JP3499238B2 - 核酸配列の配列決定方法 - Google Patents

核酸配列の配列決定方法

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    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は蛍光色素、更に詳し
くは、エネルギー転移蛍光色素及びそれらの使用に関す
る。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】サンプ
ル中の成分を標識し、検出するための種々の蛍光色素が
開発されていた。一般に、蛍光色素は高い量子収量及び
大きい吸光係数を有することが好ましく、その結果、色
素は少量の検出される成分を検出するのに使用し得る。
また、蛍光色素は大きいストークスシフト（即ち、色素
が最大吸光度を有する波長と色素が最大発光を有する波
長の差）を有することが好ましく、その結果、蛍光発光
が色素を励起するのに使用された光源から容易に区別さ
れる。開発された蛍光色素の一つのクラスはエネルギー
転移蛍光色素である。一般に、エネルギー転移蛍光色素
はドナー蛍光体とアクセプター蛍光体とを含む。これら
の色素において、ドナー蛍光体とアクセプター蛍光体が
互いに接近して、かつ互いに対し適当な配向で位置され
る場合、ドナー蛍光体からのエネルギー放出がアクセプ
ター蛍光体により吸収され、アクセプター蛍光体に蛍光
を発するようにさせる。それ故、励起されたドナー蛍光
体はドナー蛍光体の励起エネルギーを有効に吸収し、そ
のエネルギーをアクセプター蛍光体に有効に転移するこ
とができることが重要である。種々のエネルギー転移蛍
光色素が文献に記載されていた。例えば、米国特許第4,
996,143 号及びWO 95/21266 は、ドナー蛍光体とアクセ
プター蛍光体がオリゴヌクレオチド鎖により結合されて
いるエネルギー転移蛍光色素を記載している。Lee ら,
Nucleic Acids Research 20:10 2471-2483 (1992) はフ
ルオレセインの４’−アミノメチル置換基により４’−
アミノメチル−５−カルボキシフルオレセインに結合さ
れた５−カルボキシローダミンを含むエネルギー転移蛍
光色素を記載している。
【０００３】幾つかの診断アッセイ及び分析アッセイが
開発されており、これらは蛍光色素を使用するサンプル
中の多種成分の検出、例えば、フローサイトメトリー(L
anier ら, J.Immunol. 132 151-156 (1984))、染色体分
析(Gray ら, Chromosoma 739-37(1979)) 、及びＤＮＡ
配列決定を伴う。これらのアッセイについて、２種以上
のスペクトル的に分解可能な蛍光色素の組を同時に使用
することが望ましく、その結果、一種より多い標的物質
がサンプル中で同時に検出し得る。多種色素を使用する
サンプル中の多種成分の同時検出はサンプル中の個々の
成分を連続的に検出するのに必要とされる時間を短縮す
る。多重遺伝子座ＤＮＡプローブアッセイの場合、多種
のスペクトル的に分解可能な蛍光色素の使用は必要とさ
れる反応管の数を減少し、それにより実験プロトコルを
簡素化し、用途特異性キットの製造を促進する。自動化
ＤＮＡ配列決定の場合、多種のスペクトル的に分解可能
な蛍光色素の使用は単一レーン中の４つの塩基の全ての
分析を可能にし、それにより単色方法よりも処理量を増
大し、レーン内の電気泳動移動度変化と関連する不確定
要素を排除する。Connell ら, Biotechniques 5 342-34
8 (1987)、Proberら, Science 238 336-341 (1987)、Sm
ith ら, Nature 321 674-679 (1986) 、及びAnsorge
ら, Nucleic Acids Research 15 4593-4602 (1989)。
【０００４】特に、電気泳動分離及び酵素による処理を
必要とする分析、例えば、ＤＮＡ配列決定について、サ
ンプル中の多種の標的物質を同時に検出するための蛍光
色素の組を得ることと関連した幾つかの難点がある。例
えば、その組中の夫々の色素はその他の色素からスペク
トル的に分解可能である必要がある。発光スペクトルが
スペクトル的に分解される色素の収集を見出すことは困
難である。何となれば、有機蛍光色素に典型的な発光バ
ンド半幅は約40-80 ナノメーター(nm)であり、利用可能
なスペクトルの幅が励起光源により制限されるからであ
る。色素の組に関して本明細書に使用される“スペクト
ル的分解" という用語は、色素の蛍光発光バンドが充分
に異なり、即ち、充分に重ならないこと、夫々色素が結
合される試薬、例えば、ポリヌクレオチドが通常の光検
出系を使用して、例えば、米国特許第4,230,558 号、同
第4,811,218 号、またはWheelessら, pgs.21-76, Flow
Cytometry:Instrumentation and Data Analysis (Acade
mic Press, New York, 1985)により記載された系に例示
されるような、バンドパスフィルター及び光電子増倍管
の組、電荷カップリング装置及びスペクトログラフ等の
系を使用して夫々の色素により生じた蛍光シグナルに基
いて区別し得ることを意味する。
【０００５】また、夫々の色素の蛍光シグナルは、夫々
の成分が充分な感度で検出し得るように充分に強いもの
である必要がある。例えば、ＤＮＡ配列決定の場合、増
大されたサンプル装填は低い蛍光効率の保証とはなり得
ない（Pringle ら, DNA CoreFacilities Newsletter, 1
15-21 (1988))。色素により生じた蛍光シグナルは、色
素がその吸光度最大で励起される時に一般に最大であ
る。それ故、夫々の色素はほぼその吸光度最大で励起さ
れることが好ましい。色素の組の使用と関連する更に別
の難点は、色素が一般に同じ吸光度最大を有しないこと
である。同じ吸光度最大を有しない色素の組が使用され
る場合、夫々の色素をその吸光度最大で励起するのに多
光源を用意することと関連する高コストと、夫々の色素
がその吸光度最大で励起されないことから生じる低感度
の間に取決めが生じられる。上記の難点に加えて、色素
の電荷、分子サイズ、及び配座がフラグメントの電気泳
動移動度に悪影響してはならない。また、蛍光色素はフ
ラグメントを生じ、または操作するのに使用される化
学、例えば、ＤＮＡ合成溶媒及び試薬、緩衝液、ポリメ
ラーゼ酵素、リガーゼ酵素等と適合性である必要があ
る。特に４色ＤＮＡ配列決定の領域において、多色用途
のために色素の組を開発する際の多くの束縛のために、
蛍光色素の少ない組のみが開発されていた。Connell
ら, Biotechniques 5 342-348 (1987)、Proberら, Scie
