DE102004009977A1

DE102004009977A1 - Fluoreszierende Ethenonucleoside und Oligonucleotide mit hoher Stabilität

Info

Publication number: DE102004009977A1
Application number: DE102004009977A
Authority: DE
Inventors: Frank Prof. Dr. Seela; Helmut Dr. Rosemeyer; Enno Dr. Schweinberger
Original assignee: CHEMBIOTECH GmbH
Current assignee: CHEMBIOTECH GmbH
Priority date: 2004-03-01
Filing date: 2004-03-01
Publication date: 2005-09-22

Abstract

Die Erfindung betrifft die Synthese von Nukleosiden mit einer fluoreszierenden tricyclischen Base, ihren Einbau in Nukleinsäuren und ihre Verwendung bei der Anlayse besagter Nukleinsäuren sowie zur Stabilisierung besagter Nukleinsäuren gegenüber thermischer Denaturierung. DOLLAR A Die in der vorgelegten Erfindung beschriebenen fluoreszierenden Nukleoside umfassen bevorzugt Ethenoderivate des 2'-Desoxy-7-desazaadenosins sowie des 2',3'-Didesoxy-7-desazaadenosins und ihren Einbau in Nukleinsäuren auf chemische oder enzymatische Weise. Die vorgelegte Erfindung ist besonders nützlich bei der Bestimmung von Nukleinsäuren, speziell auf dem Gebiet der Medizin. Der Vorzug der vorgelegten Erfindung im Vergleich zu anderen ist, dass nunmehr chemisch stabile, stark fluoreszierende Nukleinsäurebausteine mit nur geringer struktureller Abwandlung natürlicher Nukleoside für die Synthese Nukleinsäure-bindender Verbindungen verwendet werden.

Description

1. Einleitung
Die vorgestellte Erfindung umfasst die Synthese von Nucleosiden mit einer fluoreszierenden tricyclischen Base, ihren Einbau in Oligonucleotide und deren Verwendung bei der Detektion besagter Oligonucleotide sowie zur Stabilisierung dieser Oligonucleotide gegen thermische Denaturierung.
Solche Verbindungen können entweder enzymatisch oder durch chemische Synthese in DNA und/oder RNA oder in Chimären aus beiden eingebaut werden, wobei sich fluoreszierende Oligonucleotide mit vorbestimmter Sequenz ergeben. Derartige analoge Sequenzen können entweder identisch mit oder ein analoges Komplement eines Templates oder einer Ziel-DNA bzw. RNA sein, mit der das fluoreszierende Oligonucleotid hybridisiert werden kann.
Die in dieser Erfindung beschriebenen, fluoreszierenden Nucleoside schließen bevorzugt 1,N⁶-Ethenoderivate des 7-Desazaadenosins und seiner Derivate – speziell 2'-Desoxy-β-D-ribofuranosyl- und 2',3'-Didesoxy-β-D-ribofuranosyl-Derivate, deren Inkorporation in Oligonucleotide und die Anwendung besagter Oligonucleotide ein.
Die vorgelegte Erfindung ist besonders nützlich für die Bestimmung von Nucleinsäuren, z.B. als Analyten, speziell auf dem Gebiet der Medizin.

Nucleinsäuren haben sich als besonders nützliche Analyten für die Bestimmung der An- oder Abwesenheit von Genen oder Mikroorganismen in menschlichen Körperflüssigkeiten, in der Nahrung oder in der Umwelt erwiesen. Besonders nach der Einführung der Nucleinsäurevervielfältigung – der Polymerase Kettenreaktion (PCR, siehe US Patent Nr. A-4,683,202) – hat die Nucleinsäureanalytik eine weit verbreitete Anwendung gefunden. Nunmehr sind ausreichende Mengen der Nucleinsäuren aus jeder Probe durch Amplifkation erhältlich. Die Nucleinsäure kann aus einer entsprechend vorbehandelten Probe bestimmt werden, wobei verschiedene Techniken, die sich nach dem speziellen Zweck richten, zur Anwendung kommen. Die meisten Verfahren erforden den Einsatz einer Sonde, die entweder bereits immobilisiert oder immobilisierbar und/oder durch Anknüpfung einer oder mehrerer Reportergruppen markiert ist. Eine Reportergruppe hat die Eigenschaft, selbst direkt nachweisbar zu sein, oder sie kann mit Reagentien zur Reaktionen gebracht werden, die die Sonde mit Hilfe besagter Reportergruppe nachweisbar machen. So können beispielsweise Sonden, die mit einer Reportergruppe markiert sind, analysiert werden – desgleichen Hybride, die aus der Sonde und der zu bestimmenden Nucleinsäure bestehen. Im Falle immobilisierter Sonden wird das Hybrid aus Sonde und zu analysierender Nucleinsäure an der festen Phase, an die die Sonde gebunden ist, bestimmt.

Der sinnreiche Vorteil der nachstehend eröffneten Erfindung über andere Verfahren auf diesem Gebiet besteht darin, dass nunmehr chemisch stabile, stark fluoreszierende Nucleosidbausteine mit nur leichten strukturellen Abwandlungen der natürlich vorkommenden Nucleoside zur Synthese der fluoreszierenden Nucleinsäurebindenden Sonden verwendet werden.

2. Hintergrund der Erfindung

2.1 Beschreibung des Standes der Technik

2.1.1 Fluoreszenz natürlicher Purine und Purinnucleoside

Die natürlichen Purin- und Pyrimidinbasen zeigen bei Raumtemperatur unter neutralen Bedingungen keine nennenswerte Fluoreszenz. Jedoch kann für Adenin- und Guaninkationen Fluoreszenz bei Raumtemperatur beobachtet werden. Fälle, bei denen die neutralen Moleküle stärker fluoreszieren als die entsprechenden Kationen oder Anionen sind das Purin-2-amin, das Purin-2,6-diamin sowie deren Nucleoside (Formelschema 1).

Ein anderes Nucleosid, das bei Raumtemperatur im Neutralen und in schwach saurem Medium eine intensive Fluoreszenz aufweist, ist das 7-Methylguanosin (Formelschema 1). Dieses Nucleosid – und insbesondere sein 2'-Desoxy-β-D-ribofuranosylderivat – ist an seiner N-glykosylischen Bindung außerordenlich labil, ein Fakt, dass den Einbau in DNA oder RNA unmöglich macht.

Formelschema 1

Weitere Verbindungen mit hoher Fluoreszenz sind Purin-2-on und sein N-9-Ribosid sowie das entsprechende 2'-Desoxy-β-D-ribosid. 2'-Desoxyisoinosin (4) wurde auf chemischem Wege in Oligodesoxynucleotide eingebaut und verlieh diesem dadurch Fluoreszenz, bewirkte jedoch gleichzeitig deutlich schlechtere Hybridisierungseigenschaften [F. Seela, Y. Chen, Nucleic Acids Res. 1995, 23, 2499].

Für einen Überblick über fluoreszierende Purinnucleoside und ihre Analoga sei auf folgende Literaturstelle verwiesen: F. Seela, N. Ramzaeva, H. Rosemeyer, Purines, Houben-Weyl, 1997, Vol. E9b, 254 ff.

2.1.2 Fluoreszierende Purinnucleosid Analoga

Die Reaktion von Chloracetaldehyd mit Adenin, Cytosin sowie deren Nucleosiden und Nucleotiden führt zur Bildung der sogenannten "Etheno"-Verbindungen εAde, εCyt, εA, εC etc. (Formelschema 2). Diese fusionierten Nucleosidderivate weisen eine intensive Fluoreszenz auf: so zeigt z.B. Ethenoadenosin in wässeriger Lösung (pH 7) ein Emissionsmaximum bei 415 nm (Anregung: 310 nm) mit einer Quantenausbeute von 0.56 (Fluoreszenzlebensdauer: 20 nsec) [J. A. Secrist, J. R. Barrio, N. J. Leonard, G. Weber, Biochemistry 1972, 11, 3499].

Formelschema 2

Über die Fluoreszenz von lin-Benzoadenosin (7) und seiner Nucleotide wurde ebenfalls berichtet; allerdings zeigen bereits Dimere einer solchen Verbindung eine drastische Fluoreszenzlöschung [J. R. Barrio, F.-T. Liu, G. E. Keyser, P. Van Der Lijn, N. J. Leonard, J. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 1564].

Anderen Nucleosidanaloga mit intensiver Fluoreszenz liegt die Struktur des 3'-Desoxyadenosins zu Grunde (z. B. 8, Formelschema 3); solche Verbindungen tragen in der Regel eine Alkenyl-Seitenkette in Position 8 [H. Hayakawa, H. Tanaka, K. Sasaki, H. Haraguchi, T. Saitoh, F. Tokai, T. Miyasaka, J. Heterocycl. Chem. 1989, 26, 189]. Weitere basenmodifizierte Nucleoside mit Fluoreszenz sind die 8-Azapurin-2'-desoxy-β-D-ribofuranoside 10 und 11 sowie Verbindungen des Typs 9 (Formelschema 3) [H. Rosemeyer et al. Nucleosides, Nucleotides 1997, 16, 821 ].

Formelschema 3

In letzterem Fall trägt die Verbindung an Position 7 des 7-Desazapurins eine Alkynyl-Seitenkette. Solche Verbindungen, wie z. B. das 7-Desaza-2'-desoxy-7-(hex-1-ynyl)adenosin, zeigen intensive Fluoreszenz.

Einen weiteren Prototyp fluoreszierender Nucleosidanaloga stellen die C-Nucleoside Formycin A und B dar (12, 13, Formelschema 4), die beide ursprünglich aus den Kulturfiltraten verschiedener Mikroorganismen isoliert wurden. Die Verbindungen wurden in ihre 2'-Desoxy-β-D-ribofuranoside überführt, die die gleichen Fluoreszenzeigenschaften wie die Riboverbindungen aufweisen [J. Wierchowsky, D. Shugar, Photochem. Photobiol. 1982, 35, 445; A. Rosowky, V. C. Solan, L. J. Gudas, J. Med. Chem. 1985, 28, 1096].

Formelschema 4

Eine weitere Serie fluoreszierender β-D-Ribonucleoside wurden aus eukariotischer Phenylalanin-t-RNA isoliert; ihre Struktur wurde aufgeklärt und durch chemische Synthese bestätigt (Formelschema 5) [U. L. RajBhandary, S. H. Chang, A. Stuart, R. D. Faulkner, R. M. Hoskinson, H. G. Khorana, Proc. Natl. Acad. Sci USA 1967, 57 751; U.L. RajBhandary, R. D. Faulkner, A. Stuart, J. Biol. Chem. 1968, 243, 575; K. Nakanishi, N. Furutachi, M. Funamizu, D. Grunberger, I. B. Weinstein, J. Am. Chem. Soc. 1970, 92, 7617; C. Glemarec, J.-C. Wu, G. Remaud, H. Bazin, M. Oivanen, H. Lönnberg, J. Chattopadhyaya, Tetrahedron 1988, 44, 1273; T. Itaya, M. Shimomichi, M. Ozasa, Tetrahedr. Lett. 1988, 29, 4129; T. Itaya, A. Mizutani, T. Iida, Chem. Pham. Bull. 1986, 27 4043; G. L. Anderson, B. h. Rizkalla, A. D. Broom, J. Org. Chem. 1974, 39, 937; T. Itaya, A. Mizutani, N. Watanabe, Chem. Pharm. Bull 1989, 37, 1221].

Formelschema 5

Alle diese sogenannten Wye-Nucleoside besitzen eine ungewöhnlich labile N-glykosylische Bindung, die ihren chemischen Einbau in DNA und/oder RNA verhindert.

In der Serie der Pyrimidinnucleoside haben Adams und Mitarbeiter [C. J. Adams, J. B. Murray, J. R. P. Arnold, P. G. Stockley, Tetrahedr. Lett. 1994, 35, 1597] das fluoreszierende 2-Pyrimidinon-1-β-D-ribosid dargestellt und in ein chemisch synthetisiertes Ribozym an einer nicht für die katalytische Spaltung essentielle Position eingebaut.

Kool und Mitarbeiter [R., X.-F. Ren, N. C. Chaudhuri, P. L. Paris, S. Rumney, E. T. Kool, J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7671] substituierten die heterocyclischen Basen natürlicher Nucleoside durch fluoreszierende Aromaten wie Pyren, Phenanthren oder Naphtalin (15–17). Siehe US-Patent Nr. 5,652,099 (29. Juli 1997).

2.2 Bekannte Verfahren der Oligonucleotid-Markierung

Oligonucleotide werden in einer Reihe von Methoden, so auch als diagnostische und therapeutische Sonden, verwendet und hybridisieren an eine Ziel-DNA oder RNA. Bei diesen Anwendungen ist häufig die Markierung der Oligonucleotidsonde nützlich oder gar notwendig. Die Mehrheit der bislang verwendeten Oligonucleotidsonden ist radioaktiv markiert. Wegen der kurzen Halbwertzeiten der üblicherweise verwendeten Isotope (³²P, ³⁵S), aufgrund von Sicherheitserfordernissen und nicht zuletzt wegen der hohen Kosten für die Handhabung und Entsorgung der radioaktiven Sonden besteht ein nachhaltiger Bedarf nach anderen bequem zu handhabenden, sensitiven und preiswerten Verfahren bei den diagnostischen Hybridisierungsmethoden.

