JP2003502013A

JP2003502013A - モルホリノ−ヌクレオチドの製造方法、並びに核酸配列の分析およびラベリングのためのその使用

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Publication number: JP2003502013A
Application number: JP2000601189A
Authority: JP
Inventors: フロランス・マルシアック; シルヴィー・ソウヴェイゴ; ジャン−フランソワ・モーレ; ジャン−ポール・イサルテル; ディディエ・モルコ
Original assignee: コミツサリアタレネルジーアトミーク; サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィーク
Priority date: 1999-02-22
Filing date: 2000-02-21
Publication date: 2003-01-21
Also published as: US20050070708A1; US20040209332A1; US7314928B2; US6838560B1; US20060183204A1; ATE241701T1; CA2371890A1; EP1155140A1; WO2000050626A1; FR2790005A1; FR2790005B1; PT1155140E; ES2199778T3; DE60002989T2; US7081526B2; DE60002989D1; US7105661B2; EP1155140B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、Sanger法によるＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定法における鎖伸長停止因子としての、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡ断片を作製するための、以下の式（Ｉ）：【化１】 [式中、Ｒ¹は核酸塩基を表し、Ｒ²は以下の式： −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂ −（ＣＨ₂）_n−ＳＨ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＳＲ³ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＯＲ³ {式中、ｎは１から１２の範囲の整数であり、Ｒ³はマーカー、タンパク質、酵素、脂肪酸、またはペプチドから由来する基である}の一つに対応する基を表す]のモルホリノ−ヌクレオシドの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、モルホリノ−ヌクレオシド三リン酸で酵素的に伸張した核酸（ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ）断片の製造に関する。この伸張は、核酸鎖中にこれらの誘導体
を取り込むことによる核酸配列の分析のために使用されてもよく、また配列の酵
素的ラベリングおよび固定化または検出のために使用されてもよい。

【０００２】これらのモルホリノ−ヌクレオシド三リン酸はまた、多くの応用における各種
の役割を有する付加的分子で使用されてもよい。

【０００３】

【従来の技術】

核酸配列の分析のために最も広く使用される方法は、Sanger等, Proceeding o
f National Academy of Science, 74, 1977, p. 5463-5467 [1]によって開発さ
れた「鎖伸長停止反応」法である。それは、天然のヌクレオシド三リン酸モノマ
ーの混合物から、テンプレートとして機能するＤＮＡ鎖の配列に相補するＤＮＡ
ポリマーを作成する、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの特性に基づく。上記方
法は、分析されるＤＮＡ鎖を使用して開始し、「鎖伸長停止因子」として周知で
ある従来の反応媒体分子に加えることによって一連の相補的な鎖のコピーを作成
し、ついで新たに形成された鎖の長さを分析し、鋳型の塩基配列を決定すること
を含む。この方法の原理は、以下の表１に説明される

【０００４】

【表１】

【０００５】この表１は、ＤＮＡポリメラーゼ、一般的に２５未満の塩基対の小さいオリゴ
ヌクレオチドより成るプライマー、および４種の天然のヌクレオシド三リン酸の
混合物を、鋳型を構成する測定が所望される配列を有するＤＮＡ鎖と接触させる
場合に生ずる反応を説明する。上記プライマーは、分析されるＤＮＡ鎖の相補的
な配列の鎖に相当する。分析されるＤＮＡの相補的な配列と自発的に相互作用す
る（ハイブリダイゼーション）このプライマーで開始して、上記酵素は、伸張−
重合によって、上記鋳型に相補的なコピーである新たなＤＮＡ鎖を構築するよう
に、鋳型に相補的なヌクレオシドを取り込んでいく。新たなヌクレオチドは、伸
長する鎖の３’−ＯＨ末端に、連続的に、塩基対の間の相補性に関するWatson &
Crickルールに適合して、排他的に取り込まれる。チミジンは、鋳型として機能
する鎖中に存在するアデニンとの相補性によって、新たに形成される鎖内に取り
込まれ、グアニンはシトシンとの相補性によって取り込まれ、その逆の関係も成
り立つ。もし全ての必要とされる化合物が、非制限的な量で提供されるのであれ
ば、上記鎖がマトリックスに相補的な完全な鎖を表すまで、上記酵素は形成され
る鎖の重合を触媒するであろう。

【０００６】他方で、もしポリメラーゼによって認識されるが、遊離３’−ＯＨ末端を有さ
ない分子が反応媒体に加えられると、この分子が各時間で取り込まれ、新たなヌ
クレオチドを結合するのに利用できる部位が存在しないため、鎖がもはや伸長で
きなくなり、酵素の重合作業は中断されるであろう（中断された新たに形成され
る鎖の作製）。これは、3'-デオキシチミジン5'-三リン酸を使用して以下の表２
に説明される。

【０００７】

【表２】

【０００８】（極わずかな）濃度で「Ｔ鎖伸長停止因子」と称されるこのチミジン誘導体を
使用して、テンプレート中のアデニンの位置によってランダムに固定化される部
位を有する一連のＤＮＡ鎖が、所定のテンプレートに対して得られる。得られた
結果が、表３において説明される。テンプレートの配列は第一列に記載され、Ｔ
鎖伸長停止因子（Ｓで記載）で作製された新たに形成された鎖の配列がその後の
列に記載される。

【０００９】

【表３】

【００１０】この例において、テンプレートは、示された領域中に５個のアデニンを含み、
かくしてＤＮＡポリメラーゼは、異なる長さを有する５種の中断された新たに形
成される鎖を生産する。

【００１１】ついで、この混合物を変性媒体中でのポリアクリルアミドゲル電気永劫で分析
することによって、Ｔ鎖伸長停止因子を使用して得られた各鎖の長さを測定する
。中断された新たに形成された鎖のサイズにより、マトリックスにおけるアデニ
ンの位置を推定することが可能である。

【００１２】この実験を、Ａ，ＧおよびＣ鎖伸長停止因子をそれぞれ使用して三回繰り返す
ことにより、全部で４シリーズのＤＮＡ断片が得られ、各断片の長さにより、テ
ンプレート配列の完全な配列を決定することが可能である。

【００１３】ＲＮＡ配列決定の方法は、使用される酵素が逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡ
ポリメラーゼ）であることを除いて、同様な原理に基づく。

【００１４】ＤＮＡポリメラーゼの作用を停止するための鎖伸長停止因子として最も一般的
に使用される製品は、以下の式を有する2',3'-ジデオキシヌクレオシド三リン酸
である：

【化１２】 [式中、Ｂは文献[1]に記載された核酸塩基Ａ，Ｃ，ＧまたはＴの一つを表す]。

【００１５】天然のヌクレオシド三リン酸の構造と比較してこれらの製品の構造は、次のヌ
クレオチドのための結合の部位として機能する３’位置でのヒドロキシル官能基
の欠失を示す。

【００１６】 2',3'-ジデオキシヌクレオチドの化学的合成は、３の工程を含む長くて労力の
かかるプロトコールに従って実施される。グアニンの場合、この方法の第一の工
程は、グアニンの環外アミン官能基と、糖の第一級５’ヒドロキシル官能基の保
護である。ついで３’ヒドロキシル官能基が、生産された2'-3'二重結合の除去
、ついで還元によって除去される。最後の工程は、三リン酸誘導体の調製である
。

【００１７】多の鎖伸長停止因子は、文献WO-A-96/23807 [2]に記載されている。これらは
、アラビノヌクレオシド、3'-フルオロ-2',3'-ジデオキシヌクレオシド、3'-ア
ジド-2',3'-ジデオキシヌクレオシド、または3'-アミノ-2',3'-ジデオキシヌク
レオシドの5'-三リン酸である。これらはまた、合成のために労力がかかる。

【００１８】もともとSanger法においては、合成されるＤＮＡ断片の顕視化は、相補的な鎖
の重合を開始するために使用されるプライマーの５’末端での³²Ｐでの放射性活
性ラベリングによって達成された。蛍光分子を有するプライマーを使用すること
によって、修正がなされた。この改良は、放射性活性物質の使用を避けるために
、使用の容易性についてのみ利点を有するが、異なる重合停止因子（Ａ，Ｇ，Ｔ
またはＣ停止因子）をそれぞれ使用する、４種の配列決定反応を実施する必要性
は未だ存在する。

【００１９】新たな改良は、Prober等, Science, 238, 1987, 336-341頁[3]に記載された、
核酸塩基に蛍光分子を有する配列停止因子の使用である。

【００２０】これらの条件の下では、新たに合成された鎖は、配列決定反応の前にもはやラ
ベルされることはなく、配列停止因子の取り込みと同時に直接的にラベルされる
。各ＤＮＡ塩基に対して異なる光学的特性を有する蛍光分子を選択するように注
意を払うことによって、実験プロトコールは著しく単純化された。一回の反応の
みが、互いに混合した４種の停止因子で実施される。その結果として、単一の電
気泳動レーンで開始して、配列の４種のヌクレオチドが、４種の停止因子の異な
る放射波長によって識別される。

