JP2004523602A - 効率的な橋かけ環状シアニン色素 - Google Patents
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Abstract
各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表し、n=1〜18、m=1〜18で、mはnとは独立に選択され、XおよびYは、S、O、N、CH2およびC(CH3)2からなるグループから独立に選択され、R1およびR2のうち少なくとも1つは、スルホン酸か、前記芳香族環に付着したスルホナート基かを含み、R3およびR4は、カルボキシル基、活性化カルボキシル基およびメチル基からなるグループから独立に選択され、前記R3またはR4の原子団の少なくとも1つはカルボン酸または活性化カルボン酸である。前記橋かけ環状色素の合成方法および使用方法が提供される。
Description
【0001】
本発明は、一般的には、活性化色素に関し、具体的には、活性化橋かけ環状シアニン色素と、その合成と、生体高分子を標識するための使用方法とに関する。
【背景技術】
【0002】
生物学医学研究および組換えDNA技術に用いられる多くの手順は、同位体で放射能標識されたヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの誘導体の利用に大きく依存する。しかし、放射能被曝という潜在的に有害な効果の認識の高まりと、速やかに増大する放射性廃棄物処理のコストとは、合成オリゴヌクレオチドを標識する他の方法への重点の移行の起因となってきた。多数の異なるタイプの非放射性標識について生物学的な検出アッセイでの使用法が見いだされてきたが、検出機器の改良と新規な蛍光標識試薬の数の増加との両方のために、近年蛍光標識の使用が急速に拡大してきた。
【0003】
蛍光検出技術の感度および精度は、該蛍光検出技術が用いる色素の物理的および化学的な性質に依存する。多くの商業的に入手可能な蛍光標識試薬に共通の問題は、水溶性でなく、水様液培地中の基質を標識する前に有機溶媒に溶かさなければならないことである。かかる有機溶媒は、敏感な基質に対し有害な影響を及ぼすことがある。前記色素の化学構造に関するその他の問題は、前記色素による細胞性物質の非特異的染色であって、これは観察の際のシグナル対雑音の比を低下する。
【0004】
シアニンおよび関連する色素は、高い吸光率と、比較的高い量子効率と、化学的な操作の容易性と、試薬、pHおよび温度に対する程よい安定性とを含む、従来の蛍光標識試薬より優れた多くの利点を提供する。生物学的材料の低い蛍光バックグランドと、スペクトラムの長波長部分におけるシアニン色素の高い吸光度とのために、シアニン色素は優秀なシグナル対雑音比を示す。ある種のシアニンおよび関連する色素は、比較的光安定性があり、蛍光顕微鏡下で迅速に褪色しない。これらは、生物学的マーカーおよび非生物学的マーカーに共有結合して、これらの材料を蛍光性にする。さらに、これらは比較的サイズが小さいため、シアニン色素は、標識生成物の機能をほんの少ししか攪乱しない。最後に、シアニン色素に取り込むことができる官能基の多用性は、前記色素および標識生成物の安定性を制御することを可能にし、アッセイ混合液中の無関係な成分に対する前記標識材料の非特異的な結合を低減するのに役立つ(ワゴナー(Waggoner)、米国特許第5,569,587号および第5,627,027号明細書)。
【特許文献1】
米国特許第5,569,587号明細書
【特許文献2】
米国特許第5,627,027号明細書
【0005】
シアニン色素の標的分子への共有結合による付着を改善するために、反応性のある官能基(あるいは活性化基)を取り込むことによってシアニン色素を活性化する技術が開発されてきた。ワゴナー(米国特許第5,569,587号および第5,627,027号明細書)は、共有結合によって反応する分子として使用可能な多数のシアニン色素誘導体を提供してきた。これらの色素で使われた反応基は、イソチオシアネート、イソシアネート、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ−またはジ−ハロゲン置換ジアジン、アジリジン、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物(フッ化物を除く)、水酸化スクシンイミドエステル、水酸化スルホスクシンイミドエステル、イミドエステル、グリオキサールおよびアルデヒドである。ワゴナーは、前記色素の溶解度を増大し、誘導体の活性エステルの利用による蛍光標識を可能にするために、基本的なシアニン構造にカルボキシル基を取り込むことを示唆した(米国特許第4,981,977号および第5,627,027号明細書)。
【特許文献3】
米国特許第4,981,977号明細書
【0006】
シアニン色素は、発色団が、1個の正荷電を共有する末端で2個の四級窒素原子を有する一連の共役二重結合を含む、一般的な構造を有する。中心部の二重結合の数によって、前記シアニン色素は、モノカルボシアニン(別名、トリメチンカルボシアニンまたはCy3)、ジカルボシアニン(別名、ペンタメチンカルボシアニンまたはCy5)およびトリカルボシアニン(別名、ヘプタメチンカルボシアニンまたはCy7)として分類することができる。中心部の二重結合の数(以下、「k」という。)は励起光を部分的に決定する。kの値が大きいことは、蛍光および吸光度の増大の原因となることがしばしばある。そのうえ、環状構造の修飾によって、さらなる蛍光を得ることができる。k=2のとき、励起波長は約650nmで、化合物は非常に蛍光性が高い。
