JP2003034695A - 蛍光ヌクレオチド及びそれを用いた標識法 - Google Patents
蛍光ヌクレオチド及びそれを用いた標識法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 核酸の標識のために有用な新規な蛍光ヌク
レオチドを提供する。 【解決手段】 式：Ｘ−Ｙ−Ｚ［Ｘは天然又は非天然
のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオ
チドあるいはそれらの誘導体の残基を示し、上記残基中
の塩基部分でＹと結合し；Ｙは２価の連結基又は単結合
を示し；Ｚは式（Ｉ）（Ｒ1及びＲ2はアルキル基を示
し；Ｌ1〜Ｌ7はメチン基を示し；Ｗ1及びＷ2は酸素原
子、硫黄原子、−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−、又は−Ｎ(Ｒ5)−
（Ｒ3〜Ｒ5はアルキル基を示す）を示し；Ｍは対イオン
を示し；mは分子の電荷を中和するのに必要な数を示
し；ｓ、ｔ、及びｕは０又は１を示す）で表される化合
物から誘導される１価の基であり、Ｒ1又はＲ2中に存在
する反応性基でＹと結合する］で表される蛍光ヌクレオ
チド。 【化１】
レオチドを提供する。 【解決手段】 式：Ｘ−Ｙ−Ｚ［Ｘは天然又は非天然
のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオ
チドあるいはそれらの誘導体の残基を示し、上記残基中
の塩基部分でＹと結合し；Ｙは２価の連結基又は単結合
を示し；Ｚは式（Ｉ）（Ｒ1及びＲ2はアルキル基を示
し；Ｌ1〜Ｌ7はメチン基を示し；Ｗ1及びＷ2は酸素原
子、硫黄原子、−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−、又は−Ｎ(Ｒ5)−
（Ｒ3〜Ｒ5はアルキル基を示す）を示し；Ｍは対イオン
を示し；mは分子の電荷を中和するのに必要な数を示
し；ｓ、ｔ、及びｕは０又は１を示す）で表される化合
物から誘導される１価の基であり、Ｒ1又はＲ2中に存在
する反応性基でＹと結合する］で表される蛍光ヌクレオ
チド。 【化１】
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光標識試薬とし
て有用なホスホン酸基を含むシアニン色素及びそれを含
む蛍光ヌクレオチド並びにその利用に関するものであ
る。
て有用なホスホン酸基を含むシアニン色素及びそれを含
む蛍光ヌクレオチド並びにその利用に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】相同核酸配列の検出のために最も多く用
いられる分子生物学的方法の１つはＤＮＡ／ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成であ
る。この方法ではプローブとして用いる核酸（ＤＮＡ又
はＲＮＡ）を標識し、この標識された核酸を検出すべき
核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）とハイブリダイゼーションさ
せる。プローブとして用いた核酸と検出すべき核酸の間
に相同性が存在する場合、それぞれの相補的な１本鎖の
核酸がハイブリダイゼーションし、２本鎖が形成され、
その２本鎖をプローブの標識により検出する。
いられる分子生物学的方法の１つはＤＮＡ／ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成であ
る。この方法ではプローブとして用いる核酸（ＤＮＡ又
はＲＮＡ）を標識し、この標識された核酸を検出すべき
核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）とハイブリダイゼーションさ
せる。プローブとして用いた核酸と検出すべき核酸の間
に相同性が存在する場合、それぞれの相補的な１本鎖の
核酸がハイブリダイゼーションし、２本鎖が形成され、
その２本鎖をプローブの標識により検出する。
【０００３】従来より核酸をプローブとして用いる場
合、ラジオアイソトープでプローブを標識する方法が用
いられ、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーショ
ンの有無はオートラジオグラフィーにより検出されてい
た。遺伝子プローブを標識する際にラジオアイソトープ
を利用する方法は特に感度が高い点で優れているが、ラ
ジオアイソトープの取り扱いに付随して実験室の安全性
の確保及び放射性化合物の廃棄の問題という繁雑さが存
在していた。また、ラジオアイソトープは半減期を有す
るため、一定期間しか用いることができないという問題
点もあった。
合、ラジオアイソトープでプローブを標識する方法が用
いられ、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーショ
ンの有無はオートラジオグラフィーにより検出されてい
た。遺伝子プローブを標識する際にラジオアイソトープ
を利用する方法は特に感度が高い点で優れているが、ラ
ジオアイソトープの取り扱いに付随して実験室の安全性
の確保及び放射性化合物の廃棄の問題という繁雑さが存
在していた。また、ラジオアイソトープは半減期を有す
るため、一定期間しか用いることができないという問題
点もあった。
【０００４】上記理由から、より簡便な方法として非放
射性標識法が開発されてきており、例えば、遺伝子プロ
ーブをビオチン分子（欧州特許第６３８７９号明細書）
又はジゴキシゲニン分子（欧州特許公開第３２４４７４
Ａ１号）を用いて標識する方法が知られている。標識核
酸プローブと検出すべき核酸配列とのハイブリダイゼー
ションを行った後、形成された２本鎖核酸の中にはビオ
チン分子又はジゴキシゲニン分子が存在する。ハイブリ
ダイゼーション後、これらに対して（ストレプト）アビ
ジン−マーカー酵素複合体又はジゴキシゲニンへの抗ジ
ゴキシゲニン抗体−マーカー酵素複合体を結合すること
によって、プローブがハイブリダイゼーションした核酸
を検出することができる。しかしながら、このような酵
素を用いた検出法は、感度や特異性の面で十分なもので
はなかった。
射性標識法が開発されてきており、例えば、遺伝子プロ
ーブをビオチン分子（欧州特許第６３８７９号明細書）
又はジゴキシゲニン分子（欧州特許公開第３２４４７４
Ａ１号）を用いて標識する方法が知られている。標識核
酸プローブと検出すべき核酸配列とのハイブリダイゼー
ションを行った後、形成された２本鎖核酸の中にはビオ
チン分子又はジゴキシゲニン分子が存在する。ハイブリ
ダイゼーション後、これらに対して（ストレプト）アビ
ジン−マーカー酵素複合体又はジゴキシゲニンへの抗ジ
ゴキシゲニン抗体−マーカー酵素複合体を結合すること
によって、プローブがハイブリダイゼーションした核酸
を検出することができる。しかしながら、このような酵
素を用いた検出法は、感度や特異性の面で十分なもので
はなかった。
【０００５】また、上記方法以外にも、蛍光色素で標的
物質を標識する方法が種々研究されている。蛍光標識試
薬に求められる性能としては、（１）高い蛍光量子収率
を有すること、（２）高い分子吸光係数を有すること、
（３）水溶性で、かつ水性溶媒中で凝集して自己消光を
起こさないこと、（４）加水分解を受けにくいこと、
（５）光分解が起こりにくいこと、（６）バックグラウ
ンド蛍光の影響を受けにくいこと、（７）標的物質と共
有結合を生じさせる反応性置換基が導入されていること
などが挙げられる。蛍光標識試薬として古くから知られ
ているフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）、ローダミンイソチオシアネートは高い蛍光量子収
率を有するものの、分子吸光係数が低く、また励起及び
発光波長が５００ｎｍ−６００ｎｍであるため、例えば
ブロッティングに用いるメンブレンのバックグラウンド
蛍光の影響を受けやすいという欠点がある。
物質を標識する方法が種々研究されている。蛍光標識試
薬に求められる性能としては、（１）高い蛍光量子収率
を有すること、（２）高い分子吸光係数を有すること、
（３）水溶性で、かつ水性溶媒中で凝集して自己消光を
起こさないこと、（４）加水分解を受けにくいこと、
（５）光分解が起こりにくいこと、（６）バックグラウ
ンド蛍光の影響を受けにくいこと、（７）標的物質と共
有結合を生じさせる反応性置換基が導入されていること
などが挙げられる。蛍光標識試薬として古くから知られ
ているフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）、ローダミンイソチオシアネートは高い蛍光量子収
率を有するものの、分子吸光係数が低く、また励起及び
発光波長が５００ｎｍ−６００ｎｍであるため、例えば
ブロッティングに用いるメンブレンのバックグラウンド
蛍光の影響を受けやすいという欠点がある。
【０００６】分子吸光係数の高い色素としては、例えば
米国特許第５４８６６１６号明細書、特開平２−１９１
６７４号公報、同５−２８７２０９号公報、同５−２８
７２６６号公報、同８−４７４００号公報、同９−１２
７１１５号公報、同７−１４５１４８号公報、同６−２
２２０５９号公報に記載されたシアニン色素、Journalo
f Fluorescence, 5, 231ページ（1995年）に記載された
バルビツール酸オキソノール等のポリメチン色素が知ら
れているが、これらは水に溶けにくく、また溶解しても
加水分解が生じる等の問題がある。また、色素同士の分
子間相互作用が強いために水性媒体中で凝集体を生じ、
そのため蛍光の自己消光が観測される場合が多い。ま
た、特開平２−１９１６７４号公報等に記載されている
シアニン色素は比較的安定な発色団にスルホン酸基を導
入することで水溶性を付与し、かつ凝集体の形成を抑制
した優れた色素であるが、蛍光量子収率が充分に高いと
は言えず、またスルホン酸基の導入により色素の合成が
困難になるという問題点があった。このような状況か
ら、蛍光が強い特性に加えて、水溶性が高く安定で凝集
による蛍光消光が起こらない蛍光色素の開発が求められ
ていた。
米国特許第５４８６６１６号明細書、特開平２−１９１
６７４号公報、同５−２８７２０９号公報、同５−２８
７２６６号公報、同８−４７４００号公報、同９−１２
７１１５号公報、同７−１４５１４８号公報、同６−２
２２０５９号公報に記載されたシアニン色素、Journalo
f Fluorescence, 5, 231ページ（1995年）に記載された
バルビツール酸オキソノール等のポリメチン色素が知ら
れているが、これらは水に溶けにくく、また溶解しても
加水分解が生じる等の問題がある。また、色素同士の分
子間相互作用が強いために水性媒体中で凝集体を生じ、
そのため蛍光の自己消光が観測される場合が多い。ま
た、特開平２−１９１６７４号公報等に記載されている
シアニン色素は比較的安定な発色団にスルホン酸基を導
入することで水溶性を付与し、かつ凝集体の形成を抑制
した優れた色素であるが、蛍光量子収率が充分に高いと
は言えず、またスルホン酸基の導入により色素の合成が
困難になるという問題点があった。このような状況か
ら、蛍光が強い特性に加えて、水溶性が高く安定で凝集
による蛍光消光が起こらない蛍光色素の開発が求められ
ていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明の課題は、核酸の標識のために有用な新
規な蛍光ヌクレオチドを提供することにあり、より具体
的には、上記の従来技術の問題点を回避可能な蛍光ヌク
レオチドを提供することを課題としている。本発明者ら
は上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、
蛍光標識試薬としてホスホン酸基を有するシアニン色素
を用いてヌクレオチドとの複合体を形成し、その複合体
を用いて核酸を標識及び検出すると、核酸への取り込み
率及び検出の際の蛍光強度が優れていることを見出し、
本発明を完成するに至った。
の手段】本発明の課題は、核酸の標識のために有用な新
規な蛍光ヌクレオチドを提供することにあり、より具体
的には、上記の従来技術の問題点を回避可能な蛍光ヌク
レオチドを提供することを課題としている。本発明者ら
は上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、
蛍光標識試薬としてホスホン酸基を有するシアニン色素
を用いてヌクレオチドとの複合体を形成し、その複合体
を用いて核酸を標識及び検出すると、核酸への取り込み
率及び検出の際の蛍光強度が優れていることを見出し、
本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は、式：Ｘ−Ｙ−Ｚ
［式中、Ｘは天然又は非天然のヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチド又はポリヌクレオチドあるいはそれらの誘導
体の残基を示し、上記残基中の塩基部分でＹと結合し；
Ｙは２価の連結基又は単結合を示し；Ｚは下記の一般式
（Ｉ）：
クレオチド又はポリヌクレオチドあるいはそれらの誘導
体の残基を示し、上記残基中の塩基部分でＹと結合し；
Ｙは２価の連結基又は単結合を示し；Ｚは下記の一般式
（Ｉ）：
【化２】
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に置換もしくは無置
換のアルキル基を示し；Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、
Ｌ6、及びＬ7はそれぞれ独立に置換又は無置換のメチン
基を示し；Ｗ1及びＷ2はそれぞれ独立に酸素原子、硫黄
原子、−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ 4)−、又は−Ｎ(Ｒ5)−（Ｒ3、
Ｒ4、及びＲ5はそれぞれ独立に置換若しくは無置換のア
ルキル基を示す）を示し；Ｍは対イオンを示し；mは分
子の電荷を中和するのに必要な数を示し；ｓは０又は１
を示し；ｔは０又は１を示し；ｕは０又は１を示す）で
表される化合物から誘導される１価の基であり、Ｒ1又
はＲ2中に存在する反応性基でＹと結合する］で表され
る蛍光ヌクレオチドを提供するものである。
換のアルキル基を示し；Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、
Ｌ6、及びＬ7はそれぞれ独立に置換又は無置換のメチン
