JP4721606B2 - 単一核酸分子の塩基配列決定法 - Google Patents
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Description
本発明は、単一分子検出によって単一核酸分子の塩基配列を決定する方法に関する。
発明の背景
DNAの塩基配列決定法として日常的に使用されている方法はSanger法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463,1977)である。この方法はジデオキシ鎖終止法とも称され、DNA試料の5’末端にプライマーをアニーリングさせた後、DNAポリメラーゼと4種類のデオキシヌクレオシド三リン酸dNTP(NはA,C,TおよびGである。)および各2’,3’−ジデオキシヌクレオシド三リン酸ddNTP(NはA,C,TまたはGである。)の存在下に相補鎖合成を行い、ddNTPが取り込まれた位置で伸長反応を停止させ、得られた反応産物をゲル電気泳動にかけてDNA試料の塩基配列を決定する方法である。このとき形成されるDNA断片は一般に放射性標識され、これによって断片の位置が識別可能となる。
さらにまた、放射性標識を用いる場合には特別の施設が必要となるため、これに代わる標識として蛍光標識を用い、レーザー光線の照射により蛍光を検出する塩基配列決定法も開発されている(例えば特許第2901004号公報、特公平7−43347号公報など)。
しかしSanger法を利用する場合、配列決定しようとするDNAを予めM13などのベクターに組み込んで大量に複製する必要があること、電気泳動1レーンあたり検出可能な塩基数は最大1000bpに制限されることなどの問題点がある。このため、DNAの塩基配列を5’末端から1塩基ずつ直接識別することにより該配列を決定することができ、且つDNAの多数の複製分子を必要とせずに単離された単一DNA分子を直接配列決定に使用することができるならば、配列決定の効率が著しく向上すると考えられる。
したがって、本発明の目的は、単一分子検出によって単一核酸分子の塩基配列を決定する方法を提供することである。この方法では、核酸の塩基を一分子ずつ検出することが可能であるとともに、細胞内のDNAもしくはRNA分子を直接解読できるという利点が提供される。またこれにより、配列決定のスピードが約1〜2桁向上すると共に、一本鎖の核酸分子を多数複製することなしに直接配列決定にかけることができる。
発明の概要
本発明を以下に要約する。
本発明は、その一態様において、単一色素分子検出によって核酸の塩基配列を決定する方法であって、
(1)固体表面に核酸分子を固定するステップ、
(2)該核酸分子に、その配列の一部分と相補的な配列を有するプライマーをアニーリングさせるステップ、
(3)DNAポリメラーゼと1種類の色素標識dNTP(N=A,TもしくはU,GまたはC)、あるいはRNAポリメラーゼと1種類の色素標識NTP(N=A,U,GまたはC)、を含む液を該固定された核酸分子に提供して、該プライマーの3’末端にヌクレオチドを反応させ、このとき該ポリメラーゼは反応部位と向かい合う塩基と塩基対を組むヌクレオチドを取り込むステップ、
(4)結合した色素標識dNTPまたはNTPの存在を検出するステップ、
(5)該結合した色素標識dNTPまたはNTPの色素分子を破壊するステップ、
(6)該色素標識dNTPまたはNTPの種類を順次変えて上記ステップ(3)から(5)を繰り返し、該核酸分子のヌクレオチドと相補するdNTPまたはNTPを順次結合させるステップ、
(7)該結合されたdNTPまたはNTPの種類に基づいて該核酸分子の塩基配列を決定するステップ
を含む方法を提供する。
本発明はまた、別の態様において、単一色素分子検出によって核酸の塩基配列を決定する方法であって、
(1)固体表面に、測定すべき核酸分子の配列の一部分と相補的な配列を有するプライマーを固定するステップ、
(2)該プライマーに、該核酸分子をアニーリングさせるステップ、
