JP2009008673A - シアニン色素フォスフォアミダイト - Google Patents

Abstract

【課題】新規色素を提供する。
【解決手段】化学式１で示す一般式を有するフォスフォアミダイト。

この化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表し、ｍは１から１８までの整数であり、ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ_２およびＣ（ＣＨ_３）_２からなるグループから独立に選択され、Ｒ_１はアルキル基であり、（ＰＡＭ）はフォスフォアミダイト基であり、Ｘ^（−）は陰イオンである。
【選択図】なし

Description

本発明は、一般的には、シアニン色素に関し、具体的には、シアニン色素フォスフォアミダイトと、それらの合成と、オリゴヌクレオチド標識における使用方法とに関する。

生物学医学研究に用いられる手順の多くは、プローブ、プライマー、リンカー、アダプターおよび遺伝子断片としてのオリゴヌクレオチドの利用に大きく依存している。これらの利用のいくつかは、「分子クローニング、実験マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版（Ｊ．サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８９年）および「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｆ．Ｍ．アウシュベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、ＣｕｒｒｅｎｔＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９３年）のような周知の実験マニュアルに説明されている。

望ましい配列のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシドをリンを含む共有結合で結合することにより、合成される。最も慣用されるオリゴヌクレオチドの合成方法は、弱酸の存在下で、保護されたシアノエチルフォスフォアミダイトのモノマーにヌクレオシドを反応させること、このようにして形成されたリン酸結合を酸化させること、シアノエチル基を加水分解することを伴う（フォスフォアミダイト法によるオリゴヌクレオチド合成の進歩、ボーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）、Ｓ．Ｌ．およびアイアー（Ｉｙｅｒ）、Ｒ．Ｐ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９２年、４８巻、２２２３−２３１１頁）。

自動化ＤＮＡ配列決定および地図作成、ｉｎ ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーションの検出、ＰＣＲ産物の検出および構造研究のような多くの用途では、標識されたオリゴヌクレオチドを必要とする。放射能標識が伝統的にこれらの用途に用いられていたが、近年では、ある種のシアニン色素が非常に強い蛍光を有し、生体分子の標識にとても有用であることが証明されてきた。

シアニン色素は、取り扱いの安全性と、より長波長での吸光性と、高い吸光率と、比較的高い量子効率と、小さい分子サイズと、化学的操作の容易性と、試薬、ｐＨおよび温度に対する程よい安定性とを含む、多くの望ましい特性を有する。生物学的材料の蛍光バックグランドが低いこと、およびスペクトルのより長い方の波長でシアニン色素の吸光度が高いことのため、シアニン色素は優秀なシグナル対雑音比を与える。シアニン色素の発色団の部分の構造修飾を合成することにより、４００から約１１００ｎｍまでの広い帯域の波長で吸光し発光する、異なる蛍光標識試薬を得ることができる。シアニン色素に取り込むことができる官能基の多目的性が、前記色素および標識生成物の溶解性の制御を可能にし、このような標識材料の検定用混合液の無関係な成分との非特異的な結合を低減するのに役立つ（ワゴナー（Ｗａｇｇｏｎｅｒ）、米国特許第５，５６９，５８７および５，６２７，０２７号明細書）。
米国特許第５，５６９，５８７号明細書 米国特許第５，６２７，０２７号明細書

現在のところ、オリゴヌクレオチドのシアニン色素による標識は、手作業の２つのステップからなる手順によって実行されている。まず、オリゴヌクレオチドが合成され、それから、活性化シアニン色素が前記合成されたオリゴヌクレオチドの５’末端に結合される。通常、シアニン色素は、オリゴヌクレオチドとの共有結合による結合を補助する反応基の導入により活性化される（例えば、米国特許第５，５６９，５８７および５，６２７，０２７号明細書を参照せよ）。この２つのステップからなる方法は、遅く（４〜５日間）、退屈で、高価で、しばしば望ましくない有機副生成物を製造する。

代替策となる、より便利な１つのステップからなるアプローチでは、蛍光色素はフォスフォアミダイトに転換されて、オリゴヌクレオチドの合成の間に直接標識するのに用いられる。しかし、シアニン色素の今日入手可能なフォスフォアミダイトは、これらの標準的な、未修飾の対応物に比べて、より高価で、しかもより不安定である。

米国特許第５，５５６，９５９号明細書（以下「９５９明細書」という。）は、合成オリゴヌクレオチドを標識するために、カルボシアニンフォスフォアミダイトを利用することを説明する。しかし、前記９５９明細書のシアニンフォスフォアミダイトは、トリチル基、４−Ｏ−モノメトキシトリチル基、４，４’−Ｏ−ジメトキシトリチル基またはアシル基のような保護基を含む。保護基は、保存および取り扱い中の不安定さと関連することが常であり、これらのフォスフォアミダイトの商業的な価値を下げている。
米国特許第５，５５６，９５９号明細書

発明の概要
上記の関連技術の欠点に照らし、ＤＮＡ合成機での自動合成の際にオリゴヌクレオチドを直接標識するための安定なシアニン色素フォスフォアミダイトを提供することが、本発明の目的である。保護基の導入および脱離のステップを含まない、フォスフォアミダイトを合成する便利な方法を提供することも本発明の目的である。オリゴヌクレオチドの合成の間に該オリゴヌクレオチドを標識する方法を提供することも本発明の目的である。

これらおよびその他の目的は、以下の（Ｉ）の一般式を有する本発明の色素において達成される。

この化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。ｍは１から１８までの整数である。ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ_２およびＣ（ＣＨ_３）_２からなるグループから独立に選択される。Ｒ_１はアルキル基である。（ＰＡＭ）はフォスフォアミダイト基である。Ｘ^（−）は陰イオンである。Ｑは、以下の化学式（Ｑ−１）または（Ｑ−２）であって、ｎは１、２または３である。

本発明の１の実施態様によると、前記色素は、Ｃｙ５、ベンゾＣｙ５、ジベンゾＣｙ５、Ｃｙ７、ベンゾＣｙ７、ジベンゾＣｙ７、環状Ｃｙ７、環状ベンゾＣｙ７および環状ジベンゾＣｙ７からなるグループから選択されるシアニン色素である。前記フォスフォアミダイト基は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−β−シアノエチルフォスフォアミダイト基の場合がある。

本発明の別の面は、色素フォスフォアミダイトの合成方法を提供する。前記方法は、（ａ）以下の化学式（ＩＩ）を有する色素の水酸化誘導体を形成するステップと、（ｂ）前記水酸基の水素をフォスフォアミダイト基で置換するステップとを含む。

この化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。ｍは１から１８までの整数である。ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ_２およびＣ（ＣＨ_３）_２からなるグループから独立に選択される。Ｒ_１はアルキル基である。Ｘ^（−）は陰イオンである。Ｑは、以下の化学式（Ｑ−１）または（Ｑ−２）であって、ｎは１、２または３である。

本発明の実施態様によると、前記色素は、シアニン色素、特に、Ｃｙ５、ベンゾＣｙ５、ジベンゾＣｙ５、Ｃｙ７、ベンゾＣｙ７、ジベンゾＣｙ７、環状Ｃｙ７、環状ベンゾＣｙ７または環状ジベンゾＣｙ７であってもよい。前記フォスフォアミダイト基はＮ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−β−シアノエチルフォスフォアミダイト基の場合がある。

本発明の１の実施態様では、前記色素（ＩＩ）の水酸基誘導体を形成するステップは、前記シアニン色素の水酸基誘導体の形成を可能にする条件下で、化合物（ＸＩ）、（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ）を反応させることを含む。

