JP5756995B2 - 新規蛍光性人工塩基 - Google Patents

Description

本発明は、新規蛍光性核酸人工塩基であって、プリン塩基、１−デアザプリン塩基、１，７−デアザプリン塩基の６位（プリン環の６位）に複素環分子を２つ以上縮重した官能基を有する人工塩基に関する。本発明はまた、該人工塩基を含む化合物およびその誘導体、ならびに該人工塩基を含むヌクレオチドが組み込まれた核酸に関する。本発明はさらに該核酸を調製する方法に関する。

蛍光性の核酸塩基類似体は、核酸の蛍光標識法として幅広い応用に用いることができる。核酸の蛍光標識では、一般的に、蛍光色素を天然型塩基のどれかに結合させて、この修飾塩基を化学合成や酵素反応（複製や転写）により、ＤＮＡやＲＮＡ中に導入する方法が取られている。しかし、この方法では、蛍光色素部分が核酸の構造中から大きく飛び出すこと、さらにその蛍光色素部分が核酸中のどこかの塩基とスタッキングすることにより、その核酸の機能を失活させてしまう可能性がある。また天然型塩基に蛍光色素を結合しているので、これらの塩基を複製や転写で核酸中の特定位置に取り込ませることはできない。これに対して蛍光性の核酸塩基類似体は、核酸の構造や機能を保ったまま蛍光標識を可能にし、また人工塩基対として複製や転写で機能すれば、ＤＮＡやＲＮＡ中の特定位置に導入することができる。

従来から用いられている蛍光性の核酸塩基類似体として、２−アミノプリンや２，６−ジアミノプリンなどがある（特許文献１、非特許文献１−４）。しかしこれらは、蛍光強度がそれほど強くはなく、核酸中にこれらの塩基類似体を導入すると近傍の塩基とのスタッキングによって消光されてしまう。また、これらの塩基類似体は、Ａ（アデニン）の類似塩基であり、Ｔ（チミン）の相補塩基として、複製や転写でＤＮＡやＲＮＡ中に導入させることができる。しかし、その取り込み効率は低く、また複製や転写では核酸中のＡに相当するところに取り込まれてしまうので、特定位置に導入させることはできない。すなわち、核酸中にＡが一箇所しかない場合は、その部位にＡの代わりに導入させることができるが、そのような核酸の配列は非常に特殊な場合であり、汎用性がない。またこれらの塩基類似体は、このようにＡの類似体として用いることができるので、ＤＮＡやＲＮＡ中のＡの部位をこれらで置き換えることができるが、他の塩基（Ｇ、Ｃ、Ｔなど）と置き換えるとそれらの核酸の機能を低下させてしまう可能性がある。

本発明者らは、ＤＮＡの遺伝情報を拡張するために第三の塩基対（人工塩基対）の開発を進めてきた。そしてこれまでにｓ−ｙ塩基対（ｓ：２−アミノ−６−チエニルプリン、ｙ：ピリジン−２−オン）、ｖ−ｙ塩基対（ｖ：２−アミノ−６−チアゾリルプリン）、ｓ−Ｐａ塩基対（Ｐａ：ピロロ−２−カルバルデヒド）、Ｄｓ−Ｐａ塩基対（Ｄｓ：７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン）、Ｄｓ−Ｐｎ塩基対（Ｐｎ：２−ニトロピロール）など複製や転写で機能する数種類の人工塩基対の開発に成功している（非特許文献５−１０）。さらに人工塩基ｓやｖは蛍光を有し、これらの人工塩基を用いて核酸の局部構造の解析法などを報告してきた。しかし、ｓの蛍光強度はそれほど強くなく、また極大の励起波長が３４８ｎｍ、蛍光波長が４３５ｎｍであることから、さらに長波長側にそれらの波長がシフトした核酸塩基類似体が望ましい。ｖはｓよりも蛍光強度が強いが、化合物としての安定性が低く、塩基性条件下で分解されやすいのでその利用に制限があった。Ｄｓ−Ｐａ塩基対やＤｓ−Ｐｎ塩基対は、これらの人工塩基対を導入したＤＮＡをＰＣＲで増幅可能であり、非常に有用性があるが、３５０ｎｍ以上の励起波長では、Ｄｓの蛍光は裸眼ではほとんど観測されない。

従って、複製や転写でＤＮＡやＲＮＡ中の特定部位に導入できる蛍光性人工塩基が開発されれば、核酸の新たな蛍光標識化法を確立することができる。

また、どの天然型塩基とも同程度の安定性で塩基対を形成する塩基類似体はユニバーサル塩基と呼ばれており、ピロール−３−カルボキサミド、３−ニトロピロール、５−ニトロインドールなどが知られている（特許文献２−４；非特許文献１１−１７）。しかしながら、当該技術分野において機能性核酸を人工塩基で標識するにあたっては、より高い熱安定性を有するユニバーサル塩基としての人工塩基が求められている。

米国特許第６，４５１，５３０号 米国特許第５，４３８，１３１号 米国特許第５，６８１，９４７号 米国特許第５，７８０，２３３号

Ｊ．Ｍ．Ｊｅａｎ，Ｋ．Ｂ．Ｈａｌｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，３７−４１（２００１） Ｄ．Ｃ．Ｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４，１２２８−１２３７（１９６９） Ｎ．Ｐａｔｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０３．３６１−３６６（１９９２） Ｅ．Ｌ．Ｒａｃｈｏｆｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４０．９４６−９５６（２００１） Ｔ．Ｍｉｔｓｕｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．６３，３５２８−３５３７（２００７） Ｍ．Ｋｉｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３５，５３６０−５３６９（２００７） Ｉ．Ｈｉｒａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３，７２９−７３５（２００６） Ｔ．Ｍｉｔｓｕｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７，８６５２−８６５８（２００５） Ｉ．Ｈｉｒａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２６，１３２９８−１３３０５（２００４） Ｉ．Ｈｉｒａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０，１７７−１８２（２００２） Ｐ．Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２６，２２０８−２２１５（１９９８） Ｄ．Ｌｏａｋｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３，２３６１−２３６６（１９９５） Ｄ．Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９，２４３７−２４４７（２００１） Ｎ．Ｅ．Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｊ．ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｅｓ Ｒｅｓ．，３３，６２５８−６２６７（２００５） Ｄ．Ｌｏａｋｅｓ，Ｄ．Ｍ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２２．４０３９−４０４３（１９９４） Ｒ．Ｎｉｃｏｌｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３６９．４９２−４９３（１９９４） Ｚ．Ｇｕｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１５．３３１−３３５（１９９７）

本発明の目的は、新規な蛍光性人工塩基を提供することにある。

本発明は特に、以下の諸性質の少なくとも１つ：
１）強い蛍光を発する；
２）相補人工塩基との塩基対形成により、複製や転写でＤＮＡやＲＮＡ中の特定位置に導入が可能；
３）ユニバーサル塩基としての性質を示す；
を示す新規な蛍光性人工塩基を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記問題解決のために鋭意研究に努めた結果、プリン塩基、１−デアザプリン、１，７−デアザプリンの６位（プリン環の６位）に複素環分子を２つ以上縮重した置換基を有する人工塩基が優れた蛍光特性を有することを見出し、本発明に想到した。

発明者らは、これまでに、ＤＮＡの遺伝情報の拡張を目指して複製や転写で機能する第三の塩基対（人工塩基対）の開発を進めてきた。そして、今回、複製や転写でＤＮＡやＲＮＡ中に位置特異的に導入を可能とする蛍光性の人工塩基（ｓｓ：２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）プリン−９−イル；Ｄｓｓ：７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルなど）を開発した。人工塩基ｓｓやＤｓｓの転写用基質（ｓｓＴＰやＤｓｓＴＰ）は、鋳型ＤＮＡ中の人工塩基Ｐａ（ピロロ−２−カルバルデヒド）に相補して、転写でＲＮＡ中に導入させることができる。また、ＤｓｓはＰａやＰｎ（２−ニトロピロール）との人工塩基対として複製で機能させることもできる（例えば、Ｄｓｓ−ＰａやＤｓｓ−Ｐｎ塩基対を組み込んだＤＮＡは、ＰＣＲで増幅が可能である）。さらに、これらの蛍光性人工塩基Ｄｓｓやｓｓは、天然型のどの塩基とも二本鎖ＤＮＡ中で安定な塩基対を形成することができ、ユニバーサル塩基としての性質も示すことを見出した。その結果、本発明に想到した。

以上、本発明の理解のために本発明を想到するに至る経緯を説明したが、本発明の範囲は上記説明に限定されず、請求の範囲の記載によって定められる。

本発明は、以下の態様１−１６を提供する。

態様１： 式Ｉ：
［ここにおいて、
Ａ^１およびＡ^２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり、
Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ^２は、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を含む化合物。

態様２： 式ＩＩ：
［ここにおいて、
Ａ^１およびＡ^２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり、
Ｒは、水素、メチル基、糖、リボース、デオキシリボースからなる群より選択され、
Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ^２は、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される、態様１に記載の化合物。

態様３： 以下：
（ｉ）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）；
（ｉｉ）７−（２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓｓ）；
（ｉｉｉ）２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓ）；
（ｉｖ）２−アミノ−６−（２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓｓ）；
（ｖ）４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｓ）；
（ｖｉ）４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｖ）；及び
（ｖｉｉ）４−［５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｖａｓ）；
からなる群より選択される基を含む、態様１又は２に記載の化合物。

態様４： 式Ｉ：
［ここにおいて、
Ａ^１およびＡ^２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり、
Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ^２は、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基を有するヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。

態様５： 式Ｉで表される人工塩基が、以下：
（ｉ）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）；
（ｉｉ）７−｛２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル｝イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓｓ）；
（ｉｉｉ）２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓ）；
（ｉｖ）２−アミノ−６−｛２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル｝プリン−９−イル基（ｓｓｓ）；
（ｖ）４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｓ）；
（ｖｉ）４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｖ）；及び
（ｖｉｉ）４−［５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｖａｓ）；
からなる群より選択される、態様４に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。

態様６： ヌクレオシドまたはヌクレオチドが、糖部分としてβ−Ｄ−リボフラノシルまたは２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシルを含む、態様４又は５に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。

態様７： ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸またはリボヌクレオシド５’−三リン酸である、態様４ないし６のいずれか１項に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。

態様８： ホスホロアミダイト誘導体である、態様４ないし６のいずれか１項に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。

態様９： ２００ｎｍ以上の励起波長で蛍光を発する、態様４ないし６のいずれか１項に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。

態様１０： ユニバーサル塩基として使用される、態様４ないし６のいずれか１項に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。

態様１１： 態様４ないし６のいずれか１項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸。

態様１２： ２００ｎｍ以上の励起波長で蛍光を発する、態様１１に記載の核酸。

態様１３： 核酸が、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、デオキシリボザイム、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉誘導性核酸、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、抗ｍｉｃｒｏＲＮＡ核酸分子、デコイ核酸、ＤＮＡアプタマー、およびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される機能性核酸である、態様１１又は１２に記載の核酸。

態様１４： 核酸模倣体であって、塩基部分に式Ｉ：
［ここにおいて、
Ａ^１およびＡ^２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり、
Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ^２は、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を有し、そして
骨格部分がモノフォリノヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される核酸模倣体の骨格である、
前記核酸模倣体。

態様１５： 式Ｉ：
［ここにおいて、
Ａ^１およびＡ^２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり、
Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ^２は、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を、核酸の複製反応によりＤＮＡまたはＲＮＡ中に導入する方法であって、
式ＩＩＩ：
［ここにおいて、Ｒは水素、ならびに、置換されたまたは置換されていないアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基からなる群より選択され、
ここにおいて置換されたアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基は、機能性官能基または蛍光性官能基で置換されている］
で表される塩基（以下、Ｐａ誘導体と記載する）を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型鎖として用い；
複製基質として式Ｉの人工塩基を有するデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸又はリボヌクレオシド５’−三リン酸を用いて、核酸の複製反応、転写反応又は逆転写反応を行い；
それにより塩基Ｐａ誘導体と式ＩＩの人工塩基との塩基対を含む核酸が生成することにより、式ＩＩの人工塩基を含むヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡ中に導入される；
前記方法。

態様１６： 式Ｉ：
［ここにおいて、
Ａ^１およびＡ^２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり、
Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ^２は、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を、化学合成によりＤＮＡ又はＲＮＡ中に導入する方法であって、
式Ｉで表される人工塩基又はその誘導体を有するヌクレオシドのホスホロアミダイト誘導体を用いてＤＮＡ又はＲＮＡを合成することを含む、前記方法。

本発明の蛍光性人工塩基は、強い蛍光を発し、そして相補人工塩基であるＰａ誘導体と塩基対形成が可能であるため、複製反応や転写反応によりＤＮＡやＲＮＡ中の特定位置に導入が可能である。このことから、本発明の蛍光性人工塩基は、核酸の新たな蛍光標識化法を確立するものである。

また、本発明の蛍光性人工塩基は、ユニバーサル塩基として優れた性質を示す。ユニバーサル塩基は二本鎖ＤＮＡやＲＮＡ中で天然型のどの塩基とも塩基対を形成することができるので、核酸構造中の二本鎖領域の天然型塩基を本発明の人工塩基で置換することにより機能性核酸の標識が可能となる。