(3)DNAポリメラーゼと1種類の色素標識dNTP(N=A,TもしくはU,GまたはC)、あるいはRNAポリメラーゼと1種類の色素標識NTP(N=A,U,GまたはC)、を含む液を該固定された核酸分子に提供して、該プライマーの3’末端にヌクレオチドを反応させ、このとき該ポリメラーゼは反応部位と向かい合う塩基と塩基対を組むヌクレオチドを取り込むステップ、
(4)結合した色素標識dNTPまたはNTPの存在を検出するステップ、
(5)該結合した色素標識dNTPまたはNTPの色素分子を破壊するステップ、
(6)該色素標識dNTPまたはNTPの種類を順次変えて上記ステップ(3)から(5)を繰り返し、該核酸分子のヌクレオチドと相補するdNTPまたはNTPを順次結合させるステップ、
(7)該結合されたdNTPまたはNTPの種類に基づいて該核酸分子の塩基配列を決定するステップ
を含む方法を提供する。
本発明の一実施態様において、上記ステップ(1)の固体表面はキャピラリーの内壁である。
また本発明の別の実施態様において、上記ステップ(4)の検出は上記色素標識dNTPまたはNTPの色素分子を光学的に検出することからなる。さらに具体的には、検出は、該色素分子をレーザー光線の照射によって励起し、これによって放出された蛍光シグナルを検出することによって行うことができる。このような検出方法として、例えば共焦点蛍光顕徴鏡システムを用いる方法を挙げることができる。
本発明のさらに別の実施態様において、上記ステップ(5)における色素分子の破壊はステップ(4)におけるものより強いレーザー光線の照射によって行なわれる。
本発明のさらに別の実施態様において、上記色素は蛍光色素である。
本発明のさらに別の実施態様において、上記液は、色素標識dNTPまたはNTPを含有する水溶液を疎水性液体の内部に含む液滴からなる。
発明の詳細な説明
本発明は、単一分子検出法を用いることによってDNAまたはRNAからなる核酸分子の塩基配列を決定する方法を提供する。ここで単一分子検出法とは、任意の単一分子を任意の分析法で検出する方法を意味する。本発明においては、色素標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP、ここでNはA,TもしくはU,GまたはCである。)またはヌクレオシド三リン酸(NTP、ここでNはA,U,GまたはCである。)の色素分子は、通常、分光学的装置を用いて光学的に検出することができ、後述の実施例では該検出は共焦点蛍光顕微鏡システムによって行なわれる(図2参照)。
以下においては、図1を参照しながら本発明を説明する。
本発明方法では、その第1ステップにおいて固体表面に核酸分子、または該核酸分子の配列の一部分と相補的な配列を有するプライマー、を固定する。
核酸分子は、核酸試料を通常の方法で精製し、例えば、アルカリ処理変性などをして一本鎖分子とした後に、固体表面に固定されうる。
プライマーは核酸分子にアニーリング可能であれば、そのサイズおよび種類は特に制限されない。サイズは、例えば少なくとも10ヌクレオチド,通常約15〜30ヌクレオチドでよい。配列決定されるべき核酸分子の配列の一部が判明している場合には、その配列に基づいてプライマーを作製し使用することができる。あるいはプライマーとして、例えばランダムプライマーやオリゴdTプライマーを使用することもできる。
固体表面は核酸分子もしくはプライマーが固定されうるものであればいかなる材質のものでもよく、例えばそのような材質としてガラス、石英、樹脂等を挙げることができる。また固体表面の形状は平面、曲面等のいずれの形状でもよい。固体表面として、例えばキャピラリー(例えばガラス、石英、樹脂製)の内壁を使用することができる。キャピラリーは、キャピラリーの内部に核酸分子もしくはプライマーを固定したあと、その内部に色素標識dNTPまたはNTPとポリメラーゼ酵素を含む液を自動的に送り込むのに適している。キャピラリーの内径は例えば約100〜約250μmであり、また長さは通常約10〜約50mmで十分であるが、内径および長さはこれらに限定されないものとする。