【００２１】

【発明が解決しようとする課題】

分析プロトコールの単純化は、欠点を含まないものではない。特に蛍光分子は
、塩基に直接接合される。塩基の間の認識を支配する水素結合の部位の直接的な
領域に位置するこの構造的な修飾は、酵素による認識の減少を生ずる。これを補
うために、停止因子の濃度の増大が推奨され、これは非常に高い添加値を有する
開始物質の非常に顕著な消費を導く。さらにこれらの分子は、合成するのが未だ
に困難である。

【００２２】

【課題を解決するための手段】

本発明の一つの主題は特に、このタイプの配列決定法における、合成するのが
より容易で、さらに核酸塩基の修飾を必要とせずに効率的なラベリングを実施す
ることが可能なヌクレオチド三リン酸類似体より成る鎖伸長停止因子の使用に存
する。

【００２３】かくして本発明の一つの主題は、鎖伸長停止因子を使用する核酸に相補的な配
列の酵素的重合の方法によって、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を配列決定するた
めの方法であり、ここで鎖伸長停止因子の少なくとも一つは、前駆体として、以
下の式：

【化１３】 [式中、Ｒ¹は核酸塩基を表し、Ｒ²は以下の式： −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂ −（ＣＨ₂）_n−ＳＨ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＳＲ³ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＯＲ³ {式中、ｎは１から１２の範囲の整数であり、Ｒ³はラベル、タンパク質、酵素、
脂肪酸、またはペプチドから由来する基である} の一つに対応する基を表す] に対応する化合物を有する。

【００２４】この方法において使用される鎖伸長停止因子は、ポリメラーゼおよびトランス
クリプターゼによる認識が可能である核酸塩基Ｒ¹を含むヌクレオチド誘導体で
あり、相補性についてのWatsonとCrickのルールに従う。

【００２５】Ｒ¹について使用される核酸塩基は、天然のももでも合成のものでもよい。天
然の塩基は一般的に、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、キサ
ンチン、ヒポキサンチン、および2-アミノプリン、並びにそれらの誘導体から選
択される。

【００２６】合成の塩基は、天然の塩基との相互作用が可能である、天然の核酸塩基の類似
体または誘導体である。

【００２７】好ましくはＲ¹は、以下の式の一つに対応する：

【化１４】

【００２８】式（Ｉ）のヌクレオチド誘導体において、サッカリド部分は、以下のものを含
む適切な置換モルホリンで置換される：１°）三リン酸基によってエステル化された、環状酸素に近接したヒドロキシル
官能基。上記分子のこの部分は、ヌクレオチドの4',5'部分を模倣し、伸長する
ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖に対するポリメラーゼまたはトランスクリプターゼによる
結合を可能にする。２°）任意に発色分子または生物学的に活性な基の接合を可能にし、特に別のヌ
クレオチドの結合を妨げる（重合の妨害）、Ｒ２で置換されたアミン官能基。

【００２９】文献[1]、[2]および[3]に記載されたもののような、Sanger法において従来使
用されている誘導体と比較して、これらの化合物は、以下に示されるように、リ
ボヌクレオチド三リン酸から直接的に単一の工程で合成されてもよい。

【００３０】これらの化合物の利点は、官能化のために使用でき、環を官能化することも可
能である、Ｒ²基（モルホリン環の置換基）の広範囲の選択肢という点に存する
。酸、アミン、チオール、またはエーテルのような官能基が取り込まれてもよく
、特にＤＮＡまたはＲＮＡを同定するために有用なラベルといった、各種の化合
物の接合を可能にするであろう。

【００３１】Ｒ³として使用されるラベルは、ヌクレオチドのラベリングのために周知の広
範囲の分子から選択されてもよい。それらは例えば、放射性活性製品、発光分子
、電気発光分子、および蛍光製品、他の分子とカップリング可能な分子、抗原−
抗体タイプの相互作用を可能にする分子、並びに酵素的ラベルから選択されても
よい。

【００３２】好ましくは、核酸の配列決定のために、Ｒ³は例えば、いずれかのフルオレセ
インまたはローダミンから選択される蛍光分子である。ビオチン誘導体もまた使
用されてもよい。特に、核酸をラベリングするために使用される誘導体が選択さ
れるであろう。

【００３３】ヌクレオシドのサッカリド部分がモルホリノで置換されているヌクレオシド誘
導体は、以下の文献に示されるように、従来技術においてすでに合成されている
： − Hileman等, Bioconjugate Chemistry, 5, 1994, 436-444頁 [4]； − Broker等, Nucleic Acids Research, 5, 1978, 363-385頁 [5]； − Agrawal等, Nucleic Acids Research, 14, 1986, 363-385頁 [6]； − FR-A-2 710 068 [7]；および − Rayford等, Jounal of Biological Chemistry, 260, 1985, 15708-15713頁
[8]。

【００３４】文献[4]のヌクレオシド誘導体は、フルオレセインまたはローダミンで置換さ
れるモルホリノ環を含む。それらは、核酸塩基配列決定法における鎖伸長停止因
子としてよりもむしろ、タンパク質の研究のために使用される。

【００３５】蛍光分子がモルホリノ環に直接取り込まれているため、それらの製造は、ここ
で報告される方法のものとは異なる。我々が記載している方法は、Hileman等の
方法とは対照的に、最終産物の単離と十分な特徴付けが可能である中間体精製の
工程を含む。

【００３６】文献[5]は、ビオチンで置換されたモルホリノ環を含むヌクレオシド誘導体で
、３’末端を修飾されたトランスファーＲＮＡに関する。この産物は、トランス
ファーＲＮＡ遺伝子の染色体内局在を研究するための、トランスファーＲＮＡの
化学的ラベルとして使用される。

【００３７】文献[6]は、特異的な遺伝子の検出と単離のためのプローブとして使用される
、ビオチンに接合したモルホリノ環を含むオリゴヌクレオチドに関する。

【００３８】文献[7]は、置換されたモルホリノ環を含むヌクレオシド誘導体を記載する。
それらは、ヌクレオシド誘導体のモルホリノ環に結合したハプテンに対して生産
された抗体を調製するために使用される。

【００３９】文献[8]は、アフィニティークロマトグラフィーのために使用される、ＣＨ₂Ｃ
ＯＯＨで置換されたモルホリノアデノシンを説明する。

【００４０】かくしてこれらの文献はいずれも、Sanger法に従った核酸配列決定法における
鎖伸長停止因子としての、本発明のもののようなヌクレオチド誘導体の使用に関
するものではない。

【００４１】本発明の方法において使用されるヌクレオチド誘導体は、アデニンを表すＲ₁
を有する以下に説明される反応スキームに従って、リボヌクレオシド三リン酸か
ら直接に単一の工程で調製されてもよい。

【００４２】

【化１５】

【００４３】この方法は、モルホリン環を形成するための文献[6]および[7]に記載された方
法と同じタイプのものである。

【００４４】式（Ｉ）のヌクレオチド誘導体はまた、モルホリノ−ヌクレオシドから調製さ
れてもよく、リン酸基は、Ludgwig等, J. Org. Chem. 54, 1989, 631-635頁 [9]
によって記載されたような、Ecksteinプロトコールを使用して取り込まれてもよ
い。

【００４５】酵素的重合のために使用されてもよい酵素は、以下の記載されたものであって
もよい。

【００４６】本発明に従って、式（Ｉ）のモルホリノ−ヌクレオシドを調製するための方法
は、以下の式のヌクレオシド三リン酸：

【化１６】 [式中、Ｒ¹は上述の意味を有する]と、過フッ素酸塩、Ｒ²が上述の意味を有する
式Ｒ²ＮＨ₂の化合物、および水素化ホウ素ナトリウムとの反応を含む。

【００４７】本発明はまた、核酸断片の３’ＯＨ末端でのヌクレオチド誘導体の酵素的取り
込みによる、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）断片の３’末端でのラベリングのため
の、前駆体として式（Ｉ）の化合物を有するヌクレオチド誘導体の使用に関する
。

【００４８】本発明はまた、核酸断片の３’ＯＨ末端中への上記ヌクレオチド誘導体の酵素
的取り込みによる、3'-ラベル化核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）断片を製造する方
法に関する。

【００４９】上記酵素は、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片でもよく、この場合テン
プレートは、プライマーとして機能する核酸断片に対してモルホリノ−ヌクレオ
シドを結合するために使用される。

【００５０】上記酵素はまた、好熱性細菌の耐熱性ポリメラーゼ、または末端トランスフェ
ラーゼ、または逆転写酵素であってもよい。

【００５１】かくしてラベルされたＤＮＡまたはＲＮＡ断片は、いずれかの引き続くライゲ
ーションをブロックし、エキソヌクレアーゼに対する保護を確実にし、さらにＤ
ＮＡまたはＲＮＡ断片を検出するために使用できる。

【００５２】前駆体として式（Ｉ）の化合物を有する修飾されたモルホリノ−ヌクレオチド
はまた、Ｒ³として例えばＤＮＡまたはいずれかの支持体に対する架橋のための
光架橋剤；例えば細胞内への浸透を容易にするための脂肪酸、疎水性ペプチド、
または抗体；検出のためのアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、または
アセチルコリンエステラーゼのような酵素または酵素の一部；近接のＤＮＡを切
断するための制限酵素；および蛍光分子から選択される化合物を含む、前駆体と
して式（Ｉ）の化合物を有する修飾されたモルホリノ−ヌクレオチドの、３’末
端への酵素的取り込みによる、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）断片の修飾のために
使用されてもよい。