nce 238 336-341 (1987)、及びSmith ら, Nature 321 6
74-679 (1986) 。
【０００６】多色用途に有益であることがわかった蛍光
色素の一つのクラスはローダミン色素、例えば、テトラ
メチルローダミン(TAMRA) 、ローダミンＸ(ROX) 、ロー
ダミン6G(R6G) 、ローダミン110(R110) 等である。米国
特許第5,366,860 号。ローダミン色素は蛍光色素に関し
て特に魅力的である。何となれば、(1) ローダミンは典
型的にはフルオレセインより光安定性であり、(2) ロー
ダミン標識ジデオキシヌクレオチドが熱安定性ポリメラ
ーゼ酵素に良好な基質であり、かつ(3) ローダミン色素
の発光スペクトルがフルオレセインの赤色（高い波長）
に対し顕著であるからである。特に多重検出方法の状況
において、現在入手し得るローダミン色素に関連する一
つの欠点はローダミン色素の比較的広い発光スペクトル
である。この広い発光スペクトルはスペクトル上近い色
素間のスペクトル分解を制限し、このような色素組み合
わせの多成分分析を困難にする。現在入手し得るローダ
ミン色素に関連する第二の欠点は、それらの吸収スペク
トルが現在入手し得るソリッドステート周波数二倍グリ
ーンダイオードレーザー、例えば、約532nm で発光ライ
ンを有するネオジムソリッドステートYAG レーザーの波
長に適合しないことである。このようなレーザーを使用
することは、それらのコンパクトなサイズ、長い有効寿
命、及び出力の効率の良い使用のために非常に有利であ
る。
【０００７】エネルギー転移蛍光色素は、それらをサン
プル中の多種標的物質の同時検出、例えば、ＤＮＡ配列
決定における使用に魅力的にする幾つかの特徴を有す
る。例えば、単色ドナー蛍光体は、夫々の色素が共通の
波長で強い吸収を有するようにエネルギー転移蛍光色素
の組中で使用し得る。その時、アクセプター蛍光体をエ
ネルギー転移色素中で変化することにより、スペクトル
的に分解可能な蛍光発光を有する一連のエネルギー転移
色素が発生し得る。また、エネルギー転移蛍光色素は非
エネルギー転移蛍光色素よりも大きい有効なストークス
シフトを与える。これは、エネルギー転移蛍光色素に関
するストークスシフトがドナー蛍光体が光を最大に吸収
する波長とアクセプター蛍光体が光を最大に放出する波
長の差に基いているからである。一般に、大きなストー
クスシフトを有する蛍光色素に対する要望が存する。蛍
光色素を使用するアッセイの感度は、蛍光色素により生
じた蛍光シグナルの強さに依存する。それ故、強い蛍光
シグナルを有する蛍光色素に対する要望が存する。エネ
ルギー転移蛍光色素に関して、これらの色素の蛍光シグ
ナル強さは、如何に有効にアクセプター蛍光体がドナー
蛍光体のエネルギー放出を吸収するかに依存する。これ
は、順に、アクセプター蛍光体へのドナー蛍光体の近接
及びアクセプター蛍光体に対するドナー蛍光体の配向を
含む種々の変数に依存する。それ故、ドナー蛍光体とア
クセプター蛍光体の配向が、エネルギーがドナー蛍光体
とアクセプター蛍光体の間で有効に転移されるようなも
のであるようなエネルギー転移蛍光色素に対する要望が
存する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明はドナー色素をエ
ネルギー転移蛍光色素中でアクセプター色素に結合する
ためのリンカーに関する。また、本発明は増強された蛍
光を有するエネルギー転移蛍光色素に関する。また、本
発明は本発明のエネルギー転移色素を含む試薬、色素及
び試薬の使用方法、並びに色素及び試薬が含まれるキッ
トに関する。ドナー色素をエネルギー転移蛍光色素中で
アクセプター色素に結合するための本発明の一つのリン
カーは、以下に説明されるような一般構造式Ｒ21Ｚ1C
(O)Ｒ2 2Ｒ28（式中、Ｒ21はドナー色素に結合されたC
1-5アルキルであり、C(O)はカボニル基であり、Ｚ1 は
ＮＨ、硫黄または酸素であり、Ｒ22はアルケン、ジエ
ン、アルキン、少なくとも一つの不飽和結合を有する５
員環または６員環または縮合環構造であってもよいカル
ボニル炭素に結合された置換基であり、かつＲ28はリン
カーをアクセプター色素に結合する官能基を含む）を有
する。
【０００９】
【化２３】
【００１０】リンカー中に使用されるＲ28基は、Ｒ22基
をアクセプター色素に結合するのに使用し得る当業界で
知られているあらゆる基であってもよい。典型的には、
Ｒ28基はアクセプター色素のベンゼン環またはその他の
芳香族環構造に結合されるであろう。それ故、Ｒ28はア
クセプター色素のベンゼン環またはその他の芳香族環構
造に親電子官能基、例えば、カルボン酸、酸ハライド、
スルホン酸、エステル、アルデヒド、チオ、ジスルフィ
ド、イソチオシアネート、イソシアネート、スルホニル
ハライド、マレイミド、ヒドロキシスクシンイミドエス
テル、ハロアセチル、ヒドロキシスルホスクシンイミド
エステル、イミドエステル、ヒドラジン、アジドニトロ
フェニル、及びアジドを形成することにより形成される
ことが好ましい。その時、Ｒ22基は、アクセプター色素
の親電子剤を求核体、例えば、アミノ、ヒドロキシルま
たはスルフヒドリル求核体と反応させることにより、Ｒ
22基へのドナー色素の結合の前または後にアクセプター
色素に付加し得る。
【００１１】
【発明の実施の形態】例えば、以下に説明される実施態
様において、リンカーは一般構造式Ｒ21Ｚ1C(O)Ｒ22Ｒ
29Ｚ2C(0) （式中、Ｒ21及びＲ22は上記のとおりであ
り、Ｚ1 及びＺ2は夫々独立にＮＨ、硫黄または酸素で
あり、Ｒ29はC1-5アルキルであり、末端カルボニル基は
アクセプター色素の環構造に結合されている）を有す
る。Ｚ2が窒素である変化において、C(0) Ｒ22Ｒ29Ｚ2
サブユニットはアミノ酸サブユニットを形成する。
【００１２】
【化２４】
【００１３】この実施態様において、リンカーは活性化
カルボニル基(NHSエステル）とアミン基、ヒドロキシル
基またはチオール基の反応により生成されてもよい。Ｒ
22基をアクセプター色素に結合するための多種のその他
のメカニズムが考えられ、本発明の範囲内に入ることが
意図されていることが注目される。リンカー中でＲ22と
して使用し得る５員環または６員環の特別な例として、
シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエ
ン、シクロヘキサジエン、フラン、チオフラン、ピロー
ル、イソピロール、イソアゾール、ピラゾール、イソイ
ミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピ
リダジン、ピリミジン、プラジン及びオキサジンが挙げ
られるが、これらに限定されない。縮合環構造の例とし
て、インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドー
ル及びナフタレンが挙げられるが、これらに限定されな
い。このリンカーの好ましい実施態様は、以下に示され
るように、Ｒ21及びＲ29がメチレンであり、Ｚ1 及びＺ
2がＮＨであり、かつＲ22がベンゼンである場合であ
る。
【００１４】
【化２５】
【００１５】本発明のエネルギー転移蛍光色素の一つの
クラスは４’環位置に下記のキサンテン環構造を有する
ドナー色素を含む。
【００１６】
【化２６】
【００１７】式中、Ｙ1及びＹ2は別々にされてヒドロキ
シル、酸素、イミニウムまたはアミンであり、イミニウ
ム及びアミンは三級のイミニウムまたはアミンであるこ
とが好ましい。Ｒ11−Ｒ17は本発明のエネルギー転移色
素と適合性であるあらゆる置換基であってもよく、Ｒ11
−Ｒ17は色素のスペクトル特性及び移動度特性を変化す
るために広く変化されてもよいことが注目される。この
実施態様によれば、エネルギー転移色素はまたドナー色
素により放出された励起エネルギーを吸収し、応答して
第二波長で蛍光を発するアクセプター色素を含む。ま
た、エネルギー転移色素はドナー色素をアクセプター色
素に結合するリンカーを含む。エネルギー転移色素のこ
の実施態様の一つの変化において、リンカーは上記のよ
うに一般構造式Ｒ21Ｚ1C(O) Ｒ22Ｒ28（式中、Ｒ21はキ
サンテンドナー色素の４’位に結合されたC1-5アルキル
であり、C(O)はカルボニル基であり、Ｚ1はＮＨ、硫黄
または酸素であり、Ｒ22はアルケン、ジエン、アルキ
ン、少なくとも一つの不飽和結合を有する５員環もしく
は６員環または縮合環構造であってもよいカルボニル炭
素に結合された置換基であり、かつＲ28はリンカーをア
クセプター色素に結合する官能基を含む）を有する。エ
ネルギー転移色素のこの実施態様の更に別の変化におい
て、リンカーは上記のように一般構造式Ｒ21Ｚ1C(O) Ｒ
22Ｒ29Ｚ2C(0)（式中、Ｒ21及びＲ22は上記のとおりで
あり、Ｚ1 及びＺ2 は夫々独立にＮＨ、硫黄または酸素
であり、Ｒ29はC1-5アルキルであり、末端カルボニル基
はアクセプター色素の環構造に結合れている）を有す
る。Ｚ2 が窒素である変化において、-C(0) Ｒ22Ｒ29Ｚ
2-はアミノ酸サブユニットを形成する。エネルギー転移
色素のこの実施態様の更に別の好ましい変化において、
リンカーは以下に示されるように、Ｒ21及びＲ29がメチ
レンであり、Ｚ1 及びＺ2がＮＨであり、かつＲ22がベ
ンゼンである場合である。
【００１８】
【化２７】
【００１９】ドナー色素は必要によりＲ17がフェニルま
たは置換フェニルである色素のクラスの一員であっても
よい。Ｙ1がヒドロキシルであり、かつＹ2が酸素であ
り、かつＲ17がフェニルまたは置換フェニルである場
合、その色素は色素のフルオレセインクラスの一員であ
る。Ｙ1がアミンであり、かつＹ2がイミニウムであり、
かつＲ17がフェニルまたは置換フェニルである場合、そ
の色素は色素のローダミンクラスの一員である。更にこ
の実施態様によれば、アクセプター色素は必要により色
素のキサンテンクラス、シアニンクラス、フタロシアニ
ンクラス及びスクアラインクラスの一員であってもよ
い。別の実施態様において、エネルギー転移蛍光色素は
一般構造式
【００２０】
【化２８】
【００２１】を有するドナー色素及びアクセプター色素
を有する。式中、Ｙ1 及びＹ2 は別々にされてヒドロキ
シル、酸素、イミニウムまたはアミンであり、イミニウ
ム及びアミンは三級のイミニウムまたはアミンであるこ
とが好ましく、かつＲ11−Ｒ16は本発明のエネルギー転
移色素と適合性であるあらゆる置換基である。この実施
態様によれば、以下に説明されるように、リンカーがド
ナー色素及びアクセプター色素の夫々のＸ3 置換基及び
Ｘ4 置換基の一つ、好ましくはドナー色素及びアクセプ
ター色素のＸ3 置換基に結合される。この実施態様にお
いて、リンカーは短く、かつ／または硬質であることが
好ましい。何となれば、これがドナー色素とアクセプタ
ー色素の間のエネルギーの転移を増進することがわかっ
たからである。
【００２２】
【化２９】
【００２３】別の実施態様において、エネルギー転移蛍
光色素は色素のキサンテンクラスの一員であるドナー色
素、ドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収
し、応答して第二波長で蛍光を発することができる色素
のキサンテンクラス、シアニンクラス、フタロシアニン
クラス及びスクアラインクラスの一員であるアクセプタ
ー色素、及びドナー色素をアクセプター色素に結合する
リンカーを含む。この実施態様によれば、アクセプター
は約600nm より大きく、またはドナー色素の吸光度最大
よりも少なくとも約100nm 大きい発光最大を有する。上
記の新規なエネルギー転移蛍光色素に加えて、本発明は
またエネルギー転移蛍光色素を含む蛍光試薬に関する。
一般に、これらの試薬は、本発明のエネルギー転移色素
が結合でき、エネルギー転移色素の蛍光に基いて試薬の
存在を検出するのに使用し得るあらゆる分子または物質
を含む。一実施態様において、エネルギー転移蛍光色素
で標識された、ヌクレオシドまたはモノ−、ジ−もしく
はトリホスフェートヌクレオチドを含む蛍光試薬が提供
される。ヌクレオチドは、例えば、色素標識オリゴヌク
レオチドの調製に使用し得るデオキシヌクレオチドであ
ってもよい。また、ヌクレオチドは、例えば、色素ター
ミネーター配列決定に使用し得るジデオキシヌクレオシ
ドであってもよい。別の実施態様において、蛍光試薬は
エネルギー転移蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチ
ドを含む。これらの試薬は、例えば、色素プライマー配
列決定に使用し得る。
【００２４】また、本発明は本発明のエネルギー転移色
素及び試薬を使用する方法に関する。一実施態様におい
て、その方法は本発明のエネルギー転移色素で標識され
た一連の異なるサイズのオリゴヌクレオチドを生成し、
サイズに基いて一連の標識されたオリゴヌクレオチドを
分離し、エネルギー転移色素の蛍光に基いて分離された
標識されたオリゴヌクレオチドを検出することを含む。
この方法の一実施態様において、延長された標識された
プライマーの混合物がデオキシヌクレオチドトリホスフ
ェート、及び少なくとも一種の色素標識されたジデオキ
シヌクレオチドトリホスフェート及びＤＮＡポリメラー
ゼの存在下で核酸配列をオリゴヌクレオチドプライマー
とハイブリッドを形成することにより生成される。ＤＮ
Ａポリメラーゼは、プライマーの延長を終止するジデオ
キシヌクレオチドトリホスフェートがとり込まれるまで
プライマーをデオキシヌクレオチドトリホスフェートで
延長するのに利用できる。一旦終止されると、延長され
たプライマーの混合物が分離され、ジデオキシヌクレオ
シドの色素の蛍光に基いて検出される。この実施態様の
