JP3466662B2 - 色素標識化核酸プローブの製造方法及び該核酸プローブ形成用中間体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸プローブを用いた
ハイブリダイゼーション法による核酸の検出に有用な核
酸プローブの標識化に関し、ヌクレオチドと類似の構造
を有し、色素化処理により色素としての発色特性を獲得
するモノヌクレオチド類似色素中間体を用いた核酸プロ
ーブの標識化に関する。

【０００２】

【従来の技術】一本鎖核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の二
本鎖化反応（ハイブリダイゼーション）を利用した核酸
の検出に用いられる核酸プローブとしては、一般的に
は、検索したい核酸（標的核酸）の塩基配列と相補的な
塩基配列を持つ（一本鎖）オリゴヌクレオチドが用いら
れている。以下、核酸がＤＮＡである場合を例に取り従
来技術を説明する。

【０００３】ＤＮＡプローブを用いる標的ＤＮＡの検出
は、試料中の標的ＤＮＡとＤＮＡプローブとを反応させ
てこれらのハイブリッド体を形成させ、得られたハイブ
リッド体をなんらかの方法で検出することで行われる。

【０００４】ハイブリッド体の検出方法としては種々の
方法が知られているが、ＤＮＡプローブを検出可能な物
質で標識する方法が広く用いられてきた。

【０００５】従来の標識方法としては、放射性同位元素
を用いる方法があった。これは、ＤＮＡのリン原子を、
放射性同位元素で置換する方法で、標識されたＤＮＡの
検出はオートラジオグラフィーやガイガーカウンターな
どによって行われていた。しかし、この放射性同位元素
を標識に用いる方法は、危険性をともなうので安全性の
確保のための特別な施設が必要であり、またガイガーカ
ウンター等の特別な検出装置が必須であるという問題を
有し、また、人体内での検査には用いることができない
という欠点があった。

【０００６】そこで、非放射性物質を標識物質として用
いる方法が検討され、一般的に利用されるようになって
きた。非放射性標識としては、発色、蛍光または発光を
起す各種物質が用いられている。例えば、ビオチンＤＮ
Ａプローブ法では、ウラシルと結合可能なビオチンをニ
ックトランスレーション法によりチミンと置換して導入
したＤＮＡプローブを用いて試料との反応を行い、得ら
れたハイブリッド体の検出は、ハイブリッド体を構成す
るＤＮＡプローブのビオチンに色素等の標識を結合した
アビジンもしくはストレプトアビジンを結合させること
で行われる。

【０００７】また、ＤＮＡの核酸塩基に反応基を導入し
て標識としての機能を有するプリン環誘導体やピリジン
環誘導体（例えば、蛍光を有するエテノアデノシンな
ど）に変換する方法も行われている。

【０００８】さらに、ＤＮＡを構成する塩基、糖類また
はリン酸基に標識としての色素を直接結合させる方法
や、β−アミンリンカー（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を
介してＤＮＡプローブの５’末端にカルボキシル基やス
クシンイミド基を有する色素等の標識を結合させる方法
もある。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
非放射性標識を用いる方法においても、以下のような問
題があった。先ず、ビオチンＤＮＡプローブ法では、検
出感度がＤＮＡビオチンを導入するＤＮＡの有するチミ
ン（ウラシル）の個数に依存するという欠点があった。
また、ＤＮＡを構成する核酸塩基自体を修飾してエテノ
アデノシン等に変換する方法でも、蛍光波長が限定さ
れ、しかも蛍光強度が弱い場合が多く、実用性に欠ける
という欠点があった。ＤＮＡに色素を結合させる方法で
は、色素として水に難溶性のものや水に対する溶解度の
低いものを用いるとＤＮＡプローブの反応性が悪くなる
という欠点があり、これらの色素を用いる場合には親水
性を付与するための特別な処理が必要となる。

