CN116284186A - 花菁类荧光标记物、其合成方法和应用 - Google Patents

花菁类荧光标记物、其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种花菁类荧光标记物、其合成方法和应用，该标记物的结构式为
Figure DDA0004138892880000011
本发明将五甲川类花菁类染料和脱氧嘧啶类核苷通过碳碳键连接，制备荧光探针，极大提高了荧光探针在核酸合成中的化学稳定性；通过炔烃复分解反应将五甲川类花菁类染料和脱氧嘧啶类核苷通过碳碳键连接，避免了常规碳碳键构筑策略中含碘试剂的使用，极大拓展了底物范围。

Description

花菁类荧光标记物、其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地，涉及一种花菁类荧光标记物、其合成方法和应用。
背景技术
用于标记多肽、蛋白、抗体、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、其他各种结构的非天然核酸以及有机和无机纳米颗粒的荧光探针是现代生物学、医学和材料学的重要工具，其中花菁类染料由于具有较高的消光系数和较好的化学稳定性，成为重要的荧光标记物。
目前用于DNA及其他天然和人工核酸的花菁类染料主要有三甲川、五甲川类、七甲川类花菁以及相关衍生物，其中五甲川类花菁类染料(cyanine5，也称Cy5)在650nm光激发下的发射波长是670nm，该波段属近红外区间，荧光信号具有很高的信噪比。因此五甲川类花菁类染料成为核酸研究和核酸产品中重要的荧光标记物。在现有的五甲川类花菁类染标记分子中，可以在核酸序列中任意位点进行标记的五甲川类花菁类染料的需求日益增长。
目前用于各种核酸标记的Cy5类荧光染料主要分两大类，一类是仅可标记在核酸端基的产品，主要是标记在5’端，其结构中含有一个亚磷酰胺单元(其代表结构为图11a)；或者标记在3’端，其结构中含有一个4，4-二甲氧基三苯甲基单元，以及一个或一组与固相载体相连接的官能团。另一类是可在核酸的3’端，5’端以及核酸任意位点进行标记的产品，其结构中含有一个亚磷酰胺单元和一个4，4-二甲氧基三苯甲基单元(其代表结构为图11b和图11c)。由于第二类Cy5类荧光染料的通用性较好，目前已被大量应用于科研和生产。
通用型Cy5类荧光染料主要分两大类结构：一类是以含有两个羟基的五甲川类花菁类为原料，在其中羟基上分别引入一个亚磷酰胺单元和一个4，4-二甲氧基三苯甲基单元(其代表结构为图11b)。另一类是在脱氧核苷类的亚磷酰胺化合物的脱氧核苷结构上通过共价键连接五甲川类花菁类分子(其代表结构为图11c)。图11c中的结构具有良好的结构普适性，但是核苷单元与五甲川类花菁之间以酰胺键连接，在氨解时会发生降解，因此使用有一定限制。
发明内容
针对现有的五甲川类花菁类染料在核酸标记中化学稳定性差的问题，本发明提供了一种花菁类荧光标记物、其合成方法和应用，该标记物的核苷单元与五甲川类花菁之间以碳链连接，极大提高了化学稳定性，实现了一类新型荧光探针的系列化制备。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种花菁类荧光标记物，该标记物具有如式(1)所示的结构：
Figure BDA0004138892840000021
其中，n＝1-20。
该标记物具有高化学稳定性，可用于在核酸序列中任意位置修饰，直接用于核酸荧光标记。
本发明第二方面提供一种上述花菁类荧光标记物的合成方法，该合成方法包括如下步骤：
a)将摩尔比为1：(1.2-1.6)的5’-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-5-炔乙基脱氧尿苷和2-5-[1-(3-乙基)-3,3-二甲基-2,3-二氢吲哚啉]-1,3-五甲川-3,3-二甲基-1-(4-烷基炔基)-3H-吲哚啉氢碘酸盐分散于有机溶剂中，加入与5’-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-5-炔乙基脱氧尿苷的摩尔比为100：(5-15)的Schrock金属卡拜络合物催化剂，气体保护氛围中回流反应1-12h；反应结束后过滤，得到滤液；对所述滤液进行结晶，将结晶物溶于有机溶剂中，逐滴加入醚类物质中，滴加完毕后室温下继续搅拌2-12h，反应结束后过滤，对滤渣进行以甲醇重结晶，得到在5’-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-5-炔乙基脱氧尿苷的5位上修饰有花菁类染料的中间体；
b)将步骤a)得到的在5’-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-5-炔乙基脱氧尿苷的5位上修饰有花菁类染料的中间体溶于有机溶剂中，冰水浴下加入与5’-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-5-炔乙基脱氧尿苷的摩尔比为1：(1.2-3.6)的不含活泼氢的非芳香有机胺和与5’-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-5-炔乙基脱氧尿苷的摩尔为1：(1.2-2.4)的N,N-二异丙基-O-氰乙基亚磷酰胺氯或二-(N,N-二异丙基)-O-氰乙基亚磷酰胺，室温下避光搅拌反应1-24h；反应结束后除去溶剂，再经洗涤、干燥、浓缩后，在保护气体氛围中逐滴加入到正庚烷中行结晶)过滤收集固体，得到所述花菁类荧光标记物。
本发明以5’-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-5-炔乙基脱氧尿苷和2-5-[1-(3-乙基)-3,3-二甲基-2,3-二氢吲哚啉]-1,3-五甲川-3,3-二甲基-1-(4-烷基炔基)-3H-吲哚啉氢碘酸盐作为起始原料，在Schrock金属卡拜络合物的作用下发生炔烃复分解反应，制备得到共价连接有五甲川类花菁类染料的脱氧嘧啶类化合物。随后，在该类化合物的3’位引入N,N-二异丙基-O-氰乙基亚磷酰胺，制备得到可用于核酸固相合成的五甲川类花菁类荧光单体。
优选地，步骤a)中，所述醚类物质为异丙醚、甲基叔丁基醚或苯甲醚。
优选地步骤a)中，对所述滤液进行结晶方法为：先对滤液浓缩，然后加入乙酸乙酯或乙酸正丁酯进行结晶。
优选地，步骤a)中，所述有机溶剂为无水氯苯、二氯甲烷、氯苯、二氯苯、甲苯或者二甲苯；
所述Schrock金属卡拜络合物为钨卡拜络合物。
具体地，对所述滤液进行结晶方法为：先对滤液浓缩，然后加入乙酸乙酯或乙酸正丁酯进行结晶。
优选地，步骤b)中，所述有机溶剂为无水的四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、1，4-二氧六环、乙酸乙酯、乙酸正丁酯或者甲基叔丁基醚。
优选地，步骤b)中，所述不含活泼氢的非芳香有机胺为无水三乙胺、二异丙基乙基胺、三正丁胺、1-甲基咪唑或1-乙基咪唑。
具体地，步骤b)中，搅拌反应结束后浓缩除去溶剂；
洗涤方法为：先以乙酸乙酯和水进行洗涤，有机相再以水洗涤。
本发明第三方面提供一种花菁类荧光标记物，其该标记物由上述的合成方法合成而得。
本发明第四方面提供一种上述的花菁类荧光标记物在核酸标记中的应用。
通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：
1、本发明将五甲川类花菁类染料和脱氧嘧啶类核苷通过碳碳键连接，制备荧光探针，极大提高了荧光探针在核酸合成中的化学稳定性。
2、通过炔烃复分解反应将五甲川类花菁类染料和脱氧嘧啶类核苷通过碳碳键连接，避免了常规碳碳键构筑策略中含碘等高成本试剂的使用，极大拓展了底物范围。
附图说明
图1是本发明实施例1的合成路线图，图中a)(t-BuO)3W≡C-t-Bu，氯苯，回流；b)N,N-二异丙基-O-氰乙基亚磷酰胺氯，三乙胺，四氢呋喃；
图2是本发明实施例1中化合物3的核磁共振氢谱图；
图3是本发明实施例1中化合物3的碳谱图；
图4是本发明实施例1中化合物3的质谱图；
图5是本发明实施例1中化合物4的核磁共振氢谱图；
图6是本发明实施例1中化合物4的碳谱图；
图7、图8是图6的局部放大图；
图9是本发明实施例1中化合物4的核磁共振磷谱图；
图10是本发明实施例1中化合物4的质谱；
图11是现有技术中可用于核酸修饰的商业化Cy5荧光染料。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
如图1所示，花菁类荧光标记物的一种优选的合成方法包括如下具体步骤：
步骤a)：称取6.5g化合物1和5.7g化合物2溶于50mL无水氯苯中，再加入1g钨卡拜络合物催化剂，氮气保护下回流反应12h。然后将反应液过滤除去不溶物，滤液浓缩后，先以40mL乙酸乙酯结晶，将过滤得到的粗产品再溶于1mL氯仿中，逐滴加入300mL异丙醚中，滴加完毕后室温下继续搅拌12h。过滤，粗产品再以15mL甲醇重结晶，得到深蓝色粉末(化合物3)4.7g，收率45％。
步骤b)：将1.1g化合物3溶于10mL无水乙酸乙酯中，冰水浴下加入1.7mL无水三乙胺和1.2g N,N-二异丙基-O-氰乙基亚磷酰胺氯，室温下避光搅拌过夜。反应结束后浓缩除去溶剂，加入50mL乙酸乙酯和50mL水洗涤，有机相再以70mL水洗涤。粗产品滤除干燥剂后浓缩至2-20mL，氮气保护下逐滴加入到100mL正庚烷中，滴加同时搅拌。过滤收集固体，得到深蓝色粉末(化合物4)650mg，收率51％。
实施例2
如图1所示，花菁类荧光标记物的一种优选的合成方法包括如下具体步骤：
步骤a)：称取6.5g化合物1和5.7g化合物2溶于10mL无水甲苯中，再加入3g钨卡拜络合物催化剂，氮气保护下回流反应1h。然后将反应液过滤除去不溶物，滤液浓缩后，先以40mL乙酸乙酯结晶，将过滤得到的粗产品再溶于1mL氯仿中，逐滴加入300mL甲基叔丁基异丙醚中，滴加完毕后室温下继续搅拌2h。过滤，粗产品再以15mL甲醇重结晶，得到深蓝色粉末(化合物3)4.8g，收率47％。
步骤b)：将1.1g化合物3溶于10mL无水二氯甲烷中，冰水浴下加入2.1mL无水二异丙基乙基胺和1.2g二(N,N-二异丙基)-O-氰乙基亚磷酰胺，室温下避光搅拌过夜。反应结束后浓缩除去溶剂，加入50mL乙酸乙酯和50mL水洗涤，有机相再以70mL水洗涤。粗产品滤除干燥剂后浓缩至2-20mL，氮气保护下逐滴加入到700mL正庚烷中，滴加同时搅拌。过滤收集固体，得到深蓝色粉末(化合物4)670mg，收率55％。
以上化合物3的核磁共振氢谱、碳谱以及质谱分别如图2、图3和图4所示，数据分别为：
1H NMR(CDCl3，400MHz)，δ(ppm)：8.76(s,ArH,1H),7.81-7.90(m,ArH,2H),7.13-7.42(m,ArH,24H),7.06-7.08(m,ArH,1H),6.96-7.01(m,ArH,1H),6.78-6.84(m,ArH,5H),6.58-6.61(m,CH,1H),6.33-6.35(m,CH,1H),6.18-6.21(m,CH,1H),5.58(s,1’-H,1H),5.28-5.32(m,CH,2H),4.75-4.79(m,4’-H,1H),4.27-4.21(m,5’-H,2H),4.02-4.05(m,CH2,2H),3.75(s,CH3O,3H),3.76(s,CH3O,3H),3.72-3.73(m,CH2,2H),3.49-3.55(m,CH2,2H),2.80-2.91(m,CH2,2H),2.62-2.76(m,CH2,2H),2.36-2.49(m,2’-H,2H),1.45-1.47(m,CH3,3H),1.69-1.72(m,CH3,12H)。
13C NMR(CDCl3，100MHz)，δ(ppm)：158.72,137.16,130.23,128.86,128.23,127.54,127.19,125.59,124.82,122.34,113.52,110.94,110.15,105.33,103.56,101.47,88.01,87.12,86.12,62.41,55.49,55.30,49.60,48.97,42.33,39.96,28.43,28.36,28.16,28.12,25.29,24.04,23.46,12.97。
Fomular C62H65IN4O7,calc 1104.3898,977.4848[M-I]+。found 977.4794[M-I]++。
化合物4的核磁共振氢谱、碳谱、核磁共振磷谱以及质谱分别如图5、图6-图8、图9和图10所示，数据分别为：
1H NMR(CDCl3，400MHz)，δ(ppm)6.80-7.38(m,ArH+1’-H,22H),5.13-5.72(m,CH,3H),4.41-4.78(m,CH,1H),4.25-4.35(m,CH,1H),4.09-4.21(m,5’-H,2H),4.02-4.05(m,4’-H,1H),3.66-3.75(m,CH3O,6H),3.46-3.55(m,CH2+CH,5H),3.28-3.31(m,CH2,H),2.59-2.99(m,CH2+CH,8H),2.13-2.45(m,2’-H,2H),1.64-1.71(m,CH2,4H),1.36-1.37(m,CH3,6H),1.24-1.27(m,CH3,6H),1.13-1.14(m,CH3,6H),0.79-0.87(m,CH3,6H)。
13C NMR(CDCl3，100MHz)，δ(ppm)：193.53,171.82,169.81,158.82,154.77,142.94,140.16,135.40,135.19,130.28,128.16,122.22,121.56,117.73,116.99,113.40,107.50,99.92,99.44,94.01,87.89,87.11,85.54 88.01,87.12,86.12,58.63,58.23,55.30,46.68,45.41,45.36,43.37,41.42,36.15,33.79,29.13,28.98,28.36,28.26,28.06,27.74,25.90,24.60,24.37,23.46,23.06,22.98,22.70,20.52,20.22,20.17,20.14,19.52,19.23,18.85,14.41,14.28,11.52,8.95。
31P NMR(CDCl3，162MHz)，δ(ppm):14.81,2.70(检测过程中三价膦被氧化为五价膦)。
Fomular C71H82IN6O8P,calc 1304.4976[M]+,1177.5798[M-I]+,found1177.5926[M-I]+。
以上通过核磁和质谱对合成过程的中间体及最终产物进行了结构和纯度的表征，证明中间体的结构信息正确。
以上结合实施例详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种花菁类荧光标记物，其特征在于，该标记物具有如式(1)所示的结构：
Figure FDA0004138892820000011
其中，n＝1-20。
2.根据权利要求1所述的花菁类荧光标记物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)将摩尔比为1：(1.2-1.6)的5’-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-5-炔乙基脱氧尿苷和2-5-[1-(3-乙基)-3,3-二甲基-2,3-二氢吲哚啉]-1,3-五甲川-3,3-二甲基-1-(4-烷基炔基)-3H-吲哚啉氢碘酸盐分散于有机溶剂中，加入与5’-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-5-炔乙基脱氧尿苷的摩尔比为100：(5-15)的Schrock金属卡拜络合物催化剂，气体保护氛围中回流反应1-12h；反应结束后过滤，得到滤液；对所述滤液进行结晶，将结晶物溶于有机溶剂中，逐滴加入醚类物质中，滴加完毕后室温下继续搅拌2-12h，反应结束后过滤，对滤渣进行以甲醇重结晶，得到在5’-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-5-炔乙基脱氧尿苷的5位上修饰有花菁类染料的中间体；
b)将步骤a)得到的在5’-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-5-炔乙基脱氧尿苷的5位上修饰有花菁类染料的中间体溶于有机溶剂中，冰水浴下加入与5’-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-5-炔乙基脱氧尿苷的摩尔比为1：(1.2-3.6)的不含活泼氢的非芳香有机胺和与5’-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-5-炔乙基脱氧尿苷的摩尔为1：(1.2-2.4)的N,N-二异丙基-O-氰乙基亚磷酰胺氯或二-(N,N-二异丙基)-O-氰乙基亚磷酰胺，室温下避光搅拌反应1-24h；反应结束后除去溶剂，再经洗涤、干燥、浓缩后，在保护气体氛围中逐滴加入到正庚烷中行结晶)过滤收集固体，得到所述花菁类荧光标记物。
3.根据权利要求2所述的花菁类荧光标记物的合成方法，其特征在于，步骤a)中，所述有机溶剂为无水氯苯、二氯甲烷、氯苯、二氯苯、甲苯或者二甲苯；
所述Schrock金属卡拜络合物为钨卡拜络合物。
4.根据权利要求2所述的花菁类荧光标记物的合成方法，其特征在于，步骤a)中，所述醚类物质为异丙醚、甲基叔丁基醚或苯甲醚。
5.根据权利要求2所述的花菁类荧光标记物的合成方法，其特征在于，步骤a)中，对所述滤液进行结晶方法为：先对滤液浓缩，然后加入乙酸乙酯或乙酸正丁酯进行结晶。
6.根据权利要求2所述的花菁类荧光标记物的合成方法，其特征在于，步骤b)中，所述有机溶剂为无水的四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、1，4-二氧六环、乙酸乙酯、乙酸正丁酯或者甲基叔丁基醚。
7.根据权利要求2所述的花菁类荧光标记物的合成方法，其特征在于，步骤b)中，所述不含活泼氢的非芳香有机胺为无水三乙胺、二异丙基乙基胺、三正丁胺、1-甲基咪唑或1-乙基咪唑。
8.根据权利要求2所述的花菁类荧光标记物的合成方法，其特征在于，步骤b)中，搅拌反应结束后浓缩除去溶剂；
洗涤方法为：先以乙酸乙酯和水进行洗涤，有机相再以水洗涤。
9.一种花菁类荧光标记物，其特征在于，由权利要求2至8中任一项所述的合成方法合成而得。
10.权利要求1或9所述的花菁类荧光标记物在核酸标记中的应用。
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