JP2008501679A - ２’−ニトロベンジル改変型リボヌクレオチド - Google Patents

Abstract

本開示は、ＤＮＡ配列決定反応用の試薬として使用され得る、新規な可逆的に終止されるリボヌクレオチドを提供する。本開示のヌクレオチドを用いて核酸を配列決定する方法もまた、提供される。本発明の一局面は、式ＳＭ−ＢＡＳＥを有するリボヌクレオシドに関し、ここで、ＳＭはリボースであり、ＢＡＳＥはピリミジンまたはプリンであり、そしてこのリボースは、そのリボースの２’位に可逆的な鎖終止部分を含む。ＢＡＳＥは、例えば、アデニン、グアニン、シトシンまたはウラシルであり得る。

Description

（背景）
インビボで、ＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼは、核酸の重合のために、それぞれ、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを利用し、これらのヌクレオチドを高い忠実度で区別する。ポリメラーゼによる改変型ヌクレオチドの取り込みを可能にするために、広範な努力がなされており、その努力としては、塩基の改変、糖の改変、および骨格の改変が挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼの両方の基質としてこのような改変型ヌクレオチドを使用することは、種々の理由で望ましい。とりわけ、その理由としては、生成物の検出のための蛍光標識の取り込み（非特許文献１）、ヌクレアーゼ作用に対して感受性の低いポリヌクレオチドを生成するためのリボース改変型ヌクレオチド（非特許文献２）、またはＤＮＡ配列決定のための終止ジデオキシヌクレオチドの使用（非特許文献３）が挙げられる。

改変型ヌクレオチドを使用するための試みは、多くの場合、問題のポリメラーゼの基質特異性によって妨げられる。塩基にさらなる化学部分で改変することは、全体として、良好な成功が得られ、さらなる基が非ワトソン−クリック対残基に結合され、メジャーグルーブに突き出る。他方で、糖の環の改変は、それほど十分に許容的でないと証明されており、おそらくヌクレオチド結合の間の糖と酵素との間の極めて正確な相互作用、および触媒の存在を反映している。それにもかかわらず、糖改変型ヌクレオチドを使用するために改良された能力を有するポリメラーゼを設計するための変異誘発の利用に関する数例の注目すべき成功が存在する。ＤＮＡ配列決定の場合、ポリメラーゼは、その活性部位におけるアミノ酸置換を操作してそのポリメラーゼをＴ７ ＤＮＡポリメラーゼにより類似させることによって、２’３’−ジデオキシヌクレオチドターミネーターの利用が改善されており、このようなヌクレオチドが十分に許容的であることが実証されている（非特許文献４）。

バクテリアＤＮＡポリメラーゼとバクテリアＲＮＡポリメラーゼとの間、およびファージＤＮＡポリメラーゼとファージＲＮＡポリメラーゼとの間の異なる基質特異性に関する生化学的な原因および構造的な原因に対するさらなる研究が、置換された場合にＲＮＡポリメラーゼがデオキシリボヌクレオチドを利用することを可能にする残基、およびＤＮＡポリメラーゼがリボヌクレオチドを利用することを可能にする他のものの同定をもたらした。特に、「立体的なゲート（ｓｔｅｒｉｃ ｇａｔｅ）」と称されるペプチドループは、ＤＮＡポリメラーゼがデオキシリボヌクレオチドの２’位に存在する孤立した水素原子よりも嵩高い基を受け入れることを妨げるようである。このループは、ファージがコードするＲＮＡポリメラーゼでは本質的に欠けている。これに基づいて、糖の環の２’位に結合した他の基（その基が比較的小さいという条件で）の存在に対して、ＲＮＡポリメラーゼがいくらか寛容性であり得るという根拠が存在する。このことと一致して、ＰａｄｉｌｌａおよびＳｏｕｓａは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが、１もしくは２つのさらなる可能なアミノ酸置換もまた導入されるという条件で、その２’位がＯ−メチル基またはアジド（Ｎ３）基で改変されたヌクレオチドを利用し得ることを示している（非特許文献５）。
Ｒａａｐ ＡＫ、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．、１９９８年、４００、ｐ．２８７−２９８ Ｓｉｏｕｏｄ Ｍ，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ＤＲ、Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９８年、１６、ｐ．５５６−６１ Ｓａｎｇｅｒ Ｆ，Ｎｉｃｋｌｅｎ Ｓ，Ｃｏｕｌｓｏｎ ＡＲ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９７７年、７４、５４６３−７ Ｔａｂｏｒ Ｓ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＣＣ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９５年、９２、６３３９−４３ Ｐａｄｉｌｌａ Ｒ，Ｓｏｕｓａ Ｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００２）、３０、ｐ．ｅ１３８

（発明の要旨）
本発明は、新規な可逆的に終止されるリボヌクレオチド、および核酸を配列決定するためにこれらの新規なヌクレオチドを使用するための方法の発見に基づく。

本発明の一局面は、式ＳＭ−ＢＡＳＥを有するリボヌクレオシドに関し、ここで、ＳＭはリボースであり、ＢＡＳＥはピリミジンまたはプリンであり、そしてこのリボースは、そのリボースの２’位に可逆的な鎖終止部分を含む。このようなリボヌクレオシドの例（リボヌクレオチドまたはリボヌクレオシド５’三リン酸）について、図１を参照のこと。ＢＡＳＥは、例えば、アデニン、グアニン、シトシンまたはウラシルであり得る。上記リボヌクレオシドは、ＰＭ−ＳＭ−ＢＡＳＥの構造を有するリボヌクレオシド５’リン酸、リボヌクレオシド５’二リン酸またはリボヌクレオシド５’三リン酸であり得、ここで、ＰＭはリン酸部分（例えば、一リン酸、二リン酸、または三リン酸）である。

