JP2007532718A - 蛍光標識ヌクレオチド誘導体 - Google Patents
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Abstract
Description
Flanagan,J.H.ら,Bioconjugate Chem.8:751−756(1997) Mujumdar,R.B.ら,Bioconjugate Chem.,4:2 105−111(1993) Mujumdar,R.B.ら,Cytometry,10:11−19(1989) Mujumdar,S.R.ら,Bioconjugate Chem.,7:356−362(1996) Ozmen,B.ら,Tetrahedron Letters,41:9185−9188(2000) Shealy,D.B.ら,Anal.Chem.67:247−251(1995) Southwick,P.L.ら,Cytometry,11418−430(1990) Strekowski,L.ら,J.Org.Chem.,57:4578−4580(1992) Williams,R.J.ら,Anal.Chem.,65:601−605(1993)
本発明によると、一般式Z−L−Cyで表される蛍光レポーター化合物が提供される。この実施態様によると、Zはヌクレオチドで、Lは、該ヌクレオチドの誘導体の核酸複製酵素による全体的な結合及び認識にシアニン色素が有意な干渉をしないように前記ヌクレオチドの誘導体を前記シアニン色素に連結するのに十分な長さを有する、長さが少なくとも8個の原子の鎖を有するジラジカル原子団のようなリンカーで、Cyは以下の化学式(1)のシアニン色素である。
A、B、X、R1−R5及びnは一般式2及び3(化学式(8)及び(10))について説明したとおりのものを表し、pは2ないし8の整数である。
合成経路概略図2を参酌して、スターラーバー及び還流コンデンサを備えた500mL丸底フラスコに、酢酸(150mL)と、p−ヒドラジノベンゼンスルホン酸(8)、(50.0g、0.266モル)と、3−メチル−2−ブタノン(84mL、0.785ミリモル)とを添加した。前記フラスコは115°Cのオイルバス中で加熱され、出発材料の全てが消費されるまで(メタノール:CH2Cl2が1:1のTLCを用いて監視することによって判断される)、3時間還流された。その後前記反応フラスコは室温まで冷却された。ピンク色の固体がエチル酢酸とともにろ過することによって回収された。前記ピンク色の固体は、つぎにMeOH(800mL)中に溶解されて、固体不純物を除去するためにろ紙のパッドでろ過された。イソプロピルアルコール(200mL)中の水酸化カリウム(15g)がろ液に添加され、この溶液は攪拌された。沈殿した黄色の固体が回収され、メタノール(2x50mL)で洗浄され、ジエチルエーテル(2x50mL)で洗浄され、その後、風乾された。前記黄色の固体はさらに高真空下で終夜40°Cのオーブン内で乾燥され、64.5g(87.5%)の化合物(9)が得られた。TLCでの移動度Rf=0.875(1:1 CH2Cl2:MeOH)。
再び合成経路概略図2を参酌して、ヨウ化エチル(40mL)中の化合物(9)(11g、0.04モル)の混合液が窒素雰囲気中で加熱還流された。前記反応は、TLC(4:1 CH2Cl2:MeOH)を用いて、出発材料の化合物(9)(Rf=0.65)が完全に消失し、産物の化合物(10)(Rf=0.25)が出現することについて監視された。48時間還流後、TLCは反応が完了したことを示したので、加熱が停止された。前記反応混合液は室温まで冷却され、反応産物はろ過によって回収され、アセトン(5x100mL)で洗浄され、風乾された。その後固体産物は、アセトン(300mL)中に懸濁され、終夜攪拌された。前記固体は、ろ過され、アセトン(2x50mL)で洗浄され、高真空下で終夜40°Cのオーブン内で乾燥されて、産物の化合物(10)(11.8g、定量的収率)が得られた。最大UV吸光波長=289nm。
