JP2004510433A - Dnaおよびrnaを解読するための大量並行方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、核酸を固体表面に結合する方法、およびヌクレオチド類縁体がポリメラーゼ反応において成長中のDNA鎖に組み込まれた後に、各ヌクレオチド類縁体の種別を検出することで、核酸をシーケンシングする方法を提供する。本発明はまた、切断可能なリンカーによりヌクレオチド類縁体に結合される特有の標識、およびデオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップする切断可能な化学基を含むヌクレオチド類縁体を提供する。
Description
【0001】
本出願は、2001年6月26日に提出された米国仮出願第60/300,894号の利益を主張し、また本出願は、2000年10月6日に提出された米国出願第09/684,670号の一部継続出願である(この両方の内容は、その全体が参照により本出願に援用される)。
【0002】
【発明の背景】
本出願全体にわたって、様々な刊行物を、著者と年月を括弧でくくって参照している。これらの参照文献に関する完全な引用は、本明細書の図面の簡単な説明の項の直前に記載する。これらの刊行物のその全体の開示は、本発明が関連する技術分野の事情についてより完全に記載するために、参照により本出願に援用される。
【0003】
正確かつ迅速にデオキシリボ核酸(DNA)をシーケンシングする能力は、生物学および医学に大きな変革をもたらしている。壮大なヒトゲノムプロジェクトの集合は、ハイスループットの遺伝子解析術の開発を急激に成長させている。化学、工学、生物学、およびコンピュータ科学を含むこの迅速な技術の発達により、一度に単独遺伝子を研究することから、全ゲノムを解析および比較することへの移行を可能にする。
【0004】
最初の全ヒトゲノム配列マップが完成すれば、エキソンおよびイントロンの両方において高度に多型であるゲノム中の多くの領域が知られるであろう。薬理ゲノミクスの挑戦は、薬剤応答の可変性に関連する遺伝子および機能的多型を包括的に特定することである(Roses, 2000)。疾患の発症に関連するゲノム中の多型領域の再シーケンシングは、癌のような疾患の理解、および治療法の開発に大いに貢献するであろう。したがって、完全なヒトゲノム配列マップの最大限の可能性を探るためには、ゲノムの高可変性イントロン/エキソンを再シーケンシングするための正確なハイスループットの方法が必要である。例えばヒトゲノムプロジェクト(Pennisi 2000)に使用されるハイスループットDNAシーケンシング用の現在の最新技術は、レーザ誘起蛍光検出を用いたキャピラリーアレイDNAシーケンサーである(Smith et al., 1986; Ju et al. 1995, 1996; Kheterpal et al. 1996; Salas−Solano et al. 1998)。均一な終結効率を引き起こすポリメラーゼの改良および熱安定性ポリメラーゼの導入によっても、シーケンシングデータの質は有意に改善された(Tabor and Richardson, 1987, 1995)。キャピラリーアレイDNAシーケンシング技術は、大規模なDNAシーケンシングプロジェクトの処理量および読取り長さ要件にある程度は対処し得るものの、突然変異研究に必要な処理量および精度は、疾患遺伝子の発見から法学医学的識別に及ぶ多種多様な用途に関して改善される必要がある。例えば、電気泳動ベースのDNAシーケンシング法は、ヘテロ接合体を明確に検出することが困難であり、圧縮に起因して、グアニンまたはシトシンを含むヌクレオチドに富んだ領域では100%正確であるわけではない(Bowling et al. 1991; Yamakawa et al. 1997)。さらに、プライミング部位後の最初の数個の塩基は、過剰な色素標識プライマーまたは色素標識ターミネーターからの高蛍光シグナルでマスクされる場合が多く、したがって特定しにくい。したがって、DNAシーケンシングに関する電気泳動の要件は、依然としてハイスループットDNA配列および突然変異検出プロジェクトの障壁である。
【0005】
電気泳動を使用せずに合成によりDNAシーケンシングするという概念は、1998年に最初に出現したものであり(Hyman, 1988)、各ヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応中の成長中のDNA鎖に組み込まれることから、各ヌクレオチドの種別(identity)を検出することを包含している。チップフォーマットおよびレーザ誘導蛍光検出と一体となっているかかる仕組みは、DNAシーケンシングプロジェクトの処理量を顕著に増加させる能力を有する。したがって、幾つかのグループが、超ハイスループットのDNAシーケンシング手法を構築する目的で、かかるシステムを研究してきた(Cheeseman 1994, Metzker et al. 1994)。現段階では、かかるシステムを使用してDNAを明白にシーケンシングした完全な成功は報告されていない。合成によりDNAをシーケンシングするための、4つの天然ヌクレオチド(アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、またはチミン(T)に塩基を含む)および数個の他の酵素を使用するパイロシーケンシング法(pyrosequencing approach)は、突然変異検出に現在広範に使用されている(Ronaghi 1988)。このアプローチでは、検出は、DNAポリメラーゼ反応中に放出されるピロリン酸塩(PPi)、スルフリラーゼによるアデノシン三リン酸(ATP)へのピロリン酸の定量的な変換、その後のホタルルシフェラーゼによる可視光の産生に基づく。この手法は、ヌクレオチド配列の30個以下の塩基対(bp)をシーケンシングすることができるだけであり、4つのヌクレオチドはそれぞれ、別個に添加して、かつ別個に検出する必要がある。長く伸びた同じ塩基は、パイロシーケンシング方法を用いて明白に特定することはできない。
【0006】
合成方法によるDNAシーケンシングを探究する文献での最近の研究は、主としてデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)の3’−OH基をキャップするための、蛍光色素に連結された光切断可能な化学部分を設計および合成することに集中している(Welch et al. 1999)。DNAポリメラーゼによる3’修飾ヌクレオチドの組込みに関して、成功が限られていると報告されている。その理由は、デオキシリボース上の3’位が、ポリメラーゼの活性部位中のアミノ酸残基に非常に接近しており、その結果、ポリメラーゼがデオキシリボース環のこの領域での修飾に敏感であるためである。他方、修飾DNAポリメラーゼ(ThermoシーケナーゼおよびTaq FSポリメラーゼ)は、ピリミジン(TおよびC)の5位およびプリン(GおよびA)の7位にあるエネルギー転移色素のような嵩高い基により広範に修飾されたヌクレオチドを認識可能であることが知られている(Rosenblum et al. 1997, Zhu et al. 1994)。ラットDNAポリメラーゼ、DNA鋳型−プライマー、およびジデオキシシチジン三リン酸(ddCTP)の三元複合体が決定され(Pelletier et al. 1994)、この事実を支持する。図1に示すように、この三次元構造は、ddCTPにおけるデオキシリボース環の3’位の周辺領域が非常に混雑している一方で、シチジン塩基の5’位上には修飾用の十分なスペースが存在していることを示す。
【0007】
本出願に開示するアプローチは、切断可能なリンカーにより、ヌクレオチド塩基またはヌクレオチド塩基の類縁体に、例えばピリミジン(TおよびC)の5位およびプリン(GおよびA)の7位に、蛍光色素または質量タグのような特有の標識を連結したヌクレオチド類縁体を作製すること、デオキシリボースの3’−OH基を不活性にするために、それをキャップする小さい切断可能な化学部分を使用すること、およびターミネーターとして、成長中のDNA鎖にヌクレオチド類縁体を組み込むことである。特有の標識の検出により、ヌクレオチド配列の種別が得られる。標識および3’−OHキャッピング基を除去すると、ポリメラーゼ反応は進行して、次のヌクレオチド類縁体を組み込み、次の塩基を検出する。
【0008】
3’−OH基をキャップするための光切断可能な基を使用することもまた望ましい。しかしながら、光切断可能な基は一般に嵩高く、したがってDNAポリメラーゼは、3’−OH基をキャップする光切断可能な部分を含むヌクレオチド類縁体を組み込むことが困難である。高収率で化学的に容易に切断することができる小さな化学部分が3’−OH基をキャップするのに使用できる場合、かかるヌクレオチド類縁体はまた、DNAポリメラーゼ用の基質として認識されるはずである。3’−O−メトキシ−デオキシヌクレオチドは、幾つかのポリメラーゼ用の良好な基質であることが報告されている(Axelrod et al. 1978)。3’−O−アリル−dATPもまた、Ventr(exo−)DNAポリメラーゼにより成長中のDNA鎖中に組み込まれることがわかっていた(Metzker et al. 1994)。しかしながら、メトキシ基を化学的に切断する手法は厳格であり、無水条件が必要とされる。したがって、合成によりDNAをシーケンシングするために、3’−OH基のキャッピングにメトキシ基を使用することは実用的ではない。エステル基もまた、ヌクレオチドの3’OH基をキャップするのに探究されたが、それは、DNAポリメラーゼの活性部位中の求核試剤により切断されることがわかった(Canard et al. 1995)。ケトン基のような求電子剤を有する化学基は、ポリメラーゼ中の強力な求核剤の存在に起因して、酵素反応においてヌクレオチドの3’−OHを保護するには適さない。MOM(−CH2OCH3)およびアリル(−CH2CH=CH2)基は、−OH基をキャップするのに使用することができ、高収率で化学的に切断することができる(Ireland et al. 1986; Kamal et al. 1999)。本出願に開示するアプローチは、蛍光色素または質量タグのような切断可能な特有の標識で標識され、且つ3’−OHがMOM基(−CH2OCH3)またはアリル基(−CH2CH=CH2)のような切断可能な化学部分でキャップされているヌクレオチド類縁体を、ターミネーターとして、成長中のDNA鎖に組み込むことである。次いで、最適化されたヌクレオチドセット(3’−RO−A−LABEL1、3’−RO−C−LABEL2、3’−RO−G−LABEL3、3’−RO−T−LABEL4:ここでRは、3’−OHをキャップするのに使用される化学基を意味する)を、合成アプローチによるDNAシーケンシングに使用することができる。
【0009】
質量分析(MS)を用いて小さく且つ安定な分子を検出することには多くの利点がある。例えば、質量分解能は1ダルトン程度と良好であり得る。したがって、蛍光放出スペクトルの重複によりヘテロ接合体の検出を困難にするゲル電気泳動シーケンシングシステムおよびレーザ誘導蛍光検出アプローチと比較して、本出願に開示するMSアプローチは、長いDNA断片でなく、切断された小さな質量タグを検出することにより、非常に高分解能のシーケンシングデータをもたらす。この方法はまた、マイクロ秒の時間スケールで、きわめて迅速な分離をもたらす。高分解能により、正確なデジタル突然変異およびヘテロ接合体検出が可能となる。小さな質量タグを検出することによる質量分析を用いたシーケンシングの別の利点は、ゲルベースのシステムに関連した圧縮が完全に排除されることである。
【0010】
鋳型DNAとハイブリダイズした連続したプライマー伸長産物を維持するために、ポリメラーゼ反応において自己プライミングが可能な独立体を形成する安定なループを含むプライマーを、チップのような固体表面上に固定化される各一本鎖DNA鋳型の3’末端に連結させることができる。このアプローチは、各サイクルにおける成長中の伸長産物の洗い流しの問題を解決する。
【0011】
SaxonおよびBertozzi(2000)は、生物学的セルの表面上のアジド基に、ホスフィン部分を含有する特定基を化学的に連結させる、洗練され且つ高度に特異的なカップリングを開発した。本出願では、このカップリングの化学は、共有結合させたホスフィン部分でコーティングされた固体表面を形成するために、またDNA鋳型を固体表面と特異的にカップリングさせるための、5’末端にあるアジド基を含有するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物を生成させるために適合される。固体表面の一例は、表面積を増大させるためのでこぼこした表面または多孔質表面を有する内壁を有するガラスチャネルである。別の例は、チップである。
【0012】
本出願は、チップのような固体表面に共有結合させた安定なDNA鋳型(これは、ポリメラーゼ反応を自己プライミングすることが可能である)、および4つの特有のヌクレオチド類縁体(3’−RO−A−LABEL1、3’−RO−C−LABEL2、3’−RO−G−LABEL3、3’−RO−T−LABEL4)を用いた合成アプローチによる、DNAシーケンシングのための新規かつ好適なシステムを開示する。この新規システムの成功により、多型、薬理ゲノミクス用途、および全ゲノムシーケンシング用の超ハイスループットかつ高フィデリティのDNAシーケンシングシステムの開発が可能となるであろう。この迅速かつ正確なDNA再シーケンシングシステムは、一塩基多型(SNP)(Chee et al. 1996)、遺伝子発現の順次解析(SAGE)(Velculescu et al. 1995)、法医学における特定、および遺伝子疾患関連研究の検出のような分野で必要とされる。
【0013】
【発明の概要】
本発明は、ヌクレオチド類縁体がポリメラーゼ反応において成長中のDNA鎖に組み込まれた後に、該ヌクレオチド類縁体の種別を検出することで核酸をシーケンシングする方法において:
(i)上記核酸の5’末端を固体表面に結合する工程と、
(ii)上記固体表面に結合された上記核酸に、プライマーを結合する工程と、
(iii)ポリメラーゼおよび1以上の異なるヌクレオチド類縁体を上記核酸に添加し、それにより上記成長中のDNA鎖にヌクレオチド類縁体を組み込む工程であって、ここで組み込まれたヌクレオチド類縁体は上記ポリメラーゼ反応を終結させ、また異なるヌクレオチド類縁体はそれぞれ、(a)アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシル、ならびにそれらの類縁体からなる群から選択される塩基、(b)切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識、(c)デオキシリボース、および(d)該デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするための切断可能な化学基を含む工程と、
(iv)上記固体表面を洗浄して、組み込まれていないヌクレオチド類縁体を除去する工程と、
(v)上記成長中のDNA鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体に結合された上記特有の標識を検出して、それにより組み込まれたヌクレオチド類縁体を同定する工程と、
(vi)1以上の化学的化合物を添加して、上記核酸に結合された上記プライマー上の全ての未反応−OH基、または1以上のヌクレオチド類縁体を上記プライマーに添加することにより形成されたプライマー伸長鎖上の全ての未反応−OH基を永久的にキャップする工程と、
(vii)上記成長中のDNA鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体と上記特有の標識との間の上記切断可能なリンカーを切断する工程と、
(viii)上記デオキシリボースの上記3’位にある上記−OH基をキャップしている上記切断可能な化学基を切断して、上記−OH基からキャップを外し、上記固体表面を洗浄して、切断された化合物を除去する工程と、
(ix)工程(iii)〜(viii)を繰り返して、上記成長中のDNA鎖に新たに組み込まれたヌクレオチド類縁体の上記種別を検出する工程と
を含み、
上記特有の標識が色素である場合には、工程(v)〜(vii)の順序は、(v)、(vi)、および(vii)であり、
上記特有の標識が質量タグである場合には、工程(v)〜(vii)の順序は、(vi)、(vii)、および(v)である方法に関する。
【0014】
本発明は、核酸を固体表面に結合する方法であって:
(i)上記固体表面をホスフィン部分でコーティングすることと、
(ii)上記核酸の5’末端にアジド基を結合することと、
(iii)上記固体表面上の上記ホスフィン部分と、上記核酸の上記5’末端上の上記アジド基との間の相互作用により、上記核酸の上記5’末端を上記固体表面に固定化することと
を含む方法を提供する。
【0015】
本発明は、ヌクレオチド類縁体であって:
(a)アデニンまたはアデニンの類縁体、シトシンまたはシトシンの類縁体、およびグアニンまたはグアニンの類縁体、チミンまたはチミンの類縁体、およびウラシルまたはウラシルの類縁体からなる群から選択される塩基と、
(b)切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識と、
(c)デオキシリボースと、
(d)該デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするための切断可能な化学基と
を含むヌクレオチド類縁体を提供する。
【0016】
本発明は、並行質量分析システムであって、試料タグを含む複数の試料を並行解析するための、複数の大気圧化学イオン化質量分析計を具備する並行質量分析システムを提供する。
【0017】
【発明の詳細な記述】
以下の定義は、本発明を理解するための補助として提供される。
【0018】
本明細書中で使用する場合、−OH基を「キャップする」とは、−OH基中の「H」を化学基で置き換えることを意味する。本明細書中で使用する場合、ヌクレオチド類縁体の−OH基は、切断可能な化学基でキャップされる。−OH基から「キャップを外す」とは、キャップした−OH基から化学基を切断して、化学基を「H」で置き換えること、すなわち、−OR中の「R」を「H」で置き換えることを意味する。ここで「R」は、−OH基をキャップするのに使用される化学基である。
【0019】
ヌクレオチド塩基は以下の通りに略記する:アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、およびウラシル(U)。
【0020】
「ヌクレオチド塩基の類縁体」とは、ポリメラーゼにより基質として認識され得るヌクレオチド塩基の構造的かつ機能的類縁体を指す。すなわち、例えば、二重らせんフォーマットでは、アデニン(A)の類縁体は、チミン(T)と水素結合を形成すべきであり、C類縁体は、Gと水素結合を形成すべきであり、G類縁体は、Cと水素結合を形成すべきであり、T類縁体は、Aと水素結合すべきである。ヌクレオチド塩基の類縁体の例としては、7−デアザ−アデニン、および7−デアザ−グアニン(ここで、アデニンまたはグアニンの7位にある窒素原子が炭素原子で置換されている)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0021】
「ヌクレオチド類縁体」とは、ヌクレオチドに構造的および機能的に類似している化学的化合物を指す。すなわち、ヌクレオチド類縁体は、ポリメラーゼに基質として認識され得る。すなわち、例えば、二重らせんフォーマットでは、アデニンまたはアデニンの類縁体を含むヌクレオチド類縁体は、チミンと水素結合を形成すべきであり、CまたはCの類縁体を含むヌクレオチド類縁体は、Gと水素結合を形成すべきであり、GまたはGの類縁体を含むヌクレオチド類縁体は、Cと水素結合を形成すべきであり、TまたはTの類縁体を含むヌクレオチド類縁体は、Aと水素結合を形成すべきである。本明細書中で開示するヌクレオチド類縁体の例としては、7−デアザ−アデニンまたは7−デアザ−グアニン(ここで、アデニンまたはグアニンの7位にある窒素原子が炭素原子で置換されている)のようなヌクレオチド塩基の類縁体を含む類縁体が挙げられる。さらなる例としては、切断可能なリンカーにより、シトシンまたはチミンの5位、あるいはデアザ−アデニンまたはデアザ−グアニンの7位に標識が連結されている類縁体が挙げられる。他の例としては、デオキシリボースの3’位で−OH基をキャップするのに−CH2OCH3または−CH2CH=CH2のような小化学部分を使用している類縁体が挙げられる。ジデオキシヌクレオチドの類縁体は同様に調製することができる。
【0022】
本明細書中で使用する場合、「多孔質」表面は、孔を含有するか、そうでなければでこぼこしている表面であり、その結果多孔質表面の表面積は、表面が滑らかな場合の表面積に対して増大する。
【0023】
本発明は、ヌクレオチド類縁体がポリメラーゼ反応において成長中のDNA鎖に組み込まれた後に、該ヌクレオチド類縁体の種別を検出することで核酸をシーケンシングする方法において:
(i)上記核酸の5’末端を固体表面に結合する工程と、
(ii)上記固体表面に結合された上記核酸に、プライマーを結合する工程と、
(iii)ポリメラーゼおよび1以上の異なるヌクレオチド類縁体を上記核酸に添加し、それにより上記成長中のDNA鎖にヌクレオチド類縁体を組み込む工程であって、ここで組み込まれたヌクレオチド類縁体は上記ポリメラーゼ反応を終結させ、また異なるヌクレオチド類縁体はそれぞれ、(a)アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシル、ならびにそれらの類縁体からなる群から選択される塩基、(b)切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識、(c)デオキシリボース、および(d)該デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするための切断可能な化学基を含む工程と、
(iv)上記固体表面を洗浄して、組み込まれていないヌクレオチド類縁体を除去する工程と、
(v)上記成長中のDNA鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体に結合された上記特有の標識を検出して、それにより組み込まれたヌクレオチド類縁体を同定する工程と、
(vi)1以上の化学的化合物を添加して、上記核酸に結合された上記プライマー上の全ての未反応−OH基、または1以上のヌクレオチド類縁体を上記プライマーに添加することにより形成されたプライマー伸長鎖上の全ての未反応−OH基を永久的にキャップする工程と、
(vii)上記成長中のDNA鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体と上記特有の標識との間の上記切断可能なリンカーを切断する工程と、
(viii)上記デオキシリボースの上記3’位にある上記−OH基をキャップしている上記切断可能な化学基を切断して、上記−OH基からキャップを外し、上記固体表面を洗浄して、切断された化合物を除去する工程と、
(ix)工程(iii)〜(viii)を繰り返して、上記成長中のDNA鎖に新たに組み込まれたヌクレオチド類縁体の上記種別を検出する工程と
を含み、
上記特有の標識が色素である場合には、工程(v)〜(vii)の順序は、(v)、(vi)、および(vii)であり、
上記特有の標識が質量タグである場合には、工程(v)〜(vii)の順序は、(vi)、(vii)、および(v)である方法に向けられている。
【0024】
本明細書中に記載するヌクレオチド類縁体のいずれかの一実施形態では、ヌクレオチド塩基はアデニンである。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はグアニンである。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はシトシンである。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はチミンである。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はウラシルである。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はアデニンの類縁体である。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はグアニンの類縁体である。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はシトシンの類縁体である。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はチミンの類縁体である。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はウラシルの類縁体である。
【0025】
本明細書中に記載する本発明のいずれかの異なる実施形態では、固体表面は、ガラス、シリコン、または金である。異なる実施形態では、固体表面は、磁気ビーズ、チップ、チップ内チャネル、またはチップ内多孔質チャネルである。一実施形態では、固体表面はガラスである。一実施形態では、固体表面は、シリコンである。一実施形態では、固体表面は、金である。一実施形態では、固体表面は、磁気ビーズである。一実施形態では、固体表面は、チップである。一実施形態では、固体表面は、チップ内チャネルである。一実施形態では、固体表面は、チップ内多孔質チャネルである。他の材料も、その材料が上記方法の工程を妨害しない限り使用することができる。
【0026】