【００１０】このように、従来の非放射性標識は、実用
性や工業的な生産性などにおいてなお問題を有するもの
である。本発明は、これらの従来の非放射性標識におけ
る問題に鑑みなされたものであり、工業的な生産性を有
し、核酸プローブに簡便かつ定量的に導入でき、しかも
ハイブリダイゼーション反応の反応性を阻害することな
く、高感度での検出を可能とする標識及び標識方法を提
供することを目的とする。本発明の他の目的は、高感度
な検出を可能とし、検出したい塩基配列に依存しない汎
用性のある色素標識化核酸プローブの安定した生産方法
を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明の色素標識化核酸
プローブの製造方法は、 （ａ）アゾ色素、アントラキノン色素、インジゴイド色
素、フタロシアニン色素、カルボニウム色素、キノンイ
ミン色素、メチン色素、キノリン色素、ニトロ色素、ニ
トロソ色素、ベンゾキノン色素、ナフトキノン色素、ナ
フタルイミド色素、ペノリン色素、アズレン色素及びこ
れらの誘導体からなる群より選択された色素を含む色素
構造の１以上を形成するための色素中間体の環（アズレ
ン色素以外の色素では複素環が用いられる）に糖を結合
させる過程と、 （ｂ）得られた糖結合色素中間体をリン酸化処理し、該
糖結合色素中間体の糖部分に無機リン酸基及び無機リン
酸誘導体基から選択された１〜３個のリン酸基をエステ
ル結合させてモノヌクレオチド類似色素中間体を得る過
程と、 （ｃ）該モノヌクレオチド類似色素中間体を核酸プロー
ブに導入して、核酸プローブ中間体を形成する過程と、 （ｄ）該核酸プローブ中間体の有する色素中間体部分を
色素化して色素構造とし、色素標識化核酸プローブを得
る過程とを有することを特徴とする。

【００１２】過程（ａ）で用いる色素中間体は、過程
（ｄ）の色素化によって上記の色素または色素誘導体か
ら選択された色素を含む色素構造を形成し得るものであ
り、例えばこれら色素または色素誘導体の製造段階で得
られる中間体が利用できる。なお、この中間体は、最終
的な色素化（過程（ｄ））により複数の色素構造を形成
するものであっても良い。この中間体としては、ヨウ素
水、トリクロロ酢酸、アンモニア水等の各種反応操作に
おいて用いられる化学薬品に対して安定なものが好まし
い。過程（ａ）における色素中間体と糖との結合は、Ｎ
−グルコシド結合であっても、Ｃ−グルコシド結合でも
良く、これらの結合が得られる常法を用いてこれらを反
応させればよい。用いる糖としては、例えば、リボー
ス、２−デオキシリボース等のペントース、Ｄ−グルコ
ース、α−Ｄ−グルコピラノース、及びこれらの誘導体
などを挙げることができ、複数個の糖部分が存在する場
合には、それらは同じでも、異なるものの組合せが存在
するものでもよい。

【００１３】過程（ｂ）におけるリン酸化反応には、通
常の核酸合成法等における糖のリン酸化反応（糖のリン
酸エステル化反応）等が利用できる。糖に結合させるリ
ン酸基の数は通常１とされるが、２または３個としても
良い。複数個のリン酸基を１つの糖部分に結合させる場
合には、それらは同一でも、異なる種類のリン酸基を含
むものであってもよい。更に、複数の糖部分が存在する
場合には、各糖部分に結合するリン酸基の数及び種類が
同一であっても、異なるものを含むものて合っても良
い。リン酸基としては、無機リン酸基及び無機リン酸誘
導体基から選択した基が利用できる。無機リン酸誘導体
基は、無機リン基に保護基を付加したものであり、例え
ば、β−シアノエチルリン酸、モノメチル化リン酸、リ
ン酸Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミド誘導体等のＤＮＡ
の人工的合成時に用いられる保護基が付加された形の誘
導体からなる基が利用でき、過程（ｃ）において核酸プ
ローブを化学合成により得る場合には、リン酸Ｎ，Ｎ’
−ジイソプロピルアミド誘導体からなる基を用いるのが
好ましい。

【００１４】このようにして過程（ｂ）で得られるモノ
ヌクレオチド類似色素中間体は、アゾ色素、アントラキ
ノン色素、インジゴイド色素、フタロシアニン色素、カ
ルボニウム色素、キノンイミン色素、メチン色素、キノ
リン色素、ニトロ色素、ニトロソ色素、ベンゾキノン色
素、ナフトキノン色素、ナフタルイミド色素、ペノリン
色素、アズレン色素及びこれらの誘導体からなる群より
選択された色素を含む色素構造の１以上を形成するため
の色素中間体部分と、該色素中間体部分の環（アズレン
色素以外の色素では複素環が用いられる）に結合した糖
部分と、該糖部分にエステル結合した無機リン酸基及び
無機リン酸誘導体基から選択された１〜３個のリン酸基
とを有する。