固体表面は、配列決定すべき核酸分子もしくはプライマーが固定され易いように、また未反応の色素標識dNTPまたはNTP分子が付着しないような処理をしておくことが望ましい。固体表面への核酸分子もしくはプライマーの結合は、例えば一般的なUVクロスリンク法によって実施可能である。より具体的には、核酸をカルノア液(メタノール/酢酸(3:1v/v))に溶解した溶液を石英製ガラスキャピラリーの内部に入れ、室温で乾燥固化し、次いで2×SSC(NaCl 1.75g、クエン酸ナトリウム0.882g/100ml)をキャピラリー中に入れUVを照射することによって、核酸を固体表面に結合することができる。核酸分子を固体表面に固定するときには、1分子の核酸を固定するのが望ましいが、実際には複数の核酸分子が表面に固定される。実際の測定においては、希釈された核酸分子(約0.1〜100pmol/μl、好ましくは30〜70pmol/μl)を固体表面に固定し、固定された核酸分子1個を視野に入れて配列決定を行う。
第2のステップでは、固体表面上の核酸分子にプライマーをアニーリングさせるか、あるいは、固体表面上のプライマーに核酸分子をアニーリングさせる。
第3のステップでは、DNAポリメラーゼと1種類の色素標識dNTP(N=A,TもしくはU,GまたはC)、あるいはRNAポリメラーゼと1種類の色素標識NTP(N=A,U,GまたはC)、を含む液を該固定された核酸分子に提供して、上記プライマーの3’末端にヌクレオチドを反応させる。このとき該ポリメラーゼは反応部位と向かい合う塩基と塩基対を組むヌクレオチドを取り込む。
ここで「1種類の」とは、4種類の色素標識dNTPまたはNTPのうちの特定の1つを意味する。その種類が特定されていることによって、プライマーに実際に結合するdNTPまたはNTPの種類が分かる。
図1では、核酸分子を固定したキャピラリーセル中に溶媒を流し、その流れに乗せてDNAポリメラーゼと色素標識塩基dATPを1種類だけ含む液を導入し、すでに標的DNAに結合しているDNA配列ATGの次の塩基の反応を起こさせる。このときDNAポリメラーゼによる塩基の取り込み反応が起こらなければ、未反応の塩基は洗い流されるので、単一分子検出によりDNA上に色素は検出されない。その時は、別の種類の塩基(dGTP、dCTPまたはdTTP)を含む液に対して同様の操作を行う。この操作を、塩基が上記DNA配列に取り込まれ、DNA上に色素が検出されるまで繰り返す。図では、プライマーの3’側に結合したATGという配列まで分かった標的のDNAに対して、dTTPを含む液を作用させたときに色素を検出すればATGの次はTであることが分かる。同じ塩基が連続して並んでいるDNA試料の場合、複数の塩基がDNA配列に取り込まれることも考えられるが、このような場合には色素の個数を例えば蛍光強度によって識別することによって何個の連続した塩基が取り込まれたかを検出することができる。
本発明においては、DNAポリメラーゼと1種類の色素標識dNTP(ここでN=A,TもしくはU,GまたはC)、またはRNAポリメラーゼと1種類の色素標識NTP(ここでN=A,U,GまたはC)、を含有する液は、該色素標識dNTPまたはNTPを含有する水溶液をミネラルオイル(鉱油)等の疎水性液体の内部に封入した液滴からなってもよい。このような液滴は例えばマイクロインジェクターを使って容易に調製することができる。液滴のサイズは、例えば直径約10〜25μmであり、数百fLの体積に相当する。
キャピラリーセルに流す溶媒としては、色素標識dNTPもしくはNTPやポリメラーゼを溶解可能な溶媒(例えばバッファー、例えば67mM KPO4(pH7.5),6.7mM MgCl2,1mM 2−メルカプトエタノールを含むバッファー)を用いることができる。液滴を使用する場合には、該液滴と非親和性である溶媒が好ましく、例えばLight white oil(d=0.84g/ml;一般市販名称ミネラルオイル)を使用できる。