【００５３】上述のように、この修飾されたモルホリノ−ヌクレオチドの取り込みは、酵素
的に実施される。使用可能である窒素性塩基、ラベル、および酵素は、上述のも
のと同じであってもよい。

【００５４】本発明に従って、核酸断片の３’ラベリング、核酸断片の修飾、または核酸の
配列決定のためにそれぞれ使用される、ヌクレオチド誘導体、修飾されたモルホ
リノ−ヌクレオチド、および鎖伸長停止因子は、一リン酸形態の化合物（Ｉ）で
あってもよい。

【００５５】本発明の他の特徴および利点は、添付した図面を参考にして、以下の調製例に
関する記載を読むことでより明白になるが、上記調製例は、明らかに説明の目的
のために示されるものであり、制限的な意味を有するものではない。

【００５６】

【発明の実施の形態】

以下の実施例１から４は、式（Ｉ）のモルホリノ−ヌクレオチドの合成を説明
する。

【実施例】

【００５７】実施例１：4-(カルボキシメチル)-2-(アデノシン-9-yl)-6-(ヒドロキシメチル)
モルホリン6-三リン酸（モルホリノＡグリシン）１の合成このモルホリノＡグリシン１は、Ｒ¹がアデニンで、Ｒ²が−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ
基である式（Ｉ）に相当する。

【００５８】この実施例において、全ての反応は、50mLの丸底フラスコ中で磁性攪拌しなが
ら室温で実施される。

【００５９】 1.000g(1.8mmol, 1当量)の5'-アデノシン三リン酸を10mLの水に溶解し、１当
量の過ヨウ素酸ナトリウム(388mg, 1.8mmol)を加える。ついで上記溶液を３５分
攪拌する。

【００６０】 2mLの水(pH=9.5-10)に溶解したグリシン(682mg, 9.1mmol, 5当量)を加え、溶
液のpHを固体の炭酸カリウムで9.5-10に上げる。上記溶液を５５分攪拌する。反
応混合物は黄色を呈する。

【００６１】水素化ホウ素ナトリウム(全部で166mg, 4.4mmol, 2.5当量)を、６の等量の部
分で加え、それぞれを0.2mLの水に溶解する。第一の部分を添加した後、気体の
発生が生じる。それぞれ添加の直前に溶解した他の部分を、１時間おきに加える
。

【００６２】一晩放置した後、上記溶液を1Mギ酸を加えることによってpH4-5に中和し、つ
いで蒸発させる。

【００６３】 1mL/分の流速と、溶出液として25mM酢酸トリエチルアンモニウムＴＥＡＡ／メ
タノールＭｅＯＨ[98/2]を使用する、Merck LiChrocart 125-4 LiChrospher 100
RP-18カラム("endcapped, 5μm, 125×4mm)での逆相極性のクロマトグラフィー
による分析により、40%の収率が示される(k'=3.85)。

【００６４】精製：これは、8mL/分の流速と、溶出液として25mM二炭酸トリエチルアンモニウ
ムＴＥＡＢを使用する、Macherey Nagel Nucleosil 7 C-18カラム(7μm, 250×2
1mm)を使用する予備的高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって実施さ
れる。

【００６５】特徴付け：

【数１】

【００６６】実施例２：4-(カルボキシメチル)-2-(チミジン-1-yl)-6-(ヒドロキシメチル)モ
ルホリン6-三リン酸（モルホリノＴグリシン）４の合成この化合物４は、Ｒ¹がチミンを表し、Ｒ²が−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ基を表す式（
Ｉ）に相当する。

【００６７】この実施例において、モルホリノ−ヌクレオシドが最初に調製され、ついで三
リン酸塩に変換される。

【００６８】ａ）リボチミジンモルホリノ−ヌクレオシド２の調製全ての反応は、250mLの丸底フラスコ中で磁性攪拌しながら環境温度で実施さ
れる。

【００６９】リボチミジン(3.500g, 13.5mmol, 1等量)を35mLの水に溶解し、１等量の過ヨ
ウ素酸ナトリウム(2.900g, 13.5mmol)を加える。ついで上記溶液を４５分攪拌す
る。

【００７０】 35mLの水(pH=9.5-10)に溶解したグリシン(5.089g, 67.8mmol, 5当量)を加え、
溶液のpHを固体の炭酸カリウムで9.5-10に上げる。上記溶液を１時間４５分攪拌
する。反応混合物は黄色を呈する。

【００７１】 3.5mlの水に溶解した水素化ホウ素ナトリウム(全部で1.280g, 33.8mmol, 2.5
当量)の６分の１を、上記溶液に加える。気体の発生が生じる。それぞれ添加の
直前に溶解した他の部分を、１時間おきに加える。

【００７２】一晩放置した後、上記溶液を1Mギ酸を加えることによってpH4-5に中和し、つ
いで蒸発させる。

【００７３】 1mL/分の流速と、溶出液として25mMＴＥＡＡ／ＭｅＯＨ[99/1]を使用する、Me
rck LiChrocart 125-4 LiChrospher 100 RP-18カラム("endcapped", 5μm, 125
×4mm)での逆相極性のクロマトグラフィーによる分析により、32%の収率が示さ
れる(k'=8.83)。

【００７４】精製：これは、C-18シリカのカラムでの「フラッシュ」クロマトグラフィーまた
は逆相極性(Matrex, Amicon）によって実施される。溶出液は水である。

【００７５】特徴付け：

【数２】

【００７６】ｂ）リボチミジンモルホリノ−ヌクレオシド一リン酸３の調製 234μLのリンオキシクロリドトリクロリド(2.5mmol, 1.5等量)を、デシケータ
ー中で乾燥した342mgのイミダゾール(5.0mmol, 3等量)に加え、ついで5mLの厳密
に無水のピリジン中に加える。上記混合物を、風乾しながら３０分攪拌する。

【００７７】平行して、ａ）で得られた500mgのモルホリノチミジン(1.7mmol, 1等量)を、
ピリジン中で３回乾燥し、ついで5mLの無水ピリジンに加える。

【００７８】アルゴン環境下でイミダゾール／ＰＯＣｌ₃／ピリジン混合物を、モルホリノ
ヌクレオシド溶液に加え、全体を環境温度で４８時間攪拌する。次に100μLの水
を加え、氷冷バス中で反応フラスコを注意して冷却する。上記反応混合物を乾燥
状態に蒸発させ、ついで水に二回加え、蒸発させてピリジンを除去する。

【００７９】 1mL/分の流速と、溶出液として25mMＴＥＡＡ／ＭｅＯＨ[97/3]を使用する、Ma
cherey Nagel Nucleosil 7 C-18カラム(7μm, 120×3mm)での逆相極性のクロマ
トグラフィーによる分析により、33%の収率が示される(k'=0.62)。

【００８０】精製：これは、5mL/分の流速と、溶出液として水を使用する、H:Macherey Nagel
Nucleosil 7 C-18カラム(7μm, 250×21mm)を使用する予備的ＨＰＬＣによって
実施される。

【００８１】特徴付け：

【数３】

【００８２】ｃ）リボチミジンモルホリノ−ヌクレオシド４の調製 5mLの無水ジメチルホルムアミドに溶解した1.097gのカルボニルジイミダゾー
ル(67.mmol, 5等量)を、3mLの無水ジメチルホルムアミドに溶解したｂ）で得ら
れたチミジンモルホリノヌクレオシド一リン酸３のトリブチルアンモニウム塩に
加える(511mg, 1.3mmol, 1等量)。上記混合物を環境温度で５時間攪する。過剰
なカルボニルジイミダゾールを、436μLのメタノール(10.8mmol, 8等量)を加え
ることによって破壊する。３０分後、5mLのジメチルホルムアミドに溶解した５
等量のトリブチルアンモニウムピロリン酸(3.008g, 6.7mmol)を加える。上記混
合物を２日間攪拌し、反応混合物を濾過して乾燥状態に蒸発させる。

【００８３】 1mL/分の流速で、以下の条件の下でのギ酸アンモニウム（ＡＦ）の勾配を溶出
液として使用して、SFCC PVDI 31カラム(5μm, 100×4.6mm)で、逆相極性のクロ
マトグラフィーによる分析を実施する：ｔ（分） 25mM ＡＦ 0.9M ＡＦ（％）（％）０１０００１０１０００４００１００４１０１００４３１０００これにより、２７％の収率が示された(k'=13.84)。)

【００８４】精製：これは、イオン交換相のカラムでの「フラッシュ」クロマトグラフィーに
より実施される(DEAE Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech)。溶出液はＴ
ＥＡＢの勾配である（25mMから0.9M）。

【００８５】特徴付け：

【数４】

【００８６】実施例３：4-(カルボキシメチル)-2-(グアニン-9-yl)-6-(ヒドロキシメチル)モ
ルホリン6-三リン酸（モルホリノＧグリシン）５の合成このモルホリノＧグリシン５は、Ｒ¹＝グアニンで、Ｒ²＝−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ
を有する式（Ｉ）に相当する。

