテイナーの例としては、トランスフェリンまたは常磁性ビーズ（ダイナル社製、オスロ、ノルウエー）などの金属鉄結合剤に連結された（tethered）核酸フラグメントを保持するための外部磁場発生器である。このメルトメーターの温度調節チャンバーは室内の温度を調節するための加熱手段および／または冷却または冷凍ユニットなどの温度調節装置と熱的接触している。種々の温度調節ユニットが当業者に公知であり、これに限定されるものではないが、金属性加熱ストリップ、冷却ファン、冷凍ユニットなどが挙げられる。特に、温度調節器は温度を±１℃、より好ましくは±０．１℃、最も好ましくは±０.０１℃内に調節可能なものが公知である（このような温度調節器の例はエッペンドルフ社製、ハンブルグ、ドイツのものである）。２本鎖核酸の１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡへの分離を含む核酸の熱変性は、ＤＮＡフラグメントの１本鎖配座異性体の物理的特性を検出する検出器（Fig.１および２中６）を用いて検出する。この特性は、主として３つのカテゴリーの検出器：直接検出器、準直接検出器および間接検出器によって検出され得る。熱変性の直接検出は、例えば、２本鎖核酸がその１本鎖成分に変性するときに放出される分離の熱を検出する熱量計を用いてなされ得る。直接検出の他の例は分光光度検出である。この検出方法において検出されるものは、熱変性に関連する２６０ｎｍの波長における紫外線の吸収の増加である（いわゆる変性濃色効果）。この直接法は、当業者は標的核酸のナノモル（〜１０^-14分子）の条件に限定されるものと理解される。熱変性検出の準直接法の例としては、１本または２本鎖立体配座特異的色素および挿入化合物の結合または分離の検出である。すなわち、例えば、熱変性は、分光光度検出可能２本鎖特異的色素、結合部分（binding moiety）または挿入（ intercalating）化合物の効果的濃度の増加によって検出され得る。具体的には、これらの種類の色素は、色素が２本鎖ＤＮＡ分子への結合、連結または挿入するかどうかによって、ある波長で光を吸収または放出する。この種の色素を用いて、２本鎖ＤＮＡ分子に結合、連結または挿入される色素の量が、ＤＮＡ分子が熱変性されたとき適当な波長で光の吸収または放出の増加（または減少）によって測定され得る。別法として、熱変性は分光光度検出可能１本鎖特異的色素、結合部分または挿入化合物の効果的濃度における減少によって検出され得る。これらの色素は、特定のおよび特徴的波長において吸収または放出される光の量が、色素が１本鎖ＤＮＡ分子に結合、連結または挿入されるかどうかによって変化するという点で２本鎖特異的色素と類似である。すなわち、これらの型の色素を用いて、１本鎖ＤＮＡ分子に結合、連結または挿入される色素の量は、１本鎖ＤＮＡの量が２本鎖ＤＮＡの変性で増加したとき、適当な波長での光の吸収または放出における増加（または減少）によって測定され得る。より複雑なサンドイッチ法が公知であるが、これは、さらに別の特異的結合成分が、熱変性と、検出可能色素、結合部分または挿入物の効果的濃度の増加または減少間の中間段階に関与する。この方法では、色素または中間体特異的結合部分のいずれかの結合または放出が、検出可能色素の効果的濃度における増加または減少によって分光光学的に検出され得る。種々の有用な核酸特異的色素化合物が公知であり、例えば、エチジウムブロミド、または好ましくは、ＤＡＰＩ、ヘキスト３３２５８、および最も好ましくは、ＴＯＴＯ／ＹＯＹＯ（モルキュラープローブ、ユージーン、ＯＲ）である。この後者の色素を使用すると、標的核酸のフェムトモル（〜１０^-9 分子）程度の少量でも検出可能である（グレーザーおよびヘイ、１９９２、ネイチャー３５９：８５９参照）。間接検出法としては、これに限定されるものではないが、蛍光的または赤外− 標識１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの蛍光または赤外分光光度分析である。蛍光検出は好ましくは、非変性核酸が温度調節チャンバー内に保持されている温度調節チャンバーを用いる条件下で、温度調節チャンバーを通り、検出器を通り越して通過する緩衝液の流れを含むメルトメーターの例で用いられる。この配置の例はFi g.１に示されている。この発明の装置を用いる間接検出の例として、緩衝液、好ましくは標準クエン酸塩（ＳＳＣ；サムブルックら、１９９０、前掲）などの水性緩衝液が、当初当該特定ＤＮＡフラグメントのＴm以下である温度の温度調節チャンバー５を通過して流れるようにされている（Fig.１中１は温度調節緩衝液の流れの方向を表す）。この室内に、リテイナー７に保持された試料である連結（tethered）ＤＮＡ２がある。連結２本鎖ＤＮＡは固定化鎖３および検出可能標識、好ましくは蛍光的または赤外標識鎖４からなる。温度調節チャンバー内の温度を上昇させると、ＤＮＡは特徴的温度（Ｔm）で変性し、緩衝液の流れによって、標識可能鎖は温度調節チャンバー５から検出器６を通り越して移動し、検出器で熱変性された蛍光的または赤外標識１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子７として検出される。蛍光または赤外に基づく間接検出法を用いれば、溶液中１０００− ２０００個の分子（ミドンドルフら、１９９２、エレクトロホレイシス、１３：４８７）、または、理論的には１個の分子でさえ（デービスら、１９９１、ＧＡＴＡ８：１）検出が可能である。本発明により提供されるメルトメーターの使用においては、サイズを決定し、定量し、プローブし、または配列決定すべき核酸を都合よく修飾して１本の鎖上に連結（tethering）分子を含ませる。このような連結分子の導入は、温度調節チャンバー中に２本鎖の核酸を保持し、およびディテクターによる未変性ＤＮＡの検出を防止する方法を提供する。これは、温度調節チャンバー内部の２本鎖核酸を連結、固着又は固定化することにより達成される。未変性ＤＮＡは温度調節チャンバー自体、またはより好ましくは温度調節チャンバー内のリテイナー（re tainer）（第１図の７）に固着、連結または固定化し得る。連結分子とリテイナー（retainer）の好都合な組合せは、ストレプタビジンでコートされたラテックスまたはガラスビーズに結合されビオチニル化された核酸を含むがこれに限定されない。そして、テフロン（登録商標）膜により温度調節チャンバー内に保持される。