再度合成経路概略図2を参酌して、火炎乾燥された(flame−dried)100mL丸底フラスコに、化合物(10)(10g、3.74ミリモル)が、化合物(11)(671.9mg、1.87ミリモル)、酢酸ナトリウム(368.2mg、4.49ミリモル)及びエタノール(20mL)とともに添加された。前記反応液は、オイルバス中で還流加熱され、窒素雰囲気下で1時間攪拌された。化合物(11)(500mg)及び酢酸ナトリウム(185mg)が前記反応液中に添加され、さらに1時間加熱された。その後、前記反応液はメタノール(50mL)で希釈され、塩を除去するためにろ過された。前記溶媒は減圧下で前記反応液から気化され、残渣混合物はメタノール/塩化メチレンの溶媒勾配で溶出することによってカラムクロマトグラフィーにより精製された。産物の分画は混合され、約100mLに濃縮された。前記溶液はエチルエーテル(800mL)中に注入され、得られた固体は回収され、高真空下で終夜40°Cのオーブン内で乾燥されて、緑色の固体(12)が838.7mg(67%収率)得られた(Rf=0.23(2:1 MeOH:CH2Cl2)、メタノール中での最大吸光波長=783nm)。
再度合成経路概略図2を参酌して、1,1’−チオカルボニルジイミダゾール(1.04g、5.8ミリモル)が、DMF(20mL)中のチラミン(800mg、5.8ミリモル)溶液に添加された。反応液は、室温で30分間攪拌された。そして、前記溶媒は減圧下で気化されて、オレンジ色の油状物を得た。前記油状物はメタノール(2mL)中に溶解された。水(6mL)が前記溶液に添加され、イソチオシアナート(13)が沈殿した。生成物はろ過によって回収され、冷水で洗浄された。高真空下で終夜40°Cのオーブン内で乾燥された後、1.08g(定量的収率)の化合物(13)が得られた。
再度合成経路概略図2を参酌して、2−(ヒドロキシフェニル)エチルイソチオシアナート(13)(214mg、1.2ミリモル)が、火炎乾燥された100mLフラスコ内の無水DMF(10mL)に窒素雰囲気下で0°Cで溶解された。水素化ナトリウム(95%、28.6mg、1.2ミリモル)が添加され、反応液は0°Cで10分間攪拌されて、常温で30分間攪拌された。フェノキシド液が、無水DMF(10mL)に溶解されたクロロシアニン色素(12)(200mg、0.30ミリモル)に窒素雰囲気下で添加された。反応は、TLCを用いて化合物(12)が消失し産物の化合物(14)が出現することについて監視された。18時間後、反応はメタノールで停止され、溶媒は40°Cの回転式エバポレータで除去された。粗材料は酢酸エチルで洗浄され、カラムクロマトグラフィーによって精製されて、150mg(62%)のシアニン色素(14)が得られた(メタノール中の最大吸光波長=770nm)。1HnmR(CD3OD,300MHz) δ 7.96(d,2H,J=14.1Hz),7.82(d,2H,J=8.3Hz),7.79(s,2H),7.24(m,2H),6.99(m,2H),6.64(d,2H,J=8.5Hz),6.15(d,2H,J=14.3Hz),4.12(m,4H),3.59(t,2H,J=5.8Hz),2.61 2.81(m,6H),1.98(t,2H,J=5.2Hz),1.33(s,18 H)
合成経路概略図3を参酌して、1,1,2−トリメチル−1H−ベンズインドール(15)(11.0g、52.6ミリモル)が、スターラーバーを備えた乾燥200mL丸底フラスコに添加された。前記フラスコは氷水浴中で冷却され、硫酸(10mL)が前記反応液中に攪拌しながら添加され、前記固体を部分的に溶解した。発煙硫酸(25g、30%SO3、約93.7ミリモル)が添加され、反応液は0°Cで30分間攪拌された。そして前記反応液は湿気を排除しつつ終夜室温で攪拌された。終夜反応の後、酸性油状物は氷(200mL)中に注入され、30分間攪拌された。