一実施形態では、核酸を固体表面に結合する工程は、以下の:
(i)上記固体表面をホスフィン部分でコーティングすることと、
(ii)上記核酸の5’末端にアジド基を結合することと、
(iii)上記固体表面上の上記ホスフィン部分と、上記核酸の上記5’末端上の上記アジド基との間の相互作用により、上記核酸の上記5’末端を上記固体表面に固定化することと
を含む。
【0027】
一実施形態では、固体表面をホスフィン部分でコーティングする工程は、以下の:
(i)上記固体表面を第一アミンでコーティングすることと、
(ii)トリアリールホスフィンのN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを上記第一アミンと共有結合させることと
を含む。
【0028】
一実施形態では、固体表面に結合される核酸は、一本鎖デオキシリボ核酸(DNA)である。別の実施形態では、工程(i)で固体表面に結合される核酸は、二本鎖DNAであり、ここで一方の鎖のみが、固体表面上に直接結合され、固体表面上に直接結合されない鎖は、工程(ii)に進む前に変性させることで除去される。一実施形態では、固体表面上に結合される核酸は、リボ核酸(RNA)であり、工程(iii)におけるポリメラーゼは、逆転写酵素である。
【0029】
一実施形態では、プライマーは、工程(ii)において核酸の3’末端に結合され、結合されたプライマーは、ポリメラーゼ反応中に自己プライミングすることが可能である安定なループおよびデオキシリボースの3’位にある−OH基を含む。一実施形態では、核酸にプライマーを結合する工程は、核酸にプライマーをハイブリダイズすること、または核酸にプライマーを連結することを含む。一実施形態では、プライマーは、核酸の3’末端とプライマーの5’末端とを連結する連結反応により核酸に結合される。
【0030】
一実施形態では、1以上の4つの異なるヌクレオチド類縁体が工程(iii)において添加され、ここで異なるヌクレオチド類縁体それぞれは、チミンもしくはウラシル、またはチミンもしくはウラシルの類縁体、アデニンまたはアデニンの類縁体、シトシンまたはシトシンの類縁体、およびグアニンまたはグアニンの類縁体からなる群から選択される異なる塩基を含み、4つの異なるヌクレオチド類縁体はそれぞれ、特有の標識を含む。
【0031】
一実施形態では、ヌクレオチド類縁体中のデオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップする切断可能な化学基は、−CH2OCH3または−CH2CH=CH2である。基が、1)ポリメラーゼ連鎖反応中に安定であり、2)基質としてのポリメラーゼによるヌクレオチド類縁体の認識を妨害せず、3)切断可能である限り、任意の化学基を使用することができる。
【0032】
一実施形態では、ヌクレオチド類縁体に結合される特有の標識は、蛍光部分または蛍光半導体結晶である。さらなる実施形態では、蛍光部分は、5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシローダミン−6G、N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン、および6−カルボキシ−X−ローダミンからなる群から選択される。一実施形態では、蛍光部分は、5−カルボキシフルオレセインである。一実施形態では、蛍光部分は、6−カルボキシローダミン−6G、N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミンである。一実施形態では、蛍光部分は、6−カルボキシ−X−ローダミンである。
【0033】
一実施形態では、ヌクレオチド類縁体に結合される特有の標識は、エネルギー転移供与体およびエネルギー転移受容体を含む蛍光エネルギー転移タグである。さらなる実施形態では、エネルギー転移供与体は、5−カルボキシフルオレセインまたはシアニンであり、エネルギー転移授与体は、ジクロロカルボキシフルオレセイン、ジクロロ−6−カルボキシローダミン−6G、ジクロロ−N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン、およびジクロロ−6−カルボキシ−X−ローダミンからなる群から選択される。一実施形態では、エネルギー転移授与体は、ジクロロカルボキシフルオレセインである。一実施形態では、エネルギー転移授与体は、ジクロロ−6−カルボキシローダミン−6Gである。一実施形態では、エネルギー転移授与体は、ジクロロ−N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミンである。一実施形態では、エネルギー転移授与体は、およびジクロロ−6−カルボキシ−X−ローダミンである。
【0034】
一実施形態では、ヌクレオチド類縁体に結合される特有の標識は、質量分析計により検出および識別することができる質量タグである。さらなる実施形態では、質量タグは、2−ニトロ−α−メチルベンジル基、2−ニトロ−α−メチル−3−フルオロベンジル基、2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジフルオロベンジル基、および2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジメトキシベンジル基からなる群から選択される。一実施形態では、上記質量タグは、2−ニトロ−α−メチルベンジル基である。一実施形態では、上記質量タグは、2−ニトロ−α−メチル−3−フルオロベンジル基である。一実施形態では、上記質量タグは、2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジフルオロベンジル基である。一実施形態では、上記質量タグは、2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジメトキシベンジル基である。一実施形態では、質量タグは、試料タグを含む複数の試料を並行解析するための、複数の大気圧化学イオン化質量分析計を具備する並行質量分析システムを用いて検出される。
【0035】
一実施形態では、特有の標識は、切断可能なリンカーにより、シトシンまたはチミンの5’位、あるいはデアザアデニンまたはデアザグアニンの7’位に結合される。特有の標識は、標識の結合がポリメラーゼ連鎖反応中に安定であり、かつヌクレオチド類縁体がポリメラーゼにより基質として認識され得る限り、切断可能なリンカーにより、ヌクレオチド類縁体の別の位置に結合することができる。例えば、切断可能な標識は、デオキシリボースに結合することができる。
【0036】
一実施形態では、特有の標識とヌクレオチド類縁体との間の切断可能なリンカーは、1以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、物理的手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、化学的手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、物理化学的手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、熱によって切断される。一実施形態では、リンカーは、光によって切断される。一実施形態では、リンカーは、紫外線によって切断される。さらなる実施形態では、切断可能なリンカーは、2−ニトロベンジル部分を含む光切断可能なリンカーである。
【0037】
一実施形態では、デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするのに使用する切断可能な化学基は、1以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、物理化学的手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、熱によって切断される。一実施形態では、リンカーは、光によって切断される。一実施形態では、リンカーは、紫外線によって切断される。
【0038】
一実施形態では、核酸に結合されたプライマー、またはプライマー伸長鎖上にある如何なる未反応の−OH基をも永久的にキャップするために工程(vi)で添加される化学的化合物は、ポリメラーゼ、および1以上の異なるジデオキシヌクオレオチド、あるいはジデオキシヌクレオチドの類縁体である。さらなる実施形態では、異なるジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸、2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸、2’,3’−ジデオキシシチジン5’−三リン酸、2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸、2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸、およびそれらの類縁体からなる群から選択される。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシシチジン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシシチジン5’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸の類縁体である。
【0039】
一実施形態では、ポリメラーゼおよび1以上の4つの異なるジデオキシヌクレオチドが工程(vi)で添加され、ここで異なるジデオキシヌクレオチドはそれぞれ、2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸、または2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸の類縁体、2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸、または2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸の類縁体、2’,3’−ジデオキシシチジン5’−三リン酸、または2’,3’−ジデオキシシチジン5’−三リン酸の類縁体、および2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸、または2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸、または2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸の類縁体、あるいは2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸の類縁体からなる群から選択される。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシシチジン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシシチジンの類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸の類縁体である。
【0040】
−OH基と特異的に反応する別のタイプの化学的化合物も、核酸に結合されたプライマー上、あるいは1以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体をプライマーに付加することにより形成されるプライマー伸長鎖上の如何なる未反応の−OH基をも永久的にキャップするのに使用することができる。
【0041】
本発明は、複数の異なる核酸を同時にシーケンシングする方法であって、該複数の異なる核酸をシーケンシングするために、本明細書中に開示する方法のいずれかを同時に適用することを含む方法を提供する。異なる実施形態では、上記方法を使用して、1個から100,000個以上の異なる核酸を同時にシーケンシングすることができる。
【0042】
本発明は、一塩基多型の検出、遺伝子突然変異解析、遺伝子発現の逐次解析、遺伝子発現解析、法医学における特定、遺伝子疾患関連研究、DNAシーケンシング、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、本発明に開示する方法のいずれかの使用を提供する。
【0043】
本発明は、核酸を固体表面に結合する方法であって、以下の:
(i)上記固体表面をホスフィン部分でコーティングすることと、
(ii)上記核酸の5’末端にアジド基を結合することと、
(iii)上記固体表面上の上記ホスフィン部分と、上記核酸の上記5’末端上の上記アジド基との間の相互作用により、上記核酸の上記5’末端を上記固体表面に固定化することと
を含む方法を提供する。
【0044】
一実施形態では、固体表面をホスフィン部分でコーティングする工程は、以下の:
(i)上記固体表面を第一アミンでコーティングすることと、
(ii)トリアリールホスフィンのN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを上記第一アミンと共有結合させることと
を含む。
【0045】
異なる実施形態では、固体表面は、ガラス、シリコン、または金である。異なる実施形態では、固体表面は、磁気ビーズ、チップ、チップ内チャネル、またはチップ内多孔質チャネルである。
【0046】
異なる実施形態では、固体表面に結合される核酸は、一本鎖もしくは二本鎖DNA、またはRNAである。一実施形態では、核酸は、二本鎖DNAであり、一方の鎖のみが、上記固体表面上に直接結合される。さらなる実施形態では、固体表面上に直接結合されない二本鎖DNAの鎖は、変性させることで除去される。
【0047】
本発明は、遺伝子発現解析、マイクロアレイベースの遺伝子発現解析、突然変異検出、翻訳解析、転写解析、または他の遺伝的用途のための、本明細書中に開示する核酸を固体表面に結合する方法のいずれかの使用を提供する。
【0048】
本発明は、以下の:
(a)アデニンまたはアデニンの類縁体、シトシンまたはシトシンの類縁体、およびグアニンまたはグアニンの類縁体、チミンまたはチミンの類縁体、およびウラシルまたはウラシルの類縁体からなる群から選択される塩基と、
(b)切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識と、
(c)デオキシリボースと、
(d)該デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするための切断可能な化学基と
を含むヌクレオチド類縁体を提供する。
【0049】
ヌクレオチド類縁体の一実施形態では、デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップする切断可能な化学基は、−CH2OCH3または−CH2CH=CH2である。
【0050】
一実施形態では、特有の標識は、蛍光部分または蛍光半導体結晶である。さらなる実施形態では、蛍光部分は、5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシローダミン−6G、N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン、および6−カルボキシ−X−ローダミンからなる群から選択される。
【0051】
一実施形態では、特有の標識は、エネルギー転移供与体およびエネルギー転移受容体を含む蛍光エネルギー転移タグである。さらなる実施形態では、エネルギー転移供与体は、5−カルボキシフルオレセインまたはシアニンであり、エネルギー転移授与体は、ジクロロカルボキシフルオレセイン、ジクロロ−6−カルボキシローダミン−6G、ジクロロ−N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン、およびジクロロ−6−カルボキシ−X−ローダミンからなる群から選択される。
【0052】
一実施形態では、特有の標識は、質量分析計により検出および識別することができる質量タグである。さらなる実施形態では、質量タグは、2−ニトロ−α−メチルベンジル基、2−ニトロ−α−メチル−3−フルオロベンジル基、2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジフルオロベンジル基、および2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジメトキシベンジル基からなる群から選択される。
【0053】
一実施形態では、上記特有の標識は、切断可能なリンカーにより、シトシンまたはチミンの5’位、あるいはデアザアデニンまたはデアザグアニンの7’位に結合される。特有の標識は、標識の結合がポリメラーゼ連鎖反応中に安定であり、かつヌクレオチド類縁体がポリメラーゼにより基質として認識され得る限り、切断可能なリンカーにより、ヌクレオチド類縁体の別の位置に結合することができる。例えば、切断可能な標識は、デオキシリボースに結合することができる。
【0054】
一実施形態では、特有の標識とヌクレオチド類縁体との間の切断可能なリンカーは、1以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される。さらなる実施形態では、切断可能なリンカーは、2−ニトロベンジル部分を含む光切断可能なリンカーである。
【0055】
一実施形態では、デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするのに使用する切断可能な化学基は、1以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される。
【0056】
異なる実施形態では、ヌクレオチド類縁体は、以下の:
【0057】
【化5】
【0058】
(式中、Dye1、Dye2、Dye3、およびDye4は、4つの異なる色素標識であり、
Rは、デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするのに使用する切断可能な化学基である)
からなる群から選択される。
【0059】
異なる実施形態では、ヌクレオチド類縁体は、以下の:
【0060】
【化6】
【0061】
(式中、Rは、−CH2OCH3または−CH2CH=CH2である)
からなる群から選択される。
【0062】
異なる実施形態では、ヌクレオチド類縁体は、以下の:
【0063】
【化7】
【0064】
(式中、Tag1、Tag2、Tag3、およびTag4は、4つの異なる質量タグ標識であり、
Rは、デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするのに使用する切断可能な化学基である)
からなる群から選択される。
【0065】
異なる実施形態では、ヌクレオチド類縁体は、以下の:
【0066】
【化8】
【0067】
(式中、Rは、−CH2OCH3または−CH2CH=CH2である)
からなる群から選択される。
【0068】
本発明は、一塩基多型の検出、遺伝子突然変異解析、遺伝子発現の順次解析、遺伝子発現解析、法医学における特定、遺伝子疾患関連研究、DNAシーケンシング、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、本明細書中に開示するヌクレオチド類縁体のいずれかの使用を提供する。
【0069】
本発明は、試料タグを含む複数の試料を並行解析するための、複数の大気圧化学イオン化質量分析計を具備する並行質量分析システムを提供する。一実施形態では、質量分析計は、四重極質量分析計である。一実施形態では、質量分析計は、飛行時間型質量分析計である。一実施形態では、質量分析計は、1つの装置に含まれる。一実施形態では、上記システムは、2つのターボ式ポンプをさらに具備し、ここで一方のポンプは、真空を生成するのに使用され、第2のポンプは、望ましくない成分を除去するのに使用される。一実施形態では、上記システムは、少なくとも3つの質量分析計を具備する。一実施形態では、質量タグは、150ダルトン〜250ダルトンの分子量を有する。本発明は、DNAシーケンシング解析、一塩基多型の検出、遺伝子突然変異解析、遺伝子発現の順次解析、遺伝子発現解析、法医学における特定、遺伝子疾患関連研究、DNAシーケンシング、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、上記システムの使用を提供する。
【0070】
本発明は、以下の実験的な詳細からより理解されるであろう。しかしながら、議論する特定の方法および結果は、上述に記載した特許請求の範囲でより完全に記載されている本発明の単なる説明であることは、当業者には容易に理解されよう。
【0071】
【実験の詳細】
1.合成アプローチによるシーケンシング
合成によりDNAをシーケンシングすることは、各ヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応中の成長中のDNA鎖に組み込まれることから、各ヌクレオチドの種別を検出することを包含している。かかるシステムを作動させるための基本的な要件は、(1)それぞれが特有の標識で標識され、かつ3’−OH基をキャップしている化学部分を含有する4つのヌクレオチド類縁体(aA、aC、aG、aT)の入手可能性、(2)4つのヌクレオチド類縁体(aA、aC、aG、aT)が、ポリメラーゼ反応中に、ターミネーターとして、効率的かつ正確にDNAポリメラーゼにより組み込まれる必要があること、(3)次のヌクレオチドの組込みおよび検出を可能とするために、タグおよび3’−OHをキャップしている基が高収率で除去される必要があること、および(4)成長中のDNA鎖は、洗浄、検出および切断過程を生き残り、DNA鋳型にアニーリングされたままであるべきことである。
【0072】
本明細書中に開示する合成アプローチによるシーケンシングを図2A〜2Bに示す。図2Aには、特有の標識が蛍光色素であり、表面がチップである例を示す。図2Bでは、特有の色素が質量タグであり、表面は、チップにエッチングしたチャネルである。該合成アプローチは、ポリメラーゼ反応を開始するために自己プライミングすることが可能な固定化DNA鋳型を有するガラスチップのような固体表面、およびそれぞれが、プリンまたはピリミジン塩基上の特定位置にて特有の標識(例えば蛍光色素または質量タグ)で標識され、かつ3’−OH基をキャップするための切断可能な小さな化学基(R)を含有する4つのヌクレオチド類縁体(3’−RO−A−LABEL1、3’−RO−C−LABEL2、3’−RO−G−LABEL3、3’−RO−T−LABEL4)を使用する。4つのヌクレオチド類縁体およびDNAポリメラーゼを添加すると、鋳型上の次のヌクレオチドに相補的な唯一のヌクレオチド類縁体が、表面の各スポット上でポリメラーゼにより組み込まれる(図2Aおよび2Bの工程1)。
【0073】
特有の標識が色素である図2Aでは、過剰な試薬を除去し、チップ上の組み込まれてない全てのヌクレオチド類縁体を洗い流した後に、検出器を用いて特有の標識を検出する。例えば、4つの色彩蛍光撮像機を用いてチップの表面を画像化し、チップの各スポット上におけるヌクレオチド類縁体上の特定の色素による特有の蛍光放出により、組み込まれたヌクレオチドの種別が明らかとなるであろう(図2Aの工程2)。画像化後、自己プライミングされた鋳型部分上の少量の未反応3’−OH基を、過剰のジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)(ddATP、ddGTP、ddTTP、およびddCTP)およびDNAポリメラーゼによりキャップし、次回の合成の妨害を回避する(図2Aの工程3)。これは、自動固相DNA合成でのキャッピング工程と同様の概念である(Caruthers, 1985)。3’−水酸基を欠如しているddNTPは、色素標識ヌクレオチドと比較してその小サイズ、およびそれらがDNAポリメラーゼにより組み込まれる優れた効率に起因して、ヌクレオチドの未反応3’−OH基をキャップするのに選択される。次に、色素部分を光(およそ350nm)で切断し、3’−OHを保護するR基を化学的に除去して、高収率で遊離の3’−OH基を生成させる(図2Aの工程4)。洗浄工程を適用して、切断された色素およびR基を洗い流す。この段階にあるチップ上の自己プライミングされたDNA部分は、鋳型DNAの次のヌクレオチド配列を特定するための次の反応サイクルの準備ができている(図2Aの工程5)。
【0074】
4cm×1cmのガラスチップ上の高密度(チップ当たり10,000スポット以上)の一本鎖DNAを固定化することは、現在では日常的な手順である(Schena et al. 1995)。したがって、本明細書中に開示するDNAシーケンシングシステムでは、各サイクル後には10,000個を超える塩基を特定することができ、100サイクル後には、1つのシーケンシングチップから百万個の塩基対を生成するであろう。
【0075】
考え得るDNAポリメラーゼとしては、Thermoシーケナーゼ、Taq FS DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、およびVent(exo−)DNAポリメラーゼが挙げられる。各特定の色素からの蛍光放出は、スライドガラスからの蛍光を検出するためのアクセサリを装備した蛍光分析計を用いて検出することができる。大量スケールの評価に関しては、スライドガラス上の複数の異なる蛍光色素(500nm〜700nm)を検出することが可能な多色スキャンニングシステム(GSI Lumonics ScanArray 5000 Standard Biochip Scanning System)を使用することができる。
【0076】