化合物（ＸＩ）は、以下の一般式を有するいかなる化合物であってもよい。

化合物（ＸＩＩ）は、一般式Ｐｈ−Ｒ_３−Ｐｈを有するいかなる化合物であってもよい。ここでＰｈはフェニル基で、Ｒ３は以下のいずれかである。

化合物（ＸＩＩＩ）は以下の一般式を有するいかなる化合物であってもよい。

この化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。ｍは１から１８までの整数である。ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ_２およびＣ（ＣＨ_３）_２からなるグループから独立に選択される。Ｒ_１はアルキル基である。Ｘ^（−）は陰イオンである。

代替策として、前記色素の水酸基誘導体を形成するステップは、（ａ１）以下の化学式（ＸＸ）を有する色素のアセトキシル基誘導体を形成すること、および（ａ２）前記色素のＡｃＯ基をＯＨ基に変換することを含む。

この化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。ｍは１から１８までの整数である。ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ_２およびＣ（ＣＨ_３）_２からなるグループから独立に選択される。Ｒ_１はアルキル基である。Ｘ^（−）は陰イオンである。Ｑは、以下の化学式（Ｑ−３）または（Ｑ−４）であって、ｎは、１または２であり、Ｒ２は、ハロゲンまたは水素である。

本発明の別の面は、発光色素フォスフォアミダイトをオリゴヌクレオチドを直接標識するのに用いる方法を提供する。

本発明は、生体高分子、特に、オリゴヌクレオチドの標識において他の色素を使用する場合より優れた、経済的利点および技術的な利点の両方を提供する。以下に詳しく説明されるとおり、本発明の色素フォスフォアミダイトは、合成の過程で、オリゴヌクレオチドに該色素を自動的に付加するために、例えば、オリゴ１０００Ｍ（ベックマン・コールター、カリフォルニア州）のような、いかなるＤＮＡ合成機ででも使用可能である。保護基なしの色素フォスフォアミダイトを使用することにより、保護基を除去するステップが削除されるため、標識オリゴヌクレオチドを調製するのに要する全時間が非常に短縮される。Ｃｙ７およびＤＢＣｙ７フォスフォアミダイトの共役二重結合鎖に環状の部分を取り入れることにより、Ｃｙ５様の分子種への部分的変換が効果的に防止され、安定な色素が形成される。オリゴヌクレオチド標識に本発明の色素フォスフォアミダイトを使用することにより提供されるコストおよび時間の節約に加え、従来の２つのステップからなる方法と比較して、より高い標識生成物の総合収率が達成される。
したがって、本発明は、以下をも提供する。
（１）以下の化学式１を有する色素フォスフォアミダイトであって、

この化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表し、ｍは１から１８までの整数であり、ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ _２ およびＣ（ＣＨ _３ ） _２ からなるグループから独立に選択され、Ｒ _１ はアルキル基であり、（ＰＡＭ）はフォスフォアミダイト基であり、Ｘ ^（−） は陰イオンであり、Ｑは、以下の化学式（Ｑ−１）または（Ｑ−２）であり、

ｎは１、２または３である、色素フォスフォアミダイト。
（２）前記芳香族環は、フェニル基、ナフチル基または複素環である、項目１に記載の色素フォスフォアミダイト。
（３）前記アルキル基は、１〜１８個の炭素原子を有する、項目１に記載の色素フォスフォアミダイト。
（４）前記アルキル基はエチル基である、項目３に記載の色素フォスフォアミダイト。
（５）前記色素はシアニン色素である。項目１に記載の色素フォスフォアミダイト。
（６）前記シアニン色素は、Ｃｙ５、ベンゾＣｙ５、ジベンゾＣｙ５、Ｃｙ７、ベンゾＣｙ７、ジベンゾＣｙ７、環状Ｃｙ７、環状ベンゾＣｙ７および環状ジベンゾＣｙ７からなるグループから選択される、項目５に記載の色素フォスフォアミダイト。
（７）前記陰イオンは、Ｉ ^（−） またはＢｒ ^（−） である、項目１に記載の色素フォスフォアミダイト。
（８）前記フォスフォアミダイト基は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−β−シアノエチル フォスフォアミダイト基である、項目１に記載の色素フォスフォアミダイト。
（９）ｎは２であり、前記色素は、Ｃｙ５、ＢＣｙ５またはＤＢＣｙ５であり、Ｑは以下の化学式（Ｑ−３）である、項目１に記載の色素フォスフォアミダイト。

（１０）ｎは３であり、前記色素は、Ｃｙ７、ＢＣｙ７またはＤＢＣｙ７で、Ｑは以下の化学式（Ｑ−４）である、項目１に記載の色素フォスフォアミダイト。

（１１）前記色素は、環状Ｃｙ７、環状ＢＣｙ７または環状ＤＢＣｙ７であり、Ｑは以下の化学式（Ｑ−５）である、項目１に記載の色素フォスフォアミダイト。

（１２）（ａ）以下の化学式２を有する色素の水酸基誘導体であって、

この化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表し、ｍは１から１８までの整数であり、ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ _２ およびＣ（ＣＨ _３ ） _２ からなるグループから独立に選択され、Ｒ _１ はアルキル基であり、Ｘ ^（−） は陰イオンであり、Ｑは、以下の化学式（Ｑ−６）または（Ｑ−７）であり、

ｎは１、２または３である、色素の水酸基誘導体を形成するステップと、（ｂ）前記ＯＨ基の水素はフォスフォアミダイトで置換するステップとを含む、色素フォスフォアミダイトの合成方法。
（１３）前記芳香族環は、フェニル基、ナフチル基または複素環である、項目１２に記載の方法。
（１４）前記アルキル基は、１から１２個までの炭素原子を有する、項目１２に記載の方法。
（１５）前記アルキル基はエチル基である、項目１４に記載の方法。
（１６）前記陰イオンは、I ^（−） またはＢｒ ^（−） である、項目１２に記載の方法。
（１７）前記フォスフォアミダイト基は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−β−シアノエチル フォスフォアミダイト基である、項目１２に記載の方法。
（１８）前記色素はシアニン色素である、項目１２に記載の方法。
（１９）前記シアニン色素は、Ｃｙ５、ベンゾＣｙ５、ジベンゾＣｙ５、Ｃｙ７、ベンゾＣｙ７、ジベンゾＣｙ７、環状Ｃｙ７、環状ベンゾＣｙ７および環状ジベンゾＣｙ７からなるグループから選択される、項目１２に記載の色素フォスフォアミダイト。
（２０）前記色素の水酸基誘導体を形成するステップは、前記色素の水酸基誘導体の形成を可能にする条件下で、以下の化学式を有する化合物（ＸＩ）と、

化学式Ｐｈ−Ｒ _３ −Ｐｈを有し、Ｐｈはフェニル基で、Ｒ３は以下のいずれかである、化合物（ＸＩＩ）と、

以下の化学式を有する化合物（ＸＩＩＩ）とであって、

これらの化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表し、ｍは１から１８までの整数であり、ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ _２ およびＣ（ＣＨ _３ ） _２ からなるグループから独立に選択され、Ｒ _１ はアルキル基であり、Ｘ ^（−） は陰イオンである、化合物（ＸＩ）と化合物（ＸＩＩ）と化合物（ＸＩＩＩ）とを反応させることを含む、項目１２に記載の方法。
（２１）前記芳香族環は、フェニル基、ナフチル基または複素環である、項目２０に記載の方法。
（２２）前記陰イオンはＢｒ ^（−） である、項目２０に記載の方法。
（２３）前記アルキル基は、１から１８個までの炭素原子を有する、項目２０に記載の方法。
（２４）前記アルキル基はエチル基である、項目２３に記載の方法。
（２５）化合物（ＸＩＩＩ）は、化合物（ＸＩＩＩ）の形成を可能にする条件下で、以下の化学式を有する化合物（ＸＩＶ）であって、

