JPH07504087A

JPH07504087A - 蛍光性ｎ−ヌクレオシド及び蛍光性ｎ−ヌクレオシド構造類似体の応用

Info

Publication number: JPH07504087A
Application number: JP5514326A
Authority: JP
Inventors: コンラド　マイケル　ジェー
Original assignee: クロマジェン　インク
Priority date: 1992-02-12
Filing date: 1993-02-12
Publication date: 1995-05-11
Also published as: DE69333073D1; WO1993016094A3; CA2129105A1; DE69333073T2; EP0628051A1; ATE244259T1; US5763167A; EP0628051B1; WO1993016094A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

Ｎ−し　シ゛　Ｎ−ヌ　レオシ１　の４Ｉ」ＩＡ、１１の　一本発明は、ＤＮＡやＲＮＡに通常存在する非蛍光オリゴヌクレオチドの蛍光性構造類似体に関するものであり、それらの誘導方法とそれを用いた蛍光性オリゴヌクレオチド合成への使用方法、さらには、蛍光性オリゴヌクレオチド単量体または特定の塩基配列をもつ蛍光性オリゴヌクレオチドの新しくかつ有用な応用を含んでいる。それに加え、指定されたＤＮＡ又はＩＩＮ＾ＲＮＡ列中の特異的な非蛍光性ヌクレオチドを該蛍光性構造類似体に置換することによる応用や、診断・治療目的でハイブリダイゼーション試薬やプローブとして、また診断や治療的研究の手段として、蛍光性オリゴヌクレオチドを使用する方法に関するものである。Ｂ、′の　・ｌ− ＤＮＡやＲＮＡに通常存在する６種のＮ−ヌクレオシドは、図１に示す構造を有する。Ｒ・はイノシンでは水素、グアノシンではアミノ基を表し、Ｒ＠はウリジンでは水素、チミジンではメチル基を表す。さらに、リボヌクレオチドではＲ＋ｓｓ　ＲＩｇは水酸基、２°−デオキシヌクレオチドではＲ目は水酸基、Ｒ＋＋は水素、３゛−デオキシヌクレオチドではＩ？ｔｔは水素、ＲＩｇは水酸基、そして、ジデオキシヌクレオチドにおいてはＲＬｔ、Ｒａ＋は水素を表している。通常存在する６種のヌクレオチドは２９０ｎ−以上の波長の光を吸収せず、また、生理学的条件下でも、非蛍光である。通常存在するＮ−ヌクレオチドの誘導体は、複素環式塩基、フラノース環の両方の置換体を含んでおり、様々な合成、診断や治療の目的において一般的である。これらの置換は、ｒＭ２に示されされた部位で行われる。図２において、Ｒ４は検出可能なラベルで誘導可能な反応基（Ｎ［１，、ＳＢ。：０そしてこれらはアミド、チオエーテル、又は、ジサルファイド、もしくは、付加可能な反応基Ｒ，からＲ１との組み合わせ例えば、Ｒ＋−（Ｃ８ｓ）ｘ−ＲｚまたはＲ＋−Ｒ＋−（ＣＢｘ）ｘ−Ｒｓ−（このＸは１から２５までの整数）やに５、ｋｌ、Ｒｓは［１，０１１、アルキル、アシル、アミド、チオエーテルまたはジサルファイド、これらに限らないが、これらを含む選択的な結合部位を含んでいる。）であり、Ｒ，は■またはＲ４とエテノ結合の一部であり、Ｒ番は日、Ｎ１１１．３１１または二〇であり、ＲＩは水素、メチル、臭素、フッ素またはヨウ素もしくはアルカリや芳香性の置換体もしくはアミド、チオエーテル、ジサルファイド結合またはＲ＋−（ＣＢ＋ｂ−ＲｙやＲ＋−Ｒｘ−ＣＣＨｔ）ｘ −Ｒｓ−（このＸは１から２５までの整数）のような組み合わせを含む選択結合部位であり、Ｒ８，は水素、または酸に感受性であり塩基に安定な保護基、または亜リン酸誘導体であり、Ｒ１、とＲａｙは水素であり、Ｒ１，は水素、水酸基、または亜リン酸誘導体であり、Ｒ＋＋はＨ２Ｏ日、ＯＲｊこのＲ，は保護基または付加的なフルオロホアである。Ｎ−ヌクレオシドやＣ−ヌクレオシドのＮやＣの文字は配糖体の共有結合が糖と複葉環式塩基とを結合させる塩基における元素を表している。通常のヌクレオシドの場合、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、イノシン、ウラシルもしくはチミンのいずれかである。塩基はフラノース環に結合し、その一般的構造を図３に示す。蛍光性類似体の糖置換体はずべてのＲに基に対し同じ番号表記の方式をとっているが、いくつかの複素環の類似体では興なる場合がありうる。ｌ、　の　レオ　゛の一ベルヌクレオチド配列は、一般に、特定のＤＮＡやＲＮＡとハイブリダイズする診断又は治療に用いられるプローブや標的配列の増幅を含む、様々な応用に用いられている。塩基配列を標識することはしばしば必要でありまた有用である。Ａ、ａ　−いたオ蓼ゴヌ　し　′　ローブの一ベル特異的なりＮＡやＲＮ＾ＮＡのハイブリダイゼーションは短くとも５塩基から１万塩基以上の長さをもつオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることを意味する。現在の研究における大半のオリゴヌクレオチドプローブは放射線でラベルされているが、しかし、（ａ）一般に利用されている同位元素の半減期は短く、（ｂ）安全性が必要とされること、そして（Ｃ）放射活性のあるプローブの取り扱いや廃棄の手間などの理由から、ハイブリダイゼーション診断方法が、広く受け入れられ応用されていくためには、簡便でかつ高感度の非放射性同位元素による検出方法がめられている。Ｂ、オリゴ　レオ　′プロー　の−べ１ン　の　ロ　−　に　７抗体結合、酵素処理もしくは゛レポーター”分子に結合した蛍光物質又は化学発光物質の利用という違いがあるにせよ、近年行われているハイブリダイゼーションの非同位元素法は、検知可能にしたヌクレオチド誘導体の合成に依存している。多くの場合、オリゴヌクレオチドは、一般的に特定の環内もしくは理外に標識基を持つ分子を一つもしくは複数個取り込むことにより誘導されている。標識基を結合させる技術は、（ａ）水または水溶液中で脱保護したオリゴヌクレオチドを使った数々の化学反応による、単量体ヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチド中５′または３′への官能基の付加（Ｃａｒｄｕｌｌｏら［１９８８］　ＰＮＡＳ　８５：８７９０−８７９４を参照）、（ｂ）　（ｉ）　ＮＢｆｆｉ、８口、Ｃ１１０、ＣＯＯ［Ｉの様な保護された反応基、（ｉｉ）　Ｎ日Ｓエステル、アルデヒド、ヒドラジドのような活性化されうる単一機能のリンカ−５（ｉｆｆ）複葉環式塩基又はフラノース部位のいずれかに結合したビオチンのような親和性の結合基、を含む修飾されたヌクレオチド（Ｂｒｕｍｂａｕｇｈら［１９８８１ＰＮＡＳ　８５：５Ｇ１Ｇ−５６１４；５ｐｒｏａｔ　Ｂ、Ｓ、、　Ａ、１．　Ｌａｓ＋ｏｎｄ、　Ｂ、　Ｂｅ１ｊｅｒ、　Ｐ、　Ｎｅｕｏｅｒ、　Ｐ、　Ｒｙｄｅｒ　［＋９８９n　Ｎｕｃｌ、＾ｃｊｄｓ　Ｒｅｓ、　１７：３３７１−３３８６；＾１１ｅｎ、ＤＪ、　Ｐ、Ｌ、　Ｄａｒｋｅ、　Ｓ、　Ｊ、　Ｂｅｎｋｏｖｉｃ　［１９W９］　Ｂｊ。ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８：４６１０−４６０７を参照）　、（ｃ）化学合成中オリゴヌクレオチドの５′末端に結合させるのに適した保護分子、例えば、５− アミノへキシル−゛３−０−ホスホアミダイトの使用　（Ｂａｒａｌａｂｉｄｉｓ、　Ｊ、、Ｌ、　Ｄｕｎｃａｎ　Ｇ、１．丁ｒｅｇａｒ　［１９９０］　Ｎｕｃｌ、　＾ｃｉｄｓ@Ｒｅｓ、　１８：４９３−４９９）そして（ｄ）糖部分又はポリマーのホスホジエステル骨格への官能基の付加（Ｃｏｎｖａｙ、Ｎ、Ｅ、、　Ｊ、　Ｆｉｄａｎｚａ、　Ｌ、Ｗ、　ＭｅＬａｕｇｈｌｉｎ　［１９８９］　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ　２１：４３−４４；　＾ｇｒａｗａ１．　Ｓ、、Ｐ、Ｃ，ＺａＩＩｅｃｎｉｋ　［１９９O３Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１８＋５４１９−５４２３）などが主要な技術である。最も単純には、ヌクレオシド以外のリンカ−やラベルは酵素的もしくは化学的方法によりオリゴヌクレオチドの３′又は５゛末端につながれる。ＤＮＡまたはｌＮＡｌ１の内部の塩基中のヌクレオシド残基の修飾は困難な方法であることがわかつている。それは、反応の条件がＲＮＡまたはＤＮＡオリゴマーを完全な状態に保てる程度穏やかである必要がある一方、正常なワトソンークリック塩基対や折り重なりの相互作用に供与できる反応産物を産生じなければならないからである。（図４参照）。旦−１１１工１１辺１１差進ユ旦エヌクレオチド塩基の環内または環外の誘導体化には以下のものを含めた多くの方法が述べられている。１　ハプーンーベｌン　ＤＮＡプローブはアミノ基が修飾され、後に２．４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）のようなハプテンを持つように誘導される。酵素と融合した抗ハプテン抗体はこれに結合し、その後比色基質を用いて検出される。２Ｅ　そ　：ｔ−ル　オＩゴヌ　レオ　：　ＴａｋｅｄａとＩｋｅｄａ　（［１９８４］Ｎｕｃ１．＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｓｙ＋ａｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ　１５：１ｏｌ−１０４）はアミノ誘導オリゴマーを作製するのにブトレジニルチミジンのホスホトリエステル誘導体を使用した。Ｒｕｔｈと共同研究者らはＣ＋に初めのアミンに１２の炭素長を有する°リンカーの腕”を付けたデオキシウリジンの合成法を報告した（Ｊａｂｌｏｎｓｋｉら［１９８Ｇ］　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　＋４：６１１５−６１２８）。これらは、後に蛍光分子を作るために蛍光物質と反応させた。ＵｒｄｅａとＨｏｒｎは１９９０年に、０４位の６−アミノ基が修飾されたピリミジン誘導体についての特許を取得した（Ｕ、Ｓ、特許番号４．９１０．３００）。３゛と５°アミノ修飾ホスホルアミダイドは化学合成やオリゴヌクレオチドの誘導において広（使用されており、また、商品として入手可能である。ビ　ン　たま　のビオ　ン　いた−Ｑンアビジンに対するビオチンの高い親和性は、誘導したＤＮＡプローブと酵素または化学発光試薬とを結合させるのに用いられている（Ｆｏｓｔｅｒら、［＋９８５］　Ｎｕｃｌ、＾ａｉｄｓ　Ｒｅｓ、　＋３ニア４５−７６１）。他のリンカ−に接合させたビオチンもまた広く用いられている。それらには、ビオチン−ＮＩＩＳエステル（Ｂａｙｅｒ、　Ｅ、＾０、ｉｔ、　ｆＨｃｈｅｋ　［＋９８０］Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｊｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ２６：Ｉ）、ビオチンサクシナミド（１，ｅｅ、　Ｖ、Ｔ、、　Ｄ、Ｈ。Ｃｏｎｒａｄ　［＋９８４］　Ｊ、　Ｅｘｐ、　１ｌｅｄ、１５９；１７９０）　、そしてビオチンマレイミド（Ｂａｙｅｒ、　ＥＡ、ら、［１９８５］＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅ＋＊、＋４９：５２９）がある。１ｔ６ｉＢｆｉｏｌｄら（［１９８７コＢＢＲＣ１４２，５１９−５２６）はビオチンヒドラジドをシチジンの４位のアミノ基をラベルするのに用いた。１９８９年にＫｌｅｖａｎらのアデニンの６位、シトシンの４位、そしてグアニンの２位におけるこのような誘導に対し特許が認可された。ｌ−ビオ　ンラベＩンヌクレオシド５゛−三リン酸または３−０−ホスホアミダイドをウラシルの５位のα−アミノ基に接合したビオチン部位により修飾したＣＬａｎｇｅｒら［１９８１〕ＰＮＡＳ　７８：６６３３−６６３７：５ａｉｋｉら日９８５］　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０；１３５０−１３５４）。ヌクレオチド三リン酸誘導体は、“ ニックトランスレーション”という一般的技術により効率的に二重鎖ＤＮＡ内に取り込まれる。オリゴヌクレオチド中に一旦取り込まれると、その残基はアビジン、ストレプトアビジン、さらに抗ビオチン抗体と結合し、これらは次いで蛍光や化学発光または酵素的処理により検出に用いられる。１−ンゴニンーｄｄｌｌＴＰ−べ電ン末端転移酵素はオリゴヌクレオチドの３°末端にジゴキシゲニンー１１−グイデオキシＵＴＰを一分子付加するのに用いられている。続いて、標的となる核酸に対するＩ〜イブリダイゼーンヨンにおいてＤＩＧ−ｄｄＵＴＰラベルされたハイブリダイゼーションプローブは抗ＤＩＧ−抗体接合体を用いて検出される。組しハＨプローブが例えば、ビオチン−１１−ＬＩＴＰにより誘導されたとき、蛍光免疫検出はＤＮＡ、ＲＮ＾ＮＡ体に対する特異的なモノクローナルＦａｂ’フラグメントを用いて行われる（Ｂｏｂｏら［１９９０１Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２８：１９６８−１９７３；　Ｖｉｓｃｉｄｉ　ら［＋９＋１６］　Ｊ A　Ｃ１１ｎＪｉｃｒｏｂｉｏ１．２３：３１１−３１７）。７　ソ　ンンのビサルフＤｒａｐｅｒとＧｏｌｄ（［１９８０］　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９：ｌ７７４−１７８１）はビサルファイトが触媒する末端反応によりシチジン上にα −アミノ基を導入し、後に、アミノ基は蛍光タグでラベルされた。この方法においてアミノ基は直接ピリミジン塩基に付加される。ウラシルの誘導のように、これらの誘導は水素結合や塩基対により阻害され、そして、必ずしも効率的なハイブリダイゼーションオリゴマーを産生ずるのに役立つわけではない。ルオロホアが　ＤＮＡプローブテキサスレッド（スルホクロロローダミン）が誘導するプローブは特異的な標的ＤＮＡとハイブリダイズし、また、フローサイトメタ−や顕微鏡により検出可能なものであり、商品として入手可能である。多くの研究者が５°または３゛末端にアミノまたはチオール基をもつ化学的に合成したオリゴヌクレオチドにフルオロホアが結合することを報告している（Ｂｒｕｍｂａｇｈら［１９８８］　Ｎｕｃｌｅｉｃ、＾ｃｊｄｓ　Ｒｅｓ、　１６：４９３７酵素と化学的に合成したプローブを直接化学結合させる方法は、基質の処理を通しての直接的な検出に利用されている。例えば、Ｕｅｄａらは、多重ＤＮＡプローブハイブリダイゼーションを標的ＤＮＡを固体相に結合させするために用い、その後さらにアルカリフォスファターゼ誘導ハイブリダイゼーションプローブでラベルする、オリゴサンドイッチ解析について述べている。（Ｕｅｄａら［１９８９］　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｂｃ噛。３５：１５７１−１５７５）。１ジニ　ムエ　−ルーベーンメチルアクリジニウムのひとつのフェニルエステルはＲＮＡまたはＤＮＡプローブ上の中央の位置に結合する。エステルの加水分解は一つのアクリジン、二酸化炭素そして光を発生させる。ハイブリダイズしないプローブ上のエステルは標的ＲＮＡやＤＮＡとハイブリダイズしたプローブ上のエステルとくらべ、素早く加水分解される。ハイブリダイズしたプローブの化学発光は浮遊しているプローブのものと区別することができ、“ハイブリダイゼーション保護アッセイ“に利用されている（ｆｅｅｋｓら　［１９８３］　Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｓ、２９：ｌ４７４−１４７９）。Ｄ、　−−ス　の　Ｆフラノース環（図３のＲ１１からＲ１４）の誘導法とオリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格（図３のＲ■・）における誘導法は既に報告されている。レオ　゛　に　Δ　たレボ−−Ｒ０± ホスフォロチオエートエステルはモノブロモビメインのようにフルオロホアに対する結合部位を供給するために利用されている（Ｃｏｎｖａｙら［１９８９］　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ　２１：４３−４４）。＾ｇｒａｖａｌとＺａｍｅｃｎｉｋは、ＤＮＡのホスホジエステル骨格をホスホールアミダイドやホスホロチオエートジエステルに修飾することにより、アミンに特異的なレポーター暴く例、モノブロモビメイン）やチオールに特異的なレポーター基（例、フルオロシャイン　イソチオンアネート）をそれぞれ取り込む方法を報告した（［＋９９０］　Ｎｕｃｌ、＾ｃｊｄｓ　Ｒｅｓ、　１８：５４１９−５４２３）。２　のレボ−−Ｒか°ＲＬ。Ｓ曽ｉＬｈ＋Ｆｕｎｇ及びにａｉｓｅｒは、Ｒ１０位にα−アミノ基の導入することによるヌクレオシドやヌクレオシド類似体の配糖体部位の各種の誘導体やラベルの合成について述べている（［１９８９］υ、Ｓ、特許番号４．８４９．５１３）。著者らは、蛍光性ヌクレオシド誘導体またはそれらの誘導体を用いて化学的にせよ酵素的にせよ作られた蛍光性オリゴヌクレオチドの使用と応用、または蛍光性ヌクレオシド類似体やそれらの誘導体の使用について、いかなる報告もクレームもしていない。Ｅ、゛１ゴヌ　レオ　゛　ラベル　ＵＦＬ！＠ＡＭ直Δ囲１検出可能な非放射性のオリゴヌクレオチドを作るために、ＤＮＡやＲＮＡプローブに使われているヌクレオシドを化学的に修飾する必要がある。このようなプローブの準備にはコストがかかり、また困難でもある。多くの場合、検出に用いる化学的物質はその使用が厄介であり、また高価である。このことは、臨床の研究室において重要な応用を見逃す原因となる。ハイブリダイゼーシヨンへの応用において、化学的に誘導されたプローブのその他の限界もまた明らかにされている。