変化において、４種の異なる蛍光標識されたジデオキシ
ヌクレオチドトリホスフェート、即ち、蛍光標識された
ジデオキシシトシントリホスフェート、蛍光標識された
ジデオキシアデノシントリホスフェート、蛍光標識され
たジデオキシグアノシントリホスフェート、及び蛍光標
識されたジデオキシチミジントリホスフェートが使用さ
れる。この方法の別の実施態様において、オリゴヌクレ
オチドプライマーはデオキシヌクレオシドトリホスフェ
ートとは反対に蛍光標識される。また、本発明は本発明
の色素及び試薬を使用してＤＮＡ配列決定を行うための
色素及び試薬を含むキットに関する。
【００２５】Ｉ．本発明のエネルギー転移色素リンカー 本発明はドナー色素をエネルギー転移蛍光色素中でアク
セプター色素に結合するための新規なリンカーに関す
る。また、本発明はこれらのリンカーを含むエネルギー
転移蛍光色素に関する。これらのリンカーはエネルギー
転移色素中でドナー色素とアクセプター色素の間のエネ
ルギーの有効な転移を増進することがわかった。ドナー
色素をエネルギー転移蛍光色素中でアクセプター色素に
結合するための本発明の一つのリンカーは以下に説明さ
れるような一般構造式Ｒ21Ｚ1C(O)Ｒ22Ｒ28（式中、Ｒ
21はドナー色素に結合されたC1-5アルキルであり、C(O)
はカルボニル基であり、Ｚ1はＮＨ、硫黄または酸素で
あり、Ｒ22はアルケン、ジエン、アルキン、少なくとも
一つの不飽和結合を有する５員環及び６員環またはカル
ボニル炭素に結合されている縮合環構造を含む置換基で
あり、かつＲ28はリンカーをアクセプター色素に結合す
る官能基を含む）を有する。
【００２６】
【化３０】
【００２７】このリンカーの一実施態様において、以下
に説明されるように、リンカーは一般構造式Ｒ21Ｚ1C
(O)Ｒ22Ｒ29Ｚ2C(0)（式中、Ｒ21及びＲ22は上記のとお
であり、Ｚ1及びＺ2は夫々独立にＮＨ、硫黄または酸素
であり、Ｒ29はC1-5アルキルであり、末端カルボニル基
はアクセプター色素の環構造に結合されている）を有す
る。Ｚ2が窒素である変化において、C(0)Ｒ22Ｒ29Ｚ2サ
ブユニットはアミノ酸サブユニットを形成する。
【００２８】
【化３１】
【００２９】リンカー中でＲ22として使用し得る５員環
または６員環の特別な例として、シクロペンテン、シク
ロヘキセン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエ
ン、フラン、チオフラン、ピロール、イソピロール、イ
ソアゾール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、
ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジ
ン、プラジン及びオキサジンが挙げられるが、これらに
限定されない。縮合環構造の例として、インデン、ベン
ゾフラン、チオナフテン、インドール及びナフタレンが
挙げられるが、これらに限定されない。このリンカーの
好ましい実施態様は、以下に示されるように、Ｒ21及び
Ｒ29がメチレンであり、Ｚ1及びＺ2がＮＨであり、かつ
Ｒ22がベンゼンである場合である。
【００３０】
【化３２】
【００３１】表３は本発明のリンカー中に使用し得るリ
ンカーの-C(0)Ｒ22- サブユニットの例を示す。 II. 本発明のエネルギー転移色素 一般に、本発明のエネルギー転移色素は第一波長の光を
吸収し、応答して励起エネルギーを放出するドナー色
素、ドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収
し、応答して第二波長で蛍光を発することができるアク
セプター色素、及びドナー色素をアクセプター色素に結
合するリンカーを含む。本明細書に示された分子構造の
全てに関して、これらの分子構造は示された正確な電子
構造を含むだけでなく、その全ての共鳴構造及びプロト
ン化状態を含むことが意図されている。本発明のエネル
ギー転移蛍光色素の一つのクラスは色素のキサンテンク
ラスの一員であるドナー色素、アクセプター色素及び節
Ｉに記載されたリンカーのグループの一員であるリンカ
ーを含む。本明細書に使用されるキサンテン色素は一般
構造式
【００３２】
【化３３】
【００３３】を有する全ての分子を含む。式中、Ｙ1及
びＹ2は別々にされてヒドロキシル、酸素、イミニウム
またはアミンであり、イミニウム及びアミンは三級のイ
ミニウムまたはアミンであることが好ましい。Ｙ1がヒ
ドロキシルであり、かつＹ2が酸素であり、かつＲ17が
フェニルまたは置換フェニルである場合、その色素は色
素のフルオレセインクラスの一員である。Ｙ1がアミン
である、かつＹ2がイミニウムであり、かつＲ17がフェ
ニルまたは置換フェニルである場合、その色素は色素の
ローダミンクラスの一員である。Ｒ11−Ｒ17は本発明の
エネルギー転移色素と適合性であるあらゆる置換基であ
ってもよく、Ｒ11−Ｒ17は色素のスペクトル特性及び移
動度特性を変化するために広く変化されてもよいことが
注目される。環構造中に示された番号はキサンテン環構
造の４’位を示す。リンカーがキサンテン環構造の４’
位に結合されている本発明のエネルギー転移色素につい
て、Ｒ14サブユニットがリンカーに相当する。Ｒ11−Ｒ
17置換基の例として、水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ
素、カルボキシル、アルキル、アルケン、アルキン、ス
ルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリ
ル、アルコキシ、フェニル、置換フェニル、隣接置換基
が一緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合
わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施態
様において、Ｒ15及びＲ16は一緒にされて置換または未
置換ベンゼン環を形成する。キサンテン色素のこのクラ
スは本明細書中非対称ベンゾキサンテン色素と称され、
Scott C.Bensonらにより1996年４月１日に出願された米
国特許出願第08/626,085号（発明の名称：非対称ベンゾ
キサンテン色素）に記載されており、この特許が参考と
して本明細書に含まれる。別の実施態様において、Ｒ17
は一般式
【００３４】
【化３４】
【００３５】を有するフェニルまたは置換フェニルであ
る。フェニル環の置換基Ｘ1−Ｘ5として、水素、フッ
素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、ア
ルケン、アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウ
ム、アミド、ニトリル、アルコキシ、隣接置換基が一緒
にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせが
挙げられる。一実施態様において、ドナー色素は、本明
細書中４，７−ジクロロローダミン色素と称される、Ｙ
1がアミンであり、Ｙ2がイミニウムであり、かつＸ2及
びＸ5が塩素である色素のクラスの一員である。色素の
４，７−ジクロロローダミンクラス内に入る色素及びそ
れらの合成が本明細書並びに1996年６月27日に出願され
た米国特許出願第08/672,196号（発明の名称発明の名
称：４，７−ジクロロローダミン色素）に記載されてお
り、この特許が参考として本明細書に含まれる。
【００３６】ここで使用されるアルキルは直鎖及び分岐
炭化水素部分、即ち、メチル、エチル、プロピル、イソ
プロピル、tert- ブチル、イソブチル、sec-ブチル、ネ
オペンチル、tert- ペンチル等を表す。置換アルキルは
ヒドロキシ、アミノ、チオ、シアノ、ニトロ、スルホ、
等を含むが、これらに限定されない種々の置換基のいず
れか一つで置換されたアルキル部分を表す。ハロアルキ
ルは一つ以上のハロゲン原子置換基、通常フルオロ、ク
ロロ、ブロモ、またはヨードを有する置換アルキルを表
す。アルケンは炭素−炭素結合の一つ以上が二重結合で
あり、かつ非二重結合炭素がアルキルまたは置換アルキ
ルである炭化水素を表す。アルキンは炭素の一つ以上が
三重結合で結合されており、非三重結合炭素がアルキル
部分または置換アルキル部分である炭化水素を表す。ス
ルホネートは３個の酸素原子に結合された硫黄原子を含
む部分（そのモノ−及びジ−塩を含む）、例えば、ナト
リウムスルホネート、カリウムスルホネート、ジナトリ
ウムスルホネート、等を表す。アミノは２個の水素原
子、アルキル部分、またはこれらのあらゆる組み合わせ
に結合された窒素原子を含む部分を表す。アミドは酸素
原子に二重結合され、アミノ部分に単結合された炭素原
子を含む部分を表す。ニトリルは窒素原子に三重結合さ
れた炭素原子を含む部分を表す。アルコキシは酸素原子
に単結合されたアルキル部分を含む部分を表す。アリー
ルは単一または多数のフェニルまたは置換フェニル、例
えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニ
ル等を表す。
【００３７】Ｒ11〜Ｒ17はまた夫々独立にエネルギー転
移色素を試薬、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオシドま
たはオリゴヌクレオチドに結合するのに使用し得る結合
部分であってもよい。結合部分の例として、相補官能基
が常にアミンである場合、イソチオシアネート、スルホ
ニルクロリド、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、
スクシンイミジルエステル、またはその他の活性カルボ
キシレートが挙げられる。相補官能基が常にスルフヒド
リルである場合、結合基はマレイミド、ハロアセチル、
またはヨードアセトアミドであることが好ましい。R.Ha
ugland, Molecular Probes Handbook of Fluorescent P
robes and Research Chemicals, Molecular probes, In
c. (1992) を参照のこと。特に好ましい実施態様におい
て、図１に示されるように、結合基はアミノヘキシル−
オリゴマーと反応させられて色素標識されたオリゴヌク
レオチドプライマーを生成し得るドナー色素またはアク
セプター色素のいずれかのカルボキシル基から生成され
た活性化NHS エステルである。この実施態様のエネルギ
ー転移蛍光色素はまたドナー色素により放出された励起
エネルギーを吸収し、応答して第二波長で蛍光を発する
ことができるアクセプター色素、及びドナー色素をアク
セプター色素に結合するリンカーを含む。エネルギー転
移色素の第一クラスにおいて、リンカーは節Ｉに記載さ
れたリンカーのクラスの一員であり、キサンテン環構造
の４’位でドナー色素に結合される。この第一クラスの
エネルギー転移色素はアクセプター蛍光体それ自体及び
同じドナー−アクセプター対を有するエネルギー転移蛍
光色素（この場合、ドナー−アクセプター対の間の結合
が異なる）と比較して増強された蛍光強さを示す。ま
た、本発明は、ドナー色素及びアクセプター色素が夫々
一般構造式
【００３８】
【化３５】
【００３９】（式中、Ｙ1、Ｙ2、Ｒ11〜Ｒ16及びＸ1〜
Ｘ5は先に特定されたとおりである）を有するエネルギ
ー転移蛍光色素の第二クラスに関する。色素のこのクラ
スの中で、リンカーはドナー色素及びアクセプター色素
の夫々のＸ3置換基及びＸ4置換基の一つによりドナー色
素及びアクセプター色素に結合される。
【００４０】
【化３６】
【００４１】色素のこのクラスの好ましい実施態様にお
いて、リンカーはドナー色素及びアクセプター色素の夫
々のＸ3置換基によりドナー色素及びアクセプター色素
に結合される。色素のこのクラスの中で、リンカーは短
く、かつ／または硬質であることが好ましい。何となれ
ば、これがドナー色素とアクセプター色素の間のエネル
ギーの転移を増進することがわかったからである。ま
た、本発明は、アクセプター色素が色素の４，７−ジク
ロロローダミンクラスの一員であるエネルギー転移蛍光
色素の第三クラスに関するものであり、即ち、その色素
は一般構造式
【００４２】
【化３７】
【００４３】を有する。式中、Ｒ1〜Ｒ4は夫々独立に水
素、アルキル、またはＲ1とＲ5、Ｒ2とＲ6、Ｒ3とＲ8、
Ｒ4とＲ9が一緒にされて環を形成する場合、及びこれら
の組み合わせであり、Ｒ5〜Ｒ10は夫々独立に水素、フ
ッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、
アルケン、アルキン、スルホネート、スルホン、アミ
ノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、フ
ェニル、もしくは置換フェニル、または隣接置換基が一
緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせ
であり、Ｘ1、Ｘ3及びＸ4は夫々独立に水素、フッ素、
塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、アルケ
ン、アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、アン
モニウム、アミド、ニトリル、もしくはアルコキシ、ま
たは隣接置換基が一緒にされて環を形成する場合、及び
これらの組み合わせであり、Ｘ2及びＸ5は塩素である。
Ｒ1〜Ｒ10、Ｘ3及びＸ4に関して、Ｒ1とＲ5、Ｒ2と
Ｒ6、Ｒ3とＲ8、Ｒ4とＲ9、及びＸ3とＸ4は夫々独立に
一緒にされて５員環、６員環、または７員環を形成して
もよい。環構造中に示された番号（４’、５、６）はロ