また、本発明のそのような好都合な態様には、ポルフィリンまたはフェリチンなどのキレート部分を使用するかまたは使用することなしに磁性金属に連結した核酸も含まれ、外部磁場を適用することにより、温度調節チャンバー内に保持される。連結分子は置換合成、ハイブリダイゼーション、インビトロの化学合成またはインビトロ増幅の間の化学修飾により２本鎖の核酸に付加し得る。本発明により提供されるメルトメーターの使用においてサイズ決定し、定量し、プローブしまたは配列決定すべき核酸を都合よく修飾して、一方の鎖上に検出可能な標識を含ませる。このような検出可能な標識の導入は、２本鎖の核酸の変性の検出方法を提供する。１つの限定されない好ましい検出可能な標識の例は、フルオレセインまたはローダミンなどの蛍光標識またはポリメチン色素などの赤外線標識である。検出可能な標識分子は、置換合成、ハイブリダイゼーション、インビトロの化学合成またはインビトロ増幅の間の化学修飾により２本鎖の核酸に付加し得る。また、本発明のこの態様には、２本鎖の核酸への標識可能な標識の非共有結合による導入、例えば１本鎖または２本鎖のコンフォメーションに特異的な検出可能な色素のインターカレーションも含まれる。このような核酸コンフォメーションに特異的な色素分子の例には、エチジウムブロミドまたは好ましくはＤＡＰＩ、ヘキスト３３２５８、及び最も好ましくはＴＯＴＯ／ＹＯＹＯが含まれるがこれに限られない。さらに、緩衝液チャンバー内部の溶液はイソスタビライジング化合物から構成されるのが都合よい。イソスタビライジング化合物の例にはベタイン、サルコシン、タウリン、グリセロール、ＴＭＡＯ、ＴＭＡＣl、ＴＥＡＣlその他が含まれ、そのイソスタビライジング特性を以下の表１に開示する。このようなイソスタビライジング化合物の使用は有利である。なぜならば、これらの化合物は、核酸のＴｍがその長さに比例する度合を増加させるからである［ウッド（Wood）ら，プロシーディング・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンセス・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．USA），８２巻，１５８５〜１５８８頁，（１９８５年）参照］。さらに、本発明のイソスタビライジング化合物は融解転移を鋭敏にするべく作用する。即ち、それらは２本鎖核酸が本質的に完全な２本鎖から本質的に完全な１本鎖へ変化する温度範囲を減少させるように作用する［Reesら，バイオケミストリー（Biochemistry），３２巻，１３７頁，（１９９２年）を参照］。この特徴は有利なものである。なぜならば、これは、ＤＮＡ置換合成配列決定反応の生成物を表す伸長オリゴヌクレオチドのネスト化セットなどの、極限では、１つの塩基対が異なっている、異なる核酸の分解能の上昇をもたらすからである。ＤＮＡメルトメーターは好ましい態様で自動化された装置として提供される。このメルトメーターのこの態様の模式的ダイアグラムを第２図に示す。この態様では、操作段階がコンピューター等のデータープロッセッサ（第２図の１１）により制御されたインターフェースユニット（第２図の１２）、好ましくは、例えばオメガＯＭ−９００ユニットなどのＩ／Ｏインターフェースにより制御されている。操作段階は、温度調節ユニットの制御、温度調節チャンバー内を通る緩衝液の流速の制御、及びディテクターによる熱変性の検出の制御を包含する。さらにこのメルトメーターのこの好ましい態様の特徴は、装置の操作により生じたデータを得、記録し、保存するためのコンピューターの使用にある。本発明により提供されるＤＮＡメルトメーターは核酸の、ゲルを使用しないサイズの決定、定量、プローブ、および配列決定を可能とするのに有用である。核酸フラグメント例えば、本発明により提供されるＤＮＡフラグメントのサイズの決定の方法は、そのＤＮＡフラグメントの熱変性温度以下の温度でメルトメーターの温度調節チャンバー内にそのＤＮＡフラグメントを含む溶液を置く工程を含んでなる。次いで、温度調節チャンバーの温度を、ＤＮＡフラグメントの変性を検出及び解読するのに十分な速度で直線的かつ厳密に（±０．０１から１℃）に増加させる。ＤＮＡフラグメントの熱変性がこれによって検出される。好ましい態様ではＤＮＡフラグメントの一方の鎖は連結分子に連結しており、リテイナーにより温度調節チャンバー内で保持されている。このフラグメントの他方の鎖は検出可能な標識、即ち、例えば蛍光標識または赤外線標識に連結している。温度調節チャンバーは熱変性の間に緩衝液が温度調節チャンバーを通って流れる第１及び第２の開口部を有するように有利に配置する。熱変性した、１本鎖の、蛍光または赤外線標識されたＤＮＡ分子は、温度調節チャンバーを通過する緩衝液の流れの結果としてディテクターを通過して流れ、それによって検出される。この方法の好都合な改変では、一組のＤＮＡサイズマーカーフラグメントを温度調節チャンバーに加える。このようなマーカーフラグメントは好ましくはディテクターが各マーカーフラグメントと試料ＤＮＡフラグメントを判別できるよう異なった標識をする。次いで、ＤＮＡ試料のサイズを、各ＤＮＡマーカーフラグメントについて検出された熱変性温度を用いて作成された標準曲線との比較によって決定する。ＤＮＡフラグメントを定量する方法は、ディテクターにより検出されたＤＮＡフラグメントの量を計算するさらなる段階を含んでなる。１つの態様では、検出されたフラグメントの量は、特定波長における吸収と吸収物質の量との関係に関するＢｅｅｒの法則等の当業者によく知られているアルゴリズムを用いて、検出された標識ＤＮＡの全強度から定量化する。本発明により提供される多様なＤＮＡフラグメントのなかから特定のＤＮＡフラグメントを特異的に検出するための、核酸フラグメント、例えばＤＮＡフラグメントをプローブする方法は、以下の段階を含んでなる。多様な２本鎖ＤＮＡフラグメントそれぞれの一方の鎖を連結分子に連結する。次いで、多様な２本鎖ＤＮＡフラグメントが温度調節チャンバー内で保持されるようにリテイナーの存在下で、多様な（multiplicity）連結された２本鎖ＤＮＡフラグメントの溶液をメルトメーターの温度調節チャンバー内に置く。次に、温度調節チャンバーの温度を、多様なＤＮＡフラグメントを熱変性させるに十分な温度に上昇させる。若しくは、ＤＮＡ試料を温度調節チャンバーに添加する前に熱変性を行ってもよい。この熱変性により、温度調節チャンバー内に存在する多様な１本鎖ＤＮＡフラグメントを生じ、それらは配列に特異的なプローブとの後のハイブリダイゼーションに対する標的となるものである。次いで、検出可能な標識核酸プローブをハイブリダイゼーション溶液中で多様なＤＮＡフラグメントにハイブリダイズする。