dNTPまたはNTPを標識するための色素としては、蛍光体または発光体、例えばローダミンまたはフルオレセイン、例えばテトラメチルローダミン(TMR、発光波長570nm)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC、発光波長573nm)、ローダミン6G(発光波長550nm)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC、発光波長515nm)を使用することができる。その他、4−フルオロ−7−ニトロベンゾフラゾン(NBD−F、発光波長540nm)、テキサスレッド(発光波長605nm)なども使用可能である。本発明の方法では、色素は塩基すなわちdNTPまたはNTPの種類に関係なく同一であってもよいし、あるいは塩基の種類に応じて異なっていてもよい。操作を簡便化するためには、同一の色素でdNTPまたはNTPを標識するのが好ましい。dNTPまたはNTPに色素を結合する方法としては市販品を使用してもよいし、あるいは文献(例えばJ.Histochem.Cytochem.44(5):525−529(1996))に記載される方法に従って合成してもよい。
第4のステップでは、結合した色素標識dNTPまたはNTPの存在を検出する。
結合された色素標識dNTPまたはNTPの検出は、図2に示すように、例えば共焦点蛍光顕微鏡システムを用いて該核酸分子にレーザー光線を照射し、励起された色素分子が出す蛍光シグナルを検出器に導いて光子数を計数することによって蛍光シグナルを検出することにより行なわれる。
図2においては、アルゴンイオンレーザーの励起光(488nm)をダイクロイックミラーで反射させ、対物レンズを通してDNA試料に焦点を結ぶようにし、この励起光で励起された色素分子が出す蛍光シグナルをバンドパスフィルターを通して共焦点用のピンホール(例えば、直径50μm)に導き、検出器(例えばアバランシェフォトダイオード)に入ってきた光子数をマルチチャンネルカウンターで数え、これによって蛍光シグナルを検出する。バンドパスフィルターを介在させることにより蛍光シグナルを選択的に取り出すことが可能となる。またピンホールを介在させることにより不要な光が除去される。
第5のステップでは、結合した色素標識dNTPまたはNTPの色素分子を破壊する。
本発明によれば、核酸分子上で色素標識dNTPまたはNTPを反応させ色素分子が検出された後で次の色素標識dNTPまたはNTPが結合する前に、検出を終えた色素分子を破壊する必要がある。このための手段として、例えばステップ(4)におけるものより強いレーザー光線(例えば約10mW)を照射する方法が使用できる。
第6のステップでは、色素標識dNTPまたはNTPの種類を順次変えて上記ステップ(3)から(5)を繰り返し、該核酸分子のヌクレオチドと塩基対を形成するdNTPまたはNTPを順次結合させる。
ここで「色素標識dNTPまたはNTPの種類を順次変えて」とは、4種類の色素標識dNTPまたはNTPのうち特定の塩基を核酸分子に送り込み、結合が起こらない場合には別の特定の塩基を送り込み、それでも結合が起こらない場合にはさらに別の特定の塩基を送り込み、というように、結合が起こるまで塩基の種類を変えることを意味する。塩基の結合が起こったか否かをステップ(4)で確認し、結合した塩基の色素分子の破壊をステップ(5)で行う。このステップ(3)から(5)の操作を核酸分子の塩基数(最大)分だけ順次繰り返し行う。
第7のステップでは、結合されたdNTPまたはNTPの種類に基づいて核酸分子の塩基配列を決定する。
実施例
本発明の方法をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されないものとする。
〔実施例1〕
ジー・エルサイエンス(株)(日本)より購入したカプトン被覆石英製ガラスキャピラリー(内径200μm×長さ20mm)をバーナーで加熱し、被覆カプトンの一部を燃焼除去し、この部分を顕微鏡の観察窓とした。このキャピラリーをアセトン、1M KOH、濃H2SO4/30%H2O2(1:2v/v)混合液の順に浸して、ガラス表面に付着した油分や有機物を除去、洗浄した。このガラスキャピラリーの内壁に鋳型DNAをUVクロスリンク法で固定した。すなわち、DNAをカルノア液(メタノール/酢酸(3:1v/v))に溶解した溶液をガラスキャピラリーの内部に入れ、室温で乾燥固化し、次いで2×SSC(NaCl 1.75g、クエン酸ナトリウム0.882g/100ml)をキャピラリー中に入れUVを照射することによって、DNAを固体表面に結合した。このとき、カルノア液中の鋳型DNAの濃度は50pmol/μlとしたが、この濃度に調整することにより、単一鋳型DNA上の反応を確認できる程度に十分まばらな密度でDNAを固定することができる。