ーダミン環構造の４’、５、６の環の位置を示す。本明
細書に説明されるように、４’及び５の環の位置はドナ
ー蛍光体をアクセプター蛍光体に結合する本発明のエネ
ルギー転移色素中に使用されたリンカーの結合に好まし
い部位である。４’、５、６の環の位置はまたエネルギ
ー転移色素への生物分子、例えば、ヌクレオチドまたは
オリゴヌクレオチドの結合に好ましい部位である。
【００４４】エネルギー転移色素のこのクラス中のドナ
ー色素は励起エネルギーを放出するあらゆる色素を含ん
でいてもよく、その４，７−ジクロロローダミン色素が
エネルギーを吸収し、応答してエネルギー放出を生じる
ことができる。一実施態様において、ドナー色素は、
４，７−ジクロロローダミンアクセプター色素がキサン
テン色素の４’環位に結合されているリンカーによりド
ナー色素に結合される４’環位でキサンテン環構造を有
する。リンカーは４，７−ジクロロローダミンアクセプ
ター色素の５環位または６環位に結合されることが好ま
しい。色素のこの第三クラス（即ち、４，７−ジクロロ
ローダミンがアクセプター色素である場合）のエネルギ
ー転移色素はその他のローダミン色素に較べて比較的狭
い放出スペクトルを有するという利点を与える。この狭
い放出スペクトルはこれらの色素の組により得られるス
ペクトル分解を増進し、それによりこれらの色素を使用
する多成分分析を促進する。また、本発明はエネルギー
転移蛍光色素の第四クラスに関するものであり、この場
合、ドナー色素が色素のキサンテンクラスの一員であ
り、アクセプター色素が色素のキサンテンクラス、シア
ニンクラス、フタロシアニンクラス及びスクアラインク
ラスの一員であり、アクセプターが約600nm より大きい
放出最大を有し、かつ／または好ましくはドナー色素の
吸光度最大よりも少なくとも約100nm 大きい放出最大を
有する。色素のこのクラスの中で、ドナーは色素のフル
オレセインクラスの一員であることが好ましい。本発明
のエネルギー転移色素の第四クラスは、ドナーの吸収び
アクセプターの放出の差により測定して、大きいストー
クスシフトを通常示す。加えて、これらの色素は、最小
のドナー蛍光が観察される点で有効なエネルギー転移を
示す。本発明のエネルギー転移色素の第四クラスが本明
細書に更に詳しく記載される。
【００４５】
【化３８】
【００４６】
【化３９】
【００４７】
【化４０】
【００４８】Ａ．エネルギー転移色素の第一クラス 上記のように、本発明のエネルギー転移色素の第一クラ
スは色素のキサンテンクラスの一員であり、それ故４’
環位でキサンテン環構造を有するドナー色素を含む。色
素のこのクラス中で、アクセプター色素はドナー色素に
より放出された励起エネルギーを吸収し、応答して第二
波長で蛍光を発することができる色素である。この実施
態様によれば、ドナーは色素のフルオレセインクラス、
ローダミンクラスまたは非対称ベンゾキサンテンクラス
の一員であってもよく、これらの色素の夫々は色素の更
に広いキサンテンクラスの員である。これらのキサンテ
ン色素の一般構造式が以下に示される。これらの色素に
関して説明された置換基は色素のこれらの異なるクラス
に含まれてもよい多種の置換基から選ばれてもよい。何
となれば、一般のキサンテン環構造、フルオレセイン環
構造、ローダミン環構造、及び非対称環ベンゾキサンテ
ン構造を有する全ての色素が本発明の範囲内に入ること
が意図されているからである。
【００４９】
【化４１】
【００５０】この実施態様のエネルギー転移蛍光色素中
に使用し得るアクセプター色素のクラスの例として、キ
サンテン色素、シアニン色素、フタロシアニン色素及び
スクアライン色素が挙げられるが、これらに限定されな
い。これらの色素の一般構造式が表１Ａに示される。こ
れらの色素について説明された置換基は色素のこれらの
異なるクラスに含まれてもよい多種の置換基から選ばれ
てもよい。何となれば、一般のキサンテン環構造、フル
オレセイン環構造、ローダミン環構造、非対称ベンゾキ
サンテン環構造、シアニン環構造、フタロシアニン環構
造及びスクアライン環構造を有する全ての色素が本発明
の範囲内に入ることが意図されているからである。この
実施態様に使用し得るドナー色素の例として、フルオレ
セイン、カルボキシフルオレセインの異性体（例えば、
５カルボキシ及び６カルボキシ）、カルボキシ−ＨＥＸ
の異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、
ＮＡＮ、Cl−ＦＬＡＮ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＺＯＥ、ロー
ダミン、カルボキシローダミンの異性体（例えば、５カ
ルボキシ及び６カルボキシ）、カルボキシR110の異性体
（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、カルボキ
シR6G の異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキ
シ）、４．７−ジクロロフルオレセイン（米国特許第5,
188,934 号を参照のこと）、４．７−ジクロロローダミ
ン(1996 年６月27日に出願された米国特許出願第08/67
2,196号を参照のこと）、非対称ベンゾキサンテン色素
（1996年４月１日に出願された米国特許出願第08/626,0
85号を参照のこと）、及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ
メチル−カルボキシローダミン（TMARA)の異性体（例え
ば、５カルボキシ及び６カルボキシ）が挙げられるが、
これらに限定されない。
【００５１】この実施例に使用し得るアクセプター色素
の例として、カルボキシフルオレセインの異性体（例え
ば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、４．７−ジクロ
ロフルオレセイン、４．７−ジクロロローダミン、フル
オレセイン、非対称ベンゾキサンテン色素、カルボキシ
−ＨＥＸの異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボ
キシ）、ＮＡＮ、Cl−ＦＬＡＮ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＺＯ
Ｅ、ローダミン、カルボキシローダミンの異性体（例え
ば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、カルボキシR110
の異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、
カルボキシR6Gの異性体（例えば、５カルボキシ及び６
カルボキシ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−カ