該プローブは、多様なＤＮＡフラグメントには不活性で特定のＤＮＡフラグメントに対し特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、温度は該ハイブリダイゼーションを起こさせるに充分な温度であることが好ましい。次いで、過剰のプローブを温度調節チャンバーから除いた後、温度調節チャンバー内の温度を目的の特定のＤＮＡフラグメントに由来するハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプローブを検出し解読するのに十分な速度で直線的かつ厳密に（±０ .０１から１℃）に上昇させる。好ましい態様では多様なＤＮＡフラグメントの一方の鎖は連結分子に連結しており、リテイナーにより温度調節チャンバー中で保持されている。オリゴヌクレオチドは検出可能な標識、即ち、蛍光標識または赤外線標識に連結している。温度調節チャンバーは熱変性の間に緩衝液が温度調節チャンバー内を流れる第１及び第２の出入り口を有するようにする。次いで、熱変性したオリゴヌクレオチドの、蛍光または赤外線標識されたプローブは、温度調節チャンバーを流れる緩衝液のためにディテクターを通過して流れ、それによって検出される。本発明により提供される核酸フラグメント、例えばＤＮＡフラグメントを配列決定するための方法は、以下の段階を含んでなる。多様な２本鎖ＤＮＡフラグメントそれぞれの一方の鎖を連結分子に連結し、多様な２本鎖ＤＮＡフラグメントが温度調節チャンバー内で保持されるようにリテイナーの存在下で、多様な連結された２本鎖ＤＮＡフラグメントの溶液をメルトメーターの温度調節チャンバー内に置く。次に、温度調節チャンバーの温度を、多様なＤＮＡフラグメントを熱変性させるに十分な温度に上昇させる。若しくは、ＤＮＡ試料を温度調節チャンバーに添加する前に熱変性を行ってもよい。この熱変性により、温度調節チャンバー内に存在する多様な１本鎖ＤＮＡフラグメントを生じ、それらは配列に特異的なプローブとの後のハイブリダイゼーションに対する標的となるものである。配列決定される部位に隣接する、ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列中の部位に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列決定プライマーを、変性したＤＮＡにアニールする。このアニール段階は鋳型ＤＮＡに対するプライマーのアニールを起こさせるに十分な温度で行う。次いで、慣用のジデオキシヌクレオチド置換合成核酸配列決定反応を行い、ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズした伸長オリゴヌクレオチドのネスト化セットを形成する。次に、温度調節チャンバー内の温度を目的の特定のＤＮＡフラグメントにハイブリダイズした伸長オリゴヌクレオチドのネスト化セットのそれぞれの変性を検出し解読するのに十分な速度で直線的かつ厳密に（±０.０１から１℃）に上昇させる。伸長オリゴヌクレオチドのネスト化セットのそれぞれの種をＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列を反映する一時的な（temporal）配列中でディテクターにより検出する。好ましい態様では多様なＤＮＡフラグメントの一方の鎖、即ち、オリゴヌクレオチドプライマーに相補的な鎖は連結分子に連結しており、リテイナーにより温度調節チャンバー中で保持されている。延長オリゴヌクレオチドの各組は、蛍光標識または赤外線標識されたジデオキシ末端残基により３'末端で検出可能なように標識されている。要すれば、ディテクターにより独立に検出可能なように各デオキシヌクレオチドを異なるように標識するのが都合よい。温度調節チャンバーは熱変性の間に緩衝液が温度調節チャンバー中を流れる第１及び第２の出入り口を有するようにする。次いで、熱変性した、蛍光または赤外線標識された延長オリゴヌクレオチドそれぞれが温度調節チャンバーを流れる緩衝液のためにディテクターを通過して流れ、それによってＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列を反映する一時的な配列中で検出される。当業者はまた、成分部分に解離しうる以外の本質的にあらゆる生物分子の相互作用をアッセイするのにメルトメーターを用いることができることを理解するであろう。唯一必要なことは、相互作用する分子の一つがメルトメーター内に保持しうること、および他の相互作用する分子の少なくとも一つが、たとえば蛍光標識または放射能標識で検出可能に標識しうることである。ＤＮＡ分析について記載された温度傾斜または勾配に加え、たとえば塩濃度、誘電定数、カオトロープ剤濃度、または１価または２価のカチオン濃度などの溶液勾配を用いることができる。一つの制限されない例はタンパク質−ＤＮＡ相互作用であり、該相互作用はタンパク質のＤＮＡ結合活性についえ測定することができる。この例では、ＤＮＡをメルトメーターチャンバーに上記のように保持し、蛍光標識したタンパク質を該保持ＤＮＡと相互作用させる。ついて、タンパク質を塩勾配により特異的に溶出させて蛍光分光光度計により検出して、ＤＮＡとタンパク質との間の結合相互作用の強度を定量測定する。本明細書において記載するＤＮＡメルトメーターの他の有利な使用は、当業者には明らかであり、開示した本発明の範囲に包含されるであろう。下記実施例は、本発明のある種の好ましい態様をさらに説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。実施例１ＤＮＡメルトメーターを用いた特定のＰＣＲ生成物の検出、サイズ決定および定量標準技術を用いて複製連鎖反応を行う。増幅すべきＤＮＡ鋳型を含むＤＮＡ試料を、増幅すべきＤＮＡ断片の両側のＤＮＡ配列に相同でビオチンなどの保持分子で５'末端を標識した１５〜３０ヌクレオチドの第一のオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを含む反応混合物中に、約１０⁴分子／反応の最終濃度にて混合する。この反応混合物にはまた、増幅すべきＤＮＡ断片の両側のＤＮＡ配列に相同で、第一のＰＣＲプライマーに相同な鎖と反対の鎖上にある１５〜３０ヌクレオチドの第二のオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーも含まれており、該第二のＰＣＲプライマーは５'末端がローダミンやフルオレセインなどの蛍光分子またはポリメチン染料などの赤外標識で標識されている。