質量タグを用いた合成アプローチによるシーケンシングの例を図2Bに示す。このアプローチは、ポリメラーゼ反応を開始するために自己プライミングすることが可能な固定化DNA鋳型を有するチップ内の多孔質シリカガラスチャネルのような固体表面、およびそれぞれが、塩基上の特定位置にて特有の光切断可能な質量タグで標識され、かつ3’−OH基をキャップするための切断可能な小さな化学基(R)を含有する4つのヌクレオチド類縁体(3’−RO−A−Tag1、3’−RO−C−Tag2、3’−RO−G−Tag3、3’−RO−T−Tag4)を使用する。4つのヌクレオチド類縁体およびDNAポリメラーゼを添加すると、鋳型上の次のヌクレオチドに相補的な唯一のヌクレオチド類縁体が、ガラスチップの各チャネルにおいてポリメラーゼにより組み込まれる(図2Bの工程1)。過剰な試薬を除去し、チップ上の組み込まれてない全てのヌクレオチド類縁体を洗い流した後に、自己プライミングされた鋳型部分上の少量の未反応3’−OH基を、過剰のddNTP(ddATP、ddGTP、ddTTP、およびddCTP)およびDNAポリメラーゼによりキャップし、次回の合成の妨害を回避する(図2Bの工程2)。ddNTPは、色素標識ヌクレオチドと比較してその小サイズ、およびそれらがDNAポリメラーゼにより組み込まれる優れた効率に起因して、ヌクレオチドの未反応3’−OH基をキャップするのに選択される。質量タグを光による照射(およそ350nm)で切断し(図2Bの工程3)、続いて質量分析計で検出する。各タグの特有の質量により、各チャネル中のヌクレオチドの種別が得られる(図2Bの工程4)。次に、R保護基を化学的に除去して、洗い流して、高収率で遊離3’−OH基を生成させる(図2Bの工程5)。この段階にあるチップ上の自己プライミングされたDNA部分は、鋳型DNAの次のヌクレオチド配列を特定するための次の反応サイクルの準備ができている(図2Bの工程6)。
【0077】
マトリクス支援レーザ脱離イオン化(MALDI)、およびエレクトロスプレーイオン化(ESI)のような新たなイオン化技法の開発以来、質量分析は、生物医学的研究の多くの分野で欠かせないツールとなってきた。これらのイオン化方法は、ペプチドおよびタンパク質のような生体有機分子の解析に適切であるが、DNAシーケンシング用途での質量分析の実施には、検出および試料調製の両方での改良が必要である。本明細書中に開示するアプローチは、小さくて安定な質量タグを使用するため、大きなDNAシーケンシング断片を直接検出する必要はなく、検出用にMALDIまたはESI方法を使用する必要はない。大気圧化学イオン化(APCI)は、大気圧にて気相イオン分子反応を使用するイオン化方法である(Dizidic et al. 1975)。この方法では、クロマトグラフィまたはフローインジェクションのいずれかにより、試料を空気式ネブライザーに導入し、そこで試料は、窒素ガスの高速ビームにより小滴に変換される。加熱ガスおよび溶液が反応領域に到達すると、過剰量の溶媒が、コロナ放電によりイオン化される。このイオン化された移動相は、試料に対するイオン化剤として作用し、擬似分子(M+H)+および(M−H)−イオンを生じる。コロナ放電イオン化方法により、高イオン化効率を達成することができ、小さくて安定な有機化合物に関するフェムトモル領域未満の検出感度をもつ安定なイオン化状態を維持する。しかしながら、大きな分子の検出限界により、ペプチドおよび核酸の解析に関してAPCIは、ESIおよびMALDIに置き換えられてきた。開示するアプローチでは、検出されるべき質量タグが比較的小さくて、非常に安定な有機分子であるため、ESIおよびMALDIを用いることで獲得される、大きな生物学的分子を検出する能力は必要でない。APCIは、標的プレート上の結晶を調製するために、脱塩すること、またはマトリクスと混合することといった任意の面倒な試料調製を必要としないことから、APCIは、ESIおよびMALDIを上回る利点が幾つかある。ESIでは、試料の性質および試料調製条件(すなわち、緩衝液または無機塩の存在)がイオン化効率を抑制する。MALDIは、質量分析計に試料導入する前にマトリクスを添加する必要があり、また解釈可能な質量スペクトルを得るために理想の照射スポットを探索することの必要性により、その速度が制限されることが多い。質量タグ試料が、さらなる試料精製および調製なしで、質量分析計に直接注入することができるので、これらの制限は、APCIによる克服される。質量タグ付け試料は揮発性であり、小さな質量数を有するため、これらの化合物は、高感度でAPCIイオン化により容易に検出が可能である。このシステムは、ハイスループット操作にスケールアップすることができる。
【0078】
合成システムによるシーケンシングの各構成成分について、以下に詳述する。
【0079】
2.自己プライミングされた固定化DNA部分を含有する表面の構築
表面上に固定化した一本鎖DNA鋳型を、図3に示すスキームに従って調製する。表面は、例えば4cm×1cmのガラスチップのようなガラスチップ、またはガラスチップ内チャネルであり得る。まず表面を0.5M NaOHで処理して、水で洗浄した後、高密度の3−アミノプロピルトリメトキシシランのエタノール水溶液でコーティングして(Woolley et al. 1994)、第一アミン表面を形成する。トリアリールホスフィンのN−ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)エステル(1)を、第一アミン基と共有結合させて、アミン表面を新規トリアリールホスフィン表面に変換し、その表面は、アジド基を含有するDNA(2)と特異的に反応して、固定化DNAを有するチップを形成する。アジド基は、DNAの5’末端のみに位置し、カップリング反応は、水溶液中のアジド基とトリアリールホスフィン部分との特有の反応によるものである(Saxon and Bertozzi 2000)ため、かかるDNA表面は、ハイブリダイゼーション用の最適な状態を提供するであろう。
【0080】
トリアリールホスフィンのNHSエステル(1)は、図4に示すスキームに従って調製される。3−ジフェニルホスフィノ−4−メトキシカルボニル安息香酸(3)は、Bertozzi等により記載された手順に従って調製される(Saxon and Bertozzi 2000)。N−ヒドロキシスクシンイミドでの(3)の処理により、相当するNHSエステル(4)を形成する。アミノカルボン酸部分と(4)とのカップリングにより、表面上でのDNAとの最適化されたカップリング用の長いリンカー(n=1〜10)を有する化合物(5)が生じる。N−ヒドロキシスクシンイミドでの(5)の処理により、第一アミンでコーティングした表面とのカップリングの準備が整っているNHSエステル(1)が生成する(図3)。
【0081】
アジド標識DNA(2)は、図5に示すスキームに従って合成される。アジ化ナトリウムでの5−ブロモ吉草酸のエチルエステルの処理、続く加水分解により、5−アジド吉草酸が生じ(Khoukhi et al., 1987)、これは続いて、アミノリンカー標識オリゴヌクレオチドプライマーとのカップリング用のNHSエステルに変換される。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)反応を実施するためのアジド標識プライマーを用いることで、トリアリールホスフィン修飾表面とのカップリング用のアジド標識DNA鋳型(2)が生成する(図3)。
【0082】
シーケンシングチップ上の自己プライミングされたDNA鋳型部分は、酵素連結反応を用いて、図6(AおよびB)に示すように構築される。5’−リン酸化され、3’−OHをキャップされたループオリゴヌクレオチドプライマー(B)は、固相DNA合成機により合成される。プライマー(B)は、連結反応中のプライマーの自己連結反応を防止するために、オリゴヌクレオチドの3’末端にて3’−OHがMOM(−CH2OCH3)基またはアリル(−CH2CH=CH2)基のいずれか(図6中では「R」で示す)でキャップされている修飾Cホスホルアミダイトを用いて合成される。したがって、ループを形成したプライマーは、T4 RNAリガーゼを用いて、シーケンシングチップ上に固定化されたDNA鋳型の末端のみと連結して(Zhang et al. 1996)、自己プライミングされたDNA鋳型部分を形成することができる(A)。ループを形成したプライマー(B)は、非常に安定なループ(Antao et al. 1991)、およびいったんプライマーがシーケンシングチップ上の固定化DNAに連結され、3’−OHキャップ基が化学的に切断されると、ポリメラーゼ反応中での効率的なプライミングのためのM13逆DNAシーケンシングプライマーの配列を含有する基部(Ireland et al. 1986; Kamal et al. 1999)を含有するように設計される。
【0083】
3.ヌクレオチド類縁体体3’−HO−A−Dye1、3’−HO−C−Dy e2、3’−HO−G−Dye3、3’−HO−T−Dye4を用いた合成評価によるシーケンシング
種々の色素を用いた光切断効率の評価、および合成アプローチによるシーケンシングの試験のための体系を開発した。それぞれが光切断可能なリンカーにより特有の蛍光色素で標識した4つのヌクレオチド類縁体3’−HO−A−Dye1、3’−HO−C−Dye2、3’−HO−G−Dye3、3’−HO−T−Dye4を合成し、合成アプローチによるシーケンシングで使用する。色素の例としては、Dye1=FAM、すなわち5−カルボキシフルオレセイン、Dye2=R6G、すなわち6−カルボキシローダミン−6G、Dye3=TAM、すなわちN,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン、およびDye4=ROX、すなわち6−カルボキシ−X−ローダミンが挙げられるが、これらに限定されない。4つのヌクレオチド類縁体の構造は図7に示す(R=h)。
【0084】
光切断可能な2−ニトロベンジル部分は、UV光(およそ350nm)による効率的除去のために、ビオチンをDNAおよびタンパク質に連結するのに使用されている(Olejnik et al. 1995, 1999)。本明細書中に開示するアプローチでは、2−ニトロベンジル基は、図7に示すように、蛍光色素とヌクレオチドを一緒に架橋して、色素標識ヌクレオチドを形成するのに使用される。
【0085】
代表的な例として、3’−HO−G−Dye3(Dye3=Tam)の合成を図8に示す。7−デアザ−アルキルアミノ−dGTPを、十分確立された手法(Prober et al. 1987、Lee et al. 1992、およびHobbs et al. 1991)を用いて調製する。リンカー−Tamは、光切断可能なリンカー(Rollaf 1982)をNHS−Tamとカップリングすることで合成される。次に、7−デアザ−アルキニルアミノ−dGTPをリンカー−Tamとカップリングして、3’−HO−G−Tamを製造する。遊離3’−OH(すなわち、R=H)を有するヌクレオチド類縁体は、ポリメラーゼの良好な基質である。プライミング部位後に反復配列を有さないヌクレオチド配列ACGTACGACGT(配列番号1)の一部を含有する固定化DNA鋳型を合成する(図9)。3’−HO−A−Dye1およびDNAポリメラーゼを自己プライミングされたDNA部分に添加して、それがDNAの3’部位に組み込まれる。次に、図2Aの工程を行い(3’−OHが遊離しているので、化学的切断工程は不要である)、520nmでのDye−1からの蛍光シグナルを検出する。次に、3’−HO−C−Dye2を添加して、550nmでのDye−2からの蛍光シグナルを画像化する。次に、3’−HO−G−Dye3を添加して、580nmでのDye−3からの蛍光シグナルを画像化し、最後に3’−HO−T−Dye4を添加して、610nmでのDye−4からの蛍光シグナルを画像化する。
【0086】
光化学切断効率に関する結果
DNAの3’末端にある光切断可能な蛍光色素を含有するDNAの予測光分解産物を図10に示す。2−ニトロベンジル部分は、光切断可能な保護基として広範な研究に首尾よく使用されている(Pillai 1980)。光切断工程の効率は、2−ニトロベンジル部分の光吸収効率、一次光化学工程の効率、および最終的な切断プロセスを引き起こす二次熱プロセスの効率を含む幾つかの要因に依存する(Turro 1991)。Burgess等(1997)は、ヌクレオチド部分上の2−ニトロベンジルリンカーにより結合された蛍光色素の首尾よい光切断を報告しており、蛍光色素は、光切断プロセスを抑制しないことを示している。2−ニトロベンジル発色団に基づく感光性保護基もまた、光切断を含む生物学的標識用途のために開発された(Olejnik et al. 1999)。本明細書中に開示するプロトコルを用いて、図10に示す光切断プロセスを最適化する。2−ニトロベンジル化合物の吸収スペクトルを検査して、蛍光色素の吸収スペクトルと定量的に比較する。2−ニトロベンジル部分の数と色素分子との間に1対1の関係が存在するため、これら2つの種の吸光係数の比は、特定の波長での光吸収に関する競合を反映するであろう。この情報から、2−ニトロベンジル部分が最も競合的に吸収された波長を、Olejnik等(1995)により報告されるアプローチと同様に決定することができる。
【0087】
モノクロメータ(Kratos, Schoeffel Instruments)と併合させた100W高圧キセノンランプ(LX1000UV、ILC)からの高流量の単色光を可能にする光分解設定を使用することができる。この機器により、吸収される光の強度および励起波長の関数として、モデルシステムの光切断の評価が可能である。標準的な分析的解析を用いて、光切断の度合いを決定する。この情報から、波長の関数としての光切断の効率を決定することができる。光切断が最も効率的に行われ得る波長を、シーケンシングシステムでの使用に選択することができる。
【0088】
光切断の結果は、図11に示すように、モデルシステムを用いて得られた。ジメチルスルホニルオキシド(DMSO)/NaHCO3(pH=8.2)中で室温にて一晩、PC−LC−ビオチン−NHSエステル(Pierce, Rockford IL)を5−(アミノアセトアミド)−フルオレセイン(5−アミノFAM)(Molecular Probes, Eugene OR)とカップリングさせて、一端にあるビオチン、中央にある光切断可能な2−ヒドロキシベンジル基、および他端にある色素タグ(FAM)から構成されるPL−LC−ビオチン−FAMが生産される。この光切断可能な部分は、図10に示す設計した光切断可能なヌクレオチド類縁体を綿密に模倣する。したがって、PC−LC−ビオチン−FAM部分の首尾よい光切断は、DNAシーケンシングシステムで使用される場合に、高効率の光分解の原理の証明を提供する。光分解研究に関して、PC−LC−ビオチン−FAMを、まずストレプトアビジン(XENOPORE, Hawthorne NJ)でコーティングした顕微鏡スライドガラス上に固定化する。固定化されていないPC−LC−ビオチン−FAMを洗い流した後、固定化PC−LC−ビオチン−FAMの蛍光放出スペクトルを、図12に示すようにとった(スペクトルa)。強力な蛍光放出は、PC−LC−ビオチン−FAMが、ストレプトアビジンでコーティングしたスライドガラスに首尾よく固定化されていることを示す。次に、350nmでの照射による2−ニトロベンジルリンカーの光切断性を試験した。10分の光分解(λirr=350nm、およそ0.5mW/cm2)後、かつ任意の洗浄前に、強度の減少を示さないスライド上の同じスポットの蛍光放出スペクトルが得られた(図12、スペクトルb)。これは、色素(FAM)が、350nmでの光分解プロセス中に漂白されていないことを示す。光分解後にHPLC水でのスライドガラスを洗浄した後、スライド上の同じスポットの蛍光放出スペクトルは、有意な強度減少を示した(図12、スペクトルc)。これは、蛍光色素(FAM)の大部分が、固定化ビオチン部分から切断され、洗浄手順により除去されたことを示す。この実験は、蛍光色素の高効率切断が、2−ニトロベンジル光切断可能なリンカーを用いて得ることができることを示す。
【0089】
4.ヌクレオチド類縁体3’−RO−A−Dye1、3’−RO−C−Dye2、3’−RO−G−Dye3、3’−RO−T−Dye4を用いた合成評価によるシーケンシング
セクション3の工程および条件がいったん最適化されれば、ヌクレオチド類縁体3’−RO−A−Dye1、3’−RO−C−Dye2、3’−RO−G−Dye3、3’−RO−T−Dye4の合成は、システムのさらなる研究のために実行することができる。ここで、4つ全てのヌクレオチド類縁体において3’−OHをキャップし、続いて、DNAポリメラーゼとともに混合して、図9のスキームで使用するシーケンシングシステムを評価するのに使用することができる。MOM(−CH2OCH3)またはアリル(−CH2CH=CH2)基を用いて、十分確立された合成手順を使用して3’−OH基をキャップする(図13)(Fuji et al. 19975, Metzker et al. 1994)。図14に示すように、これらの基を、高収率で化学的に切断することができる(Ireland, et al. 1986; Kamal et al. 1999)。MOMおよびアリル基の化学的切断は、かなり穏やかで特異的であり、DNA鋳型部分を減成しない。例えば、アリル基の切断は、93%を超える収率を伴って3分かかり(Kamal et al. 1999)、一方MOM基は、ほぼ100%の収率で切断されることが報告されている(Ireland, et al. 1986)。
【0090】
5.合成システムによるシーケンシングを最適化するためのエネルギー転移共役色素の使用
蛍光タグのスペクトル特性は、エネルギー転移(ET)共役色素を用いることで最適化することができる。ETプライマーおよびETジデオキシヌクレオチドは、1つのレーザの使用が蛍光タグの複数セットを励起するのを可能とする4色DNAシーケンシングの試薬の優れたセットであることがわかっている(Ju et al. 1995)。DNAポリメラーゼ(ThermoシーケナーゼおよびタグFS)は、ET色素標識ジデオキシリボヌクレオチドを効率よく組み込むことができることがわかっている(Rosenblum et al. 1997)。これらのET色素標識シーケンシング試薬は現在、ヒトゲノムプロジェクトのような大量スケールのDNAシーケンシングプロジェクトで使用されている。ET色素標識ヌクレオチド類縁体ライブラリーは、DNAシーケンシングシステムの最適化用に、図15に示すように合成することができる。供与体としてFAMを、受容体としてジクロロ(FAM、R6G、TAM、ROX)を用いたETセット(FAM−Cl2FAM、FAM−Cl2R6G、FAM−Cl2TAM、FAM−Cl2ROX)は文献に報告されており(Lee et al. 1997)、市販のDNAシーケンシング試薬セットを構成する。これらのET試薬セットは、増大した蛍光強度を生じることが証明されており、TおよびCの5位、ならびにGおよびAの7位にてこれらのET色素で標識したヌクレオチドは、DNAポリメラーゼの優れた基質である。あるいは、ET色素セットは、供与体としてシアニン(Cy2)を、エネルギー受容体としてCl2FAM、Cl2R6G、Cl2TAM、またはCl2ROXを用いて構築することができる。Cy2は、ローダミンおよびフルオレセイン誘導体と比較して、より高いモル吸光度を保有するため、供与体としてCy2を用いたET系は、供与体としてFAMを用いた系よりも相当強力な蛍光シグナルを生じる(Hung et al. 1996)。図16は、供与体としてFAMを用いたエネルギー転移系の合成に関するのと同様のカップリング化学を用いた、供与体としてCy2、および受容体としてCl2FAMを用いたET色素標識ヌクレオチド類縁体に関する合成スキームを示す(Lee et al. 1997)。スペーサ−である4−アミノメチル安息香酸(II)とCl2FAM(I)とのカップリングにより、IIIが生じ、続いてこれをNHSエステルIVに変換する。IVのアミノ−Cy2とのカップリング、続く得られた化合物のNHSエステルへの変換により、Vが得られ、続いてこれをアミノ−光リンカーヌクレオチドVIとカップリングさせて、ET色素標識ヌクレオチドVIIが得られる。
【0091】
6.ヌクレオチド類縁体3’−HO−A−Tag1、3’−HO−C−Tag2、3’−HO−G−Tag3、3’−HO−T−Tage4を用いた合成評価によるシーケンシング
質量タグの4つの例の前駆体を図17に示す。前駆体は、(a)アセトフェノン、(b)3−フルオロアセトフェノン、(c)3,4−ジフルオロアセトフェノン、および(d)3,4−ジメトキシアセトフェノンである。ニトロ化および還元すると、4つの光活性タグが4つの前駆体から生じ、これらを用いて、4つのヌクレオチド(A、C、G、T)のそれぞれの種別をコードする。明瞭なAPCI質量スペクトルが、図18に示すように、4つの質量タグ前駆体(a、b、c、d)に関して得られる。121のm/zを有するピークがa、139がb、157がc、181がdである。これの結果は、これらの4つの質量タグが極めて安定であり、質量タグ環の混信なくAPCI質量分析計において非常に高い分解能データを生成する。以下に示す例では、各質量タグからの特有のm/zそれぞれが、ヌクレオチドの種別へと変換される[Tag−1(m/z,150)=A、Tag−2(m/z,168)=C、Tag−3(m/z,186)=G、TAg−4(m/z,210)=T]。
【0092】
一般スキームに示すように、質量タグおよびヌクレオチドの種々の組合せ:体3’−HO−A−Tag1、3’−HO−C−T a g2、3’−HO−G−T a g3、3’−HO−T−Tage4(ここで、Tag1、Tag2、Tag3、およびTga4は、4つの異なる特有の質量タグである)を使用することができる。ヌクレオチド類縁体の4つの具体例を図19に示す。図19では、3’−OH基がキャップされていない場合、「R」は、Hである。上述のように、光切断可能な2−ニトロベンジル部分は、UV光(およそ350nm)照射による効率的除去のために、ビオチンをDNAおよびタンパク質に連結するのに使用されている(Olejnik et al. 1995, 1999)。質量タグとして異なる分子量を有する4つの異なる2−ニトロベンジル基を用いて、図19に示すように質量タグ標識ヌクレオチド:Aをコードする2−ニトロ−α−メチルベンジル(Tag−1)、Cをコードする2−ニトロ−α−メチル−3−フルオロベンジル(Tag−2)、Gをコードする2−ニトロ−α−メチル3,4−ジフルオロベンジル(Tag−3)、Tをコードする2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジメトキシベンジル(Tag−4)を形成する。
【0093】
代表例として、1つの質量タグ(Tag−3)のNHSエステルの合成を図20に示す。同様のスキームを用いて、他の質量タグを創出する。3’−HO−G−T a g3の合成は、十分確立された手順を用いて図21に示す(Prober et al. 1987、Lee et al. 1992、およびHobbs et al. 1991)。7−I−dGTPをN−トリフルオロアセチルプロパルギルアミンと反応させることで、まず7−プロパルギルアミノ−dGTPを調製し、次にそれをNHS−Tag−3とカップリングさせて、3’−HO−G−T a g3を生じる。遊離3’−OHを有するヌクレオチド類縁体は、ポリメラーゼの良好な基質である。
【0094】
合成アプローチによるシーケンシングを、図9の色素に関して示すスキームと同様のスキームを用いて、質量タグを使用して試験することができる。プライミング部位後に反復配列を有さないヌクレオチド配列の一部を含有するDNA鋳型を合成して、ガラスチャネルに固定化する。3’−HO−A−T a g1およびDNAポリメラーゼを、自己プライミングされたDNA部分に添加して、DNAの3’部位へのヌクレオチドの組込みを可能とする。次に、工程2Bの工程を行い(3’−OHが遊離しているので、化学的切断工程は不要である)、Tag−1(m/z=150)からの質量タグを検出する。次に、3’−HO−C−T a g2を添加して、Tag−2(m/z=186)の切断後に得られる質量スペクトルを測定する。次に、3’−HO−G−T a g3、および3’−HO−T−T a g4を順に添加して、切断産物Tag−3(m/z=186)およびTag−4(m/z=210)の質量スペクトルを測定する。予測光切断産物の例を図22に示す。光切断機構は、特有の標識が色素である場合に関して上述している。芳香族2−ニトロベンジル部分による光吸収(300〜360nm)は、2−ニトロ基をニトロソ基へと還元し、2位に位置する炭素−水素結合に酸素を挿入させ、続いて切断および脱炭酸を引き起こす(Pillai 1980)。
【0095】
ヌクレオチド類縁体3’−RO−A−Tag1、3’−RO−C−Tag2、3’−RO−G−Tag3、3’−RO−T−Tag4の合成は、特有の標識が色素である場合に関して上述しているシステムのさらなる研究のために実行することができる。ここで、4つ全てのヌクレオチド類縁体において3’−OHをキャップし、続いて、DNAポリメラーゼとともに混合して、図9のスキームで使用するシーケンシングシステムを評価するのに使用することができる。MOM(−CH2OCH3)またはアリル(−CH2CH=CH2)基を用いて、十分に確立された合成手順を使用して3’−OH基をキャップする(図13)(Fuji et al. 19975, Metzker et al. 1994)。図14に示すように、これらの基を、高収率で化学的に切断することができる(Ireland, et al. 1986; Kamal et al. 1999)。MOMおよびアリル基の化学的切断は、かなり穏やかで特異的であり、DNA鋳型部分を減成しない。
【0096】
7.合成によるシーケンシングに関する並行チャネルシステム