【００１５】このモノヌクレオチド類似色素中間体の一
例を以下に示す。

【００１６】

【化１】 上記式（Ｉ）中、Ｒ₁は、水素原子、

【００１７】

【化２】 を表わし、Ｒ₂は、水素原子、メチル基またはＮＣＣＨ₂
ＣＨ₂−を表わし、Ｒ₃は、色素中間体部分であり、

【００１８】

【化３】 を表わす。

【００１９】このヌクレオチド類似色素中間体は、ヌク
レオチドと類似の構造を有し、糖とリン酸基の存在によ
って水溶性が確保されているので、過程（ｃ）での核酸
プローブへの導入を通常のヌクレオチドの重合反応を利
用して容易に行うことができる。すなわち、該モノヌク
レオチド類似色素中間体として、核酸と同様のあるいは
類似した性質、例えば溶媒に対する溶解性やヌクレオチ
ドとの反応性、あるいは核酸プローブへの導入の際に副
反応を起さないことなどの性質を有するものを用いるこ
とで、該モノヌクレオチド類似色素中間体とヌクレオチ
ドとの結合に一般のポリヌクレオチド人工合成法やその
簡易な変法が適用できるようになり、該色素中間体を標
識として結合した核酸プローブを簡便な操作で大量に生
産することが可能となり、更に、核酸プローブに導入さ
れた後で過程（ｄ）においてこれを色素化した際に核酸
プローブの本来有する反応性を損なうこともない。

【００２０】また、このヌクレオチド類似色素中間体
を、安定な色素中間体で形成することで、これを核酸プ
ローブに導入し、色素化することで色素標識化核酸プロ
ーブの安定した生産が可能となる。

【００２１】しかも、このモノヌクレオチド類似色素中
間体の製造における各過程での反応は、色素中間体、糖
及びリン酸反応と必要に応じた保護基の付加及び脱離反
応であり、通常の染料合成法や核酸合成法における反応
過程を利用して行うことができ、原料も大量に入手でき
るので、工業的な量産が可能となる。なお、色素合成法
の応用では色素中間体の合成において、色素中間体を形
成するための原料におけるアルキル基を糖で置換してお
き、これを常法により色素中間体に変換することで糖が
結合した色素中間体を得ることができる。

【００２２】上記のようにモノヌクレオチド類似色素中
間体は、ヌクレオチドと類似する構造を有することが重
要であるので、該中間体の有する複素環構造を有する色
素中間体部分も、核酸のプリン誘導体やピリミジン誘導
体からなる塩基と、構造や性質において類似するものが
好ましい。この複素環構造としては、窒素を含むものが
好ましいが、イオウ原子、酸素原子、セレン原子等を有
する複素環構造を用いることもできる。

【００２３】更に、このモノヌクレオチド類似色素中間
体は、色素化によって色素標識として機能するものであ
り、ヌクレオチドと相補的な結合を起さないものである
ことが望ましい。また、このモノヌクレオチド類似色素
中間体の複数個を１つの核酸プローブに導入して検出感
度を高める場合には、核酸プローブに導入した複数の色
素中間体間どうしの立体障害や会合を起さないのである
ことが望ましい。なぜならば、立体障害により核酸プロ
ーブへの色素中間体の導入がうまく行われなかったり、
核酸プローブへの所望個数の導入ができても、会合によ
り光学的な吸収スペクトルが所望の範囲からずれてしま
うという問題が起る場合があるからである。

【００２４】一方、標識の検出という観点からは、色素
中間体を色素化して得られる色素構造としては、例え
ば、吸収スペクトルによる検出の場合は、長波長領域に
測定可能な光吸収があること、蛍光スペクトルによる検
出の場合は、励起光によって有効に励起され、かつ蛍光
スペクトルが測定波長領域において十分な蛍光を示すこ
とが要求される。また、色素化によって色素中間体で標
識した核酸プローブや核酸プローブと標的核酸とのハイ
ブリッドの溶媒に対する溶解性や安定性を損なうもので
はないことが要求される。