各ＰＣＲプライマーは反応混合物中に１μＭの最終濃度で含まれる。反応混合物にはまた、（１）テルムス・アクアチクス（Ｔ.aquaticus）からの熱安定性ポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー−シータス（Ｐerkin Ｅlmer-Ｃetus）、エメリービル、カリフォルニアから入手）（１〜５Ｕ／反応の最終濃度）、（２）４つのテオキシヌクレオチド３リン酸（約２００μのＭの全ｄＮＴＰ濃度）、および（３）使用したポリメラーゼ酵素に適した緩衝液であって、典型的にマグネシウムイオン塩を１〜５ｍＭの濃度で含むものも含まれる。ＤＮＡ断片は、二本鎖ＤＮＡの変性、アニールおよびオリゴヌクレオチドプライマーのポリメラーゼにより触媒された伸長からなるサイクルを繰り返すことを含む増幅プロトコールに従って増幅させる。増幅は１０〜４０サイクル、または約５０〜１５００ｎｇ（１〜１００ピコモル）のＤＮＡ断片が生成されるまで行う。特定のＤＮＡ断片は、ＤＮＡメルトメーターを用いて下記のようにして検出する。増幅断片を含むＰＣＲ反応液に、テフロン（Ｔeflon^R）フィルターに保持するに充分なサイズのストレプトアビジンコーティングビーズを含む溶液を加える。各増幅ＤＮＡ断片の一方の鎖上にあるビオチン化末端によりラテックスビーズに該断片が結合した後、ラテックスビーズの結合したＤＮＡ断片の混合物をメルトメーターの温度調節チャンバー（該チャンバーはテフロン保持フィルターを含む）に入れる。温度調節チャンバーは使用前のＤＮＡ断片の熱変性温度未満の温度に平衡化されており、典型的に１５℃の温度に平衡化されている。温度調節チャンバーから検出器を通る緩衝液溶液の流れを作るためにポンプを用い、ＤＮＡ断片の蛍光標識したまたは赤外標識した鎖を検出するため検量する。ＤＮＡ断片の検出を行うために本明細書に記載する各制御段階は、Ｉ／Ｏインターフェースと組み合わせたコンピュータにより行うのが好ましく、検出器から得られたデータも実験の永久記録のためにコンピュータにより記録する。特定の増幅したＤＮＡ断片を検出するため、該ＤＮＡ断片の変性を検出および解析するに充分な速度にて直線状かつ厳格に（±０.０１〜１℃）温度調節チャンバーの温度を上昇させる。温度調節チャンバーには場合によりＤＮＡサイズマーカー断片のセットも含まれ、その際、各断片は、一方の鎖上でビオチンで標識され、それによってストレプトアビジンコーティングラテックスビーズに結合され、他方の鎖上では蛍光標識または赤外標識で標識されている。温度調節チャンバーにはまた、所定量のイソスタビライジング化合物も含まれる。ＤＮＡ断片の検出は、検出器による適当なシグナルの検出により行う。この決定の正確さは、ＤＮＡサイズマーカー断片と関連させて、ＤＮＡ断片の観察されたサイズをＤＮＡ断片の期待されるサイズと比較することにより増大する。加えて、検出した特定のＤＮＡの量は、かかる目的のためによく知られたアルゴリズムを用い、検出した標識ＤＮＡ断片の全吸光度を積分することにより決定することができる。特定の検出した断片の量は、該断片に特異的な適当な波長で検出した全吸光度と関係付けられるであろう。特定の検出可能な標識の使用は、この目的のために特に有利である。実施例２ＤＮＡメルトメーターを用いたオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡとの特異的ハイブリダイゼーションの検出ヒトゲノムＤＮＡと遺伝子多型特異的プローブとのハイブリダイゼーションを下記のようにして行う。鎌状赤血球貧血の素質［ヒトβ−グロビン遺伝子におけるＧＴＧ（Ｇｌｕ⁶）→ＧＡＧ（Ｖａｌ⁶）］の保有者と診断された個体からのＤＮＡを、多型を破壊せず、各制限断片の凹んだ３'末端を生成する制限酵素で消化する。ついで、該ＤＮＡを、たとえば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびフェリチン化ｄＵＴＰを用いた該３' 凹末端の充填反応を行うことにより、標準条件下で（サンブルックらの上記文献参照）フェリチンで標識する。上記フェリチン化ＤＮＡ試料をまず変性し、ついでメルトメーターの温度調節チャンバー中に入れるが、該チャンバーは外部磁場生成器を備えている。該磁場は、実験の残りの経過において適用する。温度調節チャンバーに、ヒトβ−グロビンの鎌状赤血球貧血に関連する対立遺伝子に相同で、５'末端がたとえばローダミンやフルオレセインなどの蛍光分子またはポリメチン染料などの赤外標識で標識したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを加える。ついで、温度調節チャンバーを、該ＤＮＡ試料のヒトゲノムＤＮＡ中の相同部位を有するオリゴヌクレオチドプローブの熱変性温度未満の温度に調節する。ハイブリダイゼーションを最大量のハイブリダイゼーションが起こるのを可能とする適当な時間行い、ついで過剰のハイブリダイズしなかったプローブを洗浄溶液［典型的に０.１〜２×標準食塩クエン酸（ＳＳＣ）中の０.１〜１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）からなり、１×ＳＳＣは０.１５ＭＮａＣｌおよび０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０からなる］を用いて温度調節チャンバーから洗い出す。ポンプを用いて温度調節チャンバーから検出器までの洗浄溶液の流れを生成させるが、このものは標識プローブを検出するため検量する。ＤＮＡ断片の検出を行うために本明細書に記載する各制御段階は、Ｉ／Ｏインターフェースと組み合わせたコンピュータにより行うのが好ましく、検出器から得られたデータも実験の永久記録のためにコンピュータにより記録する。検出器がもはや過剰のハイブリダイズしていないプローブの通過を検出できないときは、ゲノムＤＮＡからオリゴヌクレオチドプローブの変性を検出および解析し変性したＤＮＡプローブの検出を可能にするに充分な速度にて直線状かつ厳格に（±０.０１〜１℃）温度調節チャンバーの温度を上昇させる。オリゴヌクレオチドの検出は、検出器により適当なシグナルを検出することにより行う。鎌状赤血球貧血の素質についてヘテロ接合である個体からのＤＮＡを用いる場合は、２つの異なる温度で生じる２つの区別される熱変性事象が検出されることが期待される。