JP2008510041A - ホスホン酸蛍光色素および複合体 - Google Patents

ホスホン酸蛍光色素および複合体 Download PDF

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Abstract

蛍光色素へのホスホン酸基の導入のための試薬が提供される。色素複合体を調製するための方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2004年8月13日に出願された米国特許仮出願第60/601,599号の恩典を主張し、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
連邦政府委託研究または開発下でなされた発明に対する権利に関する記述
該当なし
コンパクトディスクで提出された「配列リスト」、表、または付録を載せるコンピュータープログラムへの参照
該当なし
発明の背景
本発明は、両性イオンまたはその保護型のいずれかである一つまたは二つのホスホン酸基で置換されるローダミン、ロードール、およびフルオレセインを含むキサンテン色素などの多くの修飾色素を提供する。化学反応性色素および色素複合体を含む本発明の色素は、特に生物学的試料において、蛍光プローブとして有用である。
蛍光色素は、高感度検出試薬が必要とされる生物学的応用において特に有用であることが公知である。蛍光色素は、その他の物質に可視色および蛍光の両方をラベルするために使用される。本発明の色素は、典型的にはフルオレセイン、ローダミン、またはロードール誘導体である、キサンテンに基づく色素のホスホン酸誘導体である。
Figure 2008510041
フルオレセイン ローダミン ロードール
「フルオレセイン」色素は、典型的には9-位において2-カルボキシフェニル基によって置換される3H-キサンテン-6-オール-3-オンの誘導体を含む。「ローダミン」色素は、典型的には9-位において2-カルボキシフェニル基によって置換される6-アミノ-3H-キサンテン-3-イミンの誘導体を含む。「ロードール」色素は、典型的には9-位において2-カルボキシフェニル基によって置換される6-アミノ-3H-キサンテン-3-オンの誘導体を含む。フルオレセイン、ローダミン、およびロードールは、典型的には5または6員ラクトンまたはラクタム環を形成することが可能な誘導体によって置換される。例えば、フルオレセインの場合、色素のスピロラクトン型は、以下の構造を有する。
Figure 2008510041
多くの市販の蛍光色素は、多環式芳香族の性質を有し、疎水性である。それらの分子は、隣接する疎水性表面および残基との相互作用を介して任意の親水性環境への曝露を最小にする傾向もある。これらの相互作用は、色素-色素相互作用および色素-生体分子（例えば、タンパク質、脂質、オリゴヌクレオチド）相互作用を含む。疎水性相互作用は、蛍光色素に対する実質的な消光効果を引き起こし得る（例えば、Randolph, J.B.; Waggoner, A.S. Nucleic Acids Res. 1997, 25 (14), 2923-2929（非特許文献１）および本明細書において引用される参照を参照されたい）。この問題を克服するための一つの方法は、例えば色素分子にスルホン酸置換基を導入することによって、色素の親水性特徴を改善することである（スルホン酸化カルボシアニン色素は、米国特許第5,268,486号（特許文献１）において開示され、スルホン酸化キサンテン色素は、米国特許第6,130,101号（特許文献２）において開示される）。
本発明は、少なくとも一つのホスホン酸部分によって置換されるフルオレセイン、ロードール、およびローダミン色素を含む色素を記載する。本発明のホスホン酸置換色素は、それらの非置換疎水性類似体よりもかなりの利点を保有する。イオン化されると、ホスホン酸基は、色素分子に付加的な親水性をもたらし、水性溶液におけるそれらの可溶性を増加させる。重要なこととして、新しい色素の量子収量は、ホスホン酸部分の導入によって減少しない。スルホン酸化色素とは対照的に、本発明の色素は、市販のオリゴヌクレオチド合成器において使用される合成条件に適合する。
Randolph, J.B.; Waggoner, A.S. Nucleic Acids Res. 1997, 25 (14) 米国特許第5,268,486号 米国特許第6,130,101号
発明の簡単な概要
一つの局面において、本発明は、下記化学式およびその塩を有する蛍光色素試薬を提供する。
Figure 2008510041
式中、Flは、蛍光色素構成要素であり；Lfは、保護または非保護官能基、反応基、多官能性連結部分、ホスホラミダイト部分、および固体支持体からなる群より選択される付着メンバーを有する連結基であり；下付き文字mは、0〜1の整数であり；Pzは、化学式（a）を有する両性イオンホスホン酸基または化学式（b）もしくは（c）を有する保護ホスホン酸基であり：
Figure 2008510041
式中、波線は、該蛍光色素構成要素のsp2炭素への直接的な付着を示し；Lは、連結基であり；Naは、アンモニウムイオン基であり；RAおよびRBの各々は、H、(C1-C8)アルキル、ならびにC(O)CF3、FMOC、tブチル、tBOC、フタルイミド、およびモノメトキシトリチルなどの不安定保護基からなる群より独立に選択され；下付き文字nは、1〜4の整数であり、好ましくは1〜2であり；RCは、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、不安定保護基、または末端ヒドロキシもしくは保護ヒドロキシ基を有するアルキレン連結基である。
別の局面において、本発明は、下記化学式およびその塩を有する蛍光色素試薬を提供する。
Figure 2008510041
式中、Flは、蛍光色素構成要素であり；かつPlは、下記化学式を有する官能化ホスホン酸基であり：
Figure 2008510041
式中、波線は、該蛍光色素構成要素のsp2炭素への直接的な付着を示し；L1は、連結基であり；Rは、H、C1-C8アルキル、アリール、アリールC1-C4アルキル、-La-Na、および-La-NRARBからなる群より選択されるメンバーであり；Laは、アルキレン連結基であり、Naは、アンモニウムイオン基であり、かつRAおよびRBの各々は、H、(C1-C8)アルキル、および不安定保護基からなる群より独立に選択され；かつPaは、ホスホラミダイト部分、少なくとも一つの末端官能基または保護官能基を有する一、二、または三官能性連結基、固体支持体、および反応基からなる群より選択される官能基構成要素である。
その他の局面において、本発明は、ホスホン酸蛍光色素試薬を調製する方法ならびに本明細書において提供されるような付着されたホスホン酸蛍光色素を有するプローブ（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）を使用する方法を提供する。
発明の詳細な説明
略語および定義
他に特に記述されない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される以下の語は、以下に与えられる意味を有する。
「アルキル」という語は、接頭語において示される炭素原子の数を有する、直鎖、分岐、もしくは環式飽和一価炭化水素ラジカル、または環式および直鎖もしくは分岐飽和一価炭化水素ラジカルの組み合わせを指す。例えば、(C1-C8)アルキルは、メチル、エチル、n-プロピル、2-プロピル、tert-ブチル、ペンチル、シクロペンチル、シクロプロピルメチル、および同様のものを含むことを意図される。本明細書における定義の各々（例えば、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アリールアルコキシ）に対して、接頭語がアルキル部分における主鎖炭素原子の数を示すために含まれない場合、ラジカルまたはその部分は、8個またはそれ以下の主鎖炭素原子を有すると思われる。
「アルキレン」という語は、接頭語において示される炭素原子の数を有する、直鎖飽和二価炭化水素ラジカルまたは分岐飽和二価炭化水素ラジカルを意味する。例えば、(C1-C6)アルキレンは、メチレン、エチレン、プロピレン、2-メチルプロピレン、ペンチレン、および同様のものを含むことを意図される。
「アルケニル」という語は、接頭語において示される炭素原子の数を有し、かつ少なくとも一つの二重結合を含む、直鎖一価炭化水素ラジカルまたは分岐一価炭化水素ラジカルを指す。例えば、(C2-C6)アルケニルは、エテニル、プロペニル、および同様のものを含むことを意図される。
「アルキニル」という語は、少なくとも一つの三重結合を含み、かつ接頭語において示される炭素原子の数を有する、直鎖一価炭化水素ラジカルまたは分岐一価炭化水素ラジカルを指す。例えば、(C2-C6)アルキニルは、エチニル、プロピニル、および同様のものを含むことを意図される。
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という語は、それらの従来的な意味において使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子の残部に付着されるアルキル基を指す。同様に、ジアルキルアミノという語は、同じであるまたは異なることができる2つの付着されたアルキル基を有するアミノ基を指す。
「アリール」という語は、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキル-アルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アシルアミノ、モノ-アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、COR（Rは、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキル-アルキルカット（cut）、フェニルまたはフェニルアルキル、アリールまたはアリールアルキル）、-(CR'R'')n-COOR（nは、0〜5の整数であり、R'およびR''は、独立に水素またはアルキルであり、かつRは、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキルカット、フェニルまたはフェニルアルキル、アリールまたはアリールアルキルである）、または-(CR'R'')n-CONRaRb（nは、0〜5の整数であり、R'およびR''は、独立に水素またはアルキルであり、かつRaおよびRbは、互いに独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、フェニルまたはフェニルアルキル、アリールまたはアリールアルキルである）より選択される1〜4個の置換基、好ましくは1個、2個、または3個の置換基で独立に非置換または置換される6〜10環原子の一価単環式または二環式芳香族炭化水素ラジカルを意味する。より具体的には、アリールという語は、フェニル、ビフェニル、1-ナフチル、および2-ナフチル、ならびにその置換型を含むが、それらに限定されない。同様に、「ヘテロアリール」という語は、一つまたは複数のヘテロ原子またはヘテロ原子官能基が、環炭素を置換したが、例えばピリジル、キノリニル、キナゾリニル、チエニル、および同様のものなどの芳香族特性を保持するアリール基を指す。簡潔のために、アリールという語は、その他のラジカル（例えば、アリールオキシ、アリールアルキル）との組み合わせにおいて使用される場合、上に記載されるようなアリール基およびヘテロアリール基の両方を含むことを意図される。
「アリールアルキル」という語は、ラジカル-RaRbを指し、Raは、アルキレン基（炭素原子の示された数を有する、または規定されない場合は6個またはそれ以下の主鎖炭素原子を有する）であり、Rbは、本明細書において定義されるようなアリール基である。アリールアルキル基の例は、ベンジル、フェニルエチル、3-(3-クロロフェニル)-2-メチルフェニル、および同様のものを含む。
同様に、「アリールアルケニル」という語は、ラジカル-RaRbを意味し、Raは、アルキレン基であり、Rbは、例えば3-フェニル-2-プロペニル、および同様のものなどの、本明細書において定義されるようなアリール基である。
「アリールヘテロアルキル」は、ラジカル-RaRbを意味し、Raは、ヘテロアルキレン基（炭素原子の示された数を有する）であり、Rbは、例えば2-ヒドロキシ-2-フェニル-エチル、2-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-2-フェニル-エチル、および同様のものなどの、本明細書において定義されるようなアリール基である。
「アリールオキシ」という語は、ラジカル-ORを指し、Rは、例えばフェノキシ、ナフチルオキシ、および同様のものなどのアリール基である。
「ハロ」という接頭語および「ハロゲン」という語は、置換基を記載するために使用される場合、-F、-Cl、-Br、および-Iを指す。
「ヘテロアルキル」という語は、ヘテロアルキルラジカルの付着のポイントが、ヘテロアルキルラジカルの炭素原子を介するという理解をともなって、シアノ、-ORa、-NRbRc、および-S(O)nRd（nは、0〜2の整数である）より独立に選択される1個、2個、または3個の置換基をともなう本明細書において定義されるようなアルキルラジカルを指す。Raは、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルボキサミド、またはモノ-もしくはジ-アルキルカルバモイルである。Rbは、水素、アルキル、アリール、またはアリールアルキルである。Rcは、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルボキサミド、モノ-もしくはジ-アルキルカルバモイル、またはアルキルスルホニルである。Rdは、水素（nが0の場合）、アルキル、アリール、アリールアルキル、アミノ、モノ-アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、またはヒドロキシアルキルである。代表的な例は、例えば、2-ヒドロキシエチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、2-メトキシエチル、ベンジルオキシメチル、2-シアノエチル、および2-メチルスルホニル-エチルを含む。上記の各々に対して、Ra、Rb、Rc、およびRdは、NH2、フルオリン、アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、OH、またはアルコキシによってさらに置換され得る。付加的に、炭素原子の数を示す接頭語（例えば、C1-C10）は、シアノ、-ORa、-NRbRc、または-S(O)nRd部分を除くヘテロアルキル基の部分における炭素原子の総数を指す。
「複素環式」という語は、3〜8環原子の飽和または不飽和非芳香族環式ラジカルを指し、一つまたは二つの環原子は、O、NR（Rは、独立に水素またはアルキルである）、またはS(O)n（nは、0〜2の整数である）より選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子はCであり、一つまたは二つのC原子は、カルボニル基によって置換されていてもよい。複素環式環は、アルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、モノ-アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、-COR（Rは、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキル-アルキル、フェニル、またはフェニルアルキルである）、-(CR'R'')n-COOR（nは、0〜5の整数であり、R'およびR''は、独立に水素またはアルキルであり、かつRは、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキル-アルキル、フェニル、またはフェニルアルキルである）、または-(CR'R'')n-CONRaRb（nは、0〜5の整数、R'およびR''は、独立に水素またはアルキルであり、かつRaおよびRbは、互いに独立に、水素、アルキル、フェニル、またはフェニルアルキルである）より選択される1個、2個、または3個の置換基で独立に置換されていてもよい。より具体的には、複素環式という語は、テトラヒドロピラニル、ピペリジノ、N-メチルピペリジン-3-イル、ピペラジノ、N-メチルピロリジン-3-イル、3-ピロリジノ、2-ピロリドン-1-イル、モルホリノ、チオモルホリノ、チオモルホリノ-1-オキシド、チオモルホリノ-1,1-ジオキシド、ピロリジニル、およびその誘導体を含むが、それらに限定されない。炭素原子の数を示す接頭語（例えば、C3-C10）は、ヘテロ原子の数を除く複素環式基の部分における炭素原子の総数を指す。
「ヘテロアルキレン」という語は、-ORa、-NRbRc、および-S(O)nRd（nは、0〜2の整数である）より独立に選択される1個、2個、または3個の置換基をともなう1〜6個の炭素の直鎖飽和二価炭化水素ラジカルまたは3〜6個の炭素原子の分岐飽和炭化水素ラジカルを意味し、Ra、Rb、Rc、およびRdは、ヘテロアルキルラジカルに対して本明細書において定義されるようなものである。例は、2-ヒドロキシエタン-1,2-ジイル、2-ヒドロキシプロパン-1,3-ジイル、および同様のものを含む。
上記の語の各々（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、および「アリール」）は、示されるラジカルの置換および非置換型の両方を含むことを意図される。ラジカルの各々のタイプに対する好ましい置換基は、以下に提供される。
アルキルおよびヘテロアルキルラジカル（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、ヘテロシクロアルキル、およびヘテロシクロアルケニルとしばしば呼ばれる基を含む）に対する置換基は、以下より選択される様々な基であり得る。0〜4の範囲の数、好ましくは0個、1個、2個、または3個の置換基における、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NR''C(O)2R'、-NH-C(NH2)=NH、-NR'C(NH2)=NH、-NH-C(NH2)=NR'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-CN、および-NO2。R'、R''、およびR'''は、各々独立に水素、非置換(C1-C8)アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリール、1〜3個のハロゲンで置換されたアリール、非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリール-(C1-C4)アルキル基を指す。R'およびR''が、同じ窒素原子に付着される場合、それらは、5、6、または7員環を形成するために窒素原子と組み合わせられ得る。例えば、-NR'R''は、1-ピロリジニルおよび4-モルホリニルを含むことを意図される。置換基に関する上記の議論から、当業者は、「アリール」という語が、その最も広範の意味において、ハロアルキル（例えば、-CF3および-CH2CF3）およびアシル（例えば、-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3、および同様のもの）などの基を含むことを意図されることを理解すると思われる。他に特に規定されない限り、好ましくは、アルキル基は、0〜3個の置換基、より好ましくは0個、1個、または2個の置換基を有すると思われる。
同様に、アリール基に対する置換基は変化し、以下より選択される。0〜芳香族環系上の開原子価の総数の範囲の数における、-ハロゲン、-OR'、-OC(O)R'、-NR'R''、-SR'、-R'、-CN、-NO2、-CO2R'、-CONR'R''、-C(O)R'、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR''C(O)2R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NH-C(NH2)=NH、-NR'C(NH2)=NH、-NH-C(NH2)=NR'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-N3、-CH(Ph)2、ペルフルオロ(C1-C4)アルコキシ、およびペルフルオロ(C1-C4)アルキル；かつR'、R''、およびR'''は、水素、(C1-C8)アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリールおよびヘテロアリール、(非置換アリール)-(C1-C4)アルキル、ならびに(非置換アリール)オキシ-(C1-C4)アルキルより独立に選択される。
アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の二つは、化学式-T-C(O)-(CH2)q-U-の置換基で置換されていてもよく、式中、TおよびUは、独立に-NH-、-O-、-CH2-、または一重結合であり、qは、0〜2の整数である。または、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の二つは、化学式-A-(CH2)r-B-の置換基で置換されていてもよく、式中、AおよびBは、独立に-CH2-、-O-、-NH-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR'-、または一重結合であり、rは、1〜3の整数である。そのように形成された新しい環の一重結合の一つは、二重結合で置換されていてもよい。または、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の二つは、化学式-(CH2)s-X-(CH2)t-の置換基で置換されていてもよく、式中、sおよびtは、独立に0〜3の整数であり、かつXは、-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、または-S(O)2NR'-である。-NR'-および-S(O)2NR'-における置換基R'は、水素または非置換(C1-C6)アルキルより選択される。
