JP3266865B2 - 赤外染料で標識されたヌクレオチド及び核酸検出におけるそれらの使用 - Google Patents

赤外染料で標識されたヌクレオチド及び核酸検出におけるそれらの使用

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】本発明は、長波長領域に吸収をも
つ蛍光残基を有するヌクレオシド-5'-三リン酸及びホス
ホルアミダイト、好ましくはその塩基部分またはリン原
子にカルボシアニン基を有するヌクレオシド-5'-三リン
酸及びホスホルアミダイト、ならびに核酸の標識、検出
および配列決定のためのそれらの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸は、遺伝情報の担体または伝達体と
して生物においてきわめて重要なものである。F. Miesc
her による核酸の発見以来、核酸は広範囲の科学的な興
味を刺激し、それらの機能、構造および作用のメカニズ
ムの解明に至った。これらの基礎的な分子生物学的メカ
ニズムの知識が増えるにしたがって、近年、遺伝子の新
しい組み合わせを追求することが可能になった。この技
術は、例えば、医学的診断および治療ならびに植物育種
において新たな可能性を開いた。
【０００３】これらの相互関係を理解し、そしてその問
題を解くために必須の手段は、核酸の検出、換言すれば
核酸の特異的検出および核酸の配列すなわち核酸の一次
構造に関するものであったし、現在もそうである。核酸
の特異的検出性は、これらの分子が相互に作用する、す
なわち、他の核酸と水素結合を介して塩基対を形成する
ことによりハイブリッドを形成するという特性に基づ
く。従って、適切な手法で標識された、すなわち指示基
(indicator groups)を付与された核酸（プローブ）を用
いることにより相補的な核酸（ターゲット）を検出する
ことができる。
【０００４】核酸の一次構造（配列）の決定、すなわち
複素環式塩基の配列の決定は、配列決定技術によって行
う。この配列の知識もまた、分子生物学的研究および作
業技術において、核酸の目標を定めた特異的な使用にと
って必要条件である。また、最終的に、配列決定は核酸
相互の特異的ハイブリッド形成の原理をも利用する。ま
た、上述したように、標識された核酸断片も配列決定に
使用される。
【０００５】以上のことから、核酸の適当な標識は、い
ずれの検出方法にとっても必須条件であるということは
明白である。とりわけ、32Ｐまたは35Ｓなどの適当な同
位体を用いる放射性標識は、すでに早期の段階で配列決
定に使用されていた。しかしながら、放射性試薬を使用
することの欠点が明らかである：そのような操作には特
別の部屋の設備および許可ならびに放射性廃棄物の管理
されたやっかいな処分が必要である。放射性標識用の試
薬は高価である。そのような標識された試料の長期保管
は上記核種の半減期が短いために不可能である。
【０００６】したがって、近年、これらの重大な欠点を
回避する、すなわち放射性標識から逃れるための多くの
試みがなされてきた。そうすることにおいて、かかるタ
イプの標識の高い感度は可能なかぎり保持されなければ
ならない。事実、この場合、大きな改善がなされてきた
〔例えば、Nonradioactive Labeling and DetectionofB
iomolecules, C. Kessler（編集者）、“Springer Verl
ag Berlin,Heidelberg ”1992を参照のこと〕。
【０００７】ハプテン（ビオチンまたはジゴキシゲニン
など）、酵素（アルカリホスファターゼまたはペルオキ
シダーゼなど）または蛍光染料（フルオレセインまたは