（１）化学的に誘導されたｄＮＴＰｓをＰＣＲ増幅において既製のデオキシヌクレオチド三すン駿のように使用する場合、一般的に費用がかかりすぎる。また、増幅したＤＮＡのラベリングは、（ｉ）予めラベルしたプライマーを用いての増幅、または（ｉｆ）ラベルしたハイブリダイゼーションプローブとのアニーリングに限定される。前者の場合は増幅している間に、（ｉ）増幅している間にＤＮＡの標的でない部分にプライマーが非特異的アニーリングする、または（ｉｉ）以前の増幅実験による増幅産物が研究環境中に混在するなどの理由から、しばし、ば誤った結果がでる。ハイブリダイゼーション後の処理において費用がかかることや技術的困難をともなうことが、ラベルされたハイブリダイゼーションプローブの研究への応用に大きな障害となっている。（２）配列中の不適当な位置に、大きなまたは非水素結合性の塩基を導入することにより誘導したヌクレオシドを用いて作られた多くのオリゴマーの塩基対合は阻害される。多くの臨床試料にもともと存在する化学発光のパックグラウンドのため、アクヂニウムエステルプローブでさえ理論的に予想される程度の感度を得ることができていない。ハイブリダイゼーシヨンの後処理を必要とすることが、このような方法に対する限界となっている。（３）非放射性ラベルされたプローブを大量に低費用で産生ずることは困難である。（４）化学発光プローブは短命であり、試料の正確な定量や再プローブすることは困難である。（５）多くの場合においてハイブリダイゼーションは結果を判断するだけであり、非定量的であり半定量的であり非自動的である。これらの制限は、ＤＮＡやＲＮＡハイブリダイゼーションプローブの臨床研究室での検査や治療的使用への応用を妨げる。Ｆ、Ｎ−レオシ２　゛ホルマインン＾（一般的にはホルマインンとして呼ばれている）は蛍光性ヌクレオチド領似体の原型であり、ちと虻とはＮｏｃａｒｄ４ａ　ｉ口ｔｅｒｒｏｒｍａの培養濾過中より抗腫瘍抗生物質として単離された（ｌｌｏｒｉら（＋９６６コＪ、　Ａｎｔｉｂｊｏｔｉｃｓ、　Ｓｅｒ、＾１７：９６−９９）。そして、その構造は７−アミノ−３−ｂ−Ｄ−リポフラノシル（＋８−ピラゾロ−［４，３ｄ］ピリミジン）として同定されたく図５．６）。またＳｔｒｅｐｔｏｗｙｃｅｓ　Ｉａｖｅｎｄｕｌａｅ（Ａｉｚａｖａら［＋９６５コ＾ｇｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２９：３７５−３７６）やＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｕｍｍａｅｎｓｉｓ（日本■■ 番号１０．９２１１、日本化薬株式会社に１９６７年に付与された）の培養上清からも単離されたこの抗生物質は、全資源中のＲＮＡにおいて通常みられるＮ− ヌクレオシドの類似体である多くの微生物のＣ−リボヌクレオシド類似体の一つである。微生物から単離された他の自然に生じるＣ−リボヌク１ノオシドはホルマイシンＢ（ＫｏＹａｌｌａら［＋９６６］Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　１．ｅｔｔ、５９７−６０２；　Ａｊｚａｖａら　５ｕｐｒｎ：　ＩＪＩＢｅｚａｖａら　［＋９６５１　＾ｎｔ奄ｂ奄盾狽奄モ■ Ｓｅｒ、＾１８：１７８−１８１）、オキソホルマイシンｌｌ　（１３ｈｉｚｕｋａら［１９６８］　Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　２１；Ｉ−４；　５ａｖａら［１９６ｇ］＾ｎｔｉｂｊｏｔ、ｉｃｓ　２１：３３４−３３９）、シュウドウリジン（Ｕｅｍａｔｓｕと５ｕａｈｄｏｌｎｉｋ　［１９７２］　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ、５ｔｒｙ　１１：４６６９−４６７４）、シ３ウドマイソン（Ｄａｒｎａｌ、１ら　［＋９８７］　ＰＮＡＳ　５７：５４ｇ−５５３）、ビラゾマイシン（Ｓｖｅｅｎｙら　［１９７３］　Ｃａｎｃｅｒ　ＲｅｓB ３３：２６ｉ９−２６２３）そしてミニマインン（にｕｓａｋａ、ｂｅら［１９７２］　Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　２５：４４−４７）を含んでいる。ホルマイ７ノ、ホルマイシンＢそしてオキソホルマインンＢはピラゾロピリミジン４′に＃であり、それぞれアデノシン、イノシシそしてヒボキサンチンの構造類似体である。自然源より得られたグアノシンのビラゾビリミジノ構造類似体は文献として報告されていない。これらの化合物の生合成の完全な総説は１９７４年に出された（ＯｃｈｉらＪ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｘｘｉｖＪＯ９−９１６）。ヌ　レオ　′　ＪとＩ捏ｊｔＪＪＪ！−亘数種のＣ−ヌクレオシドは抗生物質、抗ウィルス剤、そして抗腫瘍剤として活性があることが知られていることから、それらの化学的な誘導法や物理的特性は広く研究されており、またＤＮＡやＲＮＡ中に存在するＮ−ヌクレオシドの構造や合成法と比較されている。＋９６０年代後半に、６種のＮ−ヌクレオシドに対して数種の構造類似体が生理的条件下で蛍光性を有することが発見された。類似体における蛍光性は複合環構造それ自身の分子剛度に由来する。例えば、Ｃ−ヌクレオシドのように必ずしもある種の構造類似体が全て蛍光性をもつというわけではなく、また、蛍光性が特定の構造類似体のもつ固有の性質でもない。我々の後の研究は、ピラゾール、ピラゾロビリジミジンそしてプリンのたった数種が蛍光性を有していること、また、それらが図５から図１１にその構造を示した数種の置換Ｎ−ヌクレオシド、アザヌクレオシド、エテノヌクレオシドそ（７てデアザヌクレオシドを含む、他の幾つかのヌクレオシド誘導体や構造類似体と特性を共有していることを示した。四角で囲まれた図５から図１１の構造は蛍光性であることが以前に報告されているか、もしくは本発明の開発中に見いだされたものである。蛍光性類似体を含む性質の不明なオリゴマーは、１ａｒｄとその共同研究者により、ヌクレオシドポリメラーゼ酵素を用いて物理学的研究のために用意された（ｗａｒｄら［１９６９］　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、２４４：３２４３−３２５０：　１ａｒｄら　［１９６９）　１ｏｃ　ｃｉｔ　１２２８−１２R７）。蛍光性ヌクレオシドやそれらの構造類似体を分子生物学での合成やハイブリダイゼーション技術に利用することや、蛍光オリゴヌクレオチドを合成する試みについての文献は報告されていない。ｅ　の　！。本発明は蛍光を有するヌクレオチド類似体に関するものである。これら蛍光性ヌクレオシド類似体はヌクレオチド配列の合成やラベリングにおいて単量体として有用なものである。さらに、本発明はオリゴヌクレオチドプローブの合成において、通常存在するヌクレオシドと置換可能な蛍光性ヌクレオチドを使用することに関する。ハイブリダイゼーシヨンプローブとして用いた場合、このオリゴヌクレオチドの蛍光性を、特異的な遺伝子配列の検出や同定の解析手段として用いることができる。この方法は、他の非放射性プローブを用いた検出方法と、ヌクレオチドに１！Ｐ素や他の反応蛋白を結合させなくてもよい点またはハイブリダイゼーションの検出のためにハイブリダイゼーション後の処理を必要としないという点において異なる。背景の項にで述べたように、ＤＮＡやＲＮＡプローブ技術において現在用いられている方法や構成には多くの欠点がある。（ｉ）ＩＩ型または標的ＤＮＡに対して相補的な配列中の限定した位置にある非蛍光ヌクレオチドと特異的に置換したものとして、（ｉｆ）Ｍ型、産物としての、また、増幅されたり、標的となるＤＮＡやＲＮＡの同定や検出に対するラベルとして、指定された配列に直接取り込ませることが可能な蛍光性ヌクレオシド、または蛍光構造類似体を使用することによりて、先の技術の欠点を克服することが本発明の対象である。ラベルされたポリヌクレオチドプローブやアンブリマーの合成、診断そして治療に有用である、新たな蛍光ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体そして新たな三リン酸やホスホアミダイド体を供給することが、本発明のもう一つの目的である。本発明の更なる目的は、指定された標的ＤＮＡまたはＲＮ＾配列と特異的なワトソンークリック塩基対を形成しつる、自発蛍光オリゴヌクレオチドを製造する方法を与えることである。本発明のもう一つの目的は、ＤＮＡやＲＮＡの既知の核酸配列の存在を同定及び検出し、またその機能を変化させるために蛍光性ヌクレオシド類似体並びに本発明の方法で作製及び合成したオリゴヌクレオチドの利用方法を提示することである。加えて、検出方法の改善及び単純化すること、またＤＮＡやＲＮ＾ハイブリダイゼーシｄン技術の応用や使用法を単純化することも更なる目的である。本発明の別の側面として、二重１１ＤＮＡのセンス又はアンチセンスの片方に結合する相補鎖の核酸プローブを作！１（非対称な合成）をするために、背景的方法が提供される。本発明の重要な面は、非対称な合成がａ酸プローブ試験、解析、診断、そして、治療の迅速性や定量性をもたらすのに必須の条件となることである。非対称合成の重要な点は、鋳型として二本鎖ＤＮＡの一方のみを用いてオリゴヌクレオチド、もしくはオリゴマーを合成、単離するのに、（ポリメラーゼの）プロモーター、プライマー、また、リンカ−に修飾したプライマーを非対称的に使用するところにある。非対称合成により核酸、ゲノムＤＮ＾や染色体の単一断片上にある独立かつ固有のの標的部位に同時にハイブリダイズする非対称プローブの゛カクテル“を一度に合成するために、複数の異なる鋳型を直接使用することが可能になったことも本発明の一つの重要な点である。例３に示した複数のコピーがタンデムに並んだ繰り返し配列のように同一の標的配列の複数コピーが単一のゲノム上に存在する場合、配列は同じだがゲノム上に広く分布する標的と結合するプローブの′カクテル”を作るために、単一非対称プローブの鋳型が使用される。このことは、プローブカクテル”の発明の重要な点である。本発明の別の側面として、オリゴヌクレオチドの合成、ラベリングそして検出に有用な通常存在するヌクレオシドやその誘導体である蛍光性構造類似体は、図５から１．１の構造式を有することが示された。通常存在するヌクレオチドは特異的な供与体、受容体の関係において図４に示すようなワトソンークリック塩基対と名付けられた特徴的な水素結合を形成している。また特定の蛍光ヌクレオシド類似体でも、図４の供与体、受容体のＡＣＴやフォルマイシン：Ｔにみられるようなワトソンークリック水素結合形成様式を、通常存在するヌクレオシドと同じように形成できることが示される。本発明の別の側面として、通常存在するヌクレオシドの蛍光性構造類似体の作製や誘導方法として、Ｒ１０、Ｒ１２モしてＲ１４部位を、（ｉ）ＤＮＡまたはＩＩＮ＾合成における反応基、（ｉｉ）構造類似体から蛍光の共鳴エネルギー転移における反応基、とする誘導段階をもつ方法が提供される。本発明の更なる側面として、単一または複数の蛍光構造類似体やその誘導体を使って、ポリヌクレオチドプローブを合成し、使用する方法も示されている。このようなプローブは複数の単鎖または二重鎖ポリヌクレオチドを含んだ試料をスクリーングするのに使用することができ、このようなプローブによって、ハイブリダイゼーションにより目的の配列をラベル、検出そして同定をすることが可能である。蛍光オリゴヌクレオチドプローブが図１２から１８に示したような゛液体ハイブリダイゼーシＪン°法とともに使用することが可能であることは本発明の重要なζである。先の目的に従って、本発明は、オリゴヌクレオチドをラベル、修飾または同定するために使用することが可能な本質的な蛍光ヌクレオシド自体、ハイブリダイゼーションプローブの本質的な蛍光オリゴヌクレオチドの使用法、およびヌクレオチド配列の検出方法から構成されている本発明の重要な点は、フルオロホアの安定な蛍光発光と試料中に存在するフルオロホアの量について検出や定量をするために、時間解離分光学または光子計算を利用したことにある。本発明の追加的な記述、利点、使用方法そして新たな特色は以降の記述の中で述べていくことにするが、この分野に精通した人においては、試験してみた後に部分的に明らかになってくる場合もありうるし、本発明を実施することで理解される場合がありうる。区Ｉ！１１１ｆ説、！！Ｉ図１ははＤＮＡやＲ８人中に占める６種の通常存在するＮ−ヌクレオシドを示す。図２は通常存在するトヌクレオシドの一般的構造とその誘導部位としてＲｎを示す。図３はプリンとピリミジンヌク１ノオンドのフラノース環の一般的構造をと誘導体の共通のＲｎ部位を示す。図４は通常存在するＮ−ヌクレオシドのＡＣＴとＧ、０間のワドノンークーノツク塩基対とホルマインン：Ｔ、ホルマイ：Ｕ、２，６−シンジアミツプ９ン：Ｔそして５−アミノーホルマイシンＢ：Ｃ間の塩基対を示す。図５は生物学的材料から誘導された通常存在するＮ−ヌクレオチドの構造類似体を示す。図６はピラゾロ［４，３ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体を示す。図７はピラゾロ［３，４ｄｌビリミジンヌクレオシド類似体を示す。図８はピラゾロ［１，５ａ］−１，３，５−トリアジンヌクレオシド類似体を示す。図９はアザピリミジンとアザプリンヌクレオシド類似体を示す。図１０はデアザピリミジンとデアザプリンヌクレオシド類似体を示す。図１１は（１）は非水素結合と、（Ｉ＋）は蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）類似体と０う数種の蛍光性構造類似体の例を示す。図１２はＦＴＰや八↑Ｐを用いた対称的なＲＮ＾合成の図式である。図１３はウィルスプロモーターとウィルスＲＮ＾ポリメレースを用し）プロモーターが誘導する非対称のＲＮ＾合成の図である。図１４はｐＵｃ／Ｍ１３プラスミドベクターのＥｃｏＲ１部位へ挿入されｔこ単鎖ＤＮＡの一段階ラベリングとｄＦ＋＊ｉ用いた方法の例を示した図である。図１５は標的開＾に対するプローブの迅速かつ定量的なノ＼イブＩＪダイゼーションにおける非対称なりＮＡやＲＮ＾プローブの使用の必要性を示してしする図である。ここに示すように、非対称なプローブは対称なプローブと比較し、／ヘイブＩＪダイゼーション効率において有意な上昇がみられる。図１６はりポヌクレオチド類似体、ホルマイシン＾からその２゛−デオキシド１ノホスフェイトまたはホスホアミダイド型への転換を示しｔこ図である。図１７は蛍光プローブを用いたゲノミツクＤＮＡ／−イブリダイゼーソヨン１こおける標的ＤＮＡ配列の検出の図である０図１８は蛍光プローブの液体／％＜プリダイゼーションによる増幅しｔこＤＮＡ断片の検出の図である。図１９はＲＮ＾プローブ中の＾ＴＰをＦＴＰに酵素置換反応後の未反応試薬から反応産物を分離するのに用いた分離方法を表したフローチャートである。図２０は異なる配列の複合プローブを含む゛カクテル′プローブの使用による検出感度を上昇させるメカニズムの概要を示す。図２１＾、２１Ｂ、２１Ｃは特異的蛍光ヌクレオチド類似体の同定とその種類、構造、化学名、吸収スペクトル、発光スペクトル、そして合成方法などの特性を示す。に月ｐｊソＩＴ斑所配列番号１は本発明による合成オリゴヌクレオチドである。配列番号２は合成オリゴヌクレオチドとＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　Ｉの相補鎖である。配列番号３は合成オリゴヌクレオチドとＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２の蛍光性類似体である。え乳段韮農立ｋＬｚｙ本出願において開示しクレームしていることは、新しい蛍光ヌクレオシドアナログと、この蛍光ヌクレオシドの使用方法である。例えば核酸プローブや診療用キットである。固有の蛍光ヌクレオシドアナログの利用に関する好ましい具体的を挙げれば、化学的、酵素的固体和合成を含むＤＮＡハイブリダイゼーシＨンプローブの合成、鋳型に対する酵素的ポリメラース反応、ＰＣＲ法を使っての増幅がある。他に具体的なものは、特定のＤＮＡ配列の決定における、オート蛍光ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブの利用（例えば遺伝子マツピング、感染症や遺伝子疾患の検出と診断）に適している。特に、発明の主題は、ヌクレオシドアナログが蛍光であり、オリゴヌクレオチドプローブの合成において一般のヌクレオシドに代わって置換できることである。ハイブリダイゼーションプローブとして使うとき、そのようなオリゴヌクレオチドの蛍光は、特定の遺伝子のシーケンスを探索、同定するのに、いろいろな手段で使うことができる。この方法は、他の非放射活性を有するなプローブ検出の方法とは、酵素や他の活性タンパクと結びついたヌクレオチドを利用しないという点で異なる。このように、ここで述べたことは、ルーチン化そして自動化した医ａｍ断のための発展的ハイブリダイゼーション法における固有のヌクレオシドアナログの応用である。この発明の主屈にかかる蛍光アナログは（Ａ）Ｃ−ヌクレオシドアナログ（Ｂ）Ｎ−ヌクレオシドアナログ（Ｃ）Ｎ−アザヌクレオチド、Ｎ−デアザヌクレオチドアナログという３つの一般的タイブに分けられる。これらの化合物の全ては、一般に３つの特徴がある。ｌ）オリゴヌクレオチドの酵素的化学的合成で普通のヌクレオシドと置換可能な一般的ヌクレオシドの構造的アナログであること、２）適当な波長の光によって励起され、自然の蛍光を発し、その検出のために付加的な化学的、酵素的プロセスを必要としないこと、３）一般に存在するＤＮＡの中で、普通のヌクレオシドとはスペクトルが異なること。この主要な発明において少なくとも１２５の化合物が同定されている。