KR20020032755A - 핵산 증폭 산물-프로브간의 혼성화반응 효율을 증대시킨핵산 검출 방법 - Google Patents

핵산 증폭 산물-프로브간의 혼성화반응 효율을 증대시킨핵산 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산 시료로부터 목적하는 핵산을 증폭시킨 후, 증폭된 핵산을 지지체상에 부착된 프로브와 혼성화(hybridization)시켜 시료내 특정 핵산의 존재를 확인하는 핵산 검출 방법에 있어서, 핵산 증폭시 사용되는 프라이머중 1종을 자성체 비드에 부착시켜 증폭반응시키고, 이후 열변성과 자력에 의해 핵산 증폭 산물중 한 가닥만을 분리하여 프로브와의 혼성화반응에 적용시킴으로써 핵산 증폭 산물과 프로브간의 혼성화 반응의 효율을 증대시켜 보다 정확한 핵산 분석 결과를 제공하는 방법에 관한 것이다.

Description

핵산 증폭 산물-프로브간의 혼성화반응 효율을 증대시킨 핵산 검출 방법{A method for detecting the nucleic acid by the improvement of nucleic acid amplication product-probe hybridization efficiency}
본 발명은 핵산 분석시 핵산 증폭 산물과 프로브간의 혼성화반응(hybridization)의 효율을 증대시키는 방법에 관한 것이다.
시료로부터 특정 유전자나 핵산을 분석하기 위해서는 일반적으로 시료로부터 핵산을 추출하고, 추출된 핵산 시료를 목적하는 핵산에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭 반응시켜 증량시킨후, 이를 목적 핵산에 대해 특이적인 프로브가 부착된 지지체상에 적용시켜 시료내 목적 핵산의 존재유무와 그 양을 확인하는 과정들이 수행된다.
비-전문가들도 시료로부터 핵산 분석 결과를 보다 간편하고 단시간에 확인할수 있도록 하기 위한 노력으로, DNA 칩이나 랩 온 어 칩(Lab-on-a-chip) 등 여러 가지 자동화된 기기들에 대한 연구가 집중적으로 이루어지고 있고, 이를 제품화한 기기들이 개발 시판되고 있다.
그러나, 상기한 과정에 의해 핵산 분석을 수행하는데 있어서, 전체 분석 과정중 핵산 증폭 산물을 지지체상의 프로브와 혼성화시키는 반응의 경우, 핵산 증폭 산물간의 핵산 재결합 반응과 핵산 증폭 산물과 프로브간의 혼성화반응 사이의 경쟁으로 인하여 목적하는 혼성화반응의 효율이 떨어지고, 따라서 분석 결과가 불명확하거나 부정확하게 나타나는 현상을 막을 수 없었다.
이에 따라, 분석 결과의 정확성과 효율을 증대시키기 위한 방법으로, 여러가지 시도가 이루어지고 있다. 그 일례로, 지지체 멤브레인상의 프로브와 핵산 증폭 산물간의 혼성화반응 결과를 확인하는데 있어, 마이크로 칩(microelectronic chip)내의 핵산 혼성화 반응 용액내에서 핵산의 전기적인 특성을 이용하여 전기영동에 의해 용액상의 핵산 증폭 산물들을 프로브가 부착되어 있는 부분으로 이동시켜 주어 혼성화 반응의 효율을 증대시키는 방법[참조: Nucleic Acids Res. Edman CF, Raymond DE, Wu DJ, Tu E, Sosnowski RG, Butler WF, Nerenberg M, Heller MJ. 15;25(24):4907-14(1997, 12)]이 이용되고 있다.
그러나, 상기한 종래 방법의 경우, 마이크로 칩상에서 전기영동을 시행하여 용액내의 핵산들을 프로브가 부착되어 있는 부분으로 전기적으로 이동시켜 줌으로써 혼성화 반응의 효율과 반응 속도를 어느 정도 증대시켜 줄 수는 있었으나, 핵산 증폭과정에서 생성된 핵산간에 이루어지는 핵산 재결합 반응을 차단할 수는없었다.