本発明のヌクレオチドの１つの利点は、このヌクレオチドが鎖終止ヌクレオチドとしての役割を果たし得ることである。すなわち、伸長する核酸鎖へのこのヌクレオチドの取り込みは、ポリメラーゼによる同じ鎖への任意のさらなるヌクレオチドのその後の取り込みを妨げる。

本発明のリボヌクレオシドはまた、リボヌクレオチド（リボヌクレオシドのリン酸エステル）を包含することが理解される。したがって、本発明のリボヌクレオシドは、リボヌクレオチドであり得る。このようなリボヌクレオチドの例としては、アデノシン５’一リン酸（アデニレートもしくはＡＭＰ）、アデノシン５’二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン５’一リン酸（グアニレートもしくはＧＭＰ）、グアノシン５’二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン５’三リン酸（ＧＴＰ）、ウリジン５’一リン酸（ウリジレートもしくはＵＭＰ）、ウリジン５’二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン５’三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン５’一リン酸（シチジレートもしくはＣＭＰ）、シチジン５’二リン酸（ＣＤＰ）、およびシチジン５’三リン酸（ＣＴＰ）が挙げられる。

上記可逆的な鎖終止部分は、可逆的結合によって本発明のリボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドに結合され得る。この可逆的結合は、電磁放射、化学的処理、またはそれらのくみあわせによって切断可能な結合であり得る。例えば、上記処理は、電磁放射（例えば、光（ＵＶ光））への曝露であり得る。

適切な可逆的な鎖終止部分の例としては、２−ニトロベンジル基、デシル基またはｐ−ヒドロキシフェナシルケージング基（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎａｃｙｌ ｃａｇｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）が挙げられる（図１を参照のこと）。

さらに、本発明のリボヌクレオシドおよびリボヌクレオチドは、検出可能な標識を含み得る。この検出可能な標識は、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−グルコロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ｂ−ラクタマーゼ、ジゴキシゲニン、蛍光色素分子、フルオレセイン、ｃｙ３、ｃｙ５、アルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼのような検出可能な部分またはこれらの部分の組み合わせであり得る。

好ましい実施形態において、上記検出可能な部分は、除去可能である。この検出可能な標識は、光退色によって除去され得る。あるいは、この検出可能な標識は、可逆的結合によってリボヌクレオチドに結合され得る。この可逆的結合は、電磁放射、化学的処理、またはこれらの処理の組み合わせによって切断可能な結合であり得る。

本発明の別の実施形態は、可逆的に終止するリボヌクレオシドを生成する方法に関する。このリボヌクレオシドは、リボヌクレオシド５’一リン酸、リボヌクレオシド５’二リン酸、またはリボヌクレオシド５’三リン酸であり得る。この方法は、式ＳＭ−ＢＡＳＥを有するリボヌクレオシドを生成する第一工程を包含し、ここで、ＳＭはリボースであり、ＢＡＳＥはピリミジンまたはプリンである。第二工程において、可逆的な鎖終止部分が、そのリボースの２’位に結合される。この可逆的な鎖終止部分は、２−ニトロベンジル基、デシル基、またはｐ−ヒドロキシフェナシルケージング基であり得る。

本発明の別の局面は、本発明のリボヌクレオシド／リボヌクレオチドを用いて核酸を配列決定する方法に関する。この方法において、プライマー（ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る）は、標的核酸と複合体化され（すなわち、塩基対によってハイブリダイズされ）、そしてＲＮＡポリメラーゼおよび式ＰＭ−ＳＭ−ＢＡＳＥを有する第一の種のリボヌクレオチドの１つ（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ，ＣＴＰまたはＵＴＰ）を用いて伸長される。ここで、ＰＭはリン酸部分であり、ＳＭはリボースであり、ＢＡＳＥはピリミジンまたはプリンであり、そしてこのリボースは、そのリボースの２’位に可逆的結合によって結合される鎖終止部分を含む。上記第二工程において、取り込まれた状態のリボヌクレオチドが検出されて、上記標的核酸の配列が決定される。任意の工程において、取り込まれた状態のリボヌクレオチドの鎖終止部分は、可逆的結合を除去することによって、除去され得る。必要に応じて、これらの工程は、同じ化学構造を有するが塩基が異なる第二の種のリボヌクレオチドのうちの少なくとも１つを用いて繰り返される。

プライマー／標的核酸複合体は、２つの核酸鎖をハイブリダイズさせることによって、またはＲＮＡポリメラーゼによる合成によって形成され得る。例えば、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ＆ ＲＮＡポリメラーゼは、適切なＲＮＡプロモーター部位（すなわち、適切なＤＮＡ配列）において、新規にＲＮＡプライマーを合成し得る。したがって、プライマー：標的核酸複合体は、Ｔ７ポリメラーゼを、ＮＴＰとともに、Ｔ７プロモーター配列を含むＤＮＡ分子と接触させることによって作製され得る。

本開示において言及されるＲＮＡポリメラーゼは、任意のＲＮＡポリメラーゼであり得、少なくとも、ファージがコードするＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）を包含する。