【0007】
シアニン色素の発色団の部分の構造の修飾を合成することにより、400から1100nm付近までの広いスペクトラムの範囲で吸光および発光する異なる蛍光標識試薬を得ることができる。例えば、米国特許第5,571,388号明細書は、共役二重結合の鎖の内部にさまざまな環状構造を取り込んでいるペンタメチンおよびヘプタメチンのシアニン色素を説明する。これらの色素は、630nmから900nmまでの波長を有する光を吸収する。
【特許文献4】
米国特許第5,571,388号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
このような努力は生体分子を標識するために適するシアニン色素の数を増やしたが、これらの色素の多くは特に光安定性があるわけではなく、それらの溶解特性は標識された材料の蛍光検出を伴う多くの用途に最適化されていない。適当な吸光特性および蛍光特性と、生体分子に付着するための有用な連結原子団とを有する安定なシアニン色素を提供することは非常に望ましい。有機溶媒および水溶性溶媒の両方に使用可能な色素を有することも望ましい。
【0009】
発明の概要
われわれは、2個以上の中心部の二重結合を有する色素(例えば、Cy7色素)は、保存および操作の期間中特に不安定であることを発見した。したがって、2個以上の中心部の二重結合を有する安定な蛍光色素、特に、安定なCy7色素を提供することが、本発明の目的である。それらを合成し、生物学的な材料および非生物学的な材料の標識に使用する便利な方法を提供することも、本発明の目的である。
【0010】
これらおよびその他の目的は、以下の一般的な化学式(I)を有する本発明の色素において達成される。
【0011】
【化1】
【0012】
この化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。n=1〜18、m=1〜18で、mはnとは独立に選択される。XおよびYは、S、O、N、CH2およびC(CH3)2からなるグループから独立に選択され、R1およびR2のうち少なくとも1つは、スルホン酸か、前記芳香族環に付着したスルホナート基かを含む。R3およびR4は、カルボキシル基、活性化カルボキシル基およびメチル基からなるグループから独立に選択される。本発明によると、前記R3およびR4の原子団のうち少なくとも1つは、カルボキシル基か、活性化カルボキシル基かであることが要求される。1の実施態様では、R3およびR4の両方が、カルボキシル基か、活性化カルボキシル基である。別の実施態様では、R3かR4かのいずれかが、カルボキシル基か、活性化カルボキシル基である。活性化カルボキシル基は、エステル、例えば、N−ヒドロキシナフタールイミドのエステルの場合がある。本発明の実施態様によると、前記色素は、橋かけ環状シアニン色素、より具体的には、橋かけ環状Cy7タイプのシアニン色素の場合がある。
【0013】
本発明の別の面は、橋かけ環状色素の合成法を提供する。前記方法は、(a)化学式(II)を有する色素の橋かけ環状誘導体を形成するステップ、および(b)ハロゲンを水素に置換するステップを含む。
【0014】
【化2】
【0015】
化学式(II)において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。n=1〜18、m=1〜18で、mはnとは独立に選択される。XおよびYは、S、O、N、CH2およびC(CH3)2からなるグループから独立に選択され、R1およびR2のうち少なくとも1つは、スルホン酸か、前記芳香族環に付着したスルホナート基かを含む。R5およびR6は、カルボキシル基か、メチル基かから独立に選択される、前記R5およびR6の原子団のうち少なくとも1つは、カルボキシル基である。
【0016】
本発明の実施態様によると、前記色素はシアニン色素、具体的には、Cy7、BCy7
およびDBCy7であってもよい。1の実施態様では、R5およびR6の両方がカルボキ
シル基である。別の実施態様では、R5かR6かのいずれかがカルボキシル基である。ハロゲンは塩素の場合がある。
【0017】
本発明の1の実施態様では、前記色素の橋かけ環状誘導体を形成するステップは、(a1)化合物(XI)および(XII)を2−クロロ−1−ホルミル−3−ヒドロキシメチレン−シクロヘキセンと混合して反応混合液を形成するステップ、および(a2)前記色素の橋かけ環状誘導体の形成を可能にする条件下で前記反応混合液を維持するステップを含む。
【0018】
化合物(XI)は、以下の一般式を有するいかなる化合物であってもよい。
【0019】
【化3】
【0020】
化合物(XII)は以下の一般式を有するいかなる化合物であってもよい。
【0021】
【化4】
【0022】
化合物(XI)および(XII)の化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。n=1〜18、m=1〜18で、mはnとは独立に選択される。XおよびYは、S、O、N、CH2およびC(CH3)2からなるグループから独立に選択され、R1およびR2のうち少なくとも1つは、スルホン酸か、前記芳香族環に付着したスルホナート基かを含む。R5およびR6は、カルボキシル基か、メチル基かから独立に選択され、前記R5およびR6の原子団のうち少なくとも1つは、カルボキシル基である。