【００８７】グアノシン5'-三リン酸(50mg, 0.08mmol, 1当量)を2mLの水に溶解し、１当量
の過ヨウ素酸ナトリウム(18mg, 0.08mmol)を加える。ついで上記溶液を３５分攪
拌する。2mLの水(pH=9.5-10)に溶解したグリシン(31mg, 0.42mmol, 5当量)を加
え、溶液のpHを固体の炭酸カリウムで9.5-10に上げる(pHペーパーでモニターす
る)。上記溶液を４５分攪拌する。水素化ホウ素ナトリウム(全部で8mg, 0.21mmo
l, 2.5当量)を、６の等量の部分で加え、それぞれを0.1mLの水に溶解する。それ
ぞれ添加の直前に溶解した他の部分を、１時間おきに加える。一晩放置した後、
上記溶液を1Mギ酸を加えることによってpH4-5に中和し、ついで蒸発させる。

【００８８】 1mL/分の流速で、以下の条件の下でのギ酸アンモニウムの勾配を溶出液として
使用して、SFCC PVDI 31カラム(5μm, 100×4.6mm)で、逆相極性（システムＥ）
のクロマトグラフィーによる分析を実施する：ｔ（分） 25mM ＡＦ 1M ＡＦ（％）（％）０１０００３１０００１００１００１５０１００１７１０００

【００８９】これにより、３９％の収率が示された(k'=5.5)。

【００９０】化合物５を、システムＦ：Vydac Sax-Proteinカラム(8μm, 100×4.6mm)；流
速：10mL/分；溶媒：以下の条件の下でのギ酸アンモニウムの勾配を使用する予
備的ＨＰＬＣにより精製する：ｔ（分） 25mM ＡＦ 1M ＡＦ（％）（％）０１０００３１０００１００１００１５０１００１７１０００ 14mgの化合物５が得られ、26.1%の収率である。

【００９１】特徴付け：

【数５】

【００９２】実施例４：4-(カルボキシメチル)-2-(シトシン-1-yl)-6-(ヒドロキシメチル)モ
ルホリン6-三リン酸（モルホリノＣグリシン）６の合成化合物６は、Ｒ¹＝シトシンで、Ｒ²＝−ＣＨ₂−ＣＯＯＨを有する式（Ｉ）に
相当する。

【００９３】全ての反応は、20mLの丸底フラスコ中で磁性攪拌しながら環境温度で実施され
る。

【００９４】シトシン5'-三リン酸(50.0mg, 0.09mmol, 1等量)、過ヨウ素酸ナトリウム(21m
g, 0.09mmol, 1等量)、2mLの水(pH=9.5-10)に溶解したグリシン(36mg, 0.48mmol
, 5等量)、並びにそれぞれ0.05mLの水に６の等量部分で加えられる水素化ホウ素
ナトリウム(全部で9mg,0.23mmol, 2.5等量)で開始して、反応を化合物５と同様
に実施する。

【００９５】実施例３と同様のイオン交換相カラム（システムＥ）でのクロマトグラフィー
による分析により、利用率k'=4.08が示される。

【００９６】この製品を、実施例３と同様にシステムＦを使用して半予備的ＨＰＬＣにより
精製する。

【００９７】 17mgの製品が単離され、その収率は24.3%に相当する。

【００９８】特徴付け：

【数６】

【００９９】実施例５：4-(アミノブチル)-2-(アデノシン-9-yl)-6-(ヒドロキシメチル)モル
ホリン6-三リン酸（モルホリノＡプトレッシン）７の合成このモルホリノＡプトレッシン７は、Ｒ¹がアデニンを表し、Ｒ²が−(ＣＨ₂)₄ −ＮＨ₂基を表す式（Ｉ）に相当する。

【０１００】全ての反応は、100mLのフラスコ中で磁性攪拌しながら環境温度で実施される
。

【０１０１】アデノシン5'-三リン酸(500mg, 0.9mmol, 1当量)を10mLの水に溶解し、１当量
の過ヨウ素酸ナトリウム(194mg, 0.9mmol)を加える。ついで上記溶液を４５分攪
拌する。

【０１０２】プトレッシン(456μL, 4.5mmol, 5等量)を加える。上記溶液を４５分攪拌する
。反応混合物は黄色を呈する。

【０１０３】 0.1mLの水に溶解した水素化ホウ素ナトリウム(全部で86mg, 2.3mmol, 2.5当量
)の６分の１を、上記溶液に加える。気体の発生が生じる。それぞれ添加の直前
に溶解した他の６等分を、１時間おきに加える。

【０１０４】一晩放置した後、上記溶液を1Mギ酸を加えることによってpH4-5に中和し、つ
いで蒸発させる。

【０１０５】 1mL/分の流速と、溶出液として以下の条件の下で25mMＴＥＡＢ／ＭｅＯＨ勾配
を使用する、Merck LiChrocart 125-4 LiChrospher 100 RP-18カラム("endcappe
d", 5μm, 125×4mm)で、逆相極性のクロマトグラフィーによる分析を実施する
：ｔ（分）ＴＥＡＢＭｅＯＨ（％）（％）０９７３２９７３１０９０１０１５９０１０１７９７３

【０１０６】この分析により、６７％の収率が示される(k'=3.81)。

【０１０７】製品７を、4mL/分の流速で、以下の条件の下で25mM ＴＥＡＢ／ＭｅＯＨ勾配
を溶出液として使用するPhenomenex Ultremex 5-C18カラム(250×10mm)での半予
備的ＨＰＬＣにより精製する：ｔ（分）ＴＥＡＢＭｅＯＨ（％）（％）０９５５３９５５８９０１０１０９５５

【０１０８】特徴付け：

【数７】

【０１０９】実施例６：4-(アミノブチル)-2-(チミジン-1-yl)-6-(ヒドロキシメチル)モルホ
リン6-三リン酸（モルホリノプトレッシン）９の合成化合物９は、Ｒ¹＝チミン、Ｒ²＝−(ＣＨ₂)₄−ＮＨ₂を有する式（Ｉ）に相当
する。

【０１１０】ａ）4-(アミノブチル)-2-(チミジン-1-yl)-6-(ヒドロキシメチル)モルホリノ-6-
ヒドロキシル８の調製全ての反応は、250mLの丸底フラスコ中で磁性攪拌しながら環境温度で実施さ
れる。

【０１１１】リボチミジン(2.000g, 7.74mmol, 1等量)を30mLの水に溶解し、１等量の過ヨ
ウ素酸ナトリウム(1.656, 7.75mmol)を加える。ついで上記溶液を７０分攪拌す
る。プトレッシン(3.9mL, 38.75mmol, 5等量)を加える。上記溶液を５０分攪拌
する。反応混合物は黄色を呈する。

【０１１２】 0.25mlの水に溶解した水素化ホウ素ナトリウム(全部で735mg, 19.42mmol, 2.5
当量)の６分の１を、上記溶液に加える。気体の発生が生じる。それぞれ0.25mL
の水に添加の直前に溶解した他の６等分を、１時間おきに加える。

【０１１３】一晩放置した後、上記溶液を1Mギ酸を加えることによってpH4-5に中和し、つ
いで蒸発させる。システムＧ：Merck LiChrocart 125-4 LiChrospher 100 RP-18
カラム("endcapped, 5μm, 125×4mm)；流速1mL/分；溶出液：以下の条件の下で
の25mM ＴＥＡＢ／ＣＨ₃ＣＮ勾配を使用して、逆相極性のクロマトグラフィーに
よる分析を実施する：ｔ（分）ＴＥＡＢＣＨ₃ＣＮ（％）（％）０１０００４１０００１５８５１５１８１０００

【０１１４】これにより、７６％の収率が示される(k'=5.7)。

【０１１５】システムＨ：Macherey Nagel Nucleosil 7 C-18カラム(7μm, 250×21mm)；流
速：10mL/分；溶出液：25mMＴＥＡＢ／ＣＨ₃ＣＮ[85/15]を使用する、予備的Ｈ
ＰＬＣによって製品を精製する。

【０１１６】 1.56gの化合物８、すなわち６４．６％の収率が得られる。

【０１１７】特徴付け：

【数８】

【０１１８】ｂ）4-(アミノブチル)-2-(チミジン-1-yl)-6-(ヒドロキシメチル)モルホリノ6-
リン酸９の調製モルホリノチミジン／プトレッシン８(249mg, 0.80mol, 1等量)を、１時間ベ
ーンポンプを使用して乾燥する。256mgのProton-sponge（登録商標）(1.19mmol,
1.5等量)を加え、2mLの無水リン酸トリメチルを加える；媒体を攪拌しながら氷
冷バスに配置し、109μLのリンオキシクロリドを加える(全部で2.24mmol, 2.8等
量)。２時間３０分後、さらに50mLのリンオキシクロリドを加え、この操作を１
２時間後に繰り返す。次に、無水ＤＭＦ中のトリブチルアンモニウム塩(4.0mmol
, 5等量)の形態のピロリン酸塩の0.5M溶液を8mL加える。上記混合物を０℃で１
分間攪拌し、ついで媒体をローター乾燥機とベーンポンプで乾燥する。