基を示し；Ｗ1及びＷ2はそれぞれ独立に酸素原子、硫黄
原子、−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ 4)−、又は−Ｎ(Ｒ5)−（Ｒ3、
Ｒ4、及びＲ5はそれぞれ独立に置換若しくは無置換のア
ルキル基を示す）を示し；Ｍは対イオンを示し；mは分
子の電荷を中和するのに必要な数を示し；ｓは０又は１
を示し；ｔは０又は１を示し；ｕは０又は１を示す）で
表される化合物から誘導される１価の基であり、Ｒ1又
はＲ2中に存在する反応性基でＹと結合する］で表され
る蛍光ヌクレオチドを提供するものである。
【０００９】本発明の好ましい態様によれば、Ｒ1及び
Ｒ2のうち少なくとも一つがＹ中の活性エステル基（該
活性エステル基はアミノ基、ヒドロキシル基、又はチオ
ール基と共有結合し得る）で置換されたアルキル基であ
る上記の蛍光ヌクレオチド；Ｒ1及びＲ2のうち少なくと
も一つがＹ中のカルボキシル基で置換されたアルキル基
である上記の蛍光ヌクレオチド；及びＸがヌクレオチド
あるいはそれらの誘導体の残基である上記の蛍光ヌクレ
オチドが提供される。
Ｒ2のうち少なくとも一つがＹ中の活性エステル基（該
活性エステル基はアミノ基、ヒドロキシル基、又はチオ
ール基と共有結合し得る）で置換されたアルキル基であ
る上記の蛍光ヌクレオチド；Ｒ1及びＲ2のうち少なくと
も一つがＹ中のカルボキシル基で置換されたアルキル基
である上記の蛍光ヌクレオチド；及びＸがヌクレオチド
あるいはそれらの誘導体の残基である上記の蛍光ヌクレ
オチドが提供される。
【００１０】より好ましい態様によれば、Ｘが
（１）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴ
Ｐ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ ＵＴ
Ｐ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−
Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、
１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭ
Ｐ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ
−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰ
（Ｍｅはメチル基、ＭｅＯはメトキシ基を示し、Ｍｅ又
はＭｅＯの前の数字は置換位置を示す）からなる群から
選ばれるヌクレオチド、（２）上記の（１）に記載のヌ
クレオチドに対応するデオキシヌクレオチド及びジデオ
キシヌクレオチドからなる群から選ばれるヌクレオチ
ド；及び（３）上記の（１）及び（２）に記載のヌクレ
オチドから誘導されるヌクレオチド誘導体からなる群か
ら選ばれるヌクレオチド又はその誘導体の残基である上
記の蛍光ヌクレオチド；Ｙが−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ
−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ
−、又はこれらの基の任意の組み合わせからなるなる連
結基（該連結基上の水素原子は他の置換基で置換されて
いてもよい）である上記の蛍光ヌクレオチド；及びＹが
アミノアリル基である上記の蛍光ヌクレオチドが提供さ
れる。
Ｐ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ ＵＴ
Ｐ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−
Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、
１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭ
Ｐ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ
−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰ
（Ｍｅはメチル基、ＭｅＯはメトキシ基を示し、Ｍｅ又
はＭｅＯの前の数字は置換位置を示す）からなる群から
選ばれるヌクレオチド、（２）上記の（１）に記載のヌ
クレオチドに対応するデオキシヌクレオチド及びジデオ
キシヌクレオチドからなる群から選ばれるヌクレオチ
ド；及び（３）上記の（１）及び（２）に記載のヌクレ
オチドから誘導されるヌクレオチド誘導体からなる群か
ら選ばれるヌクレオチド又はその誘導体の残基である上
記の蛍光ヌクレオチド；Ｙが−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ
−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ
−、又はこれらの基の任意の組み合わせからなるなる連
結基（該連結基上の水素原子は他の置換基で置換されて
いてもよい）である上記の蛍光ヌクレオチド；及びＹが
アミノアリル基である上記の蛍光ヌクレオチドが提供さ
れる。
【００１１】別の観点からは、核酸合成酵素、鋳型核
酸、及び上記の蛍光ヌクレオチドを用いて核酸合成反応
を行う工程を含む蛍光標識された核酸の製造方法が本発
明により提供される。この方法の好ましい態様によれ
ば、核酸合成反応が逆転写反応、ターミナルトランスフ
ェラーゼ反応、ランダムプライム法、ＰＣＲ法、及びニ
ックトランスレーション法からなる群から選ばれる１又
は２以上の反応である上記の方法が提供される。
酸、及び上記の蛍光ヌクレオチドを用いて核酸合成反応
を行う工程を含む蛍光標識された核酸の製造方法が本発
明により提供される。この方法の好ましい態様によれ
ば、核酸合成反応が逆転写反応、ターミナルトランスフ
ェラーゼ反応、ランダムプライム法、ＰＣＲ法、及びニ
ックトランスレーション法からなる群から選ばれる１又
は２以上の反応である上記の方法が提供される。
【００１２】さらに別の観点からは、上記の蛍光ヌクレ
オチドで標識された核酸プローブ又はプライマー；上記
の核酸プローブ又はプライマーからなる核酸検出用試
薬；病気の診断に用いるための上記の核酸検出用試薬；
及び核酸検出用キットであって、（１）上記の蛍光ヌク
レオチド、（２）核酸合成酵素、及び（３）緩衝液を含
むキットが提供される。また、上記の蛍光ヌクレオチド
の製造のための上記一般式（Ｉ）で表される化合物の使
用；上記の核酸プローブ又はプライマーの製造のための
上記一般式（Ｉ）で表される化合物の使用；上記の核酸
検出用試薬の製造のための上記一般式（Ｉ）で表される
化合物の使用；及び病気の診断方法であって、ヒトを含
む哺乳類動物から採取された生体試料に上記の核酸検出
用試薬を接触させる工程を含む方法が本発明により提供
される。
オチドで標識された核酸プローブ又はプライマー；上記
の核酸プローブ又はプライマーからなる核酸検出用試
薬；病気の診断に用いるための上記の核酸検出用試薬；
及び核酸検出用キットであって、（１）上記の蛍光ヌク
レオチド、（２）核酸合成酵素、及び（３）緩衝液を含
むキットが提供される。また、上記の蛍光ヌクレオチド
の製造のための上記一般式（Ｉ）で表される化合物の使
用；上記の核酸プローブ又はプライマーの製造のための
上記一般式（Ｉ）で表される化合物の使用；上記の核酸
検出用試薬の製造のための上記一般式（Ｉ）で表される
化合物の使用；及び病気の診断方法であって、ヒトを含
む哺乳類動物から採取された生体試料に上記の核酸検出
用試薬を接触させる工程を含む方法が本発明により提供
される。
【００１３】
【発明の実施の形態】Ｘが示す天然又は非天然のヌクレ
オチドとしては、例えば、（１）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴ
Ｐ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴ
Ｐ、ＵＭＰ、ＵＤＰ ＵＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴ
Ｐ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−
ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍ
ｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５
−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−Ｃ
ＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰ（Ｍｅはメチル基、ＭｅＯは
メトキシ基を示し、Ｍｅ又はＭｅＯの前の数字は置換位
置を示す）で表されるヌクレオチド、（２）前記ヌクレ
オチドに対応するデオキシヌクレオチド、及び前記ヌク
レオチドに対応するジデオキシヌクレオチド、並びに
（３）前記（１）及び（２）に記載のヌクレオチドから
さらに誘導される誘導体などを挙げることができるが、
これらに限定されることはない。天然又は非天然のヌク
レオチドの具体例としては、例えば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、
ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄ
ｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＵＴＰ、又はこれらの誘導
体などを挙げることができるが、これらに限定されるこ
とはない。
オチドとしては、例えば、（１）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴ
Ｐ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴ
Ｐ、ＵＭＰ、ＵＤＰ ＵＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴ
Ｐ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−
ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍ
ｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５
−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−Ｃ
ＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰ（Ｍｅはメチル基、ＭｅＯは
メトキシ基を示し、Ｍｅ又はＭｅＯの前の数字は置換位
置を示す）で表されるヌクレオチド、（２）前記ヌクレ
オチドに対応するデオキシヌクレオチド、及び前記ヌク
レオチドに対応するジデオキシヌクレオチド、並びに
（３）前記（１）及び（２）に記載のヌクレオチドから
さらに誘導される誘導体などを挙げることができるが、
これらに限定されることはない。天然又は非天然のヌク
レオチドの具体例としては、例えば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、
ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄ
ｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＵＴＰ、又はこれらの誘導
体などを挙げることができるが、これらに限定されるこ
とはない。
【００１４】オリゴヌクレオチドとしては、例えば、上
記のヌクレオチド又はその誘導体が１から５０個程度、
好ましくは１から３０個程度、さらに好ましくは１から
２０個程度重合したオリゴヌクレオチドを挙げることが
でき、構成単位の各ヌクレオチドは同一でも相違してい
てもよい。ポリヌクレオチドとは、上記ヌクレオチド又
はその誘導体が多数重合した重合体であり、その大きさ
（長さ）は特に限定されないが、例えば塩基数として数
ｂｐから数ｋｂに至るものでもよい。本明細書で用いる
蛍光ヌクレオチドと言う用語は、核酸成分が上記したよ
うなヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレ
オチドである場合の全てを包含し、最も広義に解釈しな
ければならない。
記のヌクレオチド又はその誘導体が１から５０個程度、
好ましくは１から３０個程度、さらに好ましくは１から
２０個程度重合したオリゴヌクレオチドを挙げることが
でき、構成単位の各ヌクレオチドは同一でも相違してい
てもよい。ポリヌクレオチドとは、上記ヌクレオチド又
はその誘導体が多数重合した重合体であり、その大きさ
（長さ）は特に限定されないが、例えば塩基数として数
ｂｐから数ｋｂに至るものでもよい。本明細書で用いる
蛍光ヌクレオチドと言う用語は、核酸成分が上記したよ
うなヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレ
オチドである場合の全てを包含し、最も広義に解釈しな
ければならない。
【００１５】Ｘはヌクレオチド残基中の塩基部分でＹと
結合する。ヌクレオチド残基の塩基部分としては、プリ
ン誘導体とピリミジン誘導体が挙げられる。プリン塩基
中における連結基Ｙとの結合部位は、糖成分と結合する
９位以外であれば特に制限されない。例えば、プリン塩
基がアデニンの場合には２位又は８位で結合することが
でき、あるいは６位に存在するアミノ基で連結基Ｙと結
合することができる。プリン塩基がグアニンの場合には
１位又は８位で結合することができ、あるいは２位に存
在するアミノ基で連結基Ｙと結合することができる。ピ
リミジン塩基中における連結基Ｙとの結合部位は、糖成
分と結合する１位以外であれば特に限定されない。例え
ばピリミジン塩基がシトシンの場合には５位又は６位で
結合することができ、あるいは４位に存在するアミノ基
で連結基Ｙと結合することができ、ピリミジン塩基がチ
ミンの場合には３位又は６位で結合することができ、あ
るいは５位に存在するメチル基で連結基Ｙと結合するこ
とができる。また、ピリミジン塩基がウラシルの場合に
は３位、５位又は６位で連結基Ｙと結合することができ