図１は、蛍光性人工塩基を有するヌクレオシドの構造を示す図である。
図２は、人工塩基を有するヌクレオチドｓＴＰ、ＤｓｓＴＰ、ｓｓＴＰの蛍光強度の違いを示す図である。Ａ．はヌクレオチドの構造を示す模式図、Ｂ．は３６５ｎｍで励起した場合のキュベット内での蛍光発光を示す写真、及びＣ．は蛍光スペクトルである。
図３は、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（ｅｘｏ＋）を用いた複製反応によるＤＮＡ中への人工塩基Ｄｓｓの取り込みを示す図である。Ａ．は複製反応の模式図であり、Ｂ．は解析結果を示すゲル電気泳動写真である。
図４は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写反応によるＲＮＡ中への人工塩基ｓｓ、Ｄｓｓの取り込みを示す図である。Ａ．は転写反応および解析手順に関する模式図であり、Ｂ．は解析結果を示すゲル電気泳動写真（ＵＶシャドウイングによる検出（左側）、および落射紫外ＬＥＤを利用した検出（右側））である。
図５は、人工塩基Ｄｓｓを含むＤＮＡ断片の二本鎖ＤＮＡの熱安定性、ならびに既存のピロール−３−カルボキサミド（ＮＰ）塩基との比較を示す図である。
図６は、各種ｓｈＲＮＡＦ１変異体によるホタルルシフェラーゼ遺伝子発現抑制効果の結果を示す。Ａ．はｓｈＲＮＡＦ１の構造を示す図であり、Ｂ．は人工塩基Ｄｓｓで置換した各種ｓｈＲＮＡＦ１変異体によるホタルルシフェラーゼ遺伝子発現抑制効果の結果を示すグラフ、そしてＣ．は人工塩基ｓｓで置換した各種ｓｈＲＮＡＦ１変異体によるホタルルシフェラーゼ遺伝子発現抑制効果の結果を示すグラフ、である。
図７は、各種ｓｈＲＮＡＦ１変異体（Ａ３６置換）のホタルルシフェラーゼ遺伝子発現抑制効果についてＩＣ_５０の算出過程を示すグラフ（上段）、およびＩＣ_５０値を示す表（下段）である。
図８は、ナイロンメンブレン上のｓｈＲＮＡＦ１変異体（Ｕ３５置換）およびリボヌクレオシド５’−三リン酸の蛍光観察の結果を示す写真（Ａ．）およびグラフ（Ｂ．）である。
図９は、電気泳動によるｓｈＲＮＡＦ１変異体（Ｕ３５置換）およびリボヌクレオシド５’−三リン酸の分離およびそれらの蛍光観察の結果を示す写真（Ａ．）およびグラフ（Ｂ．）である。グラフは、ゲル上のバンドの蛍光強度をロードした量に対してプロットしたものである。
図１０は、ｓｈＲＮＡＦ１ Ａ３６Ｄｓｓ変異体をトランスフェクション後２０時間経過した細胞を示す写真である。Ａ．は５ｎＭ（上段）または２５ｎＭ（下段）でトランスフェクションした場合の、明視野での観察結果（左側）およびＵＶ励起して観察した結果（右側）を示す写真である（倍率２０倍）。Ｂ．は２５ｎＭでトランスフェクションした場合の、ＵＶ励起して観察した結果を示す写真である（倍率４０倍）。

以下、本発明についてさらに詳細に説明する。

定義
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。

本明細書において、「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。ここで、核酸塩基は、天然型塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシル、天然型塩基の修飾体及び塩基類似体、並びに人工塩基も含む概念である。人工塩基は、該塩基が組み込まれた核酸において、天然型塩基または他の人工塩基と塩基対を形成可能な、天然型塩基ではない官能基を意味する。人工塩基の種類は特に限定されないが、例えば、置換された又は置換されていない２−アミノプリン、置換された又は置換されていないイミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン、置換された又は置換されていないピロロ［２，３−ｂ］ピリジン、置換された又は置換されていないピリジン−２−オン、置換された又は置換されていないピロロ−２−カルバルデヒド、置換された又は置換されていない２−ニトロピロールに相当する塩基、イソグアニン、イソシトシン、キサントシン、２，４−ジアミノピリミジン、４−メチルベンズイミダゾール、ジフルオロトルエン、プロピニルイソカルボスチリル、７−アザインドールなどが挙げられる。人工塩基はまた、天然型塩基の誘導体であってもよい。

本明細書において、「ヌクレオチド」とは、前記ヌクレオシドの糖部分がリン酸とエステルを作っている化合物をいう。より好ましくは、一、二、又は三リン酸エステルである。

ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖部分は、リボフラノシル、２’−デオキシリボフラノシル、あるいはハロゲンなどの置換基を２’位に有する２’−置換リボフラノシルであってよい。限定されるわけではないが、リン酸部分はアミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基、およびフルオロ基、からなる群より選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されていることが望ましい。ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖部分、およびヌクレオチドのリン酸部分は、公知のヌクレオシド、ヌクレオチド、あるいはこれらの誘導体にみられる構成をとっていればよい。糖部分がリボフラノシルであるリボヌクレオチドはリボ核酸（ＲＮＡ）の構成成分となり、２’−デオキシリボフラノシルであるデオキシリボヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の構成成分となる。

本明細書において、ヌクレオシド又はヌクレオチドの誘導体には、例えば、ホスホロアミダイト誘導体、Ｈ−ホスホネート誘導体が含まれる。

ホスホロアミダイト誘導体は、核酸の化学合成に使用するためにヌクレオシド中の１またはそれより多くの箇所において置換基が保護基で修飾されている態様である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（２００１），１０．４２−１０．４６）。具体的には、（デオキシ）リボースの５’−水酸基は、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル基、レブリニル基などの核酸合成に用いられる５’位保護基で保護されうる。これは、５’−水酸基が核酸の化学合成の際に投入されるホスホロアミダイトヌクレオシドと反応するのを防止するためである。また、投入されるホスホロアミダイトヌクレオシド上の（デオキシ）リボース残基に結合した三価のリン酸基は、ジイソプロピルアミノ基等で保護されうる。これは、結合の際に、テトラゾール等によって活性化されるためである。この三価のリン酸基はまた、シアノエチル、メトキシ等も結合する。これは、側鎖の反応を抑制するためである。さらに、塩基のプリン環のアミノ基は、フェノキシアセチル基、イソブチリル基等で保護されうる。これは、環外アミノ基の求核機能を保護するためである。本発明のホスホロアミダイト誘導体は、これらの保護基が１またはそれより多くの箇所において導入されている。好ましくは、上述したすべての箇所において保護基が導入されている。

本明細書において、「核酸」とは、１より多くのヌクレオチドが５’→３’の方向に結合した核酸鎖の分子を意味する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡを含む。二本鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡであってもよい。また、ＤＮＡには、ＲＮＡを鋳型として逆転写してなるｃＤＮＡも含まれる。あるいは、核酸は三本鎖、四本鎖等も形成しうる。

本明細書において、「ユニバーサル塩基」とは、どの天然型塩基とも同程度の安定性で塩基対を形成する塩基類似体を意味する。

人工塩基またはその誘導体を含む化合物
一態様において本発明は、以下の式Ｉ：
［ここにおいて、
Ａ^１およびＡ^２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり、
Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ^２は、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を含む化合物を提供する。

本明細書において人工塩基の誘導体には、人工塩基中の官能基が保護基で修飾された誘導体が含まれる。例えば、本発明の人工塩基のアミノ基を保護するのに適切な保護基には、フェノキシアセチル基、イソブチリル基、ジメチルホルムアミジル基などが挙げられる。人工塩基の誘導体はまた、式ＩのＲ^２に含まれるチエニル基またはチアゾリル基が、例えばメチル基、アミノ基、水酸基、チオール基などによってさらに置換された誘導体を含んでもよい。

別の態様において、本発明の人工塩基又はその誘導体を含む化合物は、
式ＩＩ：
［ここにおいて、
Ａ^１およびＡ^２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり、
Ｒは、水素、メチル基、糖、リボース、デオキシリボースからなる群より選択され、
Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ^２は、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表されてもよい。

置換基Ｒの糖には、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒドなどのトリオース、エリトルロース、エリトロース、トレオースなどのテトロース、リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、デオキシリボースなどのペントース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、フコース、不クロース、ラムノースなどのヘキソース、セドヘプツロースなどのヘプトースが挙げられる。また、置換基Ｒの糖は、さらなる置換基で修飾されていてもよい。

好ましい態様において、本発明の人工塩基又はその誘導体を含む化合物は、
（ｉ）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）；
（ｉｉ）７−｛２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル｝イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓｓ）；
（ｉｉｉ）２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓ）；
（ｉｖ）２−アミノ−６−｛２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル｝プリン−９−イル基（ｓｓｓ）；
（ｖ）４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｓ）；
（ｖｉ）４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｖ）；及び
（ｖｉｉ）４−［５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｖａｓ）；
からなる群より選択される基を含んでなる、前記化合物である。

人工塩基を有するヌクレオシド、ヌクレオチド
一態様において本発明は、以下の式Ｉ：
［ここにおいて、
Ａ^１およびＡ^２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり、
Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ^２は、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基を有するヌクレオシド、ヌクレオチド又はその誘導体を提供する。

好ましい態様において本発明は、上述の式Ｉで表される人工塩基が、以下：
（ｉ）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）；
（ｉｉ）７−｛２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル｝イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓｓ）；
（ｉｉｉ）２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓ）；
（ｉｖ）２−アミノ−６−｛２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル｝プリン−９−イル基（ｓｓｓ）；
（ｖ）４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｓ）；
（ｖｉ）４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｖ）；及び
（ｖｉｉ）４−［５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｖａｓ）；
からなる群より選択される、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体を提供する。

本発明のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体の糖部分は、リボフラノシル、２’−デオキシリボフラノシル、あるいはハロゲンなどの置換基を２’位に有する２’−置換リボフラノシルであってよい。好ましい態様において、該糖部分はβ−Ｄ−リボフラノシル又は２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシルである。

本発明のヌクレオチドのリン酸部分は特に限定されないが、好ましくは三リン酸エステル体、すなわち、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸又はリボヌクレオシド５’−三リン酸である。

本発明の人工塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドの誘導体には、本発明の人工塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドのホスホロアミダイト誘導体又はＨ−ホスホネート誘導体を含むほか、該ヌクレオシド又はヌクレオチドの官能基が保護基で修飾された誘導体が含まれる。例えば、本発明の人工塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドのアミノ基を保護するのに適切な保護基には、フェノキシアセチル基、イソブチリル基、ジメチルホルムアミジル基などが挙げられ、ヒドロキシル基を保護するのに適切な保護基にはアセチル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トシル基、ｐ−トルオイル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、トリイソプロピルシリルオキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロフラニル基、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル基などが挙げられる。

本発明の人工塩基を有するヌクレオシド、ヌクレオチド、又はそれらの誘導体は、２００ｎｍ以上の励起波長で蛍光を発する。好ましくは、２５０ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、３２５ｎｍ以上、３５０ｎｍ以上、３６５ｎｍ以上、３７０ｎｍ以上の励起波長で蛍光を発する。本発明の人工塩基は、プリン塩基、１−デアザプリン塩基、１，７−デアザプリン塩基の６位（プリン環の６位）に複素環分子を２つ以上縮重した官能基を有していることにより、特に３５０ｎｍ以上の励起波長でも強い蛍光を示す。この蛍光特性により、ｐｍｏｌ量での検出を裸眼で行うことが可能である。

また、本発明の人工塩基は、ユニバーサル塩基として使用することができる。

人工塩基を導入する方法−複製・転写・逆転写による方法
本発明はまた、本発明の人工塩基またはその誘導体を、核酸の複製反応によりＤＮＡまたはＲＮＡ中に導入する方法であって、
式ＩＩＩ：
［ここにおいて、Ｒは水素、ならびに、置換されたまたは置換されていないアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基からなる群より選択され、
ここにおいて置換されたアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基は、機能性官能基または蛍光性官能基で置換されている］
で表される塩基（以下、Ｐａ誘導体と記載する）を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型鎖として用い；
複製基質として式Ｉの人工塩基を有するデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸又はリボヌクレオシド５’−三リン酸を用いて、核酸の複製反応、転写反応、または逆転写反応を行い；
それにより塩基Ｐａ誘導体と式Ｉの人工塩基との塩基対を含む核酸が生成することにより、式Ｉの人工塩基を含むヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡ中に導入される；
前記方法、を提供する。

本発明の人工塩基は、別の人工塩基であるＰａ誘導体と塩基対を形成することが可能である。本発明の人工塩基の相補塩基であるＰａ誘導体を鋳型鎖ＤＮＡに組み込み、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素を用いた核酸複製反応により、本発明の人工塩基が鋳型ＤＮＡ中のＰａ誘導体に相補してＤＮＡ又はＲＮＡ中に取り込まれる（図３および図４）。すなわち、本発明の人工塩基は鋳型ＤＮＡ中のＰａに相補することにより、特定の位置に選択的にＤＮＡ又はＲＮＡ中に導入することができる。

本発明の方法における核酸の複製・転写・逆転写反応は公知の方法に従って行うことができる。酵素の選択、基質濃度の選択、またはアニーリング条件の選択などの反応条件は、当業者が適宜設定することができ、そのような検討は当業者が日常的に行う事項の範囲内である。しかしながら、核酸の複製・転写・逆転写反応を行う際の人工塩基のヌクレオチド基質の濃度の割合は、それぞれの天然型塩基のヌクレオチド基質濃度に対して少ない濃度とすることが、効率のよい核酸の複製・転写・逆転写のために好ましい。例えば、人工塩基のヌクレオチド基質の濃度の割合は、それぞれの天然型塩基のヌクレオチド基質濃度に対して１／２以下、１／５以下、１／１０以下、１／２０以下、１／１００以下である。

本発明の人工塩基を複製反応によりＤＮＡ中に導入する場合に使用可能なＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌のクレノウ断片、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに、Ｐｆｕ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ、Ｖｅｎｔ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｔａｑ、及びＫｌｅｎＴａｑなどの耐熱性ポリメラーゼ、などが挙げられる。また、その際に基質として利用可能な本発明の人工塩基を有するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸である。

本発明の人工塩基を転写反応によりＲＮＡ中に導入する場合に使用可能なＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼなどのファージ由来ＲＮＡポリメラーゼ、並びに、Ｑβ レプリカーゼなどのＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、などが挙げられる。また、その際に基質として利用可能な本発明の人工塩基を有するヌクレオチドは、リボヌクレオシド５’−三リン酸である