本発明の特定の化合物またはオリゴヌクレオチドは、塩型で存在し得る。そのような塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウムなどの塩基添加塩、有機アミノ、またはマグネシウム塩、または同様の塩を含む。本発明の化合物または修飾オリゴヌクレオチドが、相対的に塩基性の官能性を含む場合、酸添加塩は、原液（neat）でまたは適した不活性溶剤において、そのような化合物の中性型を十分な量の望ましい酸と接触させることによって獲得され得る。許容される酸添加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸、および同様のものなどの無機酸に由来するもの、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、乳酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、および同様のものなどの有機酸に由来する塩を含む。アルギネートおよび同様のものなどのアミノ酸の塩、ならびにグルクロン酸またはガラクツロン酸および同様のものなどの有機酸の塩も含まれる（例えば、Berge, S.M., et al,「Pharmaceutical Salts」, Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19を参照されたい）。本発明のある特定の化合物は、化合物が塩基または酸添加塩のいずれかに変換されることを可能にする塩基性および酸性官能性の両方を含む。
化合物の中性型は、塩を塩基または酸に接触させ、従来的な様式において親化合物を単離することによって再生され得る。化合物の親型は、極性溶剤における可溶性などの特定の物理的特性において様々な塩型とは異なるが、それ以外は、塩は、本発明の目的に対する化合物の親型と等価である。
本発明の特定の化合物は、非溶媒和型ならびに水和型を含む溶媒和型で存在し得る。概して、溶媒和型は、非溶媒和型と等価であり、本発明の範囲内に包含されることを意図される。本発明の特定の化合物は、多結晶または非晶質型で存在し得る。概して、すべての物理型は、本発明によって検討される使用に対して等価であり、本発明の範囲内であることを意図される。
本発明の特定の化合物は、非対称性炭素原子（光学中心）または二重結合を保有する。ラセミ化合物、ジアステレオマー、幾何異性体、および個々の異性体は、すべて本発明の範囲内に包含されることを意図される。立体化学の決定および異性体の分離に対する方法は、当技術分野において周知である（ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 4th edition J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992の4章における議論を参照されたい）。
本発明の化合物は、そのような化合物を構成する原子の一つまたは複数において原子同位体の非天然割合を含んでもよい。例えば、化合物は、例えばトリチウム（3H）、ヨウ素-125（125I）、または炭素-14（14C）などの放射性同位体で放射性ラベルされ得る。本発明の化合物のすべての同位体バリエーションは、放射性であるかないか（例えば、2H）にかかわらず、本発明の範囲内に包含されることを意図される。
「保護基」または「その保護型」は、分子マスクにおける反応基に付着される場合に、その反応性を軽減または妨害する原子の団を指す。保護基の例は、T.W. Greene and P.G. Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC CHEMISTRY, (Wiley, 2nd ed. 1991), Beaucage and lyer, Tetrahedron 48:2223-2311 (1992), およびHarrison and Harrison et al., COMPENDIUM OF SYNTHETIC ORGANIC METHODS Vols. 1-8 (John Wiley and Sons. 1971-1996)において見出され得る。代表的なアミノ保護基は、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（CBZ）、tert-ブトキシカルボニル（Boc）、トリメチルシリル（TMS）、2-トリメチルシリル-エタンスルホニル（SES）、トリチルおよび置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（FMOC）、ニトロ-ベラトリルオキシカルボニル（NVOC）、ならびに同様のものを含む（Boyle, A. L. (Editor), CURRENT PROTOCOLS IN NUCLEIC ACID CHEMISTRY, John Wiley and Sons, New York, Volume 1, 2000も参照されたい）。代表的なヒドロキシ保護基は、ヒドロキシ基がアシル化またはアルキル化される場合、ベンジルおよびトリチルエーテルならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテル、およびアリルエーテルなどのものを含む。付加的に、ヒドロキシ基は、α-メチル-6-ニトロピペロニルオキシカルボニルなどの光除去可能（photoremovable）基によって保護され得る（McGall, G.H. and Fidanza, J.A., Photolithographic synthesis of high-density oligonucleotide arrays, DNA ARRAYS METHODS AND PROTOCOLS, Rampal J. B.編, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 170:71-101 (2001), Humana Press, Inc., NY; Boyle, Ann L. (Editor), Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley and Sons, New York, Volume 1, 2000.）。
「不安定保護基」という語は、分子の残部に有意に影響しない軽度の条件下で除去可能である保護基を指す。
本明細書において使用されるように、「反応基」という語は、別の構成要素との共有結合を形成するために使用され得る求電子基または求核基を指す。求核基の例は、-NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC=(O)NHNH2、-OH、-COOH、または-SHを含む。求電子基は、活性化エステル、アクリルアミド、アシルアジド、ハロゲン化アシル、アルデヒドまたはケトン、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、無水物、ハロゲン化アリール、アジリジン、ボラネート（boranate）、カルボン酸、カルボジイミド、ジアゾアルカン、エポキシド、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホラミダイト、ハロゲン化シリル、スルホン酸エステル、およびハロゲン化スルホニルであり得る。付加的に、スペーサーは、直鎖もしくは非環式部分、環式部分、芳香族環、またはその組み合わせにおけるヘテロ原子を含み得る。上記の内で、「活性化エステル基」は、カルボニル部分が例えばアミド形成などへの求電子中心である反応において、アルキルエステル（例えば、メチルエステル）よりも反応性があるカルボン酸エステルを指す。活性化エステルの例は、ペンタフルオロフェニル（PFP）エステル、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、および同様のものを含む。
「多官能性連結部分」は、同じまたは異なり得る二つまたはそれ以上の構成要素を付着または結合するために使用され得る二つまたはそれ以上の官能基を有する連結基である。多官能性連結部分は、例えば、三価連結基および四価連結基を含む（例えば、米国特許第5,512,677号；同第5,419,966号；同第5,585,481号；同第5,942,610号、および同第5,736,626号を参照されたい）。
「ホスホラミダイト」は、典型的にはオリゴヌクレオチド合成において使用される三価リン基を指すために使用される専門用語である。ホスホラミダイト法によってオリゴヌクレオチドを形成するために使用される化学の詳細な説明は、Caruthers et al., 米国特許第4,458,066号および第4,415,732号；Caruthers et al., Genetic Engineering, 4:1-17 (1982)；Users Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers, page 6-1 through 6-22, Applied Biosystems, Part No. 901237 (1991)において提供され、それらの各々は、全体として参照により組み入れられる。ラベル化オリゴヌクレオチドは、例えば、例えばStryer, Biochemistry, Chapter 24, W. H. Freeman and Company (1981)などのDNAポリメラーゼもしくはリガーゼを使用して酵素的に、または例えば、例えばGait, OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS, IRL Press (1990)などのホスホラミダイト法、亜リン酸-トリエステル法、および同様のものなどによる化学合成によって合成され得る。ラベルは、ラベル化ヌクレオシド三リン酸モノマーを使用して酵素合成の間に導入され得る、またはラベル化非ヌクレオチドもしくはヌクレオチドホスホラミダイトを使用して化学合成の間に導入され得る、または合成の後に続いて導入され得る。オリゴヌクレオチド合成において使用される典型的なホスホラミダイト試薬は、以下の構造によって示される。
Figure 2008510041
波線は、試薬の残部への付着を示し、置換基「a」および「b」は、各々独立にイソプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、2-シアノエチルオキシ、メトキシ、またはモルホリノであり；かつ「a」および「b」は、同じではない。
上記の定義における「任意の（optional）」または「任意で（optionally）」は、その後に記載される事象または状況が、生じ得るが生じる必要がないこと、かつ説明が、事象または状況が生じる例およびそれが生じない例を含むことを意味する。例えば、「アルキル基で一または二置換されていてもよい複素環式基（heterocyclo group optionally mono- or di- substituted with an alkyl group ）」は、アルキルが存在し得るが存在する必要がないこと、かつ説明が、複素環式基がアルキル基で一または二置換される状態および複素環式基がアルキル基で置換されない状態を含むことを意味する。
「生物学的薬剤」という語は、本質的に任意のヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、アミノ炭水化物、またはリガンド、ならびにその類似体（例えば、修飾または非天然塩基を有するオリゴヌクレオチド）を指す。
「複合体」という語は、オリゴヌクレオチド、フルオロフォア、消光剤、マイナーグルーブ結合剤、および同様のものなどの二つまたはそれ以上の構成要素の共有結合によって形成される分子を指す。
「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ほとんど同じ意味で使用され、修飾塩基、糖類似体、および同様のものを有するヌクレオチドを含むがそれらに限定されない天然または合成のいずれかのヌクレオチドのポリマーを指す。上に指摘されるように、オリゴヌクレオチド複合体は、少なくとも一つの共有結合フルオロフォア、消光剤、マイナーグルーブ結合剤（MGB）、またはその他の有用なフラグメント、ならびに列挙される構成要素の組み合わせを有する、定義されるようなオリゴヌクレオチドを指すと思われる。
「固体支持体」という語は、自動化オリゴヌクレオチド技術に対して有用かつ適合する本質的に任意の固体または半固体マトリクスを指し、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、プラスチック、組み合わせ、および同様のものを含む。有用な固体支持体の例は、例えば米国特許第5,262,530号、同第5,419,966号、同第5,512,667号、および同第5,589,586号において記載されている。
本発明の実践は、他に特に示されない限り、有機化学、生化学、オリゴヌクレオチド合成および修飾、生体複合体化学、核酸ハイブリダイゼーション、分子生物学、微生物学、遺伝学、組換えDNA、ならびに当技術の技能内であるような関連分野における従来的な技術を採用すると思われる。これらの技術は、文献において完全に説明される。例えば、Maniatis, Fritsch and Sambrook, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982); Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); Gait (ed.), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL PRESS (1984); Eckstein (ed.), OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)を参照されたい。
概要
本発明は、多種多様な蛍光色素（またはフルオロフォア）が、両性イオンホスホン酸基（またはその保護型）を有し調製され得るという発見に存在し、保存安定（shelf-stable）であり、本質的に任意の生物学的薬剤（例えば、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、プローブ、および同様のもの）をラベルするために使用され得る試薬を提供する。従って、本発明は、新しい「ホスホン酸色素」ならびにこれらの「ホスホン酸色素」を使用して生物学的薬剤をラベルする方法を提供する。本発明は、本明細書において記載されるホスホン酸色素から調製され得るホスホラミダイト誘導体化色素などの試薬をさらに提供する。付加的に、ホスホン酸色素から同様に調製される支持体結合色素も記載される。
「ホスホン酸色素」（例えば、両性イオンホスホン酸基またはその保護型を有する色素）、ならびにそれらの色素を組み入れる試薬（例えば、支持体結合色素およびホスホラミダイト）は、例えばクマリン色素、ベンゾクマリン色素、フルオレセイン色素、ロードール色素、フェノキサジン色素、ベンゾフェノキサジン色素、キサンテン色素、ベンゾキサンテン色素、およびシアニン色素に適合することが見出されている。
これらおよびその他の適した色素クラスの例は、Haugland, et al., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, SIXTH ED., Molecular Probes, Eugene, Ore. 1996;米国特許第3,194,805号；同第3,128,179号；同第5,187,288号；同第5,188,934号；同第5,227,487号；同第5,248,782号；同第5,304,645号；同第5,433,896号；同第5,442,045号；同第5,556,959号；同第5,583,236号；同第5,808,044号；同第5,852,191号；同第5,986,086号；同第6,020,481号；同第6,162,931号；同第6,180,295号；および同第6,221,604号；欧州特許第1408366号；Smith, et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 1993, 1195-1204; Whitaker, et al., Anal. Biochem. 207:267-279 (1992); Krasoviskii and Bolotin, ORGANIC LUMINESCENT MATERIALS, VCH Publishers, NY., 1988; Zolliger, COLOR CHEMISTRY, 2nd Edition, VCH Publishers, NY., 1991; Hirschberg, et al., Biochemistry 37:10381-10385 (1998); Fieser and Fieser, REAGENTS FOR ORGANIC SYNTHESIS, Volumes 1 to 17, Wiley, US, 1995; Geiger, et al., Nature 359:859-861 (1992)において見出され得る。さらにその他の色素が、http://www.zeiss.com.などのオンラインサイトを介して提供される。
本発明の態様
一つの局面において、本発明は一般化学式（A）およびその塩を有する蛍光色素試薬を提供する。
Figure 2008510041
式中、Flは、蛍光色素構成要素であり；Lfは、保護または非保護官能基、反応基、多官能性連結部分、ホスホラミダイト部分、および固体支持体からなる群より選択される付着メンバーを有する連結基であり；下付き文字mは、0〜1の整数であり；Pzは、化学式（a）を有する両性イオンホスホン酸基または化学式（b）もしくは（c）を有する保護ホスホン酸基であり：
Figure 2008510041
式中、波線は、該蛍光色素構成要素のsp2炭素への直接的な付着を示し；Lは、連結基であり；Naは、アンモニウムイオン基であり；RAおよびRBの各々は、H、(C1-C8)アルキル、ならびにC(O)CF3、FMOC、tブチル、tBOC、フタルイミド、およびモノメトキシトリチルなどの不安定保護基からなる群より独立に選択され；下付き文字nは、1〜4の整数であり、好ましくは1〜2であり；RCは、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、不安定保護基、または末端ヒドロキシもしくは保護ヒドロキシ基を有するアルキレン連結基である。
本発明との関連で、本質的に任意の蛍光色素は、LfおよびPzのいずれかを含むように修飾され得る。典型的には、Pzは、以下に記載されるような合成方法を使用して、蛍光色素の芳香族環上のsp2混成炭素原子に付着される。同様に、Lfは、色素上に存在する官能基に付着され得る、または例えば、ラクトン色素の痕跡であり得る（同時係属中の特許出願番号10/026,374を参照されたい）。
適した色素は、例えば、クマリン、ベンゾクマリン、キサンテン、ベンゾ[a]キサンテン、ベンゾ[b]キサンテン、ベンゾ[c]キサンテン、シアニン、アクリジン、ジピロメテンボロンジフルオリド、フェノキサジン、ベンゾ[a]フェノキサジン、ベンゾ[b]フェノキサジン、およびベンゾ[c]フェノキサジンより選択され得る。有用な色素のさらにその他のタイプは、ルテニウムビピリジル色素、エネルギー転移色素、チアゾールオレンジ色素、N-アリール-1,8-ナフタルイミド、および本出願において示されるその他の色素である。
態様の一つの群において、蛍光色素試薬は、下付き文字mが1であり、かつ下付き文字nが1であるものである。態様のこの群内で、Pzは、化学式（a）または（b）を有し得る。好ましくは、付加的な操作または合成方法を受けると思われる試薬として、ホスホン酸エステル基は、保護される（例えば、化学式（b）におけるように）。試薬が、プローブ（以下で議論される態様を参照されたい）に組み入れられ、かつアッセイ法において使用される場合、ホスホネートは、両性イオン型である（例えば、化学式（a）におけるように）。
態様の別の群において、蛍光色素試薬は、下付き文字mが0であり、かつ下付き文字nが1であるものである。態様のこの群内で、Pzは、化学式（a）または（b）を有し得る。好ましくは、付加的な操作または合成方法を受けると思われる試薬として、ホスホン酸エステル基は、化学式（b）および（c）におけるように保護される。
態様のさらに別の群において、蛍光色素試薬は、下付き文字mが0であり、かつ下付き文字nが2であるものである。態様のこの群内で、Pz基の各々は、同じまたは異なり得、化学式（a）、（b）、または（c）を有し得る。上記のように、試薬が付加的な操作または合成方法を受ける場合、ホスホン酸エステル基は、好ましくは保護される（例えば、化学式（b）および（c）におけるように）。
多くの態様において、Lは、C2-C8アルキレンである。上記の一般化学式のその他の態様において、Naは、化学式-N+(RD)3を有するアンモニウムイオン基であり、式中、各々のRDは、H、C1-C8アルキル、アリール、およびアリールC1-C4アルキルより独立に選択される。さらにより好ましくは、各々のRDは、HまたはC1-C8アルキルより独立に選択される。
上記の一般化学式に戻って、Lfは、当業者にとって公知の様々な連結基であり得る。多くの連結基は、市販供給源から使用でき、リンカーの一端を蛍光色素に、かつリンカーの他端を保護基にカップリングさせることによって、上記の試薬において使用され得る。態様の一つの群において、Lfは、(C2-C20)アルキレン基であり、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、アミノ、保護アミノ、カルボキシ、カルボン酸エステル、カルボキサミド、尿素、および同様のものなどの官能基において終結する。その他の態様において、Lfは、付着されたホスホラミダイト部分、好ましくは2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイトを有するアルキレン基である。同様に、連結基Lは、2〜50個の主鎖原子（例えば、アルキレン連結基、ヘテロアルキレン連結基、ポリエーテル連結基、および同様のもの）を有する様々な連結基より選択され得る。