ルボキシローダミン（TMARA)の異性体（例えば、５カル
ボキシ及び６カルボキシ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミ
ン(ROX) の異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボ
キシ）及びCy5 が挙げられるが、これらに限定されな
い。これらの色素の構造式が表２に示される。本発明の
エネルギー転移色素の第一クラスにおいて、リンカーは
キサンテン環構造の４’位でドナー色素に結合される。
一実施態様において、リンカーは以下に示されるような
一般構造式Ｒ21Ｚ1C(O)Ｒ22Ｒ28（式中、Ｒ21はドナー
キサンテン色素の４’環位に結合されているC1-5アルキ
ルであり、Ｚ1はＮＨ、硫黄または酸素であり、C(O)は
カルボニル基であり、Ｒ22はアルケン、ジエン、アルキ
ン、少なくとも一つの不飽和結合を有する５員環及び６
員環またはカルボニル炭素に結合されている縮合環構造
を含む置換基であり、かつＲ28はリンカーをアクセプタ
ー色素に結合する官能基である）を有する。
【００５２】
【化４２】
【００５３】Ｒ22中に使用し得る５員環または６員環の
例として、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペ
ンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、チオフラ
ン、ピロール、イソピロール、イソアゾール、ピラゾー
ル、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピ
リジン、ピリダジン、ピリミジン、プラジン及びオキサ
ジンが挙げられるが、これらに限定されない。縮合環構
造の例として、インデン、ベンゾフラン、チオナフテ
ン、インドール及びナフタレンが挙げられるが、これら
に限定されない。この実施態様の一つの変化において、
以下に示されるように、リンカーは一般構造式Ｒ21Ｚ1C
(O)Ｒ22Ｒ29Ｚ2C(0)（式中、Ｒ21はドナーキサンテン色
素の４’環位に結合されているC1-5アルキルであり、Ｚ
1及びＺ2は夫々独立にＮＨ、硫黄または酸素であり、C
(O)はカルボニル基であり、Ｒ22はアルケン、ジエン、
アルキン、少なくとも一つの不飽和結合を有する５員環
及び６員環またはカルボニル炭素に結合されている縮合
環構造を含む置換基であり、Ｒ29はC1-5アルキルであ
り、末端カルボニル基はアクセプター色素の環構造に結
合されている）を有する。
【００５４】
【化４３】
【００５５】このリンカーの好ましい実施態様は、以下
に示されるように、Ｒ21及びＲ29がメチレンであり、Ｚ
1及びＺ2がＮＨであり、かつＲ22がベンゼンである場合
である。
【００５６】
【化４４】
【００５７】
【化４５】
【００５８】
【化４６】
【００５９】
【化４７】
【００６０】実施例４及び図２に示されるように、先に
特定されたようなドナー、アクセプター及びリンカーを
含む、5-TMR-B-CFの如きエネルギー転移色素は、アクセ
プターそれ自体並びにドナー−アクセプター対の間のリ
ンカーが異なる場合の同じドナー−アクセプター対を有
するエネルギー転移蛍光色素に較べて増強された蛍光を
示す。理論により縛られないで、観察された増強された
蛍光強さはリンカーの比較的硬質なＲ22部分により得ら
れ、維持されるドナー色素とアクセプター色素の間の改
良されたエネルギー転移配向のためであると考えられ
る。その結果として、本発明のエネルギー転移蛍光色素
はアクセプター蛍光体それ自体並びにドナー−アクセプ
ター対の間のリンカーが異なる場合の同じドナー−アク
セプター対を有するエネルギー転移蛍光色素に較べて増
強された蛍光強さを示す。これらの色素の増強された蛍
光強さは色素スタッキングを低下するのに利用できる8M
尿素の存在下で特に明らかである。この実施態様の一つ
の変化において、アクセプターは一般構造式
【００６１】
【化４８】
【００６２】（式中、Ｙ1、Ｙ2、Ｒ11〜Ｒ16及びＸ1〜
Ｘ5は先に特定されたとおりである）を有する色素のキ
サンテンクラスの一員である。この変化によれば、上記
リンカーの如きリンカーはアクセプターキサンテン色素
のＸ3またはＸ4置換基を介してアクセプターキサンテン
色素に結合されることが好ましい。以下に示されるよう
な好ましい実施態様において、リンカーはアクセプター
キサンテン色素のＸ3置換基に結合される。
【００６３】
【化４９】
【００６４】表４は本発明のこの実施態様の上記エネル
ギー転移色素の例を示す。表４中に示された色素は５−
カルボキシフルオレセインドナー色素及びTAMRA アクセ
プター色素を含むが、多種のその他のキサンテン色素が
ドナー色素として容易に置換し得ることが理解されるべ
きであることが注目される。また、多種のその他のキサ
ンテン色素、並びにシアニン色素、フタロシアニン色素
及びアクアライン色素が上記されたTAMRA アクセプター
色素に代えて容易に置換し得ることが理解されるべきで
あり、ドナー色素及びアクセプター色素に関するこれら
の変化の全てが本発明の範囲内に入る。
【００６５】
【化５０】
【００６６】
【化５１】
【００６７】Ｂ．エネルギー転移色素の第二クラス 本発明はまたドナー色素及びアクセプター色素が一般構
造式
【００６８】
【化５２】
【００６９】（式中、Ｙ1、Ｙ2、Ｒ11〜Ｒ16及びＸ1〜
Ｘ5は先に特定されたとおりである）を有する色素のキ
サンテンクラスの員である、以下に示されるようなエネ
ルギー転移蛍光色素の第二クラスに関する。この実施態
様によれば、リンカーは以下に示されるようにドナー色
素及びアクセプター色素の両方のＸ3またはＸ4置換基に
結合される。
【００７０】
【化５３】
【００７１】この実施態様において、リンカーは短く、
かつ／または硬質であることが好ましい。何となれば、
これがドナー色素とアクセプター色素の間のエネルギー
の転移を増進することがわかったからである。例えば、
この実施態様の一つの変化において、リンカーは長さが
９原子未満であるドナーをアクセプターに結合する主鎖
を有することが好ましい。この実施態様の別の変化にお
いて、リンカーはリンカーに或る程度の構造上の剛性を
与える官能基、例えば、アルケン、ジエン、アルキン、
少なくとも一つの不飽和結合を有する５員環及び６員環
または縮合環構造を含む。更に別の変化において、リン
カーは一般式Ｒ25Ｚ3C(O)またはＲ25Ｚ3C(O)Ｒ26Ｚ4C
(O)(式中、Ｒ25はドナー色素に結合されており、C(O)は
カルボニ基であり、末端カルボニル基はアクセプター色
素に結合されており、Ｒ25及びＲ26は夫々C1-4アルキル
の群から選ばれ、かつＺ3及びＺ4は夫々独立にＮＨ、Ｏ
またはＳである）を有する。この実施態様に使用し得る
ドナー色素及びアクセプター色素の例として、フルオレ