第一のものは、鎌状赤血球貧血に関連しない対立遺伝子の部位からのプローブの変性であり、この変性は、ゲノムＤＮＡとオリゴヌクレオチドプローブとの間の変異部位のミスマッチの存在のために一層低い温度で生じるであろう。第二の検出される変性事象は鎌状赤血球貧血に関連する対立遺伝子の部位からのプローブの変性であり、この変性は、ゲノムＤＮＡとオリゴヌクレオチドプローブとの間の変異部位が正確にマッチするために一層高い温度で生じるであろう。場合により、温度調節チャンバーにはＤＮＡサイズマーカー断片のセットも含まれ、その際、各断片は、一方の鎖上でフェリチンで標識され、それによって外部から適用される磁場によって温度調節チャンバー中に保持され、他方の鎖上では蛍光標識または赤外標識で標識されている。温度調節チャンバーにはまた、所定量のイソスタビライジング化合物も含まれる。この決定の正確さは、ＤＮＡサイズマーカー断片と関連させて、ＤＮＡ断片の観察されたサイズをＤＮＡ断片の期待されるサイズと比較することにより増大する。実施例３ＤＮＡメルトメーターを用いたＤＮＡ配列決定遺伝子多型の部位のジデオキシヌクレオチド／置換合成核酸配列決定を行い、伸長したオリゴヌクレオチドのネスト化のセットを下記のようにＤＮＡメルトメーターを用いて検出した。のう胞性線維症を引き起こす遺伝子多型の保有者であると診断された（のう胞性線維症膜貫通調節遺伝子においてＰｈｅ⁴⁶³をコードする３塩基コドンの欠失）個体からのＤＮＡを、多型を破壊せず、各制限断片の凹んだ３'末端を生成する制限酵素で消化する。ついで、該ＤＮＡを、標準条件下、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いた該３'凹末端の充填反応を行うことによりビオチン化ｄＵＴＰで標識する（このプロトコールの詳細はサンブルックらの上記文献を参照）。別法として、遺伝子多型の部位を包含するＤＮＡ断片は実施例１に記載したインビトロ増幅によって製造される。ついで、ビオチン化ＤＮＡ試料を変性させ、ストレプトアビジンコーティングしたラテックスビーズと混合し、ついでメルトメーターの温度調節チャンバー中に入れる。該チャンバーはテフロン保持フィルターを含む。ついで、のう胞性線維症に関連するＤＮＡ断片中の多型の両側の部位にハイブリダイズするＤＮＡ配列決定オリゴヌクレオチドプライマーを温度調節チャンバーに加える。ついで、ＤＮＡポリメラーゼ、適当な緩衝液および非標識ｄＮＴＰの混合物および４つの異なるように蛍光または赤外標識したジデオキシヌクレオチド３リン酸を、該配列決定プライマーがアニールすることができ該ポリメラーゼがのう胞性線維症の多型部位を包含する伸長されたオリゴヌクレオチドのセット中にｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰを導入することができる温度にて温度調節チャンバーに加える。オリゴヌクレオチドの最大量の伸長が起こるのに可能な適当な時間の後、上記実施例２のような温度調節チャンバーから検出器までの洗浄溶液の流れを生成させるポンプを用いて過剰の配列決定反応混合物を温度調節チャンバーから流し出す。該検出器は標識ｄｄＮＴＰのそれそれを検出すべく検量してある。ＤＮＡ断片の検出を行うために本明細書に記載する各制御段階は、Ｉ／Ｏインターフェースと組み合わせたコンピュータにより行うのが好ましく、検出器から得られたデータも実験の永久記録のためにコンピュータにより記録する。検出器が過剰の遊離ddＮＴＰsの通過をもはや検出しない場合は、対象のＤＮＡフラグメントにハイブリダイズした伸長オリゴヌクレオチドのネスト化(neste d)セットそれぞれの変性を検出および分析するのに、かつ識別的に標識した伸長オリゴヌクレオチドプライマーの検出を可能にするのに充分な速度で直線的および緊縮的に（±０.０１ないし１℃）温度調節チャンバーの温度を次第に上げる。伸長オリゴヌクレオチドは、検出器で適当なシグナルを検出することにより検出する。ＤＮＡ配列は、検出器を通過した検出シグナルを経時的に配列することにより決定する。所望により、温度調節チャンバー内にある量のイソスタビライジング化合物を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、配列を決定するための理論的な温度変性プロフィールは、表IIに示す。この表のデータは、下記のようにして得たものである。隣接（nearest-neighbor）熱力学パラメーターを分析することにより（ブレスロウア等、1986、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ・ＵＳＡ、83巻、3746頁参照）、単一ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドプライマーに加えた時の配列のＴm（℃ ）の増大を測定した。この表から分かるように、特に、精度±０.０１℃の温度調節器が市販されているという事実からみて、２２.５℃→８２.６℃の熱変性プロフィールでＤＮＡメルトメーターを用いて、理論的に約６０塩基対のＤＮＡ配列を読み取ることができる。実施例４ＤＮＡメルトメーターを用いる特定ＰＣＲ生成物のＤＮＡサイズ決定分析ポリメラーゼ連鎖反応により生成したＤＮＡフラグメントを実施例１に記載のようにして一定の大きさにする。異なる長さのＤＮＡフラグメント７つのネスト化セットを、鋳型としてバクテリオファージＭ１３mp１８を用いて製造した（その配列は、知られており、例えば、ニュー・イングランド・バイオラブス・カタログ、添付表参照）。単一の共通センス配向（即ち、５'）プライマーを５'プライマー部位から増大間隔３'でＭ１３mp１８配列に沿って配置した独特の３'プライマーのセットの１つと共に個々の反応に使用する一連のＰＣＲプライマーを用いてネスト化セットを製造した。その結果、共通の５'末端を共有し、かつこの共通末端からサイズオーダー３'でＭ１３mp１８ＤＮＡ配列の量を増大しているＤＮＡフラグメントのネスト化セットを得た。使用したプライマーの同一性は、表IIIに詳細に示してあり、各プライマーは、センス（Ｆ）またはアンチセンス（Ｒ）として、かつＭ１３mp１８配列と関連する各プライマーの５'末端の位置により同定する。これらのＰＣＲ反応の実施に当たり、５'共通プライマーをビオチニル化し、３'プラィマーをγ−³²Ｐ標識化ＡＴＰおよびＴ4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて³²Ｐで標識した：この反応は、製造元の説明書（ニュー・イングランド・バイオラブス、マサチューセッツ州ビバリー）および標準技術（サンブルック等、同上）に従って実施した。