以下のセクションにおいて、多くの色素および色素群が、具体的に議論され、特に関心対象の態様を示す。しかしながら、当業者は、本発明がそれらの態様に限定されないことを高く評価すると思われる。
キサンテン色素
態様の一つの群において、FLは、ベンゾキサンテンを含むキサンテン色素のファミリー、より具体的には、フルオレセイン色素、ローダミン色素、およびロードール色素より選択される。
態様の特定の群において、蛍光色素試薬は、化学式（I）を有する。
Figure 2008510041
式中、A1は、O、N-Z、もしくはN+(Z)2を示し、各々のZは、Hもしくは(C1-C8)アルキルである、または任意で5もしくは6員環を形成するためにR2もしくはR4と組み合わせられる、または2つの融合6員環を形成するためにR2およびR4の各々と組み合わせられ；
A2は、ORもしくはN(Z)2を示し、各々のZは、Hもしくは(C1-C8)アルキルである、または任意で5もしくは6員環を形成するためにR1もしくはR1''と組み合わせられる、または2つの融合6員環を形成するためにR1およびR1''の各々と組み合わせられ；かつRは、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、およびLfより選択される。
R1'、R1''、R1、R2、R3、およびR4は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzより各々独立に選択され；または任意で、R1'、R1''、R2、およびR3の2つの隣接メンバーは、芳香族、非芳香族、もしくは複素芳香族であり、かつPzで置換されていてもよい5もしくは6員融合環を形成するために組み合わせられ；R1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアルキル部分は、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-またはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分は、1〜6個の炭素原子を有し；かつR1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい。
R0は、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、下記化学式を有する置換または非置換へテロアリールまたはアリールである。
Figure 2008510041
式中、X1、X2、X3、X4、およびX5は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、アリール、ヘテロアリール、SO3H、PO3H2、CO2H、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され、かつ任意で、任意の2つの隣接X1〜X5は、芳香族または複素芳香族環を形成するために組み合わせられる。上記のように、R0の任意のアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい。上記の化学式内に、0〜1個のLf基および1〜4個のPz基、好ましくは1〜2個のPz基があると思われる。
関連態様において、蛍光色素試薬は、保護蛍光色素である蛍光色素を使用する。そのような保護蛍光色素の例は、当業者にとって周知であり、以下の特定の態様の説明から明白であると思われる。
いくつかの態様において、蛍光色素は、化学式（Ia）または（Ib）を有する保護キサンテン色素である。
Figure 2008510041
式中、各々のAは、ヒドロキシ、アミノ、保護ヒドロキシ、または保護アミノであり；R1'、R1''、R1、R2、R3、およびR4は、H、ハロゲン、シアノ、アリール、ヘテロアリール、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、Lf、およびPzより各々独立に選択される、または任意で、R1'、R1''、R2、およびR3の2つの隣接メンバーは、芳香族、非芳香族、もしくは複素芳香族であり、かつPzで置換されていてもよい5もしくは6員融合環を形成するために組み合わせられ、R1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアルキル部分は、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分は、1〜6個の炭素原子を有する。シンボルX1、X2、X3、およびX4は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、アリール、ヘテロアリール、SO3H、PO3H2、CO2H、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され、かつ任意で、任意の2つの隣接X1〜X4は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、および(C1-C6)アルコキシより選択される1〜4個の置換基でさらに置換されていてもよい芳香族または複素芳香族環を形成するために組み合わせられる。上記の化学式（IaおよびIb）内に、0〜1個のLf基および1〜2個のPz基があると思われる。Aに対する好ましい基は、-O-C(O)-tブチルおよび-O-C(O)-イソプロピルである。
さらにその他の態様において、本発明は、FLが、例えばベンゾ[a]キサンテン、ベンゾ[b]キサンテン、またはベンゾ[c]キサンテンなどのベンゾキサンテン色素である化合物を提供する（置換基が上に提供される意味を有し、加えて、化学式の各々における下付き文字nが、0〜3の整数であり、各々のX0が、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、アリール、ヘテロアリール、SO3H、PO3H2、CO2H、Lf、およびPzからなる群より選択され、かつX0の任意のアリールまたはヘテロアリール部分が、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい、図1における化学式II、IIa、III、IIIa、IV、およびIVaを参照されたい）。
クマリン色素
態様のさらに別の群において、蛍光色素試薬は、下記化学式を有する。
Figure 2008510041
式中、R1、R1'、R1''、R1'''、R2、およびR3は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され；R1'、R1''、R1'''、およびR1〜R3のいずれかのアルキル部分は、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分は、1〜6個の炭素原子を有し；かつR1'、R1''、R1'''、およびR1〜R3のいずれかのアリールおよびヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよく；かつA1は、OまたはN-Zを示し、Zは、Hまたは(C1-C8)アルキルである。
色素のベンゾクマリンシリーズ（VI）は、R2およびR3が、融合ベンゼン環を形成するために組み合わせられ、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、および(C1-C6)アルコキシより選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい、化学式Vのものである。
シアニン色素
さらにその他の態様において、本発明は、上記の一般化学式を有するシアニン色素試薬を提供し、FLは、シアニン色素構成要素である。
様々なシアニン色素が、本発明において有用であり、概して、以下に提供されるような化学式を有する。
Figure 2008510041
上記の化学式において、Q1およびQ2の各々は、O、S、N、およびCRaRb、または-C(=CH2)-より独立に選択され、RaおよびRbは、独立にH、メチル、エチル、または連結基（例えば、Lf）である。環AxおよびAyは、縮合置換または非置換アリールまたはヘテロアリール環を独立に示し（以下の表1を参照されたい）、アリールまたはヘテロアリール環は、上記の化学式（I）において提供されるように置換されていてもよい。文字Qは、共役連結系を示す。適した共役連結系は、以下のもの（RはH、低アルキル、またはLf）ならびにシアニン色素の表において提供される共役系である。
Figure 2008510041
上記のシアニン色素化学式に戻って、シンボルRGおよびRG'は、H、C1-C8アルキル、ヘテロアルキル、アルキレンスルホン酸、アルキレンカルボン酸、連結基（例えば、Lf）、およびPzより独立に選択され、一つまたは二つのアリールまたはヘテロアリール両性イオンホスホン酸基（Pz）が存在し、かつRa、Rb、R、AXまたはAYに存在する連結部分が、N、O、もしくはS求核剤などの官能基を含む、またはN、O、もしくはS求核剤と反応することが可能な官能性を含む。
上記の化学式は、本明細書において記載される方法に従って修飾され得るシアニン色素の範囲を伝えることを意図されるが、「シアニン色素」または「シアニン」という語は、当技術分野において周知であるシアニン色素のいずれかを指す。合成アプローチは、欧州特許第1,065,250号；国際公開公報第05/014723号；国際公開公報第99/31181号；米国特許第5,268,486号；第5,658,751号；第5,808,044号；第5,981,747号；第5,658,751号；第4,937,198号；第4,937,198号；第6,080,868号；第6,110,630号；第6,225,050号；第6,238,838号；第6,716,994号、および第6,207,464号、ならびに米国公報番号2003/0113755において開示されている。公知のシアニン色素の代表的な例は、表1において示される。表1の色素の合成が、本明細書において記載される一般方法を使用して両性イオンホスホン酸色素へと変換され得るハロゲン化色素を産出するために修飾され得ることが、当業者によって高く評価されると思われる。加えて、適当な反応性官能基をともなう置換基、リンカー、または連結基は、当技術分野において公知のその他の標準的な方法によって、これらの色素または色素類似体に組み入れられ得る。
（表１）公知のシアニン色素
Figure 2008510041
Figure 2008510041
ジピロメテンボロンジフルオリド色素（Bodipy色素）
ホスホン酸ジピロメテンボロンジフルオリド色素は、下記化学式において示されるように提供される。
Figure 2008510041
式中、X1、X2、X3、およびX4は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、SO3H、PO3H2、CO2H、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され、かつ任意で、任意の2つの隣接X1〜X4は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、および(C1-C6)アルコキシより選択される1〜4個の置換基でさらに置換されていてもよい非芳香族、芳香族、または複素芳香族5または6員環を形成するために組み合わせられる。上記の化学式（VIII）内に、0〜1個のLf基および1〜2個のPz基がある。
フェノキサジン色素
態様のさらに別の群において、蛍光色素試薬は、下記化学式を有する。
Figure 2008510041
式中、A1は、OもしくはN-Zを示し、Zは、Hもしくは(C1-C8)アルキルである、または任意で5もしくは6員環を形成するためにR2もしくはR4と組み合わせられる、または2つの融合6員環を形成するためにR2およびR4の各々と組み合わせられ；A2は、ORもしくはN(Z)2を示し、各々のZおよびRは、Hもしくは(C1-C8)アルキルである、または任意で5もしくは6員環を形成するためにR1もしくはR1''と組み合わせられる、または2つの融合6員環を形成するためにR1およびR1''の各々と組み合わせられる。
シンボルR1'、R1''、R1、R2、R3、およびR4は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzより各々独立に選択され；R1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアルキル部分は、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分は、1〜6個の炭素原子を有し；かつ上記の化学式内に0〜1個のLf基および1〜4個のPz基、好ましくは1〜2個のPz基があるように、R1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい。
本発明のさらにその他の態様において、FLは、例えば、ベンゾ[a]フェノキサジン色素、ベンゾ[b]フェノキサジン色素、またはベンゾ[c]フェノキサジン色素などのフェノキサジン色素である（置換基が上に提供される意味を有し、加えて、化学式の各々における下付き文字nが、0〜3の整数であり、かつ各々のX0が、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、アリール、ヘテロアリール、SO3H、PO3H2、CO2H、Lf、およびPzからなる群より選択され、かつX0の任意のアリールまたはヘテロアリールが、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい、図2における化学式X、XI、およびXIIを参照されたい）。
遷移金属錯体
2,2'-ジピリルに基づくルテニウム（II）錯体色素などのホスホン酸金属錯体は、下記化学式において示されるように提供される。
Figure 2008510041
式中、X1、X2、X3、およびX4の各々は、H、OH、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzより独立に選択され；X1、X2、X3、およびX4のいずれかのアルキル部分は、ハロゲン、カルボキシ、カルボキシエステル、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分は、1〜6個の炭素原子を有し；かつX1、X2、X3、およびX4のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよく；または任意で、2つのX1-4の任意の隣接組み合わせは、NまたはSより選択される0個、1個、またはそれ以上の複素環式環原子を含む飽和または不飽和置換または非置換5または6員環を形成する。Mは、ランタニド金属および遷移金属より選択される金属イオンである。上記の化学式（XIII）内に、0〜1個のLf基および1〜2個のPz基があると思われる。
別の関連態様において、X1-4の一つは、LfまたはPzであり、かつX1-4の残部は、水素である。
さらに別の関連態様において、Mは、ルテニウム、レニウム、またはオスミウムより選択される。
別の例示的な態様において、金属イオン錯体は、核酸合成条件、ならびに核酸脱保護および開裂試薬に対して安定である。
その他のホスホン酸色素
様々なその他の色素は、本明細書において記載される方法を用いて、本発明の色素試薬へと修飾され得る。トランスフォーメーションにおいて有用なさらにその他の合成方法は、当業者にとって公知である。特に、色素は、a）ホスホン酸基の導入を可能にするためのハロゲン化、およびb）生物学的薬剤または物質タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、基質、および同様のもの上記の様々な官能基に対して反応性があるようにされることによって調製され得る（表2を参照されたい）。公知の蛍光色素構造は、表2の左カラムにおいて示される。左カラムにおける色素構造に基づくハロゲン化色素前駆体の例は、表2の右カラムにおいて示される。当業者は、ホスホン酸基が、ハロゲン化環のいずれかまたはハロゲン化が可能な場所に導入され得ることを高く評価すると思われる。加えて、ホスホン酸色素を生物学的物質に付着させる基は、表2の色素における様々な位置に導入され得る。表2の提唱される色素が、一つまたは複数のホスホン酸基、生物学的またはその他の基質への色素の付着のための基を含むだけではなく、蛍光発光特性を調節するために環のいずれか上に一つまたは複数の置換基を任意で含み得ることがさらに高く評価されると思われる。
（表２）公知の色素の構造および物理的特性ならびにハロゲン化色素の構造
Figure 2008510041
Figure 2008510041
Figure 2008510041
Figure 2008510041
Figure 2008510041
他に特に示されない限り、励起および発光波長は、Jonathan LindseyによるPhotochemCADパッケージからの化学スペクトルから取られた（http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD/html/）。発光波長は、発光スペクトルから推定された。
表2において示されるハロゲン化色素中間体は、本発明の方法によってホスホン酸色素に変換され得る。当技術分野において報告される蛍光色素が、様々な方法によって対応するハロゲン化色素に変換され得ることは、当業者にとって明白であると思われる。一つのそのような方法は、ハロゲン化色素中間体で開始することである、またはいくつかの例において、ハロゲン置換基をその芳香族環の1つへと導入することが可能であると思われる。リンカー部分が、当技術分野において公知の方法または本発明によって開示されるものによって、色素分子へと導入され得ることがさらに明白であると思われる。塩素および臭素での芳香族環のハロゲン化は、当技術分野において周知であり、概論として、Breandlin and McBee, Olah, 「FRIEDEL-CRAFTS AND RELATED REACTIONS」Vol 3, pp 1517-1593, Interscience Publishers, Inc. NY, 1964およびBerliner, J. Chem. Educ. 43:124-132 (1966)を参照されたい。または、ハロゲン化物基は、Sandmeyer反応を使用するアミノ基のジアゾ化を介して芳香族環へと導入され得る（Hodgson, Chem. Rev., 40:251-277(1947)）。表2の色素に存在するアリールおよびヘテロアリール部分が置換され得ることは、当業者にとってさらに明白であると思われる。置換基は、当技術分野において公知の方法によって、色素に導入され得る。結果として、表2の色素の構造類似体（例えば、LfおよびPzを任意で組み入れるもの）も、本発明の特定の態様として検討される。
エネルギー転移色素
ホスホン酸エネルギー転移色素は、本発明の色素試薬の別の例である。そのようなエネルギー転移色素の一つの例は、以下に示される電子供与および電子求引キサンテン色素カップルである。当業者は、その他の色素組み合わせも、本発明の一部であることを高く評価すると思われる。
Figure 2008510041
より詳しくは、キサンテン部分を採用する電子転移色素は、本質的にキサンテン色素（例えば、化学式I、Ia、およびIbにおいて上で提供されるもの）またはベンゾキサンテン色素のいずれかを含み得る。リンカー部分は、概して、環式、非環式、芳香族、またはその組み合わせのいずれかであるC、N、O、P、およびSより選択される約3〜50個の主原子を有し、かつ利用できる原子価を満たすための付加的な水素原子を有する様々なリンカーであり得る。エネルギー転移色素の例は、米国特許第5,800,996号；同第5,863,727号、および同第5,565,554号；ならびに欧州特許第0 747 700号において開示されている。表4は、ホスホン酸部分（および任意で上記の一般化学式において提供されるようなさらなる連結基）を付着させるための本明細書において記載される方法に従って修飾され得るエネルギー転移色素のいくつかの例を例証する。
（表４）二量体蛍光エネルギー転移色素の例
Figure 2008510041
Figure 2008510041
表4において示される二量体エネルギー転移色素に対する合成手順は、例えば、米国特許第5,800,996号、同第5,863,727号、および同第5,565,554号において、ならびに欧州特許第0 747 700号において記載されている。2つより多いの蛍光部分を含む蛍光エネルギー転移タグは、米国特許第6,627,748号において記載される。表4における色素は、少なくとも一つのキサンテン部分または少なくとも一つのシアニン部分を含み、キサンテン-またはシアニン-色素へのホスホン酸基の導入は、本明細書において記載される方法によって容易に達成され得る。
チアゾールオレンジ類似体
さらにその他の態様において、ホスホン酸チアゾールオレンジ蛍光色素試薬が、下記化学式において示されるように提供され、
Figure 2008510041
式中、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、およびX11は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzより各々独立に選択され；または任意でX2〜X11の2つの隣接メンバーは、芳香族、非芳香族、または複素芳香族であり、かつPzで置換されていてもよい5または6員融合環を形成するために組み合わせられ；かつX1およびX12は、各々独立にH、(C1-C6)アルキル、アリール、および置換アリールであり；X1〜X12のいずれかのアルキル部分は、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分は、1〜6個の炭素原子を有し；かつX1〜X12のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい。
N-アリール-1,8-ナフタルイミド
ホスホン酸-アリール-1,8-ナフタルイミド類似体は、化学式XVにおいて示されるように提供され、