上記の化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表し、Ｙは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ _２ およびＣ（ＣＨ _３ ） _２ からなるグループから選択され、ｍは１から１８までの整数である、化合物（ＸＩＶ）を、Ｂｒ（ＣＨ _２ ） _ｍ −ＯＨに反応させることにより形成される、項目２０に記載の方法。
（２６）前記色素は、Ｃｙ５、Ｃｙ７または環状Ｃｙ７であり、化合物（Ｉ）はヨウ化１−エチル−２，３，３−トリメチル−（３Ｈ）−インドールニウムで、化合物（ＸＩＩＩ）は臭化１−（６−ヒドロキシルヘキシル）−１，１，２−トリメチル−（３Ｈ）−インドールニウムである、項目２０に記載の方法。
（２７）前記色素は、ＤＢＣｙ５、ＤＢＣｙ７または環状ＤＢＣｙ７であり、化合物（Ｉ）はヨウ化１−エチル−１，１，２−トリメチル−Ｈ−ベンゾインドールニウムで、化合物（ＸＩＩＩ）は臭化１−（６−ヒドロキシヘキシル）−１，１，２−トリメチル−Ｈ−ベンゾインドールニウムである、項目２０に記載の方法。
（２８）前記色素の水酸基誘導体を形成するステップは、（ａ１）以下の化学式３を有する水酸基誘導体であって、

上記の化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表し、ｍは１から１８までの整数であり、ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ _２ およびＣ（ＣＨ _３ ） _２ からなるグループから独立に選択され、Ｒ _１ はアルキル基であり、Ｘ ^（−） は陰イオンであり、Ｑは、以下の化学式（Ｑ−８）または（Ｑ−９）であって、

上記の式において、ｎは、１または２であり、Ｒ _２ は、ハロゲンまたは水素である、水酸基誘導体を形成するステップと、（ａ２）前記色素のＡｃＯ基をＯＨ基に転換するステップとを含む、項目１２に記載の方法。
（２９）前記芳香族環は、フェニル基、ナフチル基または複素環である、項目２８に記載の方法。
（３０）前記アルキル基は、１から１２個までの炭素原子を有する項目２８に記載の方法。
（３１）前記アルキル基はエチル基である、項目３０に記載の方法。
（３２）前記色素はシアニン色素である、項目２８に記載の方法。
（３３）前記シアニン色素は、Ｃｙ５、ベンゾＣｙ５、ジベンゾＣｙ５、環状Ｃｙ７、環状ベンゾＣｙ７および環状ジベンゾＣｙ７からなるグループから選択される、項目３３に記載の色素フォスフォアミダイト。
（３４）前記陰イオンはＩ ^（−） である、項目２８に記載の方法。
（３５）前記ハロゲンは塩素である、項目２８に記載の方法。
（３６）前記シアニン色素のアセトキシル基誘導体を形成するステップは、前記色素のアセトキシル誘導体を形成することを可能にする条件下で、以下の化学式を有する化合物（ＸＩ）と、

Ｐｈがフェニル基である、以下の化学式を有する（ＸＸＩＩ）と、

以下の化学式を有する（ＸＸＩＩＩ）とであって、

上記の化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表し、ｍは１から１８までの整数であり、ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ _２ およびＣ（ＣＨ _３ ） _２ からなるグループから独立に選択され、Ｒ _１ はアルキル基であり、Ｘ ^（−） は陰イオンである、化合物（ＸＩ）と化合物（ＸＸＩＩ）と化合物（ＸＸＩＩＩ）とを反応させることを含む、項目２８に記載の方法。
（３７）前記芳香族環は、フェニル基、ナフチル基または複素環である、項目３６に記載の方法。
（３８）前記陰イオンはＩ ^（−） である、項目３６に記載の方法。
（３９）前記アルキル基は、１から１２個までの炭素原子を有する、項目３６に記載の方法。
（４０）前記アルキル基はエチル基である、項目３９に記載の方法。
（４１）前記シアニン色素はＣｙ５または環状Ｃｙ７であり、化合物（ＸＩ）はヨウ化１−エチル−２，３，３−トリメチル−（３Ｈ）−インドールニウムであり、化合物（ＸＸＩＩＩ）はヨウ化１−（１’−アセトキシプロピル）−２，３，３’−トリメチル−（３Ｈ）−インドールニウムである、項目３６に記載の方法。
（４２）前記シアニン色素は、ＤＢＣｙ５または環状ＤＢＣｙ７ ヨウ化１−エチル−１，１，２−トリメチル−Ｈ−ベンゾインドールニウムであり、化合物（ＸＸＩＩＩ）はヨウ化１−（１’−アセトキシプロピル）−２，３，３’−トリメチル−Ｈ−ベンゾインドールニウムである、項目３６に記載の方法。
（４３）項目１に記載の色素フォスフォアミダイトとオリゴヌクレオチドとの結合を可能にする条件下で、前記色素フォスフォアミダイトを前記オリゴヌクレオチドに反応させることを含む、オリゴヌクレオチドの標識方法。

本発明は、添付する特許請求の範囲においてその完全な範囲が定義され、以下の好ましい実施態様において説明される。

発明の詳細な説明
オリゴヌクレオチドの合成過程で、該オリゴヌクレオチドに色素標識を直接導入することを促進するために、本発明は、以下の化学式（Ｉ）を有する色素フォスフォアミダイトを提供する。

この化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。ｍは１から１８までの整数である。ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ_２およびＣ（ＣＨ_３）_２からなるグループから独立に選択される。Ｒ_１はアルキル基である。（ＰＡＭ）はフォスフォアミダイト基である。Ｘ^（−）は陰イオンである。Ｑは、以下の化学式（Ｑ−５）または（Ｑ−６）であって、ｎは１、２または３である。

活性化された色素は、複素環か、フェニル基のような単一の環状芳香族構造か、ナフチル基のような縮合した環状構造かを含む場合がある。アルキル基は１から１８個までの炭素原子を有することが一般的であり、２個の炭素原子を有することが好ましい。フォスフォアミダイト基は、通常、アルキル鎖で前記色素に結合している。前記アルキル鎖の長さは、炭素原子約１から１２個分であることが好ましい。最も実用的なアルキル鎖の長さは、炭素原子約６個分である。本発明の化合物（Ｉ）は、陰イオンＸ^（−）を含む。このイオンがハロゲン化物であることが好ましいが、他の陰イオンを使ってもよい。例えば、前記陰イオンは、合成戦略に応じて、Ｉ^（−）またはＢｒ^（−）であってもよい。前記フォスフォアミダイト基は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−β−シアノエチルフォスフォアミダイト基の場合があるが、当業者に知られた他のフォスフォアミダイトを用いてもよい。

一般的にみて、本発明の色素は、フォスフォアミダイト基およびアルキル基を取り込んでいる限り、標識の目的に慣用される蛍光色素のどれでもよい。前記フォスフォアミダイト基およびアルキル基は前記色素のインドールまたはベンゾインドールの部分の窒素に結合していることが要求される。前記色素の吸光および発光波長は、スペクトルの特定の領域に制限されず、近紫外から近赤外、あるいはこれらの両端を超える、いかなる波長であってもよい。本発明の実施態様によると、前記色素は、シアニンおよび関連する色素の場合がある。