本発明の人工塩基を逆転写反応によりＤＮＡ中に導入する場合に使用可能な逆転写酵素は、ＨＩＶ、ＡＭＶ、及びＭＭＬＶ由来の逆転写酵素、などが挙げられる。また、その際に基質として利用可能な本発明の人工塩基を有するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸である。

人工塩基を導入する方法−化学合成による方法
本発明はまた、本発明の人工塩基またはその誘導体を、化学合成によりＤＮＡまたはＲＮＡ中に導入する方法であって、式Ｉで表される人工塩基または誘導体を有するヌクレオシドのホスホロアミダイト誘導体、Ｈ−ホスホネート誘導体、またはトリホスフェート誘導体を用いてＤＮＡ又はＲＮＡを合成することを含む、前記方法を提供する。

ヌクレオシドのホスホロアミダイト誘導体、Ｈ−ホスホネート誘導体、またはトリホスフェート誘導体を用いてＤＮＡ又はＲＮＡを合成する方法は、当業者に知られている。本願発明の人工塩基またはその誘導体に関して、当業者は適宜反応条件等を設定することが可能である。

本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸
本発明の人工塩基を有するヌクレオチドが組み込まれた核酸もまた、本発明により提供される。本発明の核酸は、上述した核酸の複製反応によりＤＮＡまたはＲＮＡ中に導入する方法を用いて調製することができる。あるいは、本発明の核酸は、化学合成によって、ＤＮＡ又はＲＮＡに組み込んで調製することもできる。化学合成の例は、ホスホロアミダイト法、ホスホネート法、トリホスフェート法などによる合成が挙げられる。

本発明の人工塩基を有するヌクレオチドが組み込まれた核酸は、２００ｎｍ以上の励起波長で蛍光を発する。好ましくは、２５０ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、３２５ｎｍ以上、３５０ｎｍ以上、３６５ｎｍ以上、３７０ｎｍ以上の励起波長で蛍光を発する。本発明の人工塩基は、プリン塩基、１−デアザプリン塩基、１，７−デアザプリン塩基の６位（プリン環の６位）に複素環分子を２つ以上縮重した官能基を有していることにより、特に３５０ｎｍ以上の励起波長でも強い蛍光を示す。この蛍光特性により、ｐｍｏｌ量での検出を裸眼で行うことが可能である。すなわち、本発明の人工塩基を有するヌクレオチドが組み込まれた核酸は、蛍光プローブとしての利用が可能である。

好ましい態様において、本発明の人工塩基を有するヌクレオチドが組み込まれた核酸は、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、デオキシリボザイム、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉誘導性核酸、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、抗ｍｉｃｒｏＲＮＡ核酸分子、デコイ核酸、ＤＮＡアプタマー、およびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される機能性核酸である。

アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡは、ｍＲＮＡの一部に対して相補的な核酸である。アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡはｍＲＮＡに結合して、該ｍＲＮＡからの翻訳を阻害することができる。

リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡの総称であり、デオキシリボザイムは、触媒活性を有するＤＮＡの総称である。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によってその配列に対応するｍＲＮＡが配列特異的に分解され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象である。ＲＮＡ干渉の典型的な例としては、ｄｓＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーに属するダイサー（Ｄｉｓｅｒ）により、３’−末端の側に２塩基程度のオーバーハングを有する約２１塩基〜２３塩基のｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）にプロセッシングされる。ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣと呼ばれるｓｉＲＮＡ−タンパク質複合体に取り込まれ、ｓｉＲＮＡの配列に対応する配列を有するｍＲＮＡを配列特異的に分解する。ＲＮＡ干渉は、哺乳動物（ヒト、マウスなど）、線虫、植物、ショウジョウバエ、菌類などの広範な生物種間で保存されている現象であることが示されている。本発明の人工塩基を有するヌクレオチドが組み込まれたＲＮＡ干渉誘導性核酸は、ＲＮＡ干渉におけるｓｉＲＮＡ或いはｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）として利用可能である。

ｍｉｃｒｏＲＮＡは、数十塩基で構成される、タンパク質をコードしていないが、遺伝子発現調節の機能を有するＲＮＡである。抗ｍｉｃｒｏＲＮＡ核酸分子は、ｍｉｃｒｏＲＮＡに対して作用することにより、ｍｉｃｒｏＲＮＡによる遺伝子発現調節機能を変調する分子である。

デコイ核酸は、転写因子のＤＮＡ上の結合部位と同じ配列を有する二本鎖の核酸である。デコイ核酸は、転写因子タンパク質を捕捉することによって、本来その転写因子が制御している遺伝子発現を抑制する機能を有する。

ＤＮＡアプタマー／ＲＮＡアプタマーは、ＳＥＬＥＸ法等により、特定の標的物質に対して結合するよう選択された一本鎖核酸である。

また、別の好ましい態様において、本発明の人工塩基を有するヌクレオチドが組み込まれた核酸は、以下：ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＭＡＰ（Ｓｍａｒｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法、ＵＣＡＮ法、ＴＭＡ法、Ｐａｄｌｏｃｋ Ｐｒｏｂｅ法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ）法、ｂＤＮＡ（ｂｒａｎｃｈｅｄ ＤＮＡ）法、ＰＡＬＳＡＲ（Ｐｒｏｂｅ ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ ｌｉｎｋ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＴＲＣ法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＣＰＴ（Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）法、およびＰｌｅｘｏｒ法、などの核酸増幅法に用いる増幅反応用プライマーであってもよい。

さらに別の好ましい態様において、本発明の人工塩基を有するヌクレオチドが組み込まれた核酸は、モレキュラー・ビーコン、Ｔａｑｍａｎプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ−ｂａｓｅｄプローブ、およびＲｉｂｏｓｗｉｔｃｈなどの標的核酸検出用プローブであってもよい。

本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸模倣体
本発明の人工塩基またはその誘導体を有する核酸模倣体もまた、本発明により提供される。核酸模倣体には、例えば、モルフォリノヌクレオチド、ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ：ＬＮＡ）およびペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ：ＰＮＡ）が含まれる。

核酸模倣体は、天然型の核酸の骨格構造であるリボースまたはデオキシリボースがリン酸エステル結合によって連なった構造を、別の骨格構造で置換した模倣体である。

モルフォリノヌクレオチドは、以下の構造
を骨格として有する。

ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ：ＬＮＡ）は以下の構造
或いは、
［式中、ｍは０〜２の整数、およびｐは１〜３の整数である］
或いは、
［式中、ｍは０〜２の整数、ｐは１〜３の整数、および、
Ｒは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基などである］
を骨格として有する。

ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ：ＰＮＡ）は以下の構造
を骨格として有する。

いずれの核酸模倣体の骨格構造の合成方法は当業者に公知であり、本発明の人工塩基を当該核酸模倣体の骨格構造に適用することができる。

ユニバーサル塩基としての人工塩基
本発明者らは、本発明の人工塩基が、天然型のどの塩基とも二本鎖ＤＮＡ中で安定な塩基対を形成することができる、ユニバーサル塩基としての性質も示すことを見出した。

本発明の人工塩基と天然型塩基の塩基対形成の安定性は、一定の長さのＤＮＡ断片の中央に本発明の人工塩基を導入し、その相補鎖の同じ位置に天然型塩基を組み込み、それぞれの二本鎖ＤＮＡのＴｍ値を測定することにより、熱安定性を評価することができる。

本発明の人工塩基を有するヌクレオチドが組み込まれたＤＮＡ断片は、その相補鎖ＤＮＡと二本鎖を形成し、本発明の人工塩基と天然型のどの塩基と塩基対を形成させても、二本鎖ＤＮＡの熱安定性はほぼ変わらない。そして天然型の塩基の中で最も安定なミスマッチ塩基対であるＴ−Ｇ塩基対よりも安定である。

ユニバーサル塩基として特に有用な人工塩基は、７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）、又は２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓ）である。

本発明の人工塩基は、二本鎖ＤＮＡやＲＮＡ中で天然型のどの塩基とも塩基対を形成することができるので、核酸構造中の二本鎖領域の天然型塩基を該人工塩基で置換することが可能である。したがって、二本鎖を形成する領域を含む機能性核酸であっても、本発明の人工塩基で置換することが可能である。

また、本発明の人工塩基の別の特徴である、強い蛍光を発することや、相補人工塩基であるＰａ誘導体との塩基対形成により複製や転写でＤＮＡやＲＮＡ中の特定位置への導入が可能であることなどの特徴を合わせることにより、ＤＮＡやＲＮＡの部位特異的蛍光標識化、核酸の立体構造の局部構造の解析、核酸医薬品の蛍光標識と動態検出（イメージング）、リアルタイムＰＣＲやＳＮＰ解析など多彩な基礎・応用研究に利用可能である。このような性質を有する蛍光性塩基類似体はこれまでに報告されていない。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

試薬・溶媒など
試薬及び溶媒は、標準的な供給業者から購入し、さらに精製することなく使用した。^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、２７０ＭＨｚ）および^３１Ｐ−ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ）スペクトルは、ＢＲＵＫＥＲ ＡＶ３００もしくはＪＥＯＬ核磁気共鳴スペクトロメーター上に記録した。合成したヌクレオシド誘導体は、分取用カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｂｏｎｄ Ｓｐｈｅｒｅ，Ｃ１８，１９ｍｍ ｘ １５０ｍｍ、流速１０ｍｌ／分）、ヌクレオシド５’−三リン酸は、分取用カラム（ＰＥＧＡＳＩＬ Ｃ８，センシュウ科学，１０ｍｍ ｘ １５０ｍｍ、流速６ｍｌ／分）を用いてＧｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣシステムで精製を行った。エレクトロスプレイ−イオン化マススペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）は、Ｗａｔｅｒｓ２６９０ ＬＣシステムを伴ったＷａｔｅｒｓ ＺＭＤ ４０００マスシステム上に記録した。蛍光スペクトルは、ＪＡＳＣＯ ＦＰ６５００蛍光分光計により測定し、蛍光量子収率は、硫酸キニーネを標準にして決定した。

実施例１：ヌクレオシドの合成；７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ｄＤｓｓ）および７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ｄＤｓｓｓ）の合成
条件：
（ａ）５−トリブチルスタンニル−２，２’−ビチオフェン又は５−トリブチルスタンニル−２，２’、５’、２”−ターチオフェン、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_２Ｃｌ_２、ＤＭＦ；
（ｂ）Ｐｄ／Ｃ、ＮａＢＨ_４、ピリジン、Ｈ_２Ｏ；
（ｃ）ＨＣＯＯＨ；
（ｄ）ＮａＨ、２−デオキシ３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロリド、ＣＨ_３ＣＮ、そしてＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、ＣＨ_２Ｃｌ_２。
Ｒは２，２’−ビチエン−５−イル基又は２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル基である。

（１−１）４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミンおよび４−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミンの合成
２，２’−ビチオフェン（８３０ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍｌ）溶液にｎ−ブチルリチウム（１．５７Ｍのヘキサン溶液３．２ｍｌ、５．０ｍｍｏｌ）を−７８℃で加えた。この溶液を−７８℃で３０分撹拌した後、トリブチルスタンニルクロリド（１．５ｍｌ）を加えた。反応溶液を室温で３０分間撹拌した後、水と酢酸エチルを用いて分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を濃縮したのち、２−アミノ−３−ニトロ−４−クロロピリジン（５１９ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１０５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１８ｍｌ）溶液に加えた。この溶液を１００℃で５時間撹拌したのち、酢酸エチルと水で分液した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち、減圧下で濃縮した。４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミン（８０９ｍｇ、８９％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％酢酸エチルの塩化メチレン溶液で溶出）で精製して得た。

４−（２，２’，５’，２”−ターチオフェン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミンの合成は、２，２’，５’，２”−ターチオフェン（１．２４ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を用いて同じ反応により、２５０ｍｇ、２２％の収率で得た。
４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミン：^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ８．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），７．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．１Ｈｚ），７．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２，３．６Ｈｚ），７．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），７．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６，５．１Ｈｚ），６．９７（ｂｓ，１Ｈ），６．８０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ）．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ_１３Ｈ_１０Ｎ_３Ｏ_２Ｓ_２について（Ｍ＋Ｈ）^＋ 計算値：３０４．０２１４、実測値：３０４．０１７２．
４−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミン：^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ８．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），７．５７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．１Ｈｚ），７．４０（ｍ，３Ｈ），７．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），７．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．１３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．１Ｈｚ），６．９９（ｂｓ，２Ｈ），６．８０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ）．

（１−２）４−（２，２’−ビチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミンおよび４−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミンの合成
４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミン（７６０ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）とパラジウム（１０％カーボン）のピリジン（２５ｍｌ）溶液に、１Ｍ ＮａＢＨ_４（７．５ｍｌ）を０℃で加えた。０℃で３０分間撹拌したのち、５％アンモニウムクロリド水溶液を加えた。５分間撹拌したのち、溶液をろ過した。ろ液を塩化メチレンと水で分液した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥して濃縮した。４−（２，２’−ビチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミン（４４８ｍｇ、６５％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製して得た。

４−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミンの合成は、４−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミン（２５０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を用いて同じ反応により、１０３ｍｇ、４５％の収率で得た。

４−（２，２’−ビチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミン：^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ７．５４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５４Ｈｚ），７．３６−７．３２（ｍ，４Ｈ），７．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６，５．１Ｈｚ），６．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），５．７０（ｂｓ，２Ｈ），４．７７（ｂｓ，２Ｈ）．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ_１３Ｈ_１２Ｎ_３Ｓ_２について（Ｍ＋Ｈ）^＋ 計算値：２７４．０４７３、実測値：２７４．０４７０．
４−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミン：^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ７．５５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．１Ｈｚ），７．３９−７．２９（ｍ，６Ｈ），７．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６，５．１Ｈｚ），６．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），５．７１（ｂｓ，２Ｈ），４．７９（ｂｓ，２Ｈ）．