Figure 2008510041
式中、X1、X2、X3、X4、X5、X6は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzより各々独立に選択され；または任意でX1〜X6の2つの隣接メンバーは、芳香族、非芳香族、または複素芳香族であり、かつPzで置換されていてもよい5または6員融合環を形成するために組み合わせられ；かつX7は、アリールまたはヘテロアリールであり；X1〜X6のいずれかのアルキル部分は、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分は、1〜6個の炭素原子を有し；かつX1〜X7のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい。
関連局面において、本発明は、一般化学式（B）およびその塩を有する蛍光色素試薬を提供する。
Figure 2008510041
式中、Flは、蛍光色素構成要素であり；かつPlは、下記化学式を有する官能化ホスホン酸基であり：
Figure 2008510041
式中、波線は、蛍光色素構成要素のsp2炭素への直接的な付着を示し；L1は、連結基であり；Rは、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、-La-Na、および-La-NRARBより選択され；Laは、アルキレン連結基であり、Naは、アンモニウムイオン基であり、かつRAおよびRBの各々は、H、(C1-C8)アルキル、ならびにC(O)CF3、FMOC、C(O)t-ブチル、フタルイミド、およびモノメトキシトリチルなどの不安定保護基からなる群より独立に選択され；かつPaは、ホスホラミダイト部分、少なくとも一つの末端官能基または保護官能基を有する一、二、または三官能性連結基、固体支持体、および反応基（例えば、以下に記載されるような求電子または求核基）からなる群より選択される官能基構成要素である。Rがアルキルである態様に対して、好ましいアルキル基は、分子におけるその他の官能基の存在下で除去され得るものである（例えば、tert-ブチル、tert-アミル、メチル）。
初めに記載された蛍光色素試薬のように、本発明のこの局面は、典型的にはクマリン、ベンゾクマリン、キサンテン、ベンゾ[a]キサンテン、ベンゾ[b]キサンテン、ベンゾ[c]キサンテン、シアニン、アクリジン、ジピロメテンボロンジフルオリド、フェノキサジン、ベンゾ[a]フェノキサジン、ベンゾ[b]フェノキサジン、およびベンゾ[c]フェノキサジンより選択される様々な蛍光色素構成要素（Fl）を含む。いくつかの態様において、蛍光色素構成要素は、クマリン色素、レゾルフィン色素、ジピロメテンボロンジフルオリド色素、ルテニウムビピリジル色素、エネルギー転移色素、チアゾールオレンジ色素、N-アリール-1,8-ナフタルイミド色素、メロシアニン、スチルベン、スチリルに基づく色素、およびジピリンより選択される。さらにその他の態様において、蛍光色素構成要素は、フルオレセイン色素、ローダミン色素、およびロードール色素より選択される。より詳しくは、蛍光色素は、化学式I、Ia、Ib、II、IIa、III、IIIa、IV、IVa、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIIIにおいて提供される色素、または表1もしくは2の色素のいずれかであり得、Plは、Pzに対して上に記載されるような位置におけるsp2混成炭素原子に付着される。
ホスホン酸部分は、本明細書において記載される方法を使用して（例えば、ハロゲン色素構成要素中間体のホスホニル化（phosphonylation）を介して）色素構成要素に付着され得、ホスホネートが末端基（例えば、Pa）への連結をともなって提供される適した合成段階が後に続く。
ホスホン酸色素の一般合成
さらに別の局面において、本発明は、ホスホン酸蛍光色素誘導体を調製する方法を提供し、その方法は、ホスホン酸蛍光色素誘導体を形成するために、ハロゲン原子を除去しかつホスホン酸基を芳香族環炭素原子に共有結合させるのに十分な条件下で、芳香族環炭素原子に付着された少なくとも一つのハロゲン原子を有するハロ蛍光色素基質を、亜リン酸試薬と接触させることを含む。
多くの態様において、ハロ蛍光色素基質は、ハロクマリン、ハロベンゾクマリン、ハロキサンテン、ハロベンゾ[a]キサンテン、ハロベンゾ[b]キサンテン、ハロベンゾ[c]キサンテン、ハロシアニン、ハロアクリジン、ハロジピロメテンボロンジフルオリド、ハロフェノキサジン、ハロベンゾ[a]フェノキサジン、ハロベンゾ[b]フェノキサジン、およびハロベンゾ[c]フェノキサジンより選択される。
本発明の亜リン酸試薬は、対称性または非対称性であり得る。対称性亜リン酸試薬は、化学式：HP(=O)(OR)2を有するものであり、亜リン酸エステルR基の各々は、-La-NRARBであり；Laは、アルキレン連結基であり、かつRAおよびRBの各々は、H、(C1-C8)アルキル、および不安定保護基からなる群より独立に選択され；かつRAおよびRBの少なくとも一つは、保護基である。そのような保護基の例は、C(O)CF3、フタルイミド、C(O)Ot-Bu、C(O)OBn、モノメトキシトリチル、FMOC、および同様のものである。
非対称性亜リン酸試薬は、化学式：HP(=O)(OR)(OR')を有するものであり、亜リン酸エステルR'基は、Rの存在下で除去され得る保護基である、または-La-NRARBであり；かつR基は、-L1-PaまたはLa-NRARBであり；L1は、アルキレン連結基であり、かつPaは、保護または非保護官能基である。RおよびR'の各々に対して、Laはアルキレン連結基であり、かつRAおよびRBの各々は、H、(C1-C8)アルキル、および不安定保護基からなる群より独立に選択され；かつRAおよびRBの少なくとも一つは、保護基である。有用なR'エステル基の例は、t-ブチル、ベンジル、フェニル、および同様のものである。Rが-La-NRARBでもある態様に対して；RAおよびRBの各々は、独立にH、(C1-C8)アルキル、または不安定保護基であり；かつRAおよびRBの少なくとも一つは保護基であり、そのような保護基の例は、C(O)CF3、フタルイミド、C(O)Ot-Bu、C(O)OBn、モノメトキシトリチル、Fmoc、および同様のものである。当業者は、RAまたはRBが保護基である態様に対して、R'基がエステル（または保護基）であり、かつRAまたはRB基が直交保護基（すなわち、その他の保護基の存在下で選択的に除去され得る保護基）であることを高く評価すると思われる。
上を考慮して、本発明は、下記化学式を有する化合物を提供する。
Figure 2008510041
式中、Lは、(C1-C8)アルキレンおよび(C1-C8)ヘテロアルキレン連結基からなる群より選択されるメンバーであり；Xは、官能基および保護官能基からなる群より選択されるメンバーであり、該官能基は、ヒドロキシまたは化学式NRARBを有するアミノであり；Rは、不安定保護基および-L-NRARBからなる群より選択されるメンバーであり；かつRAおよびRBの各々は、H、(C1-C8)アルキル、および不安定保護基より独立に選択され、かつRAおよびRBの少なくとも一つはH以外である。いくつかの態様において、Rは、第三ブチルである。その他の態様において、Rは-L-NRARBであり、かつXは-NRARBである。より好ましくは、各々のRAはHであり、かつ各々のRBは保護基であり、好ましくは-C(O)CF3、-C(O)OtBu、FMOC、フタルイミド、および-C(O)O-ベンジルより選択される。その他の態様において、Xは-O-ジメトキシトリチルである。最も好ましい態様において、化合物は下記より選択される。
Figure 2008510041
上の構造は、単一の互変異性型において提供されるが、当業者は、列挙が、一般的に使用される三価亜リン酸型を含むすべての型を含むことをさらに意図されることを高く評価すると思われる。
選択された亜リン酸試薬の調製および本発明の蛍光色素試薬を調製することにおけるそれらの使用に対するより具体的なスキームが、以下のスキームにおいて提供される。
ホスホン酸色素合成のための試薬およびホスホン酸色素の調製
反応スキーム1は、対称性亜リン酸試薬亜リン酸ビス(4-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)ブチル)の合成を図示する（3）。
反応スキーム1
Figure 2008510041
2,2,2-トリフルオロ-N-(4-ヒドロキシブチル)アセトアミド（1）は、ピリジンにおいて亜リン酸ジフェニル（2）と反応させられ、（3）を産出した。この試薬は、本発明の芳香族ビス-トリフルオロアセトアミドホスホン酸色素を調製するために使用された。濃NH4OHにおけるジエステルの脱保護は、両性イオン4-アミノブチルホスホン酸基を生成する。
反応スキーム2
Figure 2008510041
反応スキーム2は、ペンタクロロホスホン酸フルオレセインホスホラミダイト（11）試薬の合成を図示する。メチルエステル（4）は、メチルスルホン酸の存在下で4-ブロモベンゼン-1,3-ジオールと反応させられ、3'-ヒドロキシ-2'-プロピオン酸フルオレセイン（5）中間体を産出し、トリフルオロ酢酸/無水トリフルオロ酢酸でラクトン（6）に変換された。次いで、ラクトンは、6-アミノヘキサノールおよびジメトキシトリチルと反応させられて、DMT-中間体（7）を形成し、次いで、亜リン酸試薬（3）と反応させられ、ホスホン酸エステル（8）を産出した。エステル（8）は、ヒドロキシル基を保護するために無水トリメチル酢酸で処置され、SiO2精製の後に完全に保護された類似体（9）を産出した。TFA処置でのDMT-保護基の除去は、アルコール（10）を産出し、2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト（Aldrich, St. Louis, MO）での処置により、望ましいホスホラミダイト（11）を引き起こした。
反応スキーム3
Figure 2008510041
反応スキーム3は、完全に保護された4'-クロロ-6-ホスホン酸フルオレセイン類似体（19）の合成を図示する。AlCl3の存在下で4-ブロモフタル酸無水物およびメチル-3-(3-クロロ-2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオネートは、ベンゾフェノン（12）を産出し、1,3-ジヒドロキシナフタレンと反応させられ、フルオレセイン類似体（13）の二つの異性体を形成した。中間体（13）は、トリフルオロ酢酸/無水トリフルオロ酢酸で、ラクトン（14）に変換された。次いで、ラクトンは、O-ジメトキシトリチル-6-アミノヘキサノール（Tetrahedron Letters, 2004, 45(2):317-320）と反応させられ、DMT-中間体異性体を形成し、シリカゲルで分離され、純粋な多い6-異性体（15）を産出した。次いで、6-異性体は、無水トリメチル酢酸と反応させられ、完全に保護された類似体（16）を産出し、亜リン酸試薬（3）と反応させられ、ホスホン酸エステル（17）を産出した。TFA処置でのDMT-保護基の除去は、アルコール（18）を産出し、2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイトでの処置により、望ましいホスホラミダイト（19）を引き起こした。
反応スキーム4
Figure 2008510041
反応スキーム4は、完全に保護された6-ホスホニルロードール（27）の合成を図示する。4-ブロモフタル酸無水物と8-ヒドロキシジュロリジンとの反応は、ベンゾフェノン（20）を産出し、3-(3-クロロ-2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸メチルと反応させられ、ロードール類似体（21）を形成し、トリフルオロ酢酸/無水トリフルオロ酢酸でラクトン（22）に変換された。次いで、ラクトンは、O-ジメトキシトリチル-6-アミノヘキサノールと反応させられ、DMT-中間体（23）を形成し、次いで、無水トリメチル酢酸と反応させられ、完全に保護された類似体（24）を産出した。異性体は、シリカゲルで分離され、6-異性体が実施された。この類似体は、亜リン酸試薬（3）と反応させられ、ホスホン酸エステル（25）を産出した。TFA処置でのDMT-保護基の除去は、アルコール（26）を産出し、2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイトでの処置により、望ましいホスホラミダイト（27）を引き起こした。
反応スキーム5
Figure 2008510041
反応スキーム5は、4-(4-ヨードフェニル)レゾルシノール（31）の合成を図示する。テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウムの存在下で2,4-ジメトキシフェニルボロン酸および1-ブロモ-4-ニトロベンゼンは、4-(4-ニトロフェニル)-2,4-メトキシベンゼン（28）を産出した。パラジウム触媒の存在下での28の水素化は、粗アミン（29）を産出し、精製をともなわずにジアゾ化され、KI溶液で処置され、望ましい4-(4-ヨードフェニル)-2,4-ジメトキシベンゼン（30）を産出した。ジメトキシ類似体（30）は、三臭化ホウ素で処置され、望ましい4-(4-ヨードフェニル)レゾルシノール（31）を産出した。
反応スキーム6
Figure 2008510041
反応スキーム6は、ホスホラミダイト（39）の合成を図示する。AlCl3の存在下での3-クロロフタル酸無水物と3-(3-クロロ-2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸メチルとの反応は、ベンゾフェノン類似体を形成し、結晶化により純粋な6-クロロ異性体（32）を産出した。この異性体は、31と反応させられ、7'-(4-ヨードフェニル)置換フルオレセイン類似体（33）を産出し、無水トリメチル酢酸およびN-メチルイミダゾールで処置され、ラクトン（34）を与えた。次いで、ラクトンは、O-ジメトキシトリチル-6-アミノヘキサノールと反応させられ、DMT-中間体（35）を形成し、次いで、無水トリメチル酢酸と反応させられ、完全に保護された類似体（36）を産出した。この類似体は、亜リン酸試薬（3）と反応させられ、ホスホン酸エステル（37）を産出した。TFA処置でのDMT-保護基の除去は、アルコール（38）を産出し、2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイトでの処置により、望ましいホスホラミダイト（39）を引き起こした。
有用な非対称性亜リン酸試薬41の合成は、反応スキーム7において示される。試薬41は、ホスホン酸部分を介するホスホラミダイトなどの反応性連結基の導入を可能にする。
反応スキーム7
Figure 2008510041
例において、ホスファイト41は、反応スキーム8において示されるようなフルオレセインホスホラミダイト（46）の調製に対して使用された。
反応スキーム8
Figure 2008510041
反応スキーム8は、ホスホラミダイト（46）の合成を図示する。メタンスルホン酸の存在下での4-ブロモフタル酸無水物とレゾルシノールとの反応は、ブロモフルオレセイン（42）の5-および6-異性体の混合物を産出し、無水トリメチル酢酸およびN-メチルイミダゾールで処置され、シリカゲルクロマトグラフィーの後に、ブロックされたエステルの純粋な6-異性体（43）を与えた。中間体（43）は、中間体41と反応させられ、ホスホネート（44）を産出し、次いで、トリフルオロ酢酸で処置され、アルコール（45）を産出した。アルコールは、2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイトでの処置により、望ましいホスホラミダイト（46）を引き起こした。
ホスホン酸シアニン色素試薬の合成
反応スキーム9は、ホスホン酸シアニンホスホラミダイト（53）の合成を図示する。
反応スキーム9
Figure 2008510041
2,3,3-トリメチルインドレニンと1,4-ブタンスルトン（5.4 g、40 mmol）との反応は、望ましいインドリナム塩（47）を産出し、N,N'-ジフェニルホルムアミジンと反応させられ、ホルムアミジン（48）を与えた。1-(スルホブチル)-2,3,3-トリメチル-5-ブロモインドリナム分子内塩（49）（J.Heterocycle Chem., 39:263-269 (2002)を参照されたい）との48の反応は、シアニン中間体（50）を与えた。中間体（50）は、ホスファイト41と反応させられ、ホスホネート（51）を産出し、次いで、トリフルオロ酢酸で処置され、アルコール（52）を産出した。アルコールは、2-シアノエチルN,N,ジイソプロピルクロロホスホラミダイトでの処置により、望ましいホスホラミダイト（53）を引き起こした。
反応スキーム10は、本発明の固体支持体結合色素試薬の調製を示す。
反応スキーム10
Figure 2008510041
反応スキーム10は、シアニン固体支持体（59）の合成を図示する。1,3-プロパンスルトンとの5-ヨード-2,3,3-トリメチル-3H-インドールの反応は、望ましいインドリナム塩（54）を提供し、N,N'-ジフェニルホルムアミジンと反応し、シアニン中間体（55）を与えた。中間体（55）は、ホスファイト41と反応させられ、ジメトキシトリチル-ホスホネート（56）を産出し、次いで、トリフルオロ酢酸で処置され、モノメトキシトリチルホスホン酸中間体（57）を産出した。中間体57は、最初に無水コハク酸、次いで、PFP-TFAと反応させられ、PFP-活性エステル（58）を産出した。次いで、PFPエステルは、NH2-CPGと反応させられ、望ましい固体支持体（59）を与えた。
反応スキーム11は、本発明の活性化エステル-ホスホン酸シアニン色素試薬の調製を示す。
反応スキーム11
Figure 2008510041
反応スキーム11において、5-ヨード-2,3,3-トリメチル-3H-インドレニンは、tert-ブチル6-ヨードヘキサノエートまたはヨウ化エチルのいずれかと反応させられ、それぞれインドリナム塩60および61を与えた。次いで、化合物61は、塩化アセチルおよび無水酢酸の存在下でマロンアルデヒドビス(フェニルイミノ)一塩酸塩との反応によって中間体62へと変換された。61および62の縮合は、色素63を引き起こし、次いで、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウムおよびN-エチルモルホリンの存在下でホスファイト3との反応によってホスホニル化され、ホスホン酸色素64を与えた。保護tert-ブチル基を除去するために、化合物64は、トリフルオロ酢酸で処置された。次いで、結果として生じた酸65は、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートとの反応によりPFPエステル66へと変換された。
（表３）好ましいシアニンホスホラミダイト
Figure 2008510041
反応スキーム13は、合成オリゴヌクレオチドにおける保護ホスホン酸色素の脱保護を図示する。
反応スキーム13
Figure 2008510041
保護オリゴヌクレオチド-色素-ホスホン酸複合体（71および74）は、本発明のホスホラミダイトのいずれかを用いて合成され得る。水酸化アンモニウム脱保護は、オリゴヌクレオチド-両性イオンホスホン酸-色素複合体（73および76）を産出する。複合体73および76の構造は、質量分析によって確認された。構造72および74は、加水分解に対して示唆されるメカニズムでの仮定中間体である。
新しい亜リン酸ビス(4-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)ブチル)（3）試薬は、本発明のその他の色素の合成において使用され得る。
以下のセクションにおいて、スキームは、様々な色素の例示的な合成に対して提供される。当業者は、本発明が、これらの方法に限定されないことを高く評価すると思われる。加えて、当業者は、提唱される反応スキームが、反応スキーム14〜19における望ましい生成物を得るために改変されなければならない可能性があることを高く評価すると思われる。
反応スキーム14
Figure 2008510041
6-置換ホスホン酸クマリン色素は、反応スキーム14において示されるように、保護6-ブロモ-7-ヒドロキシ-2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボン酸（1）から開始して合成され得る（合成に対して、Baker, et al., Chem. Soc. 170-173 (1970)を参照されたい）。化合物（1）は、5-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ペンタン-1-アミンと反応させられ、DMT-アミド類似体2を産出する。亜リン酸ビス(4-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)ブチル)（3）との（2）の反応は、保護ホスホン酸色素（4）を提供する。次の段階において、ジメトキシトリチル保護基が除去され、アルコール（5）を産出し、保護ホスホラミダイト（6）へと変換され得る。
8-置換ハロゲンクマリン類似体の合成は、国際公開公報第03023357号において開示された。8-ブロモクマリンラクトン（7）は、反応スキーム14において記載されるのと同じやり方で変換され得、反応スキーム14aにおいて示される等価のホスホラミダイト（8）を産出する。
反応スキーム14a
Figure 2008510041
反応スキーム15
Figure 2008510041
ハロゲン化レゾルフィンラクトン（9）の合成は、国際公開公報第03/023357号において開示された。手短に、酸性MnO2の存在下でのニトロソベンゼン-1,3-ジオールと3-(3-ブロモ-2,4-ジヒドロキシフェニル)プロパン酸メチルとの反応は、レゾルフィン-N-オキシド（9）を産出し、ブロモレゾルフィンプロピオン酸（10）へと還元され得る（反応スキーム15）。この化合物は、ラクトン化され（11）、反応スキーム15において記載されるのと同様にホスホン酸ラクトン類似体12へと変換され得る。ブロモ酸（bromoacid）（10）は、ホスホン酸レゾルフィンホスホラミダイト13へと変換されてもよい。