図23は、並行チャネルシステムの例を示す。このシステムは、図示するような質量タグ標識、また同様に色素標識を用いて使用することができる。シリカガラスチップ内の複数のチャネルは、そのチャネルの各端をウェルプレート中のウェルに接続させている。図示した例では、それ自身のウェルにそれぞれが接続された96個のチャネルが存在する。シーケンシングシステムはまた、96個以外のチャネル数を使用することも可能である。断片を分離、DNAシーケンシング、およびサイジングする96チャネルの装置が報告されている(Woolley and Mathies 1994, Woolley et al. 1997, Simpson et al. 1998)。フォトリソグラフィーマスキングおよび化学的エッチング技法により、チップが作製される。フォトリソグラフィー的に規定されるチャネルパターンをシリカガラス基板にエッチングした後、第2のシリカスライドガラスにエッチングした基板を熱的に結合させることで、キャピラリーチャネル(内径およそ100μm)が形成される。表面積を増大させるために、チャネルは多孔質である。固定化一本鎖DNA鋳型チップは、図3に示すスキームに従って調製される。各チャネルをまず0.5M NaOHで処理して、水で洗浄した後、高密度の3−アミノプロピルトリメチルシランのエタノール水溶液でコーティングして(Wooley et al. 1994)、第1アミン表面を形成する。トリアリールホスフィンのスクシンイミジル(NHS)エステル(1)を、第1アミン基と共有結合させて、アミン表面を新規トリアリールホスフィン表面に変換して、その表面は、アジド基を含有するDNA(2)と特異的に反応して、固定化DNAを有するチップを形成する。アジド基は、DNAの5’末端のみに位置し、カップリング反応は、水溶液中のアジド基とトリアリールホスフィンとの特有の反応によるものである(Saxon and Bertozzi 2000)ため、かかるDNA表面は、ハイブリダイゼーション用の最適な状態を提供するであろう。シーケンシング試薬および洗浄溶液のような液体は、ポリメラーゼ反応を実施するため、ならびに光分解した標識を収集するために、チップ内の各チャネルを洗浄して、そこに試薬を添加する目的で、2つの96ウェルプレート間を容易に圧力駆動することができる。シリカチップは、紫外光(λおよそ350nm)に対して透過性である。図では、UV光源で照射した際、光切断された質量タグを、APCI質量分析計で検出している。
【0097】
8.合成システムによる並行質量タグシーケンシング
本明細書中に開示するアプローチは、4つの特有の光放出質量タグを検出することを含み、これらのタグは、150〜250ダルトンの分子量を有することができ、DNA配列を解読することができ、それにより質量分析計を用いて大きなDNA断片を検出する問題、ならびに長いDNA断片を直接検出するための質量分析計を用いた場合の厳しい試料要件を回避する。APCI質量分析計を用いて各質量タグを解析するのに、10秒以下を要する。システムにおいて8個の小型APCI質量分析計を用いた場合、このアプローチを用いて各装置につき毎日、およそ100,000bpの質の高いディジタルDNAシーケンシングデータを生成することができる。このアプローチを用いる場合、分離および精製要件が存在しないため、かかるシステムは、費用効率が良い。
【0098】
DNAを解析する96ウェルキャピラリーアレイ方法に対抗する質量分析を作製するために、並行質量分析計アプローチが必要である。かかる完全システムは、質量分析計のほとんどが大きな生体分子に適した分解能を達成するように設計されているという事実に主に起因して報告されていない。本明細書中に開示するシステムは、4つのヌクレオチド(A、C、G、T)の種別をコードする、150〜250ダルトンの範囲の分子量を有する4つの質量タグの検出を要する。これらの質量タグの検出専用の質量分析計は、広い質量範囲を網羅するのではなく、150〜250ダルトンの質量範囲に関する高分解能が必要とされるだけであるため、質量分析計を小型化することができ、単純な設計を有する。四重極(イオントラップ検出器を含む)または飛行時間型のいずれかの質量分析計は、イオン光学に関して選択することができる。近代的な質量分析技術は、小型化質量分析計を製造することを可能としてきた一方で、最新の研究は、独立型小型化質量分析計の設計に焦点を当てている。質量分析計の個々の構成成分は、質量分析計の解析容量を増大するために小型化されている(Liu et al. 2000, Zhang et al. 1999)。並行して複数の分析器(最大10個)を用いた小型化質量分析システムが報告されている(Badman and Cooks 2000)。しかしながら、Badman and Cookの質量分析計は、並行した複数の試料ではなく単一試料のみを測定するように設計されていた。彼等はまた、イオントラップの小型化は、質量分析計の広い質量範囲をスキャンする容量を制限すると特筆した。本明細書中に開示するアプローチは、4つの小さな質量タグ(質量範囲は、300ダルトン未満である)を検出することに焦点を当てているため、複数の小型化APCI質量分析計を、DNAシーケンシング解析用の質量タグの並行解析用の単一ユニットに、容易に構築および組み立てられる。
【0099】
完全並行質量分析システムは、適切なエレクトロニクスおよび電源配置と一体となって、複数の分析器とインターフェースで連結された複数のAPCI源を包含する。並行検出容量を有する質量分析システムは、DAN解析での適用に関する処理量障害問題を克服するであろう。単一装置中に複数の質量分析計を含有する並行システムを図23および24に示す。図中の例は、並行して3つの質量分析計を有するシステムを示す。より多数の並行質量分析計を用いれば、より高い処理量が得られる。
【0100】
図24では、3つの小型質量分析計が、2つのターボ式ポンプととともに1つの装置に含まれている。試料をイオン源に注入し、そこで試料は、ネブライザーガスと混合されて、イオン化される。イオン源と分析器との間の開口部にある一方のターボ式ポンプを差動排気システムとして用いて、イオン源から生じるフリーラジカル、中性化合物および他の望ましくない要素を連続して一掃する。第2のターボ式ポンプを用いて、3つ全ての分析器および検出器に同時に連続真空を発生させる。質量分析計のコロナ放電モードおよびスキャンニングモードは、各小型化質量分析計に関して同じであるため、各分析器およびイオン化源用の1つ電源が、3つ全ての装置に必要な電力を供給することができる。3つの別個の検出器それぞれ用の1つの電源が、スペクトル収集に使用される。得られたデータは、3つの別個のA/D変換器に移送され、同時にデータシステムにより処理されて、注入された試料中の質量タグを特定し、したがってヌクレオチドを特定する。3つ質量分析計を含有するにもかかわらず、装置全体は、研究室ベンチトップ上に適合可能である。
【0101】
9.p53遺伝子をシーケンシングすることによる、合成システムによる完全シーケンシングの確証
腫瘍抑制遺伝子p53を、DNAシーケンシングシステムを確証するためのモデル系として使用することができる。p53遺伝子は、ヒト癌において最も頻繁に突然変異される遺伝子の1つである(O’Connor et al. 1997)。まず、5’末端におけるアジド基およびp53遺伝子のエキソン7およびエキソン8由来の配列の一部を含有する塩基対DNA鋳型(以下に示す):
5’−N3−TTCCTGCATGGGCGGCATGAACCCGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCATT−3’(配列番号2)
を合成する。
【0102】
この鋳型は、群を成すホットスポット単一塩基突然変異の検出用シーケンシングシステムの使用を探究するのに選択される。合成鋳型中で突然変異の可能性がある塩基に下線を付した(A、G、C、およびT)。合成鋳型を、シーケンシングチップまたはガラスチャネル上に固定化し、続いて図6に記載するように、ループプライマーを固定化鋳型に連結させ、次にシーケンシング評価のために図2の工程を行う。PCRにより生成するDNA鋳型を用いて、DNAシーケンシングシステムをさらに確証することができる。シーケンシング鋳型は、Fu等(1998)に記載するように、ゲノムDNAプール(Behringer, Indianapolis, IN)からの各p53エキソン境界に位置するイントロン領域中の隣接プライマー(対の一方は、5’末端にてアジド基で標識される)を用いてPCRにより生成することができ、続いてシーケンシング評価のためにDNAチップ上に固定化することができる。
[参照文献]
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】
ラットDNAポリメラーゼ、DNA鋳型−プライマー、およびジデオキシシリジン三リン酸(ddCTP)の三元複合体の三次元構造。図の左側は、ddCTPの付加に関する機構を示し、図の右側は、ポリメラーゼの活性部位を示す。ジデオキシリボース環の3’位が非常に混雑している一方で、シチジン塩基の5位では十分なスペースが利用可能であることに留意されたい。
【図2A】
合成アプローチによるシーケンシングのスキーム。A:特有の標識が色素であり、固体表面がチップである例。A、C、G、T,塩基アデニン、シトシン、グアニン、およびチミンを含むヌクレオチド三リン酸;d,デオキシ;dd,ジデオキシ;R,−OH基をキャップするのに使用される切断可能な化学基;Y,切断可能なリンカー。
【図2B】
合成アプローチによるシーケンシングのスキーム。B:特有の標識が質量タグであり、固体表面がガラスチップにエッチングされたチャネルである例。A、C、G、T,塩基アデニン、シトシン、グアニン、およびチミンを含むヌクレオチド三リン酸;d,デオキシ;dd,ジデオキシ;R,−OH基をキャップするのに使用される切断可能な化学基;Y,切断可能なリンカー。
【図3】
トリアリールホスフィン部分でコーティングした固体表面へ、アジド(N3)標識DNA断片を固体化するための合成スキーム。Me,メチル基;P,リン;Ph,フェニル。
【図4】
トリアリールホスフィンN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルの合成。
【図5】
リンカーによりアジド(N3)基をDNA断片の5’末端に結合するための合成スキームであり、アジド基は続いて、固体表面上のトリアリールホスフィン部分とカップリングするのに使用される。DMSO,ジメチルスルホニルオキシド。
【図6】
ループを形成したプライマー(B)を、固体表面上の自己プライミングされたDNA鋳型部分を形成する固定化一本鎖DNA鋳型へ連結する図。P(円中),リン酸)。
【図7】
合成アプローチによるシーケンシングで使用する4つのヌクレオチド類縁体の構造例。ヌクレオチド類縁体はそれぞれ、光切断可能なリンカーにより塩基に結合された特有の蛍光色素を有しており、3’−OHは、露出しているか、またはMOM基もしくはアリル基でキャップされている。FAM,5−カルボキシフルオレセイン;R6G、6−カルボキシローダミン−6G;TAM,N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン;ROX,6−カルボキシ−X−ローダミン。R=H、CH2OCH3(MOM)またはCH2CH=CH2(アリル)。
【図8】
ヌクレオチド類縁体3’−RO−G−Tamの合成に関する代表的スキーム。同様のスキームを用いて、他の3つの修飾ヌクレオチド:3’−RO−A−Dye1、3’−RO−C−Dye2、3’−RO−T−Dye4を創出することができる。(i)テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0);(ii)POCl3、Bn4N+ピロリン酸塩;(iii)NH4OH;(iv)Na2CO3/NaHCO3(pH=9.0)/DMSO)。
【図9】
合成アプローチによるシーケンシングの試験に関するスキーム。特有の蛍光色素の結合で修飾した各ヌクレオチドを、相補鋳型に基づいて、順に添加する。色素を検出および切断して、アプローチを試験する。Dye1=Fam;Dye2=R6G;Dye3=Tam;Dye=Rox。
【図10】
光切断可能な色素(Tam)を含有するDNAの予測光切断産物。芳香族2−ニトロベンジル部分による光吸収(300〜360nm)は、2−ニトロ基をニトロソ基へと還元し、2位に位置する炭素−水素結合に酸素を挿入させ、続いて切断および脱炭酸を引き起こす(Pillai 1980)。
【図11】
光切断可能なリンカー2−ニトロベンジル基とカップリングさせたフルオロフォアの光分解効率を評価するための、PC−LC−ビオチン−FAMの合成。
【図12】
ストレプトアビジンでコーティングした顕微鏡スライドガラス上に固定化したPC−LC−ビオチン−FAMの蛍光スペクトル(λex=480nm)(a)、10分の光分解(λirr=350nm、およそ0.5mW/cm2)後の蛍光スペクトル(b)、および光切断された色素を除去するために水で洗浄した後の蛍光スペクトル(c)。
【図13】
ヌクレオチドの3’−OHをキャップするための合成スキーム。
【図14】
ヌクレオチド中の3’−OHを遊離させるための、MOM基(上列)およびアリル基(下列)の化学的切断。CITMS=クロロトリメチルシラン。
【図15A】
エネルギー転移共役系の例。ここで、FamまたはCy2は、光吸収体(エネルギー転移供与体)として用いられ、Cl2Fam、Cl2R6G、Cl2Tam、またはCl2Roxは、エネルギー転移受容体として用いられる。Cy2,シアニン;FAM,5−カルボキシフルオレセイン;R6G,6−カルボキシローダミン−6G;TAM,N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン;ROX,6−カルボキシ−X−ローダミン。
【図15B】
エネルギー転移共役系の例。ここで、FamまたはCy2は、光吸収体(エネルギー転移供与体)として用いられ、Cl2Fam、Cl2R6G、Cl2Tam、またはCl2Roxは、エネルギー転移受容体として用いられる。Cy2,シアニン;FAM,5−カルボキシフルオレセイン;R6G,6−カルボキシローダミン−6G;TAM,N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン;ROX,6−カルボキシ−X−ローダミン。
【図16】
光切断可能なエネルギー転移色素標識ヌクレオチドの合成。DMF,ジメチルホルムアミド。DEC=1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩。R=H、CH2OCH3(MOM)またはCH2CH=CH2(アリル)。
【図17】
4つの質量タグ前駆体、および4つの光活性質量タグの構造。前駆体:a)アセトフェノン、b)3−フルオロアセトフェノン、c)3,4−ジフルオロアセトフェノン、およびd)3,4−ジメトキシアセトフェノン。4つの光活性質量タグを用いて、4つのヌクレオチド(A、C、G、T)のそれぞれの種別をコードする。
【図18】
図17に示す質量タグ前駆体の大気圧化学イオン化(APCI)質量スペクトル。
【図19】
合成アプローチによるシーケンシングで使用するための4つのヌクレオチド類縁体の構造例。ヌクレオチド類縁体はそれぞれ、光切断可能なリンカーにより塩基に結合された特有の質量タグを有しており、3’−OHは、露出しているか、またはMOM基もしくはアリル基でキャップされている。角括弧は、質量タグが切断可能であることを示している。R=H、CH2OCH3(MOM)またはCH2CH=CH2(アリル)。
【図20】
質量タグの1つ(Tag−3)のNHSエステルの合成例。同様のスキームを用いて、他の質量タグを創出する。
【図21】
ヌクレオチド類縁体体3’−RO−G−Tag3の合成に関する代表的スキーム。同様のスキームを用いて、他の3つの修飾塩基:3’−RO−A−T a g1、3’−RO−C−Tag2、3’−RO−T−T a g4を創出することができる。(i)テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0);(ii)POCl3、Bn4N+ピロリン酸塩;(iii)NH4OH;(iv)Na2CO3/NaHCO3(pH=9.0)/DMSO)。
【図22】
光切断可能な質量タグを含有するDNAの予測光切断産物の例。
【図23】
並行した複数チャネルおよび並行した複数質量分析計を含むDNAシーケンシング用システム。例は、シリカガラスチップ内の96チャネルを示す。
【図24】
DNAシーケンシング用の並行質量分析システム。例は、並行した3つの質量分析計を示す。試料をイオン源に注入し、そこで試料は、ネブライザーガスと混合されて、イオン化される。ターボ式ポンプを用いて、イオン源から生じるラジカル、中性化合物および他の望ましくない要素を連続して一掃する。第2のターボ式ポンプを用いて、3つ全ての分析器および検出器に同時に連続真空を発生させる。次に、取得したシグナルを、A/D変換器でデジタル信号に変換する。続いて、3つ全ての信号をデータ取得プロセッサに送り、信号を変換して、注入試料中の質量タグを特定し、したがってヌクレオチド配列を特定する。
本出願は、2001年6月26日に提出された米国仮出願第60/300,894号の利益を主張し、また本出願は、2000年10月6日に提出された米国出願第09/684,670号の一部継続出願である(この両方の内容は、その全体が参照により本出願に援用される)。
【0002】
【発明の背景】
本出願全体にわたって、様々な刊行物を、著者と年月を括弧でくくって参照している。これらの参照文献に関する完全な引用は、本明細書の図面の簡単な説明の項の直前に記載する。これらの刊行物のその全体の開示は、本発明が関連する技術分野の事情についてより完全に記載するために、参照により本出願に援用される。
【0003】
正確かつ迅速にデオキシリボ核酸(DNA)をシーケンシングする能力は、生物学および医学に大きな変革をもたらしている。壮大なヒトゲノムプロジェクトの集合は、ハイスループットの遺伝子解析術の開発を急激に成長させている。化学、工学、生物学、およびコンピュータ科学を含むこの迅速な技術の発達により、一度に単独遺伝子を研究することから、全ゲノムを解析および比較することへの移行を可能にする。
【0004】
最初の全ヒトゲノム配列マップが完成すれば、エキソンおよびイントロンの両方において高度に多型であるゲノム中の多くの領域が知られるであろう。薬理ゲノミクスの挑戦は、薬剤応答の可変性に関連する遺伝子および機能的多型を包括的に特定することである(Roses, 2000)。疾患の発症に関連するゲノム中の多型領域の再シーケンシングは、癌のような疾患の理解、および治療法の開発に大いに貢献するであろう。したがって、完全なヒトゲノム配列マップの最大限の可能性を探るためには、ゲノムの高可変性イントロン/エキソンを再シーケンシングするための正確なハイスループットの方法が必要である。例えばヒトゲノムプロジェクト(Pennisi 2000)に使用されるハイスループットDNAシーケンシング用の現在の最新技術は、レーザ誘起蛍光検出を用いたキャピラリーアレイDNAシーケンサーである(Smith et al., 1986; Ju et al. 1995, 1996; Kheterpal et al. 1996; Salas−Solano et al. 1998)。均一な終結効率を引き起こすポリメラーゼの改良および熱安定性ポリメラーゼの導入によっても、シーケンシングデータの質は有意に改善された(Tabor and Richardson, 1987, 1995)。キャピラリーアレイDNAシーケンシング技術は、大規模なDNAシーケンシングプロジェクトの処理量および読取り長さ要件にある程度は対処し得るものの、突然変異研究に必要な処理量および精度は、疾患遺伝子の発見から法学医学的識別に及ぶ多種多様な用途に関して改善される必要がある。例えば、電気泳動ベースのDNAシーケンシング法は、ヘテロ接合体を明確に検出することが困難であり、圧縮に起因して、グアニンまたはシトシンを含むヌクレオチドに富んだ領域では100%正確であるわけではない(Bowling et al. 1991; Yamakawa et al. 1997)。さらに、プライミング部位後の最初の数個の塩基は、過剰な色素標識プライマーまたは色素標識ターミネーターからの高蛍光シグナルでマスクされる場合が多く、したがって特定しにくい。したがって、DNAシーケンシングに関する電気泳動の要件は、依然としてハイスループットDNA配列および突然変異検出プロジェクトの障壁である。
【0005】
電気泳動を使用せずに合成によりDNAシーケンシングするという概念は、1998年に最初に出現したものであり(Hyman, 1988)、各ヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応中の成長中のDNA鎖に組み込まれることから、各ヌクレオチドの種別(identity)を検出することを包含している。チップフォーマットおよびレーザ誘導蛍光検出と一体となっているかかる仕組みは、DNAシーケンシングプロジェクトの処理量を顕著に増加させる能力を有する。したがって、幾つかのグループが、超ハイスループットのDNAシーケンシング手法を構築する目的で、かかるシステムを研究してきた(Cheeseman 1994, Metzker et al. 1994)。現段階では、かかるシステムを使用してDNAを明白にシーケンシングした完全な成功は報告されていない。合成によりDNAをシーケンシングするための、4つの天然ヌクレオチド(アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、またはチミン(T)に塩基を含む)および数個の他の酵素を使用するパイロシーケンシング法(pyrosequencing approach)は、突然変異検出に現在広範に使用されている(Ronaghi 1988)。このアプローチでは、検出は、DNAポリメラーゼ反応中に放出されるピロリン酸塩(PPi)、スルフリラーゼによるアデノシン三リン酸(ATP)へのピロリン酸の定量的な変換、その後のホタルルシフェラーゼによる可視光の産生に基づく。この手法は、ヌクレオチド配列の30個以下の塩基対(bp)をシーケンシングすることができるだけであり、4つのヌクレオチドはそれぞれ、別個に添加して、かつ別個に検出する必要がある。長く伸びた同じ塩基は、パイロシーケンシング方法を用いて明白に特定することはできない。
【0006】
合成方法によるDNAシーケンシングを探究する文献での最近の研究は、主としてデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)の3’−OH基をキャップするための、蛍光色素に連結された光切断可能な化学部分を設計および合成することに集中している(Welch et al. 1999)。DNAポリメラーゼによる3’修飾ヌクレオチドの組込みに関して、成功が限られていると報告されている。その理由は、デオキシリボース上の3’位が、ポリメラーゼの活性部位中のアミノ酸残基に非常に接近しており、その結果、ポリメラーゼがデオキシリボース環のこの領域での修飾に敏感であるためである。他方、修飾DNAポリメラーゼ(ThermoシーケナーゼおよびTaq FSポリメラーゼ)は、ピリミジン(TおよびC)の5位およびプリン(GおよびA)の7位にあるエネルギー転移色素のような嵩高い基により広範に修飾されたヌクレオチドを認識可能であることが知られている(Rosenblum et al. 1997, Zhu et al. 1994)。ラットDNAポリメラーゼ、DNA鋳型−プライマー、およびジデオキシシチジン三リン酸(ddCTP)の三元複合体が決定され(Pelletier et al. 1994)、この事実を支持する。図1に示すように、この三次元構造は、ddCTPにおけるデオキシリボース環の3’位の周辺領域が非常に混雑している一方で、シチジン塩基の5’位上には修飾用の十分なスペースが存在していることを示す。
【0007】
本出願に開示するアプローチは、切断可能なリンカーにより、ヌクレオチド塩基またはヌクレオチド塩基の類縁体に、例えばピリミジン(TおよびC)の5位およびプリン(GおよびA)の7位に、蛍光色素または質量タグのような特有の標識を連結したヌクレオチド類縁体を作製すること、デオキシリボースの3’−OH基を不活性にするために、それをキャップする小さい切断可能な化学部分を使用すること、およびターミネーターとして、成長中のDNA鎖にヌクレオチド類縁体を組み込むことである。特有の標識の検出により、ヌクレオチド配列の種別が得られる。標識および3’−OHキャッピング基を除去すると、ポリメラーゼ反応は進行して、次のヌクレオチド類縁体を組み込み、次の塩基を検出する。
【0008】