本開示のポリメラーゼは、立体的なゲート領域の欠失もしくは置換、またはヌクレオチド結合領域および触媒ポケット領域の欠失もしくは置換を含み得る。

本発明の別の局面は、標的核酸を配列決定する方法に関し、この方法は、（１）標的核酸と複合体化しているプライマーを、ＲＮＡポリメラーゼならびにリボヌクレオチドであるＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰを用いて伸長して、取り込まれた状態のヌクレオチドを形成する工程であって、このリボヌクレオチドは、式ＰＭ−ＳＭ−ＢＡＳＥを有し、ここで、ＰＭはリン酸部分であり、ＳＭはリボースであり、ＢＡＳＥはピリミジンまたはプリンであり、このリボースは、そのリボースの２’位に可逆的結合によって結合される鎖終止部分を含み、このリボヌクレオチドの各々は、検出可能な標識で可逆的に標識される、工程；ならびに（２）上記検出可能な標識を検出することによって上記取り込まれた状態のヌクレオチドを検出して、上記標的核酸の配列を決定する工程、を包含する。この方法はさらに、上記取り込まれた状態のリボヌクレオチドから鎖終止部分および上記検出可能な標識を除去する任意の工程を包含し得る。これらの工程は、所望の量の核酸配列が決定されるまで繰り返され得る。

用語「２’改変型リボヌクレオチド」は、本開示において使用される場合、本開示で記載されるような新規な２’改変型リボヌクレオチドを指すことが理解される。他に示されない限り、２’改変型リボヌクレオチドは、可逆的な２’改変を含むリボヌクレオチドを包含する。この可逆的な改変は、例えば、その２’改変型ヌクレオチドを電磁放射（紫外線が挙げられる）に曝露することによって除去され得る。２’改変型リボヌクレオチドの一実施形態は、図１に示される。

（発明の詳細な説明）
本発明者らは、以前に、単一のＤＮＡ分子の直接配列決定を実施するためのストラテジーを発明した（ＷＯ ００／５３８０５）。この方法は、可逆的なターミネーターとして機能するヌクレオチドの使用に依存しており、光または化学的環境によって可逆的である糖の環を改変することによって最も実施可能になる可能性が高い（他の構成もまた可能であり得る）。さらに、理想的には、研究中のテンプレートの放出が、配列決定反応が起こる物理的位置からそのテンプレートを放出させるような前進型のポリメラーゼ酵素の使用が必要である。したがって、本発明者らは、その役割に合った前進型であることが公知のポリメラーゼを利用する研究を開始し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（および他のフェーズではその関連物（例えば、Ｔ３およびＳＰ６））が本発明者らの目的に最適であると同定した。これらのポリメラーゼは、糖改変型ヌクレオチドの使用に対して、高い前進性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）とより大きなフレキシビリティーの可能性とを兼ね備える。さらに、これらのポリメラーゼが二重鎖ＤＮＡで機能するように（天然にはヘリックスを解き（ｕｎｚｉｐ）、次いでそのポリメラーゼの後のヘリックスを再び締める（ｒｅ−ｚｉｐ））、これらのポリメラーゼは、前進型のＤＮＡポリメラーゼを構築する際に直面するいくつかの困難、ならびにこのようなＤＮＡポリメラーゼはめったに鎖を置換しないこと、および／または一本鎖テンプレートの調製において困難が生じ得るという事実を未然に防ぐ。

本発明者らの研究目的のために、本発明者らは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよび本発明者らが操作した改変体によってヌクレオチドを利用するために、数種の異なるアッセイを使用した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも２つの異なる合成様式において、リボヌクレオチドを伸びている鎖に取り込み得る。そのポリメラーゼが正規のプロモーター配列を認識すると、ポリメラーゼは、分配的な様式（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｖｅ ｍｏｄｅ）ではあるがテンプレート依存性の様式で、短期間のＲＮＡ合成を開始する。そのポリメラーゼは、前後に滑って短いＲＮＡフラグメントを放出し得るが、最終的には、伸長様式として公知の新しく安定な様式でテンプレートに固定される。さらにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、そのポリメラーゼが非テンプレート指向性様式でテンプレートの最末端に到達した場合に、ヌクレオチドを付加して転写することが報告されている。最後に、Ｔ７ ＲＮＡＰは通常は記載されるようにテンプレートでコードされるプロモーターエレメントと関連して働くが、モデル系がＴｅｍｉａｋｏｖら（Ｔｅｍｉａｋｏｖ）によって発明されており、その系において、ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を伸長させる。この実験的状況では、ＲＮＡオリゴマーはプライマーとしての役割を果たす。テンプレートおよびポリメラーゼと一緒に、そのオリゴマーは、転写の伸長様式を模倣していると記載された構造を形成するが、ポリメラーゼ酵素の特性のいくつかは、これらの条件下で若干異なり得る。

ここで、本発明者らは、Ｔｅｍｉａｋｏｖらに従って構築された複合体による、伸びているＲＮＡ鎖への、ｒＡＴＰアナログである２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰの取り込みを報告する。この取り込みは、ＲＮＡの３’末端に対するヌクレオチドの非テンプレート依存性の付加として生じ、本発明者らは、この活性が伸長様式で二重鎖ＤＮＡ基質において複合体化することを観察していない。本発明者らは、この活性はいわゆる「Ｎ＋１」効果（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼについて以前に報告された現象）と似ていると推測する。