이와 같이, 종래의 핵산 혼성화 방법은 핵산 증폭반응 결과 합성된 센스 핵산과 안티-센스 핵산간에 이루어지는 핵산 재결합 반응을 차단할 수 없었기 때문에, 핵산 증폭 산물-프로브간의 혼성화 반응의 효율이 저하되는 등의 문제점을 가지고 있었다.
따라서, 본 발명은 상기한 종래 방법의 문제점을 해결하여, 핵산 혼성화 반응의 효율을 증대시킴으로써, 전체 핵산 분석 결과의 정확도를 높여줄 수 있는 핵산 검출 방법을 제공하는데 그 목적을 가지고 있다.
도 1은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 반응 용기의 일례로서 모세관을 개략적으로 도시한 도면.
도 2는 실시예 1에 대한 도면으로, 도 2a는 혼성화반응(hybridization)전 여러 종류의 HPV 핵산에 대한 프로브가 부착된 지지체를 개략적으로 도시한 도면이고, 도 2b는 본 발명에 의한 핵산 증폭 산물-프로브간 혼성화 반응후의 결과를 나타내는 도면.
도 3은 실시예 2에 대한 도면으로, 도 3a는 혼성화반응전 여러 종류의 결핵 관련 프로브가 부착된 지지체를 개략적으로 도시한 도면이고, 도 3b는 본 발명에 의한 핵산 증폭 산물-프로브간 혼성화 반응후의 결과를 나타내는 도면.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>
1 : 공기압, 시료 및 반응액 주입구
2 : 94℃ 열변성 공간
3 : 55℃ 핵산-프라이머 결합 공간
4 : 72℃ 핵산 합성 공간
5 : 자력 및 95℃ 열변성 공간
6 : 핵산 증폭 산물-프로브 혼성화반응 공간
7 : 공기압 및 용액 배출구
8 : PCR 반응 확인용 프로브
9 : 여러 종류의 HPV 특이 프로브들
10 : 혼성화반응 확인용 프로브
11 : 결핵균 핵산 특이 프로브
12 : 리팜피신 유전자 특이 프로브
13 : 혼성화반응 확인용 프로브
본 발명은 핵산 시료 분석시 핵산 증폭 산물과 프로브간의 혼성화반응의 효율을 증대시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 핵산 시료로부터 목적하는 핵산을 증폭시킨 후, 증폭된 핵산을 지지체상에 부착된 프로브와 혼성화시켜 시료내 특정 핵산의 존재를 확인하는 핵산 검출 방법에 있어서, 핵산 증폭 산물간의 재결합 반응을 차단함으로써 핵산 증폭 산물-프로브간의 혼성화 반응의 효율을 증대시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여, 핵산 증폭 산물인 센스 핵산과 안티-센스 핵산중 하나를 제거하여 준다. 이를 위하여, 핵산 증폭과정에서 사용되는 2종의 프라이머 즉, 센스 및 안티-센스 프라이머중 어느 하나를 자성체 비드(paramagnetic bead)의 표면에 부착하여 사용하고, 핵산 증폭반응 후 자력을이용하여 상기 자성체 비드에 부착된 프라이머로부터 합성된 핵산 증폭 산물을 제거함으로써, 생성된 핵산 증폭 산물 즉, 센스 핵산과 안티-센스 핵산중 하나만이 지지체상에 부착된 프로브와 혼성화반응을 이루도록 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 핵산 검출 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다:
(1) 자성체 비드 표면에 부착된 센스 및 안티-센스 프라이머중 어느 하나와 형광 염료가 부착된 나머지 프라이머를 함유한 핵산 증폭 반응 용액을 포함하는 반응 용기내로, 분석하고자 하는 핵산 시료를 주입하는 단계,
(2) 상기 핵산 시료를 핵산 증폭 반응 온도하에서 반응시켜 증폭시키는 단계,
(3) 이후, 수득된 이중 가닥의 핵산 증폭 산물을 가열하여 단일 가닥으로 열변성시키는 단계,
(4) 상기 열변성된 핵산들을 자력 발생 공간하에 적용시켜 핵산 증폭 산물중 자성체 비드에 부착된 프라이머로부터 합성된 핵산만이 자성체 비드와 함께 자력에 의해 용기 내벽에 고정되도록 하는 단계,
(5) 형광 염료가 부착된 프라이머로부터 합성된 핵산을 포함하는 용기내의 나머지 용액을 분리하여, 목적 핵산에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 프로브들이 위치별로 고정되어 있는 지지체에 적용시켜 혼성화 반응시키는 단계,
(6) 프로브와 결합하지 않은 미결합 핵산 증폭 산물과 반응용액을 제거하고, 세척액을 사용하여 세척하는 단계 및
(7) 상기 지지체상의 핵산 증폭 산물과 프로브간의 결합물로부터 발생되는형광도를 측정하여 핵산 시료내 목적 핵산의 존재 유무를 확인하는 단계.