3’−OH基をキャップするための光切断可能な基を使用することもまた望ましい。しかしながら、光切断可能な基は一般に嵩高く、したがってDNAポリメラーゼは、3’−OH基をキャップする光切断可能な部分を含むヌクレオチド類縁体を組み込むことが困難である。高収率で化学的に容易に切断することができる小さな化学部分が3’−OH基をキャップするのに使用できる場合、かかるヌクレオチド類縁体はまた、DNAポリメラーゼ用の基質として認識されるはずである。3’−O−メトキシ−デオキシヌクレオチドは、幾つかのポリメラーゼ用の良好な基質であることが報告されている(Axelrod et al. 1978)。3’−O−アリル−dATPもまた、Ventr(exo−)DNAポリメラーゼにより成長中のDNA鎖中に組み込まれることがわかっていた(Metzker et al. 1994)。しかしながら、メトキシ基を化学的に切断する手法は厳格であり、無水条件が必要とされる。したがって、合成によりDNAをシーケンシングするために、3’−OH基のキャッピングにメトキシ基を使用することは実用的ではない。エステル基もまた、ヌクレオチドの3’OH基をキャップするのに探究されたが、それは、DNAポリメラーゼの活性部位中の求核試剤により切断されることがわかった(Canard et al. 1995)。ケトン基のような求電子剤を有する化学基は、ポリメラーゼ中の強力な求核剤の存在に起因して、酵素反応においてヌクレオチドの3’−OHを保護するには適さない。MOM(−CH2OCH3)およびアリル(−CH2CH=CH2)基は、−OH基をキャップするのに使用することができ、高収率で化学的に切断することができる(Ireland et al. 1986; Kamal et al. 1999)。本出願に開示するアプローチは、蛍光色素または質量タグのような切断可能な特有の標識で標識され、且つ3’−OHがMOM基(−CH2OCH3)またはアリル基(−CH2CH=CH2)のような切断可能な化学部分でキャップされているヌクレオチド類縁体を、ターミネーターとして、成長中のDNA鎖に組み込むことである。次いで、最適化されたヌクレオチドセット(3’−RO−A−LABEL1、3’−RO−C−LABEL2、3’−RO−G−LABEL3、3’−RO−T−LABEL4:ここでRは、3’−OHをキャップするのに使用される化学基を意味する)を、合成アプローチによるDNAシーケンシングに使用することができる。
【0009】
質量分析(MS)を用いて小さく且つ安定な分子を検出することには多くの利点がある。例えば、質量分解能は1ダルトン程度と良好であり得る。したがって、蛍光放出スペクトルの重複によりヘテロ接合体の検出を困難にするゲル電気泳動シーケンシングシステムおよびレーザ誘導蛍光検出アプローチと比較して、本出願に開示するMSアプローチは、長いDNA断片でなく、切断された小さな質量タグを検出することにより、非常に高分解能のシーケンシングデータをもたらす。この方法はまた、マイクロ秒の時間スケールで、きわめて迅速な分離をもたらす。高分解能により、正確なデジタル突然変異およびヘテロ接合体検出が可能となる。小さな質量タグを検出することによる質量分析を用いたシーケンシングの別の利点は、ゲルベースのシステムに関連した圧縮が完全に排除されることである。
【0010】
鋳型DNAとハイブリダイズした連続したプライマー伸長産物を維持するために、ポリメラーゼ反応において自己プライミングが可能な独立体を形成する安定なループを含むプライマーを、チップのような固体表面上に固定化される各一本鎖DNA鋳型の3’末端に連結させることができる。このアプローチは、各サイクルにおける成長中の伸長産物の洗い流しの問題を解決する。
【0011】
SaxonおよびBertozzi(2000)は、生物学的セルの表面上のアジド基に、ホスフィン部分を含有する特定基を化学的に連結させる、洗練され且つ高度に特異的なカップリングを開発した。本出願では、このカップリングの化学は、共有結合させたホスフィン部分でコーティングされた固体表面を形成するために、またDNA鋳型を固体表面と特異的にカップリングさせるための、5’末端にあるアジド基を含有するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物を生成させるために適合される。固体表面の一例は、表面積を増大させるためのでこぼこした表面または多孔質表面を有する内壁を有するガラスチャネルである。別の例は、チップである。
【0012】
本出願は、チップのような固体表面に共有結合させた安定なDNA鋳型(これは、ポリメラーゼ反応を自己プライミングすることが可能である)、および4つの特有のヌクレオチド類縁体(3’−RO−A−LABEL1、3’−RO−C−LABEL2、3’−RO−G−LABEL3、3’−RO−T−LABEL4)を用いた合成アプローチによる、DNAシーケンシングのための新規かつ好適なシステムを開示する。この新規システムの成功により、多型、薬理ゲノミクス用途、および全ゲノムシーケンシング用の超ハイスループットかつ高フィデリティのDNAシーケンシングシステムの開発が可能となるであろう。この迅速かつ正確なDNA再シーケンシングシステムは、一塩基多型(SNP)(Chee et al. 1996)、遺伝子発現の順次解析(SAGE)(Velculescu et al. 1995)、法医学における特定、および遺伝子疾患関連研究の検出のような分野で必要とされる。
【0013】
【発明の概要】
本発明は、ヌクレオチド類縁体がポリメラーゼ反応において成長中のDNA鎖に組み込まれた後に、該ヌクレオチド類縁体の種別を検出することで核酸をシーケンシングする方法において:
(i)上記核酸の5’末端を固体表面に結合する工程と、
(ii)上記固体表面に結合された上記核酸に、プライマーを結合する工程と、
(iii)ポリメラーゼおよび1以上の異なるヌクレオチド類縁体を上記核酸に添加し、それにより上記成長中のDNA鎖にヌクレオチド類縁体を組み込む工程であって、ここで組み込まれたヌクレオチド類縁体は上記ポリメラーゼ反応を終結させ、また異なるヌクレオチド類縁体はそれぞれ、(a)アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシル、ならびにそれらの類縁体からなる群から選択される塩基、(b)切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識、(c)デオキシリボース、および(d)該デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするための切断可能な化学基を含む工程と、
(iv)上記固体表面を洗浄して、組み込まれていないヌクレオチド類縁体を除去する工程と、
(v)上記成長中のDNA鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体に結合された上記特有の標識を検出して、それにより組み込まれたヌクレオチド類縁体を同定する工程と、
(vi)1以上の化学的化合物を添加して、上記核酸に結合された上記プライマー上の全ての未反応−OH基、または1以上のヌクレオチド類縁体を上記プライマーに添加することにより形成されたプライマー伸長鎖上の全ての未反応−OH基を永久的にキャップする工程と、
(vii)上記成長中のDNA鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体と上記特有の標識との間の上記切断可能なリンカーを切断する工程と、
(viii)上記デオキシリボースの上記3’位にある上記−OH基をキャップしている上記切断可能な化学基を切断して、上記−OH基からキャップを外し、上記固体表面を洗浄して、切断された化合物を除去する工程と、
(ix)工程(iii)〜(viii)を繰り返して、上記成長中のDNA鎖に新たに組み込まれたヌクレオチド類縁体の上記種別を検出する工程と
を含み、
上記特有の標識が色素である場合には、工程(v)〜(vii)の順序は、(v)、(vi)、および(vii)であり、
上記特有の標識が質量タグである場合には、工程(v)〜(vii)の順序は、(vi)、(vii)、および(v)である方法に関する。
【0014】
本発明は、核酸を固体表面に結合する方法であって:
(i)上記固体表面をホスフィン部分でコーティングすることと、
(ii)上記核酸の5’末端にアジド基を結合することと、
(iii)上記固体表面上の上記ホスフィン部分と、上記核酸の上記5’末端上の上記アジド基との間の相互作用により、上記核酸の上記5’末端を上記固体表面に固定化することと
を含む方法を提供する。
【0015】
本発明は、ヌクレオチド類縁体であって:
(a)アデニンまたはアデニンの類縁体、シトシンまたはシトシンの類縁体、およびグアニンまたはグアニンの類縁体、チミンまたはチミンの類縁体、およびウラシルまたはウラシルの類縁体からなる群から選択される塩基と、
(b)切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識と、
(c)デオキシリボースと、
(d)該デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするための切断可能な化学基と
を含むヌクレオチド類縁体を提供する。
【0016】
本発明は、並行質量分析システムであって、試料タグを含む複数の試料を並行解析するための、複数の大気圧化学イオン化質量分析計を具備する並行質量分析システムを提供する。
【0017】
【発明の詳細な記述】
以下の定義は、本発明を理解するための補助として提供される。
【0018】
本明細書中で使用する場合、−OH基を「キャップする」とは、−OH基中の「H」を化学基で置き換えることを意味する。本明細書中で使用する場合、ヌクレオチド類縁体の−OH基は、切断可能な化学基でキャップされる。−OH基から「キャップを外す」とは、キャップした−OH基から化学基を切断して、化学基を「H」で置き換えること、すなわち、−OR中の「R」を「H」で置き換えることを意味する。ここで「R」は、−OH基をキャップするのに使用される化学基である。
【0019】
ヌクレオチド塩基は以下の通りに略記する:アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、およびウラシル(U)。
【0020】
「ヌクレオチド塩基の類縁体」とは、ポリメラーゼにより基質として認識され得るヌクレオチド塩基の構造的かつ機能的類縁体を指す。すなわち、例えば、二重らせんフォーマットでは、アデニン(A)の類縁体は、チミン(T)と水素結合を形成すべきであり、C類縁体は、Gと水素結合を形成すべきであり、G類縁体は、Cと水素結合を形成すべきであり、T類縁体は、Aと水素結合すべきである。ヌクレオチド塩基の類縁体の例としては、7−デアザ−アデニン、および7−デアザ−グアニン(ここで、アデニンまたはグアニンの7位にある窒素原子が炭素原子で置換されている)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0021】
「ヌクレオチド類縁体」とは、ヌクレオチドに構造的および機能的に類似している化学的化合物を指す。すなわち、ヌクレオチド類縁体は、ポリメラーゼに基質として認識され得る。すなわち、例えば、二重らせんフォーマットでは、アデニンまたはアデニンの類縁体を含むヌクレオチド類縁体は、チミンと水素結合を形成すべきであり、CまたはCの類縁体を含むヌクレオチド類縁体は、Gと水素結合を形成すべきであり、GまたはGの類縁体を含むヌクレオチド類縁体は、Cと水素結合を形成すべきであり、TまたはTの類縁体を含むヌクレオチド類縁体は、Aと水素結合を形成すべきである。本明細書中で開示するヌクレオチド類縁体の例としては、7−デアザ−アデニンまたは7−デアザ−グアニン(ここで、アデニンまたはグアニンの7位にある窒素原子が炭素原子で置換されている)のようなヌクレオチド塩基の類縁体を含む類縁体が挙げられる。さらなる例としては、切断可能なリンカーにより、シトシンまたはチミンの5位、あるいはデアザ−アデニンまたはデアザ−グアニンの7位に標識が連結されている類縁体が挙げられる。他の例としては、デオキシリボースの3’位で−OH基をキャップするのに−CH2OCH3または−CH2CH=CH2のような小化学部分を使用している類縁体が挙げられる。ジデオキシヌクレオチドの類縁体は同様に調製することができる。
【0022】
本明細書中で使用する場合、「多孔質」表面は、孔を含有するか、そうでなければでこぼこしている表面であり、その結果多孔質表面の表面積は、表面が滑らかな場合の表面積に対して増大する。
【0023】
本発明は、ヌクレオチド類縁体がポリメラーゼ反応において成長中のDNA鎖に組み込まれた後に、該ヌクレオチド類縁体の種別を検出することで核酸をシーケンシングする方法において:
(i)上記核酸の5’末端を固体表面に結合する工程と、
(ii)上記固体表面に結合された上記核酸に、プライマーを結合する工程と、
(iii)ポリメラーゼおよび1以上の異なるヌクレオチド類縁体を上記核酸に添加し、それにより上記成長中のDNA鎖にヌクレオチド類縁体を組み込む工程であって、ここで組み込まれたヌクレオチド類縁体は上記ポリメラーゼ反応を終結させ、また異なるヌクレオチド類縁体はそれぞれ、(a)アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシル、ならびにそれらの類縁体からなる群から選択される塩基、(b)切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識、(c)デオキシリボース、および(d)該デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするための切断可能な化学基を含む工程と、
(iv)上記固体表面を洗浄して、組み込まれていないヌクレオチド類縁体を除去する工程と、
(v)上記成長中のDNA鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体に結合された上記特有の標識を検出して、それにより組み込まれたヌクレオチド類縁体を同定する工程と、
(vi)1以上の化学的化合物を添加して、上記核酸に結合された上記プライマー上の全ての未反応−OH基、または1以上のヌクレオチド類縁体を上記プライマーに添加することにより形成されたプライマー伸長鎖上の全ての未反応−OH基を永久的にキャップする工程と、
(vii)上記成長中のDNA鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体と上記特有の標識との間の上記切断可能なリンカーを切断する工程と、
(viii)上記デオキシリボースの上記3’位にある上記−OH基をキャップしている上記切断可能な化学基を切断して、上記−OH基からキャップを外し、上記固体表面を洗浄して、切断された化合物を除去する工程と、
(ix)工程(iii)〜(viii)を繰り返して、上記成長中のDNA鎖に新たに組み込まれたヌクレオチド類縁体の上記種別を検出する工程と
を含み、
上記特有の標識が色素である場合には、工程(v)〜(vii)の順序は、(v)、(vi)、および(vii)であり、
上記特有の標識が質量タグである場合には、工程(v)〜(vii)の順序は、(vi)、(vii)、および(v)である方法に向けられている。
【0024】
本明細書中に記載するヌクレオチド類縁体のいずれかの一実施形態では、ヌクレオチド塩基はアデニンである。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はグアニンである。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はシトシンである。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はチミンである。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はウラシルである。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はアデニンの類縁体である。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はグアニンの類縁体である。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はシトシンの類縁体である。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はチミンの類縁体である。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はウラシルの類縁体である。
【0025】
本明細書中に記載する本発明のいずれかの異なる実施形態では、固体表面は、ガラス、シリコン、または金である。異なる実施形態では、固体表面は、磁気ビーズ、チップ、チップ内チャネル、またはチップ内多孔質チャネルである。一実施形態では、固体表面はガラスである。一実施形態では、固体表面は、シリコンである。一実施形態では、固体表面は、金である。一実施形態では、固体表面は、磁気ビーズである。一実施形態では、固体表面は、チップである。一実施形態では、固体表面は、チップ内チャネルである。一実施形態では、固体表面は、チップ内多孔質チャネルである。他の材料も、その材料が上記方法の工程を妨害しない限り使用することができる。
【0026】
一実施形態では、核酸を固体表面に結合する工程は、以下の:
(i)上記固体表面をホスフィン部分でコーティングすることと、
(ii)上記核酸の5’末端にアジド基を結合することと、
(iii)上記固体表面上の上記ホスフィン部分と、上記核酸の上記5’末端上の上記アジド基との間の相互作用により、上記核酸の上記5’末端を上記固体表面に固定化することと
を含む。
【0027】
一実施形態では、固体表面をホスフィン部分でコーティングする工程は、以下の:
(i)上記固体表面を第一アミンでコーティングすることと、
(ii)トリアリールホスフィンのN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを上記第一アミンと共有結合させることと
を含む。
【0028】
一実施形態では、固体表面に結合される核酸は、一本鎖デオキシリボ核酸(DNA)である。別の実施形態では、工程(i)で固体表面に結合される核酸は、二本鎖DNAであり、ここで一方の鎖のみが、固体表面上に直接結合され、固体表面上に直接結合されない鎖は、工程(ii)に進む前に変性させることで除去される。一実施形態では、固体表面上に結合される核酸は、リボ核酸(RNA)であり、工程(iii)におけるポリメラーゼは、逆転写酵素である。
【0029】
一実施形態では、プライマーは、工程(ii)において核酸の3’末端に結合され、結合されたプライマーは、ポリメラーゼ反応中に自己プライミングすることが可能である安定なループおよびデオキシリボースの3’位にある−OH基を含む。一実施形態では、核酸にプライマーを結合する工程は、核酸にプライマーをハイブリダイズすること、または核酸にプライマーを連結することを含む。一実施形態では、プライマーは、核酸の3’末端とプライマーの5’末端とを連結する連結反応により核酸に結合される。
【0030】
一実施形態では、1以上の4つの異なるヌクレオチド類縁体が工程(iii)において添加され、ここで異なるヌクレオチド類縁体それぞれは、チミンもしくはウラシル、またはチミンもしくはウラシルの類縁体、アデニンまたはアデニンの類縁体、シトシンまたはシトシンの類縁体、およびグアニンまたはグアニンの類縁体からなる群から選択される異なる塩基を含み、4つの異なるヌクレオチド類縁体はそれぞれ、特有の標識を含む。
【0031】
一実施形態では、ヌクレオチド類縁体中のデオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップする切断可能な化学基は、−CH2OCH3または−CH2CH=CH2である。基が、1)ポリメラーゼ連鎖反応中に安定であり、2)基質としてのポリメラーゼによるヌクレオチド類縁体の認識を妨害せず、3)切断可能である限り、任意の化学基を使用することができる。
【0032】
一実施形態では、ヌクレオチド類縁体に結合される特有の標識は、蛍光部分または蛍光半導体結晶である。さらなる実施形態では、蛍光部分は、5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシローダミン−6G、N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン、および6−カルボキシ−X−ローダミンからなる群から選択される。一実施形態では、蛍光部分は、5−カルボキシフルオレセインである。一実施形態では、蛍光部分は、6−カルボキシローダミン−6G、N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミンである。一実施形態では、蛍光部分は、6−カルボキシ−X−ローダミンである。
【0033】
一実施形態では、ヌクレオチド類縁体に結合される特有の標識は、エネルギー転移供与体およびエネルギー転移受容体を含む蛍光エネルギー転移タグである。さらなる実施形態では、エネルギー転移供与体は、5−カルボキシフルオレセインまたはシアニンであり、エネルギー転移授与体は、ジクロロカルボキシフルオレセイン、ジクロロ−6−カルボキシローダミン−6G、ジクロロ−N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン、およびジクロロ−6−カルボキシ−X−ローダミンからなる群から選択される。一実施形態では、エネルギー転移授与体は、ジクロロカルボキシフルオレセインである。一実施形態では、エネルギー転移授与体は、ジクロロ−6−カルボキシローダミン−6Gである。一実施形態では、エネルギー転移授与体は、ジクロロ−N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミンである。一実施形態では、エネルギー転移授与体は、およびジクロロ−6−カルボキシ−X−ローダミンである。
【0034】
一実施形態では、ヌクレオチド類縁体に結合される特有の標識は、質量分析計により検出および識別することができる質量タグである。さらなる実施形態では、質量タグは、2−ニトロ−α−メチルベンジル基、2−ニトロ−α−メチル−3−フルオロベンジル基、2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジフルオロベンジル基、および2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジメトキシベンジル基からなる群から選択される。一実施形態では、上記質量タグは、2−ニトロ−α−メチルベンジル基である。一実施形態では、上記質量タグは、2−ニトロ−α−メチル−3−フルオロベンジル基である。一実施形態では、上記質量タグは、2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジフルオロベンジル基である。一実施形態では、上記質量タグは、2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジメトキシベンジル基である。一実施形態では、質量タグは、試料タグを含む複数の試料を並行解析するための、複数の大気圧化学イオン化質量分析計を具備する並行質量分析システムを用いて検出される。
【0035】
一実施形態では、特有の標識は、切断可能なリンカーにより、シトシンまたはチミンの5’位、あるいはデアザアデニンまたはデアザグアニンの7’位に結合される。特有の標識は、標識の結合がポリメラーゼ連鎖反応中に安定であり、かつヌクレオチド類縁体がポリメラーゼにより基質として認識され得る限り、切断可能なリンカーにより、ヌクレオチド類縁体の別の位置に結合することができる。例えば、切断可能な標識は、デオキシリボースに結合することができる。
【0036】
一実施形態では、特有の標識とヌクレオチド類縁体との間の切断可能なリンカーは、1以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、物理的手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、化学的手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、物理化学的手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、熱によって切断される。一実施形態では、リンカーは、光によって切断される。一実施形態では、リンカーは、紫外線によって切断される。さらなる実施形態では、切断可能なリンカーは、2−ニトロベンジル部分を含む光切断可能なリンカーである。
【0037】
一実施形態では、デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするのに使用する切断可能な化学基は、1以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、物理化学的手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、熱によって切断される。一実施形態では、リンカーは、光によって切断される。一実施形態では、リンカーは、紫外線によって切断される。
【0038】
一実施形態では、核酸に結合されたプライマー、またはプライマー伸長鎖上にある如何なる未反応の−OH基をも永久的にキャップするために工程(vi)で添加される化学的化合物は、ポリメラーゼ、および1以上の異なるジデオキシヌクオレオチド、あるいはジデオキシヌクレオチドの類縁体である。さらなる実施形態では、異なるジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸、2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸、2’,3’−ジデオキシシチジン5’−三リン酸、2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸、2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸、およびそれらの類縁体からなる群から選択される。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシシチジン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシシチジン5’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸の類縁体である。