反応スキーム16
Figure 2008510041
生物学的物質への付着のための反応基をともなうジピロメテンボロンジフルオリド親複素環式化合物は、米国特許第4,774,339号において最初に開示された。ジピロメテンボロンジフルオリド生成物は、スルホン化、ニトロ化、アルキル化、アシル化、およびハロゲン化を含むがそれらに限定されない当業者にとって公知の化学技術によってその後の反応において修飾可能であることが報告された。置換基が、いくつかの場合において、化学的反応性官能基を導入するために、さらに修飾され得ることがさらに報告された。手短に、これらの置換ジピロメテンボロンジフルオリドは、反応スキーム16において示されるように調製される。置換ピロール-5-カルボキサルデヒドは、臭化水素酸の存在下で置換ピロールと反応させられ、置換ジピロメテン中間体（14）を産出し、置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素（15）へと変換された。シンボルX1、X2、X3、およびX4は、色素のこのクラスに対して以前に記載されるのと同じ定義を有する。
反応スキーム17
Figure 2008510041
対象となるジピロメテンボロンジフルオリドホスホン酸色素は、反応スキーム17において示されるように合成され得る。4-ブロモピロール-2-カルボキサルデヒドおよび3-(2,4-ジメチル-1H-ピロール-3-イル)プロパン酸から開始する反応は、ブロモ-中間体14を産出し、BF3塩基でブロモジピロメテンボロンジフルオリド15を産出する。色素15は、ホスホン酸中間体を介してホスホン酸ジピロメテンボロンジフルオリド中間体（16）へとさらに変換され得、R*は、固体支持体またはホスホラミダイトであり得る。
別の態様において、中間体15cにおけるカルボン酸基は、ペンタフルオロフェニル-またはスクシンイミジルエステルなどの反応性部分へと変換され得る。
ピロロメテン（pyrrolomethene）の合成に対して必要なピロール-2-カルボキサルデヒドは、市販されている、またはVilsmeyer Haakホルミル化によって対応するピロールから容易に調製される（R. M. Silverstein, E. E. Ryskiewicz and C. Willard. ORG. SYNTH. COLL VOL IV, page 831）。
適当に置換されたピロール誘導体（反応スキーム17）は、市販されている、または例えば記載されるような当技術分野において公知の方法によって合成され得る（R. Elderfield, HETEROCYCLIC COMPOUNDS, vol. 1, ch. 6, THE CHEMISTRY OF PYRROLE AND ITS DERIVATIVES, Corwin (1950)；Silverstein, Ryskiewicz and Willard. ORG. SYNTH. COLL VOL IV, page 831およびKorostova et al., Russ. J. Org. Chem. 34, 1691 (1998)）。ピロール脂肪酸は、カルボキシまたは保護カルボキシ末端ホスホニウムまたはホスホン酸誘導体とのピロールアルデヒドのWitting反応（Witting and Schollkopf, Ber. 87: 1318 (1954)を参照されたい）によって最も都合良く調製される。
ルテニウム（II）錯体ホスホン酸色素
混合リガンドルテニウム（II）錯体ホスホラミダイト色素の合成は、以前に報告されており、市販されているシス-ビス(2,2'-ビピリジル)ルテニウム（II）脱水塩化物（Khan et al, Inorg. Chem. 38:3922-3925 (1999)）から開始する。シス-ビス(2,2'-ビピリジル)ルテニウム（II）脱水塩化物（16）および(2,2'-ビピリジン)-5-カルボン酸、5'-ブロモ-メチルエステル（17；Haino et al, Chem. Comm., 402-403 (2002)）で開始する。Khan et al手順は、反応スキーム18において示されるようにルテニウムビピリジルホスホラミダイト（19）の合成を可能にする。
反応スキーム18
Figure 2008510041
手短に、標準的な手段は、メチルエステル17をブロックされたホスホン酸ビピリジルアルコール（18）へと変換し、Khan et alによって開示されるようなホスホラミダイトの導入が後に続く19との反応は、ホスホン酸ビピリジルルテニウムホスホラミダイト19を提供し得る。
別の態様において、化合物19におけるカルボン酸基は、ホスホラミダイト基の代わりにペンタフルオロフェニル-またはスクシンイミジルエステルなどの反応性部分へと変換され得る。
ポリメチンに基づくホスホン酸色素
ホスホン酸ポリメチンに基づく色素は、米国特許第2004/0260093号において開示される基本的な方法によって合成され得る。アプローチは、反応スキーム19において手短に概説される。
反応スキーム19
Figure 2008510041
Ac2Oの存在下での活性-CH化合物20との7-(ジエチルアミノ)-2-オキソ-2H-クロメン-3-カルバルデヒドの反応は、ブロモ-中間体（21）を提供し、リン酸試薬3との反応により、ブロックされたホスホン酸中間体（22）を提供する。この中間体は、通常のやり方で、ホスホラミダイト試薬（23）へと変換され得る。
関連態様において、中間体23におけるカルボン酸基は、ホスホラミダイト基の代わりにペンタフルオロフェニル-またはスクシンイミジルエステルなどの反応性部分へと変換され得る。
ハロゲン置換2-オキソ-2H-クロメン-3-カルバルデヒドで開始するさらに別の態様において、ハロゲンは、sp2混成炭素位のいずれかの一つにおいてホスホン酸基で置換され得る。
オリゴヌクレオチドプローブおよびその他のラベル化生物学的薬剤
別の局面において、本発明は、上記の蛍光色素の一つまたは複数が、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および同様のものに付着されているオリゴヌクレオチドプローブおよびその他の生物学的薬剤を提供する。上で指摘されるように、本発明は、核酸（ヌクレオチド、ヌクレオシド、DNA、RNA、PNA、固定核酸、オリゴヌクレオチド、および同様のもの）、ペプチドまたはタンパク質、オリゴ糖、グリコシル化タンパク質、およびその他の生物学的薬剤のラベリングにおいて、広範な応用を見出す。付加的に、核酸は、修飾塩基（例えば、5-置換ピリミジン、3-置換プリン、置換デアザプリン、置換ピラゾール[3,4-d]ピリミジン、および同様のもの）を含み得る。例えば、同時係属中の特許出願番号09/724,988および同09/447,936を参照されたい。本発明は、オリゴヌクレオチドならびにマイナーグルーブ結合剤、消光薬剤または消光剤、挿入剤、架橋基、および同様のものなどの付着基を有する修飾オリゴヌクレオチドのラベリングにおける有用性も見出す。
本発明の一つの態様において、ホスホン酸色素は、少なくとも一つの基-L-RXを含み、RXは、共有結合Lによってフルオロフォアに付着される反応基である。特定の態様において、RXへホスホン酸色素を付着させる共有結合は、スペーサーとしての役目を果たす複数の介在原子を含む。反応性RX基をともなう色素は、適した反応性をともなう官能基を含むまたは含むように修飾される多種多様な有機または無機物質を蛍光ラベルし、-L-RYによって示される共役物質（RY）の化学的付着を引き起こす。反応基および官能基は、典型的には、共有結合を生成し得る求電子剤および求核剤である。典型的には、反応性色素と結合される物質との間の結合反応は、反応基RXの一つまたは複数の原子が、ホスホン酸色素を共役物質RYに付着させる新しい結合Lへと組み入れられることを引き起こす。
求電子基と求核基との反応が共有結合を産出する結合を形成することに関与する官能基の選択された例は、以下に示される。
求核基の例は、-NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC=(O)NHNH2、-OH、-COOH、または-SHを含む。求電子基は、活性化エステル、アクリルアミド、アシルアジド、ハロゲン化アシル、アルデヒドまたはケトン、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、無水物、ハロゲン化アリール、アジリジン、ボラネート（boranate）、カルボン酸、カルボジイミド、ジアゾアルカン、エポキシド、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホラミダイト、ハロゲン化シリル、スルホン酸エステル、およびハロゲン化スルホニルである。付加的に、スペーサーは、直鎖もしくは非環式部分、環式部分、芳香族環、またはその組み合わせにおいて、ヘテロ原子を含み得る。
共役物質は、核酸、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質、ペプチド、薬物、免疫グロブリン、受容体、毒素、有機小分子リガンド、酵素基質、ビタミン、炭水化物、ビオチン、ストレプトアビジン、固体基質、および本明細書において記載されかつ使用されるオリゴヌクレオチド合成のための固体支持体を含む。
一つの態様において、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸ポリマーなどの生物学的ポリマーの複合体は、エネルギー転移ペアを形成するために、本発明の付加的な色素を含む二次蛍光または非蛍光色素でもラベルされる。
さらに別の態様において、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸ポリマーなどの生物学的ポリマーの複合体は、本発明の色素に加えて二次蛍光または非蛍光色素でもラベルされ、後者の蛍光が消光されるエネルギー転移ペアを形成する。それらの天然の受容体または相補体へのこれらの複合体の結合は、蛍光における増加をともなう結合の立体構造変化または開裂を引き起こす。二重ラベル化オリゴヌクレオチドプローブの好ましい選択された例は、5'-(MB)n y-FlA-オリゴヌクレオチド-FlB-3'、5'-FlA-オリゴヌクレオチド-FlB-MB-3'であり、FlAおよびFlBは、プローブがただ一つの消光剤および一つのフルオロフォアを含み得るという条件付で、フルオロフォアまたは消光剤のいずれかであり、MBは、マイナーグルーブ結合剤であり、かつnyは0または1である。一つの態様において、消光剤は非蛍光である。
関連態様において、好ましい複合体プローブは、核酸標的を検出するための増幅方法、核酸多型および遺伝子発現分析において使用される。これらの方法は、米国特許第6,312,894号、国際公開公報第2004/018626号、Livak, KJ and Schmittgen, TD. Methods 25: 402-408 (2001)において開示される。
マイナーグルーブ結合剤の例は、米国特許第5,801,155号において開示され、消光剤は米国特許6,699,975号および国際公開公報第02099141号において開示され、すべては全体として参照により含まれる。
別の態様において、共役物質は、アルキニル結合（米国特許第5,047,519号；米国再発行特許第38,416号）、アミノアリル結合（米国特許第4,711,955号）、またはその他の結合などの、本発明の色素の付着のために付加的なリンカーまたはスペーサーを保有するように修飾されたものを含む、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、または核酸ポリマーである。
一つの態様において、キサンテンホスホホスホネートは、開裂可能リンカーを介して固体支持体に付着される。リンカー分子は、DMTr（または同様のもの）ブロッキング基で保護されたヒドロキシル基も含む。DMTr基の除去後、オリゴヌクレオチドは、ヒドロキシル基へのヌクレオチドユニットの段階的な付着によって自動化オリゴヌクレオチド合成器で合成される。消光剤は、適当なホスホラミダイトをともなってまたは合成後に反応基を含む消光剤をともなって5'端に導入され、付着されたキサンテンホスホン酸部分（XP）および消光剤（Q）を有するODNを産出する。オリゴヌクレオチド合成と適合する固体支持体は、制御孔ガラス、ポリスチレン、プラスチック、ナイロン、金、および同様のものを含む。
一つの態様において、キサンテンホスホホスホネート（XP）は、開裂可能リンカーを介して固体支持体に付着される。リンカー分子は、DMTr（または同様のもの）ブロッキング基で保護されたヒドロキシル基も含む。DMTr基の除去後、オリゴヌクレオチドは、ヒドロキシル基へのヌクレオチドユニットの段階的な付着によって自動化オリゴヌクレオチド合成器で合成される。XPフルオロフォアは、適当なホスホラミダイトをともなってまたは合成後に反応基を含むXPフルオロフォアをともなって3'端に導入され、付着されたXP部分を有するODN、またはXPおよび消光剤（Q）もしくはXPおよびQに加えてMB（MB-Q-ODN-L-Fl）を有するODNを産出する。これに関連して、MBの合成およびODNへのそれらの付着は周知であることが指摘される（例えば、米国特許第5,801,155号、米国特許出願第09/539,097号、および第9/141,764号を参照されたい。そのすべては、参照により本明細書に明確に組み入れられる）。
実施例
一般実験
すべての空気および水感受性反応は、アルゴンの微陽圧下で実行された。無水溶剤は、Aldrich（Milwaukee, WI）から獲得された。フラッシュクロマトグラフィーは、230〜400メッシュシリカゲルで行なわれた。融点は、開（open）CapillaRYにおけるMel-Temp融点装置で決定され、補正されなかった。要素解析は、Quantitative Technologies Inc. (Boundbrook, NJ)によって行なわれた。UV-可視吸収スペクトルは、UV-2100 (Shimadzu)またはLambda 2 (Perkin Elmer)スペクトロフォトメーターで200〜400-nm領域において記録された。1H NMRスペクトルは、Varian 300スペクトロフォトメーターで20℃で実行された。化学シフトは、Me4Siからのppmダウンフィールドにおいて報告される。薄層クロマトグラフィーは、シリカゲル60 F-254 (EM Reagents)アルミニウム支援プレートで実行された。
以下の実施例において、化合物ナンバリングは、反応スキーム1〜13において提供されるナンバーを指す。
実施例1
亜リン酸ビス(4-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)ブチル)（3）
この実施例は、反応スキーム1において示されるような新しいホスホニル化試薬（3）の合成を実証する。
250 mLフラスコは、磁気攪拌棒、化合物1（J. Org. Chem. 62(20): 6712-6713 (1997)を参照されたい）（9.455 g、51 mmol）、ピリジン（100 mL）、および亜リン酸ジフェニル（2）（7.035 g、25.5 mmol）を入れられた。混合物は、室温で1時間攪拌され、次いで、ロータリーエバポレーターで濃縮され、酢酸エチル（200 mL）で希釈され、10％クエン酸（2×150 mL）で洗浄された。水相は、酢酸エチル（100 mL）で再抽出され、有機相は、組み合わせられ、ブライン（100 mL）で洗浄され、Na2SO4上で乾燥され、真空で濃縮された。残留物は、シリカでクロマトグフィーにより分離され、第一にフェノールを分離するために酢酸エチルで、第二に望ましいホスファイト3を溶出するためにアセトンで溶出した。純粋な生成物画分の濃縮は、粘性液体として8.0 g（75％）のホスファイト3を与えた。
Figure 2008510041
実施例2
この実施例は、反応スキーム2において示されるような保護4',4,5,6,7-ペンタクロロ-7'-ホスホン酸フルオレセイン類似体（11）の合成を例証する。
化合物5
磁気攪拌棒を備えた0.5 L丸底フラスコは、4-ブロモレゾルシノール（3.62 g、19.2 mmol）、化合物（4）（8.264 g、16.0 mmol、国際公開公報第03/023357号において記載されるように調製される）、およびトリフルオロ酢酸（50 mL）を入れられた。メタンスルホン酸（50 mL）が添加され、結果として生じた混合物は、3時間＋80℃で攪拌された。結果として生じた赤色溶液は、冷却され、氷（〜400 g）に注がれた。獲得された固体は、焼結ガラス漏斗での濾過によって収集され、水（3×40 mL）で洗浄され、水（300 mL）およびトリエチルアミン（10 mL）の混合物に溶解された。溶液は、攪拌しながら沸点まで加熱され、次いで、冷却され、水性塩酸を添加することによってpH〜2まで酸性化された。結果として生じた上質の懸濁液は、酢酸エチルで抽出され、ブラインで2回洗浄され、MgSO4上で乾燥された。濃縮は、縮合反応の間に形成されたその脱臭素化類似体が混入された粗生成物5を与えた。混合物は、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離され、ジクロロメタンにおける3％トリエチルアミンにおけるメタノールの勾配（0〜15％）で溶出した。純粋な化合物5（トリエチルアンモニウム塩）を含む画分は、収集されかつ濃縮された。残留物は、1 N塩酸に懸濁され、酢酸エチルで抽出された。有機溶液は、分離され、ブラインで2回洗浄され、MgSO4上で乾燥され、濾過され、真空で濃縮かつ乾燥され、純粋な望ましい生成物5（5.37 g、51％）を与えた。
化合物7
0.5 L丸底フラスコは、化合物5（2.1 g、2.29 mmol）、トリフルオロ酢酸（10 mL）、CH2Cl2（10 mL）、および無水トリフルオロ酢酸（10 mL）を入れられた。10分間室温で保たれた後、溶液は濃縮された。残留TFAは、ジクロロメタンとの共蒸発によって除去された。真空下での乾燥は、オフホワイト固体としてラクトン6を与えた。DMF（30 mL）における6-アミノヘキサノール（0.75 g、6.44 mmol）およびトリエチルアミン（2.1 mL、1.53 g、15.0 mmol）の溶液が、ラクトンに添加され、結果として生じた混合物は、20分間攪拌された。トリエチルアミン（4.2 mL、3.03 g、30.0 mmol）が添加され、その後塩化ジメトキシトリチル（13.47 g、9.625 mmol）が続いて添加された。反応混合物は、オーバーナイトで攪拌され、酢酸エチル（300 mL）で希釈され、10％クエン酸（100 mL）および水（4×30 mL）で洗浄された。有機相は、分離され、Na2SO4上で乾燥され、真空で濾過されかつ濃縮された。残留物は、シリカでクロマトグラフィーで分離され、酢酸エチルで溶出し、赤色固体として2.2 g（91％）の望ましい生成物7を与えた。
化合物9
25 mLフラスコは、磁気攪拌棒、化合物7（2.10 g、1.99 mmol）、DMF（5.0 mL）、トリエチルアミン（0.50 mL、0.362 g、3.58 mmol）、およびホスファイト（3）（0.873 g、3.15 mmol）を入れられた。アルゴンは、2分間溶液を介してバブリングされ、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（0.30 g、0.26 mmol）が添加された。反応混合物は、3時間80℃で攪拌された。各々のトリエチルアミンの別の部分（0.25 mL、0.181 g、1.8 mmol）およびホスファイト3（0.426 g、1.57 mmol）、およびPd(PPh3)4（0.15 g、0.13 mmol）が、反応を完了するために添加され、（8）を産出した。さらに1時間80℃で攪拌された後、反応は、冷却され、トリエチルアミン（2.23 mL、1.618 g、16.0 mmol）、1-メチルイミダゾール（0.1 mL、0.104 g、1.26 mmol）、および無水トリメチル酢酸（1.622 mL、1.49 g、4.0 mmol）で処置された。反応は、オーバーナイトで室温で進行することを可能にされ、次いで、濃縮された。獲得された油は、酢酸エチル（200 mL）に溶解され、飽和重炭酸ナトリウム（50 mL）、ブライン（2×30 mL）で洗浄され、Na2SO4上で乾燥され、乾燥剤から濾過されかつ濃縮された。残留物は、シリカでクロマトフィーで分離され（溶出液、酢酸エチルにおける30％DCM）、非晶質固体として純粋な望ましい生成物（9）（1.27 g、0.81 mol、収率＝41％）を与えた。
化合物10
メタノール（50 mL）における化合物9（1.20 g、0.83 mmol）の溶液は、トリフルオロ酢酸（0.5 mL、0.74 g、6.5 mmol）で処置された。室温で1時間保たれた後、溶液は、トリエチルアミン（1.0 mL、0.726、7.2mol）を添加することによって中和され、次いで、真空で濃縮され、酢酸エチル（100 mL）に再溶解された。溶液は、10％クエン酸（30 mL）、ブライン（2×30 mL）で洗浄され、Na2SO4上で乾燥され、乾燥剤から濾過されかつ濃縮された。酢酸エチルで溶出するシリカゲルでのクロマトグラフィー、その後の純粋な生成物画分の濃縮は、非晶質固体として0.37 g（38％）の化合物10を与えた。
化合物11
無水CH2Cl2（10 mL）における化合物10（0.35 g、0.28 mmol）、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（53 mg、0.31 mmol）の溶液に、2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト（0.169 g、0.56 mmol）が添加された。反応は、2時間攪拌され、CH2Cl2（80 mL）で希釈された。溶液は、飽和水性重炭酸ナトリウム（30 mL）、ブライン（10 mL）で洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。抽出物は、濾過されかつ濃縮された。粗生成物は、ヘキサンにおける酢酸エチルの勾配（50〜100％）を使用して、CH2Cl2/Et3N、その後にCH2Cl2で前洗浄されたシリカゲルでクロマトフィーで分離され、白色非晶質固体として望ましいホスホラミダイト11（0.22 g、54％）を与えた。