【００２５】以上の諸要求を満足する色素構造を形成で
きる色素としては、シアニン色素、メロシアニン色素、
ローダシアニン色素、オキソノール色素、スチリル色
素、ベーススチリル色素、カルボシアニン系色素、クマ
リン誘導体、キサンテン色素、スピロピラン色素、スク
アリウム色素、ローダミン色素、ＴＣＮＱ色素、フタロ
シアニン系色素及びこれらの誘導体を挙げることがで
き、これらの色素の１以上を含む色素構造を、色素化処
理によって形成できる色素中間体（前駆体）を上記のモ
ノヌクレオチド類似色素中間体の色素中間体部分に用い
ることができる。

【００２６】これらの色素のなかでも、モル吸光係数
（ε）が１×１０⁴〜１×１０⁶のものが好ましく、１×
１０⁵〜１×１０⁶のものがより好ましい。なお、これら
の色素のなかでは、シアニンまたはメロシアニン系色素
は、モル吸光係数が約１×１０ ⁵であり、近赤外に吸収
をもち、かつ強い蛍光を発し、検出の際に生体由来の不
純物（長波長側に吸収をもたないものが多い）の影響を
受けないという利点を有するので特に好ましい。

【００２７】本発明の方法の過程（ｃ）におけるモノヌ
クレオチド類似色素中間体の核酸プローブへの導入に
は、例えば保護基により副反応を制御しつつヌクレオチ
ドを１つずつ伸ばしていく既知の一本鎖核酸合成法が利
用できる。

【００２８】例えば、核酸プローブの５’末端にモノヌ
クレオチド類似色素中間体を結合させる場合には、６つ
のステップからなる方法が利用できる。１つめのステッ
プで、人工的に合成した、あるいは天然由来の標的核酸
検出用の塩基配列を有する一本鎖核酸の３’末端を適当
な担体に固定する。これにより、３’側を保護すると同
時に、反応後に不純物との分離精製が簡単に効率良く行
える。なお、５’末端は、ＤＭＴｒ基となっており、リ
ン酸基がシアノエチル基で、、塩基にアミノ基がある場
合にはイソブチル基やベンジル基で保護されていること
が望ましい。２つめのステップで５’末端を保護してい
たＤＭＴｒ基をトリクロロ酢酸などを用いて外し、ヒド
ロキシ基にする。３つめのステップで、モノヌクレオチ
ド類似色素中間体をテトラゾールと反応させてプロトン
付加により活性化したものを先程のヒドロキシ基と反応
させ、担体固定の一本鎖核酸の５’末端にポリヌクレオ
チド類似色素中間体を付加した核酸プローブ中間体を得
る。４つめのステップで、無水酢酸／ピリジンで未反応
の５’末端にあるヒドロキシ基をキャッピングする。５
つめのステップで、ヨウ素／水／ルチジン／ＴＨＦで亜
リン酸を酸化する。６つめのステップで、核酸プローブ
のリン酸基から酸化反応により保護基としてのシアノエ
チル基を外し、また担体から３’末端を外し、必要に応
じて塩基の保護に用いたイソベンジル基やベンジル基を
外す。例えば、シアニン色素の中間体を用いた際に、こ
の段階でヨウ素イオンが水酸イオンに置換されている場
合には必要に応じてヨウ化ナトリウムのアセトン溶液で
処理するのが好ましい。また、ＤＮＡ合成機を利用する
場合で、チミジン以外の核酸塩基が３’末端にある場合
にはそれらの塩基には保護基が必要であり、ステップ６
おいて脱保護基処理が必要である。

【００２９】モノヌクレオチド類似色素中間体の複数を
核酸プローブに導入する場合には、５’末端をＤＭＴｒ
で保護したモノヌクレオチド類似色素中間体をステップ
３で用いて上記の２〜５までのステップを繰り返せばよ
い。ステップ２〜５までの反応収率はおおよそ９９％で
あり、本発明によれば該色素中間体を定量的に導入でき
る。なお、１本の核酸プローブ中に異なる複数のモノヌ
クレオチド類似色素中間体を導入しても良いなお、先に
述べたとおり、該色素中間体として耐試薬安定性の高い
ものを選択してもちいれば、上記のステップ中における
変質や核酸からの離脱を防ぐことができる。例えば、モ
ノヌクレオチド類似色素中間体の代わりに、シアニン色
素に糖及びリン酸を結合させて得たモノヌクレオチド類
似色素を用い上記にステップで核酸プローブに結合させ
た場合には、ヨウ素水、トリクロロ酢酸、アンモニア水
等に曝されることにより、シアニン色素部分の退色や核
酸からの離脱が起きる場合が認められるが、本発明のよ
うに安定した色素中間体を用いることで、このような問
題を防ぐことができる。