さらに、本発明者らは、２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ鎖のさらなる伸長のためのターミネーターとしての役割を果たすことの証拠を提供する。本発明者らは、ＵＶ照射を使用して、その末端のヌクレオチドのリボース環における標準の２’−ＯＨ基を残して２−ニトロベンジル部分を除去した。転写は、その後に再開され得るようであり、それによって、末端効果が、本発明者らが示唆したような配列決定の方法論で使用するのに望ましいように逆転する。

２’位に２−ニトロベンジル部分を有するヌクレオチドが、異常な条件下でさえも、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写複合体によってＲＮＡに取り込まれ得るという観察は、これらのヌクレオチドアナログと酵素の触媒部位との間の適合性に関する一般的な制限の程度が、必ずしも他の試薬と同様ではないことを示唆する。実際に、本発明者らは、３’のリボース位が代わりに改変されている類似の化合物を用いて、そのような効果を模倣することはできなかった。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの両方の結晶ソーキング（ｃｒｙｓｔａｌ ｓｏａｋｉｎｇ）研究（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼについてＪｏｈｓｏｎら、そしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼについてＹｉｎおよびＳｔｅｉｔｚ）は、触媒作用中のタンパク質／ヌクレオチドの動きを明らかにし、そしてこの観察について可能性のある原因に関する見識を提供する。最も特別には、これらの研究は、ヌクレオチドの触媒作用前の結合に好都合な相互作用に加えて、その触媒プロセスもまた、タンパク質チャネル内のより深くに位置付けられるまでそのヌクレオチドが「徐々に」上げられる間の、タンパク質および基質の実質的な動きに関連することを明らかにする。この複合体の動きの間、基質のヌクレオチドは多くの側鎖を越えて移動しなければならず、特に、３’−ヒドロキシルは通過の間に種々の残基を越えて接近して移動し、触媒作用後の位置の電子密度の壁に対してぴったりと密接におさまるようである。このことは、３’位に嵩高い基を置くことが触媒作用の種々の段階中に重大な立体障害を生じるようであること、および嵩高い３’基を取り込む触媒活性の（野生型または改変型）酵素がそのような立体障害を生じることは考えにくいことが確認されることを示唆する。逆に、２’改変型ＡＴＰでの本発明者らの触媒作用のデータは、この位置が触媒作用中に活性部位の複数のアミノ酸と接触することとそれほど明らかに関係せず、特に、触媒作用後にフリーのチャネルの「突出部（ｐｏｋｉｎｇ ｏｕｔ）」に位置付けられるようであるという観察を支持する。これは、構造を有意に乱すことなく座るような嵩高い改変のための空間を提供するが、次に入ってくるヌクレオチドの結合および／または触媒作用を妨げる可能性が高く、これは、観察された鎖終止挙動と一致する。明らかに、２’改変型ヌクレオチドが阻害特性を有さないということではないが、公知の生化学的証拠、結晶構造および本発明者ら自身のデータを組み合わせることで、変異体の生化学的または遺伝的スクリーニングを行って、テンプレート依存性の転写の前進型の様式でも２’−（２−ニトロベンジル）リボヌクレオチドを取り込み得るＴ７ ＲＮＡＰ改変体を発見する一連の研究への道が開かれる。本発明者らはすでに、個々にまたは組み合わせてランダムな改変体に対して最初に変異される候補アミノ酸残基を同定し得る。これらは、リジン６３１、メチオニン６３５、チロシン６３９、およびフェニルアラニン６４４であり、これらすべては、触媒作用中に最も大きな移動を示すＯヘリックスのヌクレオチド結合表面に位置される（チロシン６３９はすでに、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの２’選択に関与している（ＢｒｉｅｂａおよびＳｏｕｓａ）。図４も参照のこと）。結合ポケットの残基の「後壁」において、ヒスチジン７８４およびアスパラギン酸７８７が、ランダムな変異誘発のための明らかな候補である（ヒスチジン７８４もまたすでに、２’選択に関与している（ＢｒｉｅｂａおよびＳｏｕｓａ））。さらに、本発明者らは、グリシン５４２の置換（リボースの取り込みを阻害するＤＮＡポリメラーゼ中の「立体的なゲート（ｓｔｅｒｉｃ ｇａｔｅ）」と等価である（Ｇａｏら））、さらにこの領域の欠失を検討する。最後に、本発明者らは、結合部位の後部ポケットの嵩を小さくすること、例えば、残基７８２、７８３、７８５、７８６をグリシンまたはアラニンに変異させることを検討し得る。テンプレート依存性の転写の前進型の様式で２’−（２−ニトロベンジル）リボヌクレオチドを取り込む任意の変異体は、本発明者らの以前の開示（Ａｒｍｅｓ／Ｓｔｅｍｐｌｅ特許出願ＷＯ ００／５３８０５）で提案されるような新規な単一分子配列決定技術を実施するのに非常に有用である。立体的なゲートを除去することによってリボースおよびその可能な誘導体のアクセスを一般的に許容するために同様の努力がまずなされるという条件で、類似のアプローチが、ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われ得る（このことは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのグリシン５４２と構造的に等価な領域（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのクレノウフラグメントのＥ７１０Ａ）を変異させることと関係する。Ａｓｔａｔｋｅら）。立体的なゲートを欠失するポリメラーゼは、上に列挙した残基のうちの任意の１つ以上を含むアミノ酸配列の欠失を含み得る。同様に、ヌクレオチド結合ポケットおよび触媒ポケットにアミノ酸置換を有するポリメラーゼは、上に列挙した残基のうちの任意の１つ以上を含むアミノ酸置換を含み得る。