る。
結合する。ヌクレオチド残基の塩基部分としては、プリ
ン誘導体とピリミジン誘導体が挙げられる。プリン塩基
中における連結基Ｙとの結合部位は、糖成分と結合する
９位以外であれば特に制限されない。例えば、プリン塩
基がアデニンの場合には２位又は８位で結合することが
でき、あるいは６位に存在するアミノ基で連結基Ｙと結
合することができる。プリン塩基がグアニンの場合には
１位又は８位で結合することができ、あるいは２位に存
在するアミノ基で連結基Ｙと結合することができる。ピ
リミジン塩基中における連結基Ｙとの結合部位は、糖成
分と結合する１位以外であれば特に限定されない。例え
ばピリミジン塩基がシトシンの場合には５位又は６位で
結合することができ、あるいは４位に存在するアミノ基
で連結基Ｙと結合することができ、ピリミジン塩基がチ
ミンの場合には３位又は６位で結合することができ、あ
るいは５位に存在するメチル基で連結基Ｙと結合するこ
とができる。また、ピリミジン塩基がウラシルの場合に
は３位、５位又は６位で連結基Ｙと結合することができ
る。
【００１６】上記式中、Ｙは２価の連結基又は単結合を
示す。連結基の種類は、本発明の蛍光ヌクレオチドの性
質、例えば蛍光ヌクレオチドの化合物としての安定性、
水溶性、核酸への取込み率、又は蛍光強度などに大きな
影響をもたらさない限り、特に限定されない。当業者は
Ｘで表されるヌクレオチド部分とＺで表される蛍光化合
物部分とを連結するために適した２価の連結基を適宜選
択することができる。連結基Ｙとしては、例えば、−Ｃ
Ｈ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ
−、−Ｓ−、−ＮＨ−又はこれらの組み合わせからなる
連結基を挙げることができ、これらの連結基上の１個又
は２個以上の水素原子は他の置換基で置換されていても
よい。連結基の主鎖の炭素数は特に限定されないが、一
般的には１から５０、好ましくは１から２０、より好ま
しくは１から１０、特に好ましくは１から５程度であ
る。
示す。連結基の種類は、本発明の蛍光ヌクレオチドの性
質、例えば蛍光ヌクレオチドの化合物としての安定性、
水溶性、核酸への取込み率、又は蛍光強度などに大きな
影響をもたらさない限り、特に限定されない。当業者は
Ｘで表されるヌクレオチド部分とＺで表される蛍光化合
物部分とを連結するために適した２価の連結基を適宜選
択することができる。連結基Ｙとしては、例えば、−Ｃ
Ｈ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ
−、−Ｓ−、−ＮＨ−又はこれらの組み合わせからなる
連結基を挙げることができ、これらの連結基上の１個又
は２個以上の水素原子は他の置換基で置換されていても
よい。連結基の主鎖の炭素数は特に限定されないが、一
般的には１から５０、好ましくは１から２０、より好ま
しくは１から１０、特に好ましくは１から５程度であ
る。
【００１７】Ｚは上記一般式（Ｉ）で表される色素から
誘導される１価の基であり、Ｒ1又はＲ2中に存在する反
応性基でＹと結合する。
誘導される１価の基であり、Ｒ1又はＲ2中に存在する反
応性基でＹと結合する。
【００１８】一般式（Ｉ）において、Ｒ1及びＲ2は互い
に同一でも異なっていてもよく、好ましくは炭素原子数
が１から２０のアルキル基を示す。アルキル基は直鎖
状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれ
でもよい（本明細書において、他のアルキル基、又はア
ルキル部分を有する他の置換基のアルキル部分について
も同様である）。例えば、メチル基、エチル基、n−プ
ロピル基、ブチル基、シクロヘキシル基などを挙げるこ
とができる。上記のアルキル基は任意の位置に置換基を
有していてもよい。アルキル基上の置換基は特に制限は
ないが、色素を抗体、タンパク、ペプチド、酵素基質、
ホルモン、リンフォカイン、代謝産物、レセプター、抗
原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプタビジ
ン、トキシン、炭水化物、多糖類、核酸、デオキシ核
酸、誘導核酸、誘導デオキシ核酸、DNAフラグメント、R
NAフラグメント、誘導DNAフラグメント、誘導RNAフラグ
メント、天然薬物、ウイルス粒子、バクテリア粒子、ウ
イルス成分、イースト成分、血液細胞、血液細胞成分、
バクテリア、バクテリア成分、天然から合成脂質、合成
薬物、毒薬、環境汚染物質、重合体、重合体粒子、ガラ
ス粒子、プラスチック粒子、重合体膜等を含む物質上に
共有結合、イオン結合、水素結合等により標識するため
の反応性置換基が導入されていることが好ましい。
に同一でも異なっていてもよく、好ましくは炭素原子数
が１から２０のアルキル基を示す。アルキル基は直鎖
状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれ
でもよい（本明細書において、他のアルキル基、又はア
ルキル部分を有する他の置換基のアルキル部分について
も同様である）。例えば、メチル基、エチル基、n−プ
ロピル基、ブチル基、シクロヘキシル基などを挙げるこ
とができる。上記のアルキル基は任意の位置に置換基を
有していてもよい。アルキル基上の置換基は特に制限は
ないが、色素を抗体、タンパク、ペプチド、酵素基質、
ホルモン、リンフォカイン、代謝産物、レセプター、抗
原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプタビジ
ン、トキシン、炭水化物、多糖類、核酸、デオキシ核
酸、誘導核酸、誘導デオキシ核酸、DNAフラグメント、R
NAフラグメント、誘導DNAフラグメント、誘導RNAフラグ
メント、天然薬物、ウイルス粒子、バクテリア粒子、ウ
イルス成分、イースト成分、血液細胞、血液細胞成分、
バクテリア、バクテリア成分、天然から合成脂質、合成
薬物、毒薬、環境汚染物質、重合体、重合体粒子、ガラ
ス粒子、プラスチック粒子、重合体膜等を含む物質上に
共有結合、イオン結合、水素結合等により標識するため
の反応性置換基が導入されていることが好ましい。
【００１９】反応性置換基の種類は特に限定されない
が、例えば、サクシンイミジルエステル基、ハロゲン置
換トリアジニル基、ハロゲン置換ピリミジニル基、スル
ホニルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル
基、アジリジニル基等である。その他の置換基として
は、例えば、ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭
素、ヨウ素）、メルカプト基、シアノ基、ニトロ基、カ
ルボキシル基、リン酸基、スルホ基、ヒドロキシ基、ア
ミノ基、イソチオシアナート基、イソシアナート基、炭
素原子数が１から８程度のアルコキシ基（例えば、メト
キシ基、エトキシ基など）、炭素原子数が６から２０程
度のアリールオキシ基（例えば、フェノキシ基、ナフト
キシ基など）、炭素原子数が２から１０程度のアルコキ
シカルボニル基（例えば、メトキシカルボニル基、エト
キシカルボニル基）、炭素原子数６から２０程度のアリ
ーロキシカルボニル基（例えば、フェノキシカルボニル
基など）、炭素原子数が２から１０程度のアシル基（例
えば、アセチル基、ピバロイル基など）、炭素原子数が
２から８程度のアシルオキシ基（例えば、アセチルオキ
シ基、ベンゾイルオキシ基など）、炭素原子数が２から
８程度のアシルアミノ基（例えば、アセチルアミノ基な
ど）、炭素原子数１から８程度のスルホニル基（例え
ば、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基、ベンゼ
ンスルホニル基など）、炭素原子数が１から２０程度の
スルフィニル基（例えば、メタンスルフィニル基、エタ
ンスルフィニル基、ベンゼンスルフィニル基など）、炭
素原子数が１から８程度のスルホニルアミノ基（例え
ば、メタンスルホニルアミノ基、エタンスルホニルアミ
ノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基など）、炭素原子数
が１から１０程度のカルバモイル基（例えば、カルバモ
イル基、メチルカルバモイル基、モリホリノカルバモイ
ル基など）、炭素原子数が１から２０程度の置換アミノ
基（例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ベン
ジルアミノ基、アニリノ基、ジフェニルアミノ基な
ど）、
が、例えば、サクシンイミジルエステル基、ハロゲン置
換トリアジニル基、ハロゲン置換ピリミジニル基、スル
ホニルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル
基、アジリジニル基等である。その他の置換基として
は、例えば、ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭
素、ヨウ素）、メルカプト基、シアノ基、ニトロ基、カ
ルボキシル基、リン酸基、スルホ基、ヒドロキシ基、ア
ミノ基、イソチオシアナート基、イソシアナート基、炭
素原子数が１から８程度のアルコキシ基（例えば、メト
キシ基、エトキシ基など）、炭素原子数が６から２０程
度のアリールオキシ基（例えば、フェノキシ基、ナフト
キシ基など）、炭素原子数が２から１０程度のアルコキ
シカルボニル基（例えば、メトキシカルボニル基、エト
キシカルボニル基）、炭素原子数６から２０程度のアリ
ーロキシカルボニル基（例えば、フェノキシカルボニル
基など）、炭素原子数が２から１０程度のアシル基（例
えば、アセチル基、ピバロイル基など）、炭素原子数が
２から８程度のアシルオキシ基（例えば、アセチルオキ
シ基、ベンゾイルオキシ基など）、炭素原子数が２から
８程度のアシルアミノ基（例えば、アセチルアミノ基な
ど）、炭素原子数１から８程度のスルホニル基（例え
ば、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基、ベンゼ
ンスルホニル基など）、炭素原子数が１から２０程度の
スルフィニル基（例えば、メタンスルフィニル基、エタ
ンスルフィニル基、ベンゼンスルフィニル基など）、炭
素原子数が１から８程度のスルホニルアミノ基（例え
ば、メタンスルホニルアミノ基、エタンスルホニルアミ
ノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基など）、炭素原子数
が１から１０程度のカルバモイル基（例えば、カルバモ
イル基、メチルカルバモイル基、モリホリノカルバモイ
ル基など）、炭素原子数が１から２０程度の置換アミノ
基（例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ベン
ジルアミノ基、アニリノ基、ジフェニルアミノ基な
ど）、
【００２０】炭素数２から１０程度のスルファモイル基
（例えば、メチルスルファモイル基、エチルスルファモ
イル基、ピペリジノスルファモイル基など）、炭素原子
数が０から１５程度のアンモニウム基（例えば、トリメ
チルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基な
ど）、炭素原子数が０から１５程度のヒドラジノ基（例
えば、トリメチルヒドラジノ基など）、炭素原子数が１
から１５程度のウレイド基（例えば、ウレイド基、N,N-
ジメチルウレイド基など）、炭素原子数が１から１５程
度のイミド基（例えば、スクシンイミド基など）、炭素
原子数が１から２０程度のアルキルチオ基（例えば、メ
チルチオ基、エチルチオ基など）、炭素原子数６から２
０のアリールチオ基（例えば、フェニルチオ基、p-メチ
ルフェニルチオ基、p-クロロフェニルチオ基、２−ピリ
ジルチオ基、ナフチルチオ基など）、炭素原子数が１か
ら２０程度の置換又は無置換のヘテロ環基（例えば、ピ
リジル基、５−メチルピリジル基、チエニル基、フリル
基、モルホリノ基、テトラヒドロフリル基、２−ピラジ
ル基など）、炭素原子数が２から１８程度の不飽和炭化
水素基（例えば、ビニル基、エチニル基、１−シクロヘ
キセニル基、ベンジリジン基、ベンジリデン基など）、
炭素原子数が６から２０程度のアリール基（例えば、フ
ェニル基、４−スルホフェニル基、２，５−ジスルホフ
ェニル基、４−カルボキシフェニル基、ナフチル基な
ど）、炭素原子数が１から２０程度のアルキル基（例え
ば、メチル基、エチル基、プロピル基など）が挙げられ
る。
（例えば、メチルスルファモイル基、エチルスルファモ
イル基、ピペリジノスルファモイル基など）、炭素原子
数が０から１５程度のアンモニウム基（例えば、トリメ
チルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基な
ど）、炭素原子数が０から１５程度のヒドラジノ基（例
えば、トリメチルヒドラジノ基など）、炭素原子数が１
から１５程度のウレイド基（例えば、ウレイド基、N,N-
ジメチルウレイド基など）、炭素原子数が１から１５程
度のイミド基（例えば、スクシンイミド基など）、炭素
原子数が１から２０程度のアルキルチオ基（例えば、メ
チルチオ基、エチルチオ基など）、炭素原子数６から２
０のアリールチオ基（例えば、フェニルチオ基、p-メチ
ルフェニルチオ基、p-クロロフェニルチオ基、２−ピリ
ジルチオ基、ナフチルチオ基など）、炭素原子数が１か
ら２０程度の置換又は無置換のヘテロ環基（例えば、ピ
リジル基、５−メチルピリジル基、チエニル基、フリル
基、モルホリノ基、テトラヒドロフリル基、２−ピラジ
ル基など）、炭素原子数が２から１８程度の不飽和炭化
水素基（例えば、ビニル基、エチニル基、１−シクロヘ
キセニル基、ベンジリジン基、ベンジリデン基など）、
炭素原子数が６から２０程度のアリール基（例えば、フ
ェニル基、４−スルホフェニル基、２，５−ジスルホフ
ェニル基、４−カルボキシフェニル基、ナフチル基な
ど）、炭素原子数が１から２０程度のアルキル基（例え
ば、メチル基、エチル基、プロピル基など）が挙げられ
る。
【００２１】Ｒ1及びＲ2として、カルボキシル基、イソ
チオシアナート基、サクシンイミジルエステル基、スル
ホニルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル
基、スルホン酸基又はその塩が置換した炭素原子数１か
ら１０のアルキル基が好ましく、さらに好ましくはカル
ボキシル基、イソチオシアナート基、サクシンイミジル
エステル基、スルホン酸基又はその塩が置換した炭素原