【0023】
本発明の別の面は、本発明の活性化橋かけ環状色素を生物学的材料または非生物学的材料を標識するために使用する方法を提供する。
【0024】
本発明は、多数の利点を提供することがわかってきた。環状の部分をCy7タイプの色素の共役二重結合鎖に取り込むことにより、これらのCy5様分子種への部分的転換が効果的に防止され、安定な色素が形成される。その結果、未修飾のCy7タイプ色素で標識するのと比べてより高い標識生成物の総合収率が達成される。以下により詳細に説明するとおり、環状DBCy7のN−ヒドロキシナフタールイミドエステルは、アミノオリゴヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチドにうまく結合された。橋かけ環状DBCy7標識ターミネータはシーケンシングでうまく働き、橋かけ環状DBCy7標識プライマーはDNA断片解析でよい結果を出した。生物学医学研究に用いられる、蛍光色素を使う多くの他の手順も本発明の色素の恩恵を被る場合がある。
【0025】
本発明は、添付する特許請求の範囲にその完全な範囲が定義され、その好ましい実施態様は以下に説明される。
【0026】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の一般式(I)を有する橋かけ環状色素を提供する。
【0027】
【化5】
【0028】
この化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。XおよびYは、S、O、N、CH2およびC(CH3)2からなるグループから独立に選択される。付加されたアルキル鎖の長さは、好ましくは、炭素原子約1から18個の長さである(nおよびmは1から18までの範囲内で、独立に選択される。)。最も実用的なアルキル鎖の長さは、炭素原子約6個の長さである。1の実施態様では、nは5で、mは1である。
【0029】
前記置換または非置換芳香族環は、複素環か、フェニル基のような単一の環状芳香族構造か、ナフチル基構造かであってもよい。前記色素の吸光および発光波長は、スペクトラムの特定の領域に限定されず、近紫外から近赤外、あるいはこれらの両端を超える、いかなる波長であってもよい。
【0030】
多くの色素分子、特に、シアニン色素分子は、水溶液、とくに、バッファー溶液および生理食塩水のように無機塩が存在する溶液中では、凝集体を形成する傾向がある。これらの凝集体は、通常、吸光バンドが単量体の吸光の短波長側に移行し、一般に、弱い蛍光を有する。前記色素の芳香族環状構造にスルホナート基が結合した、アリルスルホン酸色素は、これらの凝集体を形成する傾向が最も低いことがわかった。前記色素の芳香族環状構造に結合したスルホナート基は、発色団には、ほとんどまたは全く影響を与えないが、分子の、光安定性、水溶性および荷電密度を増大させる。スルホナートという用語は、スルホン酸を含む意味であるが、それは、スルホナート基がイオン化したスルホン酸にすぎないからである。したがって、水溶性を増大するためには、R1およびR2の原子団のうちの少なくとも1つはスルホン酸か、前記芳香族環に結合したスルホナート基かであることが要求される。望ましくない、非特異的結合または2以上の反応性の発色団の間での相互作用を低減するために、非スルホナート原子団R1またはR2が、リン酸、ホスホン酸、硝酸のような、極性で荷電を帯びた周知の官能基から選択されることがある。
【0031】
本発明によると、R3およびR4は、カルボキシル基、活性化カルボキシル基およびメチル基からなるグループから独立に選択される場合がある。本発明の目的のためには、活性化カルボキシル基は、本発明の生物学的分子または非生物学的分子に対して前記色素を共有結合で結合させることを可能にする反応性の官能基を有するカルボキシル基の誘導体である。R3またはR4の原子団のうちの少なくとも1つがカルボン酸または活性化カルボン酸であること(単官能種)が要求されるが、R3およびR4の両方の原子団がカルボン酸または活性化カルボン酸である場合(二官能種)がある。かかる活性化カルボン酸の例は、N−ヒドロキシナフタールイミド、N−ヒドロキシスクシンイミド、N−ヒドロキシフタールイミドおよびスルホ−N−ヒドロキシスクシンイミドのエステルを含むが、これらに限定されない。1の実施態様では、活性化カルボン酸は、N−ヒドロキシナフタールイミドのエステルである。共役二重結合が長く連なっていることが保存および操作の期間中の不安定さの原因である、というのが本発明の発見である。
【0032】
前記共役二重結合の中に取り込まれた環状構造がかかる色素を安定化するかもしれないということが、本発明の発見である。したがって、本発明の色素は、共役二重結合の中に安定化する環状構造を取り込む。本発明の1の実施態様によると、前記環状構造は以下のとおりである。
【0033】
【化6】
【0034】
本発明の実施態様によると、前記色素はシアニン色素であってもよい。シアニン色素は、(安価な検出システムを使用すること、およびこれらの波長での生物学的材料からのバックグランドが低いことを意味する)より長い波長での吸収と、高い吸光率と、比較的高い量子収率と、小さい分子サイズと、蛍光特性を損なわずに化学的操作が容易に行えること、および試薬、pHおよび温度に対する安定性が比較的あることを含めて、敏感な検出用標識として役立つ望ましい特性が複数ある。