（１−３）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンおよび７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
４−（２，２’−ビチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミン（２７３ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）のギ酸（３．０ｍｌ）溶液を１４０℃で１２時間還流した。反応溶液を０℃に冷却して、２８％アンモニア水（５．０ｍｌ）を加えた。この溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧下で濃縮して７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（２７２ｍｇ、９６％）を得た。

７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンは、４−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミン（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を用いて同じ反応により、１０６ｍｇ、９９％の収率で得た。

７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン：^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１３．２５（ｂｓ，１Ｈ），８．５０（ｓ，１Ｈ），８．３２（ｓ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），８．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈ），７．５９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，６．２Ｈｚ），７．４７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，３．６Ｈｚ），７．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），７．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６，５．１Ｈｚ）．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ_１４Ｈ_１０Ｎ_３Ｓ_２について（Ｍ＋Ｈ）^＋ 計算値：２８４．０３１６、実測値：２８４．０３６５．
７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン：^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１３．２５（ｂｓ，１Ｈ），８．５１（ｓ，１Ｈ），８．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈ），７．５７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２，５．１Ｈｚ），７．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），７．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２，３．６Ｈｚ），７．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），７．１３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６，５．１）．

（１−４）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ｄＤｓｓ）および７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ｄＤｓｓｓ）の合成
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（１４２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＣＨ_３ＣＮ（１０ｍｌ）溶液に、ＮａＨ（２４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、鉱物油中６０％分散液）を加えた。反応溶液を室温で３０分、４０℃で３０分撹拌したのち、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロリド（２３３ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を室温で加えた。この反応溶液を室温で１２時間撹拌した後、酢酸エチルと水で分液し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下で濃縮した。７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（２２７ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％ メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製して得た。７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（２２７ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（３．５ｍｌ）とメタノール（３．５ｍｌ）溶液に、２８％ ＮａＯＣＨ_３のメタノール溶液（２０８ｍｇ）を加えて、室温で３０分間撹拌した。反応溶液を、酢酸エチルと飽和塩化アンモニウム水溶液で分液し、有機層を水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（９０ｍｇ、４５％、２段階収率）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製後、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製により得た。

７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの合成は、７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を用いて（ＮａＨを加えて１２時間リフラックスすること以外）同じ反応により２２ｍｇ、１７％、２段階収率で得た。

７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン：^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ8.77 (s, 1H), 8.35 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 8.23 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.68 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.60 (dd, 1H, J = 1.0, 5.1 Hz), 7.48-7.45 (m, 2H), 7.15 (dd, 1H, J = 3.7, 5.1 Hz), 6.54 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 5.34 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 5.11 (t, 1H, J = 5.8 Hz), 4.47 (m, 1H), 3.92 (m, 1H), 3.69-3.52 (m, 2H), 2.81 (m, 1H), 2.36 (ddd, 1H, J = 3.3, 6.2, 13.2 Hz)．^１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ147.06, 144.01, 143.65, 140.02, 136.11, 135.50, 131.45, 130.82, 129.95, 128.56, 126.24, 124.74, 124.55, 113.51, 87.89, 83.77, 70.78, 61.71, 39.39．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ_１９Ｈ_１８Ｎ_３Ｏ_３Ｓ_２について（Ｍ＋Ｈ）^＋ 計算値：４００．０７９０、実測値：４００．０８１５．
７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン：^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ8.77 (s, 1H), 8.36 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 8.24 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.70 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.57 (dd, 1H, J = 1.1, 5.1 Hz), 7.51 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.45 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.40 (dd, 1H, J = 1.1, 3.6 Hz), 7.34 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.13 (dd, 1H, J = 3.6, 5.1 Hz), 6.54 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 5.34 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 5.11 (t, 1H, J = 5.3 Hz), 4.46 (m, 1H), 3.92 (m, 1H), 3.60 (m, 2H), 2.81 (m, 1H), 2.36 (ddd, 1H, J = 3.3, 6.2, 13.2 Hz)．

実施例２：ヌクレオシドの合成；２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ｄｓｓ）および２−アミノ−６−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ｄｓｓｓ）の合成
条件：（ａ）５−トリブチルスタンニル−２，２’−ビチオフェン又は５−トリブチルスタンニル−２，２’，５’，２”−ターチオフェン、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４、ＬｉＣｌ、ジオキサン；次いでＴＢＡＦ、ＴＨＦ。Ｒは２，２’−ビチエン−５−イル基又は２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル基である。

６−Ｏ−トシル−３’，５’−ジ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−デオキシグアノシン（６５０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（５８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、リチウムクロリド（８４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）、および５−トリブチルスタニル−２，２’−ビチオフェン（５．０ｍｍｏｌ）のジオキサン溶液を１２０℃で４．５時間還流した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧下で濃縮した。２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（５５０ｍｇ、８６％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製した。２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（５５０ｍｇ）のＴＨＦ（８．６ｍｌ）溶液に、１Ｍ テトラブチルアンモニウムフルオリドのＴＨＦ溶液（２．６ｍｌ）を加えて、室温で１時間撹拌した。反応溶液を濃縮後、２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２６４ｍｇ、６４％、２段階収率）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーおよびＲＰ−ＨＰＬＣ精製により得た。

２−アミノ−６−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ｄｓｓｓ）（４０５ｍｇ、８１％、２段階収率）は、５−トリブチルスタニル−２，２’，５’，２”−ターチオフェン（５．０ｍｍｏｌ）を用いて同じ反応により得た。

２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ｄｓｓ）：^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ８．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），８．３８（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．１Ｈｚ），７．４８−７．４６（ｍ，２Ｈ），７．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．１Ｈｚ），６．５７（ｂｓ，２Ｈ），６．２９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），５．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），４．９８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），４．４０（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．５８（ｍ，２Ｈ），２．６６（ｍ，１Ｈ），２．２８（ｍ，１Ｈ）．
２−アミノ−６−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ｄｓｓｓ）：^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ８．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４Ｈｚ），８．３７（ｓ，１Ｈ），７．５６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，４．９Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．０，３．６Ｈｚ），７．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６，４．９Ｈｚ），６．５６（ｂｓ，２Ｈ），６．２８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），５．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），４．９６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．３８（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），２．６５（ｍ，１Ｈ），２．２８（ｍ，１Ｈ）．

実施例３：ヌクレオシドの合成；１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｓａｓ）、１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｓａｖ）および１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−［５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｖａｓ）の合成
Ｒは、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、又は５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基。
試薬および略号：
（ａ）ｍＣＰＢＡ、ＥｔＯＡｃ、次いでメタンスルホニルクロリド、ＤＭＦ；
（ｂ）ＮａＩ、ＣＨ_３ＣＯＣｌ、ＣＨ_３ＣＮ；
（ｃ）ＮａＨ、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロリド、ＣＨ_３ＣＮ；
（ｄ）ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、トリブチルスタンニル誘導体、ＤＭＦ；
（ｅ）ＮＨ_３、メタノール又はＮａＯＭｅ、メタノール

（３−１）４−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの合成
１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（５．３ｇ，４５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（４５ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（３０ｍｌ）に溶解したメタ−クロロ化安息香酸（１４ｇ，５４ｍｍｏｌ）溶液を０℃で撹拌しながら１時間かけて滴下して加えた。滴下後室温で３時間撹拌した後、０℃で静置した。結晶をろ過し、酢酸エチルで洗浄後、減圧下で乾燥した。これを水（３０ｍｌ）に溶解後、３０％Ｋ_２ＣＯ_３をｐＨ１０になるまで加え、室温で１時間、０℃で１時間静置した後、沈殿をろ過、エーテルで洗浄してＮ−オキシドを３．５ｇ（５８％）得た。Ｎ−オキシド（３．０ｇ、２２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１６ｍｌ）に溶解し５０℃で加熱した。メタンスルホニルクロリド（４．７ｍｌ，６０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６．４ｍｌ）溶液を７０℃で滴下し、この反応溶液を７５℃で２時間撹拌した。反応溶液を氷に加えた後、０℃で１０ＮのＮａＯＨを用いて中和した。室温で１時間撹拌し生成した沈殿をろ過して水で洗浄した後、６０℃で減圧乾燥して目的とする４−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを２．７ｇ（８０％）得た。４−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２．７ｇ、１８ｍｍｏｌ）、ＮａＩ（１３ｇ、８８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２８ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌しながらＣＨ_３ＣＯＣｌ（３．５ｍｌ、５０ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を８５℃で１２時間加熱した。反応溶液を室温に戻した後、１０％Ｎａ_２ＣＯ_３（２８ｍｌ）、１０％ＮａＨＳＯ_３（２８ｍｌ）を加えて室温で１５分撹拌した。酢酸エチルを加えて分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムで精製して４−ヨード−１−Ｎ−アセチル−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２．０ｇ）ならびに４−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２．３ｇ）を得た。４−ヨード−１−Ｎ−アセチル−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２．０ｇ、７．０ｍｍｏｌ）は、エタノール（７０ｍｌ）に溶解し、メタノール中２８％ナトリウムメトキシド（１．４ｍｌ、７．０ｍｍｏｌ）を加えて１時間還流した。反応溶液を濃縮後、酢酸エチルと飽和アンモニウムクロリド水溶液で分液し、有機層を飽和アンモニウムクロリド水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、先に得られた４−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２．３ｇ）とあわせてエタノールで再結晶して４−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（４．０ｇ，９２％）を得た。

４−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン：^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１２．０１（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），７．５９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．１Ｈｚ），７．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），６．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４Ｈｚ）．

（３−２）１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−ヨード−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの合成
４−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（９５０ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３９ｍｌ）溶液に、ＮａＨ（１５６ｍｇ、６０％油中分散液、３．９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロペントフラノシルクロリド（１．８ｇ、１．２当量）を加えて室温で１．５時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと飽和アンモニウムクロリド水溶液で分液し、有機層を飽和アンモニウムクロリド水溶液と飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムで精製して１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−ヨード−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを１．８ｇ（７７％）得た。

（３−３）１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｓａｓ）の合成
２−トリブチルスタニル−５，２−ビチオフェン（０．３ｍｍｏｌ）、１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−ヨード−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（１２０ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）、ジクロロビストリフェニルフォスフィンパラジウム（７ｍｇ）のＤＭＦ（２ｍｌ）の溶液を１００℃で１時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮してシリカゲルカラムにより精製して、１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを得た。これを、塩化メチレン（１０ｍｌ）とメタノール（２ｍｌ）に溶解し、２８％ナトリウムメチラート（０．１２ｍｌ）を加えて室温で３０分撹拌した。シリカゲルカラムならびにＨＰＬＣにより精製して１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｓａｓ、５４ｍｇ、６８％）を得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ８．２６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），７．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），７．８０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．５８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．１Ｈｚ），７．４４（ｍ，３Ｈ），７．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．１Ｈｚ），６．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），６．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．１，８．１Ｈｚ），５．２６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），５．００（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．３９（ｍ，１Ｈ），３．８４（ｍ，１Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），２．５９（ｍ，１Ｈ），２．２３（ｍ，１Ｈ）．

（３−４）１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｓａｖ）の合成
２−ブロモチアゾール（０．９ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）、ジクロロビストリフェニルフォスフィンパラジウム（３５０ｍｇ）のＤＭＦ（５０ｍｌ）の溶液に２−トリブチルスタンニルチオフェン（３．５ｍｌ、１１ｍｍｏｌ）を加え、９０℃で３時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、酢酸エチルと水で分液後、飽和食塩水で有機層を洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を濃縮後シリカゲルカラムで精製して２，２’−チエニルチアゾール（１．４ｇ，８７％）で得た。２，２’−チエニルチアゾール（２５１ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５ｍｌ）の溶液を−７８℃に冷却し、ｎ−ブチルリチウム（０．９６ｍｌ，１．５ｍｍｏｌ，１．５７Ｍヘキサン溶液）を加え、−７８℃で３０分間撹拌した。これにトリメチルシリルクロリド（１．５ｍｍｏｌ、０．１９ｍｌ）を加えて−７８℃で３０分間撹拌した。さらにｎ−ブチルリチウム（０．９６ｍｌ、１．５ｍｍｏｌ、１．５７Ｍヘキサン溶液）を加え、−７８℃で３０分間撹拌した後、トリブチルスタンニルクロリド（０．４５ｍｌ、１．６ｍｍｏｌ）を加えて室温で３０分撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮してシリカゲルカラムにより精製して、２−トリブチルスタンニル−５−（５’−トリメチルシリル−２−チエニル）チオフェン（７３５ｍｇ）を得た。１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−ヨード−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２９８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、ジクロロビストリフェニルフォスフィンパラジウム（１８ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍｌ）の溶液に、２−トリブチルスタンニル−５−（５’−トリメチルシリル−２−チエニル）チオフェン（３９７ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で１時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮してシリカゲルカラムにより精製して、１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−（２−（５−（５’−トリメチルシリル−２−チエニル）チオフェン）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（３３５ｍｇ）を得た。これを、塩化メチレン（５ｍｌ）とメタノール（５ｍｌ）に溶解し、２８％ナトリウムメチラート（２９０ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）を加えて室温で３０分撹拌した。反応溶液にアンモニウムクロリド（８０ｍｇ）を加えて濃縮した後、シリカゲルカラムならびにＨＰＬＣにより精製して１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｓａｖ，１１２ｍｇ）ならびに、１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−［２−（２−チエニル）チアゾール−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｖ’ａｓ、２６ｍｇ）を得た。

ｄＤｓａｖ： ^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ８．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），７．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），７．８７（ｍ，２Ｈ），７．７９（ｍ，２Ｈ），７．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），６．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），６．７６（ｄｄ，１Ｈ，６．１，８．０Ｈｚ），５．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），４．９９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．３８（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），２．５６（ｍ，１Ｈ），２．２４（ｍ，１Ｈ）．
ｄＤｖ’ａｓ： ^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ８．５１（ｓ，１Ｈ），８．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），７．７９（ｍ，２Ｈ），７．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），７．２２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０，４．９Ｈｚ），７．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），６．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．２，７．９Ｈｚ），５．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），４．９９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．３８（ｍ，１Ｈ），３．５９（ｍ，２Ｈ），２．５７（ｍ，１Ｈ），２．２４（ｍ，１Ｈ）．