이하, 본 발명의 방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 방법중 첫번째 단계에서는 2종의 프라이머를 함유한 핵산 증폭 반응 용액에 분석하고자 하는 핵산 시료를 주입한다.
이때 사용되는 프라이머는 증폭 반응 결과 합성된 2 종류의 핵산 즉, 센스 및 안티-센스 핵산중 하나를 분리, 제거하기 위하여, 자성체 비드에 부착된 센스(또는 안티-센스) 프라이머와 표지물질로서 형광 염료를 부착시킨 안티-센스(또는 센스) 프라이머의 2종의 프라이머를 사용한다.
이때 사용되는 자성체 비드는 기본적으로 핵산이 부착되지 않는 특성을 갖도록 표면이 폴리프로필렌(polypropylene)과 같은 소수성 수지의 소재로 코팅되어 있어야 한다.
상기 자성체 비드에 고정된 프라이머는, 증폭반응시 핵산과의 반응을 용이하게 하기 위해 5'의 말단에 5-10개 정도의 올리고 dT(oligo dT)를 부착하여 합성한 프라이머를, 공지의 화학적 또는 효소적 핵산 부착 기술, 예를 들면 EDC[1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide]를 사용하여 비드 표면의 카르복실기(carboxyl group)를 활성화시킨 후, 합성된 핵산의 아미노기(amino group)와 결합 반응시켜서 부착하는 기술[참조: Bioorg Khim. Ivanovskaia MG, Naryshkin NA, Shabarova ZA. 21(6):454-60. Russian(1995, 6)] 또는 스트렙트아비딘-비오틴 기술[참조: Methods in Enzymology, Green. N. M., Vol. XVIII, p148(1970)]에 의해 자성체 비드의 표면에 부착시켜 제조한다. 이후, 프라이머가부착된 자성체 비드는 사용시까지 건조되거나 동결되지 않도록 20%의 글리세롤이 함유된 용액중에서 -10℃ 내지 -20℃의 온도로 보관한다.
본 발명에서는 상기 프라이머외에, 자성체 비드에 고정되지 않고, 형광 염료가 부착된 또다른 프라이머를 사용한다. 자성체 비드에 고정된 프라이머가 센스 서열일 경우, 형광 염료가 부착된 프라이머는 안티-센스를, 자성체 비드에 고정된 프라이머가 안티-센스일 경우는, 형광 염료가 부착된 프라이머가 센스 서열을 갖도록 한다.
본 발명에서는 혼성화반응 후, 핵산 판독을 용이하게 하기 위해 표지물질로서 형광 염료를 사용하고, 이후 CCD 카메라나 레이져 비임을 이용하여 형광물질의 발광 정도를 분석한다[참조: Methods in Molecular Biology, Paddock, S. et al Vol. 122(1996)]. 그러나 이외에도 상황에 따라서는 효소나 방사선동위원소와 같은 당해 기술 분야에서 사용되는 통상의 표지물질을 사용하는 것도 가능하다.
핵산 증폭반응 용액은 상기한 2종의 프라이머외에, 300mM Tri-HCl, 100mM KCl, 50mM (NH4)2SO4, 25mM MgSO4, 5% DMSO, 1㎎/㎖ BSA, 5% 글리세롤, 0.5 유니트의 Taq 폴리머라제, 20mM dNTP 등과 같이 일반적인 PCR 반응액 성분들을 포함한다.