【０１１９】システムＩ：Vydac Sax-Proteinカラム(8μm, 100×4.6mm)で10mL/分の流速で
、以下の条件でのギ酸アンモニウムの勾配を溶出液として使用する逆相極性のク
ロマトグラフィーによる分析を実施する：ｔ（分）ＴＥＡＢＭｅＯＨ（％）（％）０１０００１１０００１５７０３０１７１０００

【０１２０】これにより、利用率k'=3.2が示される。

【０１２１】製品を、上述のシステムＩを使用する予備的ＨＰＬＣにより精製する。

【０１２２】 48mgの８が得られ、すなわち１３．２％の収率である。

【０１２３】特徴付け：

【数９】

【０１２４】実施例７：4-(アミノブチル)-2-(グアノシン-9-yl)-6-(ヒドロキシメチル)モル
ホリン6-三リン酸（モルホリノＧプトレッシン）１０の合成化合物１０は、Ｒ¹＝グアニンで、Ｒ²＝−(ＣＨ₂)₄−ＮＨ₂を有する式（Ｉ）
に相当する。

【０１２５】全ての反応は、50mLの丸底フラスコ中で磁性攪拌しながら環境温度で実施され
る。

【０１２６】グアノシン5'-三リン酸(50mg, 0.17mmol, 1当量)を5mLの水に溶解し、１当量
の過ヨウ素酸ナトリウム(37mg, 0.17mmol)を加える。ついで上記溶液を３０分攪
拌する。

【０１２７】プトレッシン（85μL, 0.84mmol, 5等量)を加え、上記溶液のpHを測定し、１
０にあわせる。もしより低い値が見出されるのであれば、炭酸カリウムを加えて
この値を得る。上記溶液を４５分攪拌する。

【０１２８】水素化ホウ素ナトリウム(全部で8.7mg, 0.45mmol, 2.5当量)を、６の等量の部
分で加え、それぞれを0.1mLの水に溶解する。

【０１２９】それぞれ添加の直前に溶解した他の部分を、１時間おきに加える。

【０１３０】一晩放置した後、上記溶液を1Mギ酸を加えることによってpH4-5に中和し、つい
で蒸発させる。

【０１３１】化合物１０を、メタノールから沈降し、引き続きＮａ⁺形態のDowex樹脂の5mL
を通過させることによって精製する。

【０１３２】 68mgの化合物１０が得られ、すなわち６２．２％の収率である。

【０１３３】特徴付け：

【数１０】

【０１３４】実施例８：4-(アミノブチル)-2-(シトシン-1-yl)-6-(ヒドロキシメチル)モルホ
リン6-三リン酸（モルホリノＣプトレッシン）１１の合成全反応は、50mLの丸底フラスコ中で磁性攪拌しながら環境温度で実施される。

【０１３５】シトシン5'-三リン酸(50mg, 0.09mmol, 1等量)、過ヨウ素酸ナトリウム(20mg,
0.09mmol, 1等量)、プトレッシン(47μm, 0.47mmol, 5等量)、並びにそれぞれ0
.1mLの水に６の等量部分で加えられる水素化ホウ素ナトリウム(全部で9.1mg,0.2
4mmol, 2.5等量)で開始して、反応を化合物７と同様に実施する。

【０１３６】システムＯ：Merck LiChrocart 125-4 LiChrospher 100 RP-18カラム("endcap
ped, 5μm, 125×4mm)；流速：1mL/分；溶出液：以下の条件の下で25mM ＴＥＡ
Ｂ／ＭｅＯＨ勾配を使用する、逆相極性のクロマトグラフィーにより分析を実施
する：ｔ（分） 25mM TEAB ＭｅＯＨ（％）（％）０９７３２９７３１０９０１０１５９０１０１７９７３利用率k'=4.18が示される。

【０１３７】化合物１１を、メタノールから沈降し、引き続きＮａ⁺形態のDowex樹脂の5mL
を通過させることによって精製する。

【０１３８】 47mgの化合物１１が得られ、すなわち８５．４％の収率である。

【０１３９】特徴付け：

【数１１】

【０１４０】実施例９：4-[5((2-アミノブチル)-(チオウレイジル)フルオレセイン)]-2-(アデ
ノシン-9-yl)-6-(ヒドロキシメチル)モルホリン6-三リン酸（モルホリノＡプト
レッシン−フルオレセイン）１２の合成この化合物１２は、Ｒ¹がアデニンを表し、Ｒ²が(ＣＨ₂)₄ＮＨＲ³基（Ｒ³はフ
ルオレセインから由来する基である）を有する式（Ｉ）に相当する。

【０１４１】全ての反応は、100mLのフラスコ中で磁性攪拌しながら環境温度で実施される
。

【０１４２】 184.9mg(0.5mmol, 1.5等量)のフルオレセインイソチオシアネートを、水／ピ
リジン混合物(1/1)中で、実施例５のモルホリノＡプトレッシン７の200mg(0.3mm
ol, 1等量)の３の部分に段階的に加える。媒体を４８時間攪拌し、乾燥状態に蒸
発する。

【０１４３】 1mL/分の流速と、溶出液として25mMＴＥＡＡ／ＭｅＯＨ[97/3]を使用する、Me
rck LiChrocart 125-4 LiChrospher 100 RP-18カラム("endcapped, 5μm, 125×
4mm)で、逆相極性のクロマトグラフィーによる分析により、約４８％の収率が示
される(k'=7.51)。

【０１４４】精製：これは、逆相極性のC-18シリカのカラムでの「フラッシュ」クロマトグラ
フィーにより実施される(Econosil prep 90, Alltech, France)。溶出液は、水
／ＭｅＯＨ勾配である。

【０１４５】特徴付け：

【数１２】

【０１４６】実施例１０：4-[5(((2-アミノブチル)-(チオウレイジル)フルオレセイン)-1-2-(
チミジン-1-yl)-6-(ヒドロキシメチル)モルホリン6-三リン酸（モルホリノプト
レッシン−フルオレセイン）１３の合成全ての反応は、25mLの丸底フラスコ中で磁性攪拌しながら環境温度で実施され
る。

【０１４７】 31mg(0.08mmol, 1.5等量)のフルオレセインイソチオシアネートを、水／ピリ
ジン混合物の2mL(1/1)中に溶解した化合物９の30mg(0.05mmol, 1等量)の３の部
分に段階的に加える。媒体を４８時間攪拌し、乾燥状態に蒸発する。

【０１４８】逆相極性のカラム（システムＬ）：Macherey Nagel Nucleosil 7 C-18カラム(
7μm, 250×21mm)；流速：10mL/分；溶出液：以下の条件の下での25mM ＴＥＡＢ
／ＣＨ₃ＣＮでの、高速液体クロマトグラフィーによって、化合物を１３を精製
する：ｔ（分）ＴＥＡＢＣＨ₃ＣＮ（％）（％）０１０００４１０００１５７３２７１８１０００

【０１４９】特徴付け：

【数１３】

【０１５０】実施例１１：4-[5(((2-アミノブチル)-(チオウレイジル)フルオレセイン)]-2-(
グアノシン-9-yl)-6-(ヒドロキシメチル)モルホリン6-三リン酸（モルホリノＧ
プトレッシンフルオレセイン）１４の合成全ての反応は、25mLの丸底フラスコ中で磁性攪拌しながら環境温度で実施され
る。

【０１５１】 30mg(0.08mmol, 1.5等量)のフルオレセインイソチオシアネートを、水／ピリ
ジン混合物の2mL(1/1)中に溶解した化合物１０の30mg(0.05mmol, 1等量)の３の
部分に段階的に加える。媒体を４８時間攪拌し、乾燥状態に蒸発する。

【０１５２】システムＭ：Merck LiChrocart 125-4 LiChrospher 100 RP-18カラム("endcap
ped, 5μm, 125×4mm)；流速1mL/分；溶出液：以下の条件の下での25mM ＴＥＡ
Ｂ／ＣＨ₃ＣＮ勾配を使用して、逆相極性のクロマトグラフィーによる分析を実
施する：ｔ（分）ＴＥＡＢＣＨ₃ＣＮ（％）（％）０１０００４１０００１５７３２７１８１０００これにより、約２４％の収率が示される(k'=4.62)。

【０１５３】化合物１４は、実施例１０のシステムＬを使用する逆極性のカラムでの高速液
体クロマトグラフィーにより精製される。

【０１５４】 14.5mgの化合物１４が得られる、すなわち３０．０％の収率である。

【０１５５】特徴付け：

【数１４】

【０１５６】実施例１２：4-[5(((2-アミノブチル)-(チオウレイジル)フルオレセイン)]-2-(
シトシン-1-yl)-6-(ヒドロキシメチル)モルホリン6-三リン酸（モルホリノＣプ
トレッシン−フルオレセイン）１５の合成全反応は、10mLの丸底フラスコ中で磁性攪拌しながら環境温度で実施される。

【０１５７】 36mg(0.09mmol, 1.5等量)のフルオレセインイソチオシアネートを、水／ピリ
ジン混合物の2mL(1/1)中に溶解した化合物１０の30mg(0.05mmol, 1等量)の３の
部分に段階的に加える。媒体を４８時間攪拌し、乾燥状態に蒸発する。

【０１５８】逆相極性のクロマトグラフィー（実施例１１に記載されたシステムＭ）による
分析により、利用率k'=4.7が示される。

【０１５９】化合物１５を、逆相極性のカラム（実施例１０のシステムＬ）での半予備的高
速液体クロマトグラフィーにより精製する。

【０１６０】 22.7mgの化合物１５が得られる、すなわち４４．３％の収率である。

【０１６１】特徴付け：

【数１５】

【０１６２】実施例１３：ＤＮＡ配列の分析のためのモルホリノＴグリシンの使用実施例２のモルホリノＴグリシンを、BluescriptプラスミドＤＮＡ(Stratagen
e, La Jolla, CA, USA)であるスタンダードテンプレート上の蛍光プライマー(Ap
plied Biosystems, Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA)を使用して連続反応
において試験する。使用される酵素は、Ｔａｑポリメラーゼ(Perkin-Elmer)であ
り、そのバッファーにおいて使用される（TACSバッファー, Perkin-Elmer）。

【０１６３】二つの反応を、２００および５００μMでモルホリノＴグリシンで実施し（表
４）、さらにジデオキシヌクレオチドＴ(Boehringer)を使用してコントロール反
応を実施する（表５）。

【０１６４】 10μLの全量の反応媒体は、125ngのテンプレート、1.25pmolの蛍光プライマー
、および表４と５に示された他の構成成分を含む。上記媒体を熱サイクルにかけ
、新たに形成されるＤＮＡ鎖の多くの分子を生産する。Perkin-Elmer 9700機で
の増幅を、以下の連続に従って実施する：３分、９５℃；１５サイクル（１５秒
、９５℃；１５秒、５５℃；１分、７０℃）；１５サイクル（１５秒、９５℃；
１分７０℃）。増幅産物を、Sephadex G50カラムで精製する。

【０１６５】カラム溶出液中で得られた増幅産物の移動を、Applied Biosystems 377機にお
いて、１×ＴＢＥ中でLong Rangerタイプ（６％）のアクリルアミドの変性ゲル
（７Ｍ尿素）で実施する。電気泳動を、1500Vの下で１２時間実施する。

【０１６６】この場合、チミジン三リン酸を欠失した４種の天然のヌクレオシド三リン酸の
混合物（ｄＴＴＰミックスと称される）を表すヌクレオチドのストック溶液の調
製を、以下の態様で実施する。

【０１６７】 1.25mMのｄＴＴＰの溶液(Promega)2μLを、2μLの5mM ｄＡＴＰ(Promega)、2
μLの5mM ｄＣＴＰ(Promega)および2μLの5mM ｄＧＴＰ(Promega)と混合する。

【０１６８】

【表４】

【０１６９】

【表５】

【０１７０】配列決定反応の産物を、蛍光によって検出する。得られた結果は、添付した図
面に表されており、それらは、Perkin-Elmer Analysisソフトウェアー、バージ
ョン３．０によって分析された配列決定ゲル中の産物の検出を説明する。

【０１７１】各試験について、プライマーは、コントロール反応250μmジデオキシチミジン
三リン酸についてＲＯＸラベル（赤色）（破線の曲線）、および200μmモルホリ
ノＴグリシンに関する反応についてＪＯＥラベル（緑色）（実線）という、蛍光
特性によって同定可能である。

【０１７２】図に示されているように、モルホリノＴグリシンがＴａｑポリメラーゼによっ
て塩基特異的な態様で正確に取り込まれ、鎖伸長停止因子として正確に機能する
ため、これらの試験の結果は完全に決定的である。

【０１７３】他の３種のモルホリノ−ヌクレオシド１，５および６を同じ態様で使用し、分
析される断片中の４種のＤＮＡ塩基の位置を決定することが可能である。

【０１７４】実施例１４：配列決定におけるモルホリノＡプトレッシンとモルホリノＡフルオ
レセインの試験モルホリノＡプトレッシン（ＭＡＴＴＰ）７とモルホリノＡフルオレセイン（
ＭＡＴＰＰＦ）１２を、BluescriptプラスミドＤＮＡ(Stratagene, La Jolla, C
A, USA)であるスタンダードテンプレート上の蛍光プライマー(Applied Biosyste
ms, Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA)を使用する配列決定反応において試
験する。使用される酵素は、Ｔａｑポリメラーゼ(Perkin-Elmer)であり、そのバ
ッファー(Thermo Sequenaseバッファー, Amersham Life Science)において使用
される。

【０１７５】２５０μMの濃度でジデオキシヌクレオチドｄｄＡＴＰを使用するコントロー
ル反応とともに、１００，２００および４００μMのＭＡＴＴＰで３種の配列決
定反応を実施し、２００，５００，１０００および５０００μMのＭＡＴＰＰＦ
で４種の配列決定反応を実施する。

【０１７６】 10μLの全量の反応媒体は、125ngのテンプレート、1.25pmolの蛍光プライマー
、および表に記載されたような他の構成成分を含む。

【０１７７】上記媒体は、熱サイクルにかけられ、新たに形成されたＤＮＡ鎖の多くの分子
を生産する。Perkin-Elmer 9700機(Gene Amp（登録商標）, PCR System 9700)で
の増幅を、以下の配列に従って実施する： MATTP7 :３分、９５℃；３０サイクル（１５秒、９５℃、１５秒、５５℃；１
分、７０℃） MATPPF12:３分、９５℃；３０サイクル（１５秒、９５℃、１５秒、５５℃；４
分、６０℃）。

【０１７８】増幅産物を、Sephadex G50カラムで精製する。各配列決定反応の産物を、コン
トロール反応の産物と混合し、電気泳動によって分析する。

【０１７９】得られた混合物の移動を、Applied Biosystems 377機(ABI Prism DNA Sequenc
er, Perkin-Elmer)で、１×ＴＢＥ中でのLong Rangerタイプ（６％）のアクリル
アミドの変性ゲル（７Ｍ尿素）で実施する。電気泳動を１６８０Ｖ、５０ｍＡの
下で７時間実施する。

【０１８０】１６種の反応のためのヌクレオチド：ｄＡＴＰミックスのストック溶液の調製この場合、デオキシアデノシン三リン酸が欠失した４種の天然のヌクレオチド
三リン酸の混合物（ｄＡＴＰミックスと称される）を表すヌクレオチドのストッ
ク溶液の調製を、以下の態様で実施する。1.25mMのｄＡＴＰの溶液(Promega)4μ
Lを、4μLの5mM ｄＴＴＰ(Promega)、4μLの5mM ｄＣＴＰ(Promega)および4μL
の5mM ｄＧＴＰ(Promega)と混合する。

【０１８１】

【表６】

【０１８２】ＭＡＴＰＰ７の2mMストック溶液の調製 1.17mgのＭＡＴＰＰ７を、1.04mLのＨ₂Ｏで希釈する。

【表７】

【０１８３】

【表８】

【０１８４】ＭＡＴＰＰＦ１２の20mMおよび2mMストック溶液の調製 20mMの溶液Ｓ₀：110.5μLのＨ₂Ｏでサンプル(2.2mg)を希釈する； 2mMの溶液Ｓ₁：10μLのＳ₀を取り、90μLのＨ₂Ｏを加える。

【０１８５】

【表９】

【０１８６】

【表１０】

【０１８７】

【表１１】

【０１８８】第９０から第２５０塩基の間で、100μMのモルホリノＡプトレッシン７と5mM
のモルホリノＡフルオレセイン１２で得られた結果が、図２に示されている。

【０１８９】かくして、二つの誘導体は、鎖伸長停止因子として実際に機能することが見出
される。さらに、蛍光誘導体、モルホリノＡフルオレセインを使用して実施され
た反応は、この誘導体によって有される蛍光分子によって検出されたことに注意
すべきである：蛍光鎖伸長停止因子がかくして調製された。

【０１９０】実施例１５：ＤＮＡ断片のテンプレート依存性３’ラベリングのための、モルホ
リノＡプトレッシン（ＭＡＴＰＰ）とモルホリノＡフルオレセイン（ＭＡＴＰＰ
Ｆ）の使用；３種のポリメラーゼ（Ｔａｑ，Ｋｅｌｎｏｗ，ＫｌｅｎｏｗＥｘ
ｏＦｒｅｅ）と逆転写酵素によるこれらの化合物の酵素的取り込みの試験これらの２種のヌクレオシド三リン酸誘導体を、オリゴヌクレオチド１３塩基
長をその３’末端でラベルするための酵素的取り込みにおいて試験する。使用さ
れる酵素が、Watson & Clickルールに従ってオリゴヌクレオチドに亘る相補的鎖
を必要とするため、このラベリングは、「テンプレート依存性」と称される。配
列Ａ(17870pmol/mL)とその相補的標的Ｃ(16128pmol/mL)は、以下の図に示される
：標的Ｃ： 3'-TGC CAA CCA ACC CCA CCT CAA CCT CTG-5' プライマーＡ： 5'-ACG GTT GGT TGG G (13bp) 予測断片および長さ(bp)：5'-ACG GTT TGG GGT GGA (18bp) 5'-ACG GTT GGT TGG GGT GGA GTT GGA (24bp) 5'-ACG GTT GGT TGG GGT GGA GTT GGA GA (26bp)) 5'-ACG GTT GGT TGG GGT GGA GTT GGA GAC (27bp)