In den vergangenen Jahren haben mehr und mehr nicht-radioaktive Verfahren der Oligonucleotidmarkierung die oben erwähnten Methoden verdrängt. Nichtkovalente Markierungstechniken (z. B. die Verwendung von Interkalatoren) sollen in diesem Zusammenhang nicht beschrieben werden. Im Prinzip beruhen alle anderen nicht-radioaktiven Verfahren der DNA- oder RNA-Markierung auf analogen Techniken der Nucleosid-Derivatisierung zum Zwecke der Detektion, so z. B. die Bindung von Antikörpern oder enzymatische Prozessierung oder die Anknüpfung von fluoreszenten oder chemiluminiszenten Reportergruppen. Techniken für das Anhängen von Reportergruppen sind (a) die Funktionalisierung des 5'- oder 3'-Endes entweder eines monomeren Nucleosides oder eines Oligonucleotides mittels verschiedener chemischer Reaktionen [R. A. Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 8790]; (b) die Synthese modifizierter Nucleotide oder von Synthons wie Phosphoramiditen oder Phosphonaten, die entweder (i) geschützte reaktive Gruppen (NH₂, SH, oder COOH), (ii) aktivierbare mono-funktionale Linker (NHS-Ester, Aldehyde oder Hydrazide) oder (iii) Affinitätsankergruppen (Biotin oder Digoxiginin) an der heterocyclischen Base oder dem Glykon tragen. In diesem Fall erfolgt die Oligonucleotidmarkierung durch post-synthetische Modifikation am intakten Oligomer. (c) Eine weitere Technik besteht in der Synthese passend geschützter chemischer Einheiten, die während der Oligonucleotidsynthese an das 5'-Ende des geschützten Oligonucleotids gekuppelt werden. (d) Ein anderes Verfahren besteht in der Addition funktioneller Gruppen an den glykonischen Rest oder an das Zucker-Phosphat-Rückgrat.

Nicht-nucleosidische Verbindungselemente (Linker) und Marker wurden mittels enzymatischer oder chemisch-synthetischer Methoden an die 3'- oder 5'-Termini von Oligonucleotiden angehängt. Darüber hinaus wurde auch die Markierung von nichtterminalen Nucleotiden realisiert; diese Methode weist jedoch immer noch große Probleme auf (siehe Kap. 2.3.)

Die Markierung eines Oligonucleotids durch kovalente Derivatisierung kann entweder an der heterocyclischen Base, dem Zuckerrest oder am Phosphodiester-Rückgrat erfolgen.

Die folgenden Arbeiten beschreiben Methoden zur Derivatisierung der heterocyclischen Base:

1. G. H. Keller et al., Anal. Biochem. 1988, 170, 101.
2. T. Takeda, K. Ikeda, Nucleic Acids Res., Symp. Ser. 1984, 15, 101.
3. E. Jablonski et al., Nucleic Acids Res. 1986, 14, 6115.
4. M. S. Urdea et al., 1990, US-Patent, Nr. 4,910,300.
5. A. C. Foster et al., Nucleic Acids Res. 1985, 13, 745.
6. E. A. Bayer, M. Wilchek, Meth. Biochem. Analysis 1980, 26, 1.
7. W. T. Lee, D. H. Conrad, J. Exp. Med. 1984, 159, 1790.
8. E. A. Bayer et al., Anal. Biochem. 1985, 149, 529.
9. A. Reisfeld et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987, 142, 519.
10. S. Klevan et al. 1989, US Patent, Nr. 4,828,979.
11. P. A. Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981, 87, 6633.
12. R. K. Saiki et al. Science 1985, 230, 1350.
13. Digoxigenin-Paper mit Klaus Mühlegger.
14. L. Bobo et al., J. Clin. Microbiol. 1990, 28, 1968.
15. R. P. Viscidi et al., J. Clin. Microbiol. 1986, 23, 311.
16. D. E. Draper, L. Gold, Biochemistry 1980, 19, 1774.
17. J. A. Brumbaugh et al., Nucleic Acids Res. 1988, 16, 4937.
18. M. S. Urdea et al., Clin. Chem. 1989, 35, 1571.
19. I. Weeks et al., Clin. Chem. 1983, 29, 1474.

Auch am glykonischen Rest sowie am Phosphodiester-Rückgrat wurden Derivatisierungen durchgeführt. Siehe:

1. T. Schoetzau, U. Koert, J. W. Engels, Synthesis 1999
2. A. Guzaev, E. Azhayeva, J. Hovinen, A. Azhayev, H. Lönnberg, Bioconjugate Chem. 1994, 5, 501.
3. N. E. Conway et al., Nucleic Acids Res. 1989, 21, 43.
4. S. Agrawal, P. C. Zamecnik, Nucleic Acids Res. 1990, 18, 5419.
5. Smith, Kung, Kaiser 1989, US-Patent, Nr.: 4,849,513.

Die wichtigsten Reportermoleküle für die Markierung von Oligonucleotiden sind Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluorescein, Rhodamin, Acridin, Dansyl, Coumarin, Phenazin, Oxacin, BODYPY und Cyanin-Farbstoffe. Eine Auswahl, inklusive ihrer spektroskopischen Eigenschaften ist von A. Waggoner [A. Waggoner, Methods Enzymol. 1995, 246, 362] sowie von A. Mayer beschrieben worden [A. Mayer, S. Neuenhofer, Angew. Chem. 1994, 106, 1097]. Die dort beschriebenen Farbstoffe decken das gesamte sichtbare Spektrum ab. Die heutige Entwicklung neuer Farbstoffe zielt auf die IR-Region des Spektrums hin; dies erlaubt den Einsatz kostengünstiger Photodiodensysteme und erbringt ein verbessertes Signal-Rausch Verhältnis.

Zwei umfassende Übersichtsartikel über die verschiedenen Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung sind erschienen: C. Wojczewski, K. Stolze, J. W. Engels, Synlett 1999, 10, 1667; D. M. Jameson, J. E. Ecclestone, Methods Enzymol. 1997, 278, 363.

2.3 Grenzen der nicht-radioaktiven Markierungsmethoden für Oligonucleotide

Das Hauptproblem, dass sich bei nicht-radioaktiv markierten Oligonucleotiden ergibt, liegt darin, dass eine Duplexbildung durch spezifische Basenpaarung zwischen den durch voluminöse und/oder geladene Gruppen modifizierten Nucleosiden gehindert ist. Darüber hinaus werden Nucleosid Triphosphate, die durch sperrige Substituenten modifiziert sind, oft nicht von DNA- oder RNA Polymerasen akzeptiert und daher nicht in eine wachsende Oligomerkette eingebaut.

2.4. Fluoreszierende Nucleoside des "Etheno"-Typs – Möglichkeiten und Grenzen

N. K. Kochetkov und Mitarbeiter beschrieben als erste die Umsetzung von 9-Alkyladeninen (und 1-Alkylcytosinen) mit Chloracetaldehyd in wässeriger Lösung zum 1,N⁶-Ethenoadenin bzw. 1,N⁴-Ethenocytosin [N. K. Kochetkov, V. N. Shibaev, A. A. Kost, Tetrahedron Lett. 1971, 1993]. Später weiteten N. Leonard und Mitarbeiter [ J. R. Barrio, J. A. Secrist III, N. J. Leonard, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972, 11, 3499] diese Reaktion auf Adenosin und AMP aus. Die Reaktion von Chloracetaldehyd mit 2'-Desoxyguanosin ergibt zwei Produkte, 1,N²- und 3,N²-Etheno-2'-desoxyguanosin [P. D. Sattsangi, N. J. Leonard, C. R. Frihart, J. Org. Chem. 1977, 42, 3292]. Aufgrund ihrer Neigung zur Fluoreszenz erwiesen sich Ethenonucleoside als wertvoll für den Nachweis biochemischer und physiologischer Reaktionen unter Beteiligung von Adenosin Phosphaten.

Später synthetisierten Srivastava und Mitarbeiter das 1,N⁶-Etheno-2'-desoxyadenosin [S. C. Srivastava, S. K. Raza, R. Misra, Nucleic Acids Res. 1994, 22, 1296]. Erst unlängst wurden Phosphoramidit-Synthesebausteine des 1,N⁶-Etheno-2'-desoxyadenosins und des 1,N⁶-Ethenoadenosins für die automatische DNA- und RNA-Synthese dargestellt und mit ihnen fluoreszenzmarkierte Oligonucleotide definierter Sequenz synthetisiert. Etwa gleichzeitig wurden mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse Guanin-1,N⁶-Ethenoadenin Basenpaare in Oligoribonucleotiden nachgewiesen [G. A. Leonard, K. E. McAuley-Hecht, N. J. Gibson, T. Brown, W. P. Watson, W. N. Hunter, Biochemistry 1994, 33, 4755].

Die relativ geringfügige strukturelle Änderung, die durch die Annelierung eines dritten Ringes an Adenin bewirkt wird, wird offensichtlich bei einer Duplexbildung sowie im Hinblick auf die Substrateigenschaften durch verschiedene Enzyme toleriert.

Auf der anderen Seite weisen jedoch Ethenonucleoside karzinogene Eigenschaften auf: So wurde gefunden, dass während der in-vitro Replikation durch E- coli DNA Polymerase I, 2'-Desoxyguanosin fälschlicherweise gegenüber Chloracetaldehyd-behandeltem Poly(dA) eingebaut wird. Darüber hinaus wurde auch über einen bevorzugten Einbau von dG und dC in DNA, die mit dem gleichen Reagenz behandelt worden war, berichtet. Auch im Fall des 3,N⁴-Etheno-2'-desoxycytidin wurde über Fehlinkorporationen publiziert [W. Zhang, R. Rieger, C. Iden, F. Johnson, Chem. Res. Toxicol. 1995, 8, 148].

DNA-Reparaturenzyme werden in allen Organismen exprimiert, um dem schädigenden Effekt endogener und exogener DNA-zerstörender Agentien zu begegnen [T. Lindah, Nature 1993, 362, 709]. Unlängst wurde ein menschliches Reparaturenzym – die Alkyl-N-Purin DNA Glycosylase (ANPG) – beschrieben, das die Entfernung verschiedener modifizierter Basen, darunter 3-Methyladenin, 7-Methylguanin und 1,N⁶-Ethenoadenin durch Hydrolyse der N-glykosylischen Bindung bewirkt, beschrieben. Da ANPG unmittelbar der Wirkung chemotherapeutischer alkylierender Agentien entgegengerichtet ist, stellt dieses Enzym ein potentielles Ziel für die Entwicklung neuer Pharmaka dar [O. D. Schärer, G. L. Verdine, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 10781]. Auch in diesem Hinblick sind also Etheno-modifizierte Nucleoside und Oligonucleotide, die solche Bausteine enthalten, von großer Bedeutung, um die Wirkung alkylierender Agentien in der Chemotherapie zu verstärken, in dem sie die Wirkung von ANPG inhibieren.

Die Fluoreszenzintensität von 1,N⁶-Ethenoadenosinen wurde von Yip und Tsou [K.-F. Yip, K. C. Tsou, J. Org. Chem. 1975, 40, 1066] untersucht. Diese Autoren fanden, dass 2-Substituenten wie OH oder SO₃H die Fluoreszenz verstärken, während Substituenten wie SH, NH₂ und andere diese signifikant verringern.

Im Jahr 1980 berichteten L. B. Townsend und Mitarbeiter über die Synthese bestimmter fluoreszierender Imidazo[1,2-c]pyrrolo[3,2-e]pyrimidin Ribonucleoside (= 1,N⁶-Etheno-7-desazaadenosine) [G. A. Bath, K. H. Schram, L. B. Townsend, J. Carbohydr. Nucleosides, Nucleotides 1980, 7, 333]. Auch diese Verbindungen zeigen intensive Fluoreszenz. Auf der anderen Seite führt der Einbau eines Stickstoffatoms in die Position 2 des Ethenoadenosins (= 1,N⁶-Etheno-2-aza-2'-desoxyadenosin) zu einer drastischen Verringerung der Fluoreszenzintensität [T. Sugiyama et al., Chem. Eur. J. 2000].

Bislang sind lediglich Ribonucleoside, die einen 1,N⁶-Etheno-7-desazapurin-Heterocyclus tragen beschrieben worden. Alle übrigen Typen von Nucleosiden sind bislang unbekannt und werden in dieser Erfindung erstmals eröffnet.

Die Verwendung von Etheno-modifizierten Purinribo- und speziell von 2'-Desoxyribonucleosid-Synthesebausteinen für die Markierung spezifischer Positionen einer definierten DNA- oder RNA-Sequenz ist aufgrund der außerordentlichen Labilität der bislang bekannten Ethenonucleoside gegenüber Basen und Säuren mit großen Schwierigkeiten behaftet. Dies hat bislang verhindert, dass ein Einbau von Ethenonucleosiden in Oligonucleotide zur Routine wurde.

3. Detaillierte Darstellung der Erfindung

Vorgestellt und beansprucht werden nun neuartige und chemisch stabile 1,N⁶-Etheno-2'-desoxy-β-D-ribonucleoside, vorzugsweise 1,N⁶-Etheno-7-desaza-2'-desoxyadenosin (εc⁷A_d, 19, siehe Beispiel 1), die Darstellung reaktiver Synthesebausteine dieser Verbindungen und deren Einbau in Oligonucleotide verschiedener Sequenz, vorzugsweise mit Hilfe von Phosphonaten oder Phosphoramiditen (siehe Beispiele 3 und 4).

1,N⁶-Etheno-7-desaza-2'-desoxyadenosin, das aus dem bekannten 7-Desaza-2'-desoxyadenosin (18) [F. Seela, A. Kehne, Liebigs Ann. Chem. 1983, 876] durch Umsetzung mit Chloracetaldehyd (siehe Beispiel 1) erhalten werden kann, ist ein intensiv fluoreszierendes Nucleosid, das ähnliche Fluoreszenzeigenschaften wie die Stammverbindung 1,N⁶-Etheno-2'-desoxyadenosin aufweist. Seine chemische Stabilität in saurem und basischem Medium ist jedoch erheblich größer als die des 1,N⁶-Etheno-2'-desoxyadenosins – eine Eigenschaft, die 1,N⁶-Etheno-7-desaza-2'-desoxyadenosin seiner Purin-Stammverbindung erheblich überlegen macht, besonders während der Oligonucleotidsynthese (siehe Tabelle 1 und Beispiel 2). Tabelle 1. Halbwertszeiten τ des 1,N⁶-Etheno-7-desaza-2'-desoxyadenosins und des 1,N⁶-Etheno-2'-desoxyadenosins.