핵산 시료 주입 후 단계 (2)에서는 통상의 과정에 따라 핵산 증폭 반응을 수행한다. 이를 위해 전체 반응액을 열변성 온도(94℃)에서 20초간, 핵산-프라이머 결합 온도(55℃)에서 20초간 및 핵산 합성 온도(72℃)에서 20초간 반응시키는 과정을 순서대로 수십회 반복해서 실시한다. 반응 결과, 자성체 비드에 부착된 프라이머로부터 합성된 다량의 핵산과 형광 염료가 부착된 프라이머로부터 합성된 다량의핵산들이 증폭 산물로서 수득된다.
단계 (3)에서는 단계 (2)에서 합성된 이중 가닥의 핵산 증폭 산물들을 통상의 열변성 온도(95℃)에서 1분간 반응시켜 단일 가닥의 핵산으로 분리시킨다.
이후, 열변성된 핵산들을 자력이 발생되는 공간하에 적용시키는 단계 (4)를 수행한다. 이때 부가되는 자력은 100-400G 정도가 적당하다. 단계 (4) 결과, 열변성된 핵산중 자성체 비드에 부착된 프라이머로부터 합성된 핵산들은 자력에 의해 용기 표면상에 부착되고, 나머지 형광 염료가 부착된 프라이머로부터 합성된 핵산들만이 반응 용액 중에 존재하게 된다.
이후, 반응 용액을 자력 공간으로부터 분리하여 여러 종류의 프로브들이 표면에 고정되어 있는 지지체상에 적용시켜 50℃에서 20분간 혼성화 반응시키는 단계 (5)를 수행한다. 이 단계에서는 분석하고자 하는 목적 핵산의 내부 서열에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 1종 이상의 프로브들이 위치별로 고정되어 있는 지지체를 사용한다. 혼성화반응 이전에 단계 (4)에서 핵산 증폭 산물인 센스 핵산과 안티-센스 핵산중 하나를 자력에 의해 이미 제거하였기 때문에, 본 발명의 단계 (5)에서는 단일 종의 핵산 증폭 산물과 프로브간의 핵산 결합반응만이 일어나게 되며, 핵산 증폭 산물간의 재결합은 일어날 수 없게 된다.
단계 (6)에서 미결합 핵산과 반응 용액을 제거하고, 세척액으로 세척한 후, 단계 (7)에서 그 결과를 판독한다. 본 발명에서는 표지물질로서 형광 염료를 사용하였기 때문에, CCD 카메라나 레이져 비임을 이용하여 이로부터 발생되는 형광도를 측정함으로써 핵산 시료내 특정 핵산의 존재 유무를 확인한다.
본 발명의 방법은 필요에 따라 각 단계별로 별도의 용기를 사용하여 수행하여도 가능하나, 열원이 제공된 열전도성의 튜브, 예를 들면 모세관을 사용하면 하나의 용기로 모든 과정을 수행할 수 있어 여러면에서 편리하다. 유리로 된 모세관을 사용하는 경우에는 유리 자체에 핵산이 부착될 수도 있으므로, 사전에 유리관의 내면을 실리콘이나 BSA(bovine serum albumin) 등으로 코팅시켜 주는 전처리 과정이 필요하다.
본 발명을 실시하는데 있어, 반응 용기로서 모세관을 이용하는 경우, 위치별로 시료와 반응액 주입 및 배출 영역, 핵산 증폭 영역, 자력 발생 영역 및 혼성화 영역을 설정하고, 핵산 증폭 영역에는 증폭반응에 필요한 온도들(94℃, 55℃ 및 72℃)을 제공할 수 있는 히터와 같은 열원이, 자력 발생 영역에는 자석과 같은 자력 발생 수단과 핵산 열변성을 위한 열원(95℃)이 그리고 혼성화 영역에는 목적 핵산에 특이적으로 결합할 수 있는 여러 종류의 프로브들이 구비되도록 하고, 공기압과 같이 이 영역들을 시료와 반응액이 이동할 수 있도록 하는 수단을 제공하도록 구성되어야 한다. 그 예가 도 1에 개략적으로 도시되어 있다.
이하, 본 발명을 반응 용기로서 모세관을 사용하는 경우를 중심으로 실시예로서 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공된 것으로, 본 발명을 한정하는 것으로 이해되어서는 안된다.