【0039】
一実施形態では、ポリメラーゼおよび1以上の4つの異なるジデオキシヌクレオチドが工程(vi)で添加され、ここで異なるジデオキシヌクレオチドはそれぞれ、2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸、または2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸の類縁体、2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸、または2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸の類縁体、2’,3’−ジデオキシシチジン5’−三リン酸、または2’,3’−ジデオキシシチジン5’−三リン酸の類縁体、および2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸、または2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸、または2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸の類縁体、あるいは2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸の類縁体からなる群から選択される。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシシチジン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシシチジンの類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸の類縁体である。
【0040】
−OH基と特異的に反応する別のタイプの化学的化合物も、核酸に結合されたプライマー上、あるいは1以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体をプライマーに付加することにより形成されるプライマー伸長鎖上の如何なる未反応の−OH基をも永久的にキャップするのに使用することができる。
【0041】
本発明は、複数の異なる核酸を同時にシーケンシングする方法であって、該複数の異なる核酸をシーケンシングするために、本明細書中に開示する方法のいずれかを同時に適用することを含む方法を提供する。異なる実施形態では、上記方法を使用して、1個から100,000個以上の異なる核酸を同時にシーケンシングすることができる。
【0042】
本発明は、一塩基多型の検出、遺伝子突然変異解析、遺伝子発現の逐次解析、遺伝子発現解析、法医学における特定、遺伝子疾患関連研究、DNAシーケンシング、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、本発明に開示する方法のいずれかの使用を提供する。
【0043】
本発明は、核酸を固体表面に結合する方法であって、以下の:
(i)上記固体表面をホスフィン部分でコーティングすることと、
(ii)上記核酸の5’末端にアジド基を結合することと、
(iii)上記固体表面上の上記ホスフィン部分と、上記核酸の上記5’末端上の上記アジド基との間の相互作用により、上記核酸の上記5’末端を上記固体表面に固定化することと
を含む方法を提供する。
【0044】
一実施形態では、固体表面をホスフィン部分でコーティングする工程は、以下の:
(i)上記固体表面を第一アミンでコーティングすることと、
(ii)トリアリールホスフィンのN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを上記第一アミンと共有結合させることと
を含む。
【0045】
異なる実施形態では、固体表面は、ガラス、シリコン、または金である。異なる実施形態では、固体表面は、磁気ビーズ、チップ、チップ内チャネル、またはチップ内多孔質チャネルである。
【0046】
異なる実施形態では、固体表面に結合される核酸は、一本鎖もしくは二本鎖DNA、またはRNAである。一実施形態では、核酸は、二本鎖DNAであり、一方の鎖のみが、上記固体表面上に直接結合される。さらなる実施形態では、固体表面上に直接結合されない二本鎖DNAの鎖は、変性させることで除去される。
【0047】
本発明は、遺伝子発現解析、マイクロアレイベースの遺伝子発現解析、突然変異検出、翻訳解析、転写解析、または他の遺伝的用途のための、本明細書中に開示する核酸を固体表面に結合する方法のいずれかの使用を提供する。
【0048】
本発明は、以下の:
(a)アデニンまたはアデニンの類縁体、シトシンまたはシトシンの類縁体、およびグアニンまたはグアニンの類縁体、チミンまたはチミンの類縁体、およびウラシルまたはウラシルの類縁体からなる群から選択される塩基と、
(b)切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識と、
(c)デオキシリボースと、
(d)該デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするための切断可能な化学基と
を含むヌクレオチド類縁体を提供する。
【0049】
ヌクレオチド類縁体の一実施形態では、デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップする切断可能な化学基は、−CH2OCH3または−CH2CH=CH2である。
【0050】
一実施形態では、特有の標識は、蛍光部分または蛍光半導体結晶である。さらなる実施形態では、蛍光部分は、5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシローダミン−6G、N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン、および6−カルボキシ−X−ローダミンからなる群から選択される。
【0051】
一実施形態では、特有の標識は、エネルギー転移供与体およびエネルギー転移受容体を含む蛍光エネルギー転移タグである。さらなる実施形態では、エネルギー転移供与体は、5−カルボキシフルオレセインまたはシアニンであり、エネルギー転移授与体は、ジクロロカルボキシフルオレセイン、ジクロロ−6−カルボキシローダミン−6G、ジクロロ−N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン、およびジクロロ−6−カルボキシ−X−ローダミンからなる群から選択される。
【0052】
一実施形態では、特有の標識は、質量分析計により検出および識別することができる質量タグである。さらなる実施形態では、質量タグは、2−ニトロ−α−メチルベンジル基、2−ニトロ−α−メチル−3−フルオロベンジル基、2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジフルオロベンジル基、および2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジメトキシベンジル基からなる群から選択される。
【0053】
一実施形態では、上記特有の標識は、切断可能なリンカーにより、シトシンまたはチミンの5’位、あるいはデアザアデニンまたはデアザグアニンの7’位に結合される。特有の標識は、標識の結合がポリメラーゼ連鎖反応中に安定であり、かつヌクレオチド類縁体がポリメラーゼにより基質として認識され得る限り、切断可能なリンカーにより、ヌクレオチド類縁体の別の位置に結合することができる。例えば、切断可能な標識は、デオキシリボースに結合することができる。
【0054】
一実施形態では、特有の標識とヌクレオチド類縁体との間の切断可能なリンカーは、1以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される。さらなる実施形態では、切断可能なリンカーは、2−ニトロベンジル部分を含む光切断可能なリンカーである。
【0055】
一実施形態では、デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするのに使用する切断可能な化学基は、1以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される。
【0056】
異なる実施形態では、ヌクレオチド類縁体は、以下の:
【0057】
【化5】
【0058】
(式中、Dye1、Dye2、Dye3、およびDye4は、4つの異なる色素標識であり、
Rは、デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするのに使用する切断可能な化学基である)
からなる群から選択される。
【0059】
異なる実施形態では、ヌクレオチド類縁体は、以下の:
【0060】
【化6】
【0061】
(式中、Rは、−CH2OCH3または−CH2CH=CH2である)
からなる群から選択される。
【0062】
異なる実施形態では、ヌクレオチド類縁体は、以下の:
【0063】
【化7】
【0064】
(式中、Tag1、Tag2、Tag3、およびTag4は、4つの異なる質量タグ標識であり、
Rは、デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするのに使用する切断可能な化学基である)
からなる群から選択される。
【0065】
異なる実施形態では、ヌクレオチド類縁体は、以下の:
【0066】
【化8】
【0067】
(式中、Rは、−CH2OCH3または−CH2CH=CH2である)
からなる群から選択される。
【0068】
本発明は、一塩基多型の検出、遺伝子突然変異解析、遺伝子発現の順次解析、遺伝子発現解析、法医学における特定、遺伝子疾患関連研究、DNAシーケンシング、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、本明細書中に開示するヌクレオチド類縁体のいずれかの使用を提供する。
【0069】
本発明は、試料タグを含む複数の試料を並行解析するための、複数の大気圧化学イオン化質量分析計を具備する並行質量分析システムを提供する。一実施形態では、質量分析計は、四重極質量分析計である。一実施形態では、質量分析計は、飛行時間型質量分析計である。一実施形態では、質量分析計は、1つの装置に含まれる。一実施形態では、上記システムは、2つのターボ式ポンプをさらに具備し、ここで一方のポンプは、真空を生成するのに使用され、第2のポンプは、望ましくない成分を除去するのに使用される。一実施形態では、上記システムは、少なくとも3つの質量分析計を具備する。一実施形態では、質量タグは、150ダルトン〜250ダルトンの分子量を有する。本発明は、DNAシーケンシング解析、一塩基多型の検出、遺伝子突然変異解析、遺伝子発現の順次解析、遺伝子発現解析、法医学における特定、遺伝子疾患関連研究、DNAシーケンシング、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、上記システムの使用を提供する。
【0070】
本発明は、以下の実験的な詳細からより理解されるであろう。しかしながら、議論する特定の方法および結果は、上述に記載した特許請求の範囲でより完全に記載されている本発明の単なる説明であることは、当業者には容易に理解されよう。
【0071】
【実験の詳細】
1.合成アプローチによるシーケンシング
合成によりDNAをシーケンシングすることは、各ヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応中の成長中のDNA鎖に組み込まれることから、各ヌクレオチドの種別を検出することを包含している。かかるシステムを作動させるための基本的な要件は、(1)それぞれが特有の標識で標識され、かつ3’−OH基をキャップしている化学部分を含有する4つのヌクレオチド類縁体(aA、aC、aG、aT)の入手可能性、(2)4つのヌクレオチド類縁体(aA、aC、aG、aT)が、ポリメラーゼ反応中に、ターミネーターとして、効率的かつ正確にDNAポリメラーゼにより組み込まれる必要があること、(3)次のヌクレオチドの組込みおよび検出を可能とするために、タグおよび3’−OHをキャップしている基が高収率で除去される必要があること、および(4)成長中のDNA鎖は、洗浄、検出および切断過程を生き残り、DNA鋳型にアニーリングされたままであるべきことである。
【0072】
本明細書中に開示する合成アプローチによるシーケンシングを図2A〜2Bに示す。図2Aには、特有の標識が蛍光色素であり、表面がチップである例を示す。図2Bでは、特有の色素が質量タグであり、表面は、チップにエッチングしたチャネルである。該合成アプローチは、ポリメラーゼ反応を開始するために自己プライミングすることが可能な固定化DNA鋳型を有するガラスチップのような固体表面、およびそれぞれが、プリンまたはピリミジン塩基上の特定位置にて特有の標識(例えば蛍光色素または質量タグ)で標識され、かつ3’−OH基をキャップするための切断可能な小さな化学基(R)を含有する4つのヌクレオチド類縁体(3’−RO−A−LABEL1、3’−RO−C−LABEL2、3’−RO−G−LABEL3、3’−RO−T−LABEL4)を使用する。4つのヌクレオチド類縁体およびDNAポリメラーゼを添加すると、鋳型上の次のヌクレオチドに相補的な唯一のヌクレオチド類縁体が、表面の各スポット上でポリメラーゼにより組み込まれる(図2Aおよび2Bの工程1)。
【0073】
特有の標識が色素である図2Aでは、過剰な試薬を除去し、チップ上の組み込まれてない全てのヌクレオチド類縁体を洗い流した後に、検出器を用いて特有の標識を検出する。例えば、4つの色彩蛍光撮像機を用いてチップの表面を画像化し、チップの各スポット上におけるヌクレオチド類縁体上の特定の色素による特有の蛍光放出により、組み込まれたヌクレオチドの種別が明らかとなるであろう(図2Aの工程2)。画像化後、自己プライミングされた鋳型部分上の少量の未反応3’−OH基を、過剰のジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)(ddATP、ddGTP、ddTTP、およびddCTP)およびDNAポリメラーゼによりキャップし、次回の合成の妨害を回避する(図2Aの工程3)。これは、自動固相DNA合成でのキャッピング工程と同様の概念である(Caruthers, 1985)。3’−水酸基を欠如しているddNTPは、色素標識ヌクレオチドと比較してその小サイズ、およびそれらがDNAポリメラーゼにより組み込まれる優れた効率に起因して、ヌクレオチドの未反応3’−OH基をキャップするのに選択される。次に、色素部分を光(およそ350nm)で切断し、3’−OHを保護するR基を化学的に除去して、高収率で遊離の3’−OH基を生成させる(図2Aの工程4)。洗浄工程を適用して、切断された色素およびR基を洗い流す。この段階にあるチップ上の自己プライミングされたDNA部分は、鋳型DNAの次のヌクレオチド配列を特定するための次の反応サイクルの準備ができている(図2Aの工程5)。
【0074】
4cm×1cmのガラスチップ上の高密度(チップ当たり10,000スポット以上)の一本鎖DNAを固定化することは、現在では日常的な手順である(Schena et al. 1995)。したがって、本明細書中に開示するDNAシーケンシングシステムでは、各サイクル後には10,000個を超える塩基を特定することができ、100サイクル後には、1つのシーケンシングチップから百万個の塩基対を生成するであろう。
【0075】
考え得るDNAポリメラーゼとしては、Thermoシーケナーゼ、Taq FS DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、およびVent(exo−)DNAポリメラーゼが挙げられる。各特定の色素からの蛍光放出は、スライドガラスからの蛍光を検出するためのアクセサリを装備した蛍光分析計を用いて検出することができる。大量スケールの評価に関しては、スライドガラス上の複数の異なる蛍光色素(500nm〜700nm)を検出することが可能な多色スキャンニングシステム(GSI Lumonics ScanArray 5000 Standard Biochip Scanning System)を使用することができる。
【0076】
質量タグを用いた合成アプローチによるシーケンシングの例を図2Bに示す。このアプローチは、ポリメラーゼ反応を開始するために自己プライミングすることが可能な固定化DNA鋳型を有するチップ内の多孔質シリカガラスチャネルのような固体表面、およびそれぞれが、塩基上の特定位置にて特有の光切断可能な質量タグで標識され、かつ3’−OH基をキャップするための切断可能な小さな化学基(R)を含有する4つのヌクレオチド類縁体(3’−RO−A−Tag1、3’−RO−C−Tag2、3’−RO−G−Tag3、3’−RO−T−Tag4)を使用する。4つのヌクレオチド類縁体およびDNAポリメラーゼを添加すると、鋳型上の次のヌクレオチドに相補的な唯一のヌクレオチド類縁体が、ガラスチップの各チャネルにおいてポリメラーゼにより組み込まれる(図2Bの工程1)。過剰な試薬を除去し、チップ上の組み込まれてない全てのヌクレオチド類縁体を洗い流した後に、自己プライミングされた鋳型部分上の少量の未反応3’−OH基を、過剰のddNTP(ddATP、ddGTP、ddTTP、およびddCTP)およびDNAポリメラーゼによりキャップし、次回の合成の妨害を回避する(図2Bの工程2)。ddNTPは、色素標識ヌクレオチドと比較してその小サイズ、およびそれらがDNAポリメラーゼにより組み込まれる優れた効率に起因して、ヌクレオチドの未反応3’−OH基をキャップするのに選択される。質量タグを光による照射(およそ350nm)で切断し(図2Bの工程3)、続いて質量分析計で検出する。各タグの特有の質量により、各チャネル中のヌクレオチドの種別が得られる(図2Bの工程4)。次に、R保護基を化学的に除去して、洗い流して、高収率で遊離3’−OH基を生成させる(図2Bの工程5)。この段階にあるチップ上の自己プライミングされたDNA部分は、鋳型DNAの次のヌクレオチド配列を特定するための次の反応サイクルの準備ができている(図2Bの工程6)。
【0077】
マトリクス支援レーザ脱離イオン化(MALDI)、およびエレクトロスプレーイオン化(ESI)のような新たなイオン化技法の開発以来、質量分析は、生物医学的研究の多くの分野で欠かせないツールとなってきた。これらのイオン化方法は、ペプチドおよびタンパク質のような生体有機分子の解析に適切であるが、DNAシーケンシング用途での質量分析の実施には、検出および試料調製の両方での改良が必要である。本明細書中に開示するアプローチは、小さくて安定な質量タグを使用するため、大きなDNAシーケンシング断片を直接検出する必要はなく、検出用にMALDIまたはESI方法を使用する必要はない。大気圧化学イオン化(APCI)は、大気圧にて気相イオン分子反応を使用するイオン化方法である(Dizidic et al. 1975)。この方法では、クロマトグラフィまたはフローインジェクションのいずれかにより、試料を空気式ネブライザーに導入し、そこで試料は、窒素ガスの高速ビームにより小滴に変換される。加熱ガスおよび溶液が反応領域に到達すると、過剰量の溶媒が、コロナ放電によりイオン化される。このイオン化された移動相は、試料に対するイオン化剤として作用し、擬似分子(M+H)+および(M−H)−イオンを生じる。コロナ放電イオン化方法により、高イオン化効率を達成することができ、小さくて安定な有機化合物に関するフェムトモル領域未満の検出感度をもつ安定なイオン化状態を維持する。しかしながら、大きな分子の検出限界により、ペプチドおよび核酸の解析に関してAPCIは、ESIおよびMALDIに置き換えられてきた。開示するアプローチでは、検出されるべき質量タグが比較的小さくて、非常に安定な有機分子であるため、ESIおよびMALDIを用いることで獲得される、大きな生物学的分子を検出する能力は必要でない。APCIは、標的プレート上の結晶を調製するために、脱塩すること、またはマトリクスと混合することといった任意の面倒な試料調製を必要としないことから、APCIは、ESIおよびMALDIを上回る利点が幾つかある。ESIでは、試料の性質および試料調製条件(すなわち、緩衝液または無機塩の存在)がイオン化効率を抑制する。MALDIは、質量分析計に試料導入する前にマトリクスを添加する必要があり、また解釈可能な質量スペクトルを得るために理想の照射スポットを探索することの必要性により、その速度が制限されることが多い。質量タグ試料が、さらなる試料精製および調製なしで、質量分析計に直接注入することができるので、これらの制限は、APCIによる克服される。質量タグ付け試料は揮発性であり、小さな質量数を有するため、これらの化合物は、高感度でAPCIイオン化により容易に検出が可能である。このシステムは、ハイスループット操作にスケールアップすることができる。
【0078】
合成システムによるシーケンシングの各構成成分について、以下に詳述する。
【0079】
2.自己プライミングされた固定化DNA部分を含有する表面の構築
表面上に固定化した一本鎖DNA鋳型を、図3に示すスキームに従って調製する。表面は、例えば4cm×1cmのガラスチップのようなガラスチップ、またはガラスチップ内チャネルであり得る。まず表面を0.5M NaOHで処理して、水で洗浄した後、高密度の3−アミノプロピルトリメトキシシランのエタノール水溶液でコーティングして(Woolley et al. 1994)、第一アミン表面を形成する。トリアリールホスフィンのN−ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)エステル(1)を、第一アミン基と共有結合させて、アミン表面を新規トリアリールホスフィン表面に変換し、その表面は、アジド基を含有するDNA(2)と特異的に反応して、固定化DNAを有するチップを形成する。アジド基は、DNAの5’末端のみに位置し、カップリング反応は、水溶液中のアジド基とトリアリールホスフィン部分との特有の反応によるものである(Saxon and Bertozzi 2000)ため、かかるDNA表面は、ハイブリダイゼーション用の最適な状態を提供するであろう。
【0080】
トリアリールホスフィンのNHSエステル(1)は、図4に示すスキームに従って調製される。3−ジフェニルホスフィノ−4−メトキシカルボニル安息香酸(3)は、Bertozzi等により記載された手順に従って調製される(Saxon and Bertozzi 2000)。N−ヒドロキシスクシンイミドでの(3)の処理により、相当するNHSエステル(4)を形成する。アミノカルボン酸部分と(4)とのカップリングにより、表面上でのDNAとの最適化されたカップリング用の長いリンカー(n=1〜10)を有する化合物(5)が生じる。N−ヒドロキシスクシンイミドでの(5)の処理により、第一アミンでコーティングした表面とのカップリングの準備が整っているNHSエステル(1)が生成する(図3)。
【0081】
アジド標識DNA(2)は、図5に示すスキームに従って合成される。アジ化ナトリウムでの5−ブロモ吉草酸のエチルエステルの処理、続く加水分解により、5−アジド吉草酸が生じ(Khoukhi et al., 1987)、これは続いて、アミノリンカー標識オリゴヌクレオチドプライマーとのカップリング用のNHSエステルに変換される。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)反応を実施するためのアジド標識プライマーを用いることで、トリアリールホスフィン修飾表面とのカップリング用のアジド標識DNA鋳型(2)が生成する(図3)。
【0082】
シーケンシングチップ上の自己プライミングされたDNA鋳型部分は、酵素連結反応を用いて、図6(AおよびB)に示すように構築される。5’−リン酸化され、3’−OHをキャップされたループオリゴヌクレオチドプライマー(B)は、固相DNA合成機により合成される。プライマー(B)は、連結反応中のプライマーの自己連結反応を防止するために、オリゴヌクレオチドの3’末端にて3’−OHがMOM(−CH2OCH3)基またはアリル(−CH2CH=CH2)基のいずれか(図6中では「R」で示す)でキャップされている修飾Cホスホルアミダイトを用いて合成される。したがって、ループを形成したプライマーは、T4 RNAリガーゼを用いて、シーケンシングチップ上に固定化されたDNA鋳型の末端のみと連結して(Zhang et al. 1996)、自己プライミングされたDNA鋳型部分を形成することができる(A)。ループを形成したプライマー(B)は、非常に安定なループ(Antao et al. 1991)、およびいったんプライマーがシーケンシングチップ上の固定化DNAに連結され、3’−OHキャップ基が化学的に切断されると、ポリメラーゼ反応中での効率的なプライミングのためのM13逆DNAシーケンシングプライマーの配列を含有する基部(Ireland et al. 1986; Kamal et al. 1999)を含有するように設計される。
【0083】
3.ヌクレオチド類縁体体3’−HO−A−Dye1、3’−HO−C−Dy e2、3’−HO−G−Dye3、3’−HO−T−Dye4を用いた合成評価によるシーケンシング
種々の色素を用いた光切断効率の評価、および合成アプローチによるシーケンシングの試験のための体系を開発した。それぞれが光切断可能なリンカーにより特有の蛍光色素で標識した4つのヌクレオチド類縁体3’−HO−A−Dye1、3’−HO−C−Dye2、3’−HO−G−Dye3、3’−HO−T−Dye4を合成し、合成アプローチによるシーケンシングで使用する。色素の例としては、Dye1=FAM、すなわち5−カルボキシフルオレセイン、Dye2=R6G、すなわち6−カルボキシローダミン−6G、Dye3=TAM、すなわちN,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン、およびDye4=ROX、すなわち6−カルボキシ−X−ローダミンが挙げられるが、これらに限定されない。4つのヌクレオチド類縁体の構造は図7に示す(R=h)。