【0035】
本発明の1の実施態様では、橋かけ環状色素は、トリカルボシアニン色素の環状誘導体である。前記色素の例は、Cy7、BCy7およびDBCy7を含むが、これらに限られない。ベンゾインドールシアニン色素(BCy7)は1個のベンゼン基置換があり、ジベンゾCy7(DBCy7)は、対応するインドールシアニンCy7に関して2個の余分なベンゼン基置換がある。それゆえ、ベンゾインドールシアニンは、これらのインドールを使った対応化合物よりも、吸光および発光の最大波長が長い。Cy7は、アマシャムおよびBDLから商業的に入手可能である。代替策として、シアニン色素は、既に説明されたとおり(ムジュンダー(R.J.Mujumder)ら、Bioconjugate Chemistry、4巻(2号)、105ページ、1993年、およびムジュンダーら、Bioconjugate Chemistry、7巻(2号)、356ページ、1996年、両方とも、引用によりここに取り込まれる。)、初めから(de novo)合成することができる。
【0036】
本発明の別の面は、橋かけ環状色素の合成方法を提供する。本発明の橋かけ環状色素の調製のための一般的な合成計画が図1Aに示される。前記方法は、(a)以下の化学式(II)を有する前記色素の橋かけ環状誘導体を形成するステップと、(b)ハロゲンを水素に置換するステップとを含む。
【0037】
【化7】
【0038】
化学式(II)において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。n=1〜18、m=1〜18で、mはnとは独立に選択される。XおよびYは、S、O、N、CH2およびC(CH3)2からなるグループから独立に選択され、Zはハロゲンである。R1およびR2のうち少なくとも1つは、スルホン酸か、前記芳香族環に付着したスルホナート基かを含む。R5およびR6は、カルボキシル基またはメチル基から独立に選択される。1の実施態様では、前記ハロゲンは塩素である。
【0039】
前記色素は、複素環か、フェニル基のような単一の環状芳香族構造か、ナフチル基のような縮合した環状構造かを含む場合がある。好ましくは、前記色素は、Cy7、BCy7、DBCy7を含む、上記のシアニン色素である。
【0040】
前記色素の橋かけ環状誘導体(II)は、ハロゲンZを水素に置換し、橋かけ環状色素(I)を形成するのに十分な条件下で、適当な試薬と反応させられる場合がある。本発明の目的のためには、適当な試薬は、ハロゲンZと反応し、水素で置換することができる試薬である。本発明の1の実施態様では、前記試薬は、エタンチオール酸ナトリウムと、エタンチオールと、ジメチルホルムアミド(DMF)との混合物である。PhSNa/Ph2PHのような他の試薬も使用できる。本発明の目的のためには、十分な条件とは、ハロゲンZを水素で置換することを可能にするいずれかの条件である。1の実施態様によると、前記反応は、窒素雰囲気で約100°Cで実行される場合がある。
【0041】
本発明の1の実施態様によると、図1Bに記載のとおり、前記色素の橋かけ環状誘導体を形成するステップ(a)は、(a1)化合物(XI)および(XII)を2−クロロ−1−ホルミル−3−ヒドロキシメチレン−シクロヘキセンと混合して反応混合液を形成するステップ、および(a2)前記色素の橋かけ環状誘導体の形成を可能にする条件下で前記反応混合液を維持するステップを含む場合がある。
【0042】
化合物(XI)は以下の一般式を有するいかなる化合物でもよい。
【0043】
【化8】
【0044】
化合物(XII)は、以下の一般式を有するいかなる化合物でもよい。
【0045】
【化9】
【0046】
前記化学式において、各点線は、縮合した置換または非置換芳香族環を形成するために必要な炭素原子を表す。n=1〜18、m=1〜18で、mはnとは独立に選択される。XおよびYは、S、O、N、CH2およびC(CH3)2からなるグループから独立に選択され、Zはハロゲンである。R1およびR2のうち少なくとも1つは、スルホン酸か、前記芳香族環に付着したスルホナート基かを含む。R5およびR6は、カルボキシル基およびメチル基からなるグループから独立に選択される。
【0047】
特定の化合物(XI)および(XII)の選択は、合成される橋かけ環状色素のタイプに依存する。例えば、環状のDBCy7を合成するためには、ベンゾインドールの化合物(XI)および(XIII)を用いることができる(図1Cおよび1D)。環状のCy7を合成するためには、インドールの化合物(XI)および(XIII)が使われる。当業者は、他の橋かけ環状色素が適当な化合物(XI)および(XII)を選択することによって合成されることを理解する。
【0048】