これらのプライマー（各プライマー３０pmol）を用いるＰＣＲ反応は、標準反応条件（ＰＣＲプトロコールズ、アカデミック・プレス；ニュー・ヨーク、1990参照）を用いて３０サイクル実施し、各サイクルは、９４℃で０.５分、５０℃で０.５分、および７２℃で０.５分で構成した。これらのＰＣＲ反応から、６７、１１５、１５４、３２１、４９７、７６３および１０００bpのＰＣＲ生成物ＤＮＡフラグメントネスト化セットを得た。加えて、非ネスト化３０bpフラグメントおよび１３８bpおよび５０８bpの２つの非関連ＰＣＲ生成物ＤＮＡフラグメントがラムダファージＤＮＡから同時に生成した。そのＰＣＲ生成物を一旦、それぞれ緩衝液平衡化フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させ、０.３pmol／μＬの濃度で水に再懸濁させた。メルトメーターを用いるＤＮＡサイズ決定の準備にあたり、ストレプトアビジン被覆化Ｍ−２８０ダイナビーズ（ノルウェイ、オスロ、ダイネル）５０μgを結合緩衝液（１ＭＮaＣl、１０mＭトリス−ＨＣl、ｐＨ７.５、１mＭＥＤＴＡ）中で３回洗浄した。上記のようにして生成した各ＰＣＲ生成物ＤＮＡフラグメント１.５pmolを室温で３０分間５０μgダイナビーズと共にインキュベーションすることにより、結合緩衝液５０μＬ中ダイナビーズに結合させた。次いで、得られたダイナビーズ結合ＤＮＡの懸濁液を結合緩衝液中で３回、メルトメーター緩衝液中で３回洗浄した。本研究では２処方のメルトメーター緩衝液を用いた；ＮaＣl緩衝液（５０ mＭＮaＣl、１０mＭトリス−ＨＣl、ｐＨ７.５、１mＭＥＤＴＡ、０.１％(ｖ:ｖ )トゥイーン２０）およびＴＴＥＡＣl緩衝液（２.４ＭＴＥＡＣl、５mＭＫＨ₂ＰＯ₄、１mＭＥＤＴＡ）。上記のようにして生成した１０のＰＣＲ生成物ＤＮＡフラグメントそれぞれをメルトメーターを用いて個々に一定の大きさにした。各ＤＮＡフラグメントに対して２回の測定を行った：１回はＮaＣl緩衝液を用い、もう１回はＴＥＡＣl緩衝液を用いた。ビーズ結合ＤＮＡの充填中、メルトメーターを２５℃に維持した。充填中、緩衝液流は３０μＬ／分に維持し、迂回させて浪費した。ＤＮＡ結合ビーズを適切なメルトメーター駆動用（ランニング）緩衝液で１００μＬに希釈し、０.５μmのサイズ射出フリットを備えたメルトメーター加熱ブロックに直接注入した。充填後、緩衝液流をメルトメーターに向け直し、加熱プロフィール開始前に試料を少なくとも５分２５℃で洗浄した。各ＤＮＡメルトメーターサイズ測定は、温度を１℃／分で２５℃から９９．５℃に上げる温度プロフィールを用いて実施した。画分を０.５℃間隔でワットマン３ＭＭ濾紙のストリップに直接集めた。各画分における放射性ＤＮＡの量は、シンチレーション・カウンター（ベックマン、モデルＬＳ６０００ＩＣ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いるチェレンコフカウンティングにより測定した。これらのＤＮＡフラグメントそれぞれについてメルトメーターを用いて測定したＴmは、表III（Ｔm(2)）に示す。更に、生成した各ＰＣＲ生成物については、理論的なＴmを、方程式：Ｔｍ＝81.5+16.6(log[Na+])＋0.41(%GC含量)−600/DNAフラグメント長（サンブルック等、同上、ｐ９.５１参照）を用いて計算した。これらの計算結果は、表III（Ｔm(1)）に示す。これらのＴmの比較、各場合のＴm計算値は、メルトメーターを用いたＴm実験値よりも低いことを示している。図３Ａおよび３Ｂは、ＮaＣl緩衝液（図３Ａ）またはＴＥＡＣl緩衝液（図３Ｂ）を用いる特定のＤＮＡフラグメント（４９７bp）に対するＤＮＡメルトメーターＴm測定の比較を示す。各測定では、高分離度Ｔmピークを観察したが、そのＴmは、ＴＥＡＣl緩衝液を用いて測定した場合２６.２℃下がった。この結果は、ＴＥＡＣlがメルトメーターに矛盾しないことを示す例である。ＤＮＡフラグメントサイズ対Ｔmの比較を、本明細書に記載したＤＮＡフラグメントについて図４に示す。図４に示した上部曲線は、ＮaＣl緩衝液を用いて分析したＤＮＡフラグメントのネスト化セットを表す。この滑らかな曲線は、このセットのネスト化フラグメントにおいてＴmとＤＮＡフラグメントサイズとの間に高い相互関係があることを示すものである。これは、フラグメントがその５' 範囲で重要な同一性を共有する関連セットを形成することから、予想された通りである。非ネスト化フラグメントがこの曲線に適合しないこともまた理解できる。非ネスト化ＤＮＡフラグメントの偏りは、ＤＮＡ配列および塩基組成の相異が観察されたＴmに影響を及ぼしていることを示唆するものである。下の曲線は、ＴＥＡＣl緩衝液を用いて分析されたＤＮＡフラグメントのネスト化セットを示す。この曲線におけるＤＮＡフラグメントのＴm^sは、ＮａＣｌ緩衝液を用いて観察されるＴ_m ^sより一定して低く、第３Ａ図および第３Ｂ図において示される結果と一致する。さらに、この実験において、非ネスト化フラグメントは今や、ＴＥＡＣl曲線上にあり、このイソスタビライザーの使用がＤＮＡ配列および塩基組成効果を排除して、Ｔ_mを単にＤＮＡの大きさに依存するものとすることを示す。第４図において示される非ネスト化ＤＮＡフラグメントに関して予想されるＤＮＡフラグメントの大きさの、この比較をさらに、以下の表IVにおいて説明し、表では、ＮaＣl緩衝液およびＴＥＡＣl緩衝液の条件下、メルトメーターを用いて予想されるＤＮＡフラグメントの大きさを比較する。この比較は、イソスタビライザーの使用がＤＮＡフラグメントの大きさの予想に関する精度をＮaＣl緩衝液を用いて観察される５０−７３％からＴＥＡＣl緩衝液を用いて８１−９３％まで増加させ得ることを示す。これらの結果は、ＤＮＡメルトメーターを使用して、少なくとも３０−５００bpsの範囲にわたりＤＮＡフラグメントの大きさを正確に測ることができ、またイソスタビライザーＴＥＡＣlの使用がメルトメーターを用いてのＴ_mに対する塩基組成および配列特異的寄与を排除し得ることを示す。実施例５ＤＮＡメルトメーターを用いてのＤＮＡとオリゴヌクレオチドプローブとの特異的ハイブリダイゼーションの検出特異的オリゴヌクレオチドプローブとのＤＮＡハイブリダイゼーションを実施例２に記載したように行った。複合ハイブリダイゼーション(すなわち、多重プローブとの同時ハイブリダイゼーション)を、４つの異なったオリゴヌクレオチドを用いて１１５bpのＰＣＲ産物ＤＮＡフラグメントで行った。