（３−５）１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−［５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｖａｓ）の合成
５−（２−チエニル）チアゾール（０．４ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル溶液を−７８℃に冷却し、ｎ−ブチルリチウム（０．４ｍｍｏｌ、１．５７Ｍ ヘキサン溶液）を加えて−７８℃で３０分間撹拌した。トリブチルスタニルクロリドを加えた後、室温で３０分間撹拌し、反応溶液を酢酸エチルと水で分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄濃縮後、１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−ヨード−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（１２０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、クロロビストリフェニルフォスフィンパラジウム（５％ ｍｏｌ）、ＤＭＦ（２ｍｌ）を加えて１００℃で１時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、飽和食塩水と水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。シリカゲルカラムで精製後、ナトリウムメトキシド（１．６ｍｌ）を加えて室温で３０分間撹拌し、シリカゲルカラムで精製後、ＨＰＬＣで精製してｄＤｖａｓヌクレオシド（３４ｍｇ）得た。

ｄＤｖａｓ ： ^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ８．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），８．３１（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），７．６８（ｍ，２Ｈ），７．５４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，３．６Ｈｚ），７．１９（ｄｄ，１Ｈ，３，７，５，１Ｈｚ），７．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），６．７７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．１，８．０Ｈｚ），５．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），４．９８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），４．３８（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），２．５７（ｍ，１Ｈ），２．４９（ｍ，１Ｈ）．

実施例４：アミダイト合成（ｄＤｓｓ及びｄｓｓ）
条件：
（ａ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ｄＤｓｓについてピリジン、トリメチルシリルクロリド、フェノキシアセチルクロリド、ヒドロキシベンゾトアゾール、ピリジン、ＣＨ_３ＣＮ、次いでＤＭＴｒ−Ｃｌ、ピリジン
（ｂ）２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホロアミダイト、ジイソプロピルアミン、ＴＨＦ。

（４−１）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの合成。
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ｄＤｓｓ）（２６２ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸乾燥した後、ピリジン（７．０ｍｌ）に溶解させ４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（３６７ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ ［４，５−ｂ］ピリジン（４０８ｍｇ、８９％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製して得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ 8.66 (s, 1H), 8.30 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 8.22 (d, 1H, J = 3.9 hz), 7.67 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.60 (dd, 1H, J = 1.1, 5.1 Hz), 7.48-7.46 (m, 2H), 7.34-7.31 (m, 2H), 7.24-7.14 (m, 8H), 6.80 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 6.75 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 6.55 (t, 1H, J = 6.3 Hz), 5.39 (d, 1H, J = 4.6 Hz), 4.51 (m, 1H), 3.70 および3.67 (s, s, 6H), 3.19 (m, 2H), 2.96 (m, 1H), 2.41 (m, 1H)．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ_４０Ｈ_３５Ｎ_３Ｏ_５Ｓ_２Ｎａについて （Ｍ＋Ｎａ）^＋ 計算値：７２４．１９１６、実測値：７２４．１９７８

（４−２）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン ２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイトの合成
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（２０３ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）は、ピリジンで３回、ＴＨＦで３回共沸乾燥した。このジイソプロピルエチルアミン（７６μｌ、０．４３ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（１．５ｍｌ）を加えて、最後に２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホロアミダイト（７８μｌ、０．３５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応溶液にメタノール（５０μｌ）を加え、ＥｔＯＡｃ：ＴＥＡ（２０：１、ｖ／ｖ、２０ｍｌ）で希釈した。５％炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、有機層を減圧下で濃縮した。７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン ２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイト（２６０ｍｇ、９９％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％トリエチルアミンを含む塩化メチレンとヘキサン２：３の溶液で溶出）で精製して得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ ８．３３−８．３０（ｍ，２Ｈ），８．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．４７−７．４１（ｍ，３Ｈ），７．３５−７．１７（ｍ，１０Ｈ），７．０７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６，５．１Ｈｚ），６．８２−６．７６（ｍ，４Ｈ），６．６２（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），４．３４（ｍ，１Ｈ），３．９１−３．７８（ｍ，１０Ｈ），３．４９−３．３２（ｍ，２Ｈ），２．９４（ｍ，１Ｈ），２．７３（ｍ，１Ｈ），２．６４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），２．４８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．２３−１．１２（ｍ，１２Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ １４９．４７および１４９．２９（ジアステレオ異性体）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ_４９Ｈ_５２Ｎ_５Ｏ_６Ｓ_２ＰＮａについて（Ｍ＋Ｎａ）^＋ 計算値：９２４．２９９４、実測値：９２４．３３２８．

（４−３）２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリンの合成
２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ｓｓ）（２０８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸した後、ピリジン（２．５ｍｌ）に溶解し、トリメチルシリルクロリド（４７６μｌ、３．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で３０分撹拌した（溶液Ａ）。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１２２ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸した後、ピリジン（０．２５ｍｌ）とアセトニトリル（０．２５ｍｌ）に溶解し、この溶液を０℃に冷却して、フェノキシアセチルクロリド（１０４μｌ，０．７５ｍｍｏｌ）を加えて５分間撹拌した（溶液Ｂ）。溶液Ｂに溶液Ａを０℃で加え、室温で１２時間撹拌した。反応溶液を０℃に冷却し、１４％アンモニア水溶液（０．５ｍｌ）を加えて１０分撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮した。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２４６ｍｇ、８９％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％メタノールの塩化メチレンで溶出）で精製して得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １０．７７（ｓ，１Ｈ），８．７４（ｓ，１Ｈ），８．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．６５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．１Ｈｚ），７．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，３．６Ｈｚ），７．３４−７．２９（ｍ，２Ｈ），７．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．７，５．１Ｈｚ），７．０１−６．９４（ｍ，３Ｈ），６．４１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），５．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），５．１０（ｓ，２Ｈ），４．９３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），４．４６（ｍ，１Ｈ），３．８９（ｍ，１Ｈ），３．５９（ｍ，２Ｈ），２．７９（ｍ，１Ｈ），２．３５（ｍ，１Ｈ）．

（４−４）２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリンの合成
２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２４０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸乾燥した後、ピリジン（４．４ｍｌ）に溶解させ４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１６３ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（３１４ｍｇ、８４％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製して得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ １０．７２（ｓ，１Ｈ），８．６４（ｓ，１Ｈ），８．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．６５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．１Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．５２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，３．６Ｈｚ），７．３４−７．２７（ｍ，４Ｈ），７．１９−７．１２（ｍ，８Ｈ），７．００−６．９５（ｍ，３Ｈ），６．７５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），６．６９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），６．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），５．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．７Ｈｚ），５．０５（ｍ，２Ｈ），４．５５（ｍ，１Ｈ），４．０１（ｍ，１Ｈ），３．６７，３．６４（ｓ，ｓ，６Ｈ），３．３０（ｍ，１Ｈ，Ｈ_２Ｏシグナルピークと重なる），３．１２（ｍ，１Ｈ），２．９５（ｍ，１Ｈ），２．４０（ｍ，１Ｈ）．

（４−５）２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン ２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイトの合成
２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（３１０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）は、ピリジンで３回、ＴＨＦで３回共沸乾燥した。このジイソプロピルエチルアミン（９５μｌ、０．５５ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（１．８ｍｌ）を加えて、最後に２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホロアミダイト（９８μｌ、０．４４ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応溶液にメタノール（５０μｌ）を加え、ＥｔＯＡｃ：ＴＥＡ（２０：１、ｖ／ｖ、２０ｍｌ）で希釈した。５％炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、有機層を減圧下で濃縮した。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン ２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイト（３７０ｍｇ、９７％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％トリエチルアミンを含む塩化メチレンとヘキサン２：３の溶液で溶出）で精製して得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ ８．５９，８．５８（ｓ，ｓ，１Ｈ），８．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ），７．３９−７．１７（ｍ，１４Ｈ），７．１３−７．０５（ｍ，４Ｈ），６．８２−６．７５（ｍ，４Ｈ），６．５０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），４．９４（ｂｓ，２Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），４．３４（ｍ，１Ｈ），３．９４−３．５５（ｍ，４Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），３．４５−３．４０（ｍ，２Ｈ），２．９３（ｍ，１Ｈ），２．８０−２．６６（ｍ，１Ｈ），２．６５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），２．４８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．２２−１．１１（ｍ，１２Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ １４９．５７．

実施例５：デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（ｄＤｓｓＴＰ）の合成
条件：
（ａ）無水酢酸、ピリジン、次いでジクロロ酢酸、ＣＨ_２Ｃｌ_２
（ｂ）クロロ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン、ジオキサン、ピリジン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ビス（トリブチルアンモニウム）ピロホスフェート、Ｉ_２、Ｈ_２Ｏ、２８％ＮＨ_４ＯＨ

（５−１）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−３−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（１９５ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸乾燥したのち、ピリジン（２．８ｍｌ）に溶解し、無水酢酸（１０５μｌ、１．１ｍｍｏｌ）を加えて室温で１２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。残渣をトルエンで共沸乾燥した後、塩化メチレン（２８ｍｌ）に溶解させ、ジクロロ酢酸（２８０μｌ）を０℃で加えて１５分撹拌した。反応溶液に５％炭酸水素ナトリウムを加えて分液した後、有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液ならびに飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−３−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（１１５ｍｇ、９３％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％メタノールの塩化メチレンで溶出）で精製して得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ８．７９（ｓ，１Ｈ），８．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．７Ｈｚ），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），７．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．１Ｈｚ），７．４８（ｍ，２Ｈ），７．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．１Ｈｚ），６．５５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，８．７Ｈｚ），５．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），５．３１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），４．１３（ｍ，１Ｈ），３．７１−３．６３（ｍ，１０Ｈ），３．７１−３．６３（ｍ，２Ｈ），３．０６（ｍ １Ｈ），２．５３（ｍ，１Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ_２１Ｈ_２０Ｎ_３Ｏ_４Ｓ_２について（Ｍ＋Ｈ）^＋ 計算値：４４２．０８９５、実測値：４４２．０８６９．

（５−２）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン ５’−三リン酸の合成
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−３−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（４４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を、ピリジンで共沸乾燥した後、ピリジン（１００μｌ）とジオキサン（１００μｌ）に溶解させ、２−クロロ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンの１Ｍジオキサン溶液（１１０μｌ、０．１１ｍｍｏｌ）を加えて１０分撹拌した。この溶液にトリブチルアミン（１００μｌ）とビス（トリブチルアンモニウム）ピロフォスフェートの０．５Ｍ ＤＭＦ溶液（３００μｌ、０．１５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１０分撹拌した。１％ ヨウ素のピリジン／水（９８：２、ｖ／ｖ、２．０ｍｌ）を加えて１５分撹拌した後、亜硫酸水素ナトリウムの５％水溶液（１５０μｌ）を加えた。水（５．０ｍｌ）を加えて、３０分撹拌した後、２８％アンモニア水（２０ｍｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮した後、７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン ５’−三リン酸（３３μｍｏｌ、３３％）は、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ａ−２５）カラムクロマトグラフィー（５０ｍＭから１．０Ｍ ＴＥＡＢ溶液で溶出）ならびにＣ１８−ＨＰＬＣ （０％から５０％ アセトニトリルの１００ｍＭ ＴＥＡＡにより溶出）により精製して得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ ８．４９（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），７．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３３−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．０６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，４．７Ｈｚ），６．９９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．１Ｈｚ），６．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），６．２９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．６８（ｍ，１Ｈ，Ｄ_２Ｏと重なる），４．１８（ｍ，１Ｈ），４．１０−４．０２（ｍ，２Ｈ），３．０５（ｑ，２２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．６８（ｍ，１Ｈ），２．４１（ｍ，１Ｈ），１．１４（ｔ，３４Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ −９．７１（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝１９．８Ｈｚ），−１０．７２（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝１９．８Ｈｚ），−２２．５４（ｔ，１Ｐ，Ｊ＝２０．０Ｈｚ）．
１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中のＵＶ−ｖｉｓスペクトルデータ、λｍａｘ＝２６４ｎｍ（ε９９００）、３６８ｎｍ（ε３１４００）．
ＥＳＩ−ＭＳ（Ｃ_１９Ｈ_２０Ｎ_３Ｏ_１２Ｓ_２Ｐ_３）；計算値：６３７．９６（Ｍ−Ｈ）⁻、実測値：６３７．８７（Ｍ−Ｈ）⁻．

実施例６：リボヌクレオシド５’−三リン酸（ＤｓｓＴＰ）の合成
条件：
（ａ）テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノース、クロロ酢酸
（ｂ）（ｉ）ＤＭＴｒＣｌ、ピリジン；（ｉｉ）無水酢酸、ピリジン、次いでジクロロ酢酸、ＣＨ_２Ｃｌ_２；
（ｃ）２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン、ジオキサン、ピリジン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロホスフェート、ＤＭＦ、次いでＩ_２／ピリジン／Ｈ_２Ｏ