一般式(XI)および(XII)のいかなる化合物でも図1Bに示す方法によって用いることができるが、1の実施態様では、化合物(XI)は1−(5−カルボキシペンチル)−1,1,2−トリメチル−(3H)−インドールニウム−7−スルホナートで、化合物(XII)は、3−エチル−1,1,2−トリメチル−(3H)−インドールニウム−7−スルホナートである。この実施態様では、未置換の環状色素である、環状Cy7が得られる。別の実施態様では、化合物(XI)は1−(5−カルボキシペンチル)−1,1,2−トリメチルベンゾ−インドールニウム−7−スルホナートで、化合物(XII)は、3−エチル−1,1,2−トリメチルベンゾインドールニウム−7−スルホナートである(図1C)。この実施態様では、ベンゼン置換シアニン色素である、環状DBCy7が合成される。1−(5−カルボキシペンチル)−1,1,2−トリメチル ベンゾインドールニウム−7−スルホナートのみを使い、3−エチル−1,1,2−トリメチルベンゾインドールニウム−7−スルホナートを使わないことにより、二官能酸を得ることができる。
【0049】
本発明の目的では、前記反応混合液は、少なくとも1個のカルボン酸基を有する前記色素の橋かけ環状誘導体(II)の形成を可能にする条件下で維持される。1の実施態様では、前記反応混合液は、酢酸と無水酢酸との組み合わせで酢酸ナトリウム溶液中で約120°Cまで加熱される。前記反応混合液は、この温度で約1時間インキュベーションされる。得られる中間体は乾燥状態になるまで蒸発され、50mlのジエチルエーテルで3回洗浄される。異なるモル比の、酢酸と、酢酸および無水酢酸の組み合わせとが使えるが、1の実施態様では、前記の比は約1:1である。本発明の別の実施態様によると、化合物(XI)と、化合物(XII)と、2−クロロ−1−ホルミル−3−ヒドロキシ−メチレン−シクロヘキセンと、酢酸ナトリウムと、酢酸および無水酢酸の組み合わせとのモル濃度は相等しい。有利なことに、われわれは、これらの反応条件が望ましくない副生成物なしに所望の生成物を合成することを可能にすることを発見した。本発明の目的のためには、他の反応条件も、それらが前記色素の橋かけ環状誘導体(II)の形成を支持して、かつ、望ましくない副生成物を生じないかぎり、使用してもよい。
【0050】
1の実施態様では、前記色素の橋かけ環状誘導体の合成方法は、前記橋かけ環状色素を活性化するステップをさらに含む。このステップは、カルボキシル基の水素を反応性の原子団に置換するために十分な条件下で、前記橋かけ環状色素を活性化試薬に反応させることにより実行される場合がある。本発明の目的のためには、反応性の原子団は、本発明の、生物学的分子または非生物学的分子と共有結合を形成することができる原子団である。活性化試薬は、前記色素に反応性の原子団を提供する試薬である。リン酸、ホスホン酸および硝酸のような異なる反応性の原子団が、本発明の橋かけ環状色素に導入される場合がある。1の実施態様では、前記反応性の原子団は、N−ヒドロキシナフタールイミドのエステルである。同様に、リン酸、ホスホン酸および硝酸のようなさまざまな活性化試薬を使用する場合がある。本発明の1の実施態様では、活性化試薬は、N−ヒドロキシナフタールイミドである。
【0051】
橋かけ環状色素の活性化がうまくいくかどうかは、反応条件に依存する。条件は、活性化橋かけ環状色素の形成を可能にする場合に十分である。1の実施態様では、前記色素は、活性化試薬との反応の前に溶媒に溶解され、反応は窒素雰囲気で室温で進行する。1,1’−カルボニルジイミダゾールを含むDMFの混合液が前記色素の溶媒として使用される場合がある。実施例2は、適当な反応条件の詳細を提供する。他の反応条件も、活性化橋かけ環状色素の形成を支持するかぎり、使用してもかまわない。
【0052】
本発明の別の面は、生物学的材料および非生物学的材料を標識する方法を提供する。前記方法は、(a)アミノ基か、第3の(third)官能基か、水酸基かを有する、生物学的材料または非生物学的材料を提供すること、および(b)請求項1に記載の活性化橋かけ環状色素を前記材料に結合するために十分な条件下で、前記色素を前記材料と反応させることを含む。
【0053】
本発明の目的のためには、標識に適する材料は、本発明の色素と反応して共有結合を形成することができる官能基を有する生物学的材料または非生物学的材料である。かかる官能基の例は、窒素求核剤である、アミノ基か、チオール基か、水酸基かを含むが、これらに限られない。生物学的材料の例は、細胞、タンパク質、アミノ化修飾された核酸、ハプテン、炭水化物、ジデオキシヌクレオシドターミネーターおよびこれらの組み合わせを含むが、これらに限られない。非生物学的材料の例は、ポリマーと、窒素求核剤を含むポリマー粒子とを含むが、これらに限られない。
【0054】
1の実施態様では、前記アミノ化修飾された生物学的材料は、アミノ化修飾された生体高分子、例えばアミノ化修飾された、オリゴヌクレオチドおよびペプチドである。前記アミノ化修飾されたオリゴヌクレオチドは、第一級脂肪族アミンをオリゴヌクレオチドの5’末端に結合させることにより調製される。試薬と、第一級脂肪族アミンをオリゴヌクレオチドに結合するための前記試薬の使い方の説明とは、カリフォルニア州パロ・アルトのクロンテク・ラボラトリーズ社から商業的に入手可能である(クロンテク製品プロトコール、PR71095、「N−MMT−Cn−アミノモディファイヤー」を参照せよ)。
【0055】
当業者は、糖部分の塩基部位を含む前記オリゴヌクレオチドの部位が、その5’末端リン酸に加えて、いくらでも前記アミノ基を結合するために選択することができることを理解している。アミノ誘導体化された生体高分子は、アミド結合の形成に伴い反応動力学的にみて有利であるという利点を提供する。
【0056】
本発明の実施態様によると、活性化橋かけ環状色素は、生物学的材料または非生物学的材料と、前記色素を前記材料に共有結合で結合(あるいは共役)するために十分な条件下で、反応される場合がある。条件は、前記色素の前記材料への共有結合を支持する場合に、十分である。1の実施態様では、前記色素は、DMFに溶解され、オリゴヌクレオチドと混合される。反応混合液は、暗室中で約12時間室温で維持された。別の実施態様では、ジデオキシヌクレオシドターミネーターと、環状DBCy7−活性エステルとが、DMFおよびジイソプロピルアミンに溶解される。反応は、暗室中で約12時間室温で進行する。他の反応条件も、前記色素の前記生物学的材料または非生物学的材料との結合を可能にするのに十分である限り、用いてもよい。標識反応が起こるバッファーは、例えば、重炭酸バッファーのような水溶性のバッファーでよい。本発明の1の実施態様では、0.1M重炭酸バッファー(pH9.0)が用いられる。
【0057】
DNAまたはRNAの標識された断片が、DNAまたはRNAを含むサンプル中の特異的な相補的ヌクレオチド配列の、存在および量を同定するための蛍光ハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。前記色素は、(ホルモン、タンパク質、ペプチド、リンホカインおよび代謝中間体のような)ホルモンまたはリガンドに結合でき、今度はかかるホルモンまたはリガンドがレセプターに結合できる。標的があるタイプの細胞のときには、本発明はそのタイプの細胞に結合する標識された抗体の量を計測するために用いることができる。前記計測は、前記細胞の発光の相対的な、明るさまたは暗さを決定することによって行われる。これらおよびその他の多くの可能なシアニン色素標識の用途の詳細な説明は、「効率的な活性化シアニン色素」という名称の係属中の米国特許出願第09/100,150号明細書と、「発光法による生物学的材料その他の材料の検出用標識試薬としてのシアニン色素」という名称の米国特許第5,627,027号明細書と、「発光性のアリールスルホナートシアニン色素を用いる材料の標識および検出の方法」という名称の米国特許第5,569,587号明細書とに提供されており、これらの関連する内容は、引用によりここに取り込まれている。
【0058】
以下の実施例は、本発明に係る特許請求の範囲を例示することを意図するものであって、限定することは意図しない。かかる実施例は、使用されるものの典型的なものであるが、当業者に知られた他の手順が代替的に使われる場合がある。実際、当業者は、過度の実験を要せずに、ここに示す内容に基づいて、さらなる実施態様を予見し、作成することが容易にできる。
【実施例1】
【0059】
橋かけ環状DBCy7色素の合成
活性化橋かけ環状DBCy7一酸色素は、図1Cに示すように合成された。3−エチル−1,1,2−トリメチルベンゾインドールニウム−7−スルホナート(951mg、3ミリモル)、1−(5−カルボキシペンチル)−1,1,2−トリメチルベンゾインドールニウム−7−スルホナート(1.2g、3ミリモル)、2−クロロ−1−ホルミル−3−ヒドロキシメチレンシクロヘキセン(518mg、3ミリモル)および酢酸ナトリウム(246mg、3ミリモル)を酢酸および無水酢酸の混合液(48ml/27ml)中で混合したものを撹拌しつつ115〜120°Cで1時間加熱した。反応混合液は室温まで冷却され、溶媒を蒸発させて乾燥した。残存物は、ジエチルエーテル(全量75ml)で3回洗浄され、シリカゲルカラムでCH2Cl2/MeOHの勾配(CH2Cl2中でMeOHが40%まで)を用いて精製された。得られた分画を蒸発させて、塩化環状DBCy7一酸620mg(収率24%)を得た。
【0060】
上記の生成物の純度はHPLCで分析され、82%であるとわかった(図2)。塩化環状DBCy7一酸の1H NMRスペクトル(DMSO−d6)は以下のとおりであった(化学シフトはppmが単位である。)。1.14(q、3H、CH2−CH3)、1.4〜1.5(m、6H、3CH2)、1.89(s、12H、(CH3)4、2.16(m、2H、CH2)、2.75(m、4H)、4.3(4H、2CH2−N)、6.3(dd、2H、α、α’−橋かけプロトン)、7.6〜8.27(m、10H、芳香族プロトン)、8.4(dd、2H,β,β’−橋かけプロトン)。
【0061】
塩化環状DBCy7一酸(400mg、0.466ミリモル)は50mlの無水DMF中に溶解された。この溶液は、エタンチオール酸ナトリウム(0.7856g、9.339ミリモル)およびエタンチオール(778μl、10.5ミリモル)の混合液に添加され、100°C2時間窒素雰囲気でインキュベーションされた。反応の進行は、メタノールで希釈した分注についてのUV−NIR吸光度の変化により監視された。822nmのピークの消失と786nmのピークの出現とが観察された。反応混合液は室温まで冷却され、CO2(ドライアイス)で飽和された。溶媒は、減圧下で乾燥するまで蒸発させられた。残渣沈殿物は、エチル酢酸(全量40ml)で2回、CH2Cl2(全量60ml)で3回洗浄され、逆相HPLC法により精製された。得られた収率は18%(68mg)であった。この生成物は90%の純度であった(図3)。
【実施例2】
【0062】
活性化橋かけ環状DBCy7色素(橋かけ環状DBCy7一酸エステルの合成)
橋かけ環状DBCy7一酸(20mg、0.0243ミリモル)は無水(dry)DMF(500μl)に溶解して、1,1’−カルボニルジイミダゾール(7.88mg、0.0486ミリモル)と混合された。この混合液は室温で5時間窒素雰囲気で撹拌された。N−ヒドロキシナフタールイミド(10.36mg、0.0486ミリモル)が添加され、前記反応混合液は終夜(約16時間)常温で撹拌された。このインキュベーションの後、生成物を沈殿させるために、前記反応混合液はエチル酢酸に注がれた。この沈殿は、エチル酢酸(1ml)で1回、エーテル(全部で2ml)で2回洗浄され、真空乾燥されて、活性化エステル24mg(収率97%)を得た。この生成物はHPLCで分析され、74%の純度であることがわかった。
【実施例3】
【0063】
オリゴヌクレオチドの橋かけ環状DBCy7一酸エステルを用いる標識
オリゴヌクレオチド配列は、オリゴ1000M(ベックマン)またはABI392(パーキン・エルマー)で従来のプロトコールに従って合成された。5’アミノ修飾試薬C6(10−1906−90、グレン・リサーチ(Glen research)、米国)が、前記オリゴヌクレオチドと10分間25°C上記の機器でインキュベーションされた。前記インキュベーションの後、サイクルが完了した。モノメトキシトリチル(MMT)は前記アミノ修飾試薬から除去され、結合効率が測定された。前記オリゴヌクレオチドは切断され、アンモニア/メチルアミンAMA(1/9)を用いて脱保護された。合成されたオリゴヌクレオチドは、毛管電気泳動法および逆相HPLC法により解析され、純度が80%であることがわかった。前記オリゴヌクレオチドは、250μlのトリエチル−重炭酸アンモニウムバッファー(pH8.2〜8.6)とともに蒸発乾燥させられ、それから、250μlの脱イオン水とともに蒸発乾燥させられた。前記オリゴヌクレオチドは、50μlの0.1M重炭酸バッファー(pH9.0)に溶解された。活性化橋かけ環状DBCy7色素(3mg)が50μlの無水DMFに溶解された。前記オリゴヌクレオチドと前記色素溶液とは一緒に混ぜられ、10μlのジイソプロピルアミンまたは10μlのトリエチルアミンが上記の混合液に添加された。この反応混合液は、暗室中で終夜室温でインキュベーションされた。こうして得られた生成物は、0.01MのNH4OAcバッファー(pH7.0)を用いてNAP−25カラム(セファデックスG−25、ファルマシア、米国)で精製された。上記のように得られと溶液は、蒸発乾燥された。乾燥した残渣は約200μlの水に溶解されて、さらに、セミプレップC18RPというHPLCカラムを用いて精製された。前記精製は、バッファーA(0.1MのNH4OAcバッファー(pH7.0))中のバッファーB(100%AcCN)のバッファー勾配を用いて実行された。得られた勾配は以下のとおりであった。0〜25分は50%Bまでの勾配、25〜27分は50%B、27〜32分は0%Bであった。前記HPLCからの溶出液は蒸発乾燥された。こうして得られ、標識されたオリゴヌクレオチドは、水に溶解され、紫外線分光光度計(λ=260nm)、PACE5000(ベックマンCE)、CE−LIF(図5)およびベックマンゴールドシステムHPLCを用いて解析された。前記得られた生成物は、共有結合で標識された橋かけ環状DBCy7−CONH−オリゴヌクレオチド生成物であると結論された。
【実施例4】
【0064】
橋かけ環状DBCy7を用いるジデオキシヌクレオシドターミネーターの標識
7(3−アミノ−1−プロピニル)−2’,3’−ジデオキシアデノシン5’−三リン酸(2.5マイクロモル)のトリブチルアミン塩が250μlのDMFに溶解された。橋かけ環状DBCy7活性エステル(9mg)が、50μlのDMFと15μlのジイソプロピルアミンとに溶解された。この混合液はよくかき混ぜられ、暗室中に終夜放置された。得られた生成物は、バッファーBとして100%AcCNと、バッファーAとして0.1M MH4OAcバッファー(pH7.0)とを用いるセミプレップC18逆相HPLC法で精製された。勾配条件は、開始時80%、20%B。0〜25分40%Bまでの勾配、25〜27分70%Bまでの勾配、27〜29分70%B、29〜32分間20%Bであった。このようにして得られた標識ターミネーターは、毛管電気泳動法(CEQ2000、ベックマン・コールター、カリフォルニア州)によって解析された(図6)。標識ターミネーターの収率は、約20〜25%であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【0065】
【図1】図1Aおよび1Bは、本発明の橋かけ環状色素の合成方法の概念図である。図1Cは、本発明の環状DBCy7一官能基カルボン酸の合成を示す化学反応式である。図1Dは、本発明の環状DBCy7の活性エステルの合成を示す化学反応式である。
【図2】本発明の塩化環状DBCy7一カルボン酸の逆相HPLC法クロマトグラフである。
【図3】本発明の環状DBCy7一カルボン酸の逆相HPLC法クロマトグラフである。
【図4】本発明の塩化環状DBCy7活性エステルの逆相HPLC法クロマトグラフである。
【図5】CEQ2000自動DNA配列決定システム(ベックマン・コールター社、カリフォルニア州、フラートン)を用いて得られた環状DBCy7標識プライマーの電気泳動図である。
【図6】CEQ2000自動DNA配列決定システム(ベックマン・コールター社、カリフォルニア州、フラートン)を用いて得られた環状DBCy7標識ジデオキシアデノシン三リン酸の電気泳動図である。
Claims (40)
- R3およびR4の両方が、カルボン酸または活性化カルボン酸である、請求項1に記載の活性化橋かけ環状色素。
- R3かR4かのいずれかが、カルボン酸または活性化カルボン酸である、請求項1に記載の活性化橋かけ環状色素。
- 前記活性化カルボン酸はエステルである、請求項1に記載の橋かけ環状色素。
- 前記エステル基はN−ヒドロキシナフタールイミドのエステルである、請求項4に記載の橋かけ環状色素。
- 前記芳香族環は、フェニル基、ナフチル基または複素環である、請求項1に記載の活性化橋かけ環状色素。
- n=5である、請求項1に記載の活性化橋かけ環状色素。
- m=1である、請求項1に記載の活性化橋かけ環状色素。
- 前記色素はシアニン色素である、請求項1に記載の活性化橋かけ環状色素。
- 前記シアニン色素は、Cy7、BCy7およびDBCy7からなるグループから選択される、請求項9に記載の活性化橋かけ環状色素。
- 前記色素は水溶液に溶解することができる、請求項1に記載の活性化橋かけ環状色素。
- (a)以下の化学式2を有する橋かけ環状色素の橋かけ環状誘導体を形成するステップであって、
- R5およびR6の両方がカルボキシル基である、請求項12に記載の方法。
- R5かR6かのいずれかがカルボキシル基である、請求項12に記載の方法。
- 前記芳香族環は、フェニル基、ナフチル基または複素環である、請求項12に記載の方法。
- n=5である、請求項12に記載の方法。
- m=1である、請求項12に記載の方法。
- 前記色素はシアニン色素である、請求項12に記載の方法。
- 前記シアニン色素は、Cy7、BCy7およびDBCy7からなるグループから選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記ハロゲンは塩素である、請求項12に記載の方法。
- 前記色素の橋かけ環状誘導体を形成するステップは、(a1)以下の化学式3を有する化合物(XI)と、
- 前記芳香族環はフェニル基、ナフチル基または複素環である、請求項21に記載の方法。
- n=5である、請求項21に記載の方法。
- m=1である、請求項21に記載の方法。
- 前記色素は環状Cy7であり、化合物(XI)は1−(5−カルボキシペンチル)−1,1,2−トリメチル−(3H)−インドールニウム−7−スルホナートであり、化合物(XII)は、3−エチル−1,1,2−トリメチル−(3H)−インドールニウム−7−スルホナートである、請求項21に記載の方法。
- 前記色素は環状DBCy7であり、化合物(XI)は1−(5−カルボキシペンチル)−1,1,2−トリメチルベンゾ−インドールニウム−7−スルホナートであり、化合物(XII)は、3−エチル−1,1,2−トリメチルベンゾインドールニウム−7−スルホナートである、請求項21に記載の方法。
- ステップ(a1)は、酢酸および無水酢酸の組み合わせに溶解された酢酸ナトリウムを反応混合液に添加することを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記反応混合液は、前記色素の橋かけ環状誘導体の形成を可能にする条件下で加熱される、請求項27に記載の方法。
- 前記反応混合液は、約120°Cに加熱され、約1時間インキュベーションされる、請求項28に記載の方法。
- 酢酸ナトリウムと、酢酸および無水酢酸の組み合わせとのモル比は約1:1である、請求項27に記載の方法。
- 化合物(XI)と、化合物(XII)と、2−クロロ−1−ホルミル−3−ヒドロキシ−メチレン−シクロヘキセンと、酢酸ナトリウムと、酢酸および無水酢酸の組み合わせとのモル濃度は相等しい、請求項27に記載の方法。
- 前記カルボキシル基の水素を脱離基に置換することを可能にする条件下で、標的分子と共有結合を形成することができる活性化試薬に前記橋かけ環状色素を反応させることを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記活性化試薬はN−ヒドロキシナフタールイミドのエステルである、請求項32に記載の方法。
- 請求項活性化試薬はN−ヒドロキシナフタールイミドである、請求項32に記載の方法。
- 前記橋かけ環状色素は、前記活性化試薬と反応する前は、溶媒に溶解されている、請求項32に記載の方法。
- 前記溶媒は、前記活性化反応に必要な1,1’−カルボニルジイミダゾールを含むDMFである、請求項35に記載の方法。
- (a)アミノ基か、チオール基か、水酸基かを有する生物学的材料または非生物学的材料を提供すること、および(b)請求項1に記載の活性化橋かけ環状色素を前記材料に結合するのに十分な条件下で、前記色素を前記材料に反応させることを含む、生物学的材料または非生物学的材料を標識する方法。
- 前記生物学的材料は、タンパク質、細胞、アミノ修飾された核酸、ハプテン、炭水化物、ジデオキシヌクレオシドターミネーターおよびこれらの組み合わせからなるが、これらに限られない、グループから選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記生物学的材料はアミノ修飾されたオリゴヌクレオチドである、請求項38に記載の方法。
- 前記生物学的材料はジデオキシヌクレオシドターミネーターである、請求項38に記載の方法。
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