シアニン色素は、（安価な検出システムを使用すること、およびこれらの波長での生物学的材料からのバックグランドが低いことを意味する）より長い波長での吸収と、高い吸光率と、比較的高い量子収率と、小さい分子サイズと、蛍光特性を損なわずに化学的操作が容易に行えること、および試薬、ｐＨおよび温度に対する安定性が比較的あることを含めて、敏感な検出用標識として役立つ望ましい特性が複数ある。

シアニン色素は、発色団が、末端に２個の四級窒素原子を有する一連の共役二重結合を含み、該窒素原子は１個の陽電荷を共有する、一般的な構造を有する。中心部の二重結合の数によって、前記シアニン色素は、モノカルボシアニン（ｎ＝１、別名、トリメチンカルボシアニンまたはＣｙ３）、ジカルボシアニン（ｎ＝２、別名、ペンタメチンカルボシアニンまたはＣｙ５）およびトリカルボシアニン（ｎ＝３、別名、ヘプタメチンカルボシアニンまたはＣｙ７）として分類することができる。中心部の二重結合の数は励起光を部分的に決定する。ｎの値が大きいことは、蛍光および吸光度の増大の原因となることがしばしばある。そのうえ、環状構造の修飾によって、さらなる蛍光を得ることができる。ｎ＝２のとき、励起波長は約６５０ｎｍで、化合物は非常に蛍光性が高い。

本発明の１の実施態様では、ジカルボシアニン色素（Ｃｙ５、ベンゾＣｙ５（ＢＣｙ５）およびジベンゾＣｙ５（ＤＢＣｙ５））と、トリカルボシアニン色素（Ｃｙ７、ベンゾＣｙ７（ＢＣｙ７）およびジベンゾＣｙ７（ＤＢＣｙ７））とのフォスフォアミダイトは、直接標識に用いられる。これら２つのグループの色素の間の相違点は、Ｃｙ５、ＢＣｙ５およびＤＢＣｙ５のそれぞれに対して、Ｃｙ７、ＢＣｙ７およびＤＢＣｙ７には追加の二重結合が存在することである。そのために、前記ジカルボシアニン色素は、トリカルボシアニン色素の対応する化合物に比べて最大吸光波長も最大発光波長も約１００ｎｍ短い。インドールシアニンの対応する化合物に比べて、ベンゾインドールシアニンである、ＢＣｙ５およびＢＣｙ７は、１個のベンゼン基の置換があり、ＤＢＣｙ５およびＤＢＣｙ７は、２個のベンゼン基の置換がある。そこで、ベンゾインドールシアニンは、インドールの対応する化合物よりも最大吸光波長も最大発光波長も長い。

本発明の別の実施態様では、環状Ｃｙ７およびＤＢＣｙ７色素のフォスフォアミダイトが用いられている。シアニン色素分子の共有二重結合際に環状の部分を取り込むことがＣｙ７分子種の余剰の安定性を提供していることが本発明の発見である。１の実施態様では、以下の構造をした環状部分を使用する場合がある。１の実施態様では、以下の化学式（Ｐ）を有する環状の部分が用いられる。

本発明の色素フォスフォアミダイトは、前記オリゴヌクレオチドに自動的に添加するために直接いずれかのＤＮＡ合成機に使用することができる。本発明の色素フォスフォアミダイトは、いかなる保護基も含まないが、これによりより安定になる。保護基なしの色素フォスフォアミダイトを使用することにより、保護基を除去するステップが削除されるため、標識オリゴヌクレオチド調製に要する全時間は非常に短縮される。本発明の色素フォスフォアミダイトをオリゴヌクレオチド標識に用いることにより提供されるコストおよび時間の節約に加え、標識生成物のより高い総合収率は、従来の２つのステップと比べて、より高い標識生成物の総合収率が達成される。

本発明の別の面は、色素フォスフォアミダイトの合成方法を提供する。本発明の色素フォスフォアミダイトの調製のための一般的な合成計画は図１Ａ〜１Ｃに示されている。この方法は、（ａ）以下の化学式（ＩＩ−ＯＨ）を有する色素（ＩＩ）の水酸基誘導体を形成するステップと、（ｂ）前記ＯＨ基の水素をフォスフォアミダイト基に置換するステップとを含む。

この化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。ｍは１から１８までの整数である。ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ_２およびＣ（ＣＨ_３）_２からなるグループから独立に選択される。Ｒ_１はアルキル基である。Ｘ^（−）は陰イオンである。Ｑは、以下の化学式（Ｑ−７）または（Ｑ−８）であって、ｎは１、２または３である。

色素は、複素環か、フェニル基のような単一の環状芳香族構造か、ナフチル基のような縮合した環状構造かを含む場合がある。特に関心があるのは、Ｃｙ５、Ｂｃｙ５、ＤＢＣｙ５、Ｃｙ７、Ｂｃｙ７、ＤＢＣｙ７、環状Ｃｙ７、環状ＢＣｙ７および環状ＤＢＣｙ７を含む、上記のシアニンである。

本発明の目的のためには、色素（ＩＩ）の水酸基誘導体は、色素フォスフォアミダイト（Ｉ）を形成するのに十分な条件下で、適当な試薬と反応させられる。本発明にしたがい、かつ、図１Ａに示すとおり、水素をフォスフォアミダイト基に置換するための適当な試薬は、テトラゾールと（ｉＰｒ_２Ｎ_２)_２ＰＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＮとの混合物を含むが、これに限られない。ｉＰｒ_２−Ｐ（Ｃｌ）ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮのような他の試薬を用いてもよい。１の実施態様によると、この反応は、−２０°Ｃ不活性雰囲気で実行されるのが好ましい。

本発明の実施態様によると、シアニン色素の水酸基誘導体を形成するステップ（ａ）は、図１Ｂおよび１Ｃに示すとおり、２つの代替的な方法で実行される場合がある。

図１Ｂに示す第１の方法では、シアニン色素の水酸基誘導体を形成するステップは、該シアニン色素の水酸基誘導体の形成を可能にする条件下で、化合物（ＸＩ）、（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ）を反応させることを伴う。

化合物（ＸＩ）は、以下の一般式を有するいかなる化合物でもよい。

化合物（ＸＩＩ）は、Ｐｈ−Ｒ_３−Ｐｈという一般式のいずれの化合物でもよい。ここで、Ｐｈはフェニル基で、Ｒ_３は以下の（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩｂ）または（ＸＩＩｃ）のいずれかである。

化合物（ＸＩＩＩ）は、以下の一般式のいずれの化合物であってもよい。

上記の化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。上記の化学式において、ｍは１から１８までの整数である。ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ_２およびＣ（ＣＨ_３）_２からなるグループから独立に選択される。Ｒ_１はアルキル基である。Ｘ^（−）は陰イオンである。１の実施態様では、前記陰イオンは臭素である。

特定の化合物（ＸＩ）、（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ）の選択は、合成される色素フォスフォアミダイトのタイプに依存する。例えば、Ｃｙ５フォスフォアミダイトを合成するためには、化合物（ＸＩＩａ）と、置換されない化合物（ＸＩ）および（ＸＩＩＩ）とを使用する（図２）。環状Ｃｙ７フォスフォアミダイトの合成には、化合物（ＸＩＩｃ）と、置換されない化合物（ＸＩ）および（ＸＩＩＩ）とを使用する（図７）。ＤＢＣｙ７フォスフォアミダイトを合成するためには、化合物（ＸＩＩａ）と、ベンゾ置換された化合物（ＸＩ）および（ＸＩＩＩ）とが用いられる（図３）。最後に、環状ＤＢＣｙ７フォスフォアミダイトは、ベンゾ置換された化合物（ＸＩ）および（ＸＩＩＩ）と、化合物（ＸＩＩｃ）とを用いて合成される（図８）。当業者は、適当な化合物（ＸＩ）、（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ）を選択することにより、他のフォスフォアミダイトを合成することができることを理解する。