ローダミンなど）は、特に数ある中で非放射性指示分子
（non-radioactive indicator molecules ）として成功
していることが証明されている。例えばジゴキシゲニン
などのハプテンでの標識は放射能の感度の範囲に達する
が、放射性標識に類似のハプテン標識核酸の直接的検出
は不可能である。例えば、抗体反応によって達成される
次の検出反応が必要である。この間接的な検出にはいく
つかのステップ、すなわち多くの時間と、経済上の費用
が必要である。その検出反応のためにタンパク質を使用
するので、非特異的結合を低減するために阻止ステップ
および洗浄ステップによる固相（膜、マイクロタイター
プレート）の特別な処理が必要である。それにもかかわ
らず、非特異的タンパク質結合に起因する妨害バックグ
ラウンド染色（interferingbackground colouration)が
発生するため、この２ステップ検出の感度は、通常、制
限される。根本的に同様のことが直接的酵素−標識核酸
にあてはまる。
【０００８】蛍光標識核酸を用いると、上述した間接的
検出の該欠点が生じない。原則として蛍光を励起するこ
とにより直接的検出が可能であり、可視化して適当な装
置（蛍光顕微鏡、スキャナー）で測定することができ
る。しかしながら、この場合も細胞および色素、脂肪、
タンパク質といったような試験される生体材料の組織成
分の自己蛍光（autofluorescence）が妨害する。特に固
体担体物質（例えば、ナイロン膜）を使用すると、その
固有の蛍光によりそのような妨害が生じて、検出を複雑
にするか、または妨げる。
【０００９】原則としてこれらの問題を解決するには、
励起および放出が680nmより大きい波長領域すなわち近
赤外（NIR）領域で生ずる染料を使用することである。
上述の妨害蛍光はこれらの環境下では無意味である。さ
らに重要な利点は、かなり耐久性のある安価なレーザー
ダイオードを励起に使用することができるということで
ある。
【００１０】従って、例えば、ＤＮＡ断片の蛍光標識後
のレーザーおよびセンサーを用いた光電測定によるＤＮ
Ａ配列決定の技術がある出願（US 4,729,947）の主題で
ある。この方法では、IR染料で標識されたオリゴヌクレ
オチドがいわゆるサンガー法におけるプライマーとして
公知の手法で使用され、それらはかかる方法においては
新しい相補的核酸鎖の合成のためのスターターとして挙
動する。しかしながら、この方法の欠点は−−配列決定
されるＤＮＡに依存するが−−特異的標識プライマーを
各場合ごとに幾度も新たに合成しなければならない、す
なわちそのような標識プライマーを多数合成しなければ
ならないということである。この標識されたオリゴマー
プライマーの合成は、第一に非標識オリゴヌクレオチド
を合成し、続いて第二の反応においてシグナル（レポー
ター）基を化学的に結合しなければならないので、高価
で時間もかかる。
【００１１】
【発明が解決しようとする分野】従って、本発明の目的
は、一般的で、簡単で、かつ特異的な核酸の標識を可能
にする化合物を製造することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】今や、適切に標識された
ヌクレオシド三リン酸をポリメラーゼを用いて取り込ま
せることにより核酸を新たに合成し、それと同時に標識
することができるということが判明した。デオキシリボ
核酸（ＤＮＡ）の分野においては、これは、ニックトラ
ンスレーション法〔Rigby, P.W. ら、(1977) J. Mol. B
iol. 113, 237〕およびランダムプライマー標識法〔Fei
nberg,A.P. & Vogelstein, B. (1984)Anal. Biochem.
137, 266〕を用いてＤＮＡポリメラーゼにより、デオキ
シヌクレオチドを取り込ませることによって達成され、
リボ核酸の場合は、翻訳のラインに沿ってＲＮＡポリメ
ラーゼおよびリボヌクレオチドを用いることにより達成
される。核酸を標識するさらなる方法は、ターミナルト
ランスフェラーゼおよびリボまたはデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸の補助を伴ういわゆる3'テーリング反応
（tailing reaction）によるものである。
【００１３】しかしながら、フルオレセインまたはジゴ
キシゲニン（MW 332または390 ）などの指示分子を付与
されたヌクレオシド三リン酸は−−それらの天然の基質
と対比すると−−ポリメラーゼによる基質としての受け
取りが相対的に不完全であり、新しく合成された核酸へ
の取り込みが相対的に不完全である（Hoeltke, H.-J.ら
(1990) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 371, 929)。
【００１４】従って、さらにいっそう高分子量（800〜1
000）の指示分子がポリメラーゼにより基質として受け
取られ、核酸に取り込まれることは期待できない。空間
的に要求のきびしい構造が付与されたこれらの分子は強
い立体障害のためにポリメラーゼによって転化されるこ
とはほとんど起こりそうもない。驚くべきことに、今
や、赤外染料で標識されたヌクレオシド三リン酸はＴ７
ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼにより基質とし
て受け取られ、核酸に取り込まれることが見いだされ
た。従って、本発明による化合物は新規である。
【００１５】本発明のさらなる目的は、上述の本発明に
よる標識核酸を用いて、そのように標識された核酸を、
例えばナイロン膜などの固体担体上、あるいは例えばマ
イクロタイタープレート内などの溶液中で直接的に検出
することを可能にする方法を見いだすことであった。す
でに上記したように、フルオレセインまたはテトラメチ
ルローダミンなどの発蛍光団をもちいて核酸を標識する
ことの欠点は、担体物質の固有の蛍光が、その発蛍光団
の蛍光の測定を妨害することである。
【００１６】しかしながら、本発明によるＩＲ染料で標
識したヌクレオシド三リン酸を核酸の標識に使用する
と、測定波長が近赤外領域にあるのでそのような妨害は
もはや無意味である。本来の位置のハイブリッド形成に
よる核酸検出の利点は公知である。かかる方法におい
て、標識試料またはプローブは、蛍光顕微鏡で直接的に
検出されるか、あるいはハプテン標識の場合、さらなる
操作ステップによって免疫学的反応（ELISA）において
検出される。このような可視化は、通常、試料を、例え
ばナイロン膜上にまたはマイクロタイタープレート内の
液体均一相中で固定化することにより達成される。この
追加のステップはかなり時間がかかり、高価である。し
たがって、このステップを省略することが望まれてい
る。
【００１７】適当なレーザーダイオードによるＩＲ−蛍
光標識核酸を直接的に励起することの可能性および上述
の担体物質の自己蛍光に対する検出の不感受性により、
簡単で費用に対して最も効率のよい装置を使用すること
ができる。免疫学的検出反応は省略することができる。
ＩＲ−標識核酸は、適当なスキャナーまたはマイクロタ
イタープレートリーダーの補助を伴うレーザー／検出器
の併用によって光学的手段で簡単に検出される。
【００１８】要約すると、本発明による赤外発蛍光団で
標識したヌクレオシド5'-三リン酸をポリメラーゼ基質
として使用すると、核酸への直接的な酵素的取り込み、
ならびに配列決定のためにこのように標識された核酸を
検出することが可能となり、そして、その使用はまた、
この組み合わせにおいて新規であり、同時に本発明の一
部をなすin situ ハイブリッド形成をも許容する。
【００１９】本発明は、一般式：
【００２０】
【化３】
【００２１】（式中、Ｂは複素環式塩基であるアデニ
ン、グアニン、ヒポキサンチン、7-デアザ-アデニン、7
-デアザ-グアニン、7-デアザ-ヒポキサンチン、7-デア
ザ-8-アザ-アデニン、7-デアザ-8-アザ-グアニン、7-デ
アザ-8-アザ-ヒポキサンチン、ならびにチミン、シトシ
ンおよびウラシルを示し、Ｘはｎ＝４〜20原子の結合基
を表し、Sigは650〜800nmの励起波長をもつ蛍光分子を
表し、Ｒ1およびＲ2は、それぞれＨおよび／またはOHを
表す。）で表されるヌクレオシド-5'-三リン酸を提供す
る。
【００２２】本発明の一態様において、上記の一般式中
のＢは上述したとおりであり、Ｘは好ましくはｎ＝10〜
15原子の結合基を表し、Sigは一般式：
【００２３】
【化４】
【００２４】（式中、Ｒ11およびＲ12はＨを表し、Ｒ3
は、ヌクレオチドとの結合がＲ4部位を介する場合はＨ
であり、結合がＲ3部位を介する場合は-NHCS-であり、
Ｒ4およびＲ5は、それぞれｎ＝３〜５のアルキルスルホ
ニルを示し、または、結合がＲ4部位を介する場合はＲ4
はｎ＝３〜８の-NHCS-、Ｒ5は、ｎ＝３〜５のアルキル
スルホニルを示す。）で示されるカルボシアニンを表
す。
【００２５】本発明は、また、ＤＮＡポリメラーゼの基
質としての上記化合物およびそれらの使用、ＲＮＡポリ
メラーゼの基質としての上記化合物およびそれらの使
用、核酸を標識するための上記化合物の使用、核酸を検
出するための上記化合物の使用、ＤＮＡ配列決定におけ
る上記化合物の使用およびin situ ハイブリッド形成に
おいて使用される上記化合物の使用に関する。ハイブリ
ッド形成は膜上、溶液中またはマイクロタイタープレー
ト内の溶液中で行うとよい。
【００２６】標識されたハイブリッドは適切なレーザー
ダイオードおよび検出器により検出できる。さらに、本
発明は、一般式：
【００２７】
【化５】
【００２８】（式中、Ｒ11およびＲ12はＨを表し、Ｒ3
およびＲ4はそれぞれｎ＝３〜５のアルキルスルホニル
を示し、Ｒ5はメトキシまたは2-シアノエトキシを示
し、Ｒ'およびＲ"はそれぞれエチルまたはイソプロピル
を示し、Ｘは１〜10を示す。）で表される化合物を提供
する。本発明は、ホスホルアミダイト法によるオリゴヌ
クレオチド合成に使用する、上記化合物の使用、および
オリゴヌクレオチドの5'- 標識のための上記化合物の使
用にも関する。
【００２９】
【発明の実施の形態】本発明の一般式：
【００３０】
【化６】
【００３１】で表されるヌクレオシド5'-三リン酸は、
修飾されていないヌクレオシドから出発して周知の方法
により製造される。これら、すなわちピリミジンヌクレ
オシドの場合はウリジン、チミジンおよびシチジン、お
よびプリンヌクレオシドの場合はアデノシンおよびグア
ノシン、ならびにそれに対応する7-デアザ-プリンおよ
び7-デアザ-8-アザプリンヌクレオシドは、適当な手法
でＣ−５またはＣ−６（ピリミジン）、Ｃ−８（プリ
ン）、Ｃ−８（3-デアザ-プリン）、Ｃ−７またはＣ−
８（7-デアザ-プリン）の位置で化学的に修飾され、そ
して最終的に5'-リン酸化される。
【００３２】修飾基は適当な長さのスペーサーおよび適
当な活性化された蛍光染料（例えば、イソチオシアン酸
塩またはN-ヒドロキシスクシンイミドエステルの形）で
置換され得る末端第一級または第二級アミノ基から構成
されることが都合がよい。そのような蛍光染料は活性化
された形、すなわち、例えば、アミノ基とよく反応する
形、好ましくはイソチオシアン酸塩として使用される。
その反応が完了した後、その発蛍光団はヌクレオチドの
修飾基にNHCS基を介して共有結合される。
【００３３】このようにして修飾されたヌクレオシドの
リン酸化は、文献〔すなわち、Yoshikawa, M. ら (196
7) Tetrah. Lett. 50, 5065〕に記載された公知の方法
にしたがって三塩化リンと反応させて一リン酸塩を生成
させ、次いでピロリン酸と反応させて所望の5'-三リン
酸塩を生成させることにより行われる。またそれに代わ
る方法として、予め生成させたヌクレオシド5'-三リン
酸の直接修飾も可能である。
【００３４】発蛍光団は近赤外領域、すなわち600〜800
nmの間に吸収をもつ化合物である。例えば、カルボシア
ニンなどの630nm〜780nmの化合物が好ましい。すでに上
記したように、ポリメラーゼを用いて標識ヌクレオシド
を取り込ませるための上記の方法に加えて、標識オリゴ
ヌクレオチド、いわゆるプライマーの使用に基づくさら
なる方法が一般的である。すでに言及したように、多段
階反応におけるこれらの分子の通常の合成はきわめて時
間がかかる。この方法において、オリゴヌクレオチド合
成が完了した後、追加のステップにおいてシグナル基を
オリゴマーの5'-末端に結合させなければならない。実
際のオリゴヌクレオチド合成は自動合成装置で行われる
ので、シグナル基の結合のステップもすでにその合成装
置内で行うことが可能になることも強く望まれている。
該オリゴヌクレオチド合成は単量体構成単位を少しずつ
結合させること、いわゆるヌクレオシドホスホルアミダ
イトから構成されるので、本発明のさらなる目的は自動
オリゴヌクレオチド合成における最終ステップとしてシ
グナル基の直接取り込みを可能にする発蛍光団ホスホル
アミダイトを開発することであった。そのようなＮＩＲ
−染料−ホスホルアミダイトは今まで知られておらず、
発明的に新規である。
【００３５】本発明を下記の実施例によってさらに詳細
に説明する。
【００３６】
【実施例】実施例１5-(3-アミノアリル)-2'-デオキシ-ウリジン-5'-三リン
酸 この誘導体は Langer らのProc. Natl. Acad. Sci. USA
(1981) 78, 6635の記載にしたがって合成した。 実施例２無水-11-フェノキシ-10,12-プロピレン-3,3,3',3'-テト
ラメチル-4,5-ベンズインド-インドトリカルボシアニン
-1-(4-スルホブチル)-1'-(3-アミノプロピル)-チオノ-
[5-(3-アミノアリル)-2'-デオキシウリジン-5'三リン
酸] ジメチルホルムアミド１ml中の無水-11-フェノキシ-10,
12-プロピレン-3,3,3',3'-テトラメチル-4,5-ベンズイ
ンド-1-(4-スルホブチル)-1'-(3-イソチオシアノプロピ
ル)-インドトリカルボシアニンNa塩 50mg の溶液を、
0.1Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液(pH8.5) ２ml中の5-アミ
ノアリル-dUTP-Li4 33mg(60μmol)の溶液に添加して、
その反応混合物を遮光しながら室温で約15時間放置し
た。その後、濾紙電気泳動（0.05Ｍクエン酸ナトリウム
緩衝液、pH５）によれば、出発物質の大部分が反応して
いた。所望の物質を単離するために、反応混合物を水約
50mlで希釈して、深緑色の溶液を塩化物型のDEAE Sepha
dex A-25を含むイオン交換カラムに注いだ。生成物を、
１ＭLiClに対する水の直線グラジエントでカラムから溶
離し、生成物画分を減圧で濃縮して、RP18物質上の逆相
クロマトグラフィーによって脱塩した。凍結乾燥後、所
望の三リン酸塩６μmol(10％）を得た。
【００３７】スペクトルデータ：Emissionmax 786 nm、
720 nm（肩）、238 nm 実施例３無水-10,12-プロピレン-3,3,3',3'-テトラメチル-1,1'-
ビス(3-スルホブチル)-インドトリカルボシアニン-11-
(4-アミノ)-フェノキシ-チオノ-[8-(5-アミノペンチル
アミノ)-2'-デオキシ-アデノシン-5'-三リン酸] （「IR
D-dATP」） この誘導体は、8-アミノペンチルアミノ-dATP 38mg（60
μmol)および無水-10,12-プロピレン-3,3,3',3'-テトラ
メチル-1,1'-ビス(3-スルホブチル)-11-(4-イソチオシ
アノ)-フェノキシ-インドトリカルボシアニンNa塩50mg
（60μmol)から、実施例２で述べた方法にしたがって調
製した。化合物３μmol が得られた。
【００３８】スペクトルデータ：Emissionmax 770 nm、
697 nm（肩）、279 nm 実施例４T7-DNAポリメラーゼの基質としてのIRD-dATPの使用 鋳型ＤＮＡ３μｇを、反応緩衝液 ( 200mMトリス-HCl、
pH7.5 、 100mM MgCl2、 250mM NaCl ）２μl 、M13/pU
C プライマー１pMおよびH2O ７μl の混合物中で37℃で
15分間インキュベートした。
【００３９】DTT １μl(100mM)、標識混合物（IRD 40-d
ATP 10μM 、dCTP、dGTPおよびdTTPをそれぞれ１μM ）
２μl 、H2O １μl およびT7-DNAポリメラーゼ２μl
(2.5 U／μl)を標識反応のために添加して、室温で10分
間インキュベートした。続いて、ＤＮＡ配列決定に使用
するために、終止混合物（ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTT
P) を添加することにより終止反応を行った。 実施例５無水-11-フェノキシ-10,12-プロピレン-3,3,3',3'-テト
ラメチル-4,5-ベンズイ ンド-インドトリカルボシアニン-1-(4-スルホブチル)-
1'-(3-アミノプロピル)-チオノ-[5-(3-アミノアリル)-
ウリジン-5'-三リン酸] この化合物は5-アミノアリル-UTP（実施例１にしたがっ
て調製した）および対応するイソチオシアン酸塩から実
施例２と同様にして合成した。
【００４０】スペクトルデータは実施例２の2'-デオキ
シ化合物と一致する。 実施例６無水-10,12-プロピレン-3,3,3',3'-テトラメチル-1,1'-
ビス(3-スルホブチル)-インド-トリカルボシアニン-11-
(4-アミノ)フェノキシ-チオノ-[5-(3-アミノアリル)-
2',3'-ジデオキシ-ウリジン-5'-三リン酸] （「IRD-ddU
TP 」） ステップ１：2',3'-ジデオキシ-ウリジン-5'-三リン酸 この誘導体は、市販の2',3'-ジデオキシ-シチジン-5'-
三リン酸（ベーリンガー マンハイム）をNaNO2/酢酸で
脱アミノ化することから出発する不安定なジアゾニウム
誘導体を介して合成した。
【００４１】ステップ２：5-(3- アミノアリル)-2',3'-
ジデオキシ-ウリジ ン-5'-三リン酸 この化合物は、Langerらにしたがって、2',3'-ジデオキ
シ-UTPの5-水銀誘導体を介して実施例１と同様にして調
製した。 ステップ３：「IRD-ddUTP 」 このジデオキシ誘導体は、実施例２にしたがって5-アミ
ノアリル-ddUTPとそれに対応するイソチオシアン酸塩と
を反応させることにより得られた。
【００４２】そのスペクトルデータは実施例３の2'-デ
オキシ化合物のものと一致する。 実施例７無水-10,12-プロピレン-3,3,3',3'-テトラメチル-1,1'-
ビス(3-スルホプロピル)-インド-トリカルボシアニン-1
1-[(4-エトキシ)フェノキシ-O-(2-シアノエチル)-N,N-
ジイソプロピル-ホスホルアミダイト 50ml丸底フラスコ中で、無水-11-(4-ヒドロキシエチル)
フェノキシ-10,12-プロピレン-3,3,3',3'-テトラメチル
-1,1'-ビス(3-スルホプロピル)-インドトリカルボシア
ニン-ハイドロオキサイドのNa塩 425mg(0.5mmol) を、
乾燥アセトニトリル５mlに溶解し、エチルジイソプロピ
ルアミン 0.275ml(1.6mmol) を添加した。次いで、クロ
ロ-β-シアノエトキシ-N,N-ジイソプロピルアミノホス
ファン0.125mlを窒素下、攪拌しながら約３分以内に滴
下添加した。さらに室温で30分間攪拌し、次に、５％Na
HCO3水溶液10mlを添加し、続いてジクロロメタン約10ml
をそれぞれ用いて２回抽出を行った。溜まった有機相を
硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を蒸留により除去し
て、残留物を移動溶媒ジクロロメタン／酢酸エチル／ト
リエチルアミン 45:45:10 を用いてシリカゲルにおける
クロマトグラフィーにかけた。
【００４３】収量は 480mg（理論値に対して88.7％）で
あった。 TLC （シリカゲル、上記の移動溶媒）Ｒf＝0.431 Ｐ−ＮＭＲ（d6DMSO):149 および153ppm（２ジアステ
レオマー）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ビルクナー，クリスチャン ドイツ連邦共和国 ディー−82449 ウ フィンク ヴィリンクシュトラーセ ９ 番地 (72)発明者 フォン デル エルツ，ハーバート ドイツ連邦共和国 ディー−82362 ヴ ァイルハイム，イン デル アオ 21番 地 (56)参考文献 特開 昭63−152364（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−128364（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−504144（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−500353（ＪＰ，Ａ) Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．65, Ｎｏ．５，601−605，1993 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 19/04 C07H 19/10 C07H 19/20 C12Q 1/68 G01N 33/58 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 一般式： 【化１】 ［式中、Ｂは複素環式塩基であるアデニン、グアニン、
    ヒポキサンチン、7-デアザ-アデニン、7-デアザ-グアニ
    ン、7-デアザ-ヒポキサンチン、7-デアザ-8-アザ-アデ
    ニン、7-デアザ-8-アザ-グアニン、7-デアザ-8-アザ-ヒ
    ポキサンチン、ならびにチミン、シトシンおよびウラシ
    ルを示し、 Ｘｎは４〜20原子を有する結合基を表し、 Sigは10,12-プロピレン-3,3,3',3'-テトラメチル-1,1'-
    ビス(3-スルホブチル)-インドトリカルボシアニン-11-
    (4-アミノ)-フェノキシ-チオノ、 または一般式： 【化２】 （式中、Ｒ11よびＲ12はＨであり、 Ｒ3は、ヌクレオチドとの結合がＲ5部位を介する場合は
    Ｈであり、結合がＲ3部位を介する場合は-NHCS-であ
    り、 Ｒ4およびＲ5はそれぞれ独立に-SO3Hまたは-SO3 -であ
    り、 Ｙは炭素数３〜５の線状アルキレン基であり、 Ｚは炭素数３〜５の線状アルキレン基であり、 または結合がＲ5部位を介する場合は、Ｒ5は-NHCS-であ
    り、Ｚは炭素数３〜８の線状アルキレン基であり、Ｒ4
    は-SO3Hまたは-SO3 -であり、Ｙは炭素数３〜５の線状ア
    ルキレン基である） で示されるカルボシアニンを表し、 Ｒ1およびＲ2は、それぞれＨおよび／またはOHを表す］ で表されるヌクレオシド-5'-三リン酸。
  2. 【請求項２】 ＤＮＡポリメラーゼの基質として請求項
    １に記載の化合物を使用することにより、該化合物を核
    酸に取り込む方法。
  3. 【請求項３】 ＲＮＡポリメラーゼの基質として請求項
    １に記載の化合物を使用することにより、該化合物を核
    酸に取り込む方法。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の化合物を使用すること
    により、核酸を標識する方法。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の化合物を使用すること
    により、核酸を検出する方法。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載の化合物を使用すること
    により、ＤＮＡを配列決定する方法。
  7. 【請求項７】 in situ ハイブリッド形成において請求
    項１に記載の化合物を使用する、請求項４〜６のいずれ
    か１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 ハイブリッド形成を膜上で行う、請求項
    ７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 ハイブリッド形成を溶液中で行う、請求
    項７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ハイブリッド形成をマイクロタイター
    プレート内の溶液中で行う、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 標識されたハイブリッドが適切なレー
    ザーダイオードおよび検出器により検出される、請求項
    ５に記載の方法。
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