実施例3
保護4'クロロ-6-ホスホン酸ベンゾフルオレセイン類似体（19）
この実施例は、反応スキーム3において概説されるような保護4'クロロ-6-ホスホン酸ベンゾフルオレセイン類似体（19）の合成を例証する。
化合物12
30 mLの無水1,2-ジクロロエタンにおける4-ブロモフタル酸無水物（2.27 g、10 mmol）の懸濁液に、3.3 g（25 mmol）のAlCl3、その後に3-(3-クロロ-2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸メチル（国際公開公報第03023357号）（2.3 g、10 mmol）が添加された。混合物は、数分間攪拌され、黄褐色溶液を与えた。反応は、30分間還流され、次いで、冷却されかつ濃縮された。結果として生じたゼラチン状物質は、冷1 N塩酸（70 mL）と酢酸エチル（100 mL）との間で分配された。有機相は、飽和NaClで洗浄され、Na2SO4上で乾燥されかつ濃縮された。結果として生じた油は、ジクロロメタンに懸濁されかつ冷却され、結晶化を起こした。結晶は、濾過によって収集され、冷ジクロロメタンで洗浄されかつ乾燥され、2.3 g（51％）のベンゾフェノン12の異性体混合物を与えた。
化合物13
1,3-ジヒドロキシナフタレン（4.0 g、25 mmol）、ベンゾフェノン12（7.5 g、16.3 mmol）、およびトリフルオロ酢酸（20 mL）は、組み合わせられ、溶液が形成されるまで攪拌された。この溶液に、メタンスルホン酸（20 mL）が添加され、反応は、7時間80℃で加熱された。反応は、冷却され、氷および水の混合物に注がれた。沈殿固体は、濾過によって収集され、水で洗浄された。真空での乾燥は、9.0 g（97％）の色素13（二つの異性体の混合物）を与えた。
化合物14
トリフルオロ酢酸（20 mL）の化合物13（2.75 g、4.84 mmol）の溶液に、20 mLの無水トリフルオロ酢酸が添加された。1時間室温で保たれた後、反応は、蒸発させられ、残留物は、酢酸エチルとの共蒸発によって乾燥された。固体残留物は、酢酸エチル（25 mL）に懸濁され、濾過された。少量の酢酸エチル/ヘキサン混合物（50％/50％）での洗浄および真空下での乾燥は、オフホワイト固体として2.35 g（75％）の望ましいラクトン14を与えた。
化合物16
25 mLの無水DMFにおける6-(O-DMT)-ヘキシルアミン（3.07 g、7.25 mmol）（Tetrahedon Letters (2004), 45(2), 317-320）およびトリエチルアミン（1.5 mL, 10.8 mmol）の溶液に、2.3 g（3.6 mmol）の固体ラクトン14が添加された。1時間攪拌した後、N-メチルイミダゾール（4 mL、50 mmol）および無水トリメチル酢酸（4 mL、19.7 mmol）が添加された。反応は、オーバーナイトで進行することを可能にされた。DMFは、ロータリーエバポレーターで蒸発させられ、結果として生じた油は、水と酢酸エチルとの間で分配された。有機相は、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。溶剤蒸発の後に獲得された物質は、シリカでクロマトフィーで分離され、ヘキサンにおける酢酸エチルの勾配（30〜50％）で溶出し、過剰なDMT副生成物（最速で動く構成要素）を除去し、異性体を分離した。少ない5-異性体は、最初に溶出され、その後多い6-異性体が続いて溶出された。6-異性体を含む画分は、組み合わせられかつ濃縮された。真空下での乾燥は、淡黄色非晶質固体として1.77 g（43％）の化合物16を与えた。
化合物17
化合物16（2.5 g、2.2 mmol）、ホスファイト3（1.63 g、3.9 mmol）、およびトリエチルアミン（0.82 mL、5.9 mmol）は、DMF（1.5 mL）およびトルエン（1.5 mL）の混合物に溶解された。この溶液に、0.163 g（0.14 mmol）のテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)が添加された。混合物は、触媒を溶解するために〜50℃まで加温され、80℃の油バスへと置かれた。攪拌しながらの加熱は、50分間継続された。反応は、冷却され、酢酸エチル（30 mL）で希釈された。この混合物は、シリカゲルカラム上にロードされ、酢酸エチルで溶出された。純粋な生成物画分の濃縮および真空下での乾燥は、淡黄色非晶質固体として2.2 g（68％）の望ましいホスホネート17を与えた。
化合物18
MeOH（30 mL）およびCH2Cl2（60 mL）の混合物における化合物17（2.1 g、1.43 mmol）の溶液に、0.6 mLのトリフルオロ酢酸が添加された。30分間室温で保たれた後、反応は、トリエチルアミン（0.9 mL）で中和されかつ濃縮された。結果として生じた油は、シリカでクロマトフィーで分離され、第一に酢酸エチルで、第二に酢酸エチルにおける5％MeOHで溶出した。純粋な生成物画分は、濃縮されかつ乾燥され、淡黄色非晶質固体として1.5 g（90％）の化合物18を与えた。
化合物19
2-シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（0.57 g、1.9 mmol）は、20 mLの無水CH2Cl2における化合物18（1.4 g、1.2 mmol）およびジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（0.27 g、1.56 mmol）の溶液に、滴下形式で添加された。オーバーナイトで室温で保たれた後、反応は、酢酸エチルで希釈され、飽和NaHCO3で洗浄された。有機相は、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥され、油へと濃縮された。この物質は、トリエチルアミンおよび酢酸エチルの混合物、その後に酢酸エチルで前洗浄され、酢酸エチルで溶出したシリカでクロマトフィーで分離された。生成物を含む画分の濃縮および真空下での乾燥は、淡黄色非晶質固体として1.2 g（73％）の望ましいホスホラミダイト19を与えた。
実施例4
この実施例は、反応スキーム4において概説されるような保護6-ホスホン酸ロードール類似体（27）の合成を例証する。
化合物23
4-ブロモフタル酸無水物（6.47 g、28 mmol）は、7 mLの無水DMFに溶解された。この溶液に、19 mLのトルエン、その後に3.58（18.9 mmol）の8-ヒドロキシジュロリジンが添加された。反応は、30分間110℃で攪拌しながら加熱され、次いで、室温まで冷却され、濃縮された。獲得された物質は、水とCH2Cl2（200 mL）との間で分配された。有機相は、Na2SO4上で乾燥され、濃縮され、暗黒色油性物質を与えた。それは、シリカでクロマトフィーで分離され、CH2Cl2、その後にCH2Cl2における5％MeOHで溶出した。生成物を含む画分は、組み合わせられかつ濃縮された。真空下での乾燥は、黄色非晶質固体として7.5 g（95％）の望ましいベンゾフェノン20（異性体の混合物）を与えた。
化合物21
化合物20（4.16 g、10 mmol）および3-(3-クロロ-2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸メチル（2.31 g、10 mmol）は、21 mLのメタンスルホン酸に懸濁され、固体を溶解するためにわずかに加熱された。溶液が獲得された場合、それは、油バスへと置かれ、1時間80℃で加熱された。反応は、冷却され、氷（300 mL）と混合され、13.5 gのNaOHで処置された。結果として生じた混合物は、65℃まで加熱され、ゆっくりと室温まで冷却することを可能にされた。濃塩酸（2 mL）が、pH 2まで溶液を酸性化するために添加された。沈殿物質は、濾過によって収集され、水で洗浄された。P2O5上の50℃での真空下での乾燥は、暗赤色固体として5.3 g（89％）の望ましい色素21（異性体の混合物）を与えた。
化合物24
30 mLのトリフルオロ酢酸における化合物21（3.0 g、5 mmol）の溶液に、30 mLの無水トリフルオロ酢酸が添加された。30分間室温で保たれた後、反応は濃縮され、残留物はCH2Cl2（2×100 mL）との共蒸発によって乾燥され、粘性シロップとしてラクトン22を与えた。それは、40 mLのCH2Cl2に溶解され、10 mLのCH2Cl2におけるO-DMT-6-アミノヘキサノール（2.5 g、5.9 mmol）およびトリエチルアミン（10 mL）の溶液で処置された。2時間室温で攪拌された後、反応に、トリエチルアミン（3 mL）、1-メチルイミダゾール（3 mL）、および6 mLの無水トリメチル酢酸が添加された。反応を早めるために、混合物は、油型まで濃縮され、8時間45℃で加熱された。水および酢酸エチルが、反応の分配構成要素に添加された。有機相は、10％クエン酸、飽和NaHCO3、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。溶剤蒸発の後に獲得された物質は、シリカでクロマトフィーで分離され、ヘキサンにおける50％酢酸エチルで溶出し、過剰なDMT副生成物（最速で動く構成要素）を除去し、異性体を分離した。少ない5-異性体は、最初に溶出され、その後多い6-異性体が続いて溶出された。純粋な6-異性体を含む画分は、組み合わせられかつ濃縮された。真空下での乾燥は、淡桃色非晶質固体として1.1 g（20％）の化合物24を与えた。
化合物25
化合物24（0.8 g、0.72 mmol）、7（0.6 g、1.7 mmol）、およびトリエチルアミン（0.3 mL、2.1 mmol）は、DMF（0.7 mL）およびトルエン（0.7 mL）の混合物に溶解された。この溶液に、70 mg（0.06 mmol）のテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)が添加された。混合物は、触媒を溶解するためにわずかに加温され（〜50℃）、80℃の油バスへと置かれた。攪拌しながらの加熱は、30分間継続された。反応は、冷却され、酢酸エチル（10 mL）で希釈された。この混合物は、シリカゲルカラム上へロードされ、最初は副生成物を除去するために酢酸エチルで、その後、生成物を溶出するためにCH2Cl2における5％MeOHで溶出された。純粋な生成物画分の濃縮および真空下での乾燥は、薄桃色粘性シロップとして0.9 g（88％）の望ましいホスホネート25を与えた。
化合物26
MeOH（15 mL）およびCH2Cl2（30 mL）の混合物における化合物25（0.9 g、0.63 mmol）の溶液に、0.3 mLのトリフルオロ酢酸が添加された。30分間室温で保たれた後、反応は、トリエチルアミン（0.45 mL）で中和され、濃縮された。獲得された赤色残留物は、シリカでロマトフィーで分離され、ジクロロメタンにおけるMeOHの勾配（5〜15％）で溶出した。純粋な生成物画分は、濃縮かつ乾燥され、淡黄色非晶質固体として0.5 g（71％）の化合物26を与えた。
化合物27
2-シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（0.21 g、0.7 mmol）は、10 mLの無水CH2Cl2における化合物26（0.45 g、0.45 mmol）およびジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（90 mg、1.56 mmol）の溶液に、滴下形式で添加された。3時間室温で保たれた後、反応は、酢酸エチルで希釈され、飽和NaHCO3で洗浄された。有機相は、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥され、油へと濃縮された。この物質は、少量の酢酸エチルから無水ペンタンへと沈殿され、初めは油性沈殿物を与え、ペンタンの新鮮な部分での研和により最終的に固体化された。固体は、濾過によって収集され、真空で乾燥され、薄桃色非晶質固体として0.4 g（74％）のホスホラミダイト27を与えた。
実施例5
この実施例は、反応スキーム5および6において提供されるようなレゾルシノール31および色素試薬39の調製を例証する。
4-(4-ニトロフェニル)-2,4-メトキシベンゼン（28）
600 mLの1,4-ジオキサンにおける4-ブロモニトロベンゼン（24.37 g、120.63 mmol）および2,4-ジメトキシフェニルボロン酸（20.95 g、115.07 mmol）の脱気溶液に、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（8.0g、7 mmol）、その後に120 mLの水における炭酸カリウム（17.06 g、124.3 mmol）の溶液が添加された。反応は、24時間80℃で加熱しながら攪拌され、冷却され、濾過され、濃縮された。結果として生じた物質は、酢酸エチルと水との間で分配された。有機層は、飽和NaHCO3、ブラインで洗浄され、MgSO4上で乾燥され、濃縮された。結果として生じた固体物質は、ヘキサン-酢酸エチルから再結晶化され、黄色結晶として23.56 gの望ましい生成物28を与えた。
Figure 2008510041
4-(4-アミノフェニル)-2,4-メトキシベンゼン（29）
300 mLのTHFにおける28（23.2 g、89.5 mmol）の溶液は、8時間2.0 gの10％ Pd/Cの存在下で50 psiで水素化された。触媒は、Celiteを介する濾過によって除去された。濾液は濃縮され、粗アミン29（20.8 g）を与え、付加的な精製をともなわずに次の反応において使用された。
Figure 2008510041
4-(4-ヨードフェニル)-2,4-メトキシベンゼン（30）
80 mLの1,4-ジオキサンにおける粗アミン29（20.8 g）の溶液に、濃HCl（347 mL）および氷（172 g）の混合物が添加された。反応は、氷/水バスに置かれ、0〜3℃まで冷却することを可能にされた。420 mLの水におけるNaNO2の溶液は、20分にわたって攪拌しながら添加され、攪拌は、さらに1時間継続された。ヨウ化カリウム（150.5 g）の溶液は、10分にわたって攪拌しながら添加された。反応は、室温まで加温することを可能にされ（〜2時間）、酢酸エチル（1.2 L）で抽出された。有機層は、飽和NaHCO3、Na2SO3、およびブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。粗生成物は、シリカでクロマトフィーで分離され、ヘキサンにおける20％酢酸エチルで溶出した。純粋な生成物画分の濃縮および真空下での乾燥は、15.83 g（51.3％）の30を与えた。
Figure 2008510041
4-(4-ヨードフェニル)レゾルシノール（31）
-70℃の150 mLの無水ジクロロメタンにおける30（15.83 g、46.54 mmol）の溶液に、13.63 mL（144.3 mmol）の三臭化ホウ素が滴下形式で添加された。40分後、溶液は、室温まで加温することを可能にされ、500 gの氷へ注ぐことによってゆっくりと急冷された。混合物は、1 N（〜390 mL）でpH 〜10まで希釈され、酢酸エチル（300 mL）で抽出された。有機層は、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。溶剤の蒸発および真空下での乾燥は、淡桃色固体として純粋な31（14.4 g、99％）を与えた。
Figure 2008510041
6-クロロ-2-({3-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-5-[2-(メトキシカルボニル)エチル]フェニル}カルボニル)安息香酸（32）
60 mLの無水1,2-ジクロロエタンにおける3-クロロフタル酸無水物（3.7 g、20 mmol）（J. Org. Chem., 1987, 52, 129-134）の溶液に、6.6 g（50 mmol）のAlCl3、その後に4.6 g（20 mmol）の3-(3-クロロ-2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸メチル（国際公開公報第03/023357号）が添加された。反応は、30分間還流で加熱され、冷却されかつ濃縮された。結果として生じたゼラチン状物質は、冷2 N HCl（100 mL）と酢酸エチル（100 mL）との間で分配された。有機層は、1 N HCl、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥され、濃縮され、油性物質（6-および2-クロロ異性体の混合物）を与えた。油は、ジクロロメタン（〜40 mL）に溶解され、手短に超音波分解され（超音波バス）、結晶化を起こした。混合物は、冷却され（氷/水バス）、30分間結晶化することを可能にされた（延長された結晶化時間は、望ましくない2-クロロ異性体の共結晶化を引き起こすと思われる）。結晶は、濾過によって収集され、冷ジクロロメタンで洗浄された。真空下での乾燥は、4.01 gの望ましい6-クロロ異性体（32）を与えた。
Figure 2008510041
3-(7,13-ジクロロ-16-(4-ヨードフェニル)-12,15-ジヒドロキシ-1-オキソスピロ[3-ヒドロイソベンゾフラン-3,9'-キサンテン]-11-イル)プロピオン酸（33）
TFA（12 mL）およびメタンスルホン酸（12 mL）の混合物における32（2.45 g、7.8 mmol）および31（2.48 g、6.0 mmol）の懸濁液は、3時間攪拌しながら80℃で加熱された。反応は、冷却され、水（200 mL）で希釈された。結果として生じた固体は、濾過によって収集され、水で洗浄され、乾燥された。粗物質は、酢酸エチル/ヘキサンから結晶化され、橙色固体として3.2 g（78％）の望ましい色素33を与えた。
Figure 2008510041
化合物34
30 mLの無水DMFにおける色素酸33（3.4 g、5 mmol）の溶液に、3 mLの無水トリメチル酢酸、その後に3 mLのN-メチルイミダゾールが添加された。1時間後、反応は、濃縮され、酢酸エチルに再溶解された。溶液は、10％クエン酸、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。溶剤の蒸発は、粗生成物を与え、ヘキサンにおける50％酢酸エチルで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製された。純粋な生成物画分の濃縮は、オフホワイト固体として1.6 g（43％）の望ましいラクトン34を与えた。
Figure 2008510041
化合物36
15 mLの無水DMFにおけるラクトン34（1.6 g、2.16 mmol）の溶液は、20 mLの無水DMFにおける6-(O-DMT)-ヘキシルアミン（1.1 g、2.6 mmol）（Tetrahedron Letters (2004), 45(2), 317-320）およびトリエチルアミン（0.3 mL）の冷（0℃、氷/水バス）溶液に添加された。2時間0℃で攪拌された後、反応は、室温まで加温され、1 mLの無水トリメチル酢酸および0.44 mL N-メチルイミダゾールで処置された。反応は、2時間進行することを可能にされ、次いで、濃縮された。残留物は、酢酸エチル（〜75 mL）に溶解され、飽和NaHCO3、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。溶剤は、蒸発させられ、結果として生じた物質は、シリカでクロマトフィーで分離され、2:1酢酸エチル:ヘキサンで溶出した。純粋な生成物画分の濃縮は、非晶質白色固体として2.3 g（85％）の36を与えた。
Figure 2008510041
化合物37
4 mLのトルエンにおける36（2.3 g、1.85 mmol）、亜リン酸ビス-(4-トリフルオロアセトアミドブチル)（1.15 g、1.5 eq.）、トリエチルアミン（0.75 mL）の溶液に、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（130 mg、0.11 mmol）が添加された。反応は、1時間80℃で攪拌され、室温まで冷却された。混合物は、シリカでクロマトフィーで分離され、ヘキサンにおけるアセトンの勾配（40〜60％）で溶出した。純粋な生成物画分は、濃縮され、真空下で乾燥され、白色非晶質固体として2.66 g（94％）の望ましいホスホネート37を与えた。
Figure 2008510041
化合物38
ジクロロメタン（50 mL）およびメタノール（50 mL）の混合物における37（2.4 g、1.56 mmol）の溶液に、0.6 mLのTFAが添加された。溶液は、30分間室温で保たれ、0.9 mLのトリエチルアミンを添加することによって中和された。反応は濃縮され、シリカでクロマトフィーで分離され、酢酸エチルにおけるメタノールの勾配（0〜5％）で溶出した。純粋な生成物画分の濃縮は、白色非晶質固体として1.86 g（97％）の化合物38を与えた。
Figure 2008510041
化合物39
ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（0.26 g、1.5 mmol）は、20 mLの無水ジクロロメタンにおける38（1.79 g、1.46 mmol）の溶液に添加された。反応は、テトラゾリドを溶解するために5分間攪拌された。結果として生じた溶液に、0.7 g（2.3 mmol）の2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイトが添加された。5時間攪拌された後、反応は、酢酸エチル（100 mL）で希釈され、飽和NaHCO3、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。抽出物は、濃縮され、少量の酢酸エチル（〜2 mL）に再溶解された。エーテル（10 mL）が、生成物を沈殿させるために添加された。混合物は、無水ヘプタン（200 mL）でさらに希釈され、結果として生じた乳液は、静置することを可能にされた（〜10分）。液体相を静かに移した後で獲得された残留物は、真空下で乾燥され、オフホワイト非晶質固体として1.69 g（81％）のホスホラミダイト39を与えた。