【００３０】上記のステップ２〜５は、例えばＡＰＰＩ
ＥＤ−ＢＩＯＳＹＳＴＥＭ社のＭＯＤＥＬ３８１Ａ等の
市販の核酸合成機を用いて半自動的に行うことができ
る。また、酵素反応をもちいてモノヌクレオチド類似色
素中間体を核酸に導入することもでき、この場合には
５’トリリン酸（酵素的反応の場合にはβ−シアノエチ
ルホスフォアミダイドではない）を用い３’側に一本鎖
を伸ばす反応が利用できる。

【００３１】本発明の方法における過程（ｄ）におい
て、得られた核酸プローブ中間体の有するモノヌクレオ
チド類似色素中間体が色素化され、色素標識化核酸プロ
ーブを得ることができる。この色素化処理は、用いたモ
ノヌクレオチド類似色素中間体の有する色素中間体部分
の種類に応じた反応により行われる。この色素中間体の
色素化には、例えば用いた色素中間体からの色素合成に
用いられている通常の方法が利用できる。例えば、ヨウ
化Ｎ−デオキシリボース−１，１，２−トリメチルベン
ズインドレニンを色素中間体部分として用いた場合に
は、これにグルタコンアルデヒドジアニルヨウ化１，
１，２，３−テトラメチルベンズインドレニンを加え
て、再度加熱反応させることにより、色素中間体部分を
シアニン色素とした核酸プローブを得ることができる。

【００３２】

【実施例】

実施例１ （モノヌクレオチド色素中間体の合成）以下に示した反
応スキームにより、２−デオキシ−Ｄ−リボースをヨウ
素化した。後藤利夫監修「有機化学実験の手引き」第４
巻、第１６頁に従い、無水酢酸１００ｇとピリジン１４
０ｍｌを氷冷し、１３．４ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボ
ース（分子量１３４．１３）が溶けるまで氷冷して攪拌
した。その後室温で１８時間攪拌し、反応液を氷に注い
で加水分解した。沈澱を濾過回収してメタノールで再結
晶し、１，２，５−トリアセチルデオキシリボースを得
た。

【００３３】

【化４】 Ｌ．Ｊ．Ｈａｙｎｅｓ ＆ Ｆ．Ｈ．Ｎｅｗｔｈ，Ａｄ
ｖ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｃｈｅｍ．，１０，（１
９５５） ｐｐ２０７−２５６の方法に従い、１，３，
５−トリアセチルデオキシリボースを臭酸の酢酸溶液中
で処理すると、１位のアセチル基が臭素化され、得られ
た臭化物をヨウ化ナトリウムで処理すると、臭素がヨウ
素に置換され、１−ヨード−３，５−ジアセチルデオキ
シリボースを得た。

【００３４】図１に示した反応スキーム（Ｔｈｅ Ｃｙ
ａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ Ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏ
ｍｐｏｕｎｄ， Ｆｒａｎｃｅｓ Ｍ．Ｈａｍｅｒ著な
どの常法）に従って２０．９ｇの１，１，２−トリメチ
ルベンズインドレニン（分子量２０９．２９）のエタノ
ール溶液に３２．８ｇの１−ヨード−３，５−ジアセチ
ルデオキシリボース（分子量３２８．１）を加え３時間
加熱還流した。反応液を析出して析出したＮ−（３’，
５’−ジアセチルデオキシリボース）−１，１，２−ト
リメチルベンズインドレニンヨードの赤色結晶を濾過に
より回収し、メタノールで再結晶した。