図１Ｂに示す方法によると、一般式（ＸＩ）および（ＸＩＩ）のいずれの化合物でも使用できるが、１の実施態様では、化合物（ＸＩ）は、ヨウ化１−エチル２，３，３−トリメチル−（３Ｈ）−インドールニウムであり、化合物（ＸＩＩＩ）は、臭化１−（６−ヒドロキシヘキシル）−１，１，２−トリメチル−（３Ｈ）−インドールニウムである。この実施態様では、用いる化合物（ＸＩＩ）のタイプに応じて、Ｃｙ５（図２）、Ｃｙ７または環状Ｃｙ７（図７）のような、置換されないシアニン色素のフォスフォアミダイトが得られる。化合物（ＸＩＩａ）を用いるとき、Ｃｙ５のフォスフォアミダイトが得られる。同様に、化合物（ＸＩＩｂ）では、Ｃｙ７のフォスフォアミダイトが生成され、化合物（ＸＩＩｃ）では、環状Ｃｙ７のフォスフォアミダイトが形成される。

別の実施態様では、化合物（ＸＩ）は、ヨウ化１−エチル１，１，２−トリメチル−Ｈ−ベンゾインドールニウムで、化合物（ＸＩＩＩ）は、臭化1-（６−ヒドロキシヘキシル）−１，１，２−トリメチル−Ｈ−ベンゾインドールニウムである。この実施態様では、用いる化合物（ＸＩＩ）のタイプに応じて、ＤＢＣｙ５（図３）、ＤＢＣｙ７または環状ＤＢＣｙ７（図８）のようなベンゼン置換シアニン色素のフォスフォアミダイトが合成される。化合物（ＸＩＩａ）が用いられるとき、ＤＢＣｙ５が得られる。同様に、化合物（ＸＩＩｂ）では、ＤＥＢＣｙ７のフォスフォアミダイトが生成され、化合物（ＸＩＩｃ）では、環状ＤＢＣｙ７が形成される。

さまざまな試薬が化合物（ＸＩＩＩ）を形成するために使えるが、１の実施態様では、化合物（ＸＩＩＩ）は、化合物（ＸＩＩＩ）の形成を可能にする条件下で、化合物（ＸＩＶ）をＢｒ（ＣＨ_２）_ｍ−ＯＨと反応させることにより形成される。化合物（ＸＩＶ）は、以下の一般式を有するいかなる化合物でもよい。

上記の化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。Ｙは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ２およびＣ（ＣＨ３）２からなるグループから選択される。ｍは１から１８までの整数である。例えば、図２および３に示すとおり、化合物（ＸＩＶ）は、それぞれ、１，１，２−トリメチル−（３Ｈ）−インドールまたは１，１，２−トリメチル−Ｈ−ベンゾインドールである。前記化合物（ＸＩＶ）の形成を可能にする限り、異なる反応条件を用いてもよい。例えば、図２および３に示す反応は１２５°Ｃで実行された。

図１Ｂに示す方法による色素の水酸基誘導体の合成の成否は、反応条件に依存する。１の実施態様では、化合物ＸＩと化合物ＸＩＩとが無水酢酸および酢酸の中で３０分間１２５°Ｃで加熱される。得られた中間体は、蒸発乾燥され、５０ｍｌのジエチルエーテルで３回洗浄され、それから、化合物ＸＩＩＩとピリジン中で１２５°Ｃ３０分間反応させられる。実施例１および２は、適当な反応条件の詳細を提供する。他の反応条件は、前記水酸基誘導体の形成を支持する限り、用いてもよい。

代替的な方法では、図１Ｃに示す方法によって色素（ＩＩ）の水酸基誘導体を合成してもよい。前記方法は、（ａ１）以下の化学式を有する色素（ＸＸ）のアセトキシル基誘導体を形成すること、および（ａ２）前記シアニン色素のＡｃＯ基をＯＨ基に転換することを含む。

化学式（ＸＸ）において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。ｍは１から１８までの整数である。ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ_２およびＣ（ＣＨ_３）_２からなるグループから独立に選択される。Ｒ_１はアルキル基である。Ｘ^（−）は陰イオンである。Ｑは、以下の化学式（Ｑ−９）または（Ｑ−１０）であって、ｎは１または２である。Ｒ_２はハロゲンまたは水素である。１の実施態様では、前記陰イオンはＩ^（−）である。前記色素は、複素環か、フェニル環のような単一の環状芳香族構造か、ナフチル環のような縮合した環状構造かを含む場合がある。特に関心があるのは、Cｙ５、ＢＣｙ５およびＤＢＣｙ５と、環状Ｃｙ７、環状ＢＣｙ７および環状ＤＢＣｙ７とを含む上記のシアニンである。

フォスフォアミダイトの大半は、前記方法を用いて得ることができるが、Ｃｙ７色素は、安定でなく、かつ、保存または操作の間にしばしば分解してＣｙ５タイプの分子種になってしまうために、上記の戦略を用いてＣｙ７タイプのシアニン色素を合成するうえである種の困難が存在する。以下の化学式の構造を有する環状原子団のような安定化原子団がシアニン色素分子の共役二重結合鎖に取り込まれているとき、前記Ｃｙ７分子種はより安定となり、それらのフォスフォアミダイトは図１Ｃに開示された方法によって合成できる、ということが本発明の発見である。代替的には、置換されないＣｙ７タイプのフォスフォアミダイトは、上記のとおり、図１Ｂに示す方法によって得ることができる。

前記色素（ＸＸ）のアセトキシル基誘導体を形成するステップ（ａ１）を実行するために異なる戦略を用いることができるが、１の実施態様では、このステップは、前記シアニン色素のアセトキシル基誘導体の形成を可能にする条件下で、化合物（ＸＩ）、（ＸＸＩＩ）および（ＸＸＩＩＩ）を反応させることを含む。この実施態様では、化合物（ＸＩ）は、以下のの一般式を有するいかなる化合物であってもよい。

化合物（ＸＩＩ）は、以下の（ＸＸＩＩａ）または（ＸＸＩＩｂ）の一般式を有するいかなる化合物であってもよい。ここでＰｈはフェニル基である。

化合物（ＸＸＩＩＩ）は、以下の一般式を有するいずれの化合物でもよい。

各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。ｍは１から１８までの整数である。ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ_２およびＣ（ＣＨ_３）_２からなるグループから独立に選択される。Ｒ_１はアルキル基である。Ｘ^（−）は陰イオンである。１の実施態様では、前記陰イオンはＩ^（−）である。