Eine wichtige Verkörperung betrifft die Verwendung fluoreszierender Verbindungen wie εc⁷A_d bei der chemischen Festphasensynthese von fluoreszierenden DNA-Hybridisierungssonden (= Nucleinsäure-bindende Komponenten).

1

Wie aus 1 ersichtlich wird, verleiht der Einbau von bereits einem 1,N⁶-Etheno-7-desaza-2'-desoxyadenosin in ein Oligodesoxynucleotid dem Oligomer eine starke Fluoreszenz (1, C). Die Hybridisierung mit einem nichtfluoreszierenden Komplementärstrang ergibt einen fluoreszierenden Duplex.

Bei Verwendung als Hybridisierungssonde kann die Fluoreszenz derartiger Oligonucleotide in einer Vielzahl unterschiedlicher Prozeduren zur Detektion und Identifikation spezifischer Gensequenzen dienen. Diese Methodik unterscheidet sich insofern von anderen nicht-radioaktiven Verfahren, indem in ihr keine Nucleotide, die an Enzyme oder andere reaktive Proteine gekuppelt wurden, verwendet werden.

Es wird hiermit gezeigt, dass der Einbau von beispielsweise εc⁷A_d (19) in einen inneren Abschnitt eines Oligonucleotidduplexes gegenüber einem der vier regulären Nucleoside dA, dG, dC und dT (siehe Struktur B der 2) zu nahezu identischen T_m-Werten der resultierenden Doppelstränge führt; dies zeigt, dass 1,N⁶-Etheno-7-desaza-2'-desoxyadenosin als ambiguitäre, fluoreszierende Base fungiert (Beispiel 10). Dies steht im Gegensatz zu seiner Purin-Stammverbindung, das eine Fehlbasenpaarung mit Guanin eingeht. Auch diese Tatsache macht εc⁷A_d (19) dem εA_d überlegen.

Es wird weiterhin dargelegt, dass der Einbau von beispielsweise εc⁷A_d (19) in ein Oligonucleotid als überhängenden Nucleosidrest zu einem deutlich thermisch stabilisierten Duplex führt (siehe Struktur D der 2; siehe Beispiel 9). Wird in einem Oligonucleotid-Dodecamer mit Zufallssequenz ein terminales dA=dT Basenpaar (siehe Beispiel 10, Eintrag 1) durch ein εc⁷A_d=dT Basenpaar ersetzt (siehe Beispiel 10, Eintrag 6), so erhöht sich der T_m-Wert des resultierenden fluoreszierenden Oligomeren um 2-4° (je nach verwendetem Puffersystem) im Vergleich zum Stammoligomer. Dies zeigt den stabilisierenden Effekt des terminalen (aber nicht überhängenden) εc⁷A_d Bausteines auf das restliche Undecamer.

2

Der Duplex-stabilisierende Effekt von Verbindungen wie εc⁷A_d zeigt sich auch bei solchen Oligomeren mit Zufallsequenz, in denen ein Strang einen sogenannten Aminolinker (z. B. eine 6-Aminohexyl-Kette) trägt, wie auch bei DNA-RNA-Hybriden (siehe Beispiel 9). Darüber hinaus kann grundsätzlich festgestellt werden, dass ein Duplex mit Zufallssequenz, der an jedem Ende einen εc⁷A_d-Rest trägt doppelt so stark stabilisiert wird wie ein Oligomer mit nur einem Rest. Für Oligomere, wie sie im Beispiel 9 (Eintrag 1) gezeigt sind, beträgt der stabilisierende Effekt 3.5 – 4° pro εc⁷A_d-Rest. Im Falle selbstkomplementärer, alternierender Duplexe wie [5'-d(CG)₃]₂ {T_m= 45°C} beläuft sich die Stabilisierung auf 7° pro εc⁷A_d-Rest {T_m [5'-d(εc⁷A_d-CGCGCG)]₂ = 59°C} (siehe Beispiel 9).

Die Fluoreszenz von Oligonucleotiden, die Nucleoside wie εc⁷A_d tragen, eröffnen die Möglichkeit, Duplexstabilitäten durch temperaturabhängige Fluoreszenzmessungen zu bestimmen. Während für einen Duplex wie 5'-d(TAG GTC εc⁷A_dAT ACT)·3'-d(ATC CAG TTA TGA) kein kooperativer Fluoreszenzemissions-Temperatur Plot aufgezeichnet werden kann, kann jedoch durch Messung temperaturabhängiger Anregungsspektren das Duplexschmelzen gemessen werden. Hier führt die Dissoziation der Stränge zu einer bathochromen Verschiebung des Anregungsmaximums. Eine Auftragung von λ_max des Anregungsmaximums (in nm) gegen die Temperatur ergibt ein "Schmelzprofil", aus dem ein T_m-Wert des Duplexes entnommen werden kann, der dem UV-spektrophotometrisch gemessenen völlig entspricht. Das Schmelzen eines Oligonucleotidduplexes, der einen εc⁷A_d-Rest entweder als überhängendes Nucleosid oder in einem terminalen Basenpaar trägt, kann durch Messung der temperaturabhängigen Fluoreszenzemissionsintensität bestimmt werden. Dies ist für zwei Oligonucleotidduplexe in den 4 und 5 gezeigt.

3, 4 und 5

Auch in diesen beiden Fällen sind die so ermittelten T_m-Werte identisch mit denen der durch temperaturabhängige UV-Spektrophotometrie gemessenen.

Die Erfindung eröffnet weiterhin, dass für die exonucleolytische Hydrolyse von Oligomeren, die einen εc⁷A_d-Baustein an verschiedenen Positionen entlang der DNA-Kette tragen [z. B. durch die 3'-Exonuclease Schlangengiftphosphodiesterase (EC 3.1.4.1, Crotallus durissus)] eine qualitative Korrelation zwischen der Position der fluoreszierenden Base und der Anfangsgeschwindigkeit der Fluoreszenzzunahme während der Hydrolyse besteht (siehe Beispiel 11): Je näher der εc⁷A_d-Baustein dem 3'-Ende der Oligonucleotidkette ist, desto größer ist die Anfangsgeschwindigkeit der Fluoreszenzzunahme.

4. Beispiele

Allgemeines:

Monomere.- Flashchromatographie (FC): bei 0.5 Bar an Kieselgel (Merck, Darmstadt) mit UltroRac Fraktionensammler. Dünnschichtchromatographie (DC): Kieselgel-60 F254 Platten (Merck, Darmstadt); Visualisierung durch UV-Detektion bei 254 nm. Lösungsmittelsystememe die FC und DC: A: CH₂Cl₂-MeOH (98:2); B: CH₂Cl₂-MeOH (9:1); C: CH₂Cl₂-MeOH (4:1); D: CH₂Cl₂-Aceton (4:1); E: CH₂Cl₂-Aceton (85:15); F: CH₂Cl₂-Aceton (7:3); G: CH₂Cl₂-Aceton (3:2); CH₂Cl₂-EtOH (9:1).

Fluoreszenzspektroskopie: F 4500 Fluoreszenzspektrophotometer (Hitachi, Japan). UV-Spektroskopie: U-3000 und U-3200 Spektrophotometer (Hitachi, Japan). CD-Spektroskopie: Jasco-600 Spektropolarimeter mit thermostatisch kontrollierten 1-cm Quartzküvetten, verbunden mit einem Lauda RCS Thermostaten (Lauda, Königshofen). NMR-Spektroskopie: Avance-DPX-250 und AMX-500 Spektrometer (Bruker, Karlsruhe); Messfrequenzen: ¹H: 250.133 MHz, 500.140 MHz;¹³C: 62.896 MHz, 125.700 MHz; ³¹P-NMR: 101.256 MHz. δ-Werte in ppm relativ zu Tetramethylsilan (¹H, ¹³C) als internem Standard und zu 85% H₃PO₄ (³¹P) als externem Standard. Chemische Verschiebungen in ppm sind positiv, wenn sie gegenüber dem Standard zu tieferem Feld verschoben sind.

Oligonucleotid-Festphasensynthese.- Oligonucleotide wurden an einem automatischen DNA/RNA-Synthesizer, Model ABI 392 (Applied Biosystems, Weiterstadt unter der Verwendung von Standardprotokollen nach dem "Trityl-off"-Modus dargestellt. Lediglich unmodifizierte Oligomere wurden nach dem "Trityl-on"-Modus synthetisiert. Die Kupplungsausbeuten betrugen für alle verwendeten Phosphoramidite mehr als 95%. Detritylierte modifizierte Oligomere wurden mittels Ionenaustauschchromatographie an Dionex Nucleopac PA-100 HPLC Säulen (4 × 250 mm, P/N 043010, Dionex GMbH, Idstein) gereinigt; dabei wurden folgende Gradienten benutzt: 5 min 5% 0.01 M NaOH/1.5 M LiCl (X) in 0.01 M NaOH (Y); 25 min 5 – 30% Y in X; 10 min 30 – 5% Y in X; 5 min 5% Y in X. Geräte für die Ionenaustauschchromatographie: L4250 UV/VIS Detektor, L6250 Intelligente Pumpe und D2500 Integrator (merck-Hitachi). Die tritylierten unmodifizierten Oligomere wurden mittels RP-18 HPLC gereinigt: 4 × 250 mm RP-18 Säule (Merck); an einer Merck-Hitachi Anlage bestehend aus einem 655 A-12 Flüssigchromatograph mit einem 655 A variablem Wellenlängen UV-Monitor und einem D2000 Chromato-Integrator. Gradienten: 0.1 M (Et₃NH)OAc (pH 7.0)/MeCN 95:5 (U) and MeCN (V); Gradient I: 0 – 50 min 0 – 50% V in U, Flussrate 1 ml/min; Gradient II: 0 – 20 min 0 –20 % V in U; 20 – 40 min 20 – 40% V in U, Flussrate 1 ml/min. Die Detritylierung der Oligomere wurde durch 5-minütiges Behandeln mit 2.5% Dichloressigsäurelösung in CH₂Cl₂ (1 ml) bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Neutralisation mit Et₃N, Eindampfen bis zur Trockne und Nachdampfen mit MeOH wurden die Oligomere erneut durch RP-18 HPLC unter Verwendung der oben genannten Apparatur gereinigt. Dabei wurde folgender Gradient eingesetzt: 0 – 30 min 0 – 20% V in U, 30 –35 min 20% V in U, 35 – 40 min 20 – 0% V in U, 40 – 45 min 0% V in U. Die anschließende Entsalzung der Oligomere wurden ebenfalls an einer RP-18 HPLC-Säule (4 × 100 mm) durchgeführt; Lösungsmittel für die Absorption: H₂O; Lösungsmittel für die Desorption: MeOH-MeOH 3:2; Flussrate: 1 ml/min. MALDI-TOF Massenspektren wurden am Institut für Medizinische Physik der Westfälischen Wilhelmsuniversität, Münster angefertigt; UV Laseranregung: 337 nm für 3 nsec.

Schmelzkurven.- Extinktions-Temperatur-Profile (Schmelzkurven) wurden an einem Cary 1E UV-VIS Spektrophotometer (Varian, Melbourne, Australien), verbunden mit einem Cary thermoelektrischen Element, aufgenommen. Die aktuelle Temperatur wurde in der Refrenzzelle mit einem Pt-100 Widerstand gemessen. Die ΔT_m-Werte sowie die thermodynamischen Zusstandsfunktionen (ΔH°, ΔS° und ΔG°₃₁₀) wurden mit Hilfe des Programms MeltWin 3.0 [J. A. Mc Dowell, D. H. Turner, Biochemistry 1996, 35, 14077] berechnet.

Enzymatische Hydrolyse der Oligonucleotide.- Die enzymatische Hydrolyse der Oligonucleotide wurde mit Hilfe von Schlangengiftphosphodiesterase (E.C. 3.1.4.1, Crotallus durissus) und alkalischer Phosphatase (E.C. 3.1.3.1) durchgeführt; Puffer: 0.1 M TRIS-HCl (pH 8.0). Die Chromatogramme der Hydrolysereaktionen der Oligonucleotide wurden mit der oben beschriebenen Apparatur erhalten. Lösungsmittelsystem: U; Flussrate 0.6 ml/min, Detektionswellenlänge: 260 nm. Beispiel: siehe 6.

6

Beispiel 1.

7-(2-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-7H-imidazo[1,2-c]pyrrolo[2,3-d]pyrimidin (19).

Zu 7-Desaza-2'-desoxyadenosin (2 g, 8 mmol, 18) wird Chloracetaldehyd (30 ml) hinzugefügt und die Lösung 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Eindampfen der Lösung, Chromatographie des Rückstandes an Kieselgel 60 (Säule: 15 × 3 cm, B) und Umkristallisation des Inhaltes der Hauptzone aus McOH/EtOAc erhält man 1.3 g (65%) der Titelverbindung als farblosen Feststoff. DC (Kieselgel, C): R_f = 0.8. ¹H-NMR (D₆-DMSO): 2.24 (m, 1H, H_α-C(2')); 2.48 (m, 1H, H_β-C(2')); 3.50 (m, 2H, H₂-C(5')); 3.84 (s, 1H, H-C(4')); 4.37 (s, 1H, H-C(3')); 4.90 (t, 1H, NO-C(5')); 5.29 (d, J = 3.4, 1H, HO-C(3')); 6.64 (pt, J = 6.5, 1H, H-C(1')); 6.79 (d, J = 3.2, 1H, H-C(9)); 7.44 (s, 1H, H-C(3)); 7.61 (d, J = 3.2, 1H, H-C(8)); 7.95 (s, 1H, H-C(2)); 9.11 (s, 1H, H-C(5)).¹³C-NMR (D₆-DMSO): 135.0 (C-2); 138.8 (C-4); 106.1 (C-5); 141.6 (C-6); 99.9 (C-7); 122.5 (C-8); 132.1 (C-10); 111.2 (C-11); 83.3 (C-1'); 70.9 (C-3'); 87.3 (C-4'); 61.9 (C-5'). Analyse berechnet für C₁₉H₂₆N₄O₄ (576.65): C 56.93, H 5.14, N, 20.43. Gefunden: C 57.15, H 5.02, N 19.92.