【００３５】この結晶５．３ｇをエタノール１００ｍｌ
に溶解し、触媒量のナトリウムエトキシドを加え、室温
で１時間攪拌し、ダウエックス５０（Ｈ型）で処理し、
ジクロロメタン／ヨウ化ナトリウム水で抽出処理を行
い、ジクロロメタン相を回収、除媒した。得られた残査
をアセトニトリルに溶解し、これに触媒量のテトラゾー
ルを添加し、窒素雰囲気下でβ−シアノエチルＮ，Ｎ−
テトライソプロピルホスフォアミダイド（１ｇ）を加え
室温で１時間攪拌した。生成したモノヌクレオチド類似
色素中間体をシリンジで吸いエキクロディスクを通して
窒素置換したバイアル瓶に入れた。

【００３６】実施例２ （ＤＮＡプローブ中間体の合成）ＤＮＡとして、ＡＰＰ
ＰＩＥＤ−ＢＩＯＳＹＳＴＥＭ社ＭＯＤＥＬ３８１Ａを
用いてＣＧＰ担体に固定されたチミジンの１０量体（ｄ
Ｔ１０）を合成した（０．１Ｍスケール）。５’末端の
トリチル基をトリクロロ酢酸で外して、水酸基を形成さ
せた。これに、図２の反応スキームに従って、テトラゾ
ールのアセトニトリル溶液（濃度１重量％）と実施例１
で合成したモノヌクレオチド類似色素中間体アセトニト
リル溶液（濃度０．１Ｍ）を反応させた後、廃液した。
アセトニトリルでＣＰＧ担体を洗浄、乾燥した後、２９
％アンモニア水を室温で１時間反応させ、該担体からＤ
ＮＡプローブ中間体の３’末端を外して切り出した。真
空ポンプで除媒してＤＮＡプローブ中間体の結晶を得
た。

【００３７】実施例３ （色素標識化ＤＮＡプローブの合成）図１に示した反応
スキーム（Ｔｈｅ Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ Ａｎｄ
Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ， Ｆｒａｎｃｅ
ｓ Ｍ．Ｈａｍｅｒ著などの常法）に従って２０．９ｇ
の１，１，２−トリメチルベンズインドレニン（分子量
２０９．２９）のエタノール溶液に１４．２ｇのヨード
メタン（分子量１４１．９５）を加え、１時間ごとにヨ
ードメタン１４．２ｇを追加しながら３時間加熱還流し
た。反応液を冷却し、析出した１，１，２，３−テトラ
メチルベンズインドレニヨンヨードの赤色結晶を濾過に
より回収し、メタノールで再結晶させた（以下ＩｎｄＭ
ｅという）。

【００３８】図２に示した反応スキームに従って、実施
例２で合成したＤＮＡプローブ中間体の０．１Ｍ溶液
に、グルタコンアルデヒドジアニル塩酸塩（０．１ｇ）
と少量のアニリンを加え、６５℃で１０分間加熱し、エ
ーテルで洗浄し、乾燥させた。これに、等モルのＩｎｄ
Ｍｅと酢酸カリウムおよび無水酢酸を加え、再び６５℃
１０分間加熱し、エーテルで洗浄した。ＨＰＬＣで２６
０ｎｍと７８０ｎｍに吸収のあるピークを分離精製し、
色素標識化ＤＮＡプローブを得た。 （色素標識化ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーショ
ン）ターゲット（標的）ＤＮＡとして、ＡＰＰＩＥＤ
ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社ＭＯＤＥＬ３８１Ａを用いて合
成したアデノシンの１０量体（以下ｄＡ１０）０．１μ
Ｍ（ＣＰＧから切り出し済み）、ホルムアミド１５０ｍ
ｌ、２０×ＳＳＣ９０ｍｌ、５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液
３０ｍｌ、２０％ＳＤＳ７．５ｍｌ、０．５ＭＥＤＴＡ
（ｐＨ８）６ｍｌ、サケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）
３ｍｌの組成のハイブリダイゼーション混液を用意し
た。

【００３９】一方、０．１Ｍ ＭｇＣｌを含むリン酸緩
衝液−生理食塩水２．５ｍｌに上述の色素標識化ＤＮＡ
プローブを濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加混合し
た。