[실시예 1]본 발명의 방법을 사용한 HPV(자궁경부암 유발 바이러스) 핵산 확인 시험
분석하고자하는 시료로부터 핵산을 분리, 추출하여 핵산 시료를 준비하고,자성체 비드에 부착된, HPV 핵산에 대하여 특이적인 센스 프라이머와 형광 염료가 부착된 안티-센스 프라이머가 포함된 PCR 반응 용액(300mM Tri-HCl, 100mM KCl, 50mM (NH4)2SO4, 25mM MgSO4, 5% DMSO, 1mg/ml BSA, 5% 글리세롤, 0.5 유니트의 Taq 폴리머라제, 20mM dNTP)과 함께, 준비된 핵산 시료를 혼합하여 모세관내로 주입하였다. 각 위치별로 각기 다른 온도(94℃ 열변성 공간, 55℃ 핵산-프라이머 결합 공간, 72℃ 핵산 합성 공간)를 유지하도록 제작된 모세관내에서 공기압에 의해 반응액이 수십회(약 40회) 차례로 이동하도록 하여 핵산 증폭 반응을 수행하였다. 상기 과정에서 생성된 핵산 증폭 산물들을 95℃의 자력 공간으로 공기압에 의해 이동시켜 이중 가닥의 핵산 증폭 산물들을 단일 가닥으로 열변성시키고, 이중에서 자성체 비드에 부착된 핵산 증폭 산물들이 모세관 표면에 부착되도록 반응시켰다. 이후 용액(형광 염료가 부착된 프라이머로부터 합성된 핵산 증폭 산물 포함)을 공기압에 의해 HPV 핵산에 대해 특이적인 여러 종류의 프로브들(HPV type6, HPV type11, HPV type16, HPV type18, HPV type31, HPV type33, HPV type35, HPV type42, HPV type43, HPV type45, HPV type51 및 HPV type56)이 위치별로 부착된 핵산 혼성화 영역으로 이동시켜 50℃에서 20분간 반응시켰다. 공기압에 의해 미결합 핵산 증폭 산물과 반응 용액을 배출하여 제거한 후, 세척액으로 1X SSC, 0.1% SDS을 사용하여 2-3회 세척하였다. 형광인지 디지탈 카메라(cooled ccd camera)를 사용하여 상기 혼성화 영역의 프로브에 결합된 핵산 증폭 산물의 형광 염료로부터 발생하는 형광도를 분석하여 특이적인 혼성화 반응의 결과를 판독하였다.
그 결과가 도 2b에 제시되어 있다. 도 2b의 결과에 의해 분석 시료내에는 악성 자궁경부암을 유발하는 HPV 타입16이 존재함을 알 수 있었다.
[실시예 2]본 발명의 방법을 사용한 결핵균 핵산의 존재 유무와 약제 내성 확인 시험
핵산 시료를 각각 결핵균 유전자와 결핵균에 대한 항생제인 리팜피신(Rifampicin)에 대하여 내성을 나타내는 유전자(Rpo B gene)에 대하여 특이적인, 자성체 비드에 부착된 센스 프라이머와 형광 염료가 부착된 안티-센스 프라이머를 준비하여 상기 실시예 1에서와 같은 방법으로 핵산 분석을 수행하였다.
그 결과는 도 3b에 제시되어 있다. 도 3b의 결과에 의하면 시료에서 추출된 핵산에 결핵균의 핵산은 존재하나, 이에 대한 항생제인 리팜피신에 대한 내성은 갖고 있지 않는 것으로 나타났다.
본 발명의 방법에 따르면, 핵산 증폭 반응과 혼성화 반응을 이용하여 핵산 시료로부터 특정 핵산의 존재유무를 검출하는데 있어, 핵산 증폭 산물간에 이루어지는 핵산 재결합 반응을 효과적으로 차단할 수 있기 때문에, 핵산 증폭 산물과 프로브간의 혼성화 반응의 효율을 증대시킬 수 있어, 보다 정확한 핵산 분석 결과를 제공할 수 있는 잇점이 있다.