【0084】
光切断可能な2−ニトロベンジル部分は、UV光(およそ350nm)による効率的除去のために、ビオチンをDNAおよびタンパク質に連結するのに使用されている(Olejnik et al. 1995, 1999)。本明細書中に開示するアプローチでは、2−ニトロベンジル基は、図7に示すように、蛍光色素とヌクレオチドを一緒に架橋して、色素標識ヌクレオチドを形成するのに使用される。
【0085】
代表的な例として、3’−HO−G−Dye3(Dye3=Tam)の合成を図8に示す。7−デアザ−アルキルアミノ−dGTPを、十分確立された手法(Prober et al. 1987、Lee et al. 1992、およびHobbs et al. 1991)を用いて調製する。リンカー−Tamは、光切断可能なリンカー(Rollaf 1982)をNHS−Tamとカップリングすることで合成される。次に、7−デアザ−アルキニルアミノ−dGTPをリンカー−Tamとカップリングして、3’−HO−G−Tamを製造する。遊離3’−OH(すなわち、R=H)を有するヌクレオチド類縁体は、ポリメラーゼの良好な基質である。プライミング部位後に反復配列を有さないヌクレオチド配列ACGTACGACGT(配列番号1)の一部を含有する固定化DNA鋳型を合成する(図9)。3’−HO−A−Dye1およびDNAポリメラーゼを自己プライミングされたDNA部分に添加して、それがDNAの3’部位に組み込まれる。次に、図2Aの工程を行い(3’−OHが遊離しているので、化学的切断工程は不要である)、520nmでのDye−1からの蛍光シグナルを検出する。次に、3’−HO−C−Dye2を添加して、550nmでのDye−2からの蛍光シグナルを画像化する。次に、3’−HO−G−Dye3を添加して、580nmでのDye−3からの蛍光シグナルを画像化し、最後に3’−HO−T−Dye4を添加して、610nmでのDye−4からの蛍光シグナルを画像化する。
【0086】
光化学切断効率に関する結果
DNAの3’末端にある光切断可能な蛍光色素を含有するDNAの予測光分解産物を図10に示す。2−ニトロベンジル部分は、光切断可能な保護基として広範な研究に首尾よく使用されている(Pillai 1980)。光切断工程の効率は、2−ニトロベンジル部分の光吸収効率、一次光化学工程の効率、および最終的な切断プロセスを引き起こす二次熱プロセスの効率を含む幾つかの要因に依存する(Turro 1991)。Burgess等(1997)は、ヌクレオチド部分上の2−ニトロベンジルリンカーにより結合された蛍光色素の首尾よい光切断を報告しており、蛍光色素は、光切断プロセスを抑制しないことを示している。2−ニトロベンジル発色団に基づく感光性保護基もまた、光切断を含む生物学的標識用途のために開発された(Olejnik et al. 1999)。本明細書中に開示するプロトコルを用いて、図10に示す光切断プロセスを最適化する。2−ニトロベンジル化合物の吸収スペクトルを検査して、蛍光色素の吸収スペクトルと定量的に比較する。2−ニトロベンジル部分の数と色素分子との間に1対1の関係が存在するため、これら2つの種の吸光係数の比は、特定の波長での光吸収に関する競合を反映するであろう。この情報から、2−ニトロベンジル部分が最も競合的に吸収された波長を、Olejnik等(1995)により報告されるアプローチと同様に決定することができる。
【0087】
モノクロメータ(Kratos, Schoeffel Instruments)と併合させた100W高圧キセノンランプ(LX1000UV、ILC)からの高流量の単色光を可能にする光分解設定を使用することができる。この機器により、吸収される光の強度および励起波長の関数として、モデルシステムの光切断の評価が可能である。標準的な分析的解析を用いて、光切断の度合いを決定する。この情報から、波長の関数としての光切断の効率を決定することができる。光切断が最も効率的に行われ得る波長を、シーケンシングシステムでの使用に選択することができる。
【0088】
光切断の結果は、図11に示すように、モデルシステムを用いて得られた。ジメチルスルホニルオキシド(DMSO)/NaHCO3(pH=8.2)中で室温にて一晩、PC−LC−ビオチン−NHSエステル(Pierce, Rockford IL)を5−(アミノアセトアミド)−フルオレセイン(5−アミノFAM)(Molecular Probes, Eugene OR)とカップリングさせて、一端にあるビオチン、中央にある光切断可能な2−ヒドロキシベンジル基、および他端にある色素タグ(FAM)から構成されるPL−LC−ビオチン−FAMが生産される。この光切断可能な部分は、図10に示す設計した光切断可能なヌクレオチド類縁体を綿密に模倣する。したがって、PC−LC−ビオチン−FAM部分の首尾よい光切断は、DNAシーケンシングシステムで使用される場合に、高効率の光分解の原理の証明を提供する。光分解研究に関して、PC−LC−ビオチン−FAMを、まずストレプトアビジン(XENOPORE, Hawthorne NJ)でコーティングした顕微鏡スライドガラス上に固定化する。固定化されていないPC−LC−ビオチン−FAMを洗い流した後、固定化PC−LC−ビオチン−FAMの蛍光放出スペクトルを、図12に示すようにとった(スペクトルa)。強力な蛍光放出は、PC−LC−ビオチン−FAMが、ストレプトアビジンでコーティングしたスライドガラスに首尾よく固定化されていることを示す。次に、350nmでの照射による2−ニトロベンジルリンカーの光切断性を試験した。10分の光分解(λirr=350nm、およそ0.5mW/cm2)後、かつ任意の洗浄前に、強度の減少を示さないスライド上の同じスポットの蛍光放出スペクトルが得られた(図12、スペクトルb)。これは、色素(FAM)が、350nmでの光分解プロセス中に漂白されていないことを示す。光分解後にHPLC水でのスライドガラスを洗浄した後、スライド上の同じスポットの蛍光放出スペクトルは、有意な強度減少を示した(図12、スペクトルc)。これは、蛍光色素(FAM)の大部分が、固定化ビオチン部分から切断され、洗浄手順により除去されたことを示す。この実験は、蛍光色素の高効率切断が、2−ニトロベンジル光切断可能なリンカーを用いて得ることができることを示す。
【0089】
4.ヌクレオチド類縁体3’−RO−A−Dye1、3’−RO−C−Dye2、3’−RO−G−Dye3、3’−RO−T−Dye4を用いた合成評価によるシーケンシング
セクション3の工程および条件がいったん最適化されれば、ヌクレオチド類縁体3’−RO−A−Dye1、3’−RO−C−Dye2、3’−RO−G−Dye3、3’−RO−T−Dye4の合成は、システムのさらなる研究のために実行することができる。ここで、4つ全てのヌクレオチド類縁体において3’−OHをキャップし、続いて、DNAポリメラーゼとともに混合して、図9のスキームで使用するシーケンシングシステムを評価するのに使用することができる。MOM(−CH2OCH3)またはアリル(−CH2CH=CH2)基を用いて、十分確立された合成手順を使用して3’−OH基をキャップする(図13)(Fuji et al. 19975, Metzker et al. 1994)。図14に示すように、これらの基を、高収率で化学的に切断することができる(Ireland, et al. 1986; Kamal et al. 1999)。MOMおよびアリル基の化学的切断は、かなり穏やかで特異的であり、DNA鋳型部分を減成しない。例えば、アリル基の切断は、93%を超える収率を伴って3分かかり(Kamal et al. 1999)、一方MOM基は、ほぼ100%の収率で切断されることが報告されている(Ireland, et al. 1986)。
【0090】
5.合成システムによるシーケンシングを最適化するためのエネルギー転移共役色素の使用
蛍光タグのスペクトル特性は、エネルギー転移(ET)共役色素を用いることで最適化することができる。ETプライマーおよびETジデオキシヌクレオチドは、1つのレーザの使用が蛍光タグの複数セットを励起するのを可能とする4色DNAシーケンシングの試薬の優れたセットであることがわかっている(Ju et al. 1995)。DNAポリメラーゼ(ThermoシーケナーゼおよびタグFS)は、ET色素標識ジデオキシリボヌクレオチドを効率よく組み込むことができることがわかっている(Rosenblum et al. 1997)。これらのET色素標識シーケンシング試薬は現在、ヒトゲノムプロジェクトのような大量スケールのDNAシーケンシングプロジェクトで使用されている。ET色素標識ヌクレオチド類縁体ライブラリーは、DNAシーケンシングシステムの最適化用に、図15に示すように合成することができる。供与体としてFAMを、受容体としてジクロロ(FAM、R6G、TAM、ROX)を用いたETセット(FAM−Cl2FAM、FAM−Cl2R6G、FAM−Cl2TAM、FAM−Cl2ROX)は文献に報告されており(Lee et al. 1997)、市販のDNAシーケンシング試薬セットを構成する。これらのET試薬セットは、増大した蛍光強度を生じることが証明されており、TおよびCの5位、ならびにGおよびAの7位にてこれらのET色素で標識したヌクレオチドは、DNAポリメラーゼの優れた基質である。あるいは、ET色素セットは、供与体としてシアニン(Cy2)を、エネルギー受容体としてCl2FAM、Cl2R6G、Cl2TAM、またはCl2ROXを用いて構築することができる。Cy2は、ローダミンおよびフルオレセイン誘導体と比較して、より高いモル吸光度を保有するため、供与体としてCy2を用いたET系は、供与体としてFAMを用いた系よりも相当強力な蛍光シグナルを生じる(Hung et al. 1996)。図16は、供与体としてFAMを用いたエネルギー転移系の合成に関するのと同様のカップリング化学を用いた、供与体としてCy2、および受容体としてCl2FAMを用いたET色素標識ヌクレオチド類縁体に関する合成スキームを示す(Lee et al. 1997)。スペーサ−である4−アミノメチル安息香酸(II)とCl2FAM(I)とのカップリングにより、IIIが生じ、続いてこれをNHSエステルIVに変換する。IVのアミノ−Cy2とのカップリング、続く得られた化合物のNHSエステルへの変換により、Vが得られ、続いてこれをアミノ−光リンカーヌクレオチドVIとカップリングさせて、ET色素標識ヌクレオチドVIIが得られる。
【0091】
6.ヌクレオチド類縁体3’−HO−A−Tag1、3’−HO−C−Tag2、3’−HO−G−Tag3、3’−HO−T−Tage4を用いた合成評価によるシーケンシング
質量タグの4つの例の前駆体を図17に示す。前駆体は、(a)アセトフェノン、(b)3−フルオロアセトフェノン、(c)3,4−ジフルオロアセトフェノン、および(d)3,4−ジメトキシアセトフェノンである。ニトロ化および還元すると、4つの光活性タグが4つの前駆体から生じ、これらを用いて、4つのヌクレオチド(A、C、G、T)のそれぞれの種別をコードする。明瞭なAPCI質量スペクトルが、図18に示すように、4つの質量タグ前駆体(a、b、c、d)に関して得られる。121のm/zを有するピークがa、139がb、157がc、181がdである。これの結果は、これらの4つの質量タグが極めて安定であり、質量タグ環の混信なくAPCI質量分析計において非常に高い分解能データを生成する。以下に示す例では、各質量タグからの特有のm/zそれぞれが、ヌクレオチドの種別へと変換される[Tag−1(m/z,150)=A、Tag−2(m/z,168)=C、Tag−3(m/z,186)=G、TAg−4(m/z,210)=T]。
【0092】
一般スキームに示すように、質量タグおよびヌクレオチドの種々の組合せ:体3’−HO−A−Tag1、3’−HO−C−T a g2、3’−HO−G−T a g3、3’−HO−T−Tage4(ここで、Tag1、Tag2、Tag3、およびTga4は、4つの異なる特有の質量タグである)を使用することができる。ヌクレオチド類縁体の4つの具体例を図19に示す。図19では、3’−OH基がキャップされていない場合、「R」は、Hである。上述のように、光切断可能な2−ニトロベンジル部分は、UV光(およそ350nm)照射による効率的除去のために、ビオチンをDNAおよびタンパク質に連結するのに使用されている(Olejnik et al. 1995, 1999)。質量タグとして異なる分子量を有する4つの異なる2−ニトロベンジル基を用いて、図19に示すように質量タグ標識ヌクレオチド:Aをコードする2−ニトロ−α−メチルベンジル(Tag−1)、Cをコードする2−ニトロ−α−メチル−3−フルオロベンジル(Tag−2)、Gをコードする2−ニトロ−α−メチル3,4−ジフルオロベンジル(Tag−3)、Tをコードする2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジメトキシベンジル(Tag−4)を形成する。
【0093】
代表例として、1つの質量タグ(Tag−3)のNHSエステルの合成を図20に示す。同様のスキームを用いて、他の質量タグを創出する。3’−HO−G−T a g3の合成は、十分確立された手順を用いて図21に示す(Prober et al. 1987、Lee et al. 1992、およびHobbs et al. 1991)。7−I−dGTPをN−トリフルオロアセチルプロパルギルアミンと反応させることで、まず7−プロパルギルアミノ−dGTPを調製し、次にそれをNHS−Tag−3とカップリングさせて、3’−HO−G−T a g3を生じる。遊離3’−OHを有するヌクレオチド類縁体は、ポリメラーゼの良好な基質である。
【0094】
合成アプローチによるシーケンシングを、図9の色素に関して示すスキームと同様のスキームを用いて、質量タグを使用して試験することができる。プライミング部位後に反復配列を有さないヌクレオチド配列の一部を含有するDNA鋳型を合成して、ガラスチャネルに固定化する。3’−HO−A−T a g1およびDNAポリメラーゼを、自己プライミングされたDNA部分に添加して、DNAの3’部位へのヌクレオチドの組込みを可能とする。次に、工程2Bの工程を行い(3’−OHが遊離しているので、化学的切断工程は不要である)、Tag−1(m/z=150)からの質量タグを検出する。次に、3’−HO−C−T a g2を添加して、Tag−2(m/z=186)の切断後に得られる質量スペクトルを測定する。次に、3’−HO−G−T a g3、および3’−HO−T−T a g4を順に添加して、切断産物Tag−3(m/z=186)およびTag−4(m/z=210)の質量スペクトルを測定する。予測光切断産物の例を図22に示す。光切断機構は、特有の標識が色素である場合に関して上述している。芳香族2−ニトロベンジル部分による光吸収(300〜360nm)は、2−ニトロ基をニトロソ基へと還元し、2位に位置する炭素−水素結合に酸素を挿入させ、続いて切断および脱炭酸を引き起こす(Pillai 1980)。
【0095】
ヌクレオチド類縁体3’−RO−A−Tag1、3’−RO−C−Tag2、3’−RO−G−Tag3、3’−RO−T−Tag4の合成は、特有の標識が色素である場合に関して上述しているシステムのさらなる研究のために実行することができる。ここで、4つ全てのヌクレオチド類縁体において3’−OHをキャップし、続いて、DNAポリメラーゼとともに混合して、図9のスキームで使用するシーケンシングシステムを評価するのに使用することができる。MOM(−CH2OCH3)またはアリル(−CH2CH=CH2)基を用いて、十分に確立された合成手順を使用して3’−OH基をキャップする(図13)(Fuji et al. 19975, Metzker et al. 1994)。図14に示すように、これらの基を、高収率で化学的に切断することができる(Ireland, et al. 1986; Kamal et al. 1999)。MOMおよびアリル基の化学的切断は、かなり穏やかで特異的であり、DNA鋳型部分を減成しない。
【0096】
7.合成によるシーケンシングに関する並行チャネルシステム
図23は、並行チャネルシステムの例を示す。このシステムは、図示するような質量タグ標識、また同様に色素標識を用いて使用することができる。シリカガラスチップ内の複数のチャネルは、そのチャネルの各端をウェルプレート中のウェルに接続させている。図示した例では、それ自身のウェルにそれぞれが接続された96個のチャネルが存在する。シーケンシングシステムはまた、96個以外のチャネル数を使用することも可能である。断片を分離、DNAシーケンシング、およびサイジングする96チャネルの装置が報告されている(Woolley and Mathies 1994, Woolley et al. 1997, Simpson et al. 1998)。フォトリソグラフィーマスキングおよび化学的エッチング技法により、チップが作製される。フォトリソグラフィー的に規定されるチャネルパターンをシリカガラス基板にエッチングした後、第2のシリカスライドガラスにエッチングした基板を熱的に結合させることで、キャピラリーチャネル(内径およそ100μm)が形成される。表面積を増大させるために、チャネルは多孔質である。固定化一本鎖DNA鋳型チップは、図3に示すスキームに従って調製される。各チャネルをまず0.5M NaOHで処理して、水で洗浄した後、高密度の3−アミノプロピルトリメチルシランのエタノール水溶液でコーティングして(Wooley et al. 1994)、第1アミン表面を形成する。トリアリールホスフィンのスクシンイミジル(NHS)エステル(1)を、第1アミン基と共有結合させて、アミン表面を新規トリアリールホスフィン表面に変換して、その表面は、アジド基を含有するDNA(2)と特異的に反応して、固定化DNAを有するチップを形成する。アジド基は、DNAの5’末端のみに位置し、カップリング反応は、水溶液中のアジド基とトリアリールホスフィンとの特有の反応によるものである(Saxon and Bertozzi 2000)ため、かかるDNA表面は、ハイブリダイゼーション用の最適な状態を提供するであろう。シーケンシング試薬および洗浄溶液のような液体は、ポリメラーゼ反応を実施するため、ならびに光分解した標識を収集するために、チップ内の各チャネルを洗浄して、そこに試薬を添加する目的で、2つの96ウェルプレート間を容易に圧力駆動することができる。シリカチップは、紫外光(λおよそ350nm)に対して透過性である。図では、UV光源で照射した際、光切断された質量タグを、APCI質量分析計で検出している。
【0097】
8.合成システムによる並行質量タグシーケンシング
本明細書中に開示するアプローチは、4つの特有の光放出質量タグを検出することを含み、これらのタグは、150〜250ダルトンの分子量を有することができ、DNA配列を解読することができ、それにより質量分析計を用いて大きなDNA断片を検出する問題、ならびに長いDNA断片を直接検出するための質量分析計を用いた場合の厳しい試料要件を回避する。APCI質量分析計を用いて各質量タグを解析するのに、10秒以下を要する。システムにおいて8個の小型APCI質量分析計を用いた場合、このアプローチを用いて各装置につき毎日、およそ100,000bpの質の高いディジタルDNAシーケンシングデータを生成することができる。このアプローチを用いる場合、分離および精製要件が存在しないため、かかるシステムは、費用効率が良い。
【0098】
DNAを解析する96ウェルキャピラリーアレイ方法に対抗する質量分析を作製するために、並行質量分析計アプローチが必要である。かかる完全システムは、質量分析計のほとんどが大きな生体分子に適した分解能を達成するように設計されているという事実に主に起因して報告されていない。本明細書中に開示するシステムは、4つのヌクレオチド(A、C、G、T)の種別をコードする、150〜250ダルトンの範囲の分子量を有する4つの質量タグの検出を要する。これらの質量タグの検出専用の質量分析計は、広い質量範囲を網羅するのではなく、150〜250ダルトンの質量範囲に関する高分解能が必要とされるだけであるため、質量分析計を小型化することができ、単純な設計を有する。四重極(イオントラップ検出器を含む)または飛行時間型のいずれかの質量分析計は、イオン光学に関して選択することができる。近代的な質量分析技術は、小型化質量分析計を製造することを可能としてきた一方で、最新の研究は、独立型小型化質量分析計の設計に焦点を当てている。質量分析計の個々の構成成分は、質量分析計の解析容量を増大するために小型化されている(Liu et al. 2000, Zhang et al. 1999)。並行して複数の分析器(最大10個)を用いた小型化質量分析システムが報告されている(Badman and Cooks 2000)。しかしながら、Badman and Cookの質量分析計は、並行した複数の試料ではなく単一試料のみを測定するように設計されていた。彼等はまた、イオントラップの小型化は、質量分析計の広い質量範囲をスキャンする容量を制限すると特筆した。本明細書中に開示するアプローチは、4つの小さな質量タグ(質量範囲は、300ダルトン未満である)を検出することに焦点を当てているため、複数の小型化APCI質量分析計を、DNAシーケンシング解析用の質量タグの並行解析用の単一ユニットに、容易に構築および組み立てられる。
【0099】
完全並行質量分析システムは、適切なエレクトロニクスおよび電源配置と一体となって、複数の分析器とインターフェースで連結された複数のAPCI源を包含する。並行検出容量を有する質量分析システムは、DAN解析での適用に関する処理量障害問題を克服するであろう。単一装置中に複数の質量分析計を含有する並行システムを図23および24に示す。図中の例は、並行して3つの質量分析計を有するシステムを示す。より多数の並行質量分析計を用いれば、より高い処理量が得られる。
【0100】
図24では、3つの小型質量分析計が、2つのターボ式ポンプととともに1つの装置に含まれている。試料をイオン源に注入し、そこで試料は、ネブライザーガスと混合されて、イオン化される。イオン源と分析器との間の開口部にある一方のターボ式ポンプを差動排気システムとして用いて、イオン源から生じるフリーラジカル、中性化合物および他の望ましくない要素を連続して一掃する。第2のターボ式ポンプを用いて、3つ全ての分析器および検出器に同時に連続真空を発生させる。質量分析計のコロナ放電モードおよびスキャンニングモードは、各小型化質量分析計に関して同じであるため、各分析器およびイオン化源用の1つ電源が、3つ全ての装置に必要な電力を供給することができる。3つの別個の検出器それぞれ用の1つの電源が、スペクトル収集に使用される。得られたデータは、3つの別個のA/D変換器に移送され、同時にデータシステムにより処理されて、注入された試料中の質量タグを特定し、したがってヌクレオチドを特定する。3つ質量分析計を含有するにもかかわらず、装置全体は、研究室ベンチトップ上に適合可能である。
【0101】
9.p53遺伝子をシーケンシングすることによる、合成システムによる完全シーケンシングの確証
腫瘍抑制遺伝子p53を、DNAシーケンシングシステムを確証するためのモデル系として使用することができる。p53遺伝子は、ヒト癌において最も頻繁に突然変異される遺伝子の1つである(O’Connor et al. 1997)。まず、5’末端におけるアジド基およびp53遺伝子のエキソン7およびエキソン8由来の配列の一部を含有する塩基対DNA鋳型(以下に示す):
5’−N3−TTCCTGCATGGGCGGCATGAACCCGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCATT−3’(配列番号2)
を合成する。
【0102】
この鋳型は、群を成すホットスポット単一塩基突然変異の検出用シーケンシングシステムの使用を探究するのに選択される。合成鋳型中で突然変異の可能性がある塩基に下線を付した(A、G、C、およびT)。合成鋳型を、シーケンシングチップまたはガラスチャネル上に固定化し、続いて図6に記載するように、ループプライマーを固定化鋳型に連結させ、次にシーケンシング評価のために図2の工程を行う。PCRにより生成するDNA鋳型を用いて、DNAシーケンシングシステムをさらに確証することができる。シーケンシング鋳型は、Fu等(1998)に記載するように、ゲノムDNAプール(Behringer, Indianapolis, IN)からの各p53エキソン境界に位置するイントロン領域中の隣接プライマー(対の一方は、5’末端にてアジド基で標識される)を用いてPCRにより生成することができ、続いてシーケンシング評価のためにDNAチップ上に固定化することができる。
[参照文献]
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】
ラットDNAポリメラーゼ、DNA鋳型−プライマー、およびジデオキシシリジン三リン酸(ddCTP)の三元複合体の三次元構造。図の左側は、ddCTPの付加に関する機構を示し、図の右側は、ポリメラーゼの活性部位を示す。ジデオキシリボース環の3’位が非常に混雑している一方で、シチジン塩基の5位では十分なスペースが利用可能であることに留意されたい。
【図2A】
合成アプローチによるシーケンシングのスキーム。A:特有の標識が色素であり、固体表面がチップである例。A、C、G、T,塩基アデニン、シトシン、グアニン、およびチミンを含むヌクレオチド三リン酸;d,デオキシ;dd,ジデオキシ;R,−OH基をキャップするのに使用される切断可能な化学基;Y,切断可能なリンカー。