子数１から６のアルキル基、あるいはスルホ基、カルボ
キシル基、イソチオシアナート基、サクシンイミジルエ
ステル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル
基、又はマレイミジル基が置換した炭素原子数７から２
０のアリールアルキル基である。
チオシアナート基、サクシンイミジルエステル基、スル
ホニルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル
基、スルホン酸基又はその塩が置換した炭素原子数１か
ら１０のアルキル基が好ましく、さらに好ましくはカル
ボキシル基、イソチオシアナート基、サクシンイミジル
エステル基、スルホン酸基又はその塩が置換した炭素原
子数１から６のアルキル基、あるいはスルホ基、カルボ
キシル基、イソチオシアナート基、サクシンイミジルエ
ステル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル
基、又はマレイミジル基が置換した炭素原子数７から２
０のアリールアルキル基である。
【００２２】一般式（Ｉ）において、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ
5は好ましくは炭素原子数が１から２０のアルキル基で
あり、アルキル基上の任意の位置にＲ1及びＲ2で例示し
た置換基を有していてもよい。また、Ｒ3とＲ4は互いに
連結して飽和の炭素環を形成してもよい。Ｒ3、Ｒ4、及
びＲ5としては炭素原子数1から６のアルキル基が好まし
く、さらに好ましくは炭素原子数１から３のアルキル基
である。
5は好ましくは炭素原子数が１から２０のアルキル基で
あり、アルキル基上の任意の位置にＲ1及びＲ2で例示し
た置換基を有していてもよい。また、Ｒ3とＲ4は互いに
連結して飽和の炭素環を形成してもよい。Ｒ3、Ｒ4、及
びＲ5としては炭素原子数1から６のアルキル基が好まし
く、さらに好ましくは炭素原子数１から３のアルキル基
である。
【００２３】一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）中の
Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、及びＬ7はそれぞれ独
立に置換又は無置換のメチン基を表わす。置換基として
は例えば、置換又は無置換の炭素原子数１から１５、好
ましくは炭素原子数１から１０、特に好ましくは炭素原
子数１から５のアルキル基（例えば、メチル基、エチル
基、カルボキシエチル基など）、置換又は無置換の炭素
原子数６から３０、好ましくは炭素原子数６から２０、
さらに好ましくは炭素原子数６から１５のアリール基
（例えば、フェニル基、o-カルボキシフェニル基な
ど）、置換又は無置換の炭素原子数３から２０、好まし
くは炭素原子数４から１５、さらに好ましくは炭素原子
数６から１０の複素環基（例えば、N,N−ジメチルバル
ビツール酸基など）、ハロゲン原子（例えば、塩素、臭
素、ヨウ素、フッ素など）、炭素原子数１から２０、好
ましくは１から１５、さらに好ましくは１から１０のア
ルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基など）、
炭素原子数０から２０、好ましくは炭素原子数２から１
５、さらに好ましくは炭素原子数４から１５のアミノ基
（例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、N-メチ
ル-N-フェニルアミノ基、N-メチルピペラジノ基な
ど）、炭素原子数１から１５、好ましくは炭素原子数１
から１０、さらに好ましくは炭素数１から８のアルキル
チオ基（例えば、メチルチオ基、エチルチオ基など）、
炭素原子数６から２０、好ましくは炭素原子数６から１
８、さらに好ましくは炭素原子数６から１５のアリール
チオ基（例えば、フェニルチオ基、p-メチルチオ基な
ど）等が挙げられる。ｓ、ｔ、及びｕはそれぞれ独立に
０又は１を示す。ｓが０であり、ｔ及びｕが１である場
合、又はｓ及びｔが０であり、ｕが１である場合が好ま
しい。
Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、及びＬ7はそれぞれ独
立に置換又は無置換のメチン基を表わす。置換基として
は例えば、置換又は無置換の炭素原子数１から１５、好
ましくは炭素原子数１から１０、特に好ましくは炭素原
子数１から５のアルキル基（例えば、メチル基、エチル
基、カルボキシエチル基など）、置換又は無置換の炭素
原子数６から３０、好ましくは炭素原子数６から２０、
さらに好ましくは炭素原子数６から１５のアリール基
（例えば、フェニル基、o-カルボキシフェニル基な
ど）、置換又は無置換の炭素原子数３から２０、好まし
くは炭素原子数４から１５、さらに好ましくは炭素原子
数６から１０の複素環基（例えば、N,N−ジメチルバル
ビツール酸基など）、ハロゲン原子（例えば、塩素、臭
素、ヨウ素、フッ素など）、炭素原子数１から２０、好
ましくは１から１５、さらに好ましくは１から１０のア
ルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基など）、
炭素原子数０から２０、好ましくは炭素原子数２から１
５、さらに好ましくは炭素原子数４から１５のアミノ基
（例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、N-メチ
ル-N-フェニルアミノ基、N-メチルピペラジノ基な
ど）、炭素原子数１から１５、好ましくは炭素原子数１
から１０、さらに好ましくは炭素数１から８のアルキル
チオ基（例えば、メチルチオ基、エチルチオ基など）、
炭素原子数６から２０、好ましくは炭素原子数６から１
８、さらに好ましくは炭素原子数６から１５のアリール
チオ基（例えば、フェニルチオ基、p-メチルチオ基な
ど）等が挙げられる。ｓ、ｔ、及びｕはそれぞれ独立に
０又は１を示す。ｓが０であり、ｔ及びｕが１である場
合、又はｓ及びｔが０であり、ｕが１である場合が好ま
しい。
【００２４】Ｍは対イオンを表わす。Ｍは陽イオンでも
陰イオンでもよく、陽イオンとしてはナトリウムイオ
ン、カリウムイオン、リチウムイオンなどのアルカリ金
属イオン、テトラアルキルアンモニウムイオン、ピリジ
ニウムイオンなどの有機イオンが挙げられる。陰イオン
は無機陰イオンあるいは有機陰イオンのいずれであって
もよく、ハロゲン陰イオン（例えば、フッ素イオン、塩
素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなど）、置換アリ
ールスルホン酸イオン（例えば、p-トルエンスルホン酸
イオン、p-クロルベンゼンスルホン酸イオンなど）、ア
リールジスルホン酸イオン（例えば、1,3-ベンゼンジス
ルホン酸イオン、1,5-ナフタレンジスルホン酸イオンな
ど）、アルキル硫酸イオン（例えば、メチル硫酸イオン
など）、硫酸イオン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イ
オン、テトラフルオロホウ酸イオン、ピクリン酸イオ
ン、酢酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン
などが挙げられる。また、Ｍは水素イオンでもよい。陽
イオンとして、好ましくはアンモニウムイオン、アルカ
リ金属イオン、ハロゲン陰イオン、置換アリールスルホ
ン酸イオンを挙げることができ、さらに好ましくはアル
カリ金属イオン、ハロゲン陰イオン、置換アリールスル
ホン酸イオンを挙げることができる。ｍは分子の電荷を
中和するのに必要な数を表わす。
陰イオンでもよく、陽イオンとしてはナトリウムイオ
ン、カリウムイオン、リチウムイオンなどのアルカリ金
属イオン、テトラアルキルアンモニウムイオン、ピリジ
ニウムイオンなどの有機イオンが挙げられる。陰イオン
は無機陰イオンあるいは有機陰イオンのいずれであって
もよく、ハロゲン陰イオン（例えば、フッ素イオン、塩
素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなど）、置換アリ
ールスルホン酸イオン（例えば、p-トルエンスルホン酸
イオン、p-クロルベンゼンスルホン酸イオンなど）、ア
リールジスルホン酸イオン（例えば、1,3-ベンゼンジス
ルホン酸イオン、1,5-ナフタレンジスルホン酸イオンな
ど）、アルキル硫酸イオン（例えば、メチル硫酸イオン
など）、硫酸イオン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イ
オン、テトラフルオロホウ酸イオン、ピクリン酸イオ
ン、酢酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン
などが挙げられる。また、Ｍは水素イオンでもよい。陽
イオンとして、好ましくはアンモニウムイオン、アルカ
リ金属イオン、ハロゲン陰イオン、置換アリールスルホ
ン酸イオンを挙げることができ、さらに好ましくはアル
カリ金属イオン、ハロゲン陰イオン、置換アリールスル
ホン酸イオンを挙げることができる。ｍは分子の電荷を
中和するのに必要な数を表わす。
【００２５】一般式（Ｉ）において、Ｗ1及びＷ2は同一
でも異なっていてもよく、酸素原子、硫黄原子、又は−
Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−が好ましく、酸素原子及び−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ
4)−がさらに好ましい。
でも異なっていてもよく、酸素原子、硫黄原子、又は−
Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−が好ましく、酸素原子及び−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ
4)−がさらに好ましい。
【００２６】一般式（Ｉ）で表される化合物は置換基の
種類に応じて１以上の不斉炭素を有する場合があるが、
光学異性体やジアステレオ異性体などの立体異性体、立
体異性体の混合物、ラセミ体などのいずれの場合も本発
明の範囲に包含される。また、一般式（Ｉ）で表される
化合物は水和物又は溶媒和物を形成する場合があるが、
これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。
種類に応じて１以上の不斉炭素を有する場合があるが、
光学異性体やジアステレオ異性体などの立体異性体、立
体異性体の混合物、ラセミ体などのいずれの場合も本発
明の範囲に包含される。また、一般式（Ｉ）で表される
化合物は水和物又は溶媒和物を形成する場合があるが、
これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。
【００２７】上記一般式（Ｉ）で表される化合物の好ま
しい例を以下に示すが、本発明の範囲は下記の具体的化
合物によって限定されることはない。
しい例を以下に示すが、本発明の範囲は下記の具体的化
合物によって限定されることはない。
【００２８】
【化３】
【００２９】
【化４】
【００３０】
【化５】
【００３１】
【化６】
【００３２】
【化７】
【００３３】
【化８】
【００３４】
【化９】
【００３５】
【化１０】
【００３６】上記一般式（Ｉ）で表される化合物は以下
の方法で製造することができる。 （１）ホスホン酸置換ベンゾアゾール類をBull. Chem.
Soc. Jpn., 55, 909(1982)に記載の公知の方法により製
造する。ホスホン酸置換ベンゾアゾールは対応するブロ
モ置換ベンゾアゾール類とジエチルホスファイト、トリ
エチルアミンなどの塩基、ゼロ価のパラジウム触媒を作
用させることによりホスホン酸エステル置換ベンゾアゾ
ール類に誘導し、引き続き、酸又は塩基存在下の加水分
解によりホスホン酸置換体を得ることができる。 （２）ホスホン酸置換ベンゾアゾール類をエフ・エム・
ハーマー(F.M. Harmer)著「ヘテロサイクリック・コン
パウンズ−シアニンダイズ・アンド・リレイテッド・コ
ンパウンズ(Heterocyclic Compounds-Cyanine Dyes and
Related Compounds)」、ジョン・ウイリー・アンド・
サンズ（John Wiley & Sons）社−ニューヨーク、ロン
ドン、１９６４年刊、ディー、エム・スターマー（D.M.
Sturmer）著「ヘテロサイクリック・コンパウンズ−ス
ペシャル・トピックス・イン・ヘテロサイクリック・ケ
ミストリー(Heterocyclic Compounds-Special Topics i
n Heterocyclic Chemistry)」、第１８章、第１４節、
４８２から５１５頁、ジョン・ウイリー・アンド・サン
ズ（John Wiley & Sons）社−ニューヨーク、ロンド
ン、１９７７年刊、「ロッズ・ケミストリー・オブ・カ
ーボン・コンパウンズ（Rodd's Chemistry of Carbon C
ompounds）第２版、ボリュームＩＶ、パートＢ、第１５
章、３６９から４２２頁、エルセビア・サイエンス・パ
ブリック・カンパニー・インク（Elsevier Science Pub
lishing Company Inc.）社−ニューヨーク、１９７７年
刊などに記載の方法に従い色素に誘導することができ
る。
の方法で製造することができる。 （１）ホスホン酸置換ベンゾアゾール類をBull. Chem.
Soc. Jpn., 55, 909(1982)に記載の公知の方法により製
造する。ホスホン酸置換ベンゾアゾールは対応するブロ
モ置換ベンゾアゾール類とジエチルホスファイト、トリ
エチルアミンなどの塩基、ゼロ価のパラジウム触媒を作
用させることによりホスホン酸エステル置換ベンゾアゾ
ール類に誘導し、引き続き、酸又は塩基存在下の加水分
解によりホスホン酸置換体を得ることができる。 （２）ホスホン酸置換ベンゾアゾール類をエフ・エム・
ハーマー(F.M. Harmer)著「ヘテロサイクリック・コン
パウンズ−シアニンダイズ・アンド・リレイテッド・コ
ンパウンズ(Heterocyclic Compounds-Cyanine Dyes and
Related Compounds)」、ジョン・ウイリー・アンド・
サンズ（John Wiley & Sons）社−ニューヨーク、ロン
ドン、１９６４年刊、ディー、エム・スターマー（D.M.