これらの化合物を、そのクラス、構造、化学名、吸収スペクトル、発光スペクトル、合成の方法に分けて、図２１Ａ−２ＩＣにおいて表にまとめた。主１　以下の定義は記述の理解を手助けするために用意されたものである。 ”通常存在するヌクレオチド°は、図１にみられるように、６つの単−Ｎ−ヌクレオチドである。それは通常存在するＤＮＡ、ＲＮＡに多く占められていて、古典的ワトソン・クリック塩基対形成をしていて、生理的な状況の下で、効果的な蛍光は発しない。塩基配列にみられるそれぞれの１文字表記はＡ、Ｃ，Ｇ、Ｔ。Ｕ、Ｉであり、それぞれアデノノン、シチジン、グアニジン、チミジン、ウリジン、イノシンに対応する。通常存在するヌクレオシドの”構造アナログとは、通常存在する塩基と構造（原子とその配列）が似ているという克で、普通のプリンやピリミジン塩基を模倣している分子であるといえるが、基本的な生物学的活性や生化学的機能には影響を及ぼさない修飾や置換がなされている。そのような塩基アナログは、限定されていないが、次のものを含んでいる。イミダゾールとその２．４−かっ／または５ −置換誘導体、インドールとその２−５３−１４−１５−５６−１かっ／または７−置換誘導体、ベンズイミダゾールとその３−１４−１かっ／または５−置換誘導体；インダゾールとその３−１４−１５−１６−１かっ／または７−置換誘導体：ピラゾールとその３−１４−１かっ／または５−置換誘導体；トリアゾールとその４−かつ／または５−置換誘導体；テトラゾールとその５−置換誘導体；ベンゾトリアゾールとその４−１５−１６−１かつ／または７−置換誘導体、８−アザアデニンとその置換誘導体、６−アザチミンとその置換誘導体：６一アザウラシルとその置換誘導体：５−アザシトノンとその置換誘導体；ピラゾロピリミジンとその置換誘導体；３−ジアザウラシル、オロト駿、２．６−ジオキソ１．　２．　３．　６−テトラヒドロ−４−ピリミジン；カルボン酸；バルビッール酸：尿酸、エテノアデノシン：エテノシチジン、アロプリノール（４−ヒドロキシ−ピラゾロ［４，３ｄｌビリミクン）１または以下に示す保護誘導体。塩基アナログは、図４と５で示すようないくつかのＣ−ヌクレオシドである。それは塩基とフラノースとの間の普通のＣ−Ｎ結合がＣ−Ｃ結合に置き換わっていて、それらの塩基は限定されているわけではないが、Ｃ−ヌクレオシドシュードウリジンに含まれるものとしてウラシルを含み、１−メチルウラシル；１．３− ジメチルウラシル、５（４）−カルボメトキシ−１，２，３−トリアゾール；５（４）カルボキシアミド−１，２，３−）リアゾール；３（５）−カルボキシメチルビラゾール、３（５）−カルボメトキシピラゾール；５−カルボエトキン− １−メチルピラゾール；マレイミド（Ｃ−ヌクレオリドン１ウドマイシンに含まれる）；３（４）−力ルオポキシアミド−４（３）ヒドロキシピラゾール＜Ｃ− ヌクレオシドビラゾマイシンに含まれる）：図５から１１に示された他のアナログの中のいかなるものそしてその保護された誘導体を含む。 ″蛍光発色団゛は、検出できる範囲で、蛍光を発することのできる物質またはその一部のことを言う。ヌクレオチドの蛍光構造アナログのこの蛍光は、紫外線（＞３００ｎｍ）近くから可視光の間の波長に特異的に起こる。好ましくは、蛍光は、３００ｎｍから７００ｎｍの間の波長、可視光では３００ｎｍからＳＯＯｎｍの間で最もよく発生する。゛蛍光構造アナログ”は、合成的、生化学的に６つの通常存在するＮ−ヌクレオシド（図１）の単一構造アナログからできている。それらは図５から図１１に示されているが、それらは、使われるときに単一構造かっ／またはオリゴヌクレオチドであるかによって古典的ワトソンークリック塩基対形成をするかしないかが決まる。しかしスペクトルが固有であり、生理的状況の下で選択的に励起、発光できる声で通常存在するヌクレオシドと異なっている。例えば、Ｃ−ヌクレオシドであるフォルマイノンＡはアデノシンと同じく供与体／受容体水素結合ができる構造アナログであるが、オリゴヌクレオチドの最大励起波長は３０３ｎｍであり、最大発光波長は４０５ｎｍである。（ストークシフト＝１０２ｎｍ）°誘導された“ヌクレオシドアナログは、蛍光、構造アナログであり、それらは官能基または保護基が共有結合またはそれ以外の方法でペテロサイクルのＲ４からＲ１の位置に結合している。かつ／またはグリコノドの一部分のＲ１，（５’）、Ｒ＋＋（３“）、Ｒ＋４（２’　）の位１、に結合している。２゛　グリコンドの位置の誘導体は蛍光共鳴エネルギー遷移（ＴＲ，ＥＴ）受容体または供与体を含んでいる。それは、蛍光構造アナログ自身の本来の蛍光発光を、より長い波長に強め、あるいは吸収し、再放射する。 “ポリヌクレオチド”オリゴヌクレオチド−”オリゴマー“は少なくとも通常存在するヌクレオチドまたは、蛍光構造アナログを２つ含むヌクレオチド鎖状構造である。ここで言う“雷光オリゴヌクレオチドプローブまたは”蛍光Ｉ＼イブリダイゼーンヨンプローブは少なくともそのうちの一つが蛍光であるヌクレオチド鎮状構造である。 ”ハイブリダイゼーション”は、２つの相補的な一本鎖分子（図４参ｍ）のワトソンークリック塩基結合によるアニーリングである。それはＤＮＡ　：　ＤＮＡ、ＤＮＡ　ＲＮＡ、またはＲＮＡ　ＲＮＡであり、２つの鎖は違う由来であることもある。アニーリングは、（ｉ）水素結合供与体、受容体の方向づけが図４のようになされている相補的塩基結合の間、（ｉｉ）詩興的遺伝子それはプローブがハイブリする標的ＤＮＡまたは標的ＲＮΔ（以下°標的ＤＮＡ／　Ｒ，Ｎ　Ａとする）のような相補的遺伝子シーフェンスの間で特異的である。例えば、アデノシンとフォルマイノンとの水素結合パターンを比較する。（図４）”　ＤＮＡ／ＲＮＡ融解温度”と”Ｔｍ”はハイブリダイゼーションしたＤＮＡまたはＲ，Ｎ　Ａ　ｆｆ１間での水素結合が壊れ、一本望になる、つまり二重鎖またはハイブリッドの構造が壊れる温度を言う。 ”類似蛍光シーフェンス“は、この発明によって記述された、いくつかの酵素的化学結合によって合成されたポリヌクレオチドのヌクレオシドシーフェンスのことを言う。しかし、その中では通常存在するヌクレオシドは、蛍光ヌク１ノオシドアナログとｒＩｌａシている。例えば、規定の鋳型ＤＮＡと相補的なＲＮＡプローブを合成するＲＮＡポリメラーゼを使用したとき、アデノシン−５′−三リン酸（ＡＴＰ）はフォルマイシンＡ−５°−三リン酸（ＦＴＰ）で置換されている。類似蛍光シーフェンスにおいて、蛍光ヌクレオシドアナログは、酵素による合成の際、鋳型を元にして読まれたシーフェンスの中の、相当する通常存在するヌクレオチドが存在すべき（例えば鋳型によって規定される）位置において、オリゴヌクレオチド鎖の一部分または全部において置換されている。類似した予想される置換物は、一般のホスホトリエステル合成時側々の蛍光アナログの３’　−０ −ホスホラミダイトを使って作ることができる。例えばこのようにして、クラミジア・トラケオマティスＭ　ＯＭ　Ｐ遺伝子の相補的シーフェンスまたはその蛍光アテログシークエンスは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＣＴＰ、、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの存在下でそれぞれｄＡＴＰＳｄＦＴＰを使って酵素的に合成できる。ＭＯＭＰ遺伝子配列く配列番号１）ＡＡＣＧＴＴ　ＣＧＡ　ＧＡＣＧＧＡ　ＣＡＣＣＣＣＴＴＡ　ＧＧＡＣＧΔ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＴＣＧ相補的配列（配列番号２）類似賞光シークエンス（配列番号３）この中で、類似蛍光配列のところで下線をう目また蛍光デオキシフォルマイシンＡ　（Ｆ）は相補的配列の所で同じ位置にあるデオキシアデノシン（Ａ）の構造アナログである。 ”Ｆ　Ｒ，Ｅ　Ｔ受容体”または“蛍光共鳴エネルギー遷移受容体”とは、蛍光構造アナログ受容体からの放射光を吸収し、別のより長い波長のエネルギーを再放射することができる化合物、置換基、可視光発色団、蛍光発色団のことであり、例えばダンシル、ナフチル、アンチル、ピレニルメチルウンベリフェロン、または、クーマリン分子があげられる。それらは、ここで示す発明の通常の解釈において、そのような２次的蛍光発色団は選択的に２次的ラベルとして励起される。即ち、構造アナログエネルギー供与体の最初の蛍光を大きくそして強める蛍光受容体として使用される。八、　レオシ′　口　の　゛　ム　゛要約すれば、今回の発明は通常存在するヌクレオシド塩基（Ｂ）のへテロサイクリ、クビリミジンまたはプリン構造アナログを含んでいる。それは生理的状況下で蛍光であり、それらは、炭素−炭素または炭素−窒素結合によって結合し、一連のリボース（Ｒ目！Ｒ１４冨ＯＨ）　、デオキシリボース（Ｒ目；８％Ｒ１４＝ＯＨ２またはＲ＋＋＝ＯＨ１Ｒｔａ”Ｈ）、ジデオキシリボース（Ｒｌｘ　＝　Ｒ＋　ａ　＝　Ｈ）のフラノースリング（図４−９のＦに示される）になり、そのような誘導体は以下に記述されているが、核酸化学の当業者には自明なものである。今回の発明で、フォルマイシン、２−アミノプリンリボヌクレオシド、２．６− ジアミツリボヌクレオシドの全ては（１）アデノシンと同じ塩基対間の水素結合を形成し、（ｉｉ）ワトソン・クリック塩基対を形成するのと同様に積置複製、ライゲーシヨン、フォスフォリレーンコンを含む広くさまざまな酵素的反応においてアデノシンの代わりに特異的に置換することができ、一連の蛍光ヌクレオシドやヌク１ノオンドアナＯグ（図４）の代表として使われる。本発明において、化合物の属性や関連するクレームは、他の全てのグアノノン、ンチジン、チミジン、ウリジン、イノシン、それらの誘導体の蛍光アナログについても同様である。１、　し　ン゛　口　の　通常存在するヌクレオシドの構造アナログのそれぞれの型の一般的なプリン、ピリミジン構造は、図５からＩＺＩＩそれぞれの上段に描かれている。下段は、アナログのそれぞれのクラスの代表的な例である。プリンのアナログの例のみ、因６と図７に描かれている。それ枚数に知られているピリミジンアナログは既に図５に描かれている。Ｒ＋、Ｒａ、Ｒｅだけに置換があるＮ−ヌクレオシドを除いて、各ページの上段の一般的構造において、ヘテロサイクリック塩基への置換によって、アナログと図１で示されている通常存在するＮ−ヌクレオシドの構造とが相違するようになった箇所を、楕円形で囲んで表している。２、　レオン゛　口　に−閉ｔ゛　ラ　−ス　フラノースにおいて、炭素原子が１′から５′である糖の番号は、図２に示されている。このように、塩基Ｂは糖の０１につながっている。この発明においてクレームしているいくつかの蛍光へテロサイクルのフラノースの一部は、他の全てのアナログに共通にグリコシドや置換グリコシドの以下のようなセットＦを持っている。置換体は原理的に５炭糖のいくつかで作ることができる。サブセットＦは、Ｒ１０、ＲｒｌｓＲｘ、Ｒ＋　ａ、Ｒ＋４の位置における誘導体かつ／または置換体によって定義され、それらは（ｉ）当業者に自明であり、そしてそれらは（ｉｉ）今回の発明で主張している全ての蛍光ヌクレオシドアナログのフラノシル誘導体である。これらは全てのリン酸化置換体（すなわちニリン酸、チオリン酸、アミノリン酸など）と、Ｒ１゜の位置の全ての保護置換体（すなわちジメトキント・リチル）とを含む。図５から図１１までにある全てのグリコシドＦにおいて、Ｒ１１、ＲＩｆｆｉ％　Ｒ１１、Ｒ１１は以下のように定義される。Ｒ，＋＋とＲ、＝　Ｈ；　Ｒ，＋　＋　＝　Ｈ、ＯＨまたはＯＲｉ；Ｒ＋ｚとＲ１，はｌ（、Ｑｌ（、ＱＲｍ、ＮＨＲｋのうぢのいずれか。その中で（ａ）Ｒｉ保護基は、典型的に低級アリルまたはアルキルエーテル、すなわち、メチル、ｔ−ブチル、ベンジル、０−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、０−ニトロフェニル、トリフェニルメチルであるか、またはアセチル、ベンゾニル、ニトロベンゾイル、アルキルのような低級アルキルまたはアリルエステルそしてテトラヒドロビテニルのようなアセタールまたは、トリメチルンリル、Ｌ−ブチルジメチルシリルのようなシリルエーテル；またはｐ−）ルエンスルホニル、メタンスルホニルのようなスルホン酸、または、ブロミン、フルホリン、イオジンのようなハリドである。適当なブロック基の追加の例はｒＧｒｅｅｎ、Ｔ、Ｗ　（１９ｇりＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ：ｆｉｌｅｙ＆５ｏｎｓＪに記載されている。一方Ｒ＋　ｓは、７−［３−（りＯロジメチルシリル）プロポキシ−４−メチルクーマリン、０−４−メチルクーリンルーＮ−［３−（＋−リエトキシシリル）プロピルカルバメイト、Ｎ−３−（）リエトキシシリルプロビル）ダンシルアミドのような蛍光発色団を（ＦＩＮ定されているわけではないが）含むＦＲＥＴ誘導体である。（ｂ）Ｒｍは、２゛または３゛−アミド、２′または３゛−アジド、２”、３’　−未飽和を含む適当な保護基、置換または官能基、そして、リン酸エステル、三リン酸エステル、アミノリン酸エステル骨格を持つオリゴヌクレオチドの化学的酵素的合成において含まれるリン酸誘導体のサブセットを表している。（ｃ）Ｒｋはペプチド合成で通常値われるもののような普通の一般的な窯素保護基である。（Ｇｅｉｇｅｒ、　Ｒ，。Ｗ、にｏｎｉｇ　［１９１＋１１　Ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　uｏｌ、　３．　Ｅ。Ｇｒｏｓｓ、　Ｊ、　Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、　ｅｄｓ、、　Ａｃ１１ｄｅ＋＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、ｌ−９９jこれは、（限られるわけではないが）、フォルミル、ｔ−プチルオキシ力ルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２−りＯロペンジルオキシ力ルポニル、４−クロロベンジルオキシカルボニル、フルフリルオキシカルボニル、

【−アミルオキシカルボニル、アダユンチルオキシ力ルポニル、２−フェニルプロピル−（２）−オキシカルボニル、トリフェニルメチル、ｐ−アニンルジフェニルメチル、ジ−ｐ−アユシルジフェニルメチル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィニルのような数千安定保護基を含み、そして、トリフルオロアセチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、４−トルエンスルホニルエチルオキシカルボニル、メチルスルホニルエチルオキシカルボニル、２−シアノ−１−プチルオキシ力ルボニルのように、塩基不安定保護基を含む。またクロロアセチル、アセトアセチル、２−ニトロ−ベンゾイル、ジチアスクンノイル、マレオイル、イソニコチニル、２−ブロモエチルオキシカルポニル、２．　２．　２−トリクロロエチルオキシカルボニルのような他のものも同様である。一方Ｒｋは検出可能なラベルによって誘導体化されたいかなる官能基でもよい。該ラベルとは、ＳＨｌ、ＳＨｌ；Ｏであり、それらはアミド、チオエステル、ジスルファイド結合を含む結合分子を選択的に含有することができ、更に可変的な官能基ＲＩからＲａ　（Ｒ，、Ｒｙ、ＲｓはＨ，ＯＨ、アルキル、アシル、アミド、チオエーテルまたはジスルファイド）との融合体、例えばＲ１（ＣＨ２）ｘ−Ｒｘ　（Ｘは１から８までの数字）でもよい。）または、限定されてはいないが、ハイドラザイド、マレイミダゾール、オキシジザブルジオールスクンニミンル基のような官能基を含む、ホモ二重機能的またはへテロ二重機能的リンカ−として機能するリンカ− やスペーサーでもよい。多くても、Ｒ＋ｘとＲ１轡のうち一つだけがＮＨＲｋである。さらに発明は、次の構造式をもつ新しいフォスフオルアミダイトを含む。この中でＢは、ここで述べられている蛍光ヌクレオシドアナログの中のどれかであり、Ｒ１１＋　Ｒ１１、Ｒ目、Ｒ目は既に、グリコシドＦのセットとして定義されている。Ｒ１４は、ＨまたはＯＨのどちらかであり、Ｒ＋ｓは低級アルキル、好ましくはメチルまたはイＯプロピルのような低級アルキル、またはモノフオリノ、ピロリトノ、２．　２．　６．　６−チトラメチルビＯリドノのようなヘテロサイクリックである。Ｒ＋ｇは、メチル、ベーターンアノエチル、ｐ−ニトロフェニル、０−クロロニトロフェニルまたはｐ−クロロフェニルである。他の全てのＲ基は前述のように１から２５までの炭素原子の長さのスペーサーまたはリンカ−アームを同定するものを含んでいる。Ｒ＋ｉの位置でフォスフオルアミダイトの合成に先だって、（１）ワトソンークリック塩基対を形成するのに重要な複葉環上で反応置換体を保護するために、そして（閣１）アミダイトをＤＮＡまたはＲＮ八への立体構造に適合させるために、フォスフオルアミダイトにおいて塩基の一部分Ｂを保護することができる。それは一般的にエキソサイクリックアミノ基のアシル化、アミド化を含み、限定されてはいないがアセチル、ベンゾイル、イソブトリル、スクシニル、フタロイル、ｐ−アニソイルを含む。そのようなアミジン基は限定されてはいないが、ジメチルホルムアミジン、ジ−Ｎ−ブチルホルムアミジンまたはジメチルアセトアミジンを含む。もしＢがカルボキシル、ヒドロキシルまたはメルカプトのような他の官能基で置換されるなら、それらは適当に保護もされる。本発明は、固相担体上でのオリゴヌクレオチドの合成を含んでいる。その中で、オリゴマーは図５から図１１に示されているように、保護された蛍光ヌクレオシドアナログの７オスフオルアミダイトと反応し、上述の構造のように誘導される。さらに本発明は少なくともシーフェンス上に、上述した構造のフォスフオルアミダイトとして誘導された一つの蛍光ヌクレオシドを含んだ新しい蛍光ヌクレオチドを含んでいる。ざらに固相担体に結合した、またはそれにより結合された、前述の蛍光アナログの３゛　−Ｏ−フォスフオルアミダイトを提供するのは、さらにもう一つの本発明の側面である。