Figure 2008510041
実施例6
この実施例は、代替のホスホニル化試薬の例として非対称性モノ-DMT-モノ-トリフルオロアセトアミドブチル亜リン酸試薬（41）の調製を例証する。反応の略図は、反応スキーム7において提供される。
化合物41
40 mLの無水ピリジンにおけるモノ-DMT-1,6-ヘキサンジオール（40）（Nucleic Acids Research (1993), 21(1), 145-150）（4.0 g、9.5 mmol）および化合物5（1.76 g、9.5 mmol）の溶液に、2.5 g（〜10 mmol、10〜15％フェノールを含む）の亜リン酸ジフェニルが添加された。1時間室温で保たれた後、反応は、濃縮され、酢酸エチル（100 mL）に溶解された。溶液は、10％クエン酸、飽和NaClで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。濃縮後に獲得された物質は、シリカでクロマトフィーで分離され、ヘキサンにおける酢酸エチルの勾配（60〜100％）で溶出した。ビス-DMT副生成物は、最初に溶出され、望ましいモノ-DMT-モノ-トリフルオロアセトアミド誘導体（41）が続いて溶出された。適当な画分は、組み合わせられ、濃縮され、真空で乾燥され、無色粘性液体として2.0 g（32％）のホスファイト41を与えた。
Figure 2008510041
実施例7
この実施例は、反応スキーム8において概説される方法に従って、ヒドロキシヘキシル-6-ホスホノフルオレセインおよびそのホスホラミダイト（36）の調製を例証する。
化合物42
50 mLのメタンスルホン酸における4-ブロモフタル酸無水物（6.8 g、30 mmol）およびレゾルシノール（8.8 g、80 mmol）の懸濁液は、5時間80℃で攪拌しながら加熱された。反応は、冷却され、氷および水の混合物（300 mL）へと注がれた。固体沈殿物は、濾過によって収集され、水で洗浄された。真空下での乾燥は、橙色固体として12.1 g（98％）のブロモフルオレセイン42（5-および6-異性体の混合物）を与えた。
化合物43
化合物42（4.1 g、10 mmol）、1-メチルイミダゾール（1 mL）、および無水トリメチル酢酸（8 mL、40 mmol）の溶液は、2時間50℃で加熱された。TLC分析（ヘキサンにおける20％EtOAc）は、二つの新しい生成物（5-および6-異性体）への開始物質の完全な変換を示した。MeOH（5 mL）は、過剰な無水物を急冷するために添加された。1時間室温で保たれた後、反応は、濃縮され、酢酸エチルに再溶解された。溶液は、10％クエン酸、飽和NaHCO3、飽和NaClで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。溶剤蒸発の後、混合物は、シリカでクロマトフィーで分離され、ヘキサンにおける20％酢酸エチルで溶出した。画分の三つの群が、収集された。第一の群は、より速く溶出する5-異性体を含んだ。第二の群は、5-および6-異性体の混合物であり、画分の第三の群は、純粋な6-異性体、より遅く溶出する生成物（化合物43）を含んだ。溶剤の蒸発および真空下での乾燥は、1.6 gの5-異性体、1.6 gの異性体混合物、および1.9 g（33％）の望ましい6-異性体（化合物43）を与えた。
Figure 2008510041
化合物44
3 mLのトルエンにおける化合物43（1.16 g、2.0 mmol）、化合物41（1.9 g、2.9 mmol）、トリエチルアミン（0.8 mL、5.75 mmol）、およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（140 mg、0.12 mmol）の溶液は、1時間80℃で加熱された。反応は、冷却され、20 mLのヘキサンにおける66％酢酸エチルで希釈された。沈殿臭化トリエチルアンモニウムは、濾過された。濾液は、シリカゲルカラムにロードされた。ヘキサンにおける酢酸エチルの勾配（50〜80％）での溶出、その後の濃縮および真空での乾燥は、非晶質白色固体物質として1.95 g（85％）のホスホネート44を与えた。
Figure 2008510041
化合物45
MeOH（30 mL）およびCH2Cl2（60 mL）の混合物における化合物44（1.85 g、1.6 mmol）の溶液に、0.6 mLのトリフルオロ酢酸が添加された。30分間室温で保たれた後、反応は、トリエチルアミン（1 mL）で中和され、濃縮された。獲得された赤色残留物は、シリカでクロマトフィーで分離され、酢酸エチルにおけるMeOHの勾配（0〜5％）で溶出した。純粋な生成物画分は、濃縮かつ乾燥され、非晶質白色固体として1.05 g（77％）の化合物45を与えた。
Figure 2008510041
化合物46
2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト（0.57 g、1.9 mmol）は、20 mLの無水CH2Cl2における化合物45（1.0 g、1.18 mmol）およびジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（0.2 g、1.17 mmol）の溶液に、滴下形式で添加された。オーバーナイトで室温で保たれた後、反応は、酢酸エチルで希釈され、飽和NaHCO3で洗浄された。有機相は、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥され、濃縮された。残留物は、、トリエチルアミンおよび酢酸エチルの混合物、その後に酢酸エチルで前洗浄され、酢酸エチルで溶出した、シリカでクロマトフィーで分離された。生成物を含む画分の濃縮および真空下での乾燥は、白色非晶質固体として0.72 g（58％）の望ましいホスホラミダイト46を与えた。
実施例8
この実施例は、反応スキーム9において概説される方法を使用するホスホン酸シアニンホスホラミダイト（53）の合成を例証する。
1-(スルホブチル)-2,3,3-トリメチルインドリナム、分子内塩（47）
2,3,3-トリメチルインドレニン（6.3 g、40 mmol）および1,4-ブタンスルトン（5.4 g、40 mmol）の混合物は、5時間100℃で加熱された。結果として生じた暗黒色半固体は、生成物結晶化を起こすために（inforce）、ジクロロメタンに懸濁され、冷却された。結晶は、濾過によって収集され、冷ジクロロメタンおよびエーテルで洗浄された。真空下での乾燥は、淡桃色含水固体として9.9 g（83％）の望ましいインドリナム塩47を与えた。
1-(スルホブチル)-2,3,3-トリメチル-5-ブロモインドリナム、分子内塩（49）は、5-ブロモ-2,3,3-トリメチルインドレニンから開始する非臭素化類似体に対して上に記載されるように調製された（J. Heterocycle Chem. 2002, 39(2), 263-269）。
化合物48
25 mLの無水酢酸における47（6.0 g、20.3 mmol）およびN,N'-ジフェニルホルムアミジン（4.0 g、20.4 mmol）の懸濁液は、1.5時間攪拌しながら110℃で加熱された。結果として生じた溶液は、室温まで冷却され、生成物結晶化のためにオーバーナイトで放置された。結晶は、濾過によって収集され、少量のジクロロメタンおよび多量のエーテルで洗浄された。真空下での乾燥は、橙赤色固体として6.66 g（71％）の化合物48を与えた。
化合物50
7 mLの無水酢酸における49（3.7 g、9.9 mmol）および48（4.0 g、10 mmol）の懸濁液は、1時間攪拌しながら110℃で加熱され、室温まで冷却された。不溶性物質は、濾過によって収集され、少量の無水酢酸および多量のエーテルで洗浄された。真空下での乾燥は、4.0 g（61％）の化合物50を与えた。粗物質は、付加的な精製をともなわずに、次の反応において使用された。
化合物51
1.5 mLのDMFにおける50（0.68 g、1.0 mmol）、トリエチルアミン（0.5 mL、3.75 mmol）、ホスファイト41（0.96 g、1.46 mmol）の混合物は、真空下で脱気された。この懸濁液に、70 mg（0.06 mmol）のテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)が添加された。反応は、1時間攪拌しながら80℃で加熱され、次いで、室温まで冷却された。混合物は、シリカでクロマトフィーで分離され、ジクロロメタンにおける5％トリエチルアミンにおけるMeOHの勾配（0〜15％）で溶出した。生成物を含む画分の濃縮および真空下での乾燥は、非晶質赤色固体として1.2 g（89％）の望ましいホスホネート51を与えた。
化合物52
ジクロロメタン（50 mL）およびMeOH（50 mL）の混合物における51（1.1 g、0.81 mmol）の溶液に、0.1 mLのTFAが添加された。1時間室温で保たれた後、反応は、0.2 mLのトリエチルアミンで中和され、濃縮された。次いで、残留物は、シリカでクロマトフィーで分離され、ジクロロメタン（プラス10％トリエチルアミン）におけるMeOHの勾配（0〜15％）で溶出した。純粋な生成物画分は、濃縮かつ乾燥され、0.62 g（77％）の化合物52を与えた。
化合物53
10 mLの無水ジクロロメタンにおける52（0.6 g、0.6 mmol）およびジイソプロピルエチルアミン（1 mL）の溶液に、0.2 mL（0.9 mmol）の2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイトが、攪拌しながら滴下形式で添加された。室温で保たれた後、反応は、エーテル（100 mL）で希釈された。液体相は、静かに移され、残留物は、さらなるエーテルで洗浄された。残留シロップ状物質は、泡立てられ、紫色非晶質固体として0.7 gの不安定ホスホラミダイト53を与えた。不安定性により、ホスホラミダイトは、調製後1日以内にDNA合成に使用されなければならなかった。実用的な配慮から、ホスホラミダイト（53）は、その日のオリゴヌクレオチド合成必要条件に対して十分な量において、中間体52から日々合成された。
実施例9
この実施例は、反応スキーム10において概説されるようなホスホン酸Cy5 CPG試薬59の調製を例証する。
化合物54
5-ヨード-2,3,3-トリメチル-3H-インドレニン（Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 1974, 9(3), 274-280）（4.74 g、16.6 mmol）およびプロパンスルトン（2.0 g、16.4 mmol）の混合物は、30分間+100℃で加熱された。反応混合物は、冷却され、エーテルで研和された。固体物質は、濾過され、エーテル、ジクロロメタンで洗浄され、真空で乾燥され、オフホワイト固体として望ましい生成物（5.5 g、82％）を与えた。
化合物55
20 mlのピリジンにおける54（2.3 g、5.6 mmol）およびマロンアルデヒドビス(フェニルイミノ)一塩酸塩（0.72 g、2.8 mmol）の溶液に、無水酢酸（3.4 g、33.6 mmol）が添加された。反応は、4時間室温で攪拌され、濃縮された。結果として生じた物質は、シリカでクロマトフィーで分離され、ジクロロメタン（プラス5％ピリジン）におけるメタノールの勾配（0〜10％）で溶出した。望ましい色素55の収率は、56％であった（紫色固体）。
化合物56
55（0.46 g、0.49 mmol）、ホスファイト41（1.0 g、1.53 mmol）、N-エチルモルホリン（0.3 ml）、およびDMF（1 ml）の混合物は、1分間真空下で脱気された。テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（0.1 g、0.086 mmol）が添加され、混合物は、1時間80℃で攪拌された。反応混合物は、冷却され、シリカでクロマトフィーで分離され、ジクロロメタン（プラス5％ピリジン）におけるメタノールの勾配（0〜10％）で溶出した。純粋な生成物画分の濃縮および真空下での乾燥は、0.8 g（82％）の望ましいホスホン酸色素56を与えた。
化合物57
20 mlのジクロロメタンにおける56（0.7 g、0.35 mmol）の溶液に、メタノール（0.0115 g、0.35 mmol）、その後にTFA（0.05 ml）が添加された。反応は、10分間進行することを可能にされ、トリエチルアミン（0.1 ml）で中和された。溶剤は、蒸発させられ、結果として生じた物質は、シリカでクロマトフィーで分離され、ジクロロメタン（プラス5％ピリジン）におけるメタノールの勾配（0〜20％）で溶出した。純粋な生成物画分の濃縮および真空下での乾燥は、0.12 g（20％）の望ましい生成物57を与えた。
化合物58
1.5 mlの無水DMFにおける57（0.11 g、0.065 mmol）、N-メチルイミダゾール（5 mg、0.065 mmol）、トリエチルアミン（80 mg、0.78 mmol）、および無水コハク酸（40 mg、0.39 mmol）の溶液は、20時間室温で攪拌された。ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（0.22 g、0.78 mmol）が添加された。1時間室温で保たれた後、反応は濃縮され、エーテル、その後に酢酸エチルで研和された。真空下での乾燥は、粗（TFA塩が混入される）生成物58を与え、付加的な精製をともなわずに次の反応において使用された。
制御孔サイズ支持体（CPG）59の調製
長鎖アミノアルキルCPG、500A（1.5 g、105μmol/g）は、8 mlの無水DMFにおける58（90 mg、〜45μmol）およびトリエチルアミン（50 mg、0.49 mmol）の溶液に添加された。懸濁液は、3時間オービターシェーカーを使用して攪拌され、次いで、未反応アミノ基をキャップするためにピリジン（1 ml）および無水酢酸（1 ml）で処置された。さらに1時間攪拌された後、CPGは、濾過によって収集され、DMF、酢酸エチルで洗浄され、真空で乾燥された。DMTローディング：18μmol/g。
実施例10
この実施例は、反応スキーム11において概説されるようなホスホン酸Cy5 PFPエステル試薬66の調製を例証する。
化合物60
5-ヨード-2,3,3-トリメチル-3H-インドレニン（Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 1974, 9(3), 274-280）（1.0 g、3.5 mmol）およびtert-ブチル6-ヨードヘキサノエート（1.382 g、4.6 mmol）の混合物は、9時間+90℃で加熱された。反応混合物は、冷却され、エーテルで研和された。固体物質は、濾過され、エーテルで洗浄され、真空で乾燥され、淡桃色固体として望ましい生成物（1.2 g、59％）を与えた。
Figure 2008510041
化合物61
5-ヨード-2,3,3-トリメチル-3H-インドレニン（2.0 g、7.0 mmol）およびヨウ化エチル（1.76 ml、3.42 g、22 mmol）の混合物は、3時間+90℃で加熱された。反応混合物は、冷却され、エーテルで研和された。固体物質は、濾過され、エーテルで洗浄され、真空で乾燥され、桃色固体として望ましい生成物（2.45 g、79％）を与えた。
Figure 2008510041
化合物62
61（1.5 g、3.4 mmol）、マロンアルデヒドビス(フェニルイミノ)一塩酸塩（1.76 g、6.8 mmol）、塩化アセチル（2.5 ml）、および無水酢酸（25 ml）の混合物は、1.5時間+120℃で加熱された。反応混合物は、冷却され、攪拌エーテルに滴下形式で添加された。固体物質は、濾過され、エーテル、EtOAcで洗浄され、真空で乾燥され、茶色固体として粗生成物（1.87 g、90％）を与え、精製をともなわずにさらに使用された。
化合物63
62（1.25 g、2.04 mmol）、60（1.162 g、2.0 mmol）、無水酢酸（2 ml）、およびピリジン（20 ml）の混合物は、1.5時間室温で磁気的に攪拌された。反応混合物は真空で濃縮され、残留物は、DCM/MeOH（9:1）混合物に溶解され、溶液は、攪拌エーテルに滴下形式で添加された。沈殿物は、濾過され、エーテルで洗浄され、真空で乾燥され、粗生成物を与え、シリカカラム（10％MeOH/DCM）で精製され、紫色固体として望ましい生成物（0.94 g、50％）を与えた。
Figure 2008510041
化合物64
25 mlフラスコは、化合物63（0.84 g、0.9 mmol）、ホスファイト3（2.24 g、5.4 mmol）、DMF（2 ml）、トルエン（2 ml）およびエチルモルホリン（0.859 ml、0.777 g、6.75 mmol）を入れられた。フラスコは、アルゴンを流され、アルゴンは、2分間溶液を介してバブリングされた。テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（208 mg、0.18 mmol）が添加され、反応混合物は、2時間+80℃で磁気的に攪拌された。反応混合物は、室温まで冷却され、攪拌メチルt-ブチルエーテルに滴下形式で添加された。溶液は、静かに移され、残留油性物質は、エーテルでリンスされ、MeOH/DCM（9:1）混合物に溶解され、シリカカラム（DCMにおける10〜15％MeOH）で分離され、紫色固体として望ましい生成物（250 mg、19％）を与えた。
Figure 2008510041
化合物65
64（0.25 g、0.16 mmol）、ジクロロメタン（5 ml）、およびトリフルオロ酢酸（5 ml）の混合物は、1時間室温で磁気的に攪拌された。反応混合物は、真空で濃縮され、DMFと共蒸発させられた。残留物は、アセトンに溶解され、エーテルで希釈された。結果として生じた溶液は、静かに移され、残った油性残留物は、エーテルでリンスされ、高真空で乾燥され、紫色固体として望ましい生成物（0.20 g、88％）を与えた。
Figure 2008510041
化合物66
ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（0.18 g、0.64 mmol）は、65（0.20 g、0.14 mmol）、DMF（3 ml）、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（0.082 g、0.64 mmol）の混合物に添加された。結果として生じた混合物は、10分間室温で磁気的に攪拌された。次いで、反応混合物は、減圧下で濃縮され、残留物は、アセトニトリルに溶解され、エーテルで希釈された。結果として生じた溶液は、油性残留物から静かに移された。操作は繰り返され、次いで、油性残留物は、エーテルでリンスされ、高真空下で乾燥され、紫色固体として望ましい生成物（0.15 g、56％）を与えた。
Figure 2008510041
実施例11
ホスホン酸および非ホスホン酸色素-オクタチミジレート（octathymidylate）に対する逆相HPLC滞留時間の比較
この実施例は、a）保護キサンテンホスホン酸ホスホラミダイトでのオリゴヌクレオチド合成、b）オリゴヌクレオチド複合体の脱ブロッキング、およびc）キサンテンホスホン酸オリゴヌクレオチド複合体の増加した極性を実証する。
オリゴヌクレオチド合成は、AB 3900 DNA Synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA)で行なわれた。保護オリゴヌクレオチド複合体は、標準的な条件（70℃で2時間、濃NH4OHにおける10％エタノール）下で処置され、純粋な非保護オリゴヌクレオチド複合体を産出した。
表4における精製オリゴヌクレオチド複合体は、C18逆相クロマトグラフィーによって分析された。HPLC条件は以下であった：C18逆相、Luna、4.6×100 mmカラム、30分におけるアセトニトリルの勾配（0〜45％）、0.1 M酢酸トリエチルアンモニウム、pH 7.5、1 mL/minの流速。
表4において示されるように、ホスホン酸キサンテンの滞留時間は、非ホスホン酸キサンテンよりもより速く、それらのより極性の性質を確認した。
（表４）ホスホン酸および非ホスホン酸色素-オクタチミジレートに対する逆相HPLC滞留時間、吸収および蛍光特性の比較
Figure 2008510041
実施例12
MB-Q-オリゴヌクレオチド-XP複合体のオリゴヌクレオチド合成
この実施例は、a）MB-Q-オリゴヌクレオチド-XP複合体の合成、b）保護基の除去、およびc）複合体の精製を実証する。
図3は、3'端においてホスホラミダイト試薬22を使用するホスホン酸キサンテン色素でラベルされた5'-マイナーグルーブ結合剤-消光剤DNAプローブのオリゴヌクレオチド合成の例を示す。この実施例は、成功しかつ再現可能なホスホラミダイトカップリング化学および脱保護の間の保護基の効率的な除去を実証する。オリゴヌクレオチドは、Kutyavin et al, Nucl. Acids Res., 28:655-661 (2000)において記載されるように合成された。複合体は、Wave System, Transgenomic, Inc., Omaha, Nebraskaで精製された。複合体の滞留時間は、同様の完全に脱保護された複合体に対して観測された位置に相当した。
実施例13
この実施例は、多重化ハイブリダイゼーションに基づく検出アッセイ法におけるホスホン酸ラベル化MGB Eclipseプローブの使用を実証し、HSV 1,2プローブが、FAMでラベルされ、内部対照は、ホスホン酸色素（14）でラベルされる。
MGB Eclipse XP-ラベル化プローブを使用したリアルタイムPCR