Sturmer）著「ヘテロサイクリック・コンパウンズ−ス
ペシャル・トピックス・イン・ヘテロサイクリック・ケ
ミストリー(Heterocyclic Compounds-Special Topics i
n Heterocyclic Chemistry)」、第１８章、第１４節、
４８２から５１５頁、ジョン・ウイリー・アンド・サン
ズ（John Wiley & Sons）社−ニューヨーク、ロンド
ン、１９７７年刊、「ロッズ・ケミストリー・オブ・カ
ーボン・コンパウンズ（Rodd's Chemistry of Carbon C
ompounds）第２版、ボリュームＩＶ、パートＢ、第１５
章、３６９から４２２頁、エルセビア・サイエンス・パ
ブリック・カンパニー・インク（Elsevier Science Pub
lishing Company Inc.）社−ニューヨーク、１９７７年
刊などに記載の方法に従い色素に誘導することができ
る。
【００３７】本明細書の実施例に代表的化合物の製造方
法を具体的に示したので、当業者は下記の実施例の具体
的説明を参照しつつ、原料化合物、反応条件、試薬など
を適宜選択し、必要に応じて実施例に記載した方法に修
飾ないし改変を加えることによって、上記一般式
（Ｉ））に包含される任意の化合物を製造することが可
能である。もっとも、上記一般式Ｉ）で表される化合物
の製造方法は特に限定されず、いかなる方法により製造
したものも本発明で使用できることは言うまでもない。
法を具体的に示したので、当業者は下記の実施例の具体
的説明を参照しつつ、原料化合物、反応条件、試薬など
を適宜選択し、必要に応じて実施例に記載した方法に修
飾ないし改変を加えることによって、上記一般式
（Ｉ））に包含される任意の化合物を製造することが可
能である。もっとも、上記一般式Ｉ）で表される化合物
の製造方法は特に限定されず、いかなる方法により製造
したものも本発明で使用できることは言うまでもない。
【００３８】上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、本
発明の蛍光ヌクレオチドにおいて蛍光標識成分として使
用される。ヌクレオチドに一般式（Ｉ）で表される化合
物を蛍光標識として導入するための手法は種々知られて
おり、当業者に利用可能な手段を適宜選択して利用する
ことが可能である。例えば、ヌクレオチド中のアミノ
基、水酸基などの官能基と一般式（Ｉ）で表される化合
物中のカルボキシル基、活性エステル基等の反応性置換
基をイオン結合的又は共有結合的に直接結合させるか、
あるいはヌクレオチドの一部に連結基を導入するなどの
化学修飾を行った後に一般式（Ｉ）の化合物を反応させ
ればよい。反応後に生成した蛍光ヌクレオチドは、クロ
マトグラフィー、電気泳動、再結晶などの汎用の分離技
術により精製することができる。
発明の蛍光ヌクレオチドにおいて蛍光標識成分として使
用される。ヌクレオチドに一般式（Ｉ）で表される化合
物を蛍光標識として導入するための手法は種々知られて
おり、当業者に利用可能な手段を適宜選択して利用する
ことが可能である。例えば、ヌクレオチド中のアミノ
基、水酸基などの官能基と一般式（Ｉ）で表される化合
物中のカルボキシル基、活性エステル基等の反応性置換
基をイオン結合的又は共有結合的に直接結合させるか、
あるいはヌクレオチドの一部に連結基を導入するなどの
化学修飾を行った後に一般式（Ｉ）の化合物を反応させ
ればよい。反応後に生成した蛍光ヌクレオチドは、クロ
マトグラフィー、電気泳動、再結晶などの汎用の分離技
術により精製することができる。
【００３９】本発明はさらに、本発明の蛍光ヌクレオチ
ドの利用にも関する。すなわち、本発明の蛍光ヌクレオ
チドは核酸の検出のために利用することができる。本発
明の蛍光ヌクレオチドを核酸の検出などのＤＮＡ解析に
用いる場合には、例えば、ルース（Jerry L. Ruth, DN
A, 3, 123 (1984)）に記載の方法でプローブ又はプライ
マーに本発明の蛍光ヌクレオチドを取り込ませることが
できる。すなわち、本発明により、核酸合成酵素と鋳型
核酸と本発明の蛍光ヌクレオチドとを用いて核酸合成反
応を行う工程を含む蛍光標識された核酸の調製方法が提
供される。
ドの利用にも関する。すなわち、本発明の蛍光ヌクレオ
チドは核酸の検出のために利用することができる。本発
明の蛍光ヌクレオチドを核酸の検出などのＤＮＡ解析に
用いる場合には、例えば、ルース（Jerry L. Ruth, DN
A, 3, 123 (1984)）に記載の方法でプローブ又はプライ
マーに本発明の蛍光ヌクレオチドを取り込ませることが
できる。すなわち、本発明により、核酸合成酵素と鋳型
核酸と本発明の蛍光ヌクレオチドとを用いて核酸合成反
応を行う工程を含む蛍光標識された核酸の調製方法が提
供される。
【００４０】本発明の方法において用いられる核酸合成
酵素としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（Klenow酵
素、TaqＤＮＡポリメラーゼなど任意のＤＮＡポリメラ
ーゼを含む）、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素又はタ
ーミナルトランスフェラーゼなどが挙げられるが、これ
らに限定されることはない。鋳型核酸の種類は特に限定
されず、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよい。天然由
来のＤＮＡ又はＲＮＡのほか、組み換えＤＮＡ又はＲＮ
Ａあるいは化学合成ＤＮＡ又はＲＮＡなどの非天然型Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡであってもよい（本明細書において「核
酸」と言う場合にも同様である）。核酸合成反応は、例
えば、鋳型ＤＮＡ、非蛍光のヌクレオチド混合物、本発
明の蛍光ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を用いて、酵
素反応に適した条件下（塩濃度、ｐＨ、温度などの条件
を含む）において行うことができる。このような核酸合
成法は当業者に周知であり、標識の目的などに応じて、
使用する材料や試薬などは当業者ならば適宜選択するこ
とができる。
酵素としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（Klenow酵
素、TaqＤＮＡポリメラーゼなど任意のＤＮＡポリメラ
ーゼを含む）、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素又はタ
ーミナルトランスフェラーゼなどが挙げられるが、これ
らに限定されることはない。鋳型核酸の種類は特に限定
されず、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよい。天然由
来のＤＮＡ又はＲＮＡのほか、組み換えＤＮＡ又はＲＮ
Ａあるいは化学合成ＤＮＡ又はＲＮＡなどの非天然型Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡであってもよい（本明細書において「核
酸」と言う場合にも同様である）。核酸合成反応は、例
えば、鋳型ＤＮＡ、非蛍光のヌクレオチド混合物、本発
明の蛍光ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を用いて、酵
素反応に適した条件下（塩濃度、ｐＨ、温度などの条件
を含む）において行うことができる。このような核酸合
成法は当業者に周知であり、標識の目的などに応じて、
使用する材料や試薬などは当業者ならば適宜選択するこ
とができる。
【００４１】本発明の蛍光ヌクレオチドを用いて種々の
手段により核酸を標識することができる。ランダムプラ
イム法はＤＮＡを標識するための一つ方法であり、任意
の組み合わせのヘキサヌクレオチド配列の混合物をプラ
イマー（ランダムプライマー）として使用し、このラン
ダムプライマーを標識すべき核酸にハイブリダイゼーシ
ョンさせる工程を含む。このランダムプライマーの3'-O
H末端から出発し、１本鎖に相補的な鎖をKlenow酵素な
どのＤＮＡポリメラーゼ又は他のＤＮＡポリメラーゼを
用いて合成するが、その際ＤＮＡポリメラーゼの基質で
ある４種のデオキシリボヌクレオチドが相補鎖中に挿入
される。これらのデオキシリボヌクレオチドの少なくと
も１種として本発明の蛍光ヌクレオチドを用いることに
より、蛍光ヌクレオチドで標識された相補的ＤＮＡが合
成される。
手段により核酸を標識することができる。ランダムプラ
イム法はＤＮＡを標識するための一つ方法であり、任意
の組み合わせのヘキサヌクレオチド配列の混合物をプラ
イマー（ランダムプライマー）として使用し、このラン
ダムプライマーを標識すべき核酸にハイブリダイゼーシ
ョンさせる工程を含む。このランダムプライマーの3'-O
H末端から出発し、１本鎖に相補的な鎖をKlenow酵素な
どのＤＮＡポリメラーゼ又は他のＤＮＡポリメラーゼを
用いて合成するが、その際ＤＮＡポリメラーゼの基質で
ある４種のデオキシリボヌクレオチドが相補鎖中に挿入
される。これらのデオキシリボヌクレオチドの少なくと
も１種として本発明の蛍光ヌクレオチドを用いることに
より、蛍光ヌクレオチドで標識された相補的ＤＮＡが合
成される。
【００４２】ランダムプライマーの代わりに、特異的配
列を有するオリゴＤＮＡ（特異的プライマー）を用いる
ことができる。特異的プライマーは鋳型ＤＮＡ中の相補
的領域に結合し、鋳型ＤＮＡに対する相補的ＤＮＡの合
成は特異的プライマーの3'-OH末端から開始される。ラ
ンダムプライム法の場合と同様に、相補的ＤＮＡが合成
される際に本発明の蛍光ヌクレオチドが取込まれること
により、蛍光標識された相補的ＤＮＡが合成される。
列を有するオリゴＤＮＡ（特異的プライマー）を用いる
ことができる。特異的プライマーは鋳型ＤＮＡ中の相補
的領域に結合し、鋳型ＤＮＡに対する相補的ＤＮＡの合
成は特異的プライマーの3'-OH末端から開始される。ラ
ンダムプライム法の場合と同様に、相補的ＤＮＡが合成
される際に本発明の蛍光ヌクレオチドが取込まれること
により、蛍光標識された相補的ＤＮＡが合成される。
【００４３】ニックトランスレーション法は、ＤＮアー
ゼＩの２本鎖ＤＮＡへの作用を利用した方法である。Ｄ
ＮアーゼＩの作用により鋳型２本鎖ＤＮＡの１本鎖に切
断される箇所が生じる。同時に大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩと、この酵素の基質である４種のデオキシリボヌク
レオチドと、本発明の蛍光ヌクレオチドとを反応混合物
中に添加しておく。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩは、切
断された１本鎖の５’−末端デオキシリボヌクレオシド
を切断し、同時に基質のデオキシリボヌクレオチド１個
を遊離している3'-OH末端の隣接に挿入する。この過程
を繰り返すことにより切断部位が３’末端に移動してい
く。基質のヌクレオチド中に本発明の蛍光ヌクレオチド
を含めることによって、ニックトランスレーション法を
用いて蛍光ＤＮＡを合成することができる。
ゼＩの２本鎖ＤＮＡへの作用を利用した方法である。Ｄ
ＮアーゼＩの作用により鋳型２本鎖ＤＮＡの１本鎖に切
断される箇所が生じる。同時に大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩと、この酵素の基質である４種のデオキシリボヌク
レオチドと、本発明の蛍光ヌクレオチドとを反応混合物
中に添加しておく。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩは、切
断された１本鎖の５’−末端デオキシリボヌクレオシド
を切断し、同時に基質のデオキシリボヌクレオチド１個
を遊離している3'-OH末端の隣接に挿入する。この過程
を繰り返すことにより切断部位が３’末端に移動してい
く。基質のヌクレオチド中に本発明の蛍光ヌクレオチド
を含めることによって、ニックトランスレーション法を
用いて蛍光ＤＮＡを合成することができる。
【００４４】２本鎖又は１本鎖ＤＮＡの３’末端を標識
する場合には、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌク
レオチドを3'-OH末端に結合する酵素であるターミナル
トランスフェラーゼを用いることができる。ターミナル
トランスフェラーゼは少なくとも１種のデオキシリボヌ