酸性溶液は水酸化カリウムで塩基性になるまで(pH>12)中和された。溶媒が減圧下で気化されて固体にされた。残渣の水分は、アセトンで前記固体を粉砕した後ろ過することによって除去された。乾燥した固体は、高温のメタノール(約1L)で抽出された。未溶解の塩はろ過され、ろ液は濃縮されて固体にされ、EtOAc(300mL)で粉砕された。前記固体は回収され、酢酸エチル(2x50mL)で洗浄され、乾燥された。さらに高真空下で終夜45°Cのオーブン内で乾燥されて、17g(定量的)の産物化合物(16)が得られた(TLC:Rf=0.28(4:1 CH2Cl2:MeOH)。
再び合成経路概略図3を参酌して、ヨウ化エチル(25mL)中のスルホン酸化合物(16)(6.50g、19.9ミリモル)の混合液が窒素雰囲気下で加熱還流された。前記反応は、TLC(2:1 CH2Cl2:MeOH)を用いて出発材料化合物(16)(Rf=0.58)が完全に消失し、生成物(17)(Rf=0.22)が出現することについて監視された。48時間還流後、TLCは前記反応がほぼ完了したことを示したので、加熱は停止された。反応混合液は室温まで冷却され、反応産物はろ過によって回収された。固体反応産物(17)はアセトン(3x100mL)で洗浄され、風乾された。固体産物(17)は、シリカゲル状のカラムクロマトグラフィーによって(MeOH:CH2Cl2の溶媒勾配で溶出されて)精製された。産物分画は混合され濃縮された。前記固体はろ過され、アセトン(2x50mL)で洗浄され、高真空下で終夜40°Cのオーブン内で乾燥されて、1.34gの産物化合物(17)(30%収率)を得た。
合成経路概略図3を参酌して、化合物(17)(200mg、0.63ミリモル)が化合物(11)(113.2mg、0.315ミリモル)と、酢酸ナトリウム(51.67mg、0.63ミリモル)と、エタノール(10mL)とが入った火炎乾燥された100mL丸底フラスコに添加された。反応液はオイルバス中で1時間窒素雰囲気下で攪拌しながら還流加熱された。追加量の化合物(11)(100mg)と酢酸ナトリウム(25mg)とが前記反応液中に添加され、加熱は2時間継続された。溶媒は減圧下で気化され、残渣混合物はメタノール(3mL)に溶解され、生成物は酢酸エチル(20mL)で沈殿された。得られた固体産物はろ過によって回収され、高真空下で24時間40°Cのオーブン内で乾燥された。クロロシアニン色素(18)の濃緑色固体(298mg、不純物を含む定量的収率)が得られた(TLC Rf=0.23(2:1 MeOH:CH2Cl2);メタノール中での最大吸光波長=816nm)。前記固体はこれ以上精製することなく以下の合成ステップで用いられた。
再度合成経路概略図3を参酌して、2−(ヒドロキシフェニル)エチルイソチオシアナート(13)(279mg、1.6ミリモル)が窒素雰囲気下0°Cの火炎乾燥した100mLフラスコ内の無水DMF(10mL)に溶解された。水素化ナトリウム(95%、37.4mg、1.6ミリモル)が添加され、反応液は0°Cで10分間攪拌された。窒素雰囲気下で前記フェノキシド溶液が無水DMF(10mL)中のクロロシアニン色素(18)(300mg、0.39ミリモル)に添加された。前記反応は、TLCを用いて化合物(18)の消失及び生成物(19)の出現について監視された。18時間後、反応はメタノールで停止され、溶媒は40°Cの回転式エバポレータで除去された。粗材料は酢酸エチルで洗浄され、カラムクロマトグラフィーによって精製され、105mg(29%)の化合物(19)が得られた(メタノール中での最大吸光波長=804nm)。1HnmR(DMSO,300MHz) δ 8.25(s,2H),8.11 8.15(m,4H),7.95(d,2H,J=13.4Hz),7.80(d,2H,J=8.7Hz),7.71(d,2H,J=8.5Hz),7.31(d,2H,J=8.1Hz),7.12(d,2H,J=8.1Hz),6.21(d,2H,J=14.0Hz),4.15(m,4H),3.59(t,2H,J=5.8Hz),2.60 2.80(m,6H),1.98(t,2H,J=5.2Hz),1.58(s,12H),1.33(t,6H,J=5.7Hz)。