１１５bpのＰＣＲ産物を、ＤＮＡの鋳型としてＭ１３mp１８ＤＮＡおよび各々３０pmolesの５' ビオチン化(biotinylated)プライマーＭ６１９２Ｆ(センスプライマー；配列番号３)並びに非修飾Ｍ６３０６Ｒ(アンチセンス；配列番号４)を用いて調製した。ＰＣＲを本質的には実施例４に記載したように行った。ＰＣＲ後、産生したＤＮＡフラグメントを緩衝液飽和フェノールおよびクロロホルムで各々１回抽出し、エタノールで沈降させて、０.３pmol／μlの濃度で水に再び懸濁させた。ストレプタバイジン(Ｓtreptavidine)５０μgで被覆したＭ−２８０ダイナビーズ(Ｄ yn abeads)を結合緩衝液(１ＭＮaＣl、１０mＭトリス−ＨＣl、pＨ７.５、１mＭＥＤＴＡ)中で３回洗浄することにより調製した後、結合緩衝液５０μl中、それらのビーズを室温で３０分間インキュベートすることにより１.５pmolのＰＣＲ産物ＤＮＡフラグメントに結合させた。その後、ビーズ−ＤＮＡコンジュゲートを結合緩衝液で３回洗浄して、それらのビーズを０.１ＮＮaＯＨ／０.１％（ｖ：ｖ）トゥイーン(ＴＷＥＥＮ)２０の溶液で１５分間３回洗浄することにより、ビオチン化されていない鎖を溶出した。次いで、それらのビーズを再び結合緩衝液で３回洗浄した。各々のプライマーの５'末端にＴ４ＤＮＡキナーゼで触媒して³²Ｐを加えることにより、放射能標識化プローブを調製した。２０pmolの各々のプライマーおよび適当な量の緩衝塩およびＴ４ＤＮＡキナーゼを含む反応混合物中、１６.６pm olのγ−³²Ｐ標識化ＡＴＰを製造業者(Ｎew Ｅngland Ｂiolabs)により推薦されるように使用した。プローブとして使用したオリゴヌクレオチドは、Ｍ６１９１Ｃ(１５mer；配列番号１５)、Ｍ６３０６Ｒ(３０mer；配列番号５)、Ｍ６２５８Ｒ(２３mer；配列番号４)およびＭ６２５８ＭＭ(２３mer、単一の塩基対ミスマッチを含む；配列番号１６)であった。キナーゼ化(kinased)オリゴヌクレオチドを(Ｐharmacia、Ｕppsala、Ｓwedenから得られた)ＮＡＰ−５カラムクロマトグラフィーにより組み込まれていないヌクレオチドから精製した。回収されたキナーゼ化オリゴヌクレオチドを乾燥して、０.２pmol／μlの濃度で水に再び懸濁させた。この実施例で使用したプライマーおよびプローブのヌクレオチド配列を表Ｖに示す。ハイブリダイゼーション試験のためには、結合緩衝液５０μl中、ビーズに結合させた一本鎖のＰＣＲ産物ＤＮＡ５０μgを各々１pmolのキナーゼ化相補的オリゴヌクレオチドプローブの混合物と共に室温で３０分間インキュベートした。使用したプローブ混合物は以下の通りであった：第５Ａ図において示される実験では、プローブＭ６１９２Ｃ(１５mer)、Ｍ６３０６Ｒ(２３mer)およびＭ６２５８Ｒ(３０mer)を使用し；第５Ｂ図において示される実験では、プローブＭ６１９２Ｃ(１５mer)、Ｍ６３０６ＭＭ(ミスマッチ２３mer)およびＭ６２５８Ｒ(３０mer)を使用し；また第５Ｃ図において示される実験では、プローブＭ６１９２Ｃ(１５mer)、Ｍ６３０６Ｒ(２３mer)、Ｍ６３０６ＭＭ(ミスマッチ２３mer)およびＭ６２５８Ｒ(３０mer)を使用した。ハイブリダイゼーション後、ビーズを結合緩衝液中で３回、またメルトメーター緩衝液(５０mＭＮaＣl、１０mＭトリス−ＨＣl、pＨ７.５、１mＭＥＤＴＡ、０.１％(ｖ：ｖ)トゥイーン２０) 中で３回室温にて洗浄し、非特異的ハイブリダイゼーションを除去した。３つの混合物を各々、メルトメーターを用いて別々に試験した。ビーズに結合させたハイブリタイズしたＤＮＡをロードする間、そのメルトメーターを２５℃ で維持した。緩衝液流量を３０μl／分に維持して、ロードする間、溶出液を廃棄に向かせた。ビーズをメルトメーター緩衝液中で１００μlに希釈して、０.５ μm のサイズ排除フリット(frit)を備えたメルトメーターの加熱ブロックに直接注入した。ロードした後、緩衝液の流れをメルトメーターに再び向けて、各々のハイブリダイゼーションを測定する前に、試料を２５℃で少なくとも５分間洗浄した。１℃／分の割合で２５℃から９９.５℃まで増加するものとして特徴付けられる温度プロフィルを利用して、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブをＤＮＡ鋳型から溶出した。０.５℃画分をＷhatman ３ＭＭ濾紙のストリップ上に直接集めた。シンチレーションカウンター(Ｂeckman Ｍodel ＬＳ６０００ＩＣ)を用いて、各々の画分における放射性ＤＮＡの量をチェレンコフ計数により測定した。これらの実験結果を第５Ａ図〜第５Ｄ図に示す。第５Ａ図〜第５Ｃ図は、異なったプローブが各々メルトメーターを用いて有効に検出され、また各々がＤＮＡ鋳型から特性温度で溶出され、各々のプローブ配列が容易に区別されることを示す。野生型プローブＭ６３０６ＲとミスマッチプローブＭ６３０６ＭＭとの間で見い出される区別が特に関連がある。これらの結果は、各々の複合ハイブリダイゼーション(第５Ａ図および第５Ｂ図)を比較する際、および両方のプローブが同じ複合ハイブリダイゼーション(第５Ｃ図)に含まれる場合の両方において、２３ −ヌクレオチド配列中、単一の位置で異なるこれらのプライマーの間での区別を示す。第５Ｄ図は、第５Ａ図〜第５Ｃ図において示されるメルトメーターピークに対応する画分のアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。これらの結果は、ＤＮＡメルトメーターが、ビーズに結合させたＤＮＡ鋳型にハイブリダイズした１５mer〜３０merのプローブのハイブリダイゼーションを有効に区別して、検出することができ、また単一塩基ミスマッチのレベルで区別することができることを示す。前述の開示が本発明の幾つかの特定態様を強調し、それらと同等の変更または代替は全て、以下の特許請求の範囲に示す本発明の精神および範囲内であることを理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．温度が設定される温度調節チャンバー、温度調節チャンバーの温度を調節するための、温度調節チャンバーと熱的に接触している加熱および冷却手段、および核酸のサイズ決定、定量、プロービング、または配列決定を行うために、分析すべき各核酸のＴ_mにほぼ等しい温度で熱変性二本鎖ＤＮＡを検出するための検出手段を組み合わせて含む核酸分析装置。２．