Claims (2)

  1. (1) 자성체 비드 표면에 부착된 센스 및 안티-센스 프라이머중 어느 하나와 형광 염료가 부착된 나머지 프라이머를 함유한 핵산 증폭 반응 용액을 포함하는 반응 용기내로, 분석하고자 하는 핵산 시료를 주입하는 단계,
    (2) 상기 핵산 시료를 핵산 증폭 반응 온도하에서 반응시켜 증폭시키는 단계,
    (3) 이후, 수득된 이중 가닥의 핵산 증폭 신물을 가열하여 단일 가닥으로 열변성시키는 단계,
    (4) 상기 열변성된 핵산들을 자력 발생 공간하에 적용시켜 핵산 증폭 산물중 자성체 비드에 부착된 프라이머로부터 합성된 핵산만이 자성체 비드와 함께 자력에 의해 용기 내벽에 고정되도록 하는 단계,
    (5) 형광 염료가 부착된 프라이머로부터 합성된 포함하는 용기내의 나머지 용액을 분리하여, 목적 핵산에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 프로브들이 위치별로 고정되어 있는 지지체에 적용시켜 혼성화 반응시키는 단계,
    (6) 프로브와 결합하지 않은 미결합 핵산 증폭 산물과 반응용액을 제거하고, 세척액을 사용하여 세척하는 단계 및
    (7) 상기 지지체상의 핵산 증폭 산물과 프로브간의 결합물로부터 발생되는 형광도를 측정하여 핵산 시료내 목적 핵산의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 핵산 시료로부터 특정 핵산의 존재 유무를 검출하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 반응 용기로 열원, 자력 발생 수단 및 용액 이동 수단을 구비한 모세관을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100691806B1 (ko) * 2005-08-04 2007-03-12 삼성전자주식회사 비드 및 나노포어를 이용한 핵산 검출방법 및 검출장치
EP1995328A1 (en) * 2007-05-22 2008-11-26 Koninklijke Philips Electronics N.V. Method of detecting probe-target binding
KR100985852B1 (ko) * 2007-09-18 2010-10-08 강원도립대학산학협력단 종이를 접어서 만든 스탠드 카드 및 그 제작 방법

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995025815A1 (en) * 1994-03-24 1995-09-28 Gamera Bioscience Corporation A dna meltometer and methods of use thereof
WO1996010644A1 (en) * 1994-10-03 1996-04-11 Adelman Lonnie W Magnetizable moieties in separation, sequencing and amplification of polynucleotides and polypeptides and magnetic detection thereof
WO1996017959A2 (en) * 1994-12-09 1996-06-13 Gamera Bioscience Corporation An apparatus for performing magnetic cycle reaction
US5876924A (en) * 1994-06-22 1999-03-02 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM)
JP2000102400A (ja) * 1998-09-30 2000-04-11 Sanyo Electric Co Ltd 核酸増幅方法及び装置
WO2000061803A1 (en) * 1999-04-13 2000-10-19 Nanogen, Inc. Magnetic bead-based array for genetic detection

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995025815A1 (en) * 1994-03-24 1995-09-28 Gamera Bioscience Corporation A dna meltometer and methods of use thereof
US5876924A (en) * 1994-06-22 1999-03-02 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM)
WO1996010644A1 (en) * 1994-10-03 1996-04-11 Adelman Lonnie W Magnetizable moieties in separation, sequencing and amplification of polynucleotides and polypeptides and magnetic detection thereof
WO1996017959A2 (en) * 1994-12-09 1996-06-13 Gamera Bioscience Corporation An apparatus for performing magnetic cycle reaction
JP2000102400A (ja) * 1998-09-30 2000-04-11 Sanyo Electric Co Ltd 核酸増幅方法及び装置
WO2000061803A1 (en) * 1999-04-13 2000-10-19 Nanogen, Inc. Magnetic bead-based array for genetic detection

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100691806B1 (ko) * 2005-08-04 2007-03-12 삼성전자주식회사 비드 및 나노포어를 이용한 핵산 검출방법 및 검출장치
EP1995328A1 (en) * 2007-05-22 2008-11-26 Koninklijke Philips Electronics N.V. Method of detecting probe-target binding
KR100985852B1 (ko) * 2007-09-18 2010-10-08 강원도립대학산학협력단 종이를 접어서 만든 스탠드 카드 및 그 제작 방법

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