次にこの鋳型DNAに対してDNAポリメラーゼ反応を行った。反応液は、バッファー液(67mM KPO4(pH7.5),6.7mM MgCl2,1mM 2−メルカプトエタノール)に鋳型DNAに相補する配列をもつプライマー、DNAポリメラーゼ(Klenow Fragment、東洋紡績(株)から購入)、色素標識ヌクレオチドを溶解したものである。この反応液を鋳型DNAに反応させ、取り込み反応を行った。
反応後、反応液を除去し、上と同じ溶媒をキャピラリー中に流して洗浄を行った。次いで、このガラスキャピラリー内壁を共焦点蛍光顕微鏡システムを用いて結合色素を観察した。すなわち、レーザー光で色素標識ヌクレオチドの色素分子を励起し、これからの蛍光を観察した。このとき、鋳型DNAは十分まばらにガラスキャピラリーの内壁表面に固定されているので、単一鋳型DNA上の取り込み反応を確認できた。
以下、実験例を詳述する。
使用した試薬類
鋳型DNA No.1(配列番号1)
鋳型DNA No.2(配列番号2)
プライマーNo.1(配列番号3)
プライマーNo.2(配列番号4)
色素標識ヌクレオチド
BODYPY−TMR−dUTP(フナコシ(株)から購入;吸収波長54 4nm蛍光波長570nm)
TMR−dATP(第一化学薬品(株)から購入;吸収波長550nm蛍光 波長570nm)
TMR−dGTP(第一化学薬品(株)から購入;吸収波長550nm蛍光 波長570nm)
実験1および結果
鋳型DNA No.1とプライマーNo.1の組み合わせで、BODYPY−TMR−dUTPヌクレオチドを反応させた。このDNAの組合せでは、dUTPが鋳型DNAに取り込まれるような配列になっている。実際上記の方法に準じて実験を行った結果、BODYPY−TMR−dUTPヌクレオチドが単一鋳型DNAに取り込まれたことを単一の蛍光分子からの蛍光の存在によって確認した。また参照試験1として、BODYPY−TMR−dUTPヌクレオチドが単にガラスキャピラリー内壁に付着しているのではないことを確認する試験を行った。すなわち、内壁に鋳型DNAを固定していないガラスキャピラリーに上記反応液を反応させ、BODYPY−TMR−dUTPヌクレオチドがガラスキャピラリー表面に付着していないことを蛍光が観察されないことにより確認した。さらに参照試験2として、BODYPY−TMR−dUTPヌクレオチドの代わりにTMR−dATPヌクレオチドを用いた試験を行った。この場合、TMR−dATPでは単一鋳型DNAには取り込まれないはずである。実際に、該ヌクレオチドが単一鋳型DNAに取り込まれていないことを蛍光が観察されないことにより確認した。
実験2および結果
鋳型DNA No.2とプライマーNo.2の組み合わせで上記と同様に実験を行った。このDNAの組合せでは、dATPが鋳型DNAに取り込まれるような配列になっている。TMR−dATPヌクレオチドを反応させた場合と、TMR−dGTPヌクレオチドを反応させたときを比較した結果、TMR−dATPが単一鋳型DNAに取り込まれたのに対し、TMR−dGTPは単一鋳型DNAに取り込まれていないことを確認した。
実験3および結果
実験1において、キャピラリー内壁に単一鋳型DNA No.1とプライマーNo.1の組み合わせでBODYPY−TMR−dUTPを取り込んだ試料に対して10mWの488nmのレーザー光を数秒間照射して色素標識ヌクレオチドの色素分子を破壊した。同様に実験2において、キャピラリー内壁で単一鋳型DNA No.2とプライマーNo.2の組み合わせでTMR−dATPを取り込んだ試料に対して同様に色素標識ヌクレオチドの色素分子を破壊した。この試料に対して色素標識ヌクレオチドの反応を繰り返し、取り込まれたヌクレオチドの種類を次々に特定すればよい。
産業上の利用可能性
本発明により核酸の塩基配列を一塩基ずつ検出し解読することが可能となった。
配列表フリーテキスト
配列番号1−人工配列の説明:合成鋳型DNA
配列番号2−人工配列の説明:合成鋳型DNA