（６−１）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（５６６ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）とテトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノース（７００ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）およびクロロ酢酸（１２ｍｇ）を２００℃で１０分間溶融させた。冷却した後、塩化メチレンとメタノール（１：１、ｖ／ｖ、１６ｍｌ）に溶解させ、２８％ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（２．０ｍｌ）を加えて室温で３０分撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮した後、７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（１９０ｍｇ、２３％）を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）ならびにＣ１８−ＨＰＬＣで精製して得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ８．８０（ｓ，１Ｈ），８．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），６．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．０，５．１Ｈｚ），７．４９−７．４６（ｍ，２Ｈ），７．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．１Ｈｚ），６．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），５．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），５．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，６．４Ｈｚ），５．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），４．６８（ｍ，１Ｈ），４．２０（ｍ，１Ｈ），３．７５−３．５５（ｍ，２Ｈ）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ １４７．２５，１４４．０４，１４３．９４，１４０．１０，１３６．０９，１３５．４３，１３１．５８，１３０．８９，１３０．０３，１２８．５７，１２６．２７，１２４．７８，１２４．５７，１１３．６０，８７．８３，８５．５７，７３．４９，７９．４１，６１．４１．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ_１９Ｈ_１８Ｎ_３Ｏ_４Ｓ_２について（Ｍ＋Ｈ）^＋ 計算値：４１６．０７３９、実測値：４１６．０７５５． ＥＳＩ−ＭＳ（Ｃ_１９Ｈ_１７Ｎ_３Ｏ_４Ｓ_２）； 計算値：４１６．０７（Ｍ＋Ｈ）^＋、実測値：４１５．８６（Ｍ＋Ｈ）^＋．

（６−２）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（１６６ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸乾燥した後、ピリジン（４．０ｍｌ）に溶解させ、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１６２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウムで分液し、有機層を水ならびに飽和食塩水で洗浄し、減圧下で濃縮した。ジメトキシトリチル体は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製した後、ピリジンで３回共沸乾燥した。これに、ピリジン（４ｍｌ）を加え、無水酢酸（１５１μｌ、１．６ｍｍｏｌ）を加えて室温で１２時間撹拌した。反応溶液は、酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウムで分液し、有機層を水ならびに飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。トルエンで共沸乾燥した後、塩化メチレン（４０ｍｌ）に溶解させ、ジクロロ酢酸（４００μｌ）を０℃で加えて１５分撹拌した。反応溶液に５％炭酸水素ナトリウムを加えて分液した後、有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液ならびに飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（１７８ｍｇ、８９％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．５％メタノールの塩化メチレンで溶出）で精製して得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ８．８３（ｓ，１Ｈ），８．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），８．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），７．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．１Ｈｚ），７．５０−７．４７（ｍ，２Ｈ），７．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．１Ｈｚ），６．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），６．０４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．７，６．６Ｈｚ），５．５８−５．５３（ｍ，２Ｈ），４．２８（ｍ，１Ｈ），３．８１−３．６３（ｍ，２Ｈ）２．１５（ｓ，３Ｈ），２．００（ｓ，３Ｈ）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ_２３Ｈ_２２Ｎ_３Ｏ_６Ｓ_２について（Ｍ＋Ｈ）^＋ 計算値：５００．０９５０、実測値：５００．０９２９．

（６−３）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン ５’−三リン酸の合成
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（３−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（５０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を、ピリジンで共沸乾燥した後、ピリジン（１００μｌ）とジオキサン（１００μｌ）に溶解させ、２−クロロ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンの１Ｍジオキサン溶液（１１０μｌ、０．１１ｍｍｏｌ）を加えて１０分撹拌した。この溶液にトリブチルアミン（１００μｌ）とビス（トリブチルアンモニウム）ピロフォスフェートの０．５Ｍ ＤＭＦ溶液（３００μｌ、０．１５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１０分撹拌した。１％ヨウ素のピリジン／水（９８：２、ｖ／ｖ、２．０ｍｌ）を加えて１５分撹拌した後、亜硫酸水素ナトリウムの５％水溶液（１５０μｌ）を加えた。水（５．０ｍｌ）を加えて、３０分撹拌した後、２８％アンモニア水（２０ｍｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮した後、７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン ５’−三リン酸（２６μｍｏｌ、２６％）は、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ａ−２５）カラムクロマトグラフィー（５０ｍＭから１．０Ｍ ＴＥＡＢ溶液ならびに１０％アセトニトリルの１Ｍ ＴＥＡＢ溶液で溶出）ならびにＣ１８−ＨＰＬＣ（０％から５０％アセトニトリルの１００ｍＭ ＴＥＡＡにより溶出）により精製して得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ ８．６４（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），７．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），７．３０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．１Ｈｚ），７．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，３．６Ｈｚ），７．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），６．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．１Ｈｚ），６．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），４．７４（ｍ，１Ｈ，Ｄ_２Ｏと重なる），４．５３（ｍ，１Ｈ），４．３３（ｍ，１Ｈ），４．２６−４．１２（ｍ，２Ｈ），３．０８（ｑ，２６Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．１６（ｔ，３８Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ −９．５６（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝１９．７Ｈｚ），−１０．６９（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝２０．０Ｈｚ），−２２．４４（ｔ，１Ｐ，Ｊ＝２０．０Ｈｚ）．
１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中でのＵＶ−ｖｉｓスペクトルデータ、λｍａｘ＝２６４ｎｍ（ε１０１００）、３６８ｎｍ（ε３１８００）．
ＥＳＩ−ＭＳ（Ｃ_１９Ｈ_２０Ｎ_３Ｏ_１３Ｓ_２Ｐ_３）；計算値：６５３．９６（Ｍ−Ｈ）⁻、実測値：６５３．９９（Ｍ−Ｈ）⁻

実施例７：リボヌクレオシド５’−三リン酸（ｓｓＴＰ）の合成
条件：
（ａ）５−トリブチルスタンニル−２，２’−ビチオフェン、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４、ＬｉＣｌ、ジオキサン、次いでＴＢＡＦ、ＴＨＦ
（ｂ）トリメチルシリルクロリド、フェノキシアセチルクロリド、ヒドロキシベンゾトリアゾール、ピリジン、ＣＨ_３ＣＮ、次いでＤＭＴｒ−Ｃｌ、ピリジン
（ｃ）無水酢酸、ピリジン
（ｄ）ジクロロ酢酸、ＣＨ_２Ｃｌ_２
（ｅ）クロロ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン、ジオキサン、ピリジン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ビス（トリブチルアンモニウム）ピロホスフェート、Ｉ_２、Ｈ_２Ｏ、２８％ＮＨ_４ＯＨ

（７−１）２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ｓｓ）の合成
６−Ｏ−トシル−２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ｔｅｒ−ブチルジメチルシリル−グアノシン（７８０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（５８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、リチウムクロリド（８４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）、および５−トリブチルスタンニル−２，２’−ビチオフェン（５．０ｍｍｏｌ）のジオキサン溶液を１２０℃で５時間還流した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧下で濃縮した。２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ｔｅｒ−ブチルジメチルシリル−２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリンは、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（塩化メチレンで溶出）で精製した。２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ｔｅｒ−ブチルジメチルシリル−２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリンのＴＨＦ（５．５ｍｌ）溶液に、１ＭテトラブチルアンモニウムフルオリドのＴＨＦ溶液（４．５ｍｌ）を加えて、室温で３０分撹拌した。反応溶液を濃縮後、２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（３９１ｍｇ、９０％、２段階収率）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーおよびＲＰ−ＨＰＬＣ精製により得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ８．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），８．４１（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．１Ｈｚ），７．４９−７．４６（ｍ，２Ｈ），７．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．１Ｈｚ），６．５８（ｂｓ，２Ｈ），５．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），５．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），５．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），５．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），５．０８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．５３（ｍ，１Ｈ），４．１５（ｍ，１Ｈ），３．９３（ｍ，１Ｈ），３．７０−３．５３（ｍ，２Ｈ）．

（７−２）２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２’，３’−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリンの合成
２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２１６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸した後、ピリジン（２．５ｍｌ）に溶解し、トリメチルシリルクロリド（６３５μｌ、５．０ｍｍｏｌ）を加えて室温で３０分撹拌した（溶液Ａ）。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１２２ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸した後、ピリジン（０．２５ｍｌ）とアセトニトリル（０．２５ｍｌ）に溶解し、この溶液を０℃に冷却して、フェノキシアセチルクロリド（１０４μｌ、０．７５ｍｍｏｌ）を加えて５分間撹拌した（溶液Ｂ）。溶液Ｂに溶液Ａを０℃で加え、室温で１２時間撹拌した。反応溶液を０℃に冷却し、１４％アンモニア水溶液（０．５ｍｌ）を加えて１０分撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮した。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２３０ｍｇ、８１％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％メタノールの塩化メチレンで溶出）で精製して得た。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２３０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸乾燥した後、ピリジン（４．０ｍｌ）に溶解させ４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１５２ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２２８ｍｇ、６５％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製して得た。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２２８ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸乾燥した後、ピリジン（２．６ｍｌ）に溶解させ、無水酢酸（９９μｌ、１．０ｍｍｏｌ）を加えて室温で１２時間撹拌した。反応溶液は、酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウムで分液し、有機層を水ならびに飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。トルエンで共沸乾燥した後、塩化メチレン（２６ｍｌ）に溶解させ、ジクロロ酢酸（２６０μｌ）を０℃で加えて１５分撹拌した。反応溶液に５％炭酸水素ナトリウムを加えて分液した後、有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液ならびに飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２’，３’−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（１３４ｍｇ、７９％、２段階収率）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．５％メタノールの塩化メチレンで溶出）で精製して得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ １０．８３（ｓ，１Ｈ），８．８０（ｓ，１Ｈ），８．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１Ｈ），７．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），７．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），７．３２（ｍ，２Ｈ），７．１８（ｍ，１Ｈ），７．０２−６．９５（ｍ，３Ｈ），６．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），５．９２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），５．５７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．９，５．６Ｈｚ），５．３３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），５．１０（ｓ，２Ｈ），４．２６（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｍ，２Ｈ），２．１４（ｓ，３Ｈ），１．９９（ｓ，３Ｈ）．

（７−３）２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン ５’−三リン酸の合成。
２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−１−（２’，３’−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（６５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ） を、ピリジンで共沸乾燥した後、ピリジン（１００μｌ）とジオキサン（３００μｌ）に溶解させ、２−クロロ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンの１Ｍジオキサン溶液（１１０μｌ、０．１１ｍｍｏｌ）を加えて１０分撹拌した。この溶液にトリブチルアミン（１００μｌ）とビス（トリブチルアンモニウム）ピロフォスフェートの０．５Ｍ ＤＭＦ溶液（３００μｌ，０．１５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１０分撹拌した。１％ ヨウ素のピリジン／水（９８：２、ｖ／ｖ、２．０ｍｌ）を加えて１５分撹拌した後、 亜硫酸水素ナトリウムの５％水溶液（１５０μｌ）を加えた。水（５．０ｍｌ）を加えて、３０分撹拌した後、２８％アンモニア水（２０ｍｌ）を加えて５５℃で３時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮した後、２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン ５’−三リン酸（２７．６μｍｏｌ、２７％）は、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ａ−２５）カラムクロマトグラフィー（５０ｍＭから１．０Ｍ ＴＥＡＢ溶液ならびに１０％アセトニトリルの１Ｍ ＴＥＡＢ溶液で溶出）ならびにＣ１８−ＨＰＬＣにより精製して得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ ８．４２（ｓ，１Ｈ），８．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），７．２４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．０１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８，５．０Ｈｚ），６．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），４．８６（ｍ，１Ｈ），４．６４（ｍ，１Ｈ），４．４１（ｍ，１Ｈ），４．２９（ｍ，２Ｈ），３．１９（ｑ，２５Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．２８（ｔ，３７Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ −９．２８（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝１９．４Ｈｚ），−１０．７０（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝１９．７Ｈｚ），−２２．４１（ｔ，１Ｐ，Ｊ＝２０．０Ｈｚ）．
１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中のＵＶ−ｖｉｓスペクトルデータ、λｍａｘ＝３８８ｎｍ（ε３２５００）．
ＥＳＩ−ＭＳ（Ｃ_１８Ｈ_２０Ｎ_５Ｏ_１３Ｓ_２Ｐ_３）；計算値：６６９．９７（Ｍ−Ｈ）⁻、実測値：６６９．３９（Ｍ−Ｈ）⁻．

実施例８：蛍光性人工塩基のヌクレオシド誘導体の蛍光特性
人工塩基ｓｓ、ｓｓｓ、Ｄｓｓ、Ｄｓｓｓ、Ｄｓａｓ、Ｄｓａｖ、またはＤｖａｓを有するヌクレオシドについて、蛍光特性を評価した。公知の人工塩基である２−アミノプリン、ｓ（２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基）、ｖ（２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基）、Ｄｓ（７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基）を有するヌクレオシドの蛍光特性も併せて評価し、比較した。それぞれのデオキシリボヌクレオシド誘導体の構造を図１に示し、またそれらの蛍光特性を表１に示す。

蛍光性のｄｓは、励起波長が３５０ｎｍと低波長であり、その蛍光強度（ε×φ＝２５７６）も小さい。ｄｖは、３６３ｎｍの励起で蛍光を発するが、塩基性条件化でのヌクレオシド誘導体の安定性が低い。ｄＤｓは３１０ｎｍ付近の励起で蛍光を発するが、３５０ｎｍ以上の励起では発光しない。また既存の２−アミノプリンは、３００ｎｍ付近の励起で蛍光を発するが、３５０ｎｍ以上では蛍光強度が著しく減少する。

これらに対して、ｄｓｓは、３８８ｎｍの励起で強い蛍光（ε×φ＝９０７２）を示し、ｄＤｓｓも同様に３７１ｎｍの励起でさらに強い蛍光（ε×φ＝１０４００）を示した。

また、図２に人工塩基ｓ、Ｄｓｓ又はｓｓを有するリボヌクレオシド三リン酸誘導体（転写用の基質）の蛍光とそのスペクトルを示す。人工塩基Ｄｓｓ及びｓｓを有するヌクレオチドは、人工塩基ｓを有するヌクレオチドよりも強い蛍光を示した。

従って、プリン塩基、１−デアザプリン、１，７−デアザプリンの６位（プリン環の６位）に複素環分子を２つ以上縮重した本発明の人工塩基は、既存の人工塩基よりも優れた蛍光特性を有することが明らかになった。

実施例９：複製による蛍光性人工塩基基質のＤＮＡへの取り込み
複製による蛍光性人工塩基基質のＤＮＡへの取り込みの例として、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（ｅｘｏ＋）を用いた複製によるＤＮＡ中へのＤｓｓの取り込み実験を行った。