本発明のヌクレオチドは、単一の核酸テンプレートが関与する配列決定方法（例えば、係属中のＰＣＴ出願ＷＯ ００／５３８０５に記載される方法）に使用され得る。例えば、本発明のヌクレオチドは、例えば、ピロホスフェートベースの配列決定方法のような、複数の核酸テンプレートが関与する配列決定方法に使用され得る。さらに、本発明のヌクレオチドは、終止ヌクレオチドが使用される任意の反応で置き換えられ得る。例えば、本発明のヌクレオチドは、Ｓａｎｇｅｒ法による配列決定において、ｄｄＮＴＰの代わりになり得る。

（実施例１：使用したオリゴマーおよび骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）形成）
核酸骨格を、１ｎｍｏｌのＲＮＡ−１（５’−ビオチン−ＡＡＣＵＧＣＧＧＣＧＡＵ−３’（配列番号１））および１ｎｍｏｌのＤＮＡ−１（５’−ＣＧＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＣＧＣＣＧＣ−３’（配列番号２））を１００μｌ転写緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ７．９）、３０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭスペルミジン）中で７０℃にて１０分間インキュベートすることによって、形成した。その温度を２５℃までゆっくり低下させることによって、アニーリングが生じた。ハイブリッドの濃度は、１０μＭであると想定された。

（実施例２：プライマー伸長反応）
プライマー伸長反応のために、２ｐｍｏｌの骨格を、９μｌの転写緩衝液中で１０ユニットのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）と混合して、転写複合体を形成させた。反応を、１μｌの１ｍＭヌクレオチド溶液の添加によって開始し、３７℃において２０分間インキュベートした。反応を、２μｌの５００ｍＭ ＥＤＴＡの添加によって停止し、氷上で冷却した。ＵＶ照射を、ＵＶランプにて１０分間行った。

サンプルを沈殿させ、ホルムアミドローディング緩衝液中に溶解し、そして変性１６％ポリアクリルアミドゲル（８Ｍ尿素）上で分離させた。ゲルを、ブロッティング緩衝液（０．５×ＴＢＥ）中でナイロン膜（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ，ＵＳＡ）上にエレクトロブロッティングした。ブロットを、ブロッキング緩衝液（１×ＴＢＳＴｗ／１％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ））中において室温で１時間インキュベートして非特異的ノイズを回避し、ブロッキング緩衝液中で０．５μｇ／ｍｌストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）とともに１時間インキュベートし、そして０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水中で徹底洗浄した。検出を、製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ）の指示に従って化学発光基質を使用して実施した。

（実施例３：可逆的終止反応）
可逆的終結実験のために、５ｐｍｏｌの骨格を、６．５ｐｍｏｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（精製において使用されたＮ末端ヒスチジンをプロセシングする）とともに１８０μｌ転写緩衝液中で混合して、活性転写複合体を形成させた。この反応を、２０μｌの１０ｍＭ ２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰの添加によって開始し、３７℃において２時間インキュベートした。その後、その反応を、４つのサンプルへと分割し、脱保護に供した。２つのサンプルを、上記のようなＵＶ照射に対して曝露し、２つの未処理サンプルを、同じ時間だけ周囲温度にてインキュベートした。脱保護の後に、転写緩衝液中に２５０μｌのｒＮＴＰを含む伸長混合物を１容量添加したか、または転写緩衝液のみを添加した。その後、サンプルを、３７℃においてさらに１時間インキュベートした。

生成物のプロセシング、分離および検出を、上記の通り行った。

（実施例４：骨格アッセイにおけるプライマーとしての役割を果たすＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡオリゴマーの使用）
Ｔｅｍｉａｋｏｖら（Ｔｅｍｉａｋｏｖ）は、テンプレートとしての役割を果たす一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズした場合に、短いＲＮＡオリゴマーがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ触媒性転写のためのプライマーとしての役割を果たし得ることを、示した。その後、このポリメラーゼは、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ヌクレオチドの段階的添加によって、そのコードテンプレートに沿って「ウォーキングされ（ｗａｌｋｅｄ）」得る。本発明者らは、これらの結果を確認したが、ここで使用した条件下では、さらなるヌクレオチドが非テンプレート依存性の様式で取り込まれることを観察する。

ＲＮＡオリゴマーおよび一本鎖ＤＮＡテンプレート（例えば、図２Ａにおいて示されるもの）は、転写複合体においてＴ７ ＲＮＡＰと相互作用する核酸骨格を形成し得る。同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ヌクレオチド（ここでは、ｒＡＴＰ）とともに提示された場合、このＲＮＡプライマーは、１塩基分または２塩基分、伸長される（図２Ｂ、レーン３）。骨格は、上記ＤＮＡによりコードされる次の２つのヌクレオチド（ここでは、ｒＡＴＰおよびｒＧＴＰ）を提供された場合には、３塩基分以上、伸長される（図２Ｂレーン４）。一方、次の１つのヌクレオチドが同族でない（ｎｏｎ−ｃｏｇｎａｔｅ）場合（ここでは、ｒＣＴＰ）、その伸長は、１塩基分に限定される（図２Ｂレーン５）。コードされる塩基に加えて１ヌクレオチド以上の取込みは、明らかに、温度依存性の事象ではない。この効果は、いわゆるＮ＋１効果（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）を示す。