Die UV-Spektren des εc⁷A_d wurden bei drei verschiedenen pH-Werten gemessen und die Extinktionskoeffizienten wurden bestimmt (Tabelle 1) und mit denen des entsprechenden Ribonucleosids verglichen.

Tabelle 2. Vergleich der Extinktionskoeffizienten des 1,N⁶-Etheno-7-desaza-2'-desoxyadenosins und des entsprechenden Ribonucleosids.

Die Fluoreszenzspektren des εc⁷A_d sind in 7 dargestellt.

7

pH-Abhängige Fluoreszenzmessungen zeigen, dass die volle Emissionsintensität erst oberhalb von pH 6 erreicht wird.

Beispiel 2

Stabilität des 1,N⁶-Etheno-7-desaza-2'-desoxyadenosins (19) und des 1,N⁶-Ethenoadenosins in basischem und saurem Medium.

Die chemischen Stabilitäten des 1,N⁶-Etheno-7-desaza-2'-desoxyadenosins (19) und des 1,N⁶-Ethenoadenosins wurden fluoreszenzspektrophotometrisch in 25% aq. Ammoniak bei 40°C bestimmt. Zu diesem Zweck wurde die Abnahme der Emission des εc⁷A_d bei 419 nm (Anregungswellenlänge: 289 nm) und die des εA_d bei 412 nm (3.4a) bestimmt. Für εc⁷A_d ergab sich eine Halbwertszeit von 85 h und für εA_d eine Halbwertszeit von 21 min.

Zur Bestimmung der Stabilität des εc⁷A_d in saurem Medium wurde seine Hydrolyse in 6N aq Salzsäure bei 40°C UV-spektrophotometrisch bei 280 nm bestimmt; dabei ergab sich eine Halbwertszeit von 585 min. Die Hydrolyse des εA_d war unter diesen stark sauren Bedingungen nicht mehr quantitativ erfassbar. Es ist jedoch bekannt [S. C. Srivastava, S. K. Raza, R. Misra, Nucleic Acids Res. 1994, 22, 1296], dass bereits in wässeriger Dichloressigsäure die Halbwertszeit des εA_d nur wenige Minuten beträgt.

Beispiel 3

7-(2-Desoxy-5-O-(4,4'-dimethoxytriphenylmethyl)-β-D-erythro-pentofuranosyl]-7H-imidazo[1,2-c]pyrrolo[2,3-d]pyrimidin (20).

Verbindung 19 (270 mg, 1 mmol) wird durch wiederholtes Abdampfen mit wasserfreiem Pyridin getrocknet und dann in trockenem Pyridin (1 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wird 4,4'-Dimethoxytriphenylmethylchlorid (410 mg, 1.2 mmol) hinzugefügt und die Mischung 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach 4 h fügt man MeOH (1 ml) und nach weiteren 10 min 5 proz. wässerige NaHCO₃-Lösung (5 ml) hinzu und extrahiert drei Mal mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂. Die vereinigten organischen Extrakte werden getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und eingedampft. Nach Chromatographie (FC) an Kieselgel 60 (Säule: 10 × 3 cm, F) und Eindampfen der Hauptzone erhält man die Titelverbindung (420 mg, 73%) als farblosen Schaum. DC (Kieselgel, E): R_f = 0.33. ¹H-NMR (D₆-DMSO): 2.38 (m, 1H, H_α-C(2')); 3.18 (m, 2H, H₂-C(5')); 3.70 (s, 6H, 2 OCH₃); 3.99 (m, 1H, H-C(4')); 4.42 (m, 1H, H-C(3')); 5.41 (d, J = 4.4, 1H, HO-C(3')); 6.69 (pt, J = 6.5, 1H, H-C(1')); 6.77-7.56 (m, 13H, aromatische H, 1H, H-C(9), 1H, H-C(3), 1H, H-C(8)); 7.98 (s, 1H, H-C(2)); 9.11 (s, 1H, H-C(5)). ¹³C-NMR (D₆-DMSO): 135.0 (C-2); 138.8 (C-4); 106.3 (C-5); 141.5 (C-6); 99.9 (C-7); 122.5 (C-8); 132.1 (C-10); 111.2 (C-11); 54.9 (OCH₃); 83.3 (C-1'); 70.7 (C-3'); 85.4 (C-4'); 64.1 (C-5'). Analyse berechnet für C₃₄H₃₂N₄O₅ (576.65): C 70.81, H 5.59, N 9.72. Gefunden: C 70.61, H 5.43, N 9.64.

Beispiel 4

7-[2-Desoxy-5-O-(4,4'-dimethoxytriphenyimethyl)-β-D-erythro-pentofuranosyl]-7H-imidazo[1,2-c]pyrrolo[2,3-d]pyrimidin 7-[3-(2-Cyanoethyl)-N,N-düsopropylphosphoramidit] (21).

Verbindung 20 (242 mg, 0.42 mmol) wird in trockenem CH₂Cl₂ (1 ml) gelöst und mit 140 μl (0.84 mmol) N,N-Diisopropylamin und 125 μl (0.55 mmol) Chloro-(2-cyanoethoxy)-N,N-diisopropylethylaminophosphan versetzt. Nach 30 minütigem Rühren bei Raumtemperatur fügt man 5 ml einer 5% wässerigen NaHCO₃-Lösung hinzu und extrahiert anschließend zwei Mal mit je 20 ml CH₂Cl₂. Die vereinigten organischen Extrakte werden getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und eingedampft.

Anschließende Chromatographie (FC) an Kieselgel 60 (Säule: 10 × 3 cm, F) und Eindampfen der Hauptzone erhält man die Titelsubstanz (208 mg, 64%) als farblosen Schaum. DC (Kieselgel, D): R_f = 0.63. ³¹P-NMR (CDCl₃): 150.00; 149.81 ppm.

Beispiel 5

3-(2-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-3,4-dihydro-5H-imidazo[1,2-i]purin-5-on (1,N⁶-Etheno-2'-desoxyisoguanosin) (22).

Zu einer Lösung von 2'-Desoxyisoguanosin (360 mg, 1.35 mmol) in NaOAc Puffer (pH 4.7, 8 ml) fügt man Chloracetaldehyd (0.5 ml, 4 mmol, 50% in H₂O) hinzu. Nach 24 stündigem Rühren bei Raumtemperatur werdden weitere 3 ml Puffer und eine zweite Portion Chloracetaldehyd (0.5 ml) hinzugegeben und weitere 20 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend an Serdolit lonenaustauscherharz chromatographiert (Säule: 2 × 20 cm). Nach Waschen mit (i) Wasser (100 ml) und (ii) Wasser-EtOH (95:5, 200 ml) wird das Produkt mit Wasser-EtOH (9:1, 400 ml) eluiert. Aus der Hauptzone erhält man nach Abdampfen des Lösungsmittels die Titelverbindung (152 mg, 39%) als farbloses Pulver (Zers.: 250°C). DC (Kieselgel, i-PrOH-H₂O-25% aq. NH₃, 3:1:1): R_f = 0.85. UV (H₂O): pH 1: 296, 258 nm (12700, 5100); pH 7: 295, 268 nm (10400, 7400); pH 12: 303, 292, 282 nm (7000, 11000, 11000). ¹H-NMR (D₆-DMSO): 8.06 (s, 1H, H-C(8)); 7.90, 7.48 (s, 2H, CH=CH); 6.27 (pt, J = 6.7 Hz, 1H, H-C(1')); 5.28 (s, 3'-OH + 5'-OH); 4.39 (m, 1H, H-C(3')); 3.90 (m, 1H, H-C(4')); 3.64 (m, 2H, H₂-C(5')); 2.57, 2.24 (m, H₂-C(2')). Analyse berechnet für C₁₂H₁₃N₅O₄ (291.3): C 49.48, H 4.50, N 24.04. Gefunden: C 49.28, H 4.49, N 24.20.

Beispiel 6

1-(2-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-1H-imidazo[1,2-c]-pyrazolo [4,3-e]-pyrimidine (23).

1-(2-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amin (3.0 g, 12 mmol) wird in wässerigem Acetatpuffer (1 M, pH 4.5 – 5.0, 70 ml) unter Erwärmen auf 40-50°C gelöst. Anschließend fügt man Chloracetaldehyd (50% in H₂O, 7.5 M, 15 m) hinzu und rührt die Reaktionsmischung für 70 h bei Raumtemperatur. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in MeOH suspendiert und anorganisches Material abfiltriert. Nach Waschen mit MeOH werden die vereinigten Filtrate und Waschlösungen im Vakuum bei 40-50°C eingedampft und der Rückstand an Kieselgel 60 chromatographiert (FC) (Säule: 15 × 3 cm). Elution mit CH₂Cl₂-MeOH (95:5, gefolgt von 9:1 und dann 85:15) ergibt eine Hauptfraktion, aus der nach Abdampfen des Lösungsmittels und anschließender Kristallisation aus MeOH-EtOAc (1:1) die Titelverbindung (2.71 g, 82%) als farblose Kristalle vom Schmp. 197-200°C gewonnen werden. DC (Kieselgel, CH₂Cl₂, 9:1): R_f = 0.4. UV (MeOH): λ_max 232 (41000), 278 (4500), 257 (8100). ¹H-NMR ((D₆)DMSO): 9.32 (s, H-C(2)); 8.40 (s, H-C(7)); 8.06 (d, J = 1.5, H-C(10)); 7.52 (d, J = 1.5, H-C(11)); 6.72 (pt, J = 6.3, H-C(1')); 5.35 (d, J = 3.4, 3'-OH); 4.78 (t, 5'-OH); 4.49 (m, 1H, H-C(3')); 3.86 (m, 1H, H-C(4')); 3.54 und 3.40 (2m, 2H, H₂-C(5')); 2.88 (m, 1H, H_β-C(2')); 2.34 (m, 1H, H_α-C(2')). Fluoreszenzdaten (10 mM Na-Cacodylat, 10 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, pH 7): λ_EX = 235 nm; λ_EM = 445 nm. Analyse berechnet für C₁₂H₁₃N₅O₃ (275.28): C 52.36, H 4.76, N 25.44. Gefunden: C 52.61, H 4.90, N 25.15.

Beispiel 7

1-(2-Deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-5-amino-4-(imidazol-2''-yl)-1H-pyrazol (24).

Verbindung 23 (1.2 g, 5 mmol) wird über Nacht mit 1 N wässeriger Natronlauge bei Raumtemperatur gerührt. Nach anschließender Neutralisation durch Zugabe von 2 N Salzsäure dampft man zu einem Sirup ein und löst diesen in wasserfreiem MeOH. Ausgefallenes NaCl wird abfiltriert und mit MeOH gewaschen. Die Filtrate und Waschlösungen werden vereinigt, eingedampft und der Rückstand an Kieselgel 60 chromatographiert (Säule: 10 × 3 cm). Elution mit CH₂Cl₂-MeOH (85:15) ergibt eine Hauptzone, aus der nach Abdampfen des Lösungsmittels die Titelverbindung (960 mg, 80%) als gelblicher Schaum erhalten wird. UV (MeOH): λ_max = 254 nm (10500). DC (Kieselgel, CH₂Cl₂-MeOH, 9:1): R_f = 0.3. ¹H-NMR ((D₆)DMSO): 11.9 (s, br. NH); 7.65 (s, H-C(3)); 6.95 (s, br., 2H, NH₂); 6.37 (s, br., 2H, H-C(7), H-C(8)); 6.12 (pt, J 6.4, H-C(1')); 5.21 (d, J 3.8, 3'-OH); 4.99 (t, J 5.0, 5'-OH); 4.37 (m, 1H, H-C(3')); 3.80 (m, 1H, H-C(4')); 3.45 (m, 2H, H₂-C(5')); 2.71 (m, 1H, H_β-C(2')); 2.11 (m, 1H, H_α-C(2')). Analyse berechnet für C₁₁H₁₅N₅O₃ (265.27): C 49.81, H 5.70, N 26.40. Gefunden: C 49.83, H 5.78, N 26.36.

Beispiel 8

1-(2-Deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-1H-diimidazo[1,2-c:4',5'-e][1,2,3]-triazine (25).

Eine Lösung der Verbindung 24 (0.24 g, 1 mmol) in 80% Essigsäure with in einem Eisbad für 1 h mit NaNO₂, 70 mg, 1 mmol) behandelt. Anschließend wird zu einem Sirup eingedampft. Dieser wird in Wasser aufgenommen und mehrfach mit H₂O nachgedampft, um die Essigsäure zu entfernen. Der Rückstand wird an Kieselgel 60 chromatographiert (Säule: 10 × 3 cm). Stufenweise Elution mit CH₂-Cl₂-MeOH (95:5, 9:1, 85:15) ergibt nach Eindampfen der Hauptzone Verbindung 25 (0.18 g, 65%) als gelblichen Schaum. DC (Kieselgel, CH₂Cl₂-MeOH, 9:1): R_f = 0.3. UV (MeOH): λ_max 233 (34800), 295 (4300). ¹H-NMR ((D₆)DMSO): 8.78 (d, 1H, J 1.5, N-C(11)); 8.70 (s, H-C(7)); 7.79 (d, 1H, J 1.5, H-C(10)); 6.98 (pt, 1H, J 6.1, N-C(1')); 5.43 (d, 1H, J 4.6, 3'-OH); 4.74 (t, 1H, J 5.7, 5'-OH); 4.54 (m, 1H, H-C(3')); 3.91 (m, 1H, H-C(4')); 3.55 (2 m, 2H, H₂-C(5')); 2.97 (m, 1H, H_β-C(2')); 2.47 (m, 1H, H_α-C(2')). Analyse berechnet für C₁₁H₁₂N₆O₃ (276.25): C 47.83, H 4.38, N 30.42. Gefunden: C 48.00, H 4.28, N 30.05.