クレオチド又はリボヌクレオチドを基質として必要とす
る。本発明の蛍光ヌクレオチドをターミナルトランスフ
ェラーゼの基質として用いることによって、3'-OH末端
で伸長された蛍光標識核酸を合成することができる。
する場合には、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌク
レオチドを3'-OH末端に結合する酵素であるターミナル
トランスフェラーゼを用いることができる。ターミナル
トランスフェラーゼは少なくとも１種のデオキシリボヌ
クレオチド又はリボヌクレオチドを基質として必要とす
る。本発明の蛍光ヌクレオチドをターミナルトランスフ
ェラーゼの基質として用いることによって、3'-OH末端
で伸長された蛍光標識核酸を合成することができる。
【００４５】逆転写反応法は１本鎖ＲＮＡから相補的Ｄ
ＮＡを合成する反応である。先ず、プライマーとしてオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをＲＮＡの相補的部分に
アニーリングさせた後に、逆転写酵素を用いて伸長反応
を行うことによって、ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖がプ
ライマーの3'-OH末端から出発して合成される。このＤ
ＮＡ合成においても４種のデオキシリボヌクレオチドが
酵素基質として使用され、本発明の蛍光ヌクレオチドを
その中に添加しておくことによって逆転写反応中に蛍光
ヌクレオチドが伸長していくＤＮＡ鎖に挿入され、蛍光
標識ＤＮＡが合成される。
ＮＡを合成する反応である。先ず、プライマーとしてオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをＲＮＡの相補的部分に
アニーリングさせた後に、逆転写酵素を用いて伸長反応
を行うことによって、ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖がプ
ライマーの3'-OH末端から出発して合成される。このＤ
ＮＡ合成においても４種のデオキシリボヌクレオチドが
酵素基質として使用され、本発明の蛍光ヌクレオチドを
その中に添加しておくことによって逆転写反応中に蛍光
ヌクレオチドが伸長していくＤＮＡ鎖に挿入され、蛍光
標識ＤＮＡが合成される。
【００４６】ＤＮＡからＲＮＡを合成する酵素を用い
て、本発明の蛍光ヌクレオチドで標識されたＲＮＡを合
成することもできる。ＤＮＡからＲＮＡを合成する酵素
としては、ＳＰ６、Ｔ３又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼな
どのファージによりコードされるＲＮＡポリメラーゼを
挙げることができる。これらの酵素はＳＰ６、Ｔ３又は
Ｔ７プロモーターを含む２本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡ合
成のための酵素であり、基質としての４種類のリボヌク
レオチドが使用される。基質の一つとして本発明の蛍光
ヌクレオチドを使用することによって、蛍光標識された
ＲＮＡを合成することができる。
て、本発明の蛍光ヌクレオチドで標識されたＲＮＡを合
成することもできる。ＤＮＡからＲＮＡを合成する酵素
としては、ＳＰ６、Ｔ３又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼな
どのファージによりコードされるＲＮＡポリメラーゼを
挙げることができる。これらの酵素はＳＰ６、Ｔ３又は
Ｔ７プロモーターを含む２本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡ合
成のための酵素であり、基質としての４種類のリボヌク
レオチドが使用される。基質の一つとして本発明の蛍光
ヌクレオチドを使用することによって、蛍光標識された
ＲＮＡを合成することができる。
【００４７】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて
本発明の蛍光ヌクレオチドで標識された核酸を合成する
こともできる。ＰＣＲでは、生物試料中の検出すべき核
酸は１本鎖に変性され、２種のプライマーがこの一本鎖
核酸にアニーリングする。アニーリング後、ポリメラー
ゼ(好ましくはTaqＤＮＡポリメラーゼ)及び酵素基質と
してのデオキシリボヌクレオチドにより伸長反応を行
う。プライマーの3'-OH末端から出発して相補的ＤＮＡ
が合成され、二本鎖ＤＮＡが形成される。この工程を繰
り返すことにより、試料中に含まれる検出すべきＤＮＡ
を増幅することができる。TaqＤＮＡポリメラーゼによ
る伸長反応の際に、基質の一つとして本発明の蛍光ヌク
レオチドを用いることにより、蛍光標識された増幅核酸
が得られる。
本発明の蛍光ヌクレオチドで標識された核酸を合成する
こともできる。ＰＣＲでは、生物試料中の検出すべき核
酸は１本鎖に変性され、２種のプライマーがこの一本鎖
核酸にアニーリングする。アニーリング後、ポリメラー
ゼ(好ましくはTaqＤＮＡポリメラーゼ)及び酵素基質と
してのデオキシリボヌクレオチドにより伸長反応を行
う。プライマーの3'-OH末端から出発して相補的ＤＮＡ
が合成され、二本鎖ＤＮＡが形成される。この工程を繰
り返すことにより、試料中に含まれる検出すべきＤＮＡ
を増幅することができる。TaqＤＮＡポリメラーゼによ
る伸長反応の際に、基質の一つとして本発明の蛍光ヌク
レオチドを用いることにより、蛍光標識された増幅核酸
が得られる。
【００４８】上記のようにして調製された、本発明の蛍
光ヌクレオチドで標識された蛍光核酸は、ハイブリダイ
ゼーションによる相同核酸配列の検出のための遺伝子プ
ローブとして用いることができる。標的核酸のハイブリ
ダイズした蛍光ヌクレオチドは、蛍光強度計で蛍光強度
を測定することにより容易に検出することができる。
光ヌクレオチドで標識された蛍光核酸は、ハイブリダイ
ゼーションによる相同核酸配列の検出のための遺伝子プ
ローブとして用いることができる。標的核酸のハイブリ
ダイズした蛍光ヌクレオチドは、蛍光強度計で蛍光強度
を測定することにより容易に検出することができる。
【００４９】本発明の蛍光ヌクレオチドは遺伝子プロー
ブの標識のために用いることができ、該プローブは核酸
検出用の試薬、とりわけヒトを含む哺乳類動物の病気を
診断するための診断薬として有用である。本発明の蛍光
ヌクレオチドで標識されたプローブを核酸検出用の試薬
又は診断薬として用いる場合には、１種又は２種以上の
添加物を配合して試薬組成物の形態で供給することがで
きる。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、防腐
剤など適宜の添加物を用いて、溶液剤などの所望の形態
の試薬を調製することができる。試薬の形態及びその製
造方法は、当業者が適宜選択可能である。上記の診断薬
はヒトを含む哺乳類動物に経口的又は非経口的に投与す
ることもできるが、ヒトを含む哺乳類動物から分離・採
取された血液、尿、唾液などの生体試料を上記診断薬に
接触させることにより、遺伝子異常を伴う疾患の診断な
どが可能になる。
ブの標識のために用いることができ、該プローブは核酸
検出用の試薬、とりわけヒトを含む哺乳類動物の病気を
診断するための診断薬として有用である。本発明の蛍光
ヌクレオチドで標識されたプローブを核酸検出用の試薬
又は診断薬として用いる場合には、１種又は２種以上の
添加物を配合して試薬組成物の形態で供給することがで
きる。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、防腐
剤など適宜の添加物を用いて、溶液剤などの所望の形態
の試薬を調製することができる。試薬の形態及びその製
造方法は、当業者が適宜選択可能である。上記の診断薬
はヒトを含む哺乳類動物に経口的又は非経口的に投与す
ることもできるが、ヒトを含む哺乳類動物から分離・採
取された血液、尿、唾液などの生体試料を上記診断薬に
接触させることにより、遺伝子異常を伴う疾患の診断な
どが可能になる。
【００５０】本発明の蛍光ヌクレオチドは、上記した核
酸合成反応に使用する酵素、並びに緩衝液などと一緒
に、核酸検出用キットの形態で供給することもできる。
キットに含めるべき試薬の種類はキットの目的に応じて
適宜選択することができ、蛍光ヌクレオチド、核酸合成
酵素、及び緩衝液に加えて、必要に応じて１種類以上
（好ましくは４種類）の非蛍光のヌクレオチド混合物、
精製水などをキットに含めてもよい。ランダムプライマ
ー、オリゴｄＴプライマー、あるいは目的に応じた特異
的プライマーなどのプライマーをキットに含めることも
できる。
酸合成反応に使用する酵素、並びに緩衝液などと一緒
に、核酸検出用キットの形態で供給することもできる。
キットに含めるべき試薬の種類はキットの目的に応じて
適宜選択することができ、蛍光ヌクレオチド、核酸合成
酵素、及び緩衝液に加えて、必要に応じて１種類以上
（好ましくは４種類）の非蛍光のヌクレオチド混合物、
精製水などをキットに含めてもよい。ランダムプライマ
ー、オリゴｄＴプライマー、あるいは目的に応じた特異
的プライマーなどのプライマーをキットに含めることも
できる。
【００５１】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。 合成例１：化合物Ｉ−１の合成 化合物Ｉ−１は以下に示すルートにより合成した。
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。 合成例１：化合物Ｉ−１の合成 化合物Ｉ−１は以下に示すルートにより合成した。
【化１１】
【００５２】（化合物Ｉ−１ｆの合成）化合物Ｉ−１ｇ
(4.1 g, 17.2 mmol)にトルエン (4 ml)、トリエチルア
ミン(2.6ml)、ジエチルホスファイト(2.4 ml)、テトラ
キストリフェニルホスフィンパラジウム (995 mg)を加
え、９０℃にて３時間反応させた。反応液を酢酸エチル
で抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより
精製し、化合物Ｉ−１ｆを得た。 収量：2.3 g、収率：45％ H-NMR (CDCl3) δ；7.76 (m,2H), 7.61 (m,1H), 4.13
(m,4H), 2.32 (s,3H), 1.32 (m,9H)
(4.1 g, 17.2 mmol)にトルエン (4 ml)、トリエチルア
ミン(2.6ml)、ジエチルホスファイト(2.4 ml)、テトラ
キストリフェニルホスフィンパラジウム (995 mg)を加
え、９０℃にて３時間反応させた。反応液を酢酸エチル
で抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより
精製し、化合物Ｉ−１ｆを得た。 収量：2.3 g、収率：45％ H-NMR (CDCl3) δ；7.76 (m,2H), 7.61 (m,1H), 4.13
(m,4H), 2.32 (s,3H), 1.32 (m,9H)
【００５３】（化合物Ｉ−１ｅの合成）化合物Ｉ−１ｆ
(2.3 g, 7 mmol)に濃塩酸 5 mlを加え、２時間加熱還流
を行った。反応液を減圧濃縮後、酢酸エチルを加えて生
じる結晶をろ取して化合物Ｉ−１ｅを得た。 収量：2.3 g、収率：45％ H-NMR (CDCl3) δ；7.91 (d,1H), 7.75 (dd,1H), 7.65
(m,1H), 2.59 (s,3H),1.44 (s,6H)
(2.3 g, 7 mmol)に濃塩酸 5 mlを加え、２時間加熱還流
を行った。反応液を減圧濃縮後、酢酸エチルを加えて生
じる結晶をろ取して化合物Ｉ−１ｅを得た。 収量：2.3 g、収率：45％ H-NMR (CDCl3) δ；7.91 (d,1H), 7.75 (dd,1H), 7.65
(m,1H), 2.59 (s,3H),1.44 (s,6H)
【００５４】（化合物Ｉ−１ｄの合成）化合物Ｉ−１ｅ
(0.5 g, 2 mmol)に6-ブロモヘキサン酸エチル(1 ml)、
トリエチルアミン(0.29 ml)、ジメチルアセトアミド(0.
5 ml)を加えて１００℃にて３時間反応させた。反応液
に反応後酢酸エチル(10 ml)を加えて生じるオイル成分
をデカンテーションにより分離させて化合物Ｉ−１ｄを
得た。 収量：0.53 g、収率：70％ mass(posi):301
(0.5 g, 2 mmol)に6-ブロモヘキサン酸エチル(1 ml)、
トリエチルアミン(0.29 ml)、ジメチルアセトアミド(0.