図１Ｂに示す方法と同様に、特定の化合物（ＸＩ）、（ＸＸＩＩ）および（ＸＸＩＩＩ）の選択は、合成される色素フォスフォアミダイトのタイプに依存する。例えば、Ｃｙ５フォスフォアミダイトを合成するためには、化合物（ＸＸＩＩａ）と、置換されていない化合物（ＸＩ）および（ＸＸＩＩＩ）とを用いる（図９）。環状Ｃｙ７フォスフォアミダイトの合成には、化合物（ＸＸＩＩｂ）と、置換されていない化合物（ＸＩ）および（ＸＸＩＩＩ）とを用いる（図１３）。ＤＢＣｙ５フォスフォアミダイトを合成するためには、化合物（ＸＸＩＩａ）と、ベンゾ置換された化合物（ＸＩ）および（ＸＸＩＩＩ）とを用いる（図１１）。当業者は、適当な化合物（ＸＩ）、（ＸＸＩＩ）および（ＸＸＩＩＩ）を選択することにより、他のフォスフォアミダイトを合成することができることを理解する。

図１Ｃに示す方法によって一般式（ＸＩ）および（ＸＸＩＩＩ）を有するいずれの化合物を用いてもよいが、１の実施態様では、化合物（ＸＩ）は、ヨウ化１−エチル２，３，３−トリメチル−（３Ｈ）−インドールニウムであり、化合物（ＸＸＩＩＩ）は、ヨウ化１−（ｌ’−アセトキシプロピル）−２，３，３’−トリメチル−（３Ｈ）−インドールニウムである。この実施態様では、化合物（ＸＸＩＩ）のタイプに応じて、Ｃｙ５（図９）または環状Ｃｙ７（図１３）のような置換されていないシアニン色素のフォスフォアミダイトが得られる。化合物（ＸＸＩＩａ）を用いるとき、Ｃｙ５のフォスフォアミダイトが得られる。同様に、化合物（ＸＸＩＩｂ）では、環状Ｃｙ７のフォスフォアミダイトが生成される。

他の実施態様では、化合物（ＸＩ）はヨウ化１−エチル１，１，２−トリメチル−Ｈ−ベンゾインドールニウムで、化合物（ＸＸＩＩＩ）はヨウ化１−（１’−アセトキシプロピル）−２，３，３’−トリメチル−Ｈ−ベンゾインドールニウムである。この実施態様では、化合物（ＸＸＩＩ）のタイプに応じて、ＤＢＣｙ５（図１１）または環状ＤＢＣｙ７（図示されず）のようなベンゼン置換シアニン色素のフォスフォアミダイトが合成される。化合物（ＸＸＩＩａ）を用いるとき、ＤＢＣｙ５のフォスフォアミダイトが得られる。同様に、化合物（ＸＸＩＩｂ）では、環状ＤＢＣｙ７のフォスフォアミダイトが形成される。

図１Ｃに記載の方法によって、前記色素のアセトキシル基誘導体の合成に成功するかどうかは、反応条件に依存する。１の実施態様では、化合物ＸＩおよびＸＸＩＩは、オイルバスに入れた酢酸（２０ｍｌ）および無水酢酸（２０ｍｌ）の混合液中で１２０°Ｃ２時間インキュベーションされる。溶媒はロータリーエバポレータで除去され、生成物は３０ｍｌのジエチルエーテルで２回（全量６０ｍｌのジエチルエーテル）洗浄される。得られた生成物は無水酢酸とピリジンとの混合液（２０ｍｌ／２０ｍｌ）に溶解され、それから、化合物ＸＸＩＩＩが反応混合液に添加され、前記混合液は１１０°Ｃ３０分間インキュベーションされる。前記混合液は冷却され、ロータリーエバポレータ処理して溶媒が除去される。実施例３および４は、適当な反応条件についての詳細を提供する。他の反応条件は、水酸基誘導体（ＸＸ）の形成を支持する限り、用いてもよい。

本発明の別の面は、オリゴヌクレオチドの標識方法を提供する。前記方法は、上記の本発明の色素フォスフォアミダイトを前記オリゴヌクレオチドに結合することを可能にする条件下で、前記色素フォスフォアミダイトを前記オリゴヌクレオチドに反応させるステップを含む。当業者は、本発明の開示に照らして、過度の実験を要することなく標識条件を見つけることができる。

当業者は、本発明の色素のフォスフォアミダイトが配列のどこにでも導入されうることを理解する。しかし、好ましい付加部位は、前記色素標識によるハイブリダイゼーションに対する干渉が最小となる、オリゴヌクレオチドの５’末端である。商業的に入手可能なリンカーを用いることにより第２の色素を追加することは可能なので、多色標識されたオリゴヌクレオチドを提供する。

したがって、本発明は、生体分子の蛍光検出用の安定かつ便利な標識を提供する。前記標識は、いずれのＤＮＡ合成機ででも単一の自動ステップでオリゴヌクレオチドに付加することができ、従来用いられていた保護−脱保護のステップを必要としない。

本発明の色素のフォスフォアミダイトで標識されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むサンプル中の特異的な相補ヌクレオチド配列の存在および量を同定するための蛍光ハイブリダイゼーションプローブとして使用される場合がある。これらおよびその他のシアニン色素標識の多くの可能な用途の詳細な説明は、「効率的な活性化シアニン色素」という名称の係属中の米国特許出願第０９／１００，１５０号明細書と、「発光法による生物学的材料その他の材料の検出用標識試薬としてのシアニン色素」という名称の米国特許第５，６２７，０２７号明細書と、「発光性のアリールスルホナートシアニン色素を用いる材料の標識および検出の方法」という名称の米国特許第５，５６９，５８７号明細書とに提供されており、これらの関連する内容は、引用によりここに取り込まれている。

以下の実施例は、本発明に係る特許請求の範囲を例示することを意図するものであって、限定することは意図しない。かかる実施例は、使用されるものの典型的なものであるが、当業者に知られた他の手順が代替的に使われる場合がある。実際、当業者は、過度の実験を要せずに、ここに示す内容に基づいて、さらなる実施態様を予見し、作成することが容易にできる。

これらの実施例で用いられる一般的な分析方法および特徴付け技術は以下に同定される。３００ＭＨｚでの１ＨＮＭＲスペクトルは、（Ｂｒｕｋｅｒ製）核磁気共鳴分光計で記録された。化学シフトは、ＴＭＳとの相対値で１００万分の１部（δ）単位で記録された。３００ＭＨｚの３１ＰＮＭＲスペクトルは、（Ｂｒｕｋｅｒ製）核磁気共鳴分光計で記録された。化学シフトは、リン酸との相対値で１００万分の１部（δ）単位で記録された。分析用逆相ＨＰＬＣ法による分析は、４６ｍｍｘ ２５ｃｍのＣ１８ウルトラスフェア（ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ）カラム（粒径５μ）を取り付けたベックマン製の高圧液体クロマトグラフィー装置（ベックマン カタログ番号＃２３５３２９）で行った。

ＤＢＣｙ５（図３）およびＤＢＣｙ７（図５）の水酸基誘導体の合成
ヨウ化１−（１’−エチル）−１，１，２−トリメチル−Ｈ−ベンゾインドールニウムおよびマロンアルデヒドビス（フェニルイミン）一塩酸塩（ＤＢＣｙ５）、またはグルタコンアルデヒドジアニル塩酸塩（ｇｌｕｔａｃｏｎａｉｄｅｈｙｄｅｄｉａｎｉｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＤＢＣｙ７）が無水酢酸中で３０分間１２５°Ｃ加熱された。得られた中間体は蒸発乾固され、５０ｍｌのジエチルエーテルで３回洗浄され、それから、ピリジン中で臭化１−（６−ヒドロキシヘキシル）−１，１，２−トリメチル−Ｈ−ベンゾインドールニウムとともに１２５°Ｃ３０分間反応させた。前記ピリジンを蒸発乾固させた後、残渣はジエチルエーテルで洗浄され、ＣＨ２Ｃｌ２を含むシリカゲルのカラムで精製された。ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ／アセトン／ＭｅＯＨ（８５／５／５／５）による溶出により、８０％の収率でＤＢＣｙ５−ＯＨが（図４）、あるいは６０％の収率でＤＢＣｙ７−ＯＨが（図６）、それぞれ得られた。フォスフォアミダイトはプロトンＮＭＲ（示されず）および３１ＰＮＭＲ（図４および６）によって特徴付けられた。