３　“　レオ　゛　口　の　゛　び　の　゛フォルマイシンＡは、Ｎｏｃａｒｄｉａ　１ｎｔｅｒｆｏｒｌ！ａの培養液からりボヌクレオチドとして分離される。該抗生物質はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　１ａｖｅｎｄｕｌａｅＩ！：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｕｍｍａｅｎｓｉｓの培養液からも分離され、あらゆる由来のＲＮＡに通常存在するＮ−ヌクレオシドに対する、多数の微生物由来のＣ −ヌクｌ／オシドアナログのうちのひとつである。微生物から分離された他の通常存在するＣ−ヌクレオノド（図５）には、フォルマイシン８１オキソフオルマインンＢ、ンユードウリジン、ショウドウマイシン、ビラゾマイノン、そシてミニマイノンが含まれる。フォルマイシンΔ、フォルマイシンＢそしてオキソフォルマイン７Ｂは、図６に示されるクラスのＣ−ヌク１ノオシドまたはピラゾロピリジンヌクレオシドであり、各々、アデノシン、イノシン、ハイボギサンチンの構造アナログである。自然から得られるグアノン：／のビラゾピリミジン構造アナログは、文献には報告されていないが、２−クロロ−フォルマイシンＢまたはそのデオキシ型から化学的に合成できる。これらの化合物の生合成は　ｒｏｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　（＋９７４）　Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｘｘｉｖ、　：９０９−９＋６Ｊにまとめられている。Ｃ−ヌクレオチドのＮ４．Ｎ６誘導体の合成はｒＬｃｖｉｓ　ａｎｄ　Ｔｏｖｎｓｅｎ＋ｊ　（［１９８０］　Ｊ、＾膜、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　１０２：２ｇ１７月に記載されているやイソメリックアミノビラゾｏ［３，４ｄｌ−ピリミジンの相当する合成は「萱１ｅｒｃｈｏｖｓｋｉ　ｃｔ　ａｌ、　Ｊに記載されている。他の全てのものはリボース、いくつかはアザヌクレオチド、デアザヌクレオチドを含むデオキシ、ジデオキシ体の形で商品として入手可能である。またははじめから、すなわち７−ジアザアデニンから合成することができる（Ｇｅｓｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　［１，９６？］　Ｊ、　Ｍａｄ、　Ｃｈｅｓ、ＩＯ：３２６）　、　ピラン０−ｓ−）リアジンのクラス（ｇｑえばピラゾロ［１，５ａ］　−１，、３，５−トリアジン）のＣ−ヌクレオシドアナログはｒＦｏｘ　ｅｔ　ａｌ、　［Ｉ’１７６］　Ｊ、　ｌ１ｅｔｅｒｏｃｙｃ１．　Ｃｈｅｗ、　１３：１７５Ｊで初めて記載されたように、ｒミノピラゾール−Ｃ−ヌクレオシドからｙ４製された。ニヱ交圭し笠二呂」１いし蜆隘朕０１叉Ｕ−ｎｉ±ｊ展ｄコ化とジＬ０１点化学的合成は、Ｃ−ヌク１／オンド同様、Ｎ−ヌクレオシド、エタノヌクレオシドを２−デオキシ型や３−デオキシ型として誘導体化する文献に従って実施可能である。（Ｒｏｂｉｎｓ　ａｔ、　ａｌ、　［１９７３］　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｃｈｅｌｌ、　５１＋＋３１３：　Ｊａｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　m＋９７３］Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｃｌｌ、３８：３７１９：ＤｅＣｌｅｒｑｅｔａｌ、［１９８７コＪ、１ｌｅｄ、Ｃｈｅｗ、３０：４ｇ＋）類似した方法は、アザヌクレオシド、デアザヌクレオチドのデオキシ型にもあてはまり、上記文献及び別の文献Ｊこ記載されている。（例えば、Ｒｏｂｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　［１９７３］Ｃａｎ、Ｊ、　Ｃｈｅｗ、５５；１２５１：　ＤｃＣＩｅｒｑ　Ｃ４ａｌ、５ｕｐｒａ＞　３°−アジド、３°　アミノ、２°　３°　−未飽和そして２゛　３°　 −ダイデオキシアナログの合成のためのプロトコールや手順は報告されている。（Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　［１９８７］　Ｊ、　ｆｌｅｄ、　Ｃｈｅｗ、　３０：４４０：５ａｒａｆｉｎｏｖｓｋｉ、　Ｐ、　［＋９８７］　５ｙｎｔｈｅｒ、ｉｓ　ＩＯ＋８７９）シリルまたはＦＲＥＴの一部分での２’−ＯＨの保護または誘導は、ビーターノンとアンダーソシによってなされｌこ。　（［＋９８９コ　５ｉｌｉｃｏｎ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓｏ　Ｒｃｇｉｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ｒｅｖｉｅｗ、　Ｐｅｔｒａｒｃｈ　Ｓｙ唐狽■高刀A１１Ｃ９ｐｐ、　６０−７０＞ここで報告されたものは、Ｃ−ヌクレオシドをリボースからデオキシリボースに変換する際に、アナログの２゛　−デオキシ型のみ生成する環状保護の手順についての新しい応用であり、それらを利用した方法によって、前述したアセトキシイソブチリルハライドの手順を使って製造した２つのアイソマーを分離するのに必要である困難なｆｆ３２なしで、大量の収量が得られる。ヌクレオシドアナログの１．３リン酸型は、酵素的合成において、例えば既に確立されたリン酸化または化学的リン酸化によって作ることができる。概して５゛−リン酸はＰＯＣＩ　２によって化学的に作られる。（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｋｈｏｒａｎａ　［１９５＋１］　Ｊ、＾−，Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　８０：１Ｉ４１：　Ｙｏｓｈｉｋａｖａ　ｃｔ　ａｌ、　Ｈ９６７］　Ｔｅｔｒａｌ＋ｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　５０９５）それに相当する三すン醗は同じ文献またはマイケルソンの文献（［１９６４］　Ｂｉｏｃｈｃ＋＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｅｔａ　９１：Ｉ）に従って化学的に合成することができる。ま１．：はホードとオツドの方法（［＋９６５］ｊ、＾ｗ＋、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　８７＋＋９８Ｓ）でもよい。すなわち、−リン酸は、−リン醸化型を与えるトリブチルアンモニウムビロリン酸に続いてカルボジイミド（ＣＤＩ）で処理される。これは、露出されたアミノ基でアナログをリン酸化するのがよく、そのような置換体はティヤーなどの手順に従ってエチルトリフルオロチオアセテートで処理することによってチオアセチル化することができる。（［１９７４］　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、１３９：６０９）ｌ−ユにυ−ｊ７ムに艶り五Δ丘五本発明は、通常存在するヌクレオシドに対する単数または複数の蛍光ヌクレオシドアナログを、合成オリゴヌクレオチドへ導入するための合成方法を示している。１、　７　２７＜／ｌと（辷ｌイ」ゴ旧九丹　１光フオスフズ・ルアミダイトは、蛍光タフ１ノオンドアナログのリボースとデオキシリボースモノマーから合成できる。本発明に従って、蛍光残基は２゛−デオキシフォルマイシンへのようなヌクし・オシドアナログに対して保護基が導入された３°　−０−フォスフオルアミダイトを最初に合成すること１ごまって、化学的にオリゴヌクレオチド・−・−と合成される。それから７オスフオルアミダイ）・は対応する一般的フオスフォルアミダイ；・、この場合、デオキソーアデノノン−３°　−０−フォスフオルアミダイトへ１換され、そして、一般的フォスフ−トリエステル化学合成を使って固相担体上で合成されるオリゴヌクし・オシドと反応する。β−ンアノエチル誘導体は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの中の望むべき塙匹１ご選択的１；挿入され、６０またはそれ以上の長さの規定されたソークエ、・・スのオリゴマーを生成し１、あらかじめ決められた数の蛍光塩基Ｗを有している。例えば、セルフハイグイダイゼーンヨンしていないオリゴヌクレオチドが合成されたが、それは、完全に繰り返す配列［Ａ、Ｃ１ｘと（ＦＣ）ｘ　（ここでＸは、ＡＣ，ＦＣダイマーベアーの数であり、Ｘはｘ−１０、］５．２０．２５．３０の数をとり、単−工■２においでもぐ〉９８％）全工程においてもほとんど同一の合成収率Ｃある）を有している。そして［ＦＣ］ｘは蛍光だが［ＡＣ］　ｘはそうではないというへだけが異なるオリゴマ〜・が合成される。両方のオリゴ７−は、シーフェンス［ＴＧ］ｘの相補的なもう一方のオリゴマーと特異的にハイ゛ブリダイゼーンヨノするが、それ自身や［ＡＣ］ｘと［ＴＣ］　ｘのように非相補的なシーフェンスとはハイブリダイゼーシヲンしないことが、（１）アガロースゲル上でエチジウムブロマイド染色、（１１）ハイブリッド融解時の挙動、によ、て示される。［ＦＣ］　ｘ　：　［ＴＧ’］　ｘ及び［ＡＣ］　ｘ　：　［ＴＧコＸハイブリ）・ドの０．０７５ＭＮａＣ１における融解転移温度に相当する値は、与えられたＸ（オリゴヌクレオシドの長さ）の値と１’Ｃ未満の違いであった。特に、本発明の一つの側面は、蛍光ヌクレオチド、そり、　’ｒ蛍光構造アナログの３゛　−〇−フォスフオルアミダイトの合成、そして規定の７−クニンスを持つ蛍光オリゴヌクレオチドを効率よく合成するためのアミダイトの用途、そして、増幅プライマー、雷光オリゴヌクレオチド°付は札”やハイブリダイゼーンヨノブローブのようなオリゴヌクレオチドの用途を含んでいる。２　ポＩＩボヌ′−区ｔ±」ｊ工Ｉｉｉ色」ｌ−、Ｉｙ　Ａｒ九五ｑ便月規定された配列を有する蛍光ポリリボヌクレオチドやポリデオキシリボヌクレオチドは、化学的合成、クローニング技術によってｔｅｌ＄２され、またはゲノミック１）ＮΔから得られたものを含む、さまざまな由来のＤＮＡ鋳型を使って８素的に合成することができる。フォルマイシンΔまたはアデノシンのどちらかのリボース三リン酸と一緒にＤＮＡ鋳型、大＆Ｓ菌ＲＮΔポリメラーゼ、シチジン、ウリジングアノシンで構成されるｒＮＴＰの３つを使ったＲＮＡオリゴヌクレオチドの代表的な合成が、１１１２において説明されている。フォルマイシン八またはアデノシンのどちらかのリポース三すン酵と一緒に、方向性のあるプロモーター、ウィルスＲＮＡポリメラーゼ、シチジン、ウリジン、グアノノンで構成されるｒＮＴＰの入った鋳型を使ったＲＮΔプローブの代表的な非対称合成（ａｓｙｍｍｅｔｒｊｃ　１ｌｙｎｔｈｅｓｉｓ）が、図１３に描かれている。対称ポリデオキシリボヌクレオシドは一般のＤＮＡポリメラーゼ合成、そして熱安定ＤＮＡポリメラーゼ酊素、ポリメラーゼ鎖反応を用いてＤＮＡ４ｍによって、２゛　−デオキシフォルマイシンＡ−５゛　−三リン酸（ＦＴＰ）をデオキシアすノシン−三リン酸（ｄＡＴＰ）に置換することにより作成される。ｔ（応する非対称合成は。同じ試薬、同じ手順を泪いてできるが、以下の修飾を伴う。（ｉ）フレノウ断片または修＠Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼのようなりＮＡポリメラーゼを用いた合成は、Ｍ１３フォワードプライマーシークエンスのようなプライマ一部位が、鋳型として使われるシーフェンスの始まりの場所で二本鎖のうちの一方の鎖へ入れられたｉＪｌ型を使用した。そして、その相当するプライマーは全ての合成を開始させるのに使われた。（ｉｉ）鋳型のうち、一方の鎖とのみ相補的なプライマーは、非対称１）　ＣＲとして通常記載されている増幅において使用された。（ｉｉｉ）プライマーの組のうちのどれかひとつが、ビオチンのようなリンカ−と結合した組になったプライマーは、ＰＣＨのような一般のＤＮＡ増幅で用いられた。しかし好ましくは、一方の鎖は、結合性のあるカラムまたは磁気ビーズを利用する方法などによって、その後の分離によって取り除かれた。これに匹敵する合成は、例えば、２−アミノプリン、２．６−アミノプリン（アデノシン−５“　−三リン波を置換する）の蛍光Ｎ−ヌクレオシドやフォルマイシンＢまたは５−アミノフォルマイシンＢ（イノシン三リン酸、グアノンン三すン駿をそれぞれ置換する〉の蛍光Ｃ−ヌクレオシドのリボースまたはデオキシリボース型の一方を含む、他の置換によって達成することが可能である。ＣポＷヌ　レオ　゛のＲ，Ｎ　ＡやＤＮＡは限定されていないが、以下のような方法を含むいくつかの方法で＃素的にラベルすることができる。（ｉ）フォワードリン酸化反１２；　（Ｒｉｃｈｇｒｄｓ。ｎ、　Ｃ，Ｃ，［１９６５）ＰＮＡＳ　５４：Ｉ５８ンまたは交換キ六−ゼ反応（Ｖａｎ　ｄｅ　５ａｎｄｅ　ｅｔ　ａＪ、。［＋！１７３）ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒＹ　１２：５（１５１））を用いた５° Ｄ　Ｎ　Ａ末端ラベル化、（ｉｊ）１１ｍ断片とアニールした混合配列のへキザデオキシヌクレオチド伸長することによる混合プライマーラベル化ＣＦｅ４ｎｂｅｒｇ、　Ａ、、　Ｂ、　Ｙｏｇｅｌｓｔｅｊｎ口９８３］Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３２：６；　Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、　ａ、、　Ｂ、　ＶｏＨｅｌｓｔｅｘｎ　［ｌ９Ｊ１４］　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ、１３７＋２６６j、（ｆｊｉ）デオキシ三リン酸のそノヌクレオチド単位の繰り返し付加（Ｏｋｕｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、　［１９８７）　ｌ１ｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ＋＋ｏＪ、　Ｉ５４：２８：　Ｂｅｊｄｅｃｋｅｒ、Ｇ、、Ｊ、ｌｌｅｓｓｉｎｇ　０９ｇ７）　Ｍｅ狽■盾р刀@Ｅｎｚｙｉ＋ｏｌ　１５４：２１ｔ）あるいはデオキシミリン駿の単一付加、またはＤＮＡイニシエーターのターミナル３゛　−ヒロドキシルの蛍光ヌクレオチドアナログの中のいくつかの繰り返し付加を触媒するターミナルデオキシヌクレオチド転移酵素を用いる３’−ＤＮＡ末端ラベル化、それは規定されたシーフェンス、例えば下記のように合成されたＣｈｌａＨｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ　Ｗθ計遺伝子プローブを含む、（ｉｖ）非蛍光のゴヌクレオチドが適当な蛍光ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴマーとライゲーションすること１こよってラベルされる、ライベースラベル化（Ｐｈａｒｖａｃｉａ　ＬＫＢ　［＋９８９］＾ｎａｌｅｃｔｓ　１７．２：　Ｈｅｌｆｗａｎ、　Ｄ、ｉｌ、　［１９８７］　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｉｏｌ、　１５２：３４３）　、（Ｖj二ｉａで存在するＤＮＡ鎖にランダムに蛍光アナログの三リン酸を入れるのにＤＮＡボリメＤ　た　の　上オニｊフルオー１の　のハイブリダイゼーション、熱変性、アガロースゲル泳動、蛍光検出法は規定された配列のオリゴヌクレオチドの性質を調べるために使われた。ある場合には、蛍光オリゴヌクレオチドは臨床上ｉｉ要な痛原菌または変異、すなわちＣｈｌａｍｙｄｊａｔｒａｃｈｏＩｌａｔｊ、ｓ　ＩＩＯＭＰ遺伝子から得た標的ＤＮＡのような既知の配列と相補的であった。これらの実験では、蛍光オリゴヌクレオチドの酵素的合成に用いられる鋳型は、その後のハイブリダイゼーションの研究で標的ＤＮＡとして使われることもある、クローン化した断片であった。標的ＤＮＡとオリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることによって、蛍光プローブにおいて構造アナログの蛍光の消失が起こる。そして、蛍光はハイブリッドのＭＭによりて回復し、ハイブリダイゼーションが起きたことが判明する。合成オリゴヌクレオチドポリ（ｒＰｒＵ）のセルフハイプリダイゼーシ」ン（以下に詳しく述べるが）は、そのような実験で得られた代表的な結果であり、表１にまとめられている。本発明の主題に沿った望むべき工程は、４つの基礎的段階を含む。はじめに蛍光構造アナログは化学的生物学的に、しかも蛍光オリゴヌクレオチドプローブを合成するのに必要なように、更に誘導化される。第２に興味ある核酸サンプルと相補的なりＮＡまたはＲＮＡプローブ分子は、（１）ランダムに、またはその長さにわたって特異的な位置に分布することができる。（］１）以下に述べるような末端ラベルとして配置することができる蛍光ヌクレオシドアナログを持っているように作成される。第３に、核酸サンプルは未反応のモノマーから分離され、特異的ハイブリダイゼーンミンブローブに付ける固有のものでない非特異的なラベルとして、または直接ハイブリダイゼーションプローブとして用いることにより直接性質を調べることが出来る。後者の場合、ハイブリダイゼーションは、サザンプロットトランスファーまたは”　ドツトプロット°技術のように標的ＤＮＡ／ＲＮＡまたは蛍光プローブのどちらかが固定される固相上で起こる。または液体上くここでは”ソリューションハイプリダイゼーシゴン“）で起こる。その後、プローブ／標的ハイブリッドは、単に洗浄またはろ過によってハイブリダイゼーションしていないプローブと分離される。最後に標的ＤＮＡ／ＲＮＡヘハイブリダイゼ本発明に従ってあらかじめ選択された蛍光ヌクレオシド類似体または、蛍光類似体の混合物は、単数または複数の非蛍光性の通常存在するヌクレオシドを特異的に置換し、そして、指示されたプローブを作るためにＤＮＡまたはＲＮＡに取り込まれる。指示された配列は、通常存在するヌクレオチドから構成されるヌクうに選ばれてもよいし、与えられた標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的であってもよい。このような蛍光プａ−プは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの相補的配列の類似体と呼ばれる。蛍光プ。−ブは、（ｉ）ハイブリダイゼーションプローブ、（ｉｉ）与えられたプライマーのセントに［補的な増幅可能な遺伝子配列の直接検出の７ンプライマー、または（ｉｉｉ）例えばライゲーションなどによって特異的ハイブリダイゼーションプローブに取り付けることができる非特異的 “ユニバーサル“標識、のようなその後の利用のために、酵素的か、化学的かどちらかによって合成されるであろう。通常存在するリポ−、デオキシ−１またはジデオキシリボヌクレオチドの蛍光ヌクレオシド類似体は、ここに示す手法を含む、しかしこれに限定はされない、いくつかの興なった伝統的な酵素的それに化学的手法の一つを用いて核酸重合体に取り込まれることができる。上」目しｂＬ酵素合成は以下のことを含む。（ａ）　二本鎖ＤＮＡの片方の鎖へ「ニック」を導入するためのＤＮａ　ｓ　ｅ　＋の利用。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌのホロｌＩＩ素により、これらのニックを、蛍光ヌクレオチド三リン酸類似体、例えばデオキシホルマイシノン−５゛　−三リン酸（ＦＴＰ）と通常のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の混合物を利用して、反応液中で伸長したり修復することができる。この方法だと二重らせんの両方の鎖全体にランダムに多数の蛍光体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）を導入できる。実際には、実質的な合成収量の減少、ハイブリダイゼーション待興性やＤＮＡ融解温度から見た二重らせん形成強度の低下なしに、通常のヌクレオチド（この場合デオキシアデノシン−５″　へ三リン５１（ｄＡＴＰ））を全く除いて代わりｌ：　ｄ　Ｆ　Ｔ　Ｐで置換で（ｂ）　制Ｆ１１酵素の使用によって生じたオーバーハングしたＤＮＡ−水路領域を埋めるためのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片やＴ４ＤＮＡポリメラーゼを含む種々の＃索の使用。この方法では蛍光Ｊｉｆ体をそれぞれのＤＮＡ鎖の末端に集中させる。同様に、特定のＤＮＡＩこ相補的な蛍光ＤＮＡオリゴヌクレオチドは（ｉ）ＤＮＡ鎖片と大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの使用、または請求めるＤＮＡ鋳型配列のすぐ５゛側にＭ１３正向きプライマーがあるというような、特定のプライマーに対するプライマーサイトを含む組み換えプラスミドの構築、によって合成が可能である６ＤＮＡポリメラーゼは反応液中に存在するデオキシリボヌクレオチドもしくはデオキシ類似体（例えばｄＡＴＰの代わりとしてのｄＦＴＰなどを含む）を利用して相補的なりＮＡ分子を合成する。（ｃ）　末端への蛍光類似体の集中を生ずる取り込み法には、ホモポリマーもしくは蛍光デオキシ類似体の”尻尾゛をＤＮＡオリゴマーの３“に付加する”テーリング酵素すなわちターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼの使用が含まれる。実際には、通常のヌクレオチドに代えて蛍光ｆｓ似体を用いてホモポリマーを合成したときの収量はヘテロポリマー合成時の収量よりも明らかに少ない。他の方法としては、例えばグイデオキシＡＴＰ　＜コルデシピン）を使用するのと全く同じ方法で蛍光類似体のダイデオキシ型または２′を保護した蛍光類似体（ＦＲＥＴ保護された類似体を含む）を用い同じ＃素を使用して一個の蛍光ヌクレオチドａ似体を付加する。ハイブリダイゼーションプローブを末端ラベルする第三の方法はＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼの反応を利用するもので、これにより非特異的な二本鎖または一本鎖蛍光オリゴヌクレオチドを特異的なハイプリダイゼー７＝Ｉンプａ−ブの３°または５゛末端どちら側でも共有結合させることが可能である。すなわちこの方法において使用される蛍光オリゴヌクレオチドはプローブの特異性を決めるワトソンークリック型塩基対に参加する必要がなく、一般的または普遍的な蛍光の”荷札（ｔａｇ）”としてだけ働く。上に述べたいずれの方法でもＤＮＡプローブは二本鎖であり、ハイブリダイゼーションに先立って熱またはアルカリ処理によって一本鎖の形に変性させなければならない。（ｄ）　標準的なりＮＡ増増幅たは復製の方法といくつかの利用できるＤＮＡポリメラーゼ（熱安定なりＮＡポリメラーゼを含むがそれに限らない。例えばＴａｑポリメラーゼ、修飾されたＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、クレノー断片モしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼなど）を利用し、蛍光デオキシリボヌクレオチド類似体（例えばＡＴＰやＧＴＰのそれぞれの代わりとしての２゛　−デオキシホルマイシン Δ−５−三リン酸や５−アミノーデオキシホルマイノンＢ−５°　−三リン酸）のうちの一つをヌクレオチド三リン酸の混合物中で置き換えて、指定された長さと塩基配列を持つ蛍光プローブの生成の標準的な方法として利用できる取り込み法。蛍光オリゴヌクレオチドは、通常のヌクレオチドを使用した非蛍光オリゴマーに対して収量や長さにおいて同等であり、標的ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズし一度ハイブリッド二重鎖を形成すれば非蛍光のコントロールが示すのと同じ熱安定性やエチジウムブロマイドによる染色性を示す。このような増幅において、蛍光オリゴヌクレオチドの生成は特定の配列が存在する直接の証拠ととれるが、同一性は（ｉ）確定した相補的プローブとのハイブリダイゼーション、そして（ｉｉ）類似した配列を確認するための塩基配列決定、によりさらに確認できる。（ｅ）　特定のＤＮＡ鋳型に相補的な蛍光ＲＮ人オリゴヌクレオチドの使用。蛍光ＲＮＡオリゴヌクレオチドは（１）図１２に書いであるようにＤ　Ｎ’　Ａ断片と例えば大１１１１Ｒ，Ｎ八ポリメラーゼを使って対称的に、もしくは（ｉｉ）図１３に示しであるように鋳型として使用されるめるＤＮＡ配列のすぐ５゛倒に特定のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む組み換えプラスミドを構築することにより（例えばプローブとのハイブリダイゼーシ麿ンの標的として利用される配列を持つクローン化されたクラミジアＭＯｉｌＰ遺伝子断片のすぐ５゛側にＴ７ＲＮ八ポリメラーゼのプロモーターがのっているＤＮＡ鋳型）非対称的に合成することが可能である。多くの応用のためには非対称的合成が好まれる方法であり、対応するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、リボヌクレオチド（例えば、ＴＴＰがＡＴＰの代わりにＵＴＰがＴＴＰの代わりに使用される。これらは鋳型の二本鎖のうちの一本に対する類似した相補体である。）を用いてＲＮ八へ子を合成するであろう。その結果生じる一末鎖プローブは、変性させる段階なしにその後のハイブリダイゼーソヨン反応に直接利用できる。ｌ工■ヱ立基保護された蛍光デオキシヌクレオシド類似体−３’　−０−ホスホールアミダイト（Ｊｌｌ型的なのはＲ１０＝ジメトキントリチル、Ｒ１５＝メチルもしくはベータシアノエチルである）が、標準的なホスホールアミダイトＤＮＡ合成技術（＾ｔｋｉｎｓｏｎ。Ｔ、、　ａｎｄ　Ｍ、Ｓｍ１ｔｈ［１９８４］　Ｉｎ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ@Ａｐｐｒｏａｃｈ。１１、Ｊ、　Ｇａ１ｔ、　ｅｄ、、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　ｐｐ３５−８２）を利用して固体支持体（ｇｏｌｉｄ　５ｕｐｐｏｒｔ）にとりつけられた伸長中のオリゴヌクレオチドの５°水酸基に結合される。５゛水駿基の保護を酸による洗浄ではずされた固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドは、アルゴンとテトラゾール存在下の無水アセトニトリル中で５゛−トリチル保護されたデオキシヌクレオチド類似体−３°　−０−ホスホールアミダイトと反応し、余分な試薬は洗い流され亜すン駿生成物は水様の（ａｑｕｅｏｕａ）　Ｔ　ＨＦ中でヨウ素溶液によりめるリン酸へと酸化され無水アセトニトリルにより洗浄される。新しい５゛末端を脱保護するための酸洗浄の後必要な長さと配列を得るために必要な回数同じサイクルを繰り返すことができる。さらに加えられるヌクレオチドは通常のヌクレオチドかも知れないしさらなる蛍光ヌクレオシド類似体かも知れない。従って一個もしくはもっと多くの蛍光体が与えられたプローブ中に取り込まれるかも知れないし、例えばめる配列中のすべてのＡ塩基がホルマイシン塩基と置き換えられる、というように完全な置換も含まれる。結合反応は反応時間１０分として手作業によりミニリアクターバイアル中で行うか、ファルマンアＬＫＢシーンアセンプラーかそれに類したプログラムされた合成手順を利用した機器によって行うことができる。蛍光オリゴヌクレオチドはそれからＮ８４０Ｂ　：エタノール（３：　１）中で５５℃−晩インキユベートする事により多孔性ガラス支持体からＤＮＡを切り離すことで単離される。水酸化アンモニウム溶液を含む蛍光ＤＮＡは５ｐｅｅｄ−Ｖａｃ中ですばやく乾燥し、合成に失敗した配列から低塩濃度とｐＨ勾配でＱＥＡＥ−１１ＰＬｃカラムにより分離される。ヌクレオシド類似体ホスホールアミダイトの収量は脱保護反応段階で放出されるトリチル陽イオンから計算される繰り返しの収Ｉに基づいた標準的なアミダイトの収量に匹敵する。蛍光ヌクレオシド類似体を含むプローブ分子をどのように構築し使用するのかの特定の実例を供給するために、以下は発明を実行するための最良の態様を含む手順を説明する例である。これらの例は限定的に解釈されるべきでない。すべてのパーセンテージは重量によるものであり、特に注意がない限りすべての混合溶媒の比は体積による。 ■　ルマ　シンへの２゛−−オ　シ　ルマ　シンへの　゛　°−１ス　エ　な′ びに°−０−２−シ　ェ　ルー１ジ　゛　ロビル　ル　ミ王土曵星１フォルマイシンへの２゛　−デオキシ−５°　−トリフォスフエイトまたは２゛ −デオキシ−３°　−０−フォスフオルアミダイトを合成に用いた合成計画を図１６に示した。第一段階は、Ｄｅ　Ｃ１ｅｒｑら（［＋９８７］　Ｊ、　ＭＣｄ、　Ｃｈｅｓ、　３０：４８１）のα−アセトキシイソブチリルハライドを用いた反応によってすでに達成されているが、その方法は分離が困難な３゛及び２゛両デオキシ体を生成してしまう上、収率も低かった。本発明は３°、５゛−ジシラ保護を用いたが、これはアデノシンから２゛　−デオキシアデノシンへの変換（［＋９８１］　Ｊ、＾ｓ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓａｃ、　１０３：９３２）　ｌ：応用されて成功を収めたものである。この方法は、多くの蛍光ヌクレオシドアナログの同様な変換に、概して応用が可能であると思われる。 ■７−　ミ　−３−　’５’−０−１１３３−一トーイソ　ロピルー１３−ジシロ　サンージｉルー　−Ｄ−１ボフー　シルビーゾロ　４３ｄ−ζ匹２２１．３ −ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピル−１，３−ジシロキサン（０，９ｇ、２．８５ｍＭｏ　Ｉ）を、無水ピリジン中で完全に脱水したフォルマイシン八（０，６６ｇ、２．　５ｍＭｏ　ｌ）の懸濁液に加え、室温で２４時間攪拌した。Ｔ＝４０”Ｃで減圧下溶媒を除去し、生成物を酢酸エチルと水の間で抽出した。酢酸エチル層を、（息）冷却したＩＮ塩酸、（ｉＩ）水、（ｉｉｉ）炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、（ｉｖ）塩化ナトリウム飽和水溶液で順に洗い、減圧下溶媒を除去してガム状にした。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーを行い、これを（ｉ）２．５％メタノール−クロロフォルム、（ｉｉ）６％メタノール−クロロフォルムで段階的に溶出した。この生成物は、シリカＴＬＣ上でシングルスポット（Ｒｆ＝０．８０．２０％メタノール−クロロフォルム）として検出され、３゛　５゛環状保護されたものであることが、プロトンＮＭＲと元素分析より判明した。ＬＬＬ７−　ミノ−３−３°５’−０−１１３，３−−−イソプロピル−１３− ブチロ　サンージｔルー２゛−エ　ン　オカルボニル）−ひ−ｌポフラ　シルピラゾロ　４３ｄビ■４８０ｍｇのジンラ保護されたフォルマイシン八（０，９３ｍＭｏ＋）を、ＤＭＡＰ　（０，９ｇ、７．６ｍＭｏｌ）と共に綴本Ｍ　ｅ　ＣＮ中に溶解した。すりガラスジヨイントにはめこんだ乾燥ンリンジにを用いて２００ｍＬのフェノキンカルボニルクロライドを滴下し、反応物を室温で２４時間攪拌した。減圧下溶媒を除去した後、生成物を酢酸エチルと水の間で抽出した。酢酸エチル層は上述同様に洗い、溶媒を留去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィーで分離し、クロロフォルム−ＭｅＣＮ（５０１５０）で溶出した請求める生成物の分画をプロトンＮＭＲと元素分析で同定し、これを用いて以下に述べる次段階の合成を行った。ＬＬＬＬＺ−ミ　−３−２′−−Ｄ　−１ボフラ　ノル）ピラゾロ４３ｄピ１ジン（２゛−一オシフ　ルマノン＾上述した（ｌ　１）の手順で得られた２４０ｍｇの生成物を、大過剰のヘキサメチルジンラザン存在下１２．５ｍｇの（ＮＨ＋）ｒｓＯａに加え、混合物反応液を６０°　Ｃより高い温度で一晩加熱還流した。減圧下溶媒をエバボレートし、粗トリシリル誘導体をトルエンに再溶解し、アゾビスイソブチロニトリルとトリブチル水素化スズを用い、窒素気流下で一晩加熱して完全に還元させた。生成物は、ＴＢＡＦのＴＨＦ溶液を用い、８０°　Ｃで一晩脱保護し、溶媒を留去、酢酸エチルと水との間で抽出した。水層を濃縮し、水で平衡化させたＤｏｗｅｘ　５０Ｗ−Ｘ８カラムにアプライして、１５％ＮＨ，ＯＨで溶出した。主生成物（Ｒｆ＝０．３．２０％メタノール−クロロフォルム）は、Ｄｅ　Ｃ１ｅｒｑらの方法を用いて調製された純粋な２”−デオキシフォルマイシン八と同一であることが、プロトンＮＭＲと元素分析により判明した。＋１’　７−　Ｅ　−３−２−−Ｄ−１ボ　−　シ／ｌ／　ビー゛口４３ｄビ’ 　Ｅ　シ：、ｚ−５’−ト１フ　スフェ−２“−デオ　シフ　ルマシン＾−５゛ −ツ　ス　ニー２８ｒｒ＋ｇ　（０，ｌｌｍＭｏ１）の２゛　−デオキシフォルマイシンＡをガラス蓋付き試験管に入れ、０．２ｍＬの試薬グレードのアセトンとＯ，１ｍＬのフォスフォラスオキソクロライドと混合した。不均一な反応混合液を４°Ｃで２４時間攪拌したが、その間溶液は濃黄色に変色した。冷却後３ｍＬのアセトンを加え、攪拌しながら直ちに６ｍＭｏｌの濃ＮＨ，ＯＨを加えた。アセトンを減圧下留去後、ｐＨを２以下に抑えて反応混合液を１．５時間加熱還流させ、Ｄｏｖｅｘ　−１−フォルメイトに希釈して直接アプライし、２゛　− デオキシフォルマイシンＡ−ＭＰを０゜７５ｍＬのギ酸で溶出した。２゛−デオキシフォルマイシンＡ−ＭＰは、Ｙｏｓｈｉｋａｖａらの方法（［＋９６７）　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　５０９５）によって、トリフォスフエイトに変換した。Ｖ）７−　ミ　−３−２−デオ”ＩＬ：　Ｄ　−１ボ　ラ　ノルビーゾロ４３ｄビ票ミジン−３’　−０−フ　スフ　ル　ミ　イ　２゛−−オ　シ　ルマシン＾ −３′−〇−フ　ス止ヱ区ｌン」」２°−デオキシフォルマイシン八に、ＤＭＴによる５°　−〇−保護と７−アミノ基のベンゾイル化をかける処理を常法に従って行った。１．．５ｍＬのジクロロメタンに溶解した０、３ｍＭｏｌの生成物と２５ｍｇのジイソプロピルアンモニウムテトラゾライドに、０．３３ｍＭｏｌのＯ−シアノエチル−Ｎ、Ｎ、Ｎ’ 　。Ｎｏ−テトライソプロピルフォスフをロジアミダイトを含む溶液を加えた。混合液を４時間攪拌し、ジクロロメタンと冷却した炭酸水素ナトリウム飽和水溶液の間で抽出した。ジクロロメタン層を無水塩化ナトリウム飽和水溶液で洗い、硫酸すＩ・リウムで脱水し、ろ過した後濃縮した。２５ｍｍのカラムに詰めた２“の塩基性アルミナでろ過し、ＣＨＣ，ｊ／ＥＴ、Ｎ　（９：　１）で溶出する精製によりて、泡状になるまで乾燥させることができたフォスフオルアミダイトであることが判明した。生成物の同定は、ブクトンＮＭＲ，元素分析、ヘテロサイクルの蛍光で確認し、オリゴヌクレオチドの合成に用いた。匠ｌ−且五人圭ム僅ＤＮへプＯ−ブ１こＩ　ＦＴＰ　た　２°　ｄ　Ｆ　Ｔ　Ｐ　Ｅ　廷ＴＰ　たはｄΔＴＰの　ｔ−う　ｔ” ［呈ｆ：）１巳じたシボＬ仇庄ｍ澄見　３つのＤＮＡテンプレートからＲＮＡオリゴヌクレオヂドを合成した（図１０）が、これには（ｉ）ＡＴＰの代わりにＦＴＰを用い、（１１）精製したＥ、ｃｏｌｉのＲＮＡポリメラーゼを使用した。ただし、反応を止める前に３７°Ｃで３時間反応を進行させた点が、Ｗａｒｄらの方法（［１９６９］　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＠、＋２：３２４２）とは興なっている。これにより、ＦＴＰは効果的にＡＴＰのみと置換し、他の通常のヌクレオチドＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰなどと置換することはなかった。合成が終わってから反応生成物を未反応試薬と分離したが、これには５ｃｐｈａｄｅｘＧ−５０とｐ　Ｈ７の飽和食塩水を４°Ｃで用いた。その概要は、図１９にフローチャートとして図示しである。この反応においてＲＮＡポリメラーゼは、合成したデオキシヌクレオチドポリマーのテンプレートを用いた場合と同様に、未変性及び変性させたＤＮＡを用いた場合にも、ＦＴＰを効率の良い基質として認識する。ＣＴＰ、ＬＩＴＰ＋ＧＴＰ。ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡテンプレートのひとつ、ＦＴＰかＡＴＰのいずれかを含むサンプル中では、両サンプルから溶出された分画中のモノマーのＮＴＰ＠に対し、高分子量の生成物はが７０％以上減少した。エノザイム・フリーのコントロールからは、小量のテンプレートＤＮＡ以外に高分子量の分画は全く溶出されてこなかった。また未反応のｒＮＴＰも減少することはなかづた。これと同様に、テンプレート・フリーのコントロールも、通常の三リン酸リボヌクレオチドと共に溶出されてくる未反応のｒ　Ｎ　Ｔ　Ｐ　シか含んでいなかった。天然の、もしくは合成したＤＮＡテンプレートを種々用いることでも、同様の結果が得られた。これらのＤＮＡテンプＩノートは、塩基が交互に並ぶポリｄ（ＡＣ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣＧＴ）を含んでいる。更に、ポリ（ＴＧ）またはポリ（ＧＣ）をＤＮＡテンプレートとして用い、（ｉ）Ｎ−ヌクレオシドアナログである２、６−ジアミツーアデノシノー５′　−トリフォスフエイト、または２−ジアミノ −アデノシン−５゛　−トリフォスフエイトを反応混合液中の八ＴＰと置換するか、あるいは（ｉｉ）Ｃ−ヌクレオシドであるフォルマイテンＢ−５°−トリフォスフエイト（ＦｂＴＰ）　、またはアミノ−フォルマイシンＢ−５゛のトリフォスフエイト（ａＦｂＴＰ）を反応液中のＧ　Ｔ　Ｐ　、！：　ｌｉ換するという合成によって、高分子量オリゴマーの十分な収率が得られた。ジアザ−及びアザ−ヌクレオシドアナログのいくつかをＡＴＰまたはＧＴＰ、！：ｆｉ！換した場合、テンプレートが何であろうと、収率は極端に低かった。Ｂ、ＲＮＡ　たはＤＮＡブロー　の」団ｌ涜基　試験管内において、基質及びハイブリダイゼーションのプローブとしてｍいるＲＮＡを合成するためにＤＮＡ依存型ＲＮ八ポへメラーゼ転写システムを用いることは、分子生物学においてきわめて日常的に行われている。本出願は、この方法を、自動蛍光プローブとその生成物の開発へとユニークに応用した。開発された方法は一般的な応用が可能であり、ＳＦ３、Ｔ７、Ｔ３を含むファージのポリメラーゼシステムなどにも適用できる。今のところ本発明は、図１３に示しであるように、プラスミドニ重鎮の相異なるストランドに離れて位置し、ポリリンカーの両端にある一組のプロモーターを利用している。ベクターは、（ｉ）プロモーターのひとつを認識するウィルス性ポリメラーゼを使用することで、非対称的合成の効果を上げ得るプロモーターを付けるため、また（１１）蛍光プローブ及びプローブのターゲットとなる非蛍光なコピーの非対称的生成に使用するテンプレートを複製させるために用いられた。ＤＮＡターゲットシークエンスのコピーは、二重鎖であり、プロモーターの一つに隣接する制限酵素認識部位にあるポリリンカーに挿入されている。コンピテントセル中のプラスミドの復製は、大量の転写のためのテンプレートを供給する。二通りの、相違点と相似点を持つ方法が、ＤＮＡプローブの非対称的合成のために開発されている。最初の方法では、図１４に示すように、５ｓＤＮ八プローブを、片方のテンプレート鎖の５゛端にプライマーの結合部位を持つテンプレートから合成する。そのような合成においては、プライマーは非蛍光であるか、または図の右側で示すように蛍光アナログであるフォスフオルアミダイ）・を用いて合成されなければならないであろう。この方法のバリエーンヨンとして、テンプレートの４鎖が蛍光オリゴマーの増幅によって複製されるような非対称的増幅とその分離がある。この方法は一組のプライマーを用いるが、父性したセンス鎖及びアンチセンス鎖を分離する際に用いられるビオチンのように、これらのうち片方だけが一時的な親和性を持つリンカ〜として適するものである。ＲＮＡとＤＮ八へプＯ−ブに関しては、転写員及びプローブ検出能が全て検定されているようなリファレンステンプレート、ブローブシークエノス、ターゲットシークエ／スを確立することが実用的であることが１明している。Ｘｅｎｏｐｕｓの翻訳Ｉ！長因子のアル７ｙｍ（Ｘｅ！−］（＋）がその目的に役立つが、ここで非対称的ＲＮ八へローブの合成が全てのＲ，Ｎ八及びＤＮＡの合成を反映するものとして用いられた。Ｘｅｆ−１αのｍＲＮＡは、Ｘｅｎｏｐｕｓの胚におけろ主要な転写産物であるが、これはｚｉｄｂｌａｓＬｕｌａ　トランノッンヨンの後で直ちに検出される非ミトコンドリア性ｍ　ＲＮへ転写物が非常に高い割合を占めている。Ｘｅｆ−１αの遺伝子は単離されており、ｃＤＮΔＤＮＡラリーの構築に際して、クローンの端にＥｃｏＲ１リンカ一部位が付けられた。】７０５ヌクレオチドからなるフラグメントを、片方の鎮多二Ｔ７プロモーター、その相補鎖にＳＰ６プロモーターを持つプラスミドｐｓＰ？２に挿入した。プラスミドの複製とテンプレートの直鎖化に引き続き、Ｔ７ポリメラーゼ、ｒＮＴＰ、ノチノン、ウリジン、グアノシン、そしてフォルマイ７ノΔかアデノシンいずれかのリボーストリフォスフエイトを用いて行った転写によって、４８９のＦまたはΔＩ！Ｉ＋基をそれぞれ含む１７４９塩基長のオリゴマーを生成した。全長よりも短い転写産物は見られなかった。また、どちらのケースにおいても、アナログとコントロールとしてのオリゴマーは適当量生成され、一般的にそれらを物理的挙動で区別することはできないが、アナログのシーフェンスは永続的に蛍光が施されていることで識別できる。この新しい合成システムには、ふたつのユニークな特徴がある。（１）アンチセンス鎖の合成をおこなったとき、例えばＳＦ３と通常存在する非蛍光ｒＮＴＰを用いた場合、高収率で統一されたターゲラトン−フェンスを与える。これに相当するＤＮＡプローブの非対称的合成においては、相補テンプレート鎖上の別のプライマーを同じ目的を達成するために用いる事が可能である。（２）何種類かの異なるプラスミドを含むプラスミドの混合物を、直鎖化テンプレートの”カクテル゛を作るために用いることができる。このＷＨｎ化テンプレートは、対応するプローブの”カクテル”から得られたものである。これらプローブは、ゲノムのシーフェンスの複数の部位に結合でき、それぞれが同時に転写され得る。企Ｌ」−一−２＝ＩＬこ］−ブー゛　口　ＲＮ八へローブの　パ　での１　ロー件ユ丘ｊＩ　イゼーシ　ンの例１のような、ポリｄ（ΔＴ）を用いた合成において、ＦＴＰを効果的に利用して、約３００−５００塩基長のポリマーを合成したが、それは、ポリ（ＦＵ）のシーフェンスを除けばＤＮＡテンブレー；・が全く別々に復製したものであることが、加水分解もしくはシーフェンスした時に判明した。このシーフェンスから予想されたことだが、生成物は１回のサーマルサイクルにおいてＤＮＡ鎖にアニールさせることができ、そのため、純粋な生成物ポリ（ＦＵ）：ポリ（ＦＵ）を生じた。これは、同じ処理をされたポリ（ＦＣ）と違い、予想されたようなセルフハイブリダイゼーノジンの証拠はみられなかった。この証拠とはポリ（ＦｔＪ）ポリ（ＦＵ）のアニールしたハイブリッドであるが、アガロースゲル中で臭化エチジウムで染色することで、吸光、蛍光のいずれでもンヤーブなサーマルトランジッンヨンを与えた。これはプローブが効率よくかつ特異的にハイブリダイズできることの証明である。精製したポリ（ＦＵ）−ポリ（ＦＣ）　、ポリ（ＦＣ）、ポリ（ＵＦｂ）　、ポリ（Ｃａ　Ｆ　ｂ）　、ポリ（ＦＣＧＵ）の吸光と発光のスペクトラムは、精製されたポリ（ＡＵ）　、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＡＧ）　、ポリ（ＴＧ）、ポリ（ＡＣＧ’ｒ）などのコントロールのスペクトラムは４つの点で異なる。（ｉ）ＵＶ吸光度の最大値は、アナログを含む生成物の２６５ｎｍからコントロールの２６０ｎｍにややシフトする。（１ｔ）重要な構造的吸光（室温で３つのピーク）が２９０ｎｍから３２０ｎｍの間に強くみられる。これは、無視できるような吸光を３４０ｎｍに伴っている。（ｉ　ｉ　ｉ）励起の最大値は３０３ｎｍにあられれる。（ｉｖ）可視領域にまで伸びるブロードな発光バンドが、４０５ｎｍのピークを伴ってみられる（ストークンフトと１０１０２ｎ。例えばポリ（ＦＵ）：ポリ（ＦＵ）ハイブリッドにおいて、蛍光が完全にクエンチされているということ、すなわち、溶液のｐＨを１０以上に上げることで二本鎖を変性させるまで蛍光を検出することができないということは、重要な特性である。いったん変性させれば、オリゴマーの蛍光は完全に組み込まれており、３６０ｎｍと４６０ｎｍの範囲で相対的蛍光強度はピーク強度の４０％以上である。４　・ＲＮＡ　・ＤＮＡへの　ロー　のハ　ブユタイエ丘上ｊ之１辺■区亙史ｌ支エエユ１玉山ＬＪ−乙ユ二のｌ１合成した鋳型であるポリ（ＴＧンを、相補的なＲＮＡプローブであるポリ（ＡＣ）とポリ（ＦＣ）の合成に用いた。これらはいずれも自己相補的ではなく、ハイブリッドはアニールしないか、検出できなかった。両者のうちポリ（ＦＣ）だけが蛍光を有する。これに似でいるが、ポリ（ＡＣ）テンプレートを増幅した実験を行った。すなわちビオチン化した２２量体のプライマーである５’　−ＢＩＯＴ　ＩＮ−（ＴＧ）ｌ　１−３’　を用い、ａＳのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を行って５’　−Ｂ　ＩＯＴ　ＩＮ− （ＴＧ）−３’　というシーフェンスを有するアンブリマーＤＮＡを生成し、ゲルサイジングもしくはＱＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーによって未反応のプライマーと分離させた。その後ポリマーを、３２Ｐ−ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射能でラベルした。ビオチン化されたアンブリマー５°　 −ＢＩＯＴＩＮ−（ＴＧ）−３’　とポリ（ＡＣ）、ポリ（ＦＣ）の両ＲＮへプローブを等モル量ずつ別々に混合したとき、それらが構成するハイブリッドは（１）臭化エチジウム染色と（１ｉ）解離の挙動によって区別できるわけだが、期待通り、ポリ（ＦＣ）プローブの蛍光がハイブリダイゼーシタンによってクエンチされた。アビジン化した吸着床を用い、５′　ビオチンの半分を通じてハイブリッドを吸着し、ハイブリダイズしなかったポリ（ＦＣ）を除去するために洗い流し、等量ずつに分けて放射活性と蛍光活性をアッセイした。洗ったサンプルの変性で重要な声は、溶液中の検出し得る蛍光活性が無視できるということである。高ｐＨのバッファーで変性させたとき、ハイブリダイズしたポリ（Ｆ　Ｃ）の量は、規格化されたプローブ溶比液の蛍光活性の評価を行っｆ、：際１こわか一部たことであるが、ターゲットＤＮＡである５’　−ＢＩＯＴＩＮ−（ＴＧ）− ３’　の量の１％以内であった。これは、サンプル中の放射能でラベルされた量を、規格化された溶出液を比較する計測によって判明した。伊Ｌ１−−傷」ｙ工ＩＮＡニー　７７　夕　、オシ　’　ｏ　−３’−０−ス　ル　”　・−ム　た　プユユ１立ユ１７’　ゼーシ　ン蛍光ヌクレオシドアナログのフォスフオルアミダイトを種々利用することが有効なので、ｎ量体を、ｄアデノシン−３’　−０−フォスフオルアミダイトまたはｄＦ−３°−０−フォスフオルアミダイトと、ｄＣ−３°　−０−フォスフオルアミダイトを材料にＰｈａｒｍａｃｉａ　ＩＪＢ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒを用いて合成した。このｎ量体は、２５量体から６０量体まで５塩基ずつ長さが違い、（ＡＣ）ｘまたは（ＦＣ）Ｘのシーフェンス（ただしｘ＝１２．５．１５．１７．５．２０，２２．５．２５．２７．５、または３０）を持つ。固定面からの脱着とＱＥ八へ− セファロースによる精製の後、決まった長さの蛍光オリゴマー（ＦＣ）ｘを放射能ラベルされたポリ（ＴＧ）のアンブリマーにハイブリダイズした。このポリ（ＴＧ）は、上述のｆＰＩ２及び３から得られ、ＤＮＡ融解の挙動、臭化エチジウム染色、クエンチされた蛍光体がハイブリッドの変性によって再び蛍光活性を持つことなどによって検査されたものである。６　ＦＴＰで　たＲＮＡ　ロー　いたＣｈｌａｍ　ｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの　−立イＣｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｂｏｍａｔｉｓは細胞内に生息する病原体であり、その活発な感染期には、１匹あたり３ｘｌＯ’から４ｘｌＯ’−１ビーのリポソームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）と、１コピーのゲノムＤＮＡを含んでいる。ハイブリダイズさせるプライマーンークエンスに対して５°端となる、５゛　−ビオチン化したＴ７プロモーターを含む一対のプライマーを、Ｃ，ｔｒａｃｈｏ■ａｔｉｓＬ２のストック株から得たＭＯＭＰ遺伝子のＤＮＡ断片１５０塩基対を増幅するのに用いた。５°端にＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含むＤＮＡ断片約５００ｎｇを、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ、「ＧＴＰ及びｒＦＴＰまたはｒＡＴＰ（コントロールとして加えた。）のいずれかの存在下、Ｔ７ＲＮ八ポリメラーゼで転写さぜた。３分間、１００”Ｃで加熱して酵素を失活させることで反応を停止した。５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムのゲルサイジングクロマトグラフィーによって、未反応のｒＮＴＰを、ラベルされたＲＮＡから分離した。その後プローブの濃度は２６０ｎｍの吸光から評価しｔこ。シンプルなデュアル単色蛍光スペクトロフォトメーターを使い、わずか５ｘｌＯ”′４モルのＲＮＡプローブでもバックグラウンドから検出することができた力く、これ１こ（ま励起と発光の単色発光器に２０ｎｍのスリットを用いた。感度を調節しｊこ光量子をカウントする蛍光分析器（例９、下部を参照）は、５ｘｌ（Ｉ”から５ｘｌＯ−”モルの同じプローブを検出することができる。これは、５０００から５ｏｏｏｏ匹のバクテリアから得られるはずのリポソームＲＮＡの量に等しい。い）　Ｃ，ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓＤ　Ｎ　Ａ、または（１１）アンプリファイされたターゲットＤＮＡのいずれか２００μｍを、ハイブリダイゼーンヨンバッフ７　（０，１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０２Ｍ　クエン酸ナトリウム、０．０２Ｍ　ＨＥＰＥＳ、０．００４Ｍ　ＥＤＴＡ＋ｐＨ７，４）中でプローブを１／２００に希釈した溶液２００μＬと混合した。これを３分間煮沸し、その後１時間以上かけて室温で徐々に冷やした。図１７に示すように、ゲノムＤＮＡサンプルの一部をとり、超細密ろ適用マイクロチューブまたは９６大のフィルタープレート（ポアサイズ＝０．１μｍ）に溶出した。これを０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０゜０２Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７，４で５回洗い、その後サンプルを２つ齋こ分けたが、これらのうち片方は高ｐＨバッファーで変性させ、両方の蛍光ｌくツクグラウンドとハイブリダイズしたプローブの蛍光をそれぞれ測定した。ターゲットＤＮへのアノプリマーも同様に処理されたが、異なる点は、ターゲットＤＮＡの５゛−ビオチン化プライマーの端が、はじめにアビジン化磁性床（２，８μｍ）に吸着されるため、サンプルを損失なしに洗えることである（図１８）、Ｌ−ずれの処理にしろ、プローブの蛍光活性は、１ｘｌＯ− １６モル以下のターゲットＤ　Ｎ八を含むサンプルを希釈してから測定される。感染性ＣｈｌａＢｄｉａから得られるｒＲＮＡを検出するためにほぼ同じサイズのプローブを用いたならば、このサンプル量は、１００００匹以下のバクテリア分のＤＮへの検出のために必要とされる感度にほぼ相当する。ここで用いられたプローブは約１５０塩基対の長さで、ｌプローブあたり約３８個のフォルマイシン残基を含み、リポソームＲＮＡのコピーそれぞれのただひとつのターゲット部位にのみ結合する。プローブ中またはプローブの°カクテル”中の蛍光担体の数の増加が、同時に検出感度を増加させるということが本発明の重要、な点である。プローブあたりのフォルマイシン残基が１３倍の１５０塩基対ＭＯＭＰ遺伝子を用いて、Ｘｅｆ−１ａプローブ１ｘｌＯ−”モルをデュアル単色発光蛍光スペクトロフォトメーターで検出することができるが、これに対して例９に述べるような光量子カウント技術を用いれば、１ｘｌＯ−”モルを検出することができる。７　の　。　