リアルタイムPCRは、ABI Prism（登録商標）7900 Sequence Detection System (SDS)（Applied Biosystems, Foster City, CA）、またはMJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cycle (Waltham, MA)（Afonina et al., J. Clin. Ligand Assay, Vol. 25, Vol. 23, pp.268）のいずれかで実施された。両方の機器において、3段階PCR（5秒間95℃、20秒間58℃、および30秒間76℃）プロファイルの50サイクルが、95℃での初めの2分の後に、実行された。必要な場合、蛍光データは、ABI 7900 SDSで58℃において収集された。最終量0.37U/μlまでJumpStart Taq Polymerase（Sigma カタログ#90 4184）で補足された2mM最終Mg++濃度（Sigma #D 74403）をともなう市販されている2×Jump Start（商標）Taq Ready Mix（商標）for Quantitative PCRが使用された。両方のプローブの最終濃度は、0.2μMであった。制限プライマーの濃度は、0.1μMであり、過剰プライマーは2μMであった。各々の5μl反応は、反応セットアップに先行して高速真空で96または384ウェルプレートにおいて凍結乾燥された10 ngのゲノムDNAを含んだ。Biomek（登録商標）2000 Laboratory Automation Station（Beckman Coulter, USA）は、セットアップPCR反応に対して使用された。
HSV 1,2検出
成功する多重化は、標的および内部対照の両方の増幅が、ほぼ100％効率的であることを必要とする（Livak, KJ and Schmittgen, TD. 2001. Methods 25: 402-408）。そのようなPCR効率的反応が、単一反応において多重化される場合、濃度に対するCtの滴定曲線からのリアルタイムデータは、0.99よりも大きなR2値をともなう-3.333の傾きを与えるべきである。HSV 1,2 FAMラベル化プローブおよびホスホン酸ラベル化内部対照が多重化される場合、傾きは、0.996のR2値をともなう-3.14であり、未知の試料の検出をともなって進行するのに許容される値である。
図4は、HSV 1,2 MGB Eclipseプローブアッセイ法の滴定を例証し、FAMラベル化プローブは、PYでラベルされた内部対照（IC）プローブで多重化される。多重化FAMおよびPYプローブに対する滴定リアルタイムデータは、a）において示される。滴定は、100〜106コピーの10倍濃度をともなうクローン化HSV 1,2プラスミド標的で行なわれる。ICの1000コピーは、すべてのHSV希釈において使用され、ICプライマー濃度は、すべてのHSV希釈において0.3μMであった。HSV 1,2アッセイ法に対する配列は、
Figure 2008510041
である。MGBリガンドは、DPI3であり；Qは、Eclipse Dark Quencherであり、Zは、ユニバーサル塩基である。
当業者は、提供される説明、図、および実施例から、改変および変化が、以下の特許請求の範囲およびそれらの等価物によって定義される本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の様々な態様になされ得ることを認識すると思われる。付加的に、すべての参照、特許、特許刊行物、および同様のものは、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
本発明のベンゾキサンテン色素の選択されたクラスの構造を図示する。 本発明のベンゾフェノキサジン色素の選択されたクラスの構造を図示する。 MB-Q-オリゴヌクレオチド-XPのHPLCクロマトグラムを図示する（実施例9を参照されたい）。 HSV 1,2 MGB Eclipseプローブアッセイ法の滴定を図示し、FAMラベル化プローブは、XPラベル化プローブで多重化される（実施例13）。

Claims (40)

  1. 下記化学式およびその塩を有する蛍光色素試薬：
    Figure 2008510041
    式中、
    Flが、蛍光色素構成要素であり；
    Lfが、保護または非保護官能基、反応基、多官能性連結部分、ホスホラミダイト部分、および固体支持体からなる群より選択される付着メンバーを有する連結基であり；
    下付き文字mが、0〜1の整数であり；
    Pzが、化学式（a）を有する両性イオンホスホン酸基または化学式（b）もしくは（c）を有する保護ホスホン酸基であり：
    Figure 2008510041
    式中、
    波線が、該蛍光色素構成要素のsp2炭素への直接的な付着を示し；Lが、連結基であり；Naが、アンモニウムイオン基であり；RAおよびRBの各々が、Hおよび不安定保護基からなる群より独立に選択され；RCが、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、不安定保護基、または末端ヒドロキシもしくは保護ヒドロキシ基を有するアルキレン連結基からなる群より独立に選択され；
    下付き文字nが、1〜2の整数である。
  2. 蛍光色素構成要素が、クマリン、ベンゾクマリン、キサンテン、ベンゾ[a]キサンテン、ベンゾ[b]キサンテン、ベンゾ[c]キサンテン、シアニン、アクリジン、ジピロメテンボロンジフルオリド、フェノキサジン、ベンゾ[a]フェノキサジン、ベンゾ[b]フェノキサジン、およびベンゾ[c]フェノキサジンからなる群より選択される、請求項1記載の蛍光色素試薬。
  3. 蛍光色素構成要素が、クマリン色素、レゾルフィン色素、ジピロメテンボロンジフルオリド色素、ルテニウムビピリジル色素、エネルギー転移色素、チアゾールオレンジ色素、およびN-アリール-1,8-ナフタルイミド色素からなる群より選択される、請求項1記載の蛍光色素試薬。
  4. Lが、C2-C8アルキレンである、請求項1記載の蛍光色素試薬。
  5. Naが、化学式-N+(RD)3を有するアンモニウムイオン基であり、各々のRDが、H、C1-C8アルキル、アリール、およびアリールC1-C4アルキルより独立に選択される、請求項1記載の蛍光色素試薬。
  6. 各々のRDが、HまたはC1-C8アルキルである、請求項5記載の蛍光色素試薬。
  7. mが0であり、かつnが1である、請求項1記載の蛍光色素試薬。
  8. mが0であり、かつnが2である、請求項1記載の蛍光色素試薬。
  9. mが1であり、かつnが1である、請求項1記載の蛍光色素試薬。
  10. 蛍光色素構成要素が、フルオレセイン色素、ローダミン色素、およびロードール色素からなる群より選択されるキサンテンまたはベンゾキサンテン色素である、請求項2記載の蛍光色素試薬。
  11. 化学式Iを有する、請求項10記載の蛍光色素試薬：
    Figure 2008510041
    式中、
    A1が、O、N-ZもしくはN+(Z)2を示し、各々のZが、Hもしくは(C1-C8)アルキルである、または任意で5もしくは6員環を形成するためにR2もしくはR4と組み合わせられる、または2つの融合6員環を形成するためにR2およびR4の各々と組み合わせられ；
    A2が、ORもしくはN(Z)2を示し、各々のZが、Hもしくは(C1-C8)アルキルである、または任意で5もしくは6員環を形成するためにR1もしくはR1''と組み合わせられる、または2つの融合6員環を形成するためにR1およびR1''の各々と組み合わせられ、かつRが、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、およびLfからなる群より選択され；
    R1'、R1''、R1、R2、R3、およびR4が、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzより各々独立に選択され；または任意で、R1'、R1''、R2、およびR3の2つの隣接メンバーが、芳香族、非芳香族、もしくは複素芳香族でありかつPzで置換されていてもよい5もしくは6員融合環を形成するために組み合わせられ；
    R1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアルキル部分が、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分が、1〜6個の炭素原子を有し；かつR1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分が、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよく；
    R0が、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、下記化学式を有する置換または非置換へテロアリールまたはアリールであり：
    Figure 2008510041
    式中、X1、X2、X3、X4、およびX5が、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、アリール、ヘテロアリール、SO3H、PO3H、CO2H、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され、かつ任意で、任意の2つの隣接X1〜X5が、芳香族または複素芳香族環を形成するために組み合わせられる。
  12. 化学式I(a)またはI(b)を有する、請求項10記載の蛍光色素試薬：
    Figure 2008510041
    式中、
    各々のAが、ヒドロキシ、アミノ、保護ヒドロキシ、または保護アミノであり；
    R1'、R1''、R1、R2、R3、およびR4が、H、ハロゲン、シアノ、アリール、ヘテロアリール、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、Lf、およびPzより各々独立に選択される、または任意で、R1'、R1''、R2、およびR3の2つの隣接メンバーが、芳香族、非芳香族、もしくは複素芳香族でありかつPzで置換されていてもよい5もしくは6員融合環を形成するために組み合わせられ、R1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアルキル部分が、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分が、1〜6個の炭素原子を有し、かつR1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分が、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよく；
    X1、X2、X3、およびX4が、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルケニル、(C1-C8)アルキニル、SO3H、PO3H、CO2H、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され、かつ任意で、任意の2つの隣接X1〜X4が、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzより選択される1〜4個の置換基でさらに置換されていてもよい芳香族または複素芳香族環を形成するために組み合わせられる。
  13. 下記化学式を有する、請求項1記載の蛍光色素試薬：
    Figure 2008510041
    式中、
    A1が、OもしくはN-Zを示し、Zが、Hもしくは(C1-C8)アルキルである、または任意で5もしくは6員環を形成するためにR2もしくはR4と組み合わせられる、または2つの融合6員環を形成するためにR2およびR4の各々と組み合わせられ；
    A2が、ORもしくはN(Z)2を示し、各々のZが、Hもしくは(C1-C8)アルキルである、または任意で5もしくは6員環を形成するためにR1もしくはR1''と組み合わせられる、または2つの融合6員環を形成するためにR1およびR1''の各々と組み合わせられ、かつRが、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、およびLfからなる群より選択され；
    R1'、R1''、R1、R2、R3、およびR4が、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzより各々独立に選択され；
    R1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアルキル部分が、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分が、1〜6個の炭素原子を有し；かつR1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分が、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい。
  14. 下記化学式を有する、請求項1記載の蛍光色素試薬：
    Figure 2008510041
    式中、
    R1、R1'、R1''、R1'''、R2、およびR3が、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され；
    R1'、R1''、R1'''、およびR1〜R4のいずれかのアルキル部分が、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分が、1〜6個の炭素原子を有し；かつR1'、R1''、R1'''、およびR1〜R4のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分が、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよく；かつ
    A1が、OまたはN-Zを示し、Zが、Hまたは(C1-C8)アルキルである。
  15. 下記化学式を有する、請求項1記載の蛍光色素試薬：
    Figure 2008510041
    式中、
    Q1およびQ2の各々が、O、S、N、およびCRaRb、または-C(=CH2)-より独立に選択され、
    RaおよびRbが、H、メチル、エチル、およびLfからなる群より独立に選択され；
    環AxおよびAyが、縮合置換または非置換アリールまたはヘテロアリール環を各々独立に示し；
    Qが、Lfで置換されていてもよい共役連結系であり；かつ
    RGおよびRG'が、H、C1-C8アルキル、ヘテロアルキル、アルキレンスルホン酸、アルキレンカルボン酸、Lf、およびPzからなる群より独立に選択され；一つまたは二つのPz基が、該試薬に存在する。
  16. Qが、以下からなる群より選択される共役連結系であり：
    Figure 2008510041
    式中、Rが、H、低アルキル、およびLfからなる群より選択される、
    請求項15記載の蛍光色素試薬。
  17. 下記化学式を有する、請求項1記載の蛍光色素試薬：
    Figure 2008510041
    式中、X1、X2、X3、およびX4が、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、SO3H、PO3H、CO2H、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され；かつ任意で、任意の2つの隣接X1〜X4が、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzより選択される1〜4個の置換基でさらに置換されていてもよい非芳香族、芳香族、または複素芳香族5または6員環を形成するために組み合わせられ；かつ0〜1個のLf基および1〜2個のPz基が存在する。
  18. 化合物8、9、10、11、17、18、19、25、26、27、37、38、39、64、65、および66より選択される、請求項1記載の蛍光色素試薬。
  19. 下記化学式およびその塩を有する蛍光色素試薬：
    Figure 2008510041
    式中、
    Flが、蛍光色素構成要素であり；かつ
    Plが、下記化学式を有する官能化ホスホン酸基であり：
    Figure 2008510041
    式中、波線が、該蛍光色素構成要素のsp2炭素への直接的な付着を示し；
    L1が、連結基であり；
    Rが、H、C1-C8アルキル、アリール、アリールC1-C4アルキル、-La-Na、および-La-NRARBからなる群より選択されるメンバーであり；
    Laが、アルキレン連結基であり、Naが、アンモニウムイオン基であり、かつRAおよびRBの各々が、Hおよび不安定保護基からなる群より独立に選択され；
    かつ
    Paが、ホスホラミダイト部分、少なくとも一つの末端官能基または保護官能基を有する一、二、または三官能性連結基、固体支持体、および反応基からなる群より選択される官能基構成要素である。
  20. 蛍光色素構成要素が、クマリン、ベンゾクマリン、キサンテン、ベンゾ[a]キサンテン、ベンゾ[b]キサンテン、ベンゾ[c]キサンテン、シアニン、アクリジン、ジピロメテンボロンジフルオリド、フェノキサジン、ベンゾ[a]フェノキサジン、ベンゾ[b]フェノキサジン、およびベンゾ[c]フェノキサジンからなる群より選択される、請求項19記載の蛍光色素試薬。
  21. 蛍光色素構成要素が、クマリン色素、レゾルフィン色素、ジピロメテンボロンジフルオリド色素、ルテニウムビピリジル色素、エネルギー転移色素、チアゾールオレンジ色素、およびN-アリール-1,8-ナフタルイミド色素からなる群より選択される、請求項19記載の蛍光色素試薬。
  22. 蛍光色素構成要素が、フルオレセイン色素、ローダミン色素、およびロードール色素からなる群より選択されるキサンテンまたはベンゾキサンテン色素である、請求項19記載の蛍光色素試薬。
  23. 化合物44、45、46、51、52、53、56、57、58、および59からなる群より選択される、請求項22記載の蛍光色素試薬。
  24. ホスホン酸-蛍光色素誘導体を調製する方法であって、該ホスホン酸-蛍光色素誘導体を形成するために、芳香族環炭素原子に付着された少なくとも一つのハロゲン原子を有するハロ-蛍光色素基質を、該ハロゲン原子を除去しかつホスホン酸基を該芳香族環炭素原子に共有結合させるのに十分な条件下で、亜リン酸試薬に接触させることを含む方法。
  25. ハロ-蛍光色素基質が、ハロクマリン、ハロベンゾクマリン、ハロキサンテン、ハロベンゾ[a]キサンテン、ハロベンゾ[b]キサンテン、ハロベンゾ[c]キサンテン、ハロシアニン、ハロアクリジン、ハロジピロメテンボロンジフルオリド、ハロフェノキサジン、ハロベンゾ[a]フェノキサジン、ハロベンゾ[b]フェノキサジン、およびハロベンゾ[c]フェノキサジンからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
  26. 亜リン酸試薬が、亜リン酸ジフェニル、亜リン酸ジエチル、および亜リン酸ビス(4-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)ブチル)からなる群より選択されるメンバーである、請求項24記載の方法。
  27. 亜リン酸試薬が、亜リン酸ビス(4-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)ブチル)または化合物41である、請求項24記載の方法。
  28. 請求項27記載の方法に従って調製されるホスホン酸蛍光色素誘導体。
  29. mが1であり、かつオリゴヌクレオチドへの蛍光色素試薬の付着が、Lf上に存在する官能基を介する、付着された請求項1記載の蛍光色素試薬を有するオリゴヌクレオチドプローブ。
  30. mが1であり、かつオリゴヌクレオチドへの蛍光色素試薬の付着が、Lf上に存在する官能基を介する、付着された消光剤および付着された請求項1記載の蛍光色素試薬を有するオリゴヌクレオチドプローブ。
  31. mが1であり、かつオリゴヌクレオチドへの色素試薬の付着が、Lf上に存在する官能基を介する、付着された消光剤、マイナーグルーブ結合剤、および付着された請求項1記載の蛍光色素試薬を有するオリゴヌクレオチドプローブ。
  32. オリゴヌクレオチドへの蛍光色素試薬の付着が、Pa上に存在する官能基を介する、付着された請求項19記載の蛍光色素試薬を有するオリゴヌクレオチドプローブ。
  33. オリゴヌクレオチドへの蛍光色素試薬の付着が、Pa上に存在する官能基を介する、付着された消光剤および付着された請求項19記載の蛍光色素試薬を有するオリゴヌクレオチドプローブ。
  34. オリゴヌクレオチドへの蛍光色素試薬の付着が、Pa上に存在する官能基を介する、付着された消光剤、マイナーグルーブ結合剤、および付着された請求項19記載の蛍光色素試薬を有するオリゴヌクレオチドプローブ。
  35. 下記化学式を有する化合物：
    Figure 2008510041
    式中、
    Lが、(C1-C20)アルキレンおよび(C1-C20)ヘテロアルキレン連結基からなる群より選択されるメンバーであり；
    Xが、官能基および保護官能基からなる群より選択されるメンバーであり、該官能基が、ヒドロキシ、ジオール、カルボキシ、ホルミル、カルボニル、チオ、アミノオキシ、アジド、カルバゾイル、ヒドラジン、または化学式NRARBを有するアミノであり；
    Rが、不安定保護基および-L-NRARBからなる群より選択されるメンバーであり；
    かつRAおよびRBの各々が、H、(C1-C8)アルキル、および不安定保護基より独立に選択され、かつRAおよびRBの少なくとも一つが、Hまたは(C1-C8)アルキル以外である。
  36. Rが、第三ブチル基である、請求項35記載の化合物。
  37. Rが-L-NRARBであり、かつXが-NRARBである、請求項35記載の化合物。
  38. 各々のRAがHであり、かつ各々のRBが、-C(O)CF3、-C(O)OtBu、FMOC、フタルイミド、モノメトキシトリチル、および-C(O)O-ベンジルからなる群より選択される保護基である、請求項37記載の化合物。
  39. Xが、-O-ジメトキシトリチルである、請求項35記載の化合物
  40. Figure 2008510041
    からなる群より選択される、請求項35記載の化合物。
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