Beispiel 9 T_m-Werte und thermodynamische Daten von Oligonucleotidduplexen mit εc⁷A_d als überhängendem Ende.

Beispiel 10 T_m-Werte und thermodynamische Daten von Oligonucleotidduplexes mit εc⁷A_d als überhängendem Ende.

Beispiel 11

Enzymatische Hydrolyse von Oligonucleotiden mit 1,N⁶-Etheno-7-desaza-2'-desoxyadenosin mit Schlangengift Phosphodiesterase.

Zu einer Lösung von 0.25 A₂₆₀ Einheiten eines der Oligonucleotide 5'-d(TAG GTC εc⁷AAT ACT) (11), 5'-d(Tεc⁷AG GTC AATεc⁷ACT) (14), 5'-d(TAG GTC εc⁷Aεc⁷AT ACT) (13) und 5'-d(εc⁷A TAG GTC AAT ACT) (16) in 0.1 M TRIS-HCl Puffer (pH 8.0, 1 ml) wird Schlangengift Phosphodiesterase (Crotallus durissus) hinzugefügt und der Anstieg der Fluoreszenzemissionsintensität bei 419 nm (Anregungswellenlänge: 289 nm) als Funktion der Zeit registriert. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt.

8

6. Bevorzugte Verkörperungen der Patentansprüche

zum Anspruch 1:

Halogeno bedeutet Fluoro-, Chloro-, Bromo- oder Iodo-Substituenten.

Alkylgruppen weisen vorzugsweise eine Kettenlänge von vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen auf, wobei diese sowohl linear, verzweigt oder cyclisch angeordnet sein können. Die Kettenlänge der Alkylgruppe wird sich hierbei an der sterischen Situation an der spezifischen Position, an der die Alkylgruppe hängt, orientieren. Existieren sterische Zwänge, so wird die Alkylgruppe klein sein, Methyl- und Ethylgruppen werden hierbei bevorzugt. Alle Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen können entweder substituiert oder unsubstituiert sein.

Bevorzugte Alkenylgruppen bestehen aus 2 bis 10 C-Atomen. Hier gelten ähnliche Auswahlbedingungen wie für Alkylgruppen; auch sie können linear, verzweigt oder cyclisch sein. Die am meisten bevorzugte Alkenylgruppe ist die Ethylengruppe.

Bevorzugte Alkinylgruppen bestehen ebenfalls aus 2 bis 10 C-Atomen. Auch hier können die Gruppen linear, verzweigt oder cyclisch sein. Darüber hinaus können die Alkinylgruppen auch mehr als eine Dreifachbindung enthalten. Die am meisten bevorzugte Alkinylgruppe ist die 3-Propargylfunktion.

Alkoxygruppen bestehen bevorzugt aus 1 bis 6 C-Atomen und sind über das Sauerstoffatom mit dem Rest des Moleküls verknüpft. Für den Alkylteil der Alkoxygruppen gelten dieselben Bedingungen wie für Alkylgruppen. Die am meisten bevorzugte Alkoxygruppe ist die Methoxyfunktion.

Aryloxygruppen bestehen bevorzugt aus 6 bis 20 C-Atomen. Diese können Bestandteil von einem oder mehreren Ringen sowie von Seitenketten sein, die an einen aromatischen Ring geknüpft sind. Bevorzugte Aryloxygruppen sind die Phenoxy- und die Benzoxygruppe.

Bevorzugte Sauerstoffschutzgruppen in OR¹ sind Aroyl-, Acyl- und Silylgruppen. Unter diesen wird besonders die Benzoylgruppe bevorzugt. Favorisierte Silylgruppen sind Trialkylsilylgruppen wie die Triethylsilyl- und die Triisopropylsilyloxymethylfunktion (TOM) [X. Wu, S. Pitsch, Nucleic Acids Res. 1998, 26, 4315].

Jedes Atom, dass in den Formeln des hier eröffneten Patentes repräsentiert ist, ist nicht auf ein bestimmtes Isotop beschränkt. So kann beispielsweise ein Phosphoratom sowohl ein ³¹P oder ein radioaktives ³²P-Isotop oder ein Gemisch aus beiden bedeuten. Dasselbe gilt für Wasserstoff (H/D/T), Kohlenstoff (C), Halogen (F, Cl, Br, I) und Stickstoff (N).

Bevorzugte Gruppen –NR⁴R⁵ in der Definition von R² ist die NH₂-Gruppe. In diesem Fall kann es angezeigt sein, dass während der chemischen Synthese von Verbindungen, die Gruppen gemäß Formel I enthalten, eines der Wasserstoffatome dieser Aminogruppe intermediär durch eine passende Aminoschutzgruppe geschützt werden muss. Solche Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt. Während der chemischen Synthese sollten auch OH-, SH- und NH₂-Gruppen mit geeigneten Schutzgruppen versehen werden.

Eine Schutzgruppe ist eine Gruppe, die an eine chemische Funktion (z. B. den Sauerstoff einer Hydroxylfunktion) unter Ersatz des Wasserstoffatoms angehängt wird, um die funktionelle Gruppe von unerwünschten Nebenreaktionen fernzuhalten. Eine Schutzgruppe ist desweiteren durch die Eigenschaft gekennzeichnet, dass sie – ohne Zerstörung der biologischen Aktivität des gebildeten Moleküls – wieder entfernt werden kann. Im hier geschilderten Fall betrifft dies die Bindung der Nucleinsäurebindenden Komponente an eine Nucleinsäure. Geeignete Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt. Besonders bevorzugte Schutzgruppen, zum Beispiel für die 5'-Hydroxylgruppe eines Nucleotids oder eines Oligonucleotids leiten sich von der Tritylgruppe ab (z. B. die Dimethoxytritylgruppe).

Bevorzugte Schutzgruppen einer exocyclischen Aminofunktion in Formel I sind die Acylgruppen und hier besonders die Benzoyl- (Bz), die Phenoxyacetyl- (PAC), die Acetyl- (Ac), die Formyl- und die N,N-Dialkylformamidin-Gruppe – und bei letzterer speziell die Dimethyl-, die Diisobutyl- und die Di-n-butylformamidingruppe.

Ungeachtet der Tatsache, dass die in diesem Patent beschriebenen Ethenoverbindungen selbst fluoreszierende Reportergruppen darstellen, können sie auch weitere Reportergruppen – vorzugsweise 1 oder 2 – tragen, wobei diese dann über einen Linker über jede mögliche Position wie in Formel I beschrieben, verknüpft sein können. Reportergruppen sind generell Gruppen, die die Nucleinsäure-bindende Komponente, sowie die daran gebundene Nucleinsäure von den übrigen Bestandteilen der Lösung unterscheidbar machen. Nucleinsäure-bindende Komponenten mit einer Reportergruppe können auch als markierte Nucleinsäurebindende Komponenten, als markierte Sonden oder einfach als Sonden bezeichnet werden. Diese Unterscheidung wird bewirkt durch die Auswahl der Reportergruppen aus einer Gruppe, bestehend aus direkt oder indirekt detektierbaren Gruppen oder aus einer Gruppe von immobilisierten bzw. immobilisierbaren Gruppen. Direkt detektierbare Gruppen sind beispielsweise Fluorophore wie Fluorescein oder seine Derivate wie Hexachlorofluorescein oder Hexafluorofluorescein, Rhodarnine, BODYPY-Farbstoffe, Psoralene, Squaraine, Porphyrine, fluoreszente Partikel, bioluminiszente Verbindungen wie Acridiniumester und Luminol, oder die Cyaninfarbstoffe wie Cy-5. Beispiele solcher Verbindungen sind im Europäischen Patent EP 0 680 969 zu finden. Desweiteren sind Spinlabel wie TEMPO, elektrochemisch detektierbare Gruppen, Ferrocene, Viologene, Schwermetallchelate und elektrochemilumineszente Marker wie Rutheniumbispyridyl-Komplexe und Naphtochinone, Quencherfarbstoffe wie Dabcyl und Nuclease-aktive Komplexe z. B. des Eisens und Kupfers nützliche detektierbare Gruppen. Indirekt detektierbare Gruppen sind solche, die durch eine andere Funktion erkannt werden, die direkt oder indirekt markiert ist. Beispiele solcher indirekt detektierbaren Gruppen sind Haptene wie Digoxigenin oder Biotin.

Eine Reportergruppe kann auch in einer Nucleotidsequenz bestehen, die nicht mit einer anderen Nucleotidsequenz der Probe wechselwirkt. Diese Nucleotidsequenz kann daher spezifisch durch eine andere Nucleotidsequenz mit komplementärer Basenabfolge erkannt werden. Diese Nucleotidsequenz wiederum kann entweder direkt oder indirekt markiert oder immobilisiert oder immobilisierbar sein.

Eine Reportergruppe kann darüber hinaus aus einer festen Phase bestehen. Die Anknüpfung der Nucleinsäure-bindenden Komponente kann entweder direkt oder indirekt erfolgen (wie oben beschrieben).

Eine Direktmarkierung kann durch kovalente Verknüpfung einer Nucleinsäurebindenden Komponente mit einer reaktiven Gruppe an der festen Oberfläche erfolgen – vorzugsweise über einen Abstandshalter (= Linker). Die indirekte Markierung kann – ähnlich wie oben für detektierbare Gruppen ausgeführt – durchgeführt werden. Vorzugsweise geschieht eine indirekte Anknüpfung auf nicht-kovalente biospezifische Weise, z. B. durch eine Hapten-Antikörper- oder Vitamin-Rezeptor Wechselwirkung oder komplementäre Nucleinsäure-Nucleinsäure Hybridisierung. All diese Verfahren sind ebenfalls dem Fachmann bekannt.

Festphasen, die für eine Immobilisierung einer Sonde im Sinne der Erfindung geeignet sind, werden aus einer Gruppe, bestehend aus Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Glas und TiO₂ ausgewählt. Die Gestalt der festen Phasen kann je nach Anforderung durch die verwendeten Geräte sowie des angewendeten Nachweisverfahrens ausgewählt werden. Zum Beispiel kann die feste Phase die Gestalt einer Kugel oder eines Gefässes besitzen.

Der Begriff Reportergruppe schließt vorzugsweise bereits ein Verbindungselement zum Rest des Moleküls mit ein. Dieser sogenannte Linker besitzt sterische Flexibilität, so dass es zu keiner sterischen Behinderung der Wechselwirkung zwischen zu analysierender Nucleinsäure und Nucleinsäure-bindenden Komponente kommt. Solche Linker, speziell hydrophile bestehend aus aufeinander folgenden Ethylenoxideinheiten, sind z. B. im Patent DE 3943522 beschrieben und dem Fachmann bekannt.

Aus den oben gegebenen Erklärungen wird ersichtlich, dass die vorgestellte Erfindung auch dann noch funktionstüchtig wäre, wenn das Rückgrat der Sonde nicht im strengen Sinn ein Oligonucleotid wäre. In den letzten Jahren wurden Nucleinsäurebindende Moleküle beschrieben, die ähnliche Eigenschaften wie Oligonucleotide aufweisen, aber ein anderes Rückgrat besitzen. Das Rückgrat ist üblicherweise Bestandteil der Nucleinsäure-bindenden Komponente und trägt – meist in linearer Anordnung – die Basen, gebunden an identische oder nicht identische Untereinheiten. Das bekannteste Rückgrat ist das natürliche Zucker-Phosphat Rückgrat der Nucleinsäuren – bestehend aus Ribonucleosid- (RNA), Desoxyribonucleosid- (DNA) oder Peptidyl-Base (PNA) – Untereinheiten. Daher umfasst eine bevorzugte Verkörperung Zucker- und Phosphatreste. In einer weiteren bevorzugten Verkörperung wird die Zuckerkonfiguration aus einer Gruppe, bestehend aus α-D, β-D, α-L und β-L ausgewählt; am meisten bevorzugt sind Verbindungen mit mindestens einem 2'-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl- oder einem β-D-Erythropentofuranosylrest.

Vorzugsweise stellt D ein Glycosid am C-1 des Zuckerrestes der Verbindung gemäß der Erfindung dar.

Die Nucleinsäure-bindende Komponente hybridisiert gemäß der Erfindung vorzugsweise in antiparalleler Weise an eine Nucleinsäure. Es ist jedoch auch möglich, bei entsprechender Auswahl der Nucleobase der Nucleinsäure und/oder der Nucleinsäure-bindenden Komponente, die Hybridisierung in paralleler Anordung zueinander durchzuführen. Parallele Hybridisierung von Nucleinsäuren mit Isocytosin und Isoguanin sind im Patent EP 0624 161 beschrieben.

Die Nucleinsäure, mit der die Nucleinsäure-bindende Komponente hybridisiert wird, kann selbst auch eine heterocyclische Gruppe gemäß Formel I tragen. Darüber hinaus kann die besagte Nucleinsäure natürliche und/oder unnätürliche Basen, z. B. 7-Desazaguanin besitzen. Somit wird der Begriff Nucleinsäure in der vorgelegten Erfindung in einer sehr breiten Weise verwendet.

zu den Ansprüchen 2-5:

Die bevorzugten Definitionen der verschiedenen Gruppen, wie sie für Formel I festgelegt wurden, gelten auch für Formel II sowie die folgenden Formeln, sofern nicht anders festgelegt.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist daher eine Nucleinsäure-bindende Komponente wie oben beschrieben, wobei das Rückgrat eine oder mehrere Einheiten der generellen Formel III enthält.

In den Verbindungen, dargestellt durch Formel II ist R¹⁴ bevorzugt Wasserstoff. Eine bevorzugte Definition für L ist Oxy. Bevorzugte Verkörperungen für U sind -OH und – O-Reportergruppe. Die bevorzugte Definition für V ist Oxy. Bevorzugte Definitionen für c sind ganze Zahlen zwischen 2 und 4 und für d ganze Zahlen von 0 bis 2.