の診断及び治療、例えばアンチセンスの問題のように核酸プローブの応用に関して非対称的合成の重要な点は、プローブの”カクテル”を同時に合成する能力である。この１カクテル１は、その長さ、位置、ゲノムＤＮΔやＲＮＡ上にそれらプローブが結合するターゲット部位の数などの点において異なっている。プローブカクテルをターゲットとして三つの異なる診断例に利用したことで、この特性の幅広い重要性を示す。＾、マルチコピーで　−の病原体のいくつかの種では、ｒＲＮへの複数のコピーがそれぞれの個体に存在している。例えば、バクテリアＣｈＪａＢｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓはおよそ２ｘｌＯ’の「ＲＮＡ分子を１個体あたりに含んでいる。ＣｈｌａｍｙｄｉａのｒＲＮＡは典型的なもので３０００から５０００ヌクレオチド長であるから、診断アッセイにおける感度は、ｒＲＮＡ上のターゲラトン−フェンスに特異的で、しかも５から１０種類以上の異なるブローブシークエンスから成るプローブカクテルを用いることで大きく改善されるであろう。この相異なるブローブンークエンスは、ターゲットとなるｒＲＮＡやＤＮＡ上の独立な断片に結合することができる。これを（ａ）から（ｅ）のプローブとして、図２０に示すダイアグラムの下半分に図示しである。この中で（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）（ｅ）はアナログであるが、それぞれ−水路ＤＮＡの相異なるターゲットシーフェンスに特異的な相補的プローブである。ｒＲＮＡ配列を診断のターゲットに用いることには、ふたつの不利な点がある。（ｉ）ｒＲＮＡ配列は極めて保存性が高い。それ故、何種類かの短い配列だけが、感染性病原体の検出と同定に使えるということになる。診断の感度に対するこの影響のひとつは、”リポータ−゛ラベルのごく限られた数しかそれぞれのプローブ上で使えない、したがって感度に限界が生じるというものである。（ｉ　ｉ）いくつかの病原体だけが、高コピー数のｒＲＮＡを持っている。そして多くの、例えばＤＮＡ性ウイルスなどは、ｒＲ．Ｎ八を全く持っていない。したがって、この方法が使える診断の症例が限定されてくる。Ｂ．　−”−　ＤＮＡ　の　の　ｆ一った　、』も烈全ての生物のゲノムは、ｒＲＮ八よりもはるかに大きく、核酸プローブＩ＼イブリダイゼーションのターゲッ１・シークエンスとして使えるより大きな独特の断片を数多く有している。例えば、Ｃｈｌａ＠ｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの全ゲノムが単離されており、６６０ｘｌＯ’以上の分子凰、あるいは１　ｘ　１　０’塩基対よりやや大きい程度の、相対的に小さい二重鎖Ｄ　Ｎ　Ａから成っている。それぞれのバクテリア個体はまた４．　４　ｘ　１　０’ダルトンの、７０００塩基対を越えるブラスミドを含んでいる。ｒＲＮＡと違い、プラスミドはＣｈｌａｌｌｙｄｉａに全く固有のもので、すなわちＮｅｉａｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａから得られたＤＮＡに対してクロスーハイブリダイゼーションが検出できないということである。確かに、ブラスミド自身を興なる制ｇ１！１１素で切断した断片の間でもクロスーハイブリダイゼーションは検出できない。Ｃｈｌａ健ｙｄｉａのゲノムＤＮＡのどんな部分をハイブリダイゼーションのターゲットとして使うために選んだときでさλも、Ｃｈｌａｗｙｄｉａのプラスミドだけから得た複数の制限断片に特異的なカクテルは、４本以上のＸｅｆ−１αブローブの長さに関して同等であり、１００から１０００匹のバクテリア個体と同じレベルで検出できる。Ｃ．　Ｄ　Ｎ　Ａ　亘ヱ土チコピーの■−の　・』いくつかの遺伝子のそれぞれの鎖上の隣接する遺伝子が、中程度から長い範囲にタンデムリピートを含むということが発見されたのは、ごく最近のことである。リポソーム遺伝子のリビートは、本発明に記述されているような類のＤＮ八の診断にとっては特に興味深い。例えばリポソーム遺伝子のように、リピートは高コピー数で存在しており、検出感度は改善されるが、加えて遺伝子間のスペーサー領域は選択圧を受けにくいため、各生物種間で通常きわめて多様性に富んでいる。一本鎖ＤＮＡ上に同じ固有のンークエンスが複数コピー存在している場合はは、ハイブリダイゼーシｊンのターゲットがゲノム上の部位のカクテルであるという特殊なケースを表している。それはつまり、ひとつのブローブンークエノスで、同じンークエンスを持ち、そして同じＤＮＡ鎖上にある複数のターゲツ］・部位を調べることができるということである。そのようなブローブとターゲットの再現性ある実験例が、原生寄生生物Ｅｉｍｅｒｉａの異なる穫で行われた。これはさまざまな家畜に球菌性の疾患を引き起こす。Ｅ．Ｌｅｎｅｌ．ｌａから得られたゲノムＤＮ八をいくつかの異なる制ＦｊｔＢ素で切断し、その断片を適当に切断した非対称プラスミドベクターにつなぎ、それをもってＥｓｃｌ＋ｔｒｉｃ１＋ｉａ　ｃｏｌｉ．を形質転換した。εｌ ■ｅｒｉａ．　ｔｅｎｅｌ　ｌａのゲノムＤＮ八とのハイブリダイゼーションによって、リピートシークエンスを得るために、コロニーをスクリーニングした。このゲノムＤＮＡはランダムプライミングによって３５５でラベルしてあるものである。強くハイブリダイズするクローンをピックアップし、近縁の属であるＰｌａｓｍｏｎｄｉｕｍ、ＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａＳＳａｒｃｏｃｙｓｔｉｓからのゲノムＤ　Ｎ　Ａ，　Ｅ．ｓｉｔｉｓ．Ｅ．３ａｘｊｍａ、Ｅ．　ａｃｅｖｕｌｊｎａ＋Ｅ．　ｔｅｎｅｌｌａから得られたゲノムＤＮＡをラベルしてスクリーニングにかけた。クローンの大部分は、他の属からのＤＮＡと同じ強度のシグナルを与えた。しかしながら、いくつかのクローンは特に強＜Ｅｉｍｅｒｉａｔ ’ａｔ識され、またあるものはＥ．　ｔｅｎｅｌｌａのみにしか認識されなかった。後者のクローンのインサー１・の全シークエンスは、３３４塩基対を含んでいる。制限断片によるフィジカルな調査によって示された二とは、そのシークエンスは約７３８塩基対のタンデムなリビー１・中に存在しており、少なく見積もって３０の遺伝子がタンデムにリンクしていて、それが全てひとつの染色体上にあらわれるということである。タンデムリピートをテンプレー｝・とじて合成された非対称ブローブは、テンプレートあたり１７９のフォルマイシンＡ残基を含んでいる。ハイブリダイゼーションのターゲットとして、ＥｉＩｌｅｒｃａのゲノムＤ　ＮＡのたとえどんな部分を選んだどきでも、Ｅｉｍｅｒｅａゲノム上にあるタンデムリピートの複数のコピーにのみ特異的なひとつのシークエンスのブローブは、１１個以上のＸｅｆ−１αのプローブと長さに関して同等である。Ｅｉｍｅｒｉａの感染性粒子は球菌なので、それぞれが８ゲノムを含み、そのようなターゲットのカクテルは１０個弱の球菌の検出を可能にする。タンデムリピー　トターゲットの重要な点は、検出感度や、こうしたひとつの居での検出といった問題をはるかに越えたところにある。タンデムリビ−１・シークエンスは、輻広い種と属のゲノムＤＮＡ中にみられ、そうした種の間では異なっているので、それ故、ｒＲＮ八が存在しない種も含めて非常に多様な病原体の診断ア）一ヤイのデザインに関して適用範囲の広い根本原理を与えるものである。ｆＩ５８　ライＩ上二Ｚ１」二Ｕ町目τ１■桔ｊ』一ｌ擾」」Ｌ！刀」ムＬσか」冗乙−リ（仁ｔ長プ・い　ｆゴ゜冫一のユニバニ並亜皿人尤久上上二辺上」３゛端、５゛端、あるいは３゜と５゛端の両方で粘着末端を作るためのテンプレート、例えば５’−ＡＣＧＴ−ボリｄ（ＡＴ）、ボリｄ　’　（　Ａ　Ｔ　）　− 　Ｔ　Ｇ　Ｃ　Ａ　一３“、５゜　−Ａ　Ｃ　Ｇ　Ｔ−ボ！Ｊｄ　（ＡＴ）　− ＴＧＣＡ−３’　ｔど（Ｄｍｍな修正は、上述した特性を全て持つＲ　Ｎ　Ａブローブの合成を可能にしたが、しかしそれは（ｉ）より長い蛍光ブローブを作るような鎖、または（ｉ　ｉ）指定されたターゲットｌ）　ＮΔに特異的な他のハ・イブリダイゼーノＪンノークエノスのどちらかに対しで接着させることも可能であった。あらゆるクローン化されたＤ　Ｎ　Ａ断片の普遍的なラベルを作ったり、その末端で高い蛍光活性を有するがどちらの頑もｔＸ４ブリダイズしないンークエンスを同定するためのブローブを与えたりする場合に、後者は、特に有効な方法である。その際には、これまで述べできたよう１こ、皐純なポリ（ＦＩノ）｝こおいて見られた、検出のための！・イブリツドの変性を必要としない。等価なハ・ｆブリダイズしないｔ遍的ブローブは、すでに化学的合成によって作ることができている。このとき、例えばエテノアナロクフオスフオルアミダイト、貝体的には１，Ｎ６−工千ノアデノンン−３”　一〇−フオスフオルアミダイｌ −（ｅＡ）を用いて、と゛んなＩ＼イフ゛リダイゼーノヨンプローブ１こもリンクさせることができる非特異的なタグを合成した。一般的には、そのＪラなｆ＃逼的ブ「スープの３゜端または５゛端は、５゛−アミノヘギノル、５゜−スルフイドリルヘ壽ノル、３゛−アミノへキシルアミノ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、そしてそのような他のり７カーを加えて他のオリゴマーまたは固定面に酵素的に接着するという方法よりもむしろ、化学的に合成される。匠且ユ芳』勿」しＵヒＬジムＥ匹二壬』玉コ′　ブＯ−ブの″蛍光ヌクレオシドアナログ、蛍光オリゴヌクレオチドブローブが結合している量の蛍光オリゴヌクレオチドあるいはアナログンークエンスを検出する新しい方法、を開発した。その原理となるのは、ザンプル中の蛍光担体の量を測るために光量子の計測を行うことである。これを以下に記述する。この方法が計時スベクト口スコビーと違う点は、蛍光担体または核酸ブローブの蛍光発光全ての総和であることである。これは発光の波長によらず、時間と分光総和の新しい組み合わせであると同時に、診断ア７セイ及び治療処置に用いる核酸ターゲットンークエンスを同定、検出、定量するための光量子ｌ＋測の新たな応用でもある。全ての蛍光測定に用いた、基礎となる実験のバラメー・夕−は、蛍光の強度１である。その単位は、毎秒毎リッターあたりの光量子のモル数である。ここで用し１た宙光ヌクＩノオシドアナ・ログは、あら４１る実用的な目的に供するため、永続的に蛍光を発し通席の計ｉ１１時間内では光退色しないものであるから、毎秒蛍光担体のモルあたり放射される光１子のモル数で！ｔ　Ｉｌ１！される蛍光の発光は蛍光担体の、すなわちサンプル中のプローブの量の指数としてもちいることができる。そのような計測によく用いられる！］器は、Ｃｈｒｏ＊ａｇｃｎによクて開発され！＝．（ｉ）２９０ｎｍ≦λ≦３２０ｎｒｎの範囲で強度の励起能を有するｌ．　５　０ワントＨ　ｇ　／　Ｘ　ｅＣＷ　円筒ランプ＋　（ｉｉ）３６０ｎｍ≦λ≦５５０ｎｍの範囲の励起に対応できるコー｝・されたフ１トダイソードを備えた超高感度フォトマルチプライヤー、（ｉ　ｉ　ｉ）ガラス壁を発光のフィルターとじ又使える水晶励起窓を備えた円筒キュベノ｝・。二のキュベソ１・は全サンプルがフォトマルチブライヤーチューブの前面に集まるようにマウン１・する。（１ｖ）コンピューター制御の５つの光量子計測器を連続的に接続したもの。これらは毎秒１０’回の頻度で光量子を識別することができる。モノマーのフメノレマインニノ八と、４８９残基のフオノレマイシ二ノを含むＸｅｆ−｝αプローブの全長分を、室温、ｐＨ＝１０の条件下で用いた実験において、我々が発見したことは、（１）モノマーとブローブを連続的に溶出した分百の発光は濃度ｌ７ｌ対して直線的な関係がある。（ｉ　ｉ）そのプローブの発光は、同じ数のフリーなモノマーと同じ強度であった。図１７と１８に示してあるような永続的な宙光担体を用いる通常のアッセイでは、サンプル中に存在するターゲットの量は、結合しなかったプローブを洗い流した後にハイブリッドを変性させることと、結合したプローブの員を計測することで決定される。ここで用いた塩基性条件下において、アナログブローブンークエンス中の残基の蛍光がそノマーの敗と同じだけの発光量と同じ値を示すことから、オリゴマー中にある自己消失は無視し得る量であるということである。また、これはターゲットＲＮＡやＤＮＡによって結合したプローブの皿の定量に、プローブの発光を直接に用いることができるということをも示している。それ故、輻広い用途での核酸アツセイや診断に用いる検出材料のデザインにあたって、広く応用可能な原理を与えるものである。検出感度とシグナル／ノイズ比は、計測される光量子の数と計測されている間の時間周期数との相関であるという点が、本発明から得られた重要な結論である。医、、１ｌＪＬ会共圭ｊバｒ！ユ互−Ｚ　レオ　゛の　のた　の　ｔ、ｒ　ユ上工の５’　゛　３’ｌ　ンＬ二夏量羞本発明の実験手順と化学原理は、蛍光ヌクレオシドアナログを用いるあらゆるプローブの合成と同定に用いることが可能である。その合成法が酵素を用いるものであろうと化学的なものであろうと、蛍光活性とハイブリダイゼーションの特異性の両方に関して適用できる。そうしたプローブは、ここに述べてきたような液体中でのハイブリダイゼーションの形態だけでなく、研究室などでより頻繁に用いられる技術にも用いることができる。その技術とは、゛　ドツト−プロット１検出法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、サザンブロッティング、フィルターやメンブレン上でのハイブリダイゼーションとＨＰＬＣやキャピラリー電気泳動法によるハイブリッドの分離などである。リンカ−は液体ハイブリダイゼーションに必須ではないが、ビオチン／アビジンを利用したものや、ホモ／ヘテロー二官能性リンカ−などのように、適当な親和性を持つリンカ−はプローブの補足に用いることができる。このようにプローブを捕獲するのは、Ｆｉｇｕｒｅ１３に図示しであるように、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片について濃縮、単離または検出といった目的のためである。本発明には、オリゴヌクレオチドと同様リンカ−から誘導した蛍光ヌクレオチド、蛍光オリゴヌクレオチドプローブによる増幅やそれに続く検出に用いられる、リンカ−から誘導したプライマー、そうしたオリゴヌクレオチドプローブ、プラスミド、ここに記述されているような応用例と使用法をもとに開発された、もしくはそこから“添付“された治療法などが含まれている。そうした誘導体合成例は、これらに限定されるものではないが以下の応用例を含んでいる。すなわち、プリンまたはビリミリンヌクレオシド、もしくはそれらの蛍光構造を持つアナログへのアミノ基転移、アミノ− チオール、アジド、アルデヒド、ヒドロキシスクシンイミド、５゛アミノアルキル−３゛−０−フォスフオルアミダイト、５°　−チオアルキル−３゛　−〇− フォスフオルアミダイト、３゛−アミノシリル誘導物、アミノシラン、アミノシリル誘導物、及び他のリンカ−やリンカ−と反応する物質群、または、３′か５゛が酸化されたンスージオールのンッフ塩基縮合のように、縮合反応中の物質群などである。これらは、この分計に通じている者にはよく知られているものである。以上にあげたことを説明するために、特殊なケースを以下に示す。（ｉ）　ＭＯＭＰ遺伝子のシーフェンスに対する非蛍光増幅プライマーのセットを、化学的に合成した。合成の最終段階で、もう１サイクル増やして、５゛−アミノへキシル−３°−０−７オスフオルアミダイトを、ａｔのフォスフオトリエステル化学を用い化学的に合成して完成させたプライマーの５゛末端に付加した。（１１）　強力なエトキシドで固相支持体から外した後、それぞれの鎖の末端アミノ群をＮＨ３−ビオチンエステルと反応させて、５°　ビオチン化プライマーを合成した。（ｉ　ｉ　ｉ）　プライマーを通常の方法で増幅に用いた。その後、アンブリマーをアビジン化した９６穴フイルターブレー（・で捕獲し、未反応の原料と不純物を除去するために洗つた。（１ｖ）　上述したように、捕獲したアンブリマーを、蛍光アナログでラベルしたオリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイズして、アンブリマー中のターゲットシーフェンスの量を定量した。本発明に含まれているのは、固定床、フィルター、活性化プラスチックプレート上で、蛍光アナログを他の蛍光または非蛍光オリゴヌクレオチドに結合させることである。その結合には、ライゲーションのように酵素的に結合させるもの、ここに記述されているようにリンカ−を用いて化学的に結合させるものを含む。ＩＩ　レオシ゛　口　゛　びプローブの　たの　１エル−ＦＲＥＴのここに記述したように、２つあるいはそれ以上のスペクトルの異なる検出可能なラベルを持ったオリゴヌクレオチドを合成もしくは誘導することができた。これは、興なる蛍光発光特性を持つ２つかそれ以上のヌクレオシドアナログを用いるか、または上記にあるように共有結合したＦＲＥＴアクセプターを用いるか、いずれかの方法を使うことで可能になる。もし、ＦＲＥＴアクセプターが、プローブ発光のアクセプターとして溶液中で簡単に扱えるのならば、それらもまた、蛍光プローブの検出の感度を上げるか、検出範囲を広げるために用いることができる。実例を挙げるならば、クマリーンのような染料、例えば７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセテート、７−メチル−ウンベリフェロン、ナフタレン及びアントラセン染料などの励起スペクトラムは、蛍光ヌクレオシドアナログ、例えばポリ（ＦＵ）から合成したオリゴマーの発光スペクトラムと重複している。ただし、オリゴマー自身の励起スペクトラムとは重複していない。