【００４０】ハイブリダイゼーション混液の１００μｌ
と色素標識化ＤＮＡプローブ溶液の１００μｌとを混合
し、８０℃で１０分間放置し、ゆっくりと室温に戻し、
反応混合液を得た。この反応混合液を電気泳動で展開
し、蛍光を測定することで、ＤＮＡプローブがターゲッ
トＤＮＡとハイブリダイズしていることが確認できた。
なお、このＤＮＡプローブに結合している色素標識は７
８０ｎｍに光吸収を持ち、８１５ｎｍの蛍光を発するも
のである。

【００４１】実施例４ （アズレン系色素を用いたＤＮＡプローブの合成）先
ず、以下に示す反応によりアズレン系色素の中間体を用
いたモノヌクレオチド類似色素中間体を得た。

【００４２】

【化５】 トリチル化及びリン酸化は実施例１と同様にして行っ
た。なお、３位および５位の水酸基は実施例１と同様、
アセチル化しておいてアズレン色素中間体との反応後、
アルコール中でナトリウムアルコキシドで処理して保護
基を外しても良い。

【００４３】得られたモノヌクレオチド類似色素中間体
を実施例２と同様にしてＤＮＡプローブ中間体とし、そ
れを以下の反応により色素化した。

【００４４】

【化６】 すなわち、ＤＡＮ中間体と等量の１−シクロブテン−
３，４−ジオン−１，２−ジオールと、同じく等量の１
−メチルアズレンをトリエチルアミン存在下、ｎ−ブタ
ノール中で１０７℃で反応させた。これをＨＰＬＣカラ
ム精製して色素標識化ＤＮＡプローブを得た。

【００４５】実施例５ 実施例３において、グルタコンアルデヒドジアニル塩酸
塩の代わりにプロペンジアニル塩酸塩を用いると、６９
０ｎｍに光吸収のある色素で標識化されたＤＮＡプロー
ブを合成できた。

【００４６】実施例６ １−ヨード−３，５−ジアセチルデオキシリボースの代
わりに、４−Ｏ−エチル−Ｄ−アセチルグルコースを原
料として実施例１と同様の反応でヌクレオチド類似色素
中間体を合成した。

【００４７】

【発明の効果】本発明によれば、ヌクレオチド類似色素
中間体の合成過程は、リン酸、糖及び色素中間体の複素
環等の環の反応、および必要に応じた保護基の付加、離
脱反応で行うことができ、いずれも大量に原料が入手で
き、ヌクレオチド類似色素中間体の大量生産が可能とな
る。しかも、色素中間体として色素よりも安定性の高い
ものを利用することで、色素標識化核酸プローブを安定
して得ることができる。

【００４８】更に、核酸へのヌクレオチド類似色素中間
体の導入反応を簡便かつ高収率で定量的に行うことがで
き、これを色素化して得られる色素標識化核酸プローブ
を用いることで定量的な検出が可能となり、また１つの
核酸プローブに導入される色素部位の数を増やすこと
で、検出感度の向上が図れる。

【００４９】また、色素化過程を選択することで、同一
の核酸プローブ中間体からいろいろな吸収波長を持つ色
素を得ることもでき、用途に応じて最適な色素で標識化
された核酸プローブを製造することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１〜３における色素標識化ＤＮＡプロー
ブの製造過程を示す反応スキームである。

【図２】実施例１〜３における色素標識化ＤＮＡプロー
ブの製造過程を示す反応スキームである。

フロントページの続き (72)発明者 川口 正浩 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キ ヤノン株式会社内 (56)参考文献 特開 昭62−59293（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−255499（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−75958（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−307362（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−106875（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−122696（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−180845（ＪＰ，Ａ) 特表 昭64−500353（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/58 C07H 21/04 C12Q 1/68 C07H 19/04