Die Verbindungen gemäß Formel II sind so konstruiert, dass sie den heterocyclischen Rest nicht nur im inneren Teil der Nucleinsäure-bindenden Komponente sondern auch an deren Termini – entweder basengepaart (blunt end) oder überhängend positioniert tragen.

Bevorzugte Arylgruppen sind die Phenyl- und die Naphtylgruppe, entweder unsubstituiert oder durch eine oder mehrere Amino-, Aminoalkyl-, -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-, -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-, -(C₁-C₁₀)-Alkyl-, Sulfonyl-, Sulfenyl-, Sulfinyl-, Nitro- oder Nitrosogruppen substituiert. Die am meisten bevorzugte Arylgruppe ist die Phenylgruppe. Bevorzugte Arylalkylgruppe ist die Benzylgruppe. Bevorzugte Alkylaminogruppe ist die Ethylaminogruppe. Die bevorzugte -C(=O)-O-(C₁-C₄)-Alkylgruppe enthält ein oder zwei C-Atome im Alkylrest (Methyl- oder Ethylester).

Zu den Ansprüchen 6-8:

Diese Verbindungen sind solche, die als 5'-terminal markierte Sonden verwendet werden können. Bezüglich der Definitionen der Substituenten finden die oben gegebenen Definitionen Anwendung, wenn nicht anders festgelegt.

Eine besonders bevorzugte Verbindung ist eine Verbindung der Formel V, worin M' gleich O ist, R¹⁶ ist gleich -H und R¹⁴ ist entweder -H oder -OH.

Bevorzugte Rückgrate enthalten Zucker-Phosphat-Reste; unter diesen sind solche mit 2'-Desoxyzuckern besonders bevorzugt.

Jeder Rest im Rückgrat, der eine natürliche oder eine unnatürliche Base, einschließlich der Reste gemäß Formel I trägt, wird als Untereinheit bezeichnet. Unlängst wurde eine neue Art nicht natürlicher Nucleinsäure-bindender Verbindungen beschrieben. Diese werden als Peptidylnucleinsäuren bezeichnet (PNA), da sie mindestens eine Peptidbindung zwischen den Untereinheiten enthalten (siehe: WO 92/20702). Die Nucleinsäure-bindenden Komponenten der vorgelegten Erfindung können im Prinzip jede Länge aufweisen, bevorzugt jedoch bestehen sie aus 10 bis 30 Untereinheiten.

In einer ersten Option, die besonders für kurzkettige Verbindungen geeignet ist, werden die Substanzen durch chemische Synthese unter Verwendung chemisch aktivierter Derivate der Untereinheiten aufgebaut; mindestens eine davon enthält eine modifizierte Base gemäß der Erfindung. Reaktive Gruppen der Monomere, die nicht in den aktuellen Reaktionsschritt der Oligomerisation einbezogen sind, sind vorzugsweise mit einer passenden Schutzgruppe geschützt. Diese Gruppen sind allgemein bekannt und bedürfen im Prinzip keiner Änderung.

Eine aktivierte Untereinheit ist eine Untereinheit, die speziell für die chemische Reaktion mit einem vorbestimmten Substituenten einer anderen Untereinheit entweder auf einer polymeren Oberfläche oder in einem Oligomer, das aus diesen Untereinheiten aufgebaut ist, konstruiert wurde. Solche speziell konstruierten Untereinheiten werden aus einer Gruppe, bestehend aus Phosphoramiditen, Phosphonaten (wie z. B. Methylphosphonaten), Phosphorsäuretriestern, Phosphorothioaten, Phosphodithioaten, Boranophosphaten (siehe: B. Ramsey-Shaw et al., Chem. Cummun. 1999, 1517-1518), Phosphorsäuremethylestern, Phenylphosphonaten und Phosphorsäureethylestern, ausgewählt. Die vorbestimmten Substituenten sind vorzugsweise -NH₂, -SH oder -OH.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher eine Methode für die chemische Synthese einer Verbindung gemäß der Ansprüche 1 – 10 unter Verwendung aktivierter Untereinheiten, wobei besagte Untereinheiten mindestens eine Gruppe gemäß Formel I enthalten. Hier gibt es mehrere Ansätze für eine solche chemische Synthese wie (i) die Phosphortriestermethode (Narang et al., Methods Enzymol. 1979, 68, 90-99; (ii) die Phosphordiestermethode von Brown et al., (Methods Enzymol. 1979, 68, 109-151); (iii) die Diethylphosphoramiditmethode von S. Beaucage et al., (Tetrahedron Lett. 1981, 22, 1859-1862); und (iv) die "solid-support method" beschrieben im US Patent No. 4,458,066 sowie in Methods in Molecular Biology Editor. S. Agrawal, Bd. 20, Humana Press, Totowa, NJ, 1993. Die am meisten bevorzugte Methode ist die chemische Synthese unter Verwendung von Phosphoramiditen. Eine besonders bevorzugte Methode verwendet als aktivierte Untereinheiten ein oder mehrere Verbindungen gemäß der generellen Formel VII. Dies Verfahren hat den Vorzug, einfach anwendbar zu sein, und die nötigen Reagenzien, z. B. Phosphoramidite mit einer Gruppe gemäß Formel I können äußerst effizient umgesetzt werden.

Zu den Ansprüchen 9 und 10:

Besonders bevorzugt bei diesen Verbindungen ist als -MR¹⁶ eine Triphosphatgruppe und als MR¹⁵ -OH. Am meisten bevorzugt ist die Verbindung, in der R¹⁴ gleich -H ist. Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen, worin M Oxy oder Sulfandiyl und R¹⁶ einer Gruppe gemäß der Formel IV entspricht, in der U gleich -OH, T gleich Oxo oder Thioxo, R²⁹ gleich OR³⁰ und R³⁰ eine Diphosphatgruppe ist; eingeschlossen sind auch alle Arten von Salzen.

Zu den Ansprüchen 11-13:

Ein wichtiger Gegenstand der Erfindung ist das Bindungsprodukt aus mindestens einer Nucleinsäure-bindenden Komponente der vorgelegten Erfindung und einer Nucleinsäure, wobei die beiden Bindungspartner entweder in paralleler oder antiparalleler Orientierung zueinander durch Basenpaarungen zusammengehalten werden. Dieses Hybridisierungsprodukt kann aus einem Molekül der Nucleinsäurebindenden Komponente und einem Molekül der Nucleinsäure (= Duplex) bestehen, es kann sich jedoch aus drei Strängen unter Ausbildung eines Triplexes aufbauen. Dieser Triplex kann entweder zwei Moleküle der Nucleinsäure-bindenden Komponente plus ein Molekül der Nucleinsäure oder aber zwei Moleküle der Nucleinsäure und ein Molekül der Nucleinsäure-bindenden Komponente enthalten.

Zum Anspruch 14:

Methoden zur Analyse von Nucleinsäuren durch Hybridisierung sind weithin bekannt. Solche Verfahren können leicht auf die in diesem Patent beschriebenen Verbindungen zugeschnitten werden. Vorzugsweise soll die Nucleinsäure-bindende Komponente an die passende Nucleinsäure in homogener Lösung hybridisiert werden, da solche Reaktionen in der Regel schneller ablaufen als an festen Oberflächen. Einem Fachmann ist bekannt, wie der T_m-Wert eines Hybrides der zu bestimmenden Nucleinsäure und einer Sonde vor der Konzeption eines Nachweisverfahrens zu bestimmen ist. Ist der T_m-Wert einmal bestimmt, so sollte dem Fachmann klar sein, dass er ähnliche Bedingungen in jedem Nachweisverfahren, das die gleiche Analyt-Nucleinsäure enthält, einhalten muß. Solch ein Nachweis wird üblicherweise mit der Bereitstellung einer Probe, die wahrscheinlich die zu bestimmende Nucleinsäure enthält, beginnen. Die Probenvorbereitung mag bereits mehrere Schritte umfasst haben, um die Nucleinsäuren in eine nachweisbare Form zu bringen, beispielsweise die Lyse von Zellen, die die nachzuweisenden Nucleinsäuren enthalten.

Weitere Schritte der Probenvorbereitung können in der Reinigung der nachzuweisenden Nucleinsäuren von Begleitkomponenten aus der Originalprobe bestehen, die die Bestimmung stören würden. Derartige Begleitkomponenten können Enzyme sein wie z. B. RNasen, die die zu analysierende Nucleinsäure hydrolysieren würde. Es ist darüber hinaus angezeigt, alle Begleitkomponenten, die eine Amplifikation der nachzuweisenden Nucleinsäure stören würde, aus der Originalprobe zu entfernen.

Es gibt mehrere Verfahrensweisen für die Bestimmung von Nucleinsäuren, bei denen die Nucleinsäure-bindenden Substanzen der vorgelegten Erfinung zum Einsatz kommen können. In einem ersten Fall wird die Nucleinsäure-bindende Komponente als detektierbare Sonde verwendet. In diesem Fall enthält die Nucleinsäure-bindende Komponente eine oder mehrere Untereinheiten gemäß Formel I und/oder weitere Reportergruppen. Jedes Hybrid aus der Nucleinsäure-bindenden Komponente und der nachzuweisenden Nucleinsäure kann dann über die fluoreszierende Untereinheit gemäß Formel I und/oder der detektierbaren Reportergruppe nachgewiesen werden. Derartige Verfahren können in zwei Gruppen unterteilt werden, und zwar in die homogenen und in die heterogenen Verfahren. In den heterogen ablaufenden Analyseverfahren wird das Hybrid (= Bindungsprodukt) bevorzugt an einer festen Phase nachgewiesen. Diese Methode hat den Vorzug, dass überschüssiges Probenmaterial sowie alle anderen Begleitkomponenten leicht durch Auswaschen vom Hybrid entfernt werden können, was den Nachweis einfacher gestaltet. Das gebildete Hybrid kann an der festen Phase entweder kovalent oder nicht-kovalent, spezifisch oder unspezifisch immobilisiert sein. Hier gibt es mehrere Möglichkeiten, die dem Fachmann bekannt sind.

Im sogenannten homogenen Nachweisverfahren wird das gebildete Hybrid nicht an einer Festphase immobilisiert, sondern entweder direkt oder indirekt in Lösung analysiert. Die Nucleinsäure-bindenden Komponenten gemäß der vorgelegten Erfindung sind besonders als Sonden in solchen Verfahren nützlich.

Zu den Ansprüchen 15-19:

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Methode zur enzymatischen Synthese einer Nucleinsäure-bindenden Verbindung gemaß der vorgelegten Erfindung durch Reaktion einer Triphosphat-Untereinheit an einem Primer unter Verwendung einer Nucleinsäurematrize zur Verlängerung des Primers, wobei die Triphosphat-Untereinheit eine heterocyclische Gruppe gemäß Formel I enthält. Bevorzugt verwendet diese Methode eine Triphosphat-Untereinheit gemäß Formel VIII.

Zu den Ansprüchen 20 und 21:

In einer weiteren Verkörperung können die Nucleinsäure-bindenden Komponenten gemäß der vorgelegten Erfindung als immobilisierbare oder immobilisierte Sonden zur Bindung jeder Nucleinsäure an eine feste Phase verwendet werden. Methoden zur Immobilisierung der Verbindungen sind oben beschrieben. In einer Nachweismethode ist es möglich, die Verbindung vor, nach oder während des Kontaktes mit der Probe an einer festen Phase zu immobilisieren. in jedem dieser Fälle wird die nachzuweisende Nucleinsäure an die feste Phase gebunden, wobei jeder Begleitstoff ausgewaschen werden kann. Anschließend kann das immobilisierte Hybrid nach bekannten Verfahren analysiert werden, z. B. unter Verwendung markierter Sonden wie oben beschrieben, oder durch direkte Bestimmung des Hybrides.

Eine weitere bevorzugte Verkörperung verwendet eine Nucleinsäure-bindende Komponente, die sowohl an eine feste Phase gebunden als auch durch eine Untereinheit mit einer Base gemäß Formel I oder eine andere Reportergruppe markiert ist. Das Markierungsmolekül (Label) ist in diesem Fall vorzugsweise eine Gruppe, deren detektierbare Eigenschaften sich während der Bindung zwischen nachzuweisender Nucleinsäure und Nucleinsäure-bindender Komponente ändern, z. B. das Auftreten einer Fluoreszenzlöschung oder eine Verschiebung des Fluoreszenzemissionsspektrums.

Zu den Ansprüchen 22 und 23:

Diese Verbindungen können wie die gemäß Formel VII in chemischen Synthesen verwendet werden.

Zu den Ansprüchen 25 und 26:

Bevorzugte Verkörperungen der Ansprüche 25 und 26 sind Duplexstrukturen mit terminalen Untereinheiten, die 1,N⁶-Etheno-7-desazapurin als fluoreszierende heterocyclische Base tragen.

Zum Anspruch 27:

Bevorzugte Verkörperungen sind Nucleinsäuren, die mindestens eine Untereinheit mit einer Etheno-modifizierten Base wie 1,N⁶-Etheno-7-desazapurin tragen, die nicht enzymkatalysiert entfernt werden kann, da sie über eine stabile N-glycosylische Bindung verknüpft ist, wobei besagte Nucleinsäuren als Inhibitoren von DNA-Reparaturenzymen wie ANPG fungieren.

Zu den Ansprüchen 28 und 29

Bevorzugte Verkörperungen sind Nucleinsäuren, die doppelt oder mehrfach durch die in der allgemeinen Formel I dargestellten Substanzen und ihre Anwendung z.B. in Taqman Sonden, Molecular Beacons, Invader-Sonden oder in Lightcycler-Assays finden.

Die in Anspruch 29 aufgeführten Sonden können durch enzymatische Hydrolyse frei gesetzt werden oder ihre Wirkung nach Hybridisierung entfalten. Die Fluoreszenz oder deren Löschung kann auch in Nucleinsäure-Protein-Komplexen erfolgen. Die Fluoreszenzlöschung ist nicht nur auf Farbstoffe begrenzt, die kovalent an eine Nucleinsäure gebunden wurden, sondern betrifft auch solche, die sich in der Messlösung befinden, wie z.B. Ethidiumbromid oder Cyber-Green.