７−アミノ− ４−メチルクマリン−３−アセテートのような染料は、そうした理由により、（ｉ）実例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとオリゴマー上のアミノ基群とを反応させたときのように、共有結合したＦＲＥＴアクセプターとして用いるか、または（１１）プローブ蛍光のＦ　Ｒ，Ｅ　Ｔインジケーターとして用いるために、プローブ溶液に単なる染料として加えるか、いずれかの利用の仕方がある。ハイブリダイゼーシヨンプローブへの２つめの蛍光ラベルを与えるという明らかな利点に加えて、この方法論はプローブシグナルの増幅にも役立つ。それは、発光のより効率的な捕獲、励起源からの拡散光を主とするバックグラウンドの低減、そしてより長い可視波長の検出などによって実現する。ここに記述した実験例と具体例は、ただ説明する目的のためだけのものであり、それに照らしてみた場合の各種修正や変更は、当業者に示唆されているものであることは理解されるべきである。それらは、出願の思想と範囲および添付された請求の範囲の権利範囲の中に包含されるべきものである。（２）配列番号、１（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ、３９塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー、直鎖状（１１）配列の種類ニゲツムＤＮＡ（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボゼティヵル、Ｎ。（１ｖ）アンチセンス、Ｎ。（ｖｉ）起源二（Ａ）生物名：　Ｃｈｌａ＊ｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏａａｔｉｓ（Ｃ）個体・単離クローン名：　Ｌ２／４３４／Ｂｕ（Ｇ）細胞の種１ｉ　：　Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ｖ　ｉ　ｉ）直接の起源：（Ａ）ライブラリー：　ｌａｍｂｄａ　１０５９　ｒｅｃｏｍｂｆｎａｎｔ（Ｂ）クローン：　ｌａｍｂｄａ　ｇｔｌｌ／Ｌ２／３３（ｖ　ｉ　ｉ　ｉ）ゲノム内での位置。（Ａ）染色体／セグメント名：　０ｍｐＨ２０ＲＦ（ｘｉ）配列：配列番号ＩＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧ　ＡＣＧＧＡＣＡＣｅＣＣＴＴＡＧＧＡＣＧ入　Ｃ丁τｅｃでＴＣＧ　３９（２）配列番号、２（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ　３９塩基（Ｂ）配列の型　核酸（Ｃ）鎖の数、一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）配列の種類二転写されたＤＮＡ又はＲＮＡ（１目）ハイボゼティヵル　Ｎ。（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／キー、相補的プローブ（Ｃ）特徴を決定した方法：　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｔｏ　ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ、　１（Ｄ）他の情報　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｆｏｒ　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　３（ｘｉ）配列、配列番号２實賦ｕＧＣ？ＣＴＧＣＣＴＧＴＧＧＧ　ＧＡＡＴＣＣＴＧＣＴ　Ｇｍ　３９（２）配列番号、３（１）配列の特徴：（八）配列の長さ・３９塩基（Ｂ）配列の型　核酸（Ｃ）鎖の数、−末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：転写されたＤＮＡ又はＲＮＡ（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボゼティカル：Ｎ０（１ｖ）アンチセンス：　ＹＥＳ（ＩＸ）配列の特徴：（Ａ）名称／キー−相捕的プローブ（Ｃ）特徴を決定した方法側ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｔｏ　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　１（Ｄ）他の情報：＾ｎａｌｏｇ　ｔｏ　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　２（ｘｉ）配列：配列番号３？１ＴＧＣＨＮＧＣＴＣＴＧＣＣＷＴＧＧＧ　ＧｌｔＨＴＣＣＰａＣＷ　ＧＭＮＣＯＩＭＧＣ３９ＦＩＧＵＲＥ　ＩＦＩＧＵＲＥ　２ＦＩＧＵＲＥ　３ＦＩＧＵＲＥ　４ＦＯＦＩＭＹＣＬＮ　Ａ　ＦＯＲＭＹＣＩＮ　Ｂ　ＯＸＯＦＯＲＭＹＣＩＮ　ＢＴＯＹＯＣＡＭＶＣＩＮ　ＢＡＮＧＩＹＡＭＹＣＳＮＦＩＧＵＲＥ　５ＦＩＧＵＲＥ　６ＦＩＧＵＲＥ　７ＦＩＧＵＲＥ　８（０ＮＬＹ　ＴＨＥ　ＰＵＲＩＮＥ　ＡＮＡＬＯＧＳ　ＡＲＥ　１ｕｕｓＴＲＡＴＥｏ　Ｂａ０Ｗ）ＦＩＧＵＲＥ　９［１］　Ｎ０Ｎ−ＨＢＯＮＤＩＮＧｌ、Ｎ、　ＥＴＨＥＮＯ１，Ｎ、　ＥＴＨＥＮＯＰＵＲＩＮＥＮｕＣｕＯＴＩＤＥＳ　ＰＹＲＩＭＩＯＩＮＥＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ［１ｒＪＦＬｕＯＲＥＳＣＥＮＣＥＲＥＳＯＮＡＮＣＥＥＮＥＲＧＹＴＲＡＮＳＦＥＲＡＮＡＬＯＧＳ２　６　５　Ｂｒ工αｎ匡１７結合したプローブの蛍光の澗定Ｙ工ＧＯＲＥ　１８１で

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下の構造を持つ蛍光性ヌクレオシド、またはその構造類似体、▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、およびＸ６は、Ｎ、Ｏ、Ｃ、Ｓ、またはＳｉであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、およびＸ６のうち少なくとも一つは、Ｎであり、Ｒ４は、検出可能な標識で誘導体化されうる反応性基であり、Ｒ■はＨまたはＲ４とのエテノ結合の一部であり、Ｒ■は、Ｈ、ＮＨ２、ＳＨまたは＝Ｏであり、Ｒ■とＲ■は、水素、メチル、臭素、フッ素あるいはよう素、アルキルあるいは芳香族置換体、アミド、チオエステルあるいはジスルフィド結合を含む結合性分子、またはｘが１以上２５以下の整数で、Ｒ１とＲ２は、Ｈ、ＯＨ、アルキル、アクリル、アシル、アミド、チオエーテルまたはジスルフィドであるＲ１−（ＣＨ２）ｓ−Ｒ２のようなそれらの組み合わせであり、Ｒ１０は、水素、酸感受性／塩基安定性のブロッキング基またはリン誘導体であり、Ｒ１１とＲ１２は水素であり、Ｒ１２は、水素、ＯＨ、３′アミノ、３′アジゾ、３ ′チオール、３′不飽和または３′リン誘導体であり、Ｒ１４は、水素、ＯＨまたはＯＲ３、ここでＲ３は反応性基、保護基、または付加的な蛍光団である。
２．請求の範囲１に記載の化合物で、Ｒ１０がＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、一リン酸、二リン酸、三リン酸、β，γ−メチレン−２′−三リン酸、５′−Ｏ−ホスホアミダイト、ホスホジエステル、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホアマダイトおよびホスホトリエステルからなる群から選択された化合物。
３．請求の範囲１に記載の化合物で、Ｒ１２が水素、ＯＨ、３′アミノ、３′アジゾ、３′チオール、３′不飽和及び３′リン誘導体からなる群から選択された化合物。
４．請求の範囲１に記載の化合物で、フラノース部分が保護された図のような構造式を持つ蛍光ヌクレオシド類似体である化合物；▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｂは蛍光ヌクレオシド類似体であり、Ｒ１０は水素、酸感受性／塩基安定性のブロッキング基またはリン誘導体であり、Ｒ１１とＲ１３は水素であり、Ｒ１４は水素またはＯＨのいずれかであり、Ｒ１５は、メチル、ベーターシアノエチル、ｐ−ニトロフェニル、ｏ−クロロニトロフェニルまたはクロロフェニルであり、Ｒ１０は低分子アルキル、望ましくはメチルまたはイソプロピルのような低分子アルキル、またはモノフォリノ、ピロリドノもしくは２、２、６、６− テトラメテルピロリゾノのようなヘテロ環である。
５．請求の範囲１に記載の化合物の、合成、増幅、塩基対形成、標識、塩基配列決定、複製、転写、ロケーション、検出またはＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチドの同定における、６つの通常存在する非蛍光性Ｎ−ヌクレオチドのいずれかの代替物としての使用方法。
６．請求の範囲５に記載の使用方法において、増幅、合成、標識、検出またはＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチドの同定が、（ｉ）化学的な、合成、伸長または結合方法か、（ｉｉ）増幅、複製、転写、末端標識、フィリングまたはニックトランスレーションの酵素的方法、で行われる方法。
７．蛍光ヌクレオシドを含む、標的ポリヌクレオチド配列の検出または増幅のために用いられるポリヌクレオチドプローブ。
８．請求の範囲５に記載のプローブにおいて、長さが約５から約１００００塩基で一本鎖核酸配列であり、かつ末端蛍光ヌクレオチドを含むかまたは（ｉ）末端蛍光団が、プローブの３′末端にあるときは、３′−炭素、または、（ｉｉ）末端蛍光団が、プローブの５′末端にあるときは、５′−炭素、または、（ｉｉｉ）プローブのどれかの中間のヌクレオシド残基で、その残基が、反応性基、アルキル、芳香族置換体または結合性分子で修飾または誘導されているものまたは、（ｉｖ）上記の組み合わせ、からなる結合部位に少なくとも１カ所に結合した蛍光ヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドであるプローブ。
９．配列の決まっている、非対称一本鎖蛍光核酸プローブまたは対称２本鎖蛍光核酸プローブを製造する方法において、該プローブが請求の範囲１の化合物を含み、約５から約１００００塩基の長さである方法。
１０．請求の範囲９に記載のプローブがさらに、ガラス、アガロース、アクリルアミド、ナイロンまたはニトロセルロースからなる固体担体に親和性を有するかまたは化学的に結合する、５′から３′方向のリンカーグループを含む方法。
１１．ハイブリダイゼーションが起こる条件下で、効果的な量の請求の範囲７に記載のプローブからなる混合物と標的配列が存在する疑いのあるサンプルとの接触させ、蛍光の観測または蛍光の変化によるハイブリダイゼーションの検出を行うことを含む、標的ポリヌクレオチド配列の検出方法。
１２．請求の範囲１１に記載の方法において、サンプル内の生物的実体または遺伝学的変異の存在を検査するために特に適合され、標的核酸配列とまたはその特異的配列と関連づけられた、以下の事項を含む方法：（Ａ）請求の範囲１の少なくとも１つの化合物からなる約５から約１００００塩基の長さの蛍光核酸プローブとの、サンプルからの一本鎖核酸の結合。ここで、（ｉ）蛍光オリゴヌクレオチドプローブの配列が、ハイプリダイズするように標的ＤＮＡまたは、ＲＮＡの相補的な配列と類似しており、（ｉｉ）蛍光オリゴヌクレオチドプローブが、どの蛍光ヌクレオチド類似体も、置換された通常存在するヌクレオチドの相補配列と塩基対を形成するような、ワトソン−クリック塩基対が形成可能であり、かつ（ｉｉｉ）前記蛍光オリゴヌクレオチドプローブによる一本鎖核酸の誘導が、（ａ）蛍光オリゴヌクレオチドプローブと、サンプル中に存在する標的ＤＮＡまたはＲＮＡに相補的な配列が結合するような標的ＤＮＡまたはＲＮＡの一部または配列との間でのみ、；しかし、（ｂ）蛍光オリゴヌクレオチドプローブと断片中の非標的ＤＮＡまたはＲＮＡとの間ではそれほど著しくなく、二重鎖またはハイブリッドを形成する条件で行われる。（Ｂ）ステップ（Ａ）で安定な２重鎖が形成されたかどうかを以下の方法で、決定すること。（ｉ）（ａ）ステップ（Ａ）で形成されたハイブリダイズした蛍光ヌクレオチドプローブ：標的核酸の２重鎖からハイブリダイズしていない蛍光オリゴヌクレオチドプローブを分離する。または、（ｂ）必要なら、２重鎖を形成した蛍光オリゴヌクレオチドプローブを、洗浄および／または濃縮を容易にするために固相に結合させる。（ｉｉ）分離したハイブリッドを変性させる。そして、（ｌｉｉ）サンプル中の生物学的実在または、遺伝的変異の存在を指示するものとしての（Ａ）（ｉｉｉ）（ａ）の処理により、検出可能な信号が存在するかどうかを決定する。
１３．請求の範囲１２に記載の方法において、ポリスチレンビーズ、９６穴プレート、アガロース、ポリアクリルアミド、ナイロンまたはニトロセルロースからなる固体担体に、特異性をもって化学的または親和的に連結、吸着または結合できるように、その５′末端を修飾したプライマーを用いた増幅によって、サンプル中の標的核酸配列の存在を試験する方法。
１４．請求の範囲１１に記載の方法において、標的ポリヌクレオチド配列の存在を検出するするために、（Ａ）蛍光ヌクレオチド類似体の取り込みまたは付着により修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドに相補的なまたはその相補鎖に類似したポリヌクレオチドに取り込ませること、および（Ｂ）前記相補的蛍光、または、類似した相補的蛍光オリゴヌクレオチドを前記の標的ヌクレオチドへハイブリダイズさせ、プローブの蛍光によって前記ヌクレオチドの存在を検出すること、からなる方法。
１５．請求の範囲１４に記載の方法において、ハイブリダイズさせる工程または検出する工程が、固相において行われる方法。
１６．請求の範囲１４に記載の方法において、標的配列がヒトゲノムの病気に関連づけられる部分である方法。
１７．請求の範囲１４に記載の方法において、標的ポリヌクレオチド配列が、ウィルス、ウィロイド、細菌、原生動物、モリキューラ（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅ）、トリパノソーム、マイコバクテリア、菌類または植物もしくは動物からなる真核生物からなる生物に特異的である方法。
１８．ゲノム中の多数の部位を同時に検出する方法であって、その方法が、同じもしくは異なる配列または類似した配列のプローブを利用するもので、その核酸プローブが、標的生物の１つかそれ以上の標的ＤＮＡサブユニット配列に検出可能にかつ選択的にハイブリダイズするために十分な相補性を持っている方法。
１９．請求の範囲１８における方法において、生物が原生動物である方法。
２０．請求の範囲１９における方法において、原生動物がアピコンプレクサである方法。
２１．請求の範囲１８における方法において、生物が細菌である方法。
２２．請求の範囲１８における方法において、生物がウィルスであるような方法。
２３．請求の範囲１８における方法において、生物の標的ポリヌクレオチドが、同一鎖上であるが異なる座の、単一またはタンデムな重複配列である方法。
２４．請求の範囲１８における方法において、生物の標的ポリヌクレオチドが、生物の同一のＤＮＡ鎖上の異なった座に、または異なったＤＮＡ鎖上に、異なった配列、制限断片、唯一のゲノム部分を有する区別できる断片である方法。
２５．蛍光ヌクレオシド類似体または蛍光ヌクレオシドからなるオリゴヌクレオチドプローブを検出する方法であって、該方法が、単位時間あたりの蛍光団から放射された光子を計数すること、そしてそれによってサンプル中の蛍光団の量を決定することを含む方法。
２６．請求の範囲２５に記載の方法において、蛍光団、または蛍光団からなる核酸プローブからの蛍光放射を積分するよりことを含む光子を計数する方法で、蛍光放射が最大放射波長の影響を受けない方法。
２７．請求の範囲７に記載のプローブを含む、生物学的サンプルの核酸中の標的ヌクレオチド配列の存在を検出するためのキット。
２８．請求の範囲２８に記載のキットで、（Ａ）プライマー依存の核酸ポリメラーゼの鋳型を形成するためのプライマーで、その３′末端に相補的なオリゴヌクレオチド部分からなる生物学的サンプル中の標的ヌクレオチド配列に実質的に相補的なプライマー配列からなるプライマー（Ｂ）少なくとも１つの三リン酸が蛍光ヌクレオシド類似体である、複数のヌクレオチド三リン酸（Ｃ）プライマーの３′末端が塩基対を形成し鋳型ＤＮＡ配列とハイブリダイズしたときに、５′から３′の方向にプライマーを伸長させるようなプライマー依存のＤＮＡポリメラーゼ、および（Ｄ）標的ヌクレオチド配列の検出、同定、ロケーションまたは定量のための標的配列へ強くかつ特異的にハイブリダイズ可能な標的オリゴヌクレオチドに類似した相補的配列からなる蛍光オリゴヌクレオチドプローブ、を含むキット。
２９．請求の範囲２８に記載のキットにおいて、蛍光アナログ相補的プローブを用いたハイブリダイゼーションおよび検出に利用するために、増幅のためのプライマーセットが、増幅したＤＮＡまたはＲＮＡ配列の吸着、捕捉、分離、または、濃縮に使用するためのビオチンのような化学的または親和性を有するリンカーを含有しているかまたは該リンカーに結合しているキット。
３０．オリゴヌクレオチド合成おける利用のための２′一デオキシ型の蛍光ヌクレオシド類似体の製造方法で、該方法が、（１）前記類似体から、３′、５′ジシラが保護された類似体への変換、および（２）２′−デオキシ−５′−３リン酸、または、２′−デオキシ−３′−Ｏ−ホスホアマダイト型のヌクレオシドを作るための脱保護を含む方法。
３１．請求の範囲３０に記載の方法において、２′−デオキシ−ヌクレオシド類似体が、２′−デオキシ−５′−３リン酸型に変換された方法。
３２．請求の範囲３０に記載の方法において、２′−デオキシ−ヌクレオシド類似体が、２′−デオキシ−３′−Ｏ−ホスホアマダイト型に変換された方法。