5 ml)を加えて１００℃にて３時間反応させた。反応液
に反応後酢酸エチル(10 ml)を加えて生じるオイル成分
をデカンテーションにより分離させて化合物Ｉ−１ｄを
得た。 収量：0.53 g、収率：70％ mass(posi):301
【００５５】（化合物Ｉ−１ｃの合成）化合物Ｉ−１ｅ
(2.4 g, 10 mmol)にプロパンサルト(1.3 g, 10 mmol)、
ジメチルアセトアミド(2 ml)を加えて１００℃にて３時
間反応させた。反応液に反応後酢酸エチル(10 ml)を加
えると化合物Ｉ−１ｃが析出した。 収量：3.0 g、収率：85％ mass(nega):360
(2.4 g, 10 mmol)にプロパンサルト(1.3 g, 10 mmol)、
ジメチルアセトアミド(2 ml)を加えて１００℃にて３時
間反応させた。反応液に反応後酢酸エチル(10 ml)を加
えると化合物Ｉ−１ｃが析出した。 収量：3.0 g、収率：85％ mass(nega):360
【００５６】（化合物Ｉ−１ｂ（アニル体）の合成）化
合物Ｉ−１ｃ(3.6 g, 10 mmol)に無水酢酸(10 ml)とN,
N'-ジフェニルホルムアミジン(3.9 g, 20 mmol)を加え
て１００℃にて３０分反応させた。反応液に反応後酢酸
エチル(50 ml)とヘキサン(50 ml)を加えて生じるオイル
成分をデカンテーションにより分離させ、シリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーにより化合物Ｉ−１ｂ（アニル
体）を単離した。 収量：2.3 g、収率：50％ mass(nega): 463
合物Ｉ−１ｃ(3.6 g, 10 mmol)に無水酢酸(10 ml)とN,
N'-ジフェニルホルムアミジン(3.9 g, 20 mmol)を加え
て１００℃にて３０分反応させた。反応液に反応後酢酸
エチル(50 ml)とヘキサン(50 ml)を加えて生じるオイル
成分をデカンテーションにより分離させ、シリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーにより化合物Ｉ−１ｂ（アニル
体）を単離した。 収量：2.3 g、収率：50％ mass(nega): 463
【００５７】（化合物Ｉ−１ａの合成）化合物Ｉ−１ｂ
(0.46 g, 1 mmol)と化合物Ｉ−１ｄ(0.38 g, 1 mmol)を
DMF(5 ml)に溶解しトリエチルアミン(0.5 ml)および無
水酢酸(0.5 ml)を加え、60℃で1時間反応させた。反応
液に酢酸エチル(50 ml)を加えると結晶が析出した。そ
の粗結晶をゲル濾過（SEPHADEX LH-20）により精製し、
化合物Ｉ−１ａを得た。 mass(nega): 751 吸収極大（メタノール）：555 nm 分子吸光係数：140000
(0.46 g, 1 mmol)と化合物Ｉ−１ｄ(0.38 g, 1 mmol)を
DMF(5 ml)に溶解しトリエチルアミン(0.5 ml)および無
水酢酸(0.5 ml)を加え、60℃で1時間反応させた。反応
液に酢酸エチル(50 ml)を加えると結晶が析出した。そ
の粗結晶をゲル濾過（SEPHADEX LH-20）により精製し、
化合物Ｉ−１ａを得た。 mass(nega): 751 吸収極大（メタノール）：555 nm 分子吸光係数：140000
【００５８】（化合物Ｉ−１の合成）前記化合物Ｉ−１
ａ全量をメタノール(10 ml)に溶解し、５%水酸化リチウ
ム水溶液(5 ml)を加えて室温で2時間反応させた。反応
液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(10 ml)を加えた後
メタノールを減圧濃縮すると化合物Ｉ−１の粗結晶が析
出する。粗結晶をメタノールに溶解し、大過剰の酢酸カ
リウムを加え、加熱、濃縮した後、ゲル濾過（SEPHADEX
LH-20）により精製し、化合物Ｉ−１を得た。 収量：0.33 g、収率：42％（I-1bより） mass(posi):761 吸収極大（メタノール）：555nm 分子吸光係数：145000
ａ全量をメタノール(10 ml)に溶解し、５%水酸化リチウ
ム水溶液(5 ml)を加えて室温で2時間反応させた。反応
液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(10 ml)を加えた後
メタノールを減圧濃縮すると化合物Ｉ−１の粗結晶が析
出する。粗結晶をメタノールに溶解し、大過剰の酢酸カ
リウムを加え、加熱、濃縮した後、ゲル濾過（SEPHADEX
LH-20）により精製し、化合物Ｉ−１を得た。 収量：0.33 g、収率：42％（I-1bより） mass(posi):761 吸収極大（メタノール）：555nm 分子吸光係数：145000
【００５９】合成例２：化合物II−１の合成
化合物I−１ｂの合成において用いた N,N'-ジフェニル
ホルムアミジンを3-アニリノ−アクリルアルデヒドフェ
ニルイミンに置き換え、他の工程は化合物I−１の合成
法に準じて化合物II−１を合成した。 mass(posi):761 吸収極大（メタノール）：648nm 分子吸光係数：210000
ホルムアミジンを3-アニリノ−アクリルアルデヒドフェ
ニルイミンに置き換え、他の工程は化合物I−１の合成
法に準じて化合物II−１を合成した。 mass(posi):761 吸収極大（メタノール）：648nm 分子吸光係数：210000
【００６０】合成例３
具体的に示した他の色素についてはBull. Chem. Soc. J
pn., 55, 909(1982)およびエフ・エム・ハーマー(F.M.
Harmer)著「ヘテロサイクリック・コンパウンズ−シア
ニンダイズ・アンド・リレイテッド・コンパウンズ(Het
erocyclic Compounds-Cyanine Dyes and Related Compo
unds)」、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ（John Wi
ley & Sons）社−ニューヨーク、ロンドン、１９６４年
刊などの公知の方法で製造することができた。
pn., 55, 909(1982)およびエフ・エム・ハーマー(F.M.
Harmer)著「ヘテロサイクリック・コンパウンズ−シア
ニンダイズ・アンド・リレイテッド・コンパウンズ(Het
erocyclic Compounds-Cyanine Dyes and Related Compo
unds)」、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ（John Wi
ley & Sons）社−ニューヨーク、ロンドン、１９６４年
刊などの公知の方法で製造することができた。
【００６１】実施例１：化合物I-1-dUTP結合体の合成
5 mg(3部)の化合物Ｉ−１を0.1Mの MES緩衝液2mlに溶解
し、WSC塩酸塩3.66mg(5部)及びSulfo-NHS 4.20mg(5部)
を加え室温で15分間攪拌した。これに、アミノアリル-d
UTP(Sigma)2.2mgを200μlの0.1MのMESに溶解して添加
し、室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)10
0μlを加え反応を停止させた後、8 gのODSシリカ(YMC-O
DS-AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、30%メタノ
ール水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取
クロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)
により精製し純度95%の目的物を得た(収率80%)。 MS分析値：M- 1230
し、WSC塩酸塩3.66mg(5部)及びSulfo-NHS 4.20mg(5部)
を加え室温で15分間攪拌した。これに、アミノアリル-d
UTP(Sigma)2.2mgを200μlの0.1MのMESに溶解して添加
し、室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)10
0μlを加え反応を停止させた後、8 gのODSシリカ(YMC-O
DS-AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、30%メタノ
ール水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取
クロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)
により精製し純度95%の目的物を得た(収率80%)。 MS分析値：M- 1230
【００６２】実施例２：化合物II-1-dUTP結合体の合成
5.5 mg(2.0部)の化合物II−１を200μlのDMSOに溶解
し、WSC塩酸塩3.1 mg (5部)及びSulfo-NHS 3.55 mg(5
部)を加え室温で15分間攪拌した。これに、2 mlの0.1MM
ESに溶解したアミノアリル-dUTP(Sigma)2.2 mgを添加
し、室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)10
0μlを加え反応を停止させた後、8 gのODSシリカ(YMC-O
DS-AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、45%メタノ
ール水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取
クロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)
により精製し純度94%の目的物を得た(収率73%)。 MS分析値：M- 1256
し、WSC塩酸塩3.1 mg (5部)及びSulfo-NHS 3.55 mg(5
部)を加え室温で15分間攪拌した。これに、2 mlの0.1MM
ESに溶解したアミノアリル-dUTP(Sigma)2.2 mgを添加
し、室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)10
0μlを加え反応を停止させた後、8 gのODSシリカ(YMC-O
DS-AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、45%メタノ
ール水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取
クロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)
により精製し純度94%の目的物を得た(収率73%)。 MS分析値：M- 1256
【００６３】実施例３：化合物I-10-dUTP結合体の合成
6.00 mg(2.0部)の化合物I-10を200μlのDMSOに溶解し、
WSC塩酸塩3.1 mg(5部)及びSulfo-NHS 3.55 mg(5部)を
加え室温で30分間攪拌した。これに、2 mlの0.1MMESに
溶解したアミノアリル-dUTP(Sigma) 2.2 mgを添加し、
室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5) 100μ
lを加え反応を停止させた後、8 gのODSシリカ(YMC-ODS-
AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、50%メタノール
水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取クロ
マトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)により
精製し純度98%の目的物を得た(収率70%)。 MS分析値：M- 1208
WSC塩酸塩3.1 mg(5部)及びSulfo-NHS 3.55 mg(5部)を
加え室温で30分間攪拌した。これに、2 mlの0.1MMESに
溶解したアミノアリル-dUTP(Sigma) 2.2 mgを添加し、
室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5) 100μ
lを加え反応を停止させた後、8 gのODSシリカ(YMC-ODS-
AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、50%メタノール
水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取クロ
マトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)により
精製し純度98%の目的物を得た(収率70%)。 MS分析値：M- 1208
【００６４】実施例４：化合物III-1-dUTP結合体の合成
3.27 mg(1.0部)の化合物III-1を200μlのDMSOに溶解
し、WSC塩酸塩3.1 mg(5部)及びSulfo-NHS 3.55 mg(5
部)を加え室温で30分間攪拌した。これに2 mlの0.1MのM
ESに溶解したアミノアリル-dUTP(Sigma)2.2 mgを添加
し、室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)10
0μlを加え反応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-OD
S-AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、40%メタノー
ル水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取ク
ロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)に
より精製し純度95%の目的物を得た。(収率81%) MS分析値：M- 1312
し、WSC塩酸塩3.1 mg(5部)及びSulfo-NHS 3.55 mg(5
部)を加え室温で30分間攪拌した。これに2 mlの0.1MのM
ESに溶解したアミノアリル-dUTP(Sigma)2.2 mgを添加
し、室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)10
0μlを加え反応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-OD
S-AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、40%メタノー
ル水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取ク
ロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)に
より精製し純度95%の目的物を得た。(収率81%) MS分析値：M- 1312
【００６５】実施例５：化合物IV-1-dUTP結合体の合成
1.00 mg(1.0部)の化合物IV-1を300μlの0.1M MESに溶解
し、WSC塩酸塩3.1 mg(5部)及びSulfo-NHS 3.55 mg(5
部)を加え室温で30分間攪拌した。これに0.25 mg（0.4
部）のアミノアリル-dUTP(Sigma)を加え、さらに1M炭酸
緩衝液（ｐＨ９．０）３００μｌを添加して室温で一晩
反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5) 100μlを加え反応
を停止させた後、中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN
Ultrapack ODS-S-40B)により精製し純度90%の目的物
を得た。(収率74%) MS分析値：M- 1199
し、WSC塩酸塩3.1 mg(5部)及びSulfo-NHS 3.55 mg(5
部)を加え室温で30分間攪拌した。これに0.25 mg（0.4
部）のアミノアリル-dUTP(Sigma)を加え、さらに1M炭酸
緩衝液（ｐＨ９．０）３００μｌを添加して室温で一晩
反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5) 100μlを加え反応
を停止させた後、中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN
Ultrapack ODS-S-40B)により精製し純度90%の目的物
を得た。(収率74%) MS分析値：M- 1199
【００６６】使用例１：転写反応を用いた蛍光標識ＤＮ
Ａプローブの作製 ヒト肝臓ｍＲＮＡ（Clontech社）（０．５μｇ）および
オリゴｄＴプライマー（ｄＴ18-21、 Gibco BRL）
（０．５μｇ）を混合し、７０℃で１０分間加熱した
後、氷上で急冷した。この混合物に、ＲＮａｓｅＯＵＴ
（Gibco BRL）（４０Ｕ）、ｄＡＴＰ（５００μＭ）、
ｄＧＴＰ（５００μＭ）、ｄＣＴＰ（５００μＭ）、ｄ
ＴＴＰ（２００μＭ）、実施例１で得た化合物Ｉ-1-dUT
P結合体（１００μＭ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ
逆転写酵素(Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ)（４００Ｕ）、ＤＥＰ
Ｃ処理水（全量２０μｌになる量）を添加し、４２℃で
２時間反応させた。反応終了後、ＥＤＴＡ及びＮａＯＨ
を添加し６５℃で１時間インキュベートすることで、反