Claims

Eine Nucleinsäure, bestehend aus einem Rückgrat, gekennzeichnet dadurch, dass an besagtes Rückgrat mindestens eine heterocyclische Gruppe geknüpft ist, die durch die allgemeine Formel I dargestellt wird
worin Q unabhängig aus einer Gruppe, bestehend aus N und CR² ausgewählt ist; X unabhängig aus einer Gruppe, bestehend aus NR⁷, N und CR⁷ ausgewählt ist mit der Maßgabe, dass – wenn X gleich NR⁷ ist, dann wird Y aus einer Gruppe bestehend aus N und CR⁸ ausgewählt, und Z ist gleich C, ist die Bindung zwischen X (= NR⁷) und Y (= N oder CR⁸) eine Einfachbindung, und die Bindung zwischen Y (= N oder CR⁸) und Z (= C) ist eine Doppelbindung; – wenn X gleich N ist, dann wird Y aus einer Gruppe bestehend aus N und CR⁸ ausgewählt, und Z ist gleich N, und die Bindung zwischen X (= N) und Y (= N oder CR⁸) ist eine Doppelbindung, und die Bindung zwischen Y (= N oder CR⁸) und Z (= N) ist eine Einfachbindung; – wenn X gleich CR⁷ ist, dann wird Y aus einer Gruppe bestehend aus N und CR⁸ ausgewählt, und Z ist gleich N, und die Bindung zwischen X (= CR⁷) und Y (= N oder CR⁸) ist eine Doppelbindung, und die Bindung zwischen Y (= N oder CR⁸) und Z (= N) ist eine Einfachbindung; Y ist ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus N und CR⁸ mit der Maßgabe, dass, - wenn Y gleich N ist, dann wird X aus einer Gruppe, bestehend aus NR⁷, N und CR⁷ ausgewählt mit der Bedingung, dass – Z gleich N ist, wenn X gleich N oder CR⁷, und die Bindung zwischen X (= N oder CR⁷) und Y (= N) eine Doppelbindung, und die Bindung zwischen Y (= N) und Z (= N) eine Einfachbindung ist; – Z gleich C ist, wenn X gleich NR⁷ und die Bindung zwischen X (= NR⁷) und Y (= N) eine Einfachbindung und die Bindung zwischen Y (= N) und Z (= C) eine Doppelbindung ist; Z ist ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus NR^9', CR^9' und N mit der Maßgabe, dass, – wenn Z gleich N ist, dann – wird X – unabhängig von Y – aus einer Gruppe, bestehend aus N und CR⁷ ausgewählt, – wird Y – unabhängig von X – aus einer Gruppe, bestehend aus N und CR⁸ ausgewählt, und die Bindung zwischen X (= N oder CR⁷) und Y (= N oder CR⁸) ist eine Doppelbindung, und die Bindung zwischen Y (= N oder CR⁸) und Z (= N) ist eine Einfachbindung; – wenn Z gleich C ist, dann – ist X – unabhängig von Y – NR⁷ und – und Y wird aus einer Gruppe, bestehend aus N und CR⁸ ausgewählt, und die Bindung zwischen Y (= N oder CR⁸) und X (= NR⁷) ist eine Einfachbindung, und die Bindung zwischen Y (= N oder CR⁸) und Z (= C) ist eine Doppelbindung. Die unterbrochene Linie in Formel I kennzeichnet, dass mehrere Möglichleiten existieren, die Doppelbindung zu lokalisieren; dies ist abhängig von den Definitionen für X, Y und Z. R² wird ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -Halogeno, -OR¹, -SR³, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -NO₂, -NR⁴R⁵, -Cyano, und -C(=O)R⁶; R⁶ wird ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus -OH, -(C₁-C₆)-Alkoxy, -(C₆-C₂₂)-Aryloxy, und NHR⁹; R¹, R³, R⁴ und R⁵ werden unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -(C₂-C₂₂)-Aryl oder -Heteroaryl, einer Schutzgruppe und einer Reportergruppe ausgewählt; R⁷, R⁸ werden unabhängig voneinander ausgewählt – aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -Halogeno, -OR¹, -SR³, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -NO₂, -NR⁴R⁵, -Cyano und -C(=O)R⁶ mit der Massgabe, dass das Atom, an das R⁷ und R⁸ unmittelbar gebunden ist, ein Kohlenstoffatom ist; – aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl oder -Heteroaryl, einer Schutzgruppe und einer Reportergruppe, mit der Massgabe, dass das Atom, an das R⁷ und R⁸ unmittelbar gebunden ist, ein Stickstoffatom ist; R⁹ wird unabhängig aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₂₂)-Alkinyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl oder -Heteroaryl, einer Schutzgruppe und einer Reportergruppe, ausgewählt; R¹⁰, R¹¹ werden unabhängig aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -Halogeno, -OR¹, -SR³, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -NO₂, -NR⁴R⁵, -Cyano und -C(=O)R⁶, ausgewählt, dabei kann die Bindung zwischen C-10 und C-11 auch eine Einfachbindung sein; D ist die Verknüpfungsposition der Gruppe – dargestellt in Formel I – zum Rest der Nucleinsäure-bindenden Verbindung; besagte Alkyl, Alkenyl und Alkinylgruppen können unsubstituiert oder durch ein oder mehrere Reste substituiert sein, wobei die besagten Reste aus einer Gruppe, bestehend aus -Halogeno, -SH, -S, -(C₁-C₆)-Alkyl, -(C₁-C₆)-Alkoxy, -OH, -NR⁴R⁵, -C(=O)R⁶, -NH-C(=O)NR⁴R⁵, -NH-C(=S) ausgewählt werden; r, s sind unabhängig voneinander ganze Zahlen von 1 bis 18.
Nucleinsäure-bindende Substanzen des Anspruchs 1., gekennzeichnet dadurch, dass das Rückgrat aus Zucker- und Phosphatresten besteht.
Nucleinsäure-bindende Substanzen des Anspruchs 2., gekennzeichnet dadurch, dass die Zuckerkonfiguration aus einer Gruppe, bestehend aus α-D-, β-D-, α-L- und β-L- Konfigurationen, ausgewählt ist.
Nucleinsäure-bindende Substanzen des Anspruchs 3., gekennzeichnet dadurch, dass die Zuckerreste aus einer Gruppe, bestehend aus 2'-Desoxy-β-D-erythropentofuranosyl- und β-D-Ribofuranosyl-, ausgewählt sind.
Nucleinsäure-bindende Substanzen der Ansprüche 1 – 4, gekennzeichnet dadurch, dass das Rückgrat ein oder mehrere Einheiten der generellen Formel II enthält,
wobei: A aus einer Gruppe, bestehend aus O, S, CH₂ und N-(C₁-C₁₀)-Alkyl, ausgewählt wird; L aus einer Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, -NR²²-, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, oder -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, und -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -NR²²-(C₁-C₆)-Alkyl-O-ausgewählt wird; T aus einer Gruppe, bestehend aus Oxo, Thioxo und Selenoxo, ausgewählt wird; U aus einer Gruppe, bestehend aus -OH, -O-Reportergruppe, -SH, -SeH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-Alkyl, -NR²³R²⁴ und -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl)-O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-R²⁵, ausgewählt wird; V aus einer Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl und -NR²², ausgewählt wird; R¹⁴ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -Halogen, Azido und -NH₂, ausgewählt wird; R²² aus einer Gruppe, bestehend aus -H und -(C₁-C₁₀)-Alkyl, ausgewählt wird; NR²³R²⁴ kann zusammen mit einem Stickstoffatom ein 5-6-gliedriger heterocyclischer Ring sein oder kann unabhängig aus einer Gruppe, bestehend aus -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₁-C₂₀)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₁-C₆)-Alkyl-[NH(CH₂)_c]_d-NR²⁶R²⁷, ausgewählt sein; R²⁵ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -Halogeno, -Amino, -(C₁-C₁₈)-Alkylamino, -COOH, -CONH₂, und -COO(C₁-C₄)-Alkyl, ausgewählt wird; R²⁶, R²⁷ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₆)-Alkyl und -(C₁-C₄)-Alkoxy-(C₁-C₆)-Alkyl, ausgewählt werden; c eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist; d eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist, und B eine Gruppe entsprechend der allgemeinen Formel I – wie im Anspruch 1. definiert –, wobei jede Alkyl- Alkenyl- und Alkinylgruppe unsubstituiert oder wie im Anspruch 1. ausgeführt substituiert sein kann, sowie alle Salze dieser Gruppe.
Nucleinsäuren des Anspruchs 1., die mindestens eine Reportergruppe enthalten.
Nucleinsäure-bindende Substanzen des Anspruchs 1., gekennzeichnet dadurch, dass das Rückgrat an terminaler Position eine Gruppe der allgemeinen Formel III enthält,
wobei: A aus einer Gruppe, bestehend aus O, S, CH₂ und N-(C₁-C₆)-Alkyl, ausgewählt wird; M aus einer Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, -NR²², -(C₁-C₁₀)-Alkyl oder -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -NR²²-, -(C₁-C₁₀)-Alkyl oder -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -NR²²-(C₁-C₆)-Alkyl-O-, ausgewählt wird; R²² aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, einer Schutzgruppe und einer Reportergruppe, ausgewählt wird; R¹⁴ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxy, -Halogeno, -Azido, -SH, -(C₁-C₁₀)-Alkylmercapto und -NH₂, ausgewählt wird; R¹⁵ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(CX₁-C₆)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -C₂-C₁₀)-Alkinyl, -(C₂-C₁₀)-Alkyl-Carbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkenyl-Carbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkinyl-Carbonyl), -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-Alkyl, eine feste Phase und eine Gruppe gemäß Formel IV
wobei: T aus einer Gruppe, bestehend aus Oxo, Thioxo und Selenoxo, ausgewählt ist; U aus einer Gruppe, bestehend aus -OH, -O-Reportergruppe, -SH, -SeH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-Alkyl, -NR²³R²⁴ und -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-R²⁵ oder wobei NR²³R²⁴ zusammen mit einem Stickstoffatom einen 5-6-gliedrigen heterocyclischen Ring bildet, ausgewählt sind; R²³, R²⁴ unabhängig voneienander aus einer Gruppe, bestehend aus -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₁-C₂₀)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-Alkyl, und -(C₁-C₆)-[NH(CH₂)_c]_d-NR²⁶R²⁷, ausgewählt sind; R²⁵ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -Halogeno, -Amino, -(C₁-C₁₈)-Alkylamino, -C(=O)OH, C(=O)NH₂ und C(=O)O(C₁-C₄)-Alkyl, ausgewählt sind; R²⁶R²⁷ unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₆)-Alkyl und -(C₁-C₄)-Alkoxy-(C₁-C₆)-Alkyl, ausgewählt ist; R²⁹ aus einer Gruppe, bestehend aus -OR³⁰ und -SR³⁰, ausgewählt ist; R³⁰ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, einer Schutzgruppe, einer festen Phase und einer Reportergruppe, ausgewählt ist; c eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist; d eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist; B eine Gruppe gemäß Formel I darstellt, worin jede Alkyl, Alkenyl und Alkynyl unsubstituiert oder wie im Anspruch 1. beschrieben substituiert ist, sowie jede Art von Salz derselben;
Eine Nucleinsäure-bindende Substanz gemäß Anspruch 1., gekennzeichnet dadurch, dass besagtes Rückgrat in terminaler Position eine Gruppe gemäß Formel V einschließt
wobei: A aus einer Gruppe, bestehend aus O, S, CH₂ und N-(C₁-C₆)-Alkyl, ausgewählt ist; M' aus einer Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, -NR²², -(C₁-C₁₀)-Alkyl oder -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und NR²²-(C₁-C₆)-Alkyl-O-, ausgewählt ist; R²² aus einer Gruppe, bestehend aus -H, einer Schutzgruppe, einer Reportergruppe und -(C₁-C₁₀)-Alkyl, ausgewählt ist; R¹⁴ aus einer Gruppe, bestehend aus H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxy, -Halogeno, -Azido, -SH, -S-(C₁-C₆)-Alkylmercapto und -NH₂, ausgewählt ist; R¹⁶ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₈)-Alkyl, -(C₂-C₁₈)-Alkenyl, -(C₂-C₁₈)-Alkinyl, -(C₂-C₁₈)-Alkyl-Carbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkenyl-Carbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkinyl-Carbonyl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₈)-Alkyl, einer Schutzgruppe oder einer Verbindung der Formel IV
wobei: T aus einer Gruppe, bestehend aus Oxo, Thioxo und Selenoxo, ausgewählt ist; U aus einer Gruppe, bestehend aus -OH, -O-Reportergruppe, -SH, -SeH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-Alkyl, -NR²³R²⁴ und -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-R²⁵ oder wobei NR²³R²⁴ zusammen mit einem Stickstoffatom einen 5-6-gliedrigen heterocyclischen Ring bildet, ausgewählt sind; R²³, R²⁴ unabhängig voneienander aus einer Gruppe, bestehend aus -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₁-C₂₀)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-Alkyl, und -(C₁-C₆)-[NH(CH₂)_c]_d-NR²⁶R²⁷, ausgewählt sind; R²⁵ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -Halogeno, -Amino, -(C₁-C₁₈)-Alkylamino, -C(=O)OH, C(=O)NH₂ und C(=O)O(C₁-C₄)-Alkyl, ausgewählt sind; R²⁶R²⁷ unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₆)-Alkyl und -(C₁-C₄)-Alkoxy-(C₁-C₆)-Alkyl, ausgewählt ist; R²⁹ aus einer Gruppe, bestehend aus -OR³⁰ und -SR³⁰, ausgewählt ist; R³⁰ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, einer Schutzgruppe, einer festen Phase und einer Reportergruppe, ausgewählt ist; c eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist; d eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist; B eine Gruppe gemäß Formel I darstellt, gekennzeichnet dadurch, dass jede Alkyl-, Alkenyl- und Alkynylgruppe unsubstituiert oder wie im Anspruch 1. beschrieben substituiert ist, sowie jede Art von Salz derselben.