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）アゾ色素、アントラキノン色素、
   インジゴイド色素、フタロシアニン色素、カルボニウム
   色素、キノンイミン色素、メチン色素、キノリン色素、
   ニトロ色素、ニトロソ色素、ベンゾキノン色素、ナフト
   キノン色素、ナフタルイミド色素、ペノリン色素及びこ
   れらの誘導体からなる群より選択された色素を含む色素
   構造の１以上を形成するための色素中間体の複素環に糖
   を結合させる過程と、 （ｂ）得られた糖結合色素中間体をリン酸化処理し、該
   糖結合色素中間体の糖部分に無機リン酸基及び無機リン
   酸誘導体基から選択された１〜３個のリン酸基をエステ
   ル結合させてモノヌクレオチド類似色素中間体を得る過
   程と、 （ｃ）該モノヌクレオチド類似色素中間体を核酸プロー
   ブに導入して、核酸プローブ中間体を形成する過程と、 （ｄ）該核酸プローブ中間体の有する色素中間体部分を
   色素化して色素構造とし、色素標識化核酸プローブを得
   る過程とを有することを特徴とする色素標識化核酸プロ
   ーブの製造方法。
2. 【請求項２】 糖部分の遊離水酸基に保護基が付加され
   ている請求項１に記載の製造方法。
3. 【請求項３】 過程（ｃ）の色素化で得られる色素構造
   のモル吸光係数（ε）が１×１０⁴〜１×１０⁶の範囲に
   ある請求項１または２に記載の製造方法。
4. 【請求項４】 アゾ色素、アントラキノン色素、インジ
   ゴイド色素、フタロシアニン色素、カルボニウム色素、
   キノンイミン色素、メチン色素、キノリン色素、ニトロ
   色素、ニトロソ色素、ベンゾキノン色素、ナフトキノン
   色素、ナフタルイミド色素、ペノリン色素及びこれらの
   誘導体からなる群より選択された色素を含む色素構造の
   １以上を形成するための色素中間体部分と、該色素中間
   体部分の複素環に結合した糖部分と、該糖部分にエステ
   ル結合した無機リン酸基及び無機リン酸誘導体基から選
   択された１〜３個のリン酸基とを有することを特徴とす
   る核酸プローブ中間体形成用のモノヌクレオチド類似色
   素中間体。
5. 【請求項５】 糖部分の遊離水酸基に保護基が付加され
   ている請求項４に記載のモノヌクレオチド類似色素中間
   体。
6. 【請求項６】 色素構造のモル吸光係数（ε）が１×１
   ０⁴〜１×１０⁶の範囲にある請求項４または５に記載の
   モノヌクレオチド類似色素中間体。
7. 【請求項７】 標的核酸検出用の塩基配列と、請求項４
   〜６のいずれかに記載のモノヌクレオチド類似色素中間
   体を有することを特徴とする色素標識化核酸プローブ形
   成用の核酸プローブ中間体。
8. 【請求項８】 （ａ）アズレン色素及びこれらの誘導体
   からなる群より選択された色素を含む色素構造の１以上
   を形成するための色素中間体の環に糖を結合させる過程
   と、 （ｂ）得られた糖結合色素中間体をリン酸化処理し、該
   糖結合色素中間体の糖部分に無機リン酸基及び無機リン
   酸誘導体基から選択された１〜３個のリン酸基をエステ
   ル結合させてモノヌクレオチド類似色素中間体を得る過
   程と、 （ｃ）該モノヌクレオチド類似色素中間体を核酸プロー
   ブに導入して、核酸プローブ中間体を形成する過程と、 （ｄ）該核酸プローブ中間体の有する色素中間体部分を
   色素化して色素構造とし、色素標識化核酸プローブを得
   る過程とを有することを特徴とする色素標識化核酸プロ
   ーブの製造方法。
9. 【請求項９】 アズレン色素及びこれらの誘導体からな
   る群より選択された色素を含む色素構造の１以上を形成
   するための色素中間体部分と、該色素中間体部分の環に
   結合した糖部分と、該糖部分にエステル結合した無機リ
   ン酸基及び無機リン酸誘導体基から選択された１〜３個
   のリン酸基とを有することを特徴とする核酸プローブ中
   間体形成用のモノヌクレオチド類似色素中間体。
10. 【請求項１０】 糖部分の遊離水酸基に保護基が付加さ
    れている請求項９に記載のモノヌクレオチド類似色素中
    間体。
11. 【請求項１１】 色素構造のモル吸光係数（ε）が１×
    １０ ⁴ 〜１×１０ ⁶ の範囲にある請求項９または１０に記
    載のモノヌクレオチド類似色素中間体。
12. 【請求項１２】 標的核酸検出用の塩基配列と、請求項
    ９〜１１のいずれかに記載のモノヌクレオチド類似色素
    中間体を有することを特徴とする色素標識化核酸プロー
    ブ形成用の核酸プローブ中間体。