ＲＮＡ／ＤＮＡ骨格とＴ７ ＲＮＡポリメラーゼとによる安定な転写複合体の形成は、ヌクレオチドアナログが伸びているＲＮＡ鎖に取り込まれる可能性を試験するためのサンプル系を提供する。

（実施例５：２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ鎖中に取り込まれる）
本研究において、本発明者らは、２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのための基質として使用した。この２−ニトロベンジル改変は、上記ヌクレオチドアナログの分子量と、後者のヌクレオチドアナログが取り込まれるあらゆる核酸の分子量とを増加させる。結果的に、ＮＢ部分を含むＲＮＡの電気泳動移動度は、それに応じて変化し、これによって、改変型転写物が同定されるのを可能にする。その調製の性質に起因して、本実験において使用する２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰは、推定５％だけｒＡＴＰが混入している（材料および方法を参照のこと）。

図２Ｂのレーン６において示されるように、主に２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰを含む反応主要生成物の移動度は、１０ヌクレオチドの非改変型ＲＮＡと１１ヌクレオチドの非改変型ＲＮＡとの間の位置で移動するようである（レーン３およびレーン４と比較）。この中間分子量生成物は、少なくとも１つの２−ニトロベンジル改変型ヌクレオチドの取込みを示唆する。

１分子当たりどれぐらいの数の２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰヌクレオチドが取り込まれたか？ ９ヌクレオチド位置における弱いバンド（レーン６およびレーン７を比較）は、混入している非改変型ｒＡＴＰもまた利用されたことを示す（ｒＡＴＰの濃度は、約５μＭであり、この低濃度においてさえ、このｒＡＴＰは、Ｔ７ ＲＮＡＰによって容易に使用され得る（Ｓｏｎｇ）ことに留意されたい）。１０ヌクレオチド長生成物が全く存在しないことは、（高ｒＡＴＰ濃度の場合（レーン６を参照のこと）と同様に）何らかの非改変型ｒＡＴＰがＮ＋１型活性中に取り込まれた可能性を、排除する。この主要生成物は、１つの２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰの取り込みの結果、２つの２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰの取り込みの結果（これらのうちの２番目のものは、非テンプレート依存性（すなわち、Ｎ＋１型）である）、または標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌｌｙ）に取り込まれたｒＡＴＰに付加された１つの２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰの取り込みの結果であり得る。高濃度の２つの２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰ存在下における転写の主要生成物の正体についてのさらなる証拠は、脱保護実験によってもたらされる。

（実施例６：ＵＶ光による２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰの脱保護）
２−ニトロベンジル部分は、光エネルギーを吸収して、２−ニトロベンジルと「保護された」分子（所定の）との間の共有結合を切断する能力のために、多くの適用において使用されている感光性（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）基である。２’−（２−ニトロベンジル）改変型ヌクレオチドの場合、この結合の切断は、リボース環上にフリーの２’−ＯＨ基を作り出す。この光脱保護の生成物は、その結果として、非改変型ｒＡＴＰの取り込みによって伸長されるＲＮＡオリゴマーと同じ位置で生じ得る。

図２Ｂ、レーン７に示されるように、２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰ取り込みの主要生成物のＵＶ処理は、その電気泳動移動度の増加をもたらす。ここでこの主要なバンドは、長さ１０ｎｔのＲＮＡと同じ位置に流れる（レーン３とレーン７とを比較のこと）。この観察によって、Ｔ７ ＲＮＡＰにより発生しようとしているＲＮＡ鎖への２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰ取り込みの記録が確認される（非改変型ＲＮＡオリゴマーは、ＵＶ処理に応答してそれらの電気泳動移動度を変化させない；データは示さず）。このことは、本発明者らが、２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰ取り込みの主要生成物の組成に関して上記の代替のうちの１つを排除することを可能にする。

単一の２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰ取り込みは、９ヌクレオチドより大きい全てのバンドの喪失およびＵＶ処理に対する応答として９ヌクレオチドのバンドの強度の増大をもたらすはずである。そのどちらでもないので、この可能性は否定され得る。

主要生成物は、Ｔ７ ＲＮＡＰ活性のＮ＋１様式において取り込まれた１個の２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰ、または２個の２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰを含むのか？ これまでに提示された実験結果は、これらの２つの可能性を形式的に区別できないが、２個の２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰは、かなり可能性の低い２つの仮定を想定することを要する。

最初に、２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰ取り込みは、ｒＡＴＰよりもはるかに効率的でなければならない。すなわち、改変型ヌクレオチドは、よりよい基質でなければならない。２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰの提供は、どのようなオリゴマーの形成においても生じず、ただ１つの改変型ＡＴＰが取り込まれる（このことは、長さ９ヌクレオチドと１０ヌクレオチドとの間の位置で生じなければならない；１Ｂ、レーン６）。このことは、１つの２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰの任意の取り込みの次に、必然的に、第２の（Ｎ＋１型活性）改変型ヌクレオチドの付加が続くことを示唆する。他方で、転写複合体が非改変型ｒＡＴＰのみを伴って存在する場合、その反応生成物は、１つまたは２つのヌクレオチドだけ伸長したＲＮＡオリゴマーの混合物である（図２Ｂ、レーン４）。