二本鎖ＤＮＡフラグメントの熱変性を検出することにより多様な(multipl icity)二本鎖ＤＮＡフラグメントから１つの二本鎖ＤＮＡフラグメントを検出する方法であって、（ａ）該１つのＤＮＡフラグメントの熱変性温度以下の温度で、請求項１に記載の装置の温度調節チャンバー中に多様な二本鎖ＤＮＡフラグメントの溶液を入れ、（ｂ）温度調節チャンバー中の温度を、直線的かつ厳重に、少なくとも該１つのＤＮＡフラグメントの熱変性温度である温度まで漸増させ、（ｃ）該１つのＤＮＡフラグメントの熱変性温度である温度で熱変性させたＤＮＡフラグメントを検出することを含む方法。３．検出手段が熱量計である請求項１に記載の装置。４．検出手段が蛍光検出器である請求項１に記載の装置。５．検出手段が紫外線分光光度計である請求項１に記載の装置。６．ＤＮＡフラグメントの鎖の１本が検出可能なように標識されている請求項２に記載の方法。７．検出可能な標識が蛍光標識である請求項６に記載の方法。８．ＤＮＡフラグメントの各々の鎖の１本が連結（tethering）分子で標識されている請求項２に記載の方法。９．連結分子がビオチンまたはフェリチンである請求項８に記載の方法。１０．所望により温度調節チャンバーが連結分子で標識されたＤＮＡフラグメントを保持する手段を含んでいる請求項１に記載の方法。１１．二本鎖ＤＮＡフラグメント保持手段がテフロン（登録商標）フィルターである請求項１０に記載の方法。１２．ＤＮＡフラグメントの各々の鎖の１本がビオチンで標識され、ストレプトアビジンコートビーズと結合するものである請求項２に記載の方法。１３．二本鎖ＤＮＡフラグメント保持手段が外部から適用された磁場である請求項１０に記載の装置。１４．多様なＤＮＡフラグメントの各々の鎖の１本がフェリチンで標識されている請求項２に記載の方法。１５．温度調節チャンバーが所望により第１開口部と第２開口部を含み、これら開口部のそれぞれが緩衝溶液が温度調節チャンバーを通過するためのポンピング手段に接続されている請求項１に記載の装置。１６．多様なＤＮＡフラグメントを含む溶液が所望によりイソスタビライジング化合物を含有する請求項２に記載の方法。１７．ＤＮＡフラグメントのサイズを決定する方法であって、（ａ）ＤＮＡフラグメントの熱変性温度以下の温度で、請求項１に記載の装置の温度調節チャンバー中にＤＮＡフラグメントを含有する溶液を入れ、（ｂ）温度調節チャンバー中の温度を少なくとも該ＤＮＡフラグメントの熱変性温度である温度まで漸増させ、（ｃ）該ＤＮＡフラグメントの熱変性温度を検出する工程を含む方法。１８．ＤＮＡフラグメントの鎖の１本が検出可能なように標識されている請求項１７に記載の方法。１９．検出可能な標識が蛍光標識である請求項１８に記載の方法。２０．ＤＮＡフラグメントの鎖の１本が連結分子で標識されている請求項１７に記載の方法。２１．連結分子がビオチンまたはフェリチンである請求項２０に記載の方法。２２．多様のＤＮＡフラグメントを含む溶液が所望によりイソスタビライジング化合物を含有している請求項１７に記載の方法。２３．多様なＤＮＡフラグメントが検出可能なように標識された既知のサイズのＤＮＡフラグメントの標準化されたセットを含有している請求項１７に記載の方法。２４．多様なＤＮＡフラグメントからＤＮＡフラグメントを検出するための方法であって、（ａ）多様なＤＮＡフラグメントの各々の１本鎖を連結分子で標識し、（ｂ）工程（ａ）のＤＮＡフラグメントが保持手段によって保持されるように、請求項８に記載の装置の温度調節チャンバー中に工程（ａ）の多様な標識ＤＮＡフラグメントの溶液を入れ、（ｃ）多様なＤＮＡフラグメントを熱変性させるのに十分な温度に温度調節チャンバーの温度を上昇させ、（ｄ）ハイブリダイゼーションを生じさせるのに十分な温度で多様なＤＮＡフラグメント中のＤＮＡフラグメントに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるプローブを含有するハイブリダイゼーション溶液中で多様なＤＮＡフラグメントをハイブリダイズさせ、（ｅ）温度調節チャンバーから過剰のハイブリダイズしていないプローブを洗浄し、（ｆ）少なくとも、ＤＮＡフラグメントからハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを変性させる該プローブの熱変性温度である温度に温度調節チャンバーの温度を漸増し、（ｇ）ＤＮＡフラグメントからの該オリゴヌクレオチドプローブの熱変性を検出する工程を含む方法。２５．ＤＮＡフラグメントの鎖の１本が検出可能なように標識されている請求項２４に記載の方法。２６．検出可能な標識が蛍光標識である請求項２５に記載の方法。２７．多様なＤＮＡフラグメントを含む溶液が所望によりイソスタビライジング化合物を含有するものである請求項２４に記載の方法。２８．ＤＮＡフラグメント中のヌクレオチド配列を決定する方法であって、（ａ）ＤＮＡフラグメントの１本鎖を連結分子で標識し、（ｂ）工程（ａ）の標識ＤＮＡフラグメントが保持手段によって保持されるように、請求項８に記載の装置の温度調節チャンバー中に工程（ａ）の該ＤＮＡフラグメントの溶液を入れ、（ｃ）該ＤＮＡフラグメントを熱変性させるのに十分な温度に温度調節チャンバーの温度を上昇させ、（ｄ）ハイブリダイゼーションを生じさせるのに十分な温度で、ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列中の部位でＤＮＡフラグメントに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを含有するハイブリダイゼーション溶液中でＤＮＡフラグメントをハイブリダイズさせ、（ｅ）ＤＮＡフラグメントに対してジデオキシヌクレオチド配列決定反応を行い、ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズした伸長オリゴヌクレオチドのネスト化（nested）セットを作製し、（ｆ）少なくとも、該ＤＮＡフラグメントからの伸長オリゴヌクレオチドのそれぞれを変性させるようにＤＮＡフラグメントにハイブリダイズした伸長オリゴヌクレオチドのそれぞれを熱変性温度である温度に温度調節チャンバーの温度を漸増し、（ｇ）ＤＮＡフラグメントからの伸長オリゴヌクレオチドのそれぞれの熱変性を検出する工程を含む方法。２９．種々の蛍光標識を用いて各々検出可能なように標識されているジデオキシヌクレオチドを用いてジデオキシヌクレオチド配列決定反応が行われ、該装置の検出手段が蛍光検出器である請求項２８に記載の方法。３０．多様な伸長オリゴヌクレオチドを含む溶液が所望によりイソスタビライジング化合物を含むものである請求項２８に記載の方法。