【０１９１】３種の酵素を、このラベリングのために使用する：ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ(Boehringer Mannheim)、Ｋｌｅｎｏｗ断片(Boehringer Mannheim)およびＫｌ
ｅｎｏｗエキソヌクレアーゼフリーポリメラーゼ(Amersham Life Science)。"Re
ady to go" T4 Polynucleotide Kinaseキット(Pharmacia Biotech)を使用して、 ³² Ｐリン酸塩の取り込みにより、５’末端でプライマーをラベルする。放射性ラ
ベルプライマーは、Ａ^★と記載される

【０１９２】３種の酵素のための反応バッファーが、１０種の反応のために調製される：

【表１２】

【表１３】

【０１９３】ついで酵素を、１０種の反応のために以下の態様で希釈する： − Ｔａｑ(5U/μL)：10×0.1μLのＴａｑ＋10×15.5μLのＨ₂Ｏ； − Ｋｌｅｎｏｗ(20U/μL)：10×0.1μLのＫｌｅｎｏｗ＋10×15.5μLのＨ₂Ｏ
； − ＫｌｅｎｏｗＥｘｏＦｒｅｅ(5U/μL)：10×0.1μLのＫｌｅｎｏｗＥ
ｘｏＦｒｅｅ＋10×15.5μLのＨ₂Ｏ。

【０１９４】通常のヌクレオシド三リン酸を含む溶液もまた調製する： − それぞれ0.1mMのｄＧＴＰとｄＴＴＰの混合物より成る溶液「２Ｐ］； − それぞれ0.1mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの混合物よ
り成る溶液「４Ｐ」

【０１９５】実施反応は、以下の表１４に記載される：

【表１４】

【０１９６】かくしてモルホリノＡプトレッシンを、４００，２００および５０μＭの３種
の濃度で試験し、一方モルホリノＡフルオレセインを、２．５ｍＭ、４００，２
００および５０ｍＭで反応する。

【０１９７】酵素を添加する前に、混合ｂつうを９４℃で５分変性する。ついでハイブリダ
イゼーションが生じるように環境温度に戻して放置する。Ｔａｑについて７０℃
で、二つのＫｌｅｎｏｗ断片について３７℃で、１０分間伸長を実施する。最後
に媒体を再びホルムアミド溶液で変性し、９０℃で５分加熱し、その後ポリアク
リルアミドゲルに配置する。２０００Ｖでの電気泳動による分離を実施する。リ
ン酸基イメージャーを使用してゲルを読みとる；得られた結果が図３に示される
。

【０１９８】この図において、レーン１は、ラベル化オリゴヌクレオチドＡの移動コントロ
ールとして機能する。このオリゴヌクレオチドは、１３塩基（１３マー）の長さ
を有する。レーン２，３および４は、オリゴヌクレオチドＡノシン町とモルホリ
ノＡプトレッシンの取り込みがモニターできるように機能する。これらの条件の
下で、ヌクレオチドｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（溶液「Ｐ２」）のみが加えられ、
プライマーの伸長を実施するための酵素によって使用できる。反応媒体中のモル
ホリノＡプトレッシンの存在により、塩基１８のレベルで取り込みが可能である
。「２Ｐ」混合物のみを媒体に配置して、コントロールを実施した；この場合、
重合を継続するアデノシン誘導体を有さないため、第１７塩基まで酵素は伸長を
継続する。かくして、１７塩基長であるこのコントロールと、反応２，３および
４の間の移動の差異は、ＭＡＴＰＰの取り込み、および鎖の伸長の中断を確認す
る。反応５から８は、モルホリノＡフルオレセインを使用する同様な反応に相当
する。ここでまた、ＭＡＴＰＰＦは実際に取り込まれ、相補的な鎖の重合を停止
する。しかしながら二つのＫｌｅｎｏｗ断片については、モルホリノ誘導体の代
わりに別の塩基（ＧまたはＴ）の偶然的な取り込みが存在することに注意すべき
である。特にこの場合、１８マーおよび２４マーに相当する伸長産物が見出され
る。

【０１９９】ウェル９（図４参照）は、コントロール反応である：反応媒体は４種の通常の
でオキシヌクレオシドを含み、最大の伸長まで、つまり２７マーが得られるまで
、プライマーを最終的に伸長できる。

【０２００】結論として、３種の酵素は、最も小さい濃度を含む、全ての試験された濃度に
おいて、モルホリノＡプトレッシンとモルホリノＡフルオレセインを取り込む。

【０２０１】オリゴヌクレオチドの伸長の過程でモルホリノヌクレオチド誘導体を取り込む
逆転写酵素の能力を確認した。この試験において、逆転写酵素(M-MLV, Promega;
活性：200000I/mL)をモデルとして選択する。この酵素は、ヌクレオシド三リン
酸の存在下で、オリゴヌクレオチドプライマーから標的鎖（ＤＮＡまたはＲＮＡ
）に相補的なＤＮＡ鎖を合成可能である。モルホリノＡプトレッシンとモルホリ
ノＡフルオレセインがかくして、250μMの最終濃度で試験される。コントロール
コピーもまた、「４Ｐ」溶液の４種のヌクレオシド三リン酸で、ゲル上に試験さ
れる。

【０２０２】標的Ｃ（２７マー、16128pmol/mL）の配列およびプライマーＢ(１４マー、563
68pmol/mL)の配列が以下に示される。放射性活性ラベルされるこのプライマーＢ
はＢ^★と記載される。

【０２０３】かくして溶液Ｂ^★は、50μLの容量で10pmolのプライマーＢを含む。Ｃおよび
Ｂの溶液はまた、１０倍に希釈される；これらの溶液はそれぞれＣ／１０および
Ｂ／１０と記載される。標的Ｃ：3'-TGC CAA CCA ACC CCA CCT CAA CCT CTG-5' プライマーＢ：5'-ACG GTT GGT TGG GG (14bp)

【０２０４】

【表１５】

【０２０５】上述のように、酵素の添加前に９４℃で５分で混合物を変性し、環境温度に冷
却する。伸長を３７℃で６０分実施する。媒体をホルムアミド溶液で変性し、９
０℃で５分加熱し、その後ポリアクリルアミドゲルに乗せる。分離を１５００Ｖ
での電気泳動によって実施する。リン酸基イメージャーを使用して、ゲルを読み
とる；得られた結果が図４に示される。

【０２０６】この図において、レーン４は、ラベル化プライマーＢの長さを確認可能である
。レーン３は、４種の天然のでオキシヌクレオチドの存在下で、２７塩基対の最
終産物までのプライマーＢの最大の伸長を示す。反応１および２は、モルホリノ
誘導体が逆転写酵素によりプライマーＢの伸長の過程で取り込まれることを示す
。この取り込みは定量的であり、１８塩基対の産物を生ずる（モルホリノ誘導体
の不存在下では、伸長は第１７塩基でブロックされる）。

【０２０７】結論として、モルホリノ誘導体は、逆転写酵素によって非常によく認識され、
塩基特異的な方法で伸長の間プライマー内に取り込まれる。

【０２０８】

【参考文献】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の鎖伸長停止因子（実線の曲線）、および従来
技術の鎖伸長停止因子（破線の曲線）を有する、プラスミドＤＮＡの配列決定に
ついて得られた結果を説明する図である。

【図２】図２は、配列決定において、モルホリノＡプトレッシン（ＭＡ
ＴＰＰ）およびモルホリノＡフルオレセイン（ＭＡＴＰＰＦ）を試験することに
よって得られた結果を説明する図である。

【図３】図３は、オリゴヌクレオチドＡの伸張と、モルホリノＡプトレ
ッシンの取り込みをモニターするための試験の、ポリアクリルアミドゲルでの結
果を説明する図である。

【図４】図４は、プライマーＢの伸張と、モルホリノ誘導体の取り込み
をモニターするための試験の、ポリアクリルアミドゲルでの結果を説明する図で
ある。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１月３０日（２００１．１．３０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【化１】 [式中、Ｒ¹は核酸塩基を表し、Ｒ²は以下の式： −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂ −（ＣＨ₂）_n−ＳＨ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＳＲ³ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＯＲ³ {式中、ｎは１から１２の範囲の整数であり、Ｒ³は核酸断片の３’ＯＨ末端で、
ラベル、タンパク質、酵素、脂肪酸、またはペプチドから由来する基である} の一つに対応する基を表す] の化合物を有するヌクレオチド誘導体の酵素的取り込みを含む、3'-ラベル化核
酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）断片を製造する方法。

【化２】 [式中、Ｒ¹は核酸塩基を表し、Ｒ²は以下の式： −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＳＲ³ −（ＣＨ₂）_n−ＯＲ³ {式中、ｎは１から１２の範囲の整数であり、Ｒ³は、光架橋剤、脂肪酸、疎水性
ペプチド、抗体、酵素および蛍光分子から選択される化合物を表す} の一つに対応する基を表す] に相当する化合物を有する修飾されたモルホリノヌクレオチドを、３’末端で酵
素的に取り込むことによる、核酸断片を修飾する方法。