配列番号3−人工配列の説明:プライマー
配列番号4−人工配列の説明:プライマー
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明の単一色素分子検出によりDNAの塩基配列を決定する方法を模式的に示したものである。
図2は、共焦点蛍光顕微鏡システムを用いて色素分子由来の蛍光シグナルを検出する仕方を模式的に示したものである。
Claims (8)
- 単一色素分子検出によって核酸の塩基配列を決定する方法であって、
(1)固体表面に核酸分子を固定するステップであって、該固体表面がキャピラリーの内壁である、前記ステップ、
(2)該核酸分子に、その配列の一部分と相補的な配列を有するプライマーをアニーリングさせるステップ、
(3)DNAポリメラーゼと1種類の色素標識dNTP(Nは、A,TもしくはU,GまたはCである)、あるいはRNAポリメラーゼと1種類の色素標識NTP(Nは、A,U,GまたはCである)、を含む液滴を該固定された核酸分子に提供して、該プライマーの3’末端にヌクレオチドを反応させ、このとき該ポリメラーゼは反応部位と向かい合う塩基と塩基対を組むヌクレオチドを取り込むステップ、
(4)結合した色素標識dNTPまたはNTPの存在を検出するステップ、
(5)該結合した色素標識dNTPまたはNTPの色素分子を破壊するステップ、
(6)該色素標識dNTPまたはNTPの種類を順次変えて上記ステップ(3)から(5)を繰り返し、該核酸分子のヌクレオチドと塩基対を形成するdNTPまたはNTPを順次結合させるステップ、
(7)該結合されたdNTPまたはNTPの種類に基づいて該核酸分子の塩基配列を決定するステップ
を含む、上記方法。 - 単一色素分子検出によって核酸の塩基配列を決定する方法であって、
(1)固体表面に、測定すべき核酸分子の配列の一部分と相補的な配列を有するプライマーを固定するステップであって、該固体表面がキャピラリーの内壁である、前記ステップ、
(2)該プライマーに、該核酸分子をアニーリングさせるステップ、
(3)DNAポリメラーゼと1種類の色素標識dNTP(Nは、A,TもしくはU,GまたはCである)、あるいはRNAポリメラーゼと1種類の色素標識NTP(Nは、A,U,GまたはCである)、を含む液滴を該固定された核酸分子に提供して、該プライマーの3’末端にヌクレオチドを反応させ、このとき該ポリメラーゼは反応部位と向かい合う塩基と塩基対を組むヌクレオチドを取り込むステップ、
(4)結合した色素標識dNTPまたはNTPの存在を検出するステップ、
(5)該結合した色素標識dNTPまたはNTPの色素分子を破壊するステップ、
(6)該色素標識dNTPまたはNTPの種類を順次変えて上記ステップ(3)から(5)を繰り返し、該核酸分子のヌクレオチドと相補するdNTPまたはNTPを順次結合させるステップ、
(7)該結合されたdNTPまたはNTPの種類に基づいて該核酸分子の塩基配列を決定するステップ
を含む、上記方法。 - 前記ステップ(4)において、前記色素標識dNTPまたはNTPの色素分子を光学的に検出することからなる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ステップ(4)において、色素分子をレーザー光線の照射によって励起し、これによって放出された蛍光シグナルを検出することからなる、請求項3に記載の方法。
- 前記検出が共焦点蛍光顕微鏡システムを用いて行なわれる、請求項4に記載の方法。
- 前記ステップ(5)における色素分子の破壊が、前記ステップ(4)におけるものより強いレーザー光線の照射によって行なわれる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記色素が蛍光色素である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記液滴が、前記色素標識dNTPまたはNTPを含有する水溶液を疎水性液体の内部に含む液滴からなる、請求項1または2に記載の方法。
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