セイン、５または６カルボキシフルオレセイン、５また
は６カルボキシ−ＨＥＸ、ＮＡＮ、Cl−ＦＬＡＮ、ＴＥ
Ｔ、ＪＯＥ、ＺＯＥ、４．７−ジクロロフルオレセイ
ン、非対称ベンゾキサンテン色素、ローダミン、５また
は６カルボキシローダミン、５または６カルボキシ−R1
10、５または６カルボキシ−R6G 、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−テトラメチル（５または６）−カルボキシローダミン
（TAMRA)、５または６カルボキシ−Ｘ−ローダミン(RO
X) 及び４．７−ジクロロローダミンが挙げられるが、
これらに限定されない。これらの色素の構造式が表２に
示される。
【００７２】この実施態様の別の変化において、リンカ
ーはＲ27Ｚ5C(O)基（式中、Ｒ27はドナー色素に結合さ
れたC1-5アルキルであり、Ｚ5はＮＨ、硫黄または酸素
であり、かつC(O)はアクセプター色素に結合されたカル
ボニル基である）を含む。表５は本発明のエネルギー転
移色素の第二クラスの例を示す。表５に示された色素は
５−アミノメチルフルオレセインドナー色素を含むが、
多種のその他のキサンテン色素がドナー色素として容易
に置換し得ることが理解されるべきであることが注目さ
れる。また、多種のその他のキサンテン色素、並びにシ
アニン色素、フタロシアニン色素及びアクアライン色素
が上記されたTAMRA アクセプター色素に代えて容易に置
換し得ることが理解されるべきであり、ドナー色素及び
アクセプター色素に関するこれらの変化の全てが本発明
の範囲内に入る。
【００７３】
【化５４】
【００７４】
【化５５】
【００７５】
【化５６】
【００７６】Ｃ．エネルギー転移色素の第三クラス エネルギー転移蛍光色素の第三クラスはアクセプター色
素としての４．７−ジクロロローダミン色素及びドナー
色素としての４．７−ジクロロローダミン色素が吸収す
ることができる放出を生じる色素を含む。これらの色素
はアクセプター色素単独に較べて増強された蛍光強さを
示す。加えて、４．７−ジクロロローダミン色素はその
他のローダミン色素よりも狭い発光スペクトルを示し、
これが多成分分析におけるそれらの使用を促進する。好
ましい実施態様において、これらのエネルギー転移色素
は色素の第一クラス及び第二クラスに記載の色素を含
み、この場合、アクセプターは４．７−ジクロロローダ
ミン色素である。 １．４．７−ジクロロローダミン色素 ４．７−ジクロロローダミン色素化合物は一般構造式
【００７７】
【化５７】
【００７８】を有する。式中、Ｒ1〜Ｒ4は夫々独立に水
素、アルキル、またはＲ1とＲ5、Ｒ2とＲ6、Ｒ3とＲ8、
Ｒ4とＲ9が一緒にされて環を形成する場合、及びこれら
の組み合わせであり、Ｒ5〜Ｒ10は夫々独立に水素、フ
ッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、
アルケン、アルキン、スルホネート、スルホン、アミ
ノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、フ
ェニルもしくは置換フェニル、または隣接置換基が一緒
にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせで
あり、Ｘ1、Ｘ3及びＸ4は夫々独立に水素、フッ素、塩
素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、アルケ
ン、アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、アン
モニウム、アミド、ニトリル、もしくはアルコキシ、ま
たは隣接置換基が一緒にされて環を形成する場合、及び
これらの組み合わせであり、かつＸ2及びＸ5は塩素であ
る。
【００７９】色素の４．７−ジクロロローダミンクラス
の中に入る色素及びそれらの合成が“４．７−ジクロロ
ローダミン色素”という発明の名称の1996年６月27日に
出願された米国特許出願第08/672,196号に記載されてお
り、その特許が参考として本明細書に含まれる。Ｒ1〜
Ｒ4に関して、アルキル置換基は約１〜８個の炭素原子
を含んでもよく（即ち、メチル、エチル、プロピル、イ
ソプロピル、tert- ブチル、イソブチル、sec-ブチル、
ネオペンチル、tert- ペンチル等）、直鎖炭化水素部分
及び分岐炭化水素部分であってもよい。好ましい実施態
様において、Ｒ1〜Ｒ4は夫々独立に水素、メチル、また
はエチルであり、更に好ましくは水素またはメチルであ
る。Ｒ5〜Ｒ10に関して、アルキル置換基、アルケン置
換基、アルキン置換基及びアルコキシ置換基は好ましく
は約１〜８個の炭素原子を含んでもよく（即ち、メチ
ル、エチル、プロピル、イソプロピル、tert- ブチル、
イソブチル、sec-ブチル、ネオペンチル、tert- ペンチ
ル等）、直鎖炭化水素部分及び分岐炭化水素部分であっ
てもよい。Ｒ1〜Ｒ10に関して、Ｒ1とＲ5、Ｒ2とＲ6、
Ｒ3とＲ8、Ｒ4とＲ9は夫々独立に一緒にされて５員環、
６員環、または７員環を形成してもよい。
【００８０】一実施態様において、Ｒ6及びＲ7はベンゾ
であり、かつ／またはＲ9及びＲ10はベンゾである。好
ましい実施態様において、Ｒ5〜Ｒ10は夫々独立に水
素、メチル、またはエチルであり、更に好ましくは水素
またはメチルである。Ｘ1、Ｘ3及びＸ4に関して、Ｘ1は
好ましくはカルボキシレートであり、かつＸ 3及びＸ4の
一つは４．７−ジクロロローダミンアクセプター色素を
ドナー色素に結合し、またはヌクレオチドもしくはオリ
ゴヌクレオチドをエネルギー転移色素に結合するのに使
用される置換基を含んでいてもよい。４’環位にあるＲ
8置換基はまたアクセプターをドナー色素またはヌクレ
オチドもしくはオリゴヌクレオチドの如き生物分子に結
合するのに使用し得る。本明細書中DR110-2 と称され
る、本発明に使用し得る一つの特に好ましいアクセプタ
ー色素において、Ｒ1〜Ｒ10は別々にされて水素であ
り、Ｘ1はカルボキシレートであり、Ｘ3及びＸ4の一方
は結合基(L)であり、他方は水素である。DR110-2 の構
造が以下に示される。
【００８１】
【化５８】
【００８２】本明細書中DR6G-2と称される、本発明に使
用し得る第二の特に好ましいアクセプター色素におい
て、Ｒ1及びＲ2の一方はエチルであり、他方は水素であ
り、Ｒ 3及びＲ4の一方はエチルであり、他方は水素であ
り、Ｒ5及びＲ8は別々にされてメチルであり、Ｒ6、
Ｒ7、Ｒ9、及びＲ10は水素であり、Ｘ1はカルボキシレ
ートであり、Ｘ3及びＸ4の一方は結合基であり、他方は
水素である。DR6G-2の構造が以下に示される。
【００８３】
【化５９】
【００８４】本明細書中DTMRと称される、本発明に使用
し得る第三の特に好ましいアクセプター色素において、
Ｒ1〜Ｒ6は別々にされて水素であり、Ｙ1〜Ｙ4は別々に
されてメチルであり、Ｘ1はