JPH07507576A - 赤外染料で標識されたヌクレオチド及び核酸検出におけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 赤外染料で標識されたヌクレオチド及び核酸検出におけるそれらの使用 本発明は、長波長領域に吸収をもつ蛍光残基を有するヌクレオシド−５°−三リ ン酸及びホスホルアミダイト、好ましくはその塩基部分またはリン原子にカルボ シアニン基を有するヌクレオシド−５°−三リン酸及びホスホルアミダイト、な らびに核酸の標識、検出および配列決定のためのそれらの使用に関する。

核酸は、遺伝情報の担体または伝達体として生物においてきわめて重要なもので ある。Ｆ、　Ｍｉｅｓｃｈｅｒによる核酸の発見以来、核酸は広範囲の科学的な 興味を刺激し、それらの機能、構造および作用のメカニズムの解明に至った。こ れらの基礎的な分子生物学的メカニズムの知識が増えるにしたがって、近年、遺 伝子の新しい組み合わせを追求することが可能になった。この技術は、例えば、 医学的診断および治療ならびに植物育種において新たな可能性を開いた。

これらの相互関係を理解し、そしてその問題を解くために必須の手段は、核酸の 検出、換言すれば核酸の特異的検出および核酸の配列すなわち核酸の一次構造に 関するものであったし、現在もそうである。

核酸の特異的検出性は、これらの分子が相互に作用する、すなわち、池の核酸と 水素結合を介して塩基対を形成することによりハイブリッドを形成するという特 性に基づく。従って、適切な手法で標識された、すなわち指示基（ｉｎｄｉｃａ ｔｏｒ　ｇｒｏｕｐｓ）を付与された核酸（プローブ）を用いることにより相補 的な核酸（ターゲット）を検出することができる。

核酸の一次構造（配列）の決定、すなわち複素環式塩基の配列の決定は、配列決 定技術によって行う。この配列の知識もまた、分子生物学的研究および作業技術 において、核酸の目標を定めた特異的な使用にとって必要条件である。また、最 終的に、配列決定は核酸相互の特異的ハイブリッド形成の原理をも利用する。ま た、上述したように、標識された核酸断片も配列決定に使用される。

以上のことから、核酸の適当な標識は、いずれの検出方法にとっても必須条件で あるということは明白である。

とりわけ、３２Ｐまたは３５３などの適当な同位体を用いる放射性標識は、すで に早期の段階で配列決定に使用されていた。しかしながら、放射性試薬を使用す ることの欠点が明らかである：そのような操作には特別の部屋の設備および許可 ならびに放射性廃棄物の管理されたやっかいな処分が必要である。放射性標識用 の試薬は高価である。そのような標識された試料の長期保管は上記核種の半減期 が短いために不可能である。

したがって、近年、これらの重大な欠点を回避する、すなわち放射性標識から逃 れるための多くの試みがなされてきた。そうすることにおいて、かかるタイプの 標識の高い感度は可能なかぎり保持されなければならない。事実、この場合、大 きな改善がなされてきた〔例えば、Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｌａｂｅｌ ｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、　Ｃ， Ｋｅｓｓｌｅｒ　（編集者）、”Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　ｖｅｒｔａｇ　Ｂｅｒｌｉ ｎ、　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ″１９９２を参照のこと〕。

ハプテン（ビオチンまたはジゴキシゲニンなど）、酵素（アルカリホスファター ゼまたはペルオキシダーゼなど）または蛍光染料（フルオレセインまたはローダ ミンなど）は、特に数ある中で非放射性指示分子（ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉ ｖｅ　１ｎｄｉｃａｔｏｒ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　）として成功していることが 証明されている。

例えばジゴキシゲニンなどのハプテンでの標識は放射能の感度の範囲に達するが 、放射性標識に類似のハプテン標識核酸の直接的検出は不可能である。例えば、 抗体反応によって達成される次の検出反応が必要である。この間接的な検出には いくつかのステップ、すなわち多くの時間と、経済上の費用が必要である。その 検出反応のためにタンパク質を使用するので、非特異的結合を低減するために阻 止ステップおよび洗浄ステップによる固相（膜、マイクロタイタープレート）の 特別な処理が必要である。それにもかかわらず、非特異的タンパク質結合に起因 する妨害バックグラウンド染色（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ 　ｃｏｌｏｕｒａｔｉｏｎ）が発生するため、この２ステツプ検出の感度は、通 常、制限される。根本的に同様のことが直接的酵素−標識核酸にあてはまる。

蛍光標識核酸を用いると、上述した間接的検出の該欠点が生じない。原則として 蛍光を励起することにより直接的検出が可能であり、可視化して適当な装置（蛍 光顕微鏡、スキャナー）で測定することができる。しかしながら、この場合も細 胞および色素、脂肪、タンパク質といったような試験される生体材料の組織成分 の自己蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）が妨害する。特に固体担体物 質（例えば、ナイロン膜）を使用すると、その固有の蛍光によりそのような妨害 が生じて、検出を複雑にするか、または妨げる。

原則としてこれらの問題を解決するには、励起および放出が６８０ｎｍより大き い波長領域すなわち近赤外（ＮＩＲ）領域で生ずる染料を使用することである。

上述の妨害蛍光はこれらの環境下では無意味である。さらに重要な利点は、かな り耐久性のある安価なレーザーダイオードを励起に使用することができるという ことである。

従って、例えば、ＤＮＡ断片の蛍光標識後のレーザーおよびセンサーを用いた充 電測定によるＤＮＡ配列決定の技術がある出願（ＵＳ　４，７２９，９４７）の 主題である。この方法では、ＩＲ染料で標識されたオリゴヌクレオチドがいわゆ るサンが一法におけるプライマーとして公知の手法で使用され、それらはかかる 方法においては新しい相補的核酸鎖の合成のためのスターターとして挙動する。

しかしながら、この方法の欠点はｍ−配列決定されるＤＮＡに依存するがｍ−特 異的標識プライマーを各場合ごとに幾度も新たに合成しなければならない、すな わちそのような標識プライマーを多数合成しなければならないということである 。この標識されたオリゴマープライマーの合成は、第一に非標識オリゴヌクレオ チドを合成し、続いて第二の反応においてシグナル（レポーター）基を化学的に 結合しなければならないので、高価で時間もかかる。

従って、本発明の目的は、一般的で、簡単で、かつ特異的な核酸の標識を可能に する化合物を製造することにある。

今や、適切に標識されたヌクレオシド三リン酸をポリメラーゼを用いて取り込ま せることにより核酸を新たに合成し、それと同時に標識することができるという ことが判明した。デオキシリポ核酸（ＤＮＡ）の分野においては、これは、ニッ クトランスレーション法［Ｒｉｇｂｙ、　Ｐ、Ｗ、ら、（１９７７）　Ｊ、　Ｍ ｏ１．　Ｂｉｏｌ、１１３．２３７　）およびランダムプライマー標識法［Ｆｅ ｉｎｂｅｒｇ、Ａ、Ｐ、　＆　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、　Ｂ、　（１９８４）　 Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３７．２６６）を用いてＤＮＡポリメラーゼ により、デオキシヌクレオチドを取り込ませることによって達成され、リボ核酸 の場合は、翻訳のラインに沿ってＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチドを 用いることにより達成される。核酸を標識するさらなる方法は、ターミナルトラ ンスフェラーゼおよびリポまたはデオキシリボヌクレオシド三リン酸の補助を伴 ういわゆる３°テ一リング反応（ｔａｉｌｉｎｇ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）によるも のである。

しかしながら、フルオレセインまたはジゴキシゲニン（ＭＷ　３３２または３９ ０）などの指示分子を付与されたヌクレオシド三リン酸はｍ−それらの天然の基 質と対比するとｍ−ポリメラーゼによる基質としての受け取りが相対的に不完全 であり、新しく合成された核酸への取り込みが相対的に不完全である（）Ｉｏｅ ｌｔｋｅ、　）１．−Ｊ、ら（１！１１９０）　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｈｏ ｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ　３７１．９２９）。

従って、さらにいっそう高分子量（８００〜１ｏｏｏ）の指示分子がポリメラー ゼにより基質として受け取られ、核酸に取り込まれることは期待できない。空間 的に要求のきびしい構造が付与されたこれらの分子は強い立体障害のためにポリ メラーゼによって転化されることはほとんど起こりそうもない。

驚くべきことに、今や、赤外染料で標識されたヌクレオシド三リン酸はＴ７　Ｄ ＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼにより基質として受け取られ、核酸に取り 込まれることが見いだされた。

従って、本発明による化合物は新規である。

本発明のさらなる目的は、上述の本発明による標識核酸を用いて、そのように標 識された核酸を、例えばナイロン膜などの固体担体上、あるいは例えばマイクロ タイタープレート内などの溶液中で直接的に検出することを可能にする方法を見 いだすことであった。

すでに上記したように、フルオレセインまたはテトラメチルローダミンなどの発 蛍光団をもちいて核酸を標識することの欠点は、担体物質の固有の蛍光が、その 発蛍光団の蛍光の測定を妨害することである。

しかしながら、本発明によるＩＲ染料で標識したヌクレオシド三リン酸を核酸の 標識に使用すると、測定波長が近赤外領域にあるのでそのような妨害はもはや無 意味である。

本来の位置のハイブリッド形成による核酸検出の利点は公知である。かかる方法 において、標識試料またはプローブは、蛍光顕微鏡で直接的に検出されるか、あ るいはハプテン標識の場合、さらなる操作ステップによって免疫学的反応（ＢＬ ＩＳＡ）において検出される。このような可視化は、通常、試料を、例えばナイ ロン膜上にまたはマイクロタイタープレート内の液体均一相中で固定化すること により達成される。この追加のステップはかなり時間がかかり、高価である。し たがって、このステップを省略することが望まれている。

適当なレーザーダイオードによるＩＲ−蛍光標識核酸を直接的に励起することの 可能性および上述の担体物質の自己蛍光に対する検出の不感受性により、簡単で 費用に対して最も効率のよい装置を使用することができる。免疫学的検出反応は 省略することができる。ＩＲ−標識核酸は、適当なスキャナーまたはマイクロタ イタープレートリーダーの補助を伴うレーザー／検出器の併用によって光学的手 段で簡単に検出される。

要約すると、本発明による赤外発蛍光団で標識したヌクレオシド５°−三リン酸 をポリメラーゼ基質として使用すると、核酸への直接的な酵素的取り込み、なら びに配列決定のためにこのように標識された核酸を検出することが可能となり、 そして、その使用はまた、この組み合わせにおいて新規であり、同時に本発明の 一部をなすｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成をも許容する。

本発明の一般式： で表されるヌクレオシド５′−三リン酸は、修飾されていないヌクレオシドから 出発して周知の方法により製造される。これら、すなわちピリミジンヌクレオシ ドの場合はウリジン、チミジンおよびンチジン、およびプリンヌクレオシドの場 合はアデノシンおよびグアノシン、ならびにそれに対応する７−デアザニブリン および７−ジアザ−８−アザプリンヌクレオシドは、適当な手法でＣ−５または Ｃ−６（ピリミジン）、Ｃ−８（プリン）　、Ｃ−８（３−デアザ−プリン）　 、Ｃ−７またはＣ−８（７−ジアザ−プリン）の位置で化学的に修飾され、そし て最終的に５−リン酸化される。

修飾基は適当な長さのスペーサーおよび適当な活性化された蛍光染料（例えば、 イソチオシアン酸塩またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの形）で置換 され得る末端第一級または第二級アミノ基から構成されることが都合がよい。

そのような蛍光染料は活性化された形、すなわち、例えば、アミノ基とよく反応 する形、好ましくはイソチオシアン酸塩として使用される。その反応が完了した 後、その発蛍光団はヌクレオチドの修飾基にＮＨＣ３基を介して共有結合される 。

このようにして修飾されたヌクレオシドのリン酸化は、文献〔すなわち、Ｙｏｓ ｈｉｋａｗａ、　Ｍ、ら（１９６７）　Ｔｅｔｒａｈ、　Ｌｅｔｔ、　５０．５ ０６５〕に記載された公知の方法にしたがって三塩化リンと反応させて−リン酸 塩を生成させ、次いでピロリン酸と反応させて所望の５“−三リン酸塩を生成さ せることにより行われる。またそれに代わる方法として、予め生成させたヌクレ オシド５−三リン酸の直接修飾も可能である。

発蛍光団は近赤外領域、すなわち６００〜８００ｎｍの間に吸収をもつ化合物で ある。例えば、カルボシアニンなどの６３０ｎｍ〜７８０ｎｍの化合物が好まし い。

すでに上記したように、ポリメラーゼを用いて標識ヌクレオシドを取り込ませる ための上記の方法に加えて、標識オリゴヌクレオチド、いわゆるプライマーの使 用に基づくさらなる方法が一般的である。すでに言及したように、多段階反応に おけるこれらの分子の通常の合成はきわめて時間がかかる。この方法において、 オリゴヌクレオチド合成が完了した後、追加のステップにおいてシグナル基をオ リゴマーの５゛−末端に結合させなければならない。

実際のオリゴヌクレオチド合成は自動合成装置で行われるので、シグナル基の結 合のステップもすてにその合成装置内で行うことが可能になることも強く望まれ ている。該オリゴヌクレオチド合成は単量体構成単位を少しずつ結合させること 、いわゆるヌクレオシドホスホルアミダイトから構成されるので、本発明のさら なる目的は自動オリゴヌクレオチド合成における最終ステップとしてシグナル基 の直接取り込みを可能にする発蛍光団ホスホルアミダイトを開発することであっ た。そのようなＮＩＲ−染料−ホスホルアミダイトは今まで知られておらず、発 明的に新規である。

本発明を下記の実施例によってさらに詳細に説明する。

実施例１ ５−（３−アミノアリル）−２“−デオキシ−ウリジン−５−三リン酸この誘導 体はＬａｎｇｅｒらのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓ Ａ　（１９８１）　７８．６６３５の記載にしたがって合成した。

実施例２ ジメチルホルムアミド１ｍｌ中の無水−１１−フェノキシ−１０，１２−プロピ レン−３，３，３’　、　３’−テトラメチル−４，５−ベンズインド＝ｌ−（ ４−スルホブチル）−１“＝（３−イソチオシアノプロピル）−インドトリカル ボシアニンＮａ塩５０ｍｇの溶液を、０．１Ｍホウ酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ８ ゜５）２ｍｌ中の５−アミノアリル−ｄＵＴＰ−Ｌｉｔ　３３ｍｇ（６０μｍｏ りの溶液に添加して、その反応混合物を遮光しながら室温で約１５時間放置した 。その後、濾紙電気泳動（０，０５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５）によ れば、出発物質の大部分が反応していた。所望の物質を単離するために、反応混 合物を本釣５ｈ＋１で希釈して、深緑色の溶液を塩化物型のＤＥＡＥ　５ｅｐｈ ａｄｅｘ　Ａ−２５を含むイオン交換カラムに注いだ。生成物を、ＩＭＬｉＣＩ に対する水の直線グラジェントでカラムから溶離し、生成物画分を減圧で濃縮し て、ＲＰ１８物質上物質相クロマトグラフィーによって脱塩した。凍結乾燥後、 所望の三リン酸塩６μｍｏｌ（１０％）を得た。

スペクトルデータ：　Ｅｍｉｓｓｉｏｎ、、、　７８６　ｎｍ、７２０　ｎｍ　 （肩）、３８　ｎｍ 実施例３ この誘導体は、８−アミノペンチルアミノ−ｄＡＴＰ　３８ｍｇ　（６０μｍｏ ｌ）および無水−１０，１２−プロピレン−３，３，３’　、　３’−テトラメ チル−１，１’−ビス（３−スルホブチル）−１１−（４−イソチオシアノ）− フェノキシ−インドトリカルボシアニンＮａ塩５０ｍｇ　（６０μｍｏｌ）から 、実施例２で述べた方法にしたがって調製した。化合物３μｍｏｌが得られた。

スペクトルデータ：　Ｅｍｉｓｓｉｏｎｍ、、　７７０　ｎｍ、　６９７　ｎｍ 　（肩）、２７９　ｎｍ 実施例４ 鋳型ＤＮＡ３μｇを、反応緩衝液（２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５， １００ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２５０ｍＭ　ＮａＣｌ　）　２　ｕ　ｌ　、　Ｍ１３ ／ｐＵｃブライ７７−１ｐおよびＨ２Ｏ７μｌの混合物中で３７℃で１５分間イ ンキュベートした。

ＤＴＴ　１　μｍ（１００ｍＭ）、標識混合物（ＩＲＤ　４Ｏ−ｄＡＴＰ　１０ μＭ　、　ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰをそれぞれｌμＭ）２μｌ　、　 Ｈ２Ｏ１μｍおよびＴ７−ＤＮＡポリメラーゼ２μ＋　（２，５０／μｌ）を標 識反応のために添加して、室温で１０分間インキュベートした。

続いて、ＤＮＡ配列決定に使用するために、終止混合物（ｄｄＡＴＰ、　ｄｄＧ ＴＰ、　ｄｄＣＴＰ、　ｄｄＴＴＰ）を添加することにより終止反応を行った。

実施例５ この化合物は５−アミノアリル−〇ＴＰ　（実施例１にしたがって調製した）お よび対応するイソチオシアン酸塩から実施例２と同様にして合成した。

スペクトルデータは実施例２の２°−デオキシ化合物と一致する。

実施例６ ステツプ１：２’、３°−ジデオキシ−ウリジン−５°−三リン酸この誘導体は 、市販の２’　、　３’−ジデオキシ−シチジン−５°−三リン酸（ベーリンガ ー　マンハイム）をＮａＮＯ２／酢酸で脱アミノ化することから出発する不安定 なジアゾニウム誘導体を介して合成した。

この化合物は、Ｌａｎｇｅｒらにしたがって、２゛、３“−ジデオキシ刊ＴＰの ５−水銀誘導体を介して実施例１と同様にして調製した。

ステップ３　：　ｒｌＲＤ−ｄｄＵＴＰ　Ｊこのジデオキシ誘導体は、実施例２ にしたがって５−アミノアリル−ｄｄＵＴＰとそれに対応するイソチオシアン酸 塩とを反応させることにより得られた。

そのスペクトルデータは実施例３の２゛−デオキシ化合物のものと一致する。

実施例７ ５０ｍ１丸底フラスコ中で、無水−１１−（４−ヒドロキシエチル）フェノキシ −１０，１２−プロピレン−３，３，３°、３°−テトラメチル−１，１−ビス （３−スルホプロピル）−インドトリカルボシアニン−ハイドロオキサイドのＮ ａ塩４２５ｍｇ（０，５ｍｍｏｌ）を、乾燥アセトニトリル５ｍｌに溶解し、エ チルジイソプロピルアミン０．２７５ｍ１　（１，６ｍｍｏｌ）を添加した。次 いて、クロロ−β−ンアノエトキシーＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスファン ０．１２５ｍ１を窒素下、攪拌しながら約３分以内に滴下添加した。さらに室温 で３０分間攪拌し、次に、５％ＮａＨＣＯ３水溶液１０ｍ１を添加し、続いてジ クロロメタン約１０ｍ１をそれぞれ用いて２回抽出を行った。溜まった有機相を 硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を蒸留により除去して、残留物を移動溶媒ジク ロロメタン／酢酸エチル／トリエチルアミン４５：４５：１０を用いてシリカゲ ルにおけるクロマトグラフィーにかけた。

収量は４８０ｍｇ　（理論値に対して８８．７％）であった。

ＴＬＣ（シリカゲル、上記の移動溶媒）Ｒ，＝０．４”　’　Ｐ　−Ｎ　Ｍ　Ｒ （ｄ、ｏＭｓｏ）　：１４９および１５３ｐｐｍ　（２ジアステレオマフロント ページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３３ 　７０５５−２Ｊ３３１５６６　７０５５−２Ｊ ３３１５８　Ａ　７０５５−２Ｊ ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０９ ＧＯＩＮ　２１／７８　Ｃ８３１０−２Ｊ（７２）発明者　ビルクナー、クリス チャンドイツ連邦共和国　ディー−８２４４９ラフインク　ヴイリンクシュトラ ーセ　９番地Ｉ （７２）発明者　フォノ　デル　エルツ、バーバートドイツ連邦共和国　ディー −８２３６２ヴアイルハイム、イン　デル　アオ　２１番地

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｂは複素環式塩基であるアデニン、グアニン、ヒポキサンチン、７−デ アザーアデニン、７−デアザーグアニン、７−デアザーヒポキサンチン、７−デ アザ−８−アザーアデニン、７−デアザ−８−アザーグアニン、７−デアザ−８ −アザーヒポキサンチン、ならびにチミン、シトシンおよびウラシルを示し、 Ｘはｎ＝４〜２０原子の結合基を表し、Ｓｉｇは６５０〜８００ｎｍの励起波長 をもつ蛍光分子を表し、Ｒ１およびＲ２は、それぞれＨおよび／またはＯＨを表 す。）で表されるヌクレオシド−５′−三リン酸。
2. ２．Ｂは上述したとおりであり、Ｘは好ましくはｎ＝１０〜１５原子の結合基を 表し、Ｓｉｇは一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ１およびＲ２は、Ｈまたは共にフェニル残基を表し、Ｒ３は、ヌクレ オチドとの結合がＲ４部位を介する場合はＨであり、結合がＲ３部位を介する場 合は−ＮＨＣＳ−であり、Ｒ４およびＲ５は、それぞれｎ＝３〜５のアルキルス ルホニルを示し、または、結合がＲ４部位を介する場合はＲ４はｎ＝３〜８の− ＮＨＣＳ−、Ｒ５は、ｎ＝３〜５のアルキルスルホニルを示す。）で示されるカ ルボシアニンを表す、請求項１に記載の化合物。
3. ３．ＤＮＡポリメラーゼの基質としての請求項１または２に記載の化合物および それらの使用。
4. ４．ＲＮＡポリメラーゼの基質としての請求項１または２に記載の化合物および それらの使用。
5. ５．核酸を標識するための請求項１または２に記載の化合物の使用。
6. ６．核酸を検出するための請求項１または２に記載の化合物の使用。
7. ７．ＤＮＡ配列決定における請求項１または２に記載の化合物の使用。
8. ８．ｉｎｓｉｔｕハイブリッド形成において使用される請求項１または２に記載 の化合物の使用。
9. ９．ハイブリッド形成を膜上で行う、請求項８に記載の化合物の使用。
10. １０．ハイブリッド形成を溶液中で行う、請求項８に記載の化合物の使用。
11. １１．ハイブリッド形成をマイクロタイタープレート内の溶液中で行う、請求項 １０に記載の化合物の使用。
12. １２．標識されたハイブリッドが適切なレーザーダイオードおよび検出器により 検出される、請求項６に記載の化合物の使用。
13. １３．一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ１およびＲ２はＨまたは共にフェニル残基を表し、Ｒ３およびＲ４は それぞれｎ＝３〜５のアルキルスルホニルを示し、 Ｒ５はメトキシまたは２−シアノエトキシを示し、Ｒ′およびＲ′′はそれぞれ エチルまたはイソプロピルを示し、Ｘは１〜１０を示す。 ） で表される化合物。
14. １４．ホスホルアミダイト法によるオリゴヌクレオチド合成に使用する、請求項 １３に記載の化合物の使用。
15. １５．オリゴヌクレオチドの５′−標識のための請求項１４に記載の化合物の使 用。