２×反応緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１４ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ ＤＴＴ）中に溶かした鋳型鎖ＤＮＡ（配列番号１、３５−ｍｅｒ、４００ｎＭ）と５’末端が^３２Ｐで標識されたプライマー（配列番号２、２３−ｍｅｒ、４００ｎＭ）を９５℃で３分間加温後徐冷してアニーリングの操作を行い、二本鎖を形成させた。その二本鎖ＤＮＡ溶液を５μｌずつ分注した後、４×ｄＮＴＰ混合溶液（４０μＭ ｄＴＴＰ、４０μＭ ｄＣＴＰ、０−４０μＭ ｄＤｓｓＴＰ）を２．５μｌと水で希釈したＫｌｅｎｏｗフラグメント（Ｔａｋａｒａ）２．５μｌ（１ユニット）を加えて、３７℃で酵素反応を開始した。３７℃でインキュベーションした後、１０μｌの１０Ｍ 尿素を含むＴＢＥ溶液を加えて７５℃で３分加温して反応を終了させた。反応溶液の一部を１５％ポリアクリルアミド−７Ｍ 尿素ゲルで電気泳動して、バイオイメージングアナライザー（ＦＬＡ７０００、富士フィルム）で解析した。

人工塩基対Ｄｓｓ−Ｐａ（ピロロ−２−カルバルデヒド）を利用することにより、Ｄｓｓの相補塩基であるＰａが組み込まれたＤＮＡを鋳型とする大腸菌のクレノウ断片を用いた複製反応において、伸張したＤＮＡ鎖中の特定位置（鋳型ＤＮＡ中のＰａに相補する位置）にｄＤｓｓＴＰを取り込ませることができた（図３）。

図３の電気泳動写真中、３３−ｍｅｒと示されたバンドは完全に伸張したＤＮＡ断片である。蛍光性人工塩基の基質（ｄＤｓｓＴＰ）の量を少なくすることにより（天然型塩基基質１０μＭに対して、ｄＤｓｓＴＰを０．５μＭ）効率よくＤｓｓヌクレオチドをＤＮＡ中に取り込ませられることが明らかになった。ｄＤｓｓＴＰを加えない場合（図４の電気泳動写真のｎｏｎｅで示したレーン）は、鋳型ＤＮＡ中のＰａの直前で複製が止まり、２８−ｍｅｒのバンドが認められることから、ｄＤｓｓＴＰに依存してＤＮＡ鎖が伸長したことが分かる。すなわち、鋳型ＤＮＡ中のＰａに相補して、選択的にｄＤｓｓＴＰが相補ＤＮＡ鎖に取り込まれることが明らかとなった。

実施例１０：転写による蛍光性人工塩基基質のＲＮＡへの取り込み
転写による蛍光性人工塩基基質のＲＮＡへの取り込みの例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写によるＲＮＡ中へのｓｓ及びＤｓｓの取り込み実験を行った。

Ｔ７ポリメラーゼによる転写のための鋳型は、化学合成された２本ＤＮＡ鎖（１０μＭ ３５−ｍｅｒのコード鎖（配列番号４）と２１−ｍｅｒの非コード鎖（配列番号５））を、１０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝溶液中、９５℃で加熱し、その後４℃まで徐冷してアニーリングすることにより調製した。Ｔ７ポリメラーゼによる転写は、２４ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ スペルミジン、５ｍＭ ＤＴＴ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液（２０μｌ）中、１ｍＭ 天然型ＮＴＰｓ、０．０５−０．１ｍＭ ｓｓＴＰ又はＤｓｓＴＰ（ｓｓ又はＤｓｓを有するリボヌクレオシド５’−三リン酸）の存在下、２μＭ 鋳型及び５０ユニットのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｋｙｏｔｏ）を用いて転写を行った。３７℃で３時間反応した後、１０Ｍ 尿素および０．０５％ＢＰＢを含む色素溶液（２０μｌ）を加えて反応を止めた。その混合溶液を７５℃で３分間加熱した後、２０％ポリアクリルアミド−７Ｍ 尿素ゲルを用いてそれぞれ電気泳動を行った。転写産物の検出は、まず、蛍光指示薬を含むＴＬＣ上にゲルをのせ、上から２５４ｎｍのＵＶを照射し、核酸がＵＶを吸収することで転写産物のバンドが影として検出されることを利用し、その像をポラロイドカメラにより撮影した。また、蛍光性人工塩基ｓｓやＤｓｓを含む転写物は、落射紫外ＬＥＤを利用してバイオイメージングアナライザー、ＬＡＳ４０００（富士フィルム）により検出した。結果を図４に示した。

ｓｓＴＰ又はＤｓｓＴＰのどちらの人工塩基基質も鋳型ＤＮＡ中のＰａに相補して、ＲＮＡ中に取り込まれた。図４Ｂ中、上段の電気泳動がｓｓＴＰの取り込みを示し、下段がＤｓｓＴＰの取り込みを示す。またそれぞれの左側の電気泳動は、ＵＶシャドウイングにより検出し、右側はＬＡＳ４０００を用いて主波長３６５ｎｍのＵＶ−ＬＥＤの落射光源で励起して、その蛍光を検出した図である。従って、左側の電気泳動では、全てのＲＮＡ転写物がバンドとして検出され、右側の電気泳動では、蛍光性人工塩基が取り込まれたＲＮＡ転写物がバンドとして検出される。図４Ｂに示されるように、ｓｓＴＰとＤｓｓＴＰのどちらも鋳型ＤＮＡ中にＰａが含まれるときだけ全長の転写産物（１７−ｍｅｒ（配列番号６））が認められた。また、Ｐａを含まない鋳型ＤＮＡ（それぞれの電気泳動写真の左側のレーン）では蛍光性の転写物が検出されなかった。これらのことから、それぞれの蛍光性人工塩基基質がＰａに依存してＲＮＡ中に選択的に取り込まれていることが明らかとなった。

実施例１１：ユニバーサル塩基としての性質を示す蛍光性人工塩基
１２−ｍｅｒ ＤＮＡの中央にＤｓｓを有するヌクレオチドを導入し、その相補鎖の同じ位置に天然型塩基を組み込み、それぞれの二本鎖ＤＮＡの熱安定性を測定した。Ｄｓｓを含むそれぞれの二本鎖ＤＮＡの熱安定性は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−２４５０分光光度計で測定し、ＩｇｏｒＰｒｏソフトウエア（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ）を用いて一次微分法によりＴｍ値を算出した。５μＭの二本鎖ＤＮＡ（鎖長１２塩基対）を、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中で、２６０ｎｍの吸光度の温度変化を測定した。その結果を図５（左側）に示す。

蛍光性人工塩基Ｄｓｓを組み込んだＤＮＡ断片は、その相補鎖ＤＮＡと二本鎖を形成し、Ｄｓｓと天然型のどの塩基と塩基対を形成させても、二本鎖ＤＮＡの熱安定性はほぼ同じ（Ｔｍ＝４３．９−４５．９℃）であった。それらの二本鎖ＤＮＡの熱安定性は、Ａ−Ｔ塩基対の場合（Ｔｍ＝４８．６℃）と比較して３℃ほど低下するだけで、天然型の塩基の中で最も安定なミスマッチ塩基対であるＴ−Ｇ塩基対（Ｔｍ＝４２．４℃）よりも安定であった。

公知のユニバーサル塩基として使用頻度の高い３−ニトロピロールは、天然型の塩基対よりも著しく二本鎖ＤＮＡの安定性を下げ、また、その熱安定性は相補する天然型塩基によりＴｍ＝１７．８−２３．２℃の開きがある（図５右側）。

従って、Ｄｓｓは、二本鎖ＤＮＡの安定性を大きく下げず、また相補する天然塩基の違いによる熱安定性の変動が少ないことから、ユニバーサル塩基として従来の塩基類似体よりも優れている。

実施例１２：蛍光性人工塩基Ｄｓｓ、ｓｓを部位特異的に含むｓｈＲＮＡの調製
本実施例では、人工塩基対Ｄｓｓ−Ｐａあるいはｓｓ−Ｐａを利用したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによる転写により、蛍光性人工塩基（Ｄｓｓ、あるいはｓｓ）を含む５２−ｍｅｒのｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡＦ１）を調製した。ｓｈＲＮＡＦ１（配列番号１０）は、ホタルルシフェラーゼのｍＲＮＡをターゲットとしたＲＮＡ干渉実験用のｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）である。図６ＡにｓｈＲＮＡＦ１の二次構造を示した。蛍光性人工塩基の導入箇所は、転写産物のパッセンジャー鎖中の１０番目、１２番目、１６番目、２０番目、２１番目、そしてガイド鎖中の３４−４１番目であり、それぞれＤｓｓ、あるいはｓｓのいずれかを導入した。目的とする人工塩基を含むｓｈＲＮＡ産物は、電気泳動において、蛍光性人工塩基がとりこまれていない産物由来のバンドと比べて移動度が異なること、ＵＶ（波長３６５ｎｍ）照射により人工塩基由来の蛍光をそのバンドで観察できること、を利用して確認できた。

（１）Ｔ７転写のための鋳型の調製
ホタルルシフェラーゼのｍＲＮＡをターゲットとしたＲＮＡ干渉実験用として、位置選択的に蛍光性人工塩基Ｄｓｓあるいはｓｓを部位特異的に導入したｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡＦ１、全長５２−ｍｅｒ）を転写で得るための鋳型ＤＮＡを調製した。化学合成によりＰａを含む２本のＤＮＡ鎖（６６７ｎＭの６９−ｍｅｒのコード鎖と非コード鎖）を、１０ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液にて９５℃で加熱し、その後４℃まで徐冷してアニーリングすることにより、鋳型ＤＮＡを調製した。

（２）Ｔ７転写
Ｔ７転写はＥｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＡｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７−Ｆｌａｓｈ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、２００ｎＭ 鋳型ＤＮＡ、２ｍＭ 天然型ＮＴＰｓ、０．１ｍＭ ＤｓｓＴＰまたは０．１ｍＭ ｓｓＴＰの存在下、３７℃で２時間反応した。反応後の溶液をマイクロコンＹＭ−３（ミリポア社）を用いてＴＥ緩衝液に交換することで脱塩処理した後、１５％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルを用いて電気泳動を行い、目的とする全長のｓｈＲＮＡを精製した。

実施例１３：培養細胞へのｓｈＲＮＡ各種変異体の導入とレポーター遺伝子発現抑制効果の解析
本実施例では、Ｔ７転写とゲル精製により調製した種々のｓｈＲＮＡを、そのターゲットとなるレポーター遺伝子（ホタルルシフェラーゼ）ならびにコントロールとしてレニラルシフェラーゼの遺伝子を含むプラスミドと共にリポフェクション法によりＨｅＬａ細胞に導入し、ルシフェラーゼの発光から、その遺伝子発現が抑制されているかを調べた。その結果を図６に示す。

（１）細胞培養
ＨｅＬａ細胞の培養は、二酸化炭素濃度５％、培養温度３７℃の条件下で、１０％ 仔ウシ血清（ＦＢＳ、ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）を含むＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ、シグマ社）に抗生物質（ペニシリン最終濃度１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン １００μｇ／ｍＬ）を添加したものを用いて行った。

（２）ｓｈＲＮＡとプラスミドの細胞への導入
１穴あたり１．５×１０^４個（培養液１００μｌ）のＨｅＬａ細胞を９６穴プレートに撒き、抗生物質を含まない１０％ 仔ウシ血清含有ＭＥＭ培地で２４時間培養した。トランスフェクションは、リポフェクタミン２０００試薬（インビトロジェン、１穴あたり０．５μｌ）とホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド（プロメガ社製ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ、１穴あたり２００ｎｇ）と、レニラルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド（プロメガ社製ｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ／ＴＫ］、１穴あたり２００ｎｇ）とＰＢＳ中でアニーリング処理した各種ｓｈＲＮＡ（１穴あたり７５ｆｍｏｌ）をＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン）中で混合した溶液（５０μｌ）を添加することで行った。ｓｈＲＮＡの最終濃度は０．５ｎＭである。２２時間培養後に、２種類のルシフェラーゼタンパク質の発光量をそれぞれ調べた。

（３）レポーター遺伝子発現抑制効果の解析
ｓｈＲＮＡのターゲットとなるホタルルシフェラーゼのタンパク質発現の抑制効果は、プロメガ製品のデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ試薬を用いて、ホタルルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼの発光定量により解析した。具体的には、トランスフェクション後の細胞を１穴あたり１００μｌのＰＢＳで２回洗浄したのち、２０μｌの細胞溶解用緩衝液を加えて２５℃で３０分間静かに攪拌しながら細胞を溶解した。この溶液に、１００μｌのＬＡＲＩＩ試薬を加えて混合後、ＬＡＳ４０００（富士フィルム）を用いてホタルルシフェラーゼの発光を検出（露光時間：１２０秒）後、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ試薬を１００μｌ加えて、レニラルシフェラーゼの発光を検出（露光時間：２００秒）し、それぞれの発光の強さをＳｃｉｅｎｃｅＬａｂ ２００５ ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅ（富士フィルム）で定量した。それぞれの検出において、バックグラウンドはトランスフェクションを行わなかった場合の発光量であり、それぞれのルシフェラーゼの発光量からそのバックグラウンドを差し引いた後、ターゲットとするホタルルシフェラーゼの発光量を、共発現させたコントロールとなるレニラルシフェラーゼの発光量で割ることによって規格化した。ｓｈＲＮＡ非存在下での値を１００％として、種々のｓｈＲＮＡ存在下でのターゲットとするホタルルシフェラーゼの相対活性を算出した。

ｓｈＲＮＡＦ１（ＷＴ）の活性と比較して、ｓｈＲＮＡのパッセンジャー鎖中の塩基１０番目、１２番目、１６番目、２０番目、２１番目を蛍光性人工塩基に置換した場合では、天然型塩基置換の場合と同様、ｓｈＲＮＡ変異体の活性にはほとんど影響がみられなかった。また、ガイド鎖中の塩基３４−４１番目を蛍光性人工塩基に置換した場合では、３５番目、３６番目、３７番目塩基の置換であれば、ｓｈＲＮＡ活性を損なわずに、蛍光性人工塩基を導入可能であることがわかった。なお、ｓｈＲＮＡを最終濃度０．５ｎＭでトランスフェクションした後の培地中へのＩＦＮ−αの分泌量はいずれも８０ｐｇ／ｍｌ以下であり、ｓｈＲＮＡ導入による有意なＩＦＮ−αの誘導はみとめられなかった。

以上の結果から、パッセンジャー鎖だけではなくガイド鎖中においても、人工塩基Ｄｓｓ、ｓｓの変異を導入してもｓｈＲＮＡの活性には影響を及ぼさない箇所が存在することがわかった。

実施例１４：各種ｓｈＲＮＡによるレポーター遺伝子発現抑制効果−ＩＣ _５０ の算出
ｓｈＲＮＡＦ１の３６番目に人工塩基Ｄｓｓ、あるいはｓｓを導入した場合での抑制効果とＷＴの抑制効果について、異なるｓｈＲＮＡ濃度で遺伝子発現抑制を解析することにより、ＩＣ_５０を算出した。ＩＣ_５０値はカレイダグラフ（Ａｌｂｅｃｋ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、計算式 ｙ＝１００×Ｍ１／（Ｍ０＋Ｍ１）に当てはめて、最小二乗法によるデータフィッティングにより算出した。その結果を図７に示した。図中に示した式のｙ（％）は、ｓｈＲＮＡ存在下でのターゲットとするルシフェラーゼの相対活性（実施例２参照）、Ｍ０（ｎＭ）はｓｈＲＮＡ濃度、ＩＣ_５０値はＭ１（ｎＭ）に相当する。ｓｈＲＮＡＦ１のＡ３６をＤｓｓあるいはｓｓに置換した場合のＩＣ_５０値は、いずれも置換されていないｓｈＲＮＡＦ１と同程度の約０．０２ｎＭであった。

実施例１５：蛍光性人工塩基を含むｓｈＲＮＡの蛍光観察
ｓｈＲＮＡに導入した人工塩基Ｄｓｓやｓｓは長波長側のＵＶ励起によって青色の蛍光を発する特性をもっている。そこで人工塩基Ｄｓｓ、あるいはｓｓの蛍光を利用したｓｈＲＮＡの検出を、従来の蛍光性人工塩基ｓと比較して行った。

ｓｈＲＮＡとしては、ｓｈＲＮＡＦ１のＵ３５をＤｓｓで置換したｓｈＲＮＡＦ１ Ｕ３５Ｄｓｓ、ｓｈＲＮＡＦ１のＵ３５をｓｓで置換したｓｈＲＮＡＦ１ Ｕ３５ｓｓ、および、ｓｈＲＮＡＦ１のＵ３５をｓで置換したｓｈＲＮＡＦ１ Ｕ３５ｓ、を使用した。

所定量のｓｈＲＮＡをナイロンメンブレインに９６穴タイプの吸引マニホールドを利用してドットブロットした後、バイオイメージャーＬＡＳ４０００（富士フィルム）のＤＡＰＩモード（主波長３６５ｎｍのＵＶ−ＬＥＤ落射光源、検出フィルターＬ４１）でその蛍光を検出した結果を図８に示した。リン酸緩衝液中でｓＴＰ、ｓｓＴＰ、ＤｓｓＴＰを３６５ｎｍで励起した場合の蛍光極大波長は、それぞれ４３６ｎｍ、４６８ｎｍ、４５９ｎｍであり、その波長での蛍光強度はＤｓｓＴＰ＞ｓｓＴＰ＞ｓＴＰの順である。そして、ｓｈＲＮＡの検出感度もＵ３５Ｄｓｓ＞Ｕ３５ｓｓ＞Ｕ３５ｓの順となった。また、この蛍光はｓｈＲＮＡ量に比例して検出可能なことも確認できた（図８Ｂのグラフ）。さらには、この蛍光性人工塩基の基質およびｓｈＲＮＡは、ポリアクリルアミドゲル上でも定量的に検出できた（図９）。したがって、Ｄｓｓとｓｓの蛍光強度が濃度に依存して直線関係にあり、それぞれの蛍光強度からｓｈＲＮＡの定量、ならびにｓｈＲＮＡの同定や分解の過程を調べることが可能である。また、従来の蛍光性人工塩基ｓと比較して、Ｄｓｓ、ｓｓ共に感度が向上し、特に本実施例の条件ではＤｓｓの感度が著しく向上していることが明らかとなった。

実施例１６：細胞における蛍光性人工塩基を含むｓｈＲＮＡの蛍光観察
ｓｈＲＮＡＦ１のＡ３６をＤｓｓで置換したｓｈＲＮＡＦ１ Ａ３６ＤｓｓをＨｅＬａ細胞に５ｎＭまたは２５ｎＭでトランスフェクションして２０時間インキュベートした後、培地をＰＢＳに交換して蛍光顕微鏡（ニコン ＥＣＬＩＰＳＥ−Ｔｉ 蛍光倒立顕微鏡、落射蛍光用フィルタブロックＵＶ−１Ａ ｆｉｌｔｅｒ）で観察した。図１０に、その結果を示す蛍光顕微鏡写真を示す。ＵＶ励起によって観察された蛍光は、明視野で観察した細胞と重なっており、トランスフェクションにより細胞内に導入されたｓｈＲＮＡに含まれるＤｓｓの蛍光が観測できた。本実験により、数十ｎＭ量のｓｈＲＮＡを用いたトランスフェクションで細胞内での蛍光を観察可能であることが明らかになった。

以上実施例１２ないし１６の結果から、本発明の蛍光性人工塩基の転写による機能性ＲＮＡへの導入、それによる機能性ＲＮＡの活性保持、機能性ＲＮＡの蛍光標識が可能であることが明らかとなった。

本発明の蛍光性人工塩基と人工塩基対技術を用いることにより、ＤＮＡやＲＮＡの部位特異的蛍光標識化、核酸の立体構造の局部構造の解析、核酸医薬品の蛍光標識と動態検出、リアルタイムＰＣＲやＳＮＰ解析など、多彩な基礎・応用研究に利用可能である。

配列番号１： ＤＮＡ複製のためのテンプレート
配列番号２： ＤＮＡ複製のためのプライマー
配列番号３： 複製されたＤＮＡ
配列番号４： Ｔ７転写のためのテンプレートＤＮＡ
配列番号５： Ｔ７転写のためのプライマー
配列番号６： 転写されたＲＮＡ
配列番号７： 熱安定性試験のためのＤＮＡ
配列番号８： 熱安定性試験のためのＤＮＡ
配列番号９： 熱安定性試験のためのＤＮＡ
配列番号１０： ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを標的としたｓｈＲＮＡ
［配列表］

Claims (17)

1. 人工塩基またはその誘導体を含む化合物であって、式Ｉ：
   ［ここにおいて、
   Ａ^１は、Ｎ又はＣＨであり、
   Ａ^２はＣＨであり、
   Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
   Ｒ^２は、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
   で表される人工塩基又はその誘導体を含み、
   ここで、人工塩基の誘導体は、当該人工塩基のＲ ^１ のアミノ基がフェノキシアセチル基、イソブチリル基、又はジメチルホルムアミジル基で保護された誘導体であるか、Ｒ^２に含まれるチエニル基又はチアゾリル基が、メチル基、アミノ基、水酸基、チオール基によってさらに置換された誘導体であり、
   そして全体として式ＩＩ：
   ［ここにおいて、
   Ｒは、水素、メチル基、糖、リボース、デオキシリボースからなる群より選択される］
   で表される、前記化合物。
2. 以下：
   （ｉ）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）；
   （ｉｉ）７−（２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓｓ）；
   （ｉｉｉ）４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｓ）；
   （ｉｖ）４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｖ）；及び
   （ｖ）４−［５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｖａｓ）；
   からなる群より選択される基を含む、請求項１記載の化合物。
3. 人工塩基を有するヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体であって、人工塩基が式Ｉ：
   ［ここにおいて、
   Ａ^１は、Ｎ又はＣＨであり、
   Ａ^２はＣＨであり、
   Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
   Ｒ^２は、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
   で表されるものであり、
   ここで、人工塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドの誘導体は、ヌクレオシド又はヌクレオチドのホスホロアミダイト誘導体又はＨ−ホスホネート誘導体、ヌクレオシド又はヌクレオチドのアミノ基がフェノキシアセチル基、イソブチリル基、またはジメチルホルムアミジル基で保護された誘導体、ヌクレオシド又はヌクレオチドのヒドロキシル基がアセチル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トシル基、ｐ−トルオイル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、トリイソプロピルシリルオキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロフラニル基、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル基で保護された誘導体である、
   前記ヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。
4. 式Ｉで表される人工塩基が、以下：
   （ｉ）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）；
   （ｉｉ）７−｛２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル｝イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓｓ）；
   （ｉｉｉ）４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｓ）；
   （ｉｖ）４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｖ）；及び
   （ｖ）４−［５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｖａｓ）；
   からなる群より選択される、請求項３に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。
5. ヌクレオシドまたはヌクレオチドが、糖部分としてβ−Ｄ−リボフラノシルまたは２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシルを含む、請求項３又は４に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。
6. ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸またはリボヌクレオシド５’−三リン酸である、請求項３ないし５のいずれか１項に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。
7. ホスホロアミダイト誘導体である、請求項３ないし５のいずれか１項に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。
8. ２００ｎｍ以上の励起波長で蛍光を発する、請求項３ないし５のいずれか１項に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。
9. ユニバーサル塩基として使用される、請求項３ないし５のいずれか１項に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。
10. 請求項３ないし５のいずれか１項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸。
11. ２００ｎｍ以上の励起波長で蛍光を発する、請求項１０に記載の核酸。
12. 核酸が、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、デオキシリボザイム、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉誘導性核酸、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、抗ｍｉｃｒｏＲＮＡ核酸分子、デコイ核酸、ＤＮＡアプタマー、およびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される機能性核酸である、請求項１０又は１１に記載の核酸。
13. 核酸が、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＳＭＡＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＴＭＡ法、Padlock Probe法、ＲＣＡ法、ｂＤＮＡ法、ＰＡＬＳＡＲ法、Invader法、ＴＲＣ法、ＣＰＴ法、およびＰｌｅｘｏｒ法からなる群より選択される核酸増幅法に用いる増幅反応用プライマーである、請求項１０又は１１に記載の核酸。
14. 核酸が、モレキュラー・ビーコン、Ｔａｑｍａｎプローブ、Scorpion-basedプローブ、およびRiboswitchからなる群より選択される標的核酸検出用プローブである、請求項１０又は１１に記載の核酸。
15. 核酸模倣体であって、塩基部分に式Ｉ：
    ［ここにおいて、
    Ａ^１は、Ｎ又はＣＨであり、
    Ａ^２はＣＨであり、
    Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
    Ｒ^２は、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
    で表される人工塩基又はその誘導体を有し、
    ここで、人工塩基の誘導体は、当該人工塩基のアミノ基がフェノキシアセチル基、イソブチリル基、又はジメチルホルムアミジル基で保護された誘導体であるか、Ｒ^２に含まれるチエニル基又はチアゾリル基が、メチル基、アミノ基、水酸基、チオール基によってさらに置換された誘導体であり、そして
    骨格部分がモノフォリノヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される核酸模倣体の骨格である、
    前記核酸模倣体。
16. 式Ｉ：
    ［ここにおいて、
    Ａ^１は、Ｎ又はＣＨであり、
    Ａ^２はＣＨであり、
    Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
    Ｒ^２は、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
    で表される人工塩基又はその誘導体を、核酸の複製反応によりＤＮＡまたはＲＮＡ中に導入する方法であって、
    式ＩＩＩ：
    ［ここにおいて、Ｒは水素、ならびに、置換されたまたは置換されていないアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基からなる群より選択され、
    ここにおいて置換されたアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基は、機能性官能基または蛍光性官能基で置換されている］
    で表される塩基（以下、Ｐａ誘導体と記載する）を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型鎖として用い；
    複製基質として式Ｉの人工塩基を有するデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸又はリボヌクレオシド５’−三リン酸を用いて、核酸の複製反応、転写反応又は逆転写反応を行い；
    それにより塩基Ｐａ誘導体と式Ｉの人工塩基との塩基対を含む核酸が生成することにより、式Ｉの人工塩基を含むヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡ中に導入される；
    ここで、式Ｉで表される人工塩基の誘導体は、当該人工塩基のアミノ基がフェノキシアセチル基、イソブチリル基、又はジメチルホルムアミジル基で保護された誘導体であるか、Ｒ^２に含まれるチエニル基又はチアゾリル基が、メチル基、アミノ基、水酸基、チオール基によってさらに置換された誘導体である、
    前記方法。
17. 式Ｉ：
    ［ここにおいて、
    Ａ^１は、Ｎ又はＣＨであり、
    Ａ^２はＣＨであり、
    Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
    Ｒ^２は、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
    で表される人工塩基又はその誘導体を、化学合成によりＤＮＡ又はＲＮＡ中に導入する方法であって、
    式Ｉで表される人工塩基又はその誘導体を有するヌクレオシドのホスホロアミダイト誘導体を用いてＤＮＡ又はＲＮＡを合成することを含む、
    ここで、式Ｉで表される人工塩基の誘導体は、当該人工塩基のアミノ基がフェノキシアセチル基、イソブチリル基、又はジメチルホルムアミジル基で保護された誘導体であるか、Ｒ^２に含まれるチエニル基又はチアゾリル基が、メチル基、アミノ基、水酸基、チオール基によってさらに置換された誘導体である、
    前記方法。