第２に、発生しつつあるＲＮＡ鎖における末端２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰの３’−ＯＨ基は、それでもなお、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ依存性伸長のための標的でなければならない（すなわち、２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰは、非ターミネーターでなくてはならない）。非ターミネーターでなければならないという要件は、さらなる実験において扱われる。

（実施例７：２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰは、転写の可逆的ターミネーターとして作用する）
ポリメラーゼによるＮＢ改変型ヌクレオチドの取り込みについての潜在的な適用は、新規な配列決定技術（ＷＯ ００／５３８０５）において可逆的ターミネーターとしてのその使用である。従って、本発明者らは、２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰが転写のターミネーターとして作用する能力を試験した。

図３に示される実験において、骨格を、Ｔ７ ＲＮＡＰおよび２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰとともにインキュベートした。先に記載される実験のように、このような反応の生成物は、１０ヌクレオチドオリゴマーの電気泳動移動度と１１ヌクレオチドオリゴマー電気泳動移動度との間にある、見かけ上の電気泳動移動度を有する（図３、レーン１）。ＵＶ照射に供されると、このＲＮＡに取り込まれたＮＢ部分が除去され、この生成物の移動度は、１０ヌクレオチドオリゴマーの移動度へと増大する（図３、レーン２）。転写は、非改変型ｒＮＴＰの付加の際に再び始まり得る。末端塩基ヌクレオチドの２−ニトロベンジル部分が光脱保護によって除去されると、主要バンドのシグナル強度の減少がもたらされる。これは、おそらく、その生成物が伸長していることが原因である（図３、レーン４）。対照的に、ニトロベンジル基をなお有しているＲＮＡ鎖は、転写複合体によって伸長され得ないので、生成物の量は、事実上変化しないままである（図３、レーン３）。本発明者らは、脱保護された物質が完全に利用されなかったことに注目する。これは、種々の理由（ポリメラーゼが、必然的に、これらの「追跡」実験においてミスマッチから伸長しなければならないという事実が挙げられる）のために、まさにその場合であり得る。にもかかわらず、２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰがターミネーターとして機能した（これは、脱保護の際に逆になり得る）という示唆により、そのデータは、もっともよく説明されると考えられる。

結論として、本発明者らは、２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰが転写の正真正銘のターミネーターとしての役割を果たすことを示した。転写物の伸長は、保護している２−ニトロベンジル基をＵＶ照射によって除去すると、再開し得る。２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰの性質はまた、高濃度の２’−（２−ニトロベンジル）−ＡＴＰの存在下での転写の主要生成物が、１つではなく２つの改変型ヌクレオチドだけ伸長したＲＮＡプライマーであり得るという、上記の可能性を排除する。

本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、および参考文献は、参考として本明細書に援用される。

（参考文献）

図１は、２’−２−ニトロベンジル−ＡＴＰ、２’−デシル−ＡＴＰおよび２’−ｐ−ヒドロキシフェナシル−ＡＴＰの化学構造を示す。アデノシン塩基は、任意の他の塩基（例えば、グアノシン、ウリジン、またはシチジン）で置換され得る。この化学構造は、ＰＭ−ＳＭ−ＢＡＳＥであり、ここで、ＰＭはリン酸基またはリン酸部分であり、ＳＭは糖基または糖部分であり、そしてＢＡＳＥはピリミジンまたはプリンである。 図２（Ａ）は、ＲＮＡオリゴマーと５’オーバーハングを有する一本鎖ＤＮＡテンプレートとの複合体を示す。上側の鎖は、配列番号１として配列表に示され、下側の鎖は、配列番号２として配列表に示される。図２（Ｂ）は、図２（Ａ）に示されるようなテンプレートに基づく転写産物を示す。 図３は、本発明のヌクレオチドを用いる転写実験を示す。 図４は、Ｔ７ポリメラーゼの触媒部位を示す。

Claims (28)