応の停止とｍＲＮＡの分解を行った。反応液をＣｅｎｔ
ｒｉＳｅｐカラム(ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ ＳＥＰＡＲＡ
ＴＩＯＮ，ＩＮＣ)に通し、未反応の化合物Ｉ-1-dUTP結
合体などを除去して精製した。
Ａプローブの作製 ヒト肝臓ｍＲＮＡ（Clontech社）（０．５μｇ）および
オリゴｄＴプライマー（ｄＴ18-21、 Gibco BRL）
（０．５μｇ）を混合し、７０℃で１０分間加熱した
後、氷上で急冷した。この混合物に、ＲＮａｓｅＯＵＴ
（Gibco BRL）（４０Ｕ）、ｄＡＴＰ（５００μＭ）、
ｄＧＴＰ（５００μＭ）、ｄＣＴＰ（５００μＭ）、ｄ
ＴＴＰ（２００μＭ）、実施例１で得た化合物Ｉ-1-dUT
P結合体（１００μＭ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ
逆転写酵素(Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ)（４００Ｕ）、ＤＥＰ
Ｃ処理水（全量２０μｌになる量）を添加し、４２℃で
２時間反応させた。反応終了後、ＥＤＴＡ及びＮａＯＨ
を添加し６５℃で１時間インキュベートすることで、反
応の停止とｍＲＮＡの分解を行った。反応液をＣｅｎｔ
ｒｉＳｅｐカラム(ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ ＳＥＰＡＲＡ
ＴＩＯＮ，ＩＮＣ)に通し、未反応の化合物Ｉ-1-dUTP結
合体などを除去して精製した。
【００６７】また、比較用として、化合物Ｉ-1-dUTP結
合体の代わりに色素（Ｃｙ３）で標識した比較用の蛍光
ヌクレオチド（Cy3-AP3-dUTP；Amersham pharmacia bio
tech）を使用して上記と同様に逆転写反応を行い、反応
物を精製した。精製後の反応液をそれぞれアガロースゲ
ル電気泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色後ＦＬＡ２０００(富
士写真フイルム)でスキャンした。その結果、本発明の
化合物Ｉ-1-dUTP結合体を使用した方が蛍光強度が強
く、より鮮明に検出できることが判明した。また、蛍光
光度計で蛍光強度を測定し、２６０ｎｍの吸光度よりＤ
ＮＡ量を測定し、それらの結果から計算した取り込み率
及びプローブ１μＭ当たりの蛍光強度を計算した。これ
らの結果を表１に示す。表１から分かるように、本発明
の化合物Ｉ-1-dUTP結合体を使用した場合の方が取り込
み率および蛍光強度が高かった。
合体の代わりに色素（Ｃｙ３）で標識した比較用の蛍光
ヌクレオチド（Cy3-AP3-dUTP；Amersham pharmacia bio
tech）を使用して上記と同様に逆転写反応を行い、反応
物を精製した。精製後の反応液をそれぞれアガロースゲ
ル電気泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色後ＦＬＡ２０００(富
士写真フイルム)でスキャンした。その結果、本発明の
化合物Ｉ-1-dUTP結合体を使用した方が蛍光強度が強
く、より鮮明に検出できることが判明した。また、蛍光
光度計で蛍光強度を測定し、２６０ｎｍの吸光度よりＤ
ＮＡ量を測定し、それらの結果から計算した取り込み率
及びプローブ１μＭ当たりの蛍光強度を計算した。これ
らの結果を表１に示す。表１から分かるように、本発明
の化合物Ｉ-1-dUTP結合体を使用した場合の方が取り込
み率および蛍光強度が高かった。
【００６８】
【表１】
【００６９】使用例２：ＰＣＲ法による蛍光色素ラベル
化ＤＮＡプローブの作製 ＰＣＲ反応液の組成： 鋳型ＤＮＡ：１０ｐｇ プライマー１および２：各０．５μＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ：各２００μＭ ｄＴＴＰ：各１５０μＭ 化合物II-1-dUTP結合体またはCy3-AP3-dUTP：５０μＭ Pyrobest DNA polymerase （ＴＡＫＡＲＡ）：０．５ｕ
ｎｉｔ 減菌水：全量で２０μｌ（鋳型ＤＮＡとしては、PCR-Sc
riptTMＳＫ（＋）（STRATAGENE社）にα-2-HS-グリコプ
ロテイン遺伝子を組み込んだものを使用し、プライマー
１および２の配列は各々配列表１および２に示す）
化ＤＮＡプローブの作製 ＰＣＲ反応液の組成： 鋳型ＤＮＡ：１０ｐｇ プライマー１および２：各０．５μＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ：各２００μＭ ｄＴＴＰ：各１５０μＭ 化合物II-1-dUTP結合体またはCy3-AP3-dUTP：５０μＭ Pyrobest DNA polymerase （ＴＡＫＡＲＡ）：０．５ｕ
ｎｉｔ 減菌水：全量で２０μｌ（鋳型ＤＮＡとしては、PCR-Sc
riptTMＳＫ（＋）（STRATAGENE社）にα-2-HS-グリコプ
ロテイン遺伝子を組み込んだものを使用し、プライマー
１および２の配列は各々配列表１および２に示す）
【００７０】上記組成液をＰＣＲ反応液として使用し、
９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒のサ
イクルを３０サイクル行い、ＰＣＲ反応を行った。反応
液をＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム(ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ
ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ，ＩＮＣ)に通し、未反応の蛍光
ヌクレオチドなどを除去し、生成物を精製した。精製後
の反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＳＹＢＲ Ｇｒ
ｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染
色後ＦＬＡ２０００(富士写真フイルム)でスキャンし
た。その結果、本発明の化合物II-1-dUTP結合体を使用
した方が蛍光強度が強く、より鮮明に検出できることが
判明した。また、蛍光光度計で蛍光強度を測定し、２６
０ｎｍの吸光度よりＤＮＡ量を測定し、それらの結果か
ら計算した取り込み率及びプローブ１μＭ当たりの蛍光
強度を計算した。これらの結果を表２に示す。表２から
分かるように、本発明の化合物II-1-dUTP結合体を使用
した場合の方が取り込み率および蛍光強度が高かった。
９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒のサ
イクルを３０サイクル行い、ＰＣＲ反応を行った。反応
液をＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム(ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ
ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ，ＩＮＣ)に通し、未反応の蛍光
ヌクレオチドなどを除去し、生成物を精製した。精製後
の反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＳＹＢＲ Ｇｒ
ｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染
色後ＦＬＡ２０００(富士写真フイルム)でスキャンし
た。その結果、本発明の化合物II-1-dUTP結合体を使用
した方が蛍光強度が強く、より鮮明に検出できることが
判明した。また、蛍光光度計で蛍光強度を測定し、２６
０ｎｍの吸光度よりＤＮＡ量を測定し、それらの結果か
ら計算した取り込み率及びプローブ１μＭ当たりの蛍光
強度を計算した。これらの結果を表２に示す。表２から
分かるように、本発明の化合物II-1-dUTP結合体を使用
した場合の方が取り込み率および蛍光強度が高かった。
【００７１】
【表２】
【００７２】
【発明の効果】本発明の蛍光ヌクレオチドは、ＤＮＡ合
成の際の取り込み率および取り込み後の蛍光強度に優れ
ており、核酸の標識物質として有用である。
成の際の取り込み率および取り込み後の蛍光強度に優れ
ており、核酸の標識物質として有用である。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Fuji Photo Film Co. Ltd.
<120> Fluorescent nucleotide and method for labeling by using the same
<130> A11317M
<160> 2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
tggccgcctt caacgctcag 20
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
tcaggcactt tcattaacag gcacat 26
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ｂ
Ｇ０１Ｎ 33/531 33/533
33/533 33/58 Ａ
33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(72)発明者 猪股 弘子
埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士写
真フイルム株式会社朝霞研究所内
(72)発明者 小島 政芳
埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士写
真フイルム株式会社朝霞研究所内
Ｆターム(参考） 2G045 AA25 BA11 DA12 DA13 DA14
DA36 FA11 FB02
4B024 AA11 CA01 CA09 HA13 HA14
HA19
4B063 QA01 QA12 QA18 QA19 QQ02
QQ42 QR08 QR32 QR38 QR56
QR82 QS25 QS34 QS39 QX02
4B064 AF27 CA21 CB21 DA13
4C057 AA17 AA18 AA20 BB02 LL21
LL44 MM01 MM05 MM09
Claims (13)
- 【請求項１】 式：Ｘ−Ｙ−Ｚ ［式中、Ｘは天然又は非天然のヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチド又はポリヌクレオチドあるいはそれらの誘導
体の残基を示し、上記残基中の塩基部分でＹと結合し；
Ｙは２価の連結基又は単結合を示し；Ｚは下記の一般式
（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に置換もしくは無置
換のアルキル基を示し；Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、
Ｌ6、及びＬ7はそれぞれ独立に置換又は無置換のメチン
基を示し；Ｗ1及びＷ2はそれぞれ独立に酸素原子、硫黄
原子、−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ 4)−、又は−Ｎ(Ｒ5)−（Ｒ3、
Ｒ4、及びＲ5はそれぞれ独立に置換若しくは無置換のア
ルキル基を示す）を示し；Ｍは対イオンを示し；mは分
子の電荷を中和するのに必要な数を示し；ｓは０又は１
を示し；ｔは０又は１を示し；ｕは０又は１を示す）で
表される化合物から誘導される１価の基であり、Ｒ1又
はＲ2中に存在する反応性基でＹと結合する］で表され
る蛍光ヌクレオチド。 - 【請求項２】 Ｒ1及びＲ2のうち少なくとも一つがＹ中
の活性エステル基（該活性エステル基はアミノ基、ヒド
ロキシル基、又はチオール基と共有結合し得る）で置換
されたアルキル基である請求項１に記載の蛍光ヌクレオ
チド。 - 【請求項３】 Ｒ1及びＲ2のうち少なくとも一つがＹ中
のカルボキシル基で置換されたアルキル基である請求項
１又は２に記載の蛍光ヌクレオチド。 - 【請求項４】 Ｘがヌクレオチドあるいはそれらの誘導
体の残基である、請求項１から３のいずれか１項に記載
の蛍光ヌクレオチド。 - 【請求項５】 Ｘが（１）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、Ｇ
ＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭ
Ｐ、ＵＤＰ ＵＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍ
ｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１
−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴ
Ｐ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−
ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５
−ＭｅＯ−ＣＴＰ（Ｍｅはメチル基、ＭｅＯはメトキシ
基を示し、Ｍｅ又はＭｅＯの前の数字は置換位置を示
す）からなる群から選ばれるヌクレオチド、（２）上記
の（１）に記載のヌクレオチドに対応するデオキシヌク
レオチド及びジデオキシヌクレオチドからなる群から選
ばれるヌクレオチド；及び（３）上記の（１）及び
（２）に記載のヌクレオチドから誘導されるヌクレオチ
ド誘導体からなる群から選ばれるヌクレオチド又はその
誘導体の残基である請求項１から４のいずれか１項に記
載の蛍光ヌクレオチド。 - 【請求項６】 Ｙが−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ
≡Ｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、又はこ
れらの基の任意の組み合わせからなるなる連結基（該連
結基上の水素原子は他の置換基で置換されていてもよ
い）である請求項１から５のいずれか１項に記載の蛍光
ヌクレオチド。 - 【請求項７】 Ｙがアミノアリル基である請求項１から
５のいずれか１項に記載の蛍光ヌクレオチド。 - 【請求項８】 核酸合成酵素、鋳型核酸、及び請求項１
から７のいずれか１項に記載の蛍光ヌクレオチドを用い
て核酸合成反応を行う工程を含む蛍光標識された核酸の
製造方法。 - 【請求項９】 核酸合成反応が逆転写反応、ターミナル
トランスフェラーゼ反応、ランダムプライム法、ＰＣＲ
法、及びニックトランスレーション法からなる群から選
ばれる１又は２以上の反応である請求項８に記載の方
法。 - 【請求項１０】 請求項１から７のいずれか１項に記載
の蛍光ヌクレオチドで標識された核酸プローブ又はプラ
イマー。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載の核酸プローブ又は
プライマーからなる核酸検出用試薬。 - 【請求項１２】 病気の診断に用いるための請求項１１
に記載の試薬。 - 【請求項１３】 核酸検出用キットであって、（１）請
求項１から７のいずれか１項に記載の蛍光ヌクレオチ
ド、（２）核酸合成酵素、及び（３）緩衝液を含むキッ
ト。
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|---|---|---|---|
| JP2001219210A JP2003034695A (ja) | 2001-07-19 | 2001-07-19 | 蛍光ヌクレオチド及びそれを用いた標識法 |
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| JP2001219210A Pending JP2003034695A (ja) | 2001-07-19 | 2001-07-19 | 蛍光ヌクレオチド及びそれを用いた標識法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008510041A (ja) * | 2004-08-13 | 2008-04-03 | エポック バイオサイエシズ インコーポレーティッド | ホスホン酸蛍光色素および複合体 |
| JP2009527629A (ja) * | 2006-02-21 | 2009-07-30 | エポック バイオサイエンシズ インコーポレーティッド | ホスホニル化蛍光色素および複合体 |
| JP2011046662A (ja) * | 2009-08-28 | 2011-03-10 | Fujifilm Corp | 近赤外蛍光造影剤 |
| WO2020186483A1 (zh) * | 2019-03-20 | 2020-09-24 | 深圳大学 | 五甲川菁染料及其制备方法 |
-
2001
- 2001-07-19 JP JP2001219210A patent/JP2003034695A/ja active Pending
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| US7767834B2 (en) | 2004-08-13 | 2010-08-03 | Elitech Holding B.V. | Phosphonylated fluorescent dyes and conjugates |
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