【化３】 [式中、Ｒ¹は核酸塩基を表し、Ｒ²は以下の式： −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂ −（ＣＨ₂）_n−ＳＨ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＳＲ³ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＯＲ³ {式中、ｎは１から１２の範囲の整数であり、Ｒ³は、ラベル、タンパク質、酵素
、脂肪酸、またはペプチドから由来する基である} の一つに対応する基を表す] の化合物を有する方法。

【化４】の一つに対応する、請求項１から５のいずれか一項記載の方法。

【化５】 [式中、Ｒ¹がアデニンであり、Ｒ²が−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ₂
、または−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ−Ｒ³（式中、Ｒ³はフルオレセインから由来する基
を表す）を表す] に対応するモルホリノ−ヌクレオチド。

【化６】 [式中、Ｒ¹がチミンであり、Ｒ²が−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ₂、
または−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ−Ｒ³（式中、Ｒ³はフルオレセインから由来する基を
表す）を表す] に対応するモルホリノ−ヌクレオチド。

【化７】 [式中、Ｒ¹がシトシンであり、Ｒ²が−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ₂
、または−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ−Ｒ³（式中、Ｒ³はフルオレセインから由来する基
を表す）を表す] に対応するモルホリノ−ヌクレオチド。

【化８】 [式中、Ｒ¹がグアニンであり、Ｒ²が−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ₂
、または−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ−Ｒ³（式中、Ｒ³はフルオレセインから由来する基
を表す）を表す] に対応するモルホリノ−ヌクレオチド。

【化９】 [式中、Ｒ¹は核酸塩基を表し、Ｒ²は以下の式： −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂ −（ＣＨ₂）_n−ＳＨ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＳＲ³ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＯＲ³ {式中、ｎは１から１２の範囲の整数であり、Ｒ³は、ラベル、タンパク質、酵素
、脂肪酸、またはペプチドから由来する基である} の一つに対応する基を表す] のモルホリノ−ヌクレオシドを生産する方法であって、以下の式：

【化１０】 [式中、Ｒ¹は上述の意味を有する] のヌクレオシド三リン酸を、過ヨウ素酸塩、式Ｒ²ＮＨ₂[式中、Ｒ²は上述の意味
を有する]の化合物、および水素化ホウ素ナトリウムを反応させる方法。

【化１１】 [式中、Ｒ¹は核酸塩基を表し、Ｒ²は以下の式： −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂ −（ＣＨ₂）_n−ＳＨ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＳＲ³ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＯＲ³ {式中、ｎは１から１２の範囲の整数であり、Ｒ³は、ラベル、タンパク質、酵素
、脂肪酸、またはペプチドから由来する基である} の一つに対応する基を表す] のモルホリノ−ヌクレオシドの使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者シルヴィー・ソウヴェイゴフランス・Ｆ−38320・エルベイ・ル・ノヤレ（番地なし) (72)発明者ジャン−フランソワ・モーレフランス・Ｆ−38500・クーブルヴィー・モンテ・デュ・ピレ（番地なし) (72)発明者ジャン−ポール・イサルテルフランス・Ｆ−38120・サン−テグレヴ・リュ・デュ・フォールネ・９ (72)発明者ディディエ・モルコフランス・Ｆ−38210・トゥラン・アヴニュ・ドゥ・ラ・ガル・11・レ・ノワイエ・Ａ１・１Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA12 DA13 DA14 FB01 FB02 FB05 FB06 FB07 GC15 4B024 AA11 AA20 BA80 CA01 CA11 HA19 4B063 QA13 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR35 QR42 QR56 QR62 QR66 QS03 QS25 QS34 QS36 QX02 QX07 4B064 AF27 CA21 DA13

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】前駆体として、以下の式：【化１】 [式中、Ｒ¹は核酸塩基を表し、Ｒ²は以下の式： −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂ −（ＣＨ₂）_n−ＳＨ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＳＲ³ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＯＲ³ {式中、ｎは１から１２の範囲の整数であり、Ｒ³は核酸断片の３’ＯＨ末端で、
ラベル、タンパク質、酵素、脂肪酸、またはペプチドから由来する基である} の一つに対応する基を表す] の化合物を有するヌクレオチド誘導体の酵素的取り込みを含む、3'-ラベル化核
酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）断片を製造する方法。
【請求項２】前駆体として、以下の式：【化２】 [式中、Ｒ¹は核酸塩基を表し、Ｒ²は以下の式： −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＳＲ³ −（ＣＨ₂）_n−ＯＲ³ {式中、Ｒ³は、光架橋剤、脂肪酸、疎水性ペプチド、抗体、酵素および蛍光分子
から選択される化合物を表す} の一つに対応する基を表す] に相当する化合物を有する修飾されたモルホリノヌクレオチドを、３’末端で酵
素的に取り込むことによる、核酸断片を修飾する方法。
【請求項３】鎖伸長停止因子を使用する、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に
相補的な配列の酵素的重合の方法によって、核酸の配列を決定する方法であって
、上記鎖伸長停止因子の少なくとも一つが、前駆体として、以下の式：【化３】 [式中、Ｒ¹は核酸塩基を表し、Ｒ²は以下の式： −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂ −（ＣＨ₂）_n−ＳＨ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＳＲ³ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＯＲ³ {式中、ｎは１から１２の範囲の整数であり、Ｒ³は、ラベル、タンパク質、酵素
、脂肪酸、またはペプチドから由来する基である} の一つに対応する基を表す] の化合物を有する方法。
【請求項４】上記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片である
、請求項１から３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】上記酵素が、好熱性細菌の耐熱性ポリメラーゼ、または末端
トランスフェラーゼ、または逆転写酵素である、請求項１から３のいずれか一項
記載の方法。
【請求項６】上記核酸塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、
ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、および2-アミノプリン、並びにそれら
の誘導体から選択される天然の核酸塩基である、請求項１から５のいずれか一項
記載の方法。
【請求項７】上記Ｒ¹が、以下の式：【化４】の一つに対応する、請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】上記ラベルが、放射性活性製品、発光製品、電気発光製品、
および蛍光製品、他の分子とカップリング可能な分子、抗原−抗体タイプの相互
作用を可能にする分子、並びに酵素的ラベルから選択される、請求項１から７の
いずれか一項記載の方法。
【請求項９】上記Ｒ³が、蛍光分子である、請求項１から７のいずれか一
項記載の方法。
【請求項１０】上記Ｒ³が、フルオレセイン誘導体、ビオチン誘導体、お
よびローダミン誘導体から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】上記誘導体、修飾されたモルホリノ−ヌクレオチド、また
は鎖伸長停止因子が、一リン酸形態の化合物（Ｉ）である、請求項１から３のい
ずれか一項記載の方法。
【請求項１２】以下の式：【化５】 [式中、Ｒ¹がアデニンであり、Ｒ²が−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ₂
、または−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ−Ｒ³（式中、Ｒ³はフルオレセインから由来する基
を表す）を表す] に対応するモルホリノ−ヌクレオチド。
【請求項１３】以下の式：【化６】 [式中、Ｒ¹がチミンであり、Ｒ²が−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ₂、
または−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ−Ｒ³（式中、Ｒ³はフルオレセインから由来する基を
表す）を表す] に対応するモルホリノ−ヌクレオチド。
【請求項１４】以下の式：【化７】 [式中、Ｒ¹がシトシンであり、Ｒ²が−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ₂
、または−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ−Ｒ³（式中、Ｒ³はフルオレセインから由来する基
を表す）を表す] に対応するモルホリノ−ヌクレオチド。
【請求項１５】以下の式：【化８】 [式中、Ｒ¹がグアニンであり、Ｒ²が−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ₂
、または−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ−Ｒ³（式中、Ｒ³はフルオレセインから由来する基
を表す）を表す] に対応するモルホリノ−ヌクレオチド。
【請求項１６】以下の式：【化９】 [式中、Ｒ¹は核酸塩基を表し、Ｒ²は以下の式： −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂ −（ＣＨ₂）_n−ＳＨ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＳＲ³ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＯＲ³ {式中、ｎは１から１２の範囲の整数であり、Ｒ³は、ラベル、タンパク質、酵素
、脂肪酸、またはペプチドから由来する基である} の一つに対応する基を表す] のモルホリノ−ヌクレオシドを生産する方法であって、以下の式：【化１０】 [式中、Ｒ¹は上述の意味を有する] のヌクレオシド三リン酸を、過ヨウ素酸塩、式Ｒ²ＮＨ₂[式中、Ｒ²は上述の意味
を有する]の化合物、および水素化ホウ素ナトリウムを反応させる方法。
【請求項１７】ＤＮＡまたはＲＮＡ断片のラベリングのための、以下の式
：【化１１】 [式中、Ｒ¹は核酸塩基を表し、Ｒ²は以下の式： −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂ −（ＣＨ₂）_n−ＳＨ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＯＨ −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＳＲ³ −（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−Ｒ³ −（ＣＨ₂）_n−ＯＲ³ {式中、ｎは１から１２の範囲の整数であり、Ｒ³は、ラベル、タンパク質、酵素
、脂肪酸、またはペプチドから由来する基である} の一つに対応する基を表す] のモルホリノ−ヌクレオシドの使用。