Eine Verbindung gemäß Anspruch 8., gekennzeichnet dadurch, dass M' gleich O ist, R¹⁶ gleich H ist und R¹⁴ aus einer Gruppe, bestehend aus -H und -OH ausgewählt ist.
Eine Verbindung gemäß Formel VI
wobei A aus einer Gruppe, bestehend aus O, S, CH₂ und N-(C₁-C₆)-Alkyl, ausgewählt ist; R¹⁴ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -O-Schutzgruppe, -S-Schutzgruppe, -NH-Schutzgruppe, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -Halogeno, -Azido, -SH, -(C₁-C₆)-Alkylmercapto und NH₂, ausgewählt ist; R¹⁵, R¹⁶ unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₈)-Alkyl, -(C₂-C₁₈)-Alkenyl, -(C₂-C₁₈)-Alkinyl, -(C₂-C₁₈)-Alkyl-Carbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkenyl-Carbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkinyl-Carbonyl, -(C₆-C₁₄)-Aryl)-(C₁-C₈)-Alkyl, einer Schutzgruppe und einer Verbindung gemäß Formel IV, ausgewählt sind Formula IV
wobei: T aus einer Gruppe, bestehend aus Oxo, Thioxo und Selenoxo, ausgewählt ist; U aus einer Gruppe, bestehend aus -OH, -O-Reportergruppe, -SH, -SeH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-Alkyl, NR²³R²⁴ und -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-R²⁵ oder wobei NR²³R²⁴ zusammen mit einem Stickstoffatom einen 5-6-gliedrigen heterocyclischen Ring bildet, ausgewählt sind; R²³, R²⁴ unabhängig voneienander aus einer Gruppe, bestehend aus -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₁-C₂₀)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-Alkyl, und -(C₁-C₆)-[NH(CH₂)_c]_d-NR²⁶R²⁷, ausgewählt sind; R²⁵ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -Halogeno, -Amino, -(C₁-C₁₈)-Alkylamino, -C(=O)OH, C(=O)NH₂ und C(=O)O(C₁-C₄)-Alkyl, ausgewählt sind; R²⁶R²⁷ unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₆)-Alkyl und -(C₁-C₄)-Alkoxy-(C₁-C₆)-Alkyl, ausgewählt ist; R²⁹ aus einer Gruppe, bestehend aus -OR³⁰ und -SR³⁰, ausgewählt ist; R³⁰ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, einer Schutzgruppe, einer festen Phase und einer Reportergruppe, ausgewählt ist; c eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist; d eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist; B eine Gruppe gemäß Formel I darstellt, gekennzeichnet dadurch, dass jede Alkyl-, Alkenyl- und Alkynylgruppe unsubstituiert oder wie im Anspruch 1. beschrieben substituiert ist, sowie jede Art von Salz derselben.
Eine Verbindung gemäß Formel VII
worin A aus einer Gruppe, bestehend aus O, S, CH₂ und N-(C₁-C₆)-Alkyl, ausgewählt ist; M, M' unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, NR²², -(C₁-C₁₀)-Alkyl oder -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und NR²²-(C₁-C₆)-Alkyl-O-, ausgewählt ist; R²² aus einer Gruppe, bestehend aus -H und -(C₁-C₁₀)-Alkyl, ausgewählt ist; R¹⁴ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, OR³¹, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkynyloxy, -Halogeno, -Azido, -NHR³¹, -SR³¹ und NH₂, ausgewählt ist; R³¹ eine Schutzgruppe oder eine Reportergruppe darstellt; R³², R¹⁷ unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl und -(C₆-C₂₂)-Aryl, ausgewählt sind; R¹⁸ aus einer Gruppe, bestehend aus substituierten oder unsubstituierten -(C₁-C₆)-Alkyl, unsubstituierten -(C₁-C₆)-Alkoxy und -(C₁-C₆)-Alkoxy – einfach oder mehrfach substituiert durch eine Gruppe, bestehend aus -Halogeno, p-Nitroaryloxy und -Cyano –, ausgewählt ist; B eine Gruppe gemäß Formel I, entsprechend dem Anspruch 1 sowie jede Art von Salz dieser Gruppe darstellt.
Eine Verbindung gemäß Anspruch 11, gekennzeichnet dadurch, dass besagte Gruppe der Formel I mindestens eine Reportergruppe enthält.
Ein Bindungsprodukt zwischen mindestens einer Nucleinsäure-bindenden Komponente gemäß den Ansprüchen 1 – 8 und einer Nucleinsäure, gekennzeichnet dadurch, dass die Nucleinsäure und die Nucleinsäurebindende Komponente miteinander über Wasserstoffbrückenbindungen entweder in paralleler oder antiparalleler Orientierung hybridisiert sind.
Eine Methode für die Detektion einer Nucleinsäure, die folgende Schritte umfasst: – Bereitstellung einer Probe, die eine Nucleinsäure enthält; – Bereitstellung einer Nucleinsäure-bindenden Verbindung gemäß Anspruch 1, die komplementär zu einem Teil oder allen besagten Nucleinsäuren ist; – Mischen der besagten Probe mit der besagten Nucleinsäure-bindenden Komponente unter Bedingungen, die zu einer Bindung zwischen beiden besagten Verbindungen führen; – Untersuchung des Produktes aus der Reaktion der besagten Nucleinsäureprobe und der Nucleinsäure-bindenden Komponente als einem Mass für die Anwesenheit der besagten Nucleinsäureprobe.
Die Verwendung einer Verbindung mit einer Base gemäß Formel I in Hybridisierungsreaktionen von Sonden und Nucleinsäuren, gekennzeichnet dadurch, dass besagte Gruppe der Formel I sich in einer beliebigen Position der Sonde befindet und mit Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil in der hybridisierten Nucleinsäure bassenpaart.
Eine Methode zur chemischen Synthese einer Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 – 9 unter Verwendung aktivierter Untereinheiten, gekennzeichnet dadurch, dass besagte Untereinheiten mindestens eine Gruppe gemäß Formel I enthalten.
Eine Methode gemäß des Anspruchs 16, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Untereinheit eine Verbindung gemäß der Ansprüche 10 – 12 ist.
Eine Methode zur enzymatischen Synthese einer Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 – 9, die die Reaktion einer Triphosphateinheit mit einem Primer umfasst, wobei eine Nucleinsäure als Matrize für die Verlängerung des Primers und die Triphosphateinheit eine heterocyclische Gruppe gemäß Formel I enthält.
Eine Methode gemäß des Anspruchs 18, worin besagte Triphosphateinheit eine Struktur gemäß der Formel VIII aufweist
wobei A aus einer Gruppe, bestehend aus O, S, CH₂ und N-(C₁-C₁₀)-Alkyl, ausgewählt ist; PPP eine Triphosphatgruppe darstellt; R¹⁴ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxy, -Halogeno, -Azido und NH₂, ausgewählt ist; B eine Gruppe gemäß Formel I sowie deren Salze sind.
Eine Methode zur Entscheidung über An- oder Abwesenheit von Nucleinsäuren, von denen jede eine bestimmte Sequenz aufweist; die Methode umfasst dabei folgende Arbeitsschritte: – die Zusammenführung besagter Sonde mit einer festen Phase, an deren Oberfläche Nucleinsäure-bindende Substanzen immobilisiert sind, von denen jede eine zu den besagten Sequenzen besagter Nucleinsäuren komplementäre Sequenz aufweist; – der Nachweis der Hybridbildung an besagter fester Oberfläche zwischen einer Nucleinsäure mit bestimmter Sequenz und der Nucleinsäure bindenden Komponente, wobei letztere eine komplementäre Sequenz zu ersterer aufweist und die dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens eine der besagten Nucleinsäure-bindenden Komponenten eine Verbindung gemäß der Ansprüche 1 – 9 ist.
Eine Methode zur Entscheidung über An- oder Abwesenheit einer Nucleinsäure in einer Probe sowie zur Bestimmung ihrer Menge mit den folgenden Schritten: – die Bereitstellung von Primern, wobei ein erster Primer vollständig komplementär zu einer ersten Bindungssequenz besagter Nucleinsäure und der zweite Primer völlig komplementär zu einer Bindungssequenz eines Komplementärstranges dieser Nucleinsäure ist, sowie von einer Probe, die zwischen den Bindungsstellen besagter Primer komplementär zur Nucleinsäure oder ihres Komplementärstranges ist; die besagte Sonde ist an verschiedenen Untereinheiten durch mindestens zwei verschiedene Reportergruppen markiert, von denen eine eine Base gemäß Formel I trägt; – die Durchführung einer Kettenverlängerung besagter Primer und die Trennung besagter Reportergruppen durch Abbau der Sonde und – die Analyse der Abbaureaktion der Sonde mit Hilfe von mindestens einer der erwähnten Reportergruppen. Die Methode ist dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der besagten Primer oder eine der Sonden eine Nucleinsäure-bindende Komponente gemäß den Ansprüchen 1 – 9 darstellen.
Eine Verbindung der generellen Struktur VIII
wobei A aus einer Gruppe, bestehend aus O, S, CH₂ und N-(C₁-C₁₀)-Alkyl, ausgewählt ist; PPP eine Triphosphatgruppe darstellt; R¹⁴ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxy, -Halogeno, -Azido und NH₂, ausgewählt ist; B eine Gruppe gemäß Formel I sowie deren Salze sind.
Eine Verbindung der generellen Struktur IX
wobei A aus einer Gruppe, bestehend aus O, S, CH₂ und N-(C₁-C₆)-Alkyl, ausgewählt ist; M, M' unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, NR²², -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -NR²²-(C₁-C₆)-Alkyl-O-, ausgewählt ist; R²² aus einer Gruppe, bestehend aus -H und -(C₁-C₁₀)-Alkyl, ausgewählt ist; R¹⁴ aus einer Gruppe, bestehend aus -H, OR³¹, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxy, -Halogeno, -Azido, -NHR³¹, -SR³¹ und -NH₂, ausgewählt ist; R³¹ eine Schutz- oder Reportergruppe darstellt; R³², R¹⁷ unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl und -(C₆-C₂₂)-Aryl, ausgewählt sind; R¹⁸ aus einer Gruppe, bestehend aus substituiertem oder unsubstituiertem -(C₁-C₆), unsubstituiertem -(C₁-C₆)-Alkoxy oder -(C₁-C₆)-Alkoxy, welche einfach oder mehrfach durch -Halogeno, -p-Nitroaryloxy oder -Cyanogruppen substituiert sind, ausgewählt ist; B eine Gruppe der Formel I gemäß des Anspruchs 1 sowie jede Art von Salz derselben darstellt.
Eine Verbindung der generellen Formel X
wobei A aus einer Gruppe, bestehend aus O, S, CH₂ und N-(C₁-C₆)-Alkyl, ausgewählt ist; M, M' unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, NR²², -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und NR²²-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, ausgewählt ist; R²² aus einer Gruppe, bestehend aus -H und -(C₁-C₁₀)-Alkyl, ausgewählt ist; R¹⁴ aus einer Gruppe, bestehend aus H, -OR³¹, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxy, -Halogeno, -Azido, -NHR³¹, -SR³¹ und -NH₂, ausgewählt ist; R³¹ eine Schutz- oder Reportergruppe darstellt; B eine Gruppe gemäß Formel I entsprechend dem Anspruch 1, sowie alle ihre Salze darstellt.
Eine Nucleinsäure-bindende Substanz mit einem Rückgrat, dass an seinem 5'- und/oder 3'- und/oder 2'-Ende heterocyclische Gruppen gemäß der in Formel I dargestellten Struktur trägt; die besagte Nucleinsäure-bindende Komponente hybridisiert mit einer Nucleinsäure in einer Weise, dass die besagten terminalen Untereinheiten überhängen, ohne einen Basenpaarungspartner im Gegenstrang zu besitzen.
Eine Nucleinsäure-bindende Substanz mit einem Rückgrat, dass an seinem 5'- und/oder 3'- und/oder 2'-Ende heterocyclische Gruppen gemäß der in Formel I dargestellten Struktur trägt; die besagte Nucleinsäure-bindende Komponente hybridisiert mit einer Nucleinsäure unter Ausbildung glatter Enden (blunt ends).
Eine Nucleinsäure mit einem Rückgrat, welches heterocyclische Gruppen gemäß der allgemeinen Formel I trägt, gekennzeichnet dadurch, dass die besagte Nucleinsäure als Inhibitor von DNA-Reparaturenzymen wirkt, die Basen hydrolytisch entfernen.
Nucleinsäure-bindende Substanzen der Ansprüche 7 und 8, gekennzeichnet dadurch, dass das Rückgrat am gegenüberliegenden – nicht durch eine Gruppe der allgemeinen Formeln III und V besetzten Terminus – eine die Fluoreszenz der besagten Gruppe löschende Gruppe (Quencher) trägt. Beide Gruppen – Fluorophor und Quencher – sind an den Enden einer Nucleinsäure positioniert, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Haarnadelstruktur, bestehend aus einem Stamm und einer Schleife, ausbildet. Die Nucleotidsequenz der Schleife ist komplementär zu einer nachzuweisenden Nucleinsäure (molecular beacon).
Nucleinsäure-bindende Substanzen der Ansprüche 1 – 5, gekennzeichnet dadurch, dass das Rückgrat ein oder mehrere Einheiten der generellen Formel I und weitere Chromophore in einer solchen Position trägt, dass eine Fluoreszenzreduktion (Quenching) der Einheiten der generellen Formel I und/oder der Chromophore erfolgt. Durch Hybridisierung besagter Nucleinsäure-bindender Substanzen mit einer zu detektierenden Substanz wie z.B. einer Nucleinsäure oder einem Protein oder durch Phosphodiesterhydrolyse wird die Fluoreszenzreduktion aufgehoben.