【図2B】
合成アプローチによるシーケンシングのスキーム。B:特有の標識が質量タグであり、固体表面がガラスチップにエッチングされたチャネルである例。A、C、G、T,塩基アデニン、シトシン、グアニン、およびチミンを含むヌクレオチド三リン酸;d,デオキシ;dd,ジデオキシ;R,−OH基をキャップするのに使用される切断可能な化学基;Y,切断可能なリンカー。
【図3】
トリアリールホスフィン部分でコーティングした固体表面へ、アジド(N3)標識DNA断片を固体化するための合成スキーム。Me,メチル基;P,リン;Ph,フェニル。
【図4】
トリアリールホスフィンN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルの合成。
【図5】
リンカーによりアジド(N3)基をDNA断片の5’末端に結合するための合成スキームであり、アジド基は続いて、固体表面上のトリアリールホスフィン部分とカップリングするのに使用される。DMSO,ジメチルスルホニルオキシド。
【図6】
ループを形成したプライマー(B)を、固体表面上の自己プライミングされたDNA鋳型部分を形成する固定化一本鎖DNA鋳型へ連結する図。P(円中),リン酸)。
【図7】
合成アプローチによるシーケンシングで使用する4つのヌクレオチド類縁体の構造例。ヌクレオチド類縁体はそれぞれ、光切断可能なリンカーにより塩基に結合された特有の蛍光色素を有しており、3’−OHは、露出しているか、またはMOM基もしくはアリル基でキャップされている。FAM,5−カルボキシフルオレセイン;R6G、6−カルボキシローダミン−6G;TAM,N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン;ROX,6−カルボキシ−X−ローダミン。R=H、CH2OCH3(MOM)またはCH2CH=CH2(アリル)。
【図8】
ヌクレオチド類縁体3’−RO−G−Tamの合成に関する代表的スキーム。同様のスキームを用いて、他の3つの修飾ヌクレオチド:3’−RO−A−Dye1、3’−RO−C−Dye2、3’−RO−T−Dye4を創出することができる。(i)テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0);(ii)POCl3、Bn4N+ピロリン酸塩;(iii)NH4OH;(iv)Na2CO3/NaHCO3(pH=9.0)/DMSO)。
【図9】
合成アプローチによるシーケンシングの試験に関するスキーム。特有の蛍光色素の結合で修飾した各ヌクレオチドを、相補鋳型に基づいて、順に添加する。色素を検出および切断して、アプローチを試験する。Dye1=Fam;Dye2=R6G;Dye3=Tam;Dye=Rox。
【図10】
光切断可能な色素(Tam)を含有するDNAの予測光切断産物。芳香族2−ニトロベンジル部分による光吸収(300〜360nm)は、2−ニトロ基をニトロソ基へと還元し、2位に位置する炭素−水素結合に酸素を挿入させ、続いて切断および脱炭酸を引き起こす(Pillai 1980)。
【図11】
光切断可能なリンカー2−ニトロベンジル基とカップリングさせたフルオロフォアの光分解効率を評価するための、PC−LC−ビオチン−FAMの合成。
【図12】
ストレプトアビジンでコーティングした顕微鏡スライドガラス上に固定化したPC−LC−ビオチン−FAMの蛍光スペクトル(λex=480nm)(a)、10分の光分解(λirr=350nm、およそ0.5mW/cm2)後の蛍光スペクトル(b)、および光切断された色素を除去するために水で洗浄した後の蛍光スペクトル(c)。
【図13】
ヌクレオチドの3’−OHをキャップするための合成スキーム。
【図14】
ヌクレオチド中の3’−OHを遊離させるための、MOM基(上列)およびアリル基(下列)の化学的切断。CITMS=クロロトリメチルシラン。
【図15A】
エネルギー転移共役系の例。ここで、FamまたはCy2は、光吸収体(エネルギー転移供与体)として用いられ、Cl2Fam、Cl2R6G、Cl2Tam、またはCl2Roxは、エネルギー転移受容体として用いられる。Cy2,シアニン;FAM,5−カルボキシフルオレセイン;R6G,6−カルボキシローダミン−6G;TAM,N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン;ROX,6−カルボキシ−X−ローダミン。
【図15B】
エネルギー転移共役系の例。ここで、FamまたはCy2は、光吸収体(エネルギー転移供与体)として用いられ、Cl2Fam、Cl2R6G、Cl2Tam、またはCl2Roxは、エネルギー転移受容体として用いられる。Cy2,シアニン;FAM,5−カルボキシフルオレセイン;R6G,6−カルボキシローダミン−6G;TAM,N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン;ROX,6−カルボキシ−X−ローダミン。
【図16】
光切断可能なエネルギー転移色素標識ヌクレオチドの合成。DMF,ジメチルホルムアミド。DEC=1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩。R=H、CH2OCH3(MOM)またはCH2CH=CH2(アリル)。
【図17】
4つの質量タグ前駆体、および4つの光活性質量タグの構造。前駆体:a)アセトフェノン、b)3−フルオロアセトフェノン、c)3,4−ジフルオロアセトフェノン、およびd)3,4−ジメトキシアセトフェノン。4つの光活性質量タグを用いて、4つのヌクレオチド(A、C、G、T)のそれぞれの種別をコードする。
【図18】
図17に示す質量タグ前駆体の大気圧化学イオン化(APCI)質量スペクトル。
【図19】
合成アプローチによるシーケンシングで使用するための4つのヌクレオチド類縁体の構造例。ヌクレオチド類縁体はそれぞれ、光切断可能なリンカーにより塩基に結合された特有の質量タグを有しており、3’−OHは、露出しているか、またはMOM基もしくはアリル基でキャップされている。角括弧は、質量タグが切断可能であることを示している。R=H、CH2OCH3(MOM)またはCH2CH=CH2(アリル)。
【図20】
質量タグの1つ(Tag−3)のNHSエステルの合成例。同様のスキームを用いて、他の質量タグを創出する。
【図21】
ヌクレオチド類縁体体3’−RO−G−Tag3の合成に関する代表的スキーム。同様のスキームを用いて、他の3つの修飾塩基:3’−RO−A−T a g1、3’−RO−C−Tag2、3’−RO−T−T a g4を創出することができる。(i)テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0);(ii)POCl3、Bn4N+ピロリン酸塩;(iii)NH4OH;(iv)Na2CO3/NaHCO3(pH=9.0)/DMSO)。
【図22】
光切断可能な質量タグを含有するDNAの予測光切断産物の例。
【図23】
並行した複数チャネルおよび並行した複数質量分析計を含むDNAシーケンシング用システム。例は、シリカガラスチップ内の96チャネルを示す。
【図24】
DNAシーケンシング用の並行質量分析システム。例は、並行した3つの質量分析計を示す。試料をイオン源に注入し、そこで試料は、ネブライザーガスと混合されて、イオン化される。ターボ式ポンプを用いて、イオン源から生じるラジカル、中性化合物および他の望ましくない要素を連続して一掃する。第2のターボ式ポンプを用いて、3つ全ての分析器および検出器に同時に連続真空を発生させる。次に、取得したシグナルを、A/D変換器でデジタル信号に変換する。続いて、3つ全ての信号をデータ取得プロセッサに送り、信号を変換して、注入試料中の質量タグを特定し、したがってヌクレオチド配列を特定する。
Claims (60)
- ヌクレオチド類縁体がポリメラーゼ反応において成長中のDNA鎖に組み込まれた後に、該ヌクレオチド類縁体の種別を検出することで核酸をシーケンシングする方法において:
(i)上記核酸の5’末端を固体表面に結合する工程と、
(ii)上記固体表面に結合された上記核酸に、プライマーを結合する工程と、
(iii)ポリメラーゼおよび1以上の異なるヌクレオチド類縁体を上記核酸に添加し、それにより上記成長中のDNA鎖にヌクレオチド類縁体を組み込む工程であって、ここで組み込まれたヌクレオチド類縁体は上記ポリメラーゼ反応を終結させ、また異なるヌクレオチド類縁体はそれぞれ、(a)アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシル、ならびにそれらの類縁体からなる群から選択される塩基、(b)切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識、(c)デオキシリボース、および(d)該デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするための切断可能な化学基を含む工程と、
(iv)上記固体表面を洗浄して、組み込まれていないヌクレオチド類縁体を除去する工程と、
(v)上記成長中のDNA鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体に結合された上記特有の標識を検出して、それにより組み込まれたヌクレオチド類縁体を同定する工程と、
(vi)1以上の化学的化合物を添加して、上記核酸に結合された上記プライマー上の全ての未反応−OH基、または1以上のヌクレオチド類縁体を上記プライマーに添加することにより形成されたプライマー伸長鎖上の全ての未反応−OH基を永久的にキャップする工程と、
(vii)上記成長中のDNA鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体と上記特有の標識との間の上記切断可能なリンカーを切断する工程と、
(viii)上記デオキシリボースの上記3’位にある上記−OH基をキャップしている上記切断可能な化学基を切断して、上記−OH基からキャップを外し、上記固体表面を洗浄して、切断された化合物を除去する工程と、
(ix)工程(iii)〜(viii)を繰り返して、上記成長中のDNA鎖に新たに組み込まれたヌクレオチド類縁体の上記種別を検出する工程と
を含み、
上記特有の標識が色素である場合には、工程(v)〜(vii)の順序は、(v)、(vi)、および(vii)であり、
上記特有の標識が質量タグである場合には、工程(v)〜(vii)の順序は、(vi)、(vii)、および(v)である方法。 - 前記固体表面は、ガラス、シリコン、または金である、請求項1に記載の方法。
- 前記固体表面は、磁気ビーズ、チップ、チップ内チャネル、またはチップ内多孔質チャネルである、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸を前記固体表面に結合する前記工程は、以下の:
(i)前記固体表面をホスフィン部分でコーティングすることと、
(ii)前記核酸の前記5’末端にアジド基を結合することと、
(iii)前記固体表面上の前記ホスフィン部分と、前記核酸の前記5’末端上の前記アジド基との間の相互作用により、前記核酸の前記5’末端を前記固体表面に固定化することと
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記固体表面を前記ホスフィン部分でコーティングする前記工程は、以下の:
(i)前記表面を第一アミンでコーティングすることと、
(ii)トリアリールホスフィンのN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを前記第一アミンと共有結合させることと
を含む、請求項4に記載の方法。 - 前記固体表面に結合される前記核酸は、一本鎖DNAである、請求項1に記載の方法。
- 工程(i)で前記固体表面に結合される前記核酸は、二本鎖DNAであり、一方の鎖のみが、前記固体表面上に直接結合され、前記固体表面上に直接結合されない鎖は、工程(ii)に進む前に変性させることで除去される、請求項1に記載の方法。
- 前記固体表面上に結合される前記核酸は、RNAであり、工程(iii)における前記ポリメラーゼは、逆転写酵素である、請求項1に記載の方法。
- 前記プライマーは、工程(ii)において前記核酸の3’末端に結合され、結合されたプライマーは、前記ポリメラーゼ反応中に自己プライミングすることが可能である安定なループおよびデオキシリボースの3’位にある−OH基を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸に前記プライマーを結合する前記工程は、前記核酸に前記プライマーをハイブリダイズすること、または前記核酸に前記プライマーを連結することを含む、請求項1に記載の方法。
- 1以上の4つの異なるヌクレオチド類縁体が工程(iii)において添加され、異なるヌクレオチド類縁体それぞれは、チミンもしくはウラシル、またはチミンもしくはウラシルの類縁体、アデニンまたはアデニンの類縁体、シトシンまたはシトシンの類縁体、およびグアニンまたはグアニンの類縁体からなる群から選択される異なる塩基を含み、該4つの異なるヌクレオチド類縁体はそれぞれ、特有の標識を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド類縁体中の前記デオキシリボースの前記3’位にある前記−OH基をキャップする前記切断可能な化学基は、−CH2OCH3または−CH2CH=CH2である、請求項1に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド類縁体に結合される前記特有の標識は、蛍光部分または蛍光半導体結晶である、請求項1に記載の方法。
- 前記蛍光部分は、5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシローダミン−6G、N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン、および6−カルボキシ−X−ローダミンからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド類縁体に結合される前記特有の標識は、エネルギー転移供与体およびエネルギー転移受容体を含む蛍光エネルギー転移タグである、請求項1に記載の方法。
- 前記エネルギー転移供与体は、5−カルボキシフルオレセインまたはシアニンであり、前記エネルギー転移授与体は、ジクロロカルボキシフルオレセイン、ジクロロ−6−カルボキシローダミン−6G、ジクロロ−N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン、およびジクロロ−6−カルボキシ−X−ローダミンからなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド類縁体に結合される前記特有の標識は、質量分析計により検出および識別することができる質量タグである、請求項1に記載の方法。
- 前記質量タグは、2−ニトロ−α−メチルベンジル基、2−ニトロ−α−メチル−3−フルオロベンジル基、2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジフルオロベンジル基、および2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジメトキシベンジル基からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記特有の標識は、切断可能なリンカーにより、シトシンまたはチミンの5’位、あるいはデアザアデニンまたはデアザグアニンの7’位に結合される、請求項1に記載の方法。
- 前記特有の標識と前記ヌクレオチド類縁体との間の前記切断可能なリンカーは、1以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される、請求項1に記載の方法。
- 前記切断可能なリンカーは、2−ニトロベンジル部分を含む光切断可能なリンカーである、請求項20に記載の方法。
- 前記デオキシリボースの前記3’位にある前記−OH基をキャップするのに使用する前記切断可能な化学基は、1以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される、請求項1に記載に方法。
- 前記核酸に結合された前記プライマー、または前記プライマー伸長鎖上にある如何なる未反応の−OH基をも永久的にキャップするために工程(vi)で添加される前記化学的化合物は、ポリメラーゼ、および1以上の異なるジデオキシヌクオレオチド、あるいはジデオキシヌクレオチドの類縁体である、請求項1に記載の方法。
- 前記異なるジデオキシヌクレオチドは、2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸、2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸、2’,3’−ジデオキシシチジン5’−三リン酸、2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸、2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸、およびそれらの類縁体からなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
- ポリメラーゼおよび1以上の4つの異なるジデオキシヌクレオチドが工程(vi)で添加され、異なるジデオキシヌクレオチドはそれぞれ、2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸、または2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸の類縁体、2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸、または2’,3’−ジデオキシグアノシン5’−三リン酸の類縁体、2’,3’−ジデオキシシチジン5’−三リン酸、または2’,3’−ジデオキシシチジン5’−三リン酸の類縁体、および2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸、または2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸、または2’,3’−ジデオキシチミジン5’−三リン酸の類縁体、あるいは2’,3’−ジデオキシウリジン5’−三リン酸の類縁体からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記質量タグは、試料タグを含む複数の試料の並行解析用の、複数の大気圧化学イオン化質量分析計を具備する並行質量分析システムを用いて検出される、請求項17に記載の方法。
- 複数の異なる核酸を同時にシーケンシングする方法であって、請求項1に記載の方法を、該複数の異なる核酸に適用する方法。
- 一塩基多型の検出、遺伝子突然変異解析、遺伝子発現の順次解析、遺伝子発現解析、法医学における特定、遺伝子疾患関連研究、DNAシーケンシング、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、請求項1または27に記載の方法の使用。
- 核酸を固体表面に結合する方法であって、以下の:
(i)前記固体表面をホスフィン部分でコーティングすることと、
(ii)前記核酸の5’末端にアジド基を結合することと、
(iii)前記固体表面上の前記ホスフィン部分と、前記核酸の前記5’末端上の前記アジド基との間の相互作用により、前記核酸の前記5’末端を前記固体表面に固定化することと
を含む方法。 - 前記固体表面を前記ホスフィン部分でコーティングする前記工程は、以下の:
(i)前記表面を第一アミンでコーティングすることと、
(ii)トリアリールホスフィンのN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを前記第一アミンと共有結合させることと
を含む、請求項29に記載の方法。 - 前記固体表面は、ガラス、シリコン、または金である、請求項29に記載の方法。
- 前記固体表面は、磁気ビーズ、チップ、チップ内チャネル、またはチップ内多孔質チャネルである、請求項29に記載の方法。
- 前記固体表面に結合される前記核酸は、一本鎖DNA、二本鎖DNA、またはRNAである、請求項29に記載の方法。
- 前記核酸は、二本鎖DNAであり、一方の鎖のみが、前記固体表面上に直接結合される、請求項33に記載の方法。
- 前記固体表面上に直接結合されない前記二本鎖DNAの鎖は、変性させることで除去される、請求項34に記載の方法。
- 遺伝子発現解析、マイクロアレイベースの遺伝子発現解析、突然変異検出、翻訳解析、または転写解析のための、請求項29に記載の方法の使用。
- ヌクレオチド類縁体であって、以下の:
(a)アデニンまたはアデニンの類縁体、シトシンまたはシトシンの類縁体、およびグアニンまたはグアニンの類縁体、チミンまたはチミンの類縁体、およびウラシルまたはウラシルの類縁体からなる群から選択される塩基と、
(b)切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識と、
(c)デオキシリボースと、
(d)該デオキシリボースの3’位にある−OH基をキャップするための切断可能な化学基と
を含む。 - 前記デオキシリボースの前記3’位にある前記−OH基をキャップする前記切断可能な化学基は、−CH2OCH3または−CH2CH=CH2である、請求項37に記載のヌクレオチド類縁体。
- 前記特有の標識は、蛍光部分または蛍光半導体結晶である、請求項37に記載のヌクレオチド類縁体。
- 前記蛍光部分は、5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシローダミン−6G、N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン、および6−カルボキシ−X−ローダミンからなる群から選択される、請求項39に記載のヌクレオチド類縁体。
- 前記特有の標識は、エネルギー転移供与体およびエネルギー転移受容体を含む蛍光エネルギー転移タグである、請求項37に記載のヌクレオチド類縁体。
- 前記エネルギー転移供与体は、5−カルボキシフルオレセインまたはシアニンであり、前記エネルギー転移授与体は、ジクロロカルボキシフルオレセイン、ジクロロ−6−カルボキシローダミン−6G、ジクロロ−N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン、およびジクロロ−6−カルボキシ−X−ローダミンからなる群から選択される、請求項41に記載のヌクレオチド類縁体。
- 前記特有の標識は、質量分析計により検出および識別することができる質量タグである、請求項37に記載の方法。
- 前記質量タグは、2−ニトロ−α−メチルベンジル基、2−ニトロ−α−メチル−3−フルオロベンジル基、2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジフルオロベンジル基、および2−ニトロ−α−メチル−3,4−ジメトキシベンジル基からなる群から選択される、請求項43に記載のヌクレオチド類縁体。
- 前記特有の標識は、切断可能なリンカーにより、シトシンまたはチミンの5’位、あるいはデアザアデニンまたはデアザグアニンの7’位に結合される、請求項37に記載のヌクレオチド類縁体。
- 前記特有の標識と前記ヌクレオチド類縁体との間の前記リンカーは、1以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される、請求項37に記載のヌクレオチド類縁体。
- 前記切断可能なリンカーは、2−ニトロベンジル部分を含む光切断可能なリンカーである、請求項46に記載のヌクレオチド類縁体。
- 前記デオキシリボースの前記3’位にある前記−OH基をキャップするのに使用する前記切断可能な化学基は、1以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される、請求項37に記載のヌクレオチド類縁体。
- 一塩基多型の検出、遺伝子突然変異解析、遺伝子発現の順次解析、遺伝子発現解析、法医学における特定、遺伝子疾患関連研究、DNAシーケンシング、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、請求項37に記載のヌクレオチド類縁体の使用。
- 試料タグを含む複数の試料の並行解析用の、複数の大気圧化学イオン化質量分析計を具備する並行質量分析システム。
- 前記質量分析計は、四重極質量分析計、または飛行時間型質量分析計である、請求項54に記載のシステム。
- 前記質量分析計は、1つの装置に含まれる、請求項54に記載のシステム。
- 2つのターボ式ポンプをさらに具備するシステムであって、一方のポンプは、真空を生成するのに使用され、第2のポンプは、望ましくない成分を除去するのに使用される、請求項54に記載のシステム。
- 少なくとも3つの質量分析計を具備する、請求項54に記載のシステム。
- 前記質量タグは、150ダルトン〜250ダルトンの分子量を有する、請求項54に記載のシステム。
- DNAシーケンシング解析、一塩基多型の検出、遺伝子突然変異解析、遺伝子発現の順次解析、遺伝子発現解析、法医学における特定、遺伝子疾患関連研究、DNAシーケンシング、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、請求項54に記載のシステムの使用。
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