環状Ｃｙ７の水酸基誘導体（図７）または環状ＤＢＣｙ７の水酸基誘導体（図８）の合成
ａ １−ホルミル−１−シクロヘキセン ジエチル アセタールの合成
１−シクロヘキセン−１−カルボキシアルデヒド（５．０ｇ、４５．４ミリモル）の溶液中に、無水エタノール（６０ｍＬ）およびＴｓＯＨ（０．００８５ｇ、２．２７ミリモル）に溶かしたオルトギ酸トリエチル（１３．５ｇ、９０．８ミリモル）が３°Ａ型のモレキュラーシーブ（１ｇ）を通して添加された。上記の反応物は加熱されアルゴン存在下で６時間還流され、それから、室温に冷却された。固体のＮａＨＣＯ３で急冷した後、反応混合液は濾過されて、油状に濃縮され（５．０ｇ、収率６０％）、それから、これ以上精製されることなく以下のステップに用いられた。

ｂ ５−フェニルアミノ−２，４−トリメチレン−２，４−ペンタジエン）塩化フェニルアンモニウムの合成
ジメチルホルムアミド（DMF)（３．２７ｇ、４４．７ミリモル）を乾燥するために、アルゴン存在下０°Ｃで激しく撹拌しながらＰＯＣｌ３が、１滴ずつ添加された。３０分後に、ＤＭＦ（６ｍＬ）中に入れた１−ホルミル−１−シクロヘキセンジエチル アセタール（２．７４ｇ、１４．９ミリモル）がカニューラを通して添加された。得られた反応混合液は０°Ｃで１時間撹拌され、それから、室温で２時間撹拌された。反応は０°Ｃまで冷却され、アニリン（４．１６ｇ、４４．７ミリモル）が１滴ずつ添加された。アニリンの添加後、反応は３０分間室温まで加温され、それから、氷水（１００ｍＬ）で急冷された。反応混合液は、濃いＮａＯＨ溶液でｐＨ１０〜１２に調整され、ジエチルエーテルで３回抽出された。エーテル相を一緒に混ぜ合わせて濃いＨＣｌでｐＨ１〜２まで酸性にした。エタノール（１０ｍｌ）が前記混合液に添加され、該混合液は−２０°Ｃで３時間保持された。沈殿は回収され、エタノールから再結晶化され、中間体の紫色の薄片が生成された（３．０１ｇ、収率６２％）。

ｃ 環状Ｃｙ７または環状ＤＢＣｙ７の水酸基誘導体の合成
ヨウ化１−エチル−２，３，３−トリメチル−インドールニウムまたはヨウ化１−エチル１，１，２−トリメチル−Ｈ−ベンゾインドールニウム（３．００ミリモル）および（５−フェニルアミノ−２，４−トリメチレン−２，４−ペンタジエン）塩化フェニルアンモニウム（０．９７５ｇ、３．００ミリモル）が、ＡＣ２Ｏ（５０ｍＬ）中で１時間１２５°Ｃで撹拌された。反応は、室温まで冷却され、濃縮された。残渣は、ジエチルエーテルで３回洗浄されて、真空乾燥された。得られた中間体は、臭化１−（１’−ヒドロキシルヘキシル）−２，３，３−トリメチル−インドールニウムまたは臭化１−（１’−ヒドロキシルヘキシル）−１，１，２−トリメチル−ベンゾインドールニウム(３．００ミリモル）と、ピリジン（５０ｍＬ）と混合され、１２５°Ｃ１時間撹拌された。反応は、室温まで冷却され、濃縮された。粗生成物は、ジエチルエーテルで３回洗浄され、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ、アセトン、ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２、体積比５：５：５：８５）により精製され、モノ−ヒドロキシルヘキシル環状Ｃｙ７については収率４６．４％、モノ−ヒドロキシヘキシル環状ＤＢＣｙ７については収率４６．７％であった。

水酸化Ｃｙ５（図９）または水酸化ＤＢＣｙ５（図１１）の合成
酢酸（２０ｍｌ）と無水酢酸（２０ｍｌ）との混合液に溶かしたヨウ化１−エチル２，３，３−トリメチル−（３Ｈ）−インドールニウム（Ｃｙ５）またはヨウ化１−エチル１，１，２−トリメチル−Ｈ−ベンゾインドールニウム（ＤＢＣｙ５）（４．４７ミリモル）およびマロンアルデヒドビス （フェニルアミン）一塩酸塩（８．５０ミリモル）の溶液が、１２０°Ｃに予熱されたオイルバス中で２時間加熱された。溶媒はロータリーエバポレータで除去され、生成物は３０ｍｌのジエチルエーテルで２回（全量６０ｍｌのジエチルエーテル）洗浄され、余剰のマロンアルデヒド塩酸ジアニルを除去した。このようにして得られた粗生成物は、無水酢酸およびピリジンの混合液（２０ｍｌ／２０ｍｌ）に溶解され、ヨウ化１−（１’−アセトキシプロピル）−２，３，３’トリメチル−（３Ｈ）−インドールニウム（Ｃｙ５）またはヨウ化１−（１’−アセトキシプロピル）−１，１，２−トリメチル−Ｈベンゾインドールニウム（ＤＢＣｙ５）（４．４７ミリモル）が添加され、反応混合液は１１０°Ｃ３０分間加熱された。この混合液は冷却され、ロータリーエバポレータ処理で溶媒を除去した。残渣はジエチルエーテルで洗浄され、乾燥された。前記残渣は水／メタノールが５０：５０の液２００ｍｌ中に２ＭＨＣｌが溶けた溶液に溶解され、終夜室温で撹拌された。溶媒は蒸発され、残渣はＣＨ２Ｃｌ２と水との間で分配された。有機層は硫酸ナトリウムで乾燥され、溶媒を蒸発させた。粗生成物は、メタノール：アセトン：エチル酢酸：ジクロロメタンが５／５／５／８５の割合で混合した液と、これに続いて、同じ成分を８／８／８／７６の割合で混合した液とを用いるシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製された。適当な分画がプールされ、蒸発されて、１ｇの水酸化Ｃｙ５（４７％）および１．２ｇの水酸化ＤＢＣｙ５（５６％）を得た。

水酸化Ｃｙ５の１Ｈスペクトルは、以下のとおりであった。（化学シフトはｐｐｍ単位である。）８．０２（ｄｄ、２Ｈ、∃−ＣＨ＝）、７．４−７．０（ｍ、８Ｈ、芳香族）、６．９（ｔ、１Ｈ、（−ＣＨ＝）、６．５８（ｄ、１Ｈ、∀−ＣＨ＝）、６．２１（ｄ、１Ｈ、∀−ＣＨ＝）、４．３（ｍ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ３）、４．１（ｍ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２）、３．８７（ｍ、ＣＨ２）、３．６（ｓ、１Ｈ、−ＯＨ）、２．１（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２）、１．７（ｄ、１２Ｈ、（ＣＨ３）４）および１．４２（ｔ、３Ｈ、−ＣＨ２−ＣＨ３）。水酸化ＤＢＣｙ５の１Ｈスペクトルは、以下のとおりであった。（化学シフトはｐｐｍ単位である。）８．２４（ｄｄ、２Ｈ、∃−ＣＨ＝）、７．４−８．２２（ｍ、１２Ｈ、芳香族）、７．５（ｔ、１Ｈ、（−ＣＨ＝）、６．５（ｄ、１Ｈ、∀−ＣＨ＝）、６．２（ｄ、１Ｈ、∀’−ＣＨ＝）、４．４（ｍ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ３）、４．１（ｍ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２）、３．９（ｍ、ＣＨ２）、３．７（ｓ、１Ｈ、−ＯＨ）、２．２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２）、１．９４（ｄ、１２Ｈ、（ＣＨ３）４）および１．４（ｔ、３Ｈ、−ＣＨ２−ＣＨ３）。