図1A、1B、2A及び2Bを参酌して、シアニン色素(14)及び(19)の正規化された吸光スペクトルが、それぞれ以下に示すシアニン色素Cy7及びDBCy7のスペクトルと比較された。
2個の蛍光レポーター化合物(20)及び(21)は、ベックマン・コールターCEQ200DNA解析システムにおける4個のダイターミネーターのうちの2個を置換した。ベックマン・コールター社の1999年の著作物である、CEQTM 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing Chemistry Protocol,A Step by Step Guide to Dye Terminator Cycle Sequencing on the CEQ 2000,718119ABに説明される現行のシーケンシングプロトコールは、化合物(20)及び(21)が該プロトコールに記載のddCTP及びddATP試薬の代用とされることを除いて、踏襲された。蛍光レポーター化合物(20)及び(21)を用いると、前記CEQ2000のシーケンシングプロトコールを用いてテストされるときには、最大600塩基までの配列情報が得られた。
Claims (18)
- 以下の化学式(1)の蛍光レポーター化合物であって、
Zはヌクレオチドであり、
Lは、該ヌクレオチドの誘導体の核酸複製酵素による全体的な結合及び認識にシアニン色素が有意な干渉をしないように前記ヌクレオチドの誘導体を前記シアニン色素に結合するのに十分な長さのリンカーであり、
Cyは以下の化学式(2)のシアニン色素で、
A及びBは、それぞれ独立に、シアニン核を形成するのに必要な原子であり、
R1及びR2はそれぞれ独立にC1−C6アルキル基であり、
R3は、水素又はC1−C4アルキル基であり、
R4及びR5は、それぞれ独立に、H及びSO3 −からなるグループから選択され、
nは2ないし4の整数である、蛍光レポーター化合物。 - Lは長さが少なくとも8個の原子の鎖を有するリンカーである、請求項1に記載の蛍光レポーター化合物。
- R4及びR5は両方ともSO3 −である、請求項1ないし4のいずれかに記載の化合物。
- R1及びR2は両方ともC1−C4アルキル基である、請求項1ないし5のいずれかに記載の化合物。
- R1及びR2は同一である、請求項1ないし6のいずれかに記載の化合物。
- 水溶液中で測定された蛍光最大発光波長が750nmを超える、請求項1ないし7のいずれかに記載の化合物。
- 請求項1に記載の蛍光レポーター標識化合物を第1核酸配列と反応させて該蛍光レポーター標識化合物で標識された第2核酸配列を作成するステップと、
第2核酸配列のレポーターを検出するステップとを含む、核酸配列解析方法。 - 4個のDNA塩基のそれぞれに対応する請求項1に記載の蛍光レポーター標識化合物の混合物を用意するステップと、
DNAテンプレートを、複製酵素、DNAヌクレオチドの混合物及び前記蛍光レポーター標識化合物の混合物と反応させるステップと、
各DNA断片の3’末端残基に共有結合で結合した蛍光レポーター標識化合物を有するDNA断片を作成するステップと、
前記蛍光レポーター標識DNA断片を分離するステップと、
分離された蛍光レポーター標識DNA断片のそれぞれについてレポーターを検出してDNA配列を同定するステップとを含む、DNA塩基配列決定方法。 - R4及びR5は両方ともSO3 −である、請求項13に記載の化合物。
- R1及びR2は両方ともC1−C4アルキル基である、請求項13ないし16のいずれかに記載の化合物。
- R1及びR2は同一である、請求項13ないし17のいずれかに記載の化合物。
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