1. 式ＳＭ−ＢＡＳＥを有するリボヌクレオシドであって、ＳＭはリボースであり、ＢＡＳＥはピリミジンまたはプリンであり、そして該リボースは、該リボースの２’位に可逆的な鎖終止部分を含む、リボヌクレオシド。
2. 前記塩基が、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択される、請求項１に記載のリボヌクレオシド。
3. リボヌクレオシド５’リン酸、リボヌクレオシド５’二リン酸またはリボヌクレオシド５’三リン酸からなる群より選択されるリボヌクレオチドである、請求項１に記載のリボヌクレオシド。
4. アデノシン５’一リン酸、アデノシン５’二リン酸、アデノシン５’三リン酸、グアノシン５’一リン酸、グアノシン５’二リン酸、グアノシン５’三リン酸、ウリジン５’一リン酸、ウリジン５’二リン酸、ウリジン５’三リン酸、シチジン５’一リン酸、シチジン５’二リン酸、およびシチジン５’三リン酸からなる群より選択されるリボヌクレオチドである、請求項１に記載のリボヌクレオシド。
5. 前記可逆的な鎖終止部分が、可逆的結合によって前記リボースに結合している、請求項１に記載のリボヌクレオシド。
6. 前記可逆的結合が、電磁放射、化学的処理、またはそれらの組み合わせによって切断可能な結合である、請求項５に記載のリボヌクレオシド。
7. 前記電磁放射が光である、請求項６に記載のリボヌクレオシド。
8. 前記可逆的な鎖終止部位が２−ニトロベンジル基である、請求項１に記載のリボヌクレオシド。
9. 前記可逆的な鎖終止部位がデシル基である、請求項１に記載のリボヌクレオシド。
10. 前記可逆的な鎖終止部位がｐ−ヒドロキシフェナシルケージング基である、請求項１に記載のリボヌクレオシド。
11. 前記リボヌクレオチドが、検出可能な標識で標識されている、請求項１に記載のリボヌクレオシド。
12. 前記検出可能な標識が、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−グルコロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ｂ−ラクタマーゼ、ジゴキシゲニン、蛍光色素分子、フルオレセイン、ｃｙ３、ｃｙ５、アルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項１１に記載のリボヌクレオシド。
13. 前記検出可能な標識が、光退色によって除去され得る、請求項１１に記載のリボヌクレオシド。
14. 前記検出可能な標識が、可逆的結合によって前記リボヌクレオチドに結合されている、請求項１１に記載のリボヌクレオシド。
15. 前記可逆的結合が、電磁放射、化学的処理、またはそれらの組み合わせによって切断可能な結合である、請求項１４に記載のリボヌクレオシド。
16. 可逆的に終止するリボヌクレオシドを生成する方法であって、該方法は、
    （ａ）式ＳＭ−ＢＡＳＥを有するリボヌクレオシドを提供する工程であって、ＳＭはリボースであり、ＢＡＳＥはピリミジンまたはプリンである、工程；
    （ｂ）該リボースの２’位に可逆的な鎖終止部分を結合させる工程
    を包含する、方法。
17. 工程（ｂ）の前または後に、前記リボヌクレオシドに検出可能な部分を結合させる工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記可逆的な鎖終止部分が、２−ニトロベンジル基、デシル基およびｐ−ヒドロキシフェナシルケージング基からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
19. 標的核酸を配列決定する方法であって、該方法は、
    （ａ）標的核酸と複合体化するプライマーを、ＲＮＡポリメラーゼおよび式ＰＭ−ＳＭ−ＢＡＳＥを有する第一の種のリボヌクレオチドのうちの少なくとも１つを用いて伸長させて、取り込まれた状態のリボヌクレオチドを形成する工程であって、ＰＭはリン酸部分であり、ＳＭはリボースであり、ＢＡＳＥはピリミジンまたはプリンであり、該リボースは、該リボースの２’位に可逆的結合によって結合される鎖終止部分を含む、工程；
    （ｂ）該取り込まれた状態のリボヌクレオチドを検出して、該標的核酸の配列を決定する工程
    を包含する、方法。
20. 請求項１９に記載の方法であって、
    （ｃ）前記可逆的結合を切断することによって、前記取り込まれた状態のリボヌクレオチドの前記鎖終止部分を除去する工程；
    （ｄ）式ＰＭ−ＳＭ−ＢＡＳＥを有する第二の種のリボヌクレオチドのうちの少なくとも１つを用いて工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を繰り返す工程であって、ＰＭはリン酸部分であり、ＳＭはリボースであり、ＢＡＳＥはピリミジンまたはプリンであり、該リボースは、該リボースの２’位に可逆的結合によって結合される鎖終止部分を含む、工程
    をさらに包含する、方法。
21. 前記プライマーと前記標的核酸との間の複合体が、ハイブリダイゼーションまたはＲＮＡポリメラーゼによる合成によって形成される、請求項１９に記載の方法。
22. 前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるファージがコードするＲＮＡポリメラーゼである、請求項１９に記載の方法。
23. 標的核酸を配列決定する方法であって、該方法は、
    （ａ）標的核酸と複合体化するプライマーを、ＲＮＡポリメラーゼならびにリボヌクレオチドであるＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰを用いて伸長させて、取り込まれた状態のヌクレオチドを形成する工程であって、該リボヌクレオチドは、式ＰＭ−ＳＭ−ＢＡＳＥを有し、ＰＭはリン酸部分であり、ＳＭはリボースであり、ＢＡＳＥはピリミジンまたはプリンであり、該リボースは、該リボースの２’位に可逆的結合によって結合される鎖終止部分を含み、そして該リボヌクレオチドの各々は、検出可能な標識で可逆的に標識される、工程；
    （ｂ）該検出可能な標識を検出することによって該取り込まれた状態のヌクレオチドを検出して、該標的核酸の配列を決定する工程
    を包含する、方法。
24. 請求項２３に記載の方法であって、
    （ｃ）前記鎖終止部分および前記検出可能な標識を前記取り込まれた状態のリボヌクレオチドから除去する工程；
    （ｄ）所望の量の核酸配列が決定されるまで工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を繰り返す工程
    をさらに包含する、方法。
25. 前記プライマーと前記標的核酸との間の前記複合体が、ハイブリダイゼーションまたはＲＮＡポリメラーゼによる合成によって形成される、請求項２３に記載の方法。
26. 前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるファージがコードするＲＮＡポリメラーゼである、請求項２３または２４に記載の方法。
27. 前記ＲＮＡポリメラーゼが、２’改変型リボヌクレオチドを伸長する核酸に取り込み得る立体的なゲートの欠失を含む、請求項２３に記載の方法。
28. 前記ＲＮＡポリメラーゼが、２’改変型リボヌクレオチドを伸長する核酸に取り込み得るヌクレオチド結合中のさらなるアミノ酸置換および触媒ポケットを含む、請求項２３に記載の方法。

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