環状Ｃｙ７の水酸基誘導体の合成（図１３）
ヨウ化１−（１’−アセトキシプロピル）−２，３，３−トリメチル−（３Ｈ）−インドールニウム（７７４ｍｇ、２ミリモル）と、ビスアルデヒド（３４５ｍｇ、２ミリモル）と、ヨウ化１−（１’−エチル）−２，３，３−トリメチルインドールニウム（６３０．４０ｍｇ、２ミリモル）と、酢酸ナトリウム（３２８．１２ｍｇ、４ミリモル）とが丸底フラスコで混合された。この混合物に２４ｍｌのＡｃＯＨと１８ｍｌのＡＣ２Ｏとが添加された。反応混合液は１００°Ｃ６０分間加熱された。反応の進行は７７８ｎｍのＵＶ−ＶＩＳで監視された。前記反応混合液は室温まで冷却された。溶媒は脱気により蒸発乾固された。残渣は５０ｍｌのジエチルエーテルで３回洗浄され（全量１５０ｍｌ）、生成物１．１６ｇ（７４％）を得た。得られた化合物１．１６ｇは丸底フラスコに入れられ、６０ｍｌの無水ＤＭＦと、ＮａＳＣ２Ｈ５（２０等量）が添加された。反応混合液は７４８ｎｍでＵＶ−ＶＩＳにより監視された。前記反応混合液は冷却され、脱気により蒸発乾固された。得られた残渣はＣＨＣｌ３で粉砕された。前記残渣は、ＣＨ２Ｃｌ２の入ったシリカゲルカラムで精製された。ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ／アセトン／ＭｅＯＨ（８５／５／５／５）による溶出で所望の生成物を０．２３１ｇ（２２％）得た。環状Ｃｙ７フォスフォアミダイトは、プロトンＮＭＲと、３１ＰＮＭＲとで特徴付けられた。

本発明の色素フォスフォアミダイトのオリゴヌクレオチドへの結合
所望の標識オリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成機（オリゴ１０００ＭまたはＡＢＩ３９２）でＡｐａｃ、Ｇｉｐｒ−ｐａｃ、ＣａｃおよびＴフォスフォアミダイトを用いて得られる。１００ｍｇの前記色素フォスフォアミダイトは１ｍｌのアセトニトリル（０．１Ｍ溶液）に溶解され、前記ＤＮＡ合成機に設置された。前記色素フォスフォアミダイトは１０分間結合された。合成後、前記オリゴヌクレオチドは、ＮＨ４ＯＨまたは０．０５ＭＫ２ＣＯ３／ＭｅＯＨを用いて、室温で２時間切断および脱保護を施された。得られた溶液は、スピードバック（ｓｐｅｅｄ ＶＡＣ）で蒸発させられた。標識オリゴヌクレオチドはＣ１８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣ（ベックマンＨＤＬＬゴールドシステム）によって単離された。バッファーＡ（０．１ＭＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ７．０）と、バッファーＢ（１００％アセトニトリル）とが用いられた。Ａ中のＢの０〜５０％の勾配が用いられた。０〜２０分は１５％Ｂまでの勾配、２０〜２５分は２５％Ｂまでの勾配、２５〜３２分は５０％Ｂまでの勾配、３２〜３７分は５０％Ｂのまま、３７〜３８分は０％Ｂであった（図１５Ａおよび１５Ｂ）。ＨＰＬＣからの溶出液は完全に蒸発乾固され、それから水に溶解された。この溶液の２６０ｎｍおよび６５０ｎｍの吸光度はベックマンＳＵ−７０分光光度計で計測され、シアニン色素で標識されたオリゴヌクレオチドと矛盾しないことがわかった（図示せず）。精製された標識オリゴヌクレオチドの存在は、ベックマンのＬＩＦ検出器ＣＥＱ２０００を装備したＰＡＣＥ５０００による毛管電気泳動法と、ＨＰＬＣとによっても確認された。

本発明の色素フォスフォアミダイトの合成方法を示す反応概念図。 本発明の色素フォスフォアミダイトの合成方法を示す反応概念図。 本発明の色素フォスフォアミダイトの合成方法を示す反応概念図。 本発明のＣｙ５フォスフォアミダイトの合成を示す反応概念図。 本発明のＤＢＣｙ５フォスフォアミダイトの合成を示す反応概念図。 図３の反応概念図によって得られた本発明のＤＢＣｙ５フォスフォアミダイトの３１ＰＮＭＲスペクトル。 本発明のＤＢＣｙ７フォスフォアミダイトの合成を示す反応概念図。 図５の反応概念図によって得られた本発明のＤＢＣｙ７フォスフォアミダイトの３１ＰＮＭＲスペクトル。 本発明の環状Ｃｙ７フォスフォアミダイトの合成を示す反応概念図。 本発明の環状ＤＢＣｙ７フォスフォアミダイトの合成を示す反応概念図。 本発明のＣｙ５フォスフォアミダイトの合成を示す反応概念図。 図９の反応概念図によって得られた本発明のＣｙ５フォスフォアミダイトの３１ＰＮＭＲスペクトル。 本発明のＤＢＣｙ５フォスフォアミダイトの合成を示す反応概念図。 図１１の反応概念図によって得られた本発明のＤＢＣｙ５フォスフォアミダイトの３１ＰＮＭＲスペクトル。 本発明の環状Ｃｙ７フォスフォアミダイトの合成を示す反応概念図。 図１３の反応概念図によって得られた本発明の環状Ｃｙ７フォスフォアミダイトの３１ＰＮＭＲスペクトル。 精製前の本発明の色素フォスフォアミダイトで標識されたオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラム。 精製後の本発明の色素フォスフォアミダイトで標識されたオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラム。

Claims (3)

1. 複数の色素でオリゴヌクレオチドを標識する方法であって、該方法は、以下の工程：
   以下の化学式１を有する複数のフォスフォアミダイト色素と該オリゴヌクレオチドとを、該オリゴヌクレオチドへの該色素の結合を可能にする条件下で反応させる工程；
   

   

   
   
   
   この化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表し、
   ｍは１から１８までの整数であり、
   ＹおよびＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ _２ およびＣ（ＣＨ _３ ） _２ からなるグループから独立に選択され、
   Ｒ _１ はアルキル基であり、
   （ＰＡＭ）はフォスフォアミダイト基であり、
   Ｘ ^（−） は陰イオンであり、
   Ｑは、以下の化学式（Ｑ−１）または（Ｑ−２）であり、
   

   

   
   
   
   

   

   
   
   
   ｎは１、２または３である、工程
   を包含する、方法。
2. 前記複数の色素は、非同一である、請求項１に記載の方法。
3. 請求項１または２に記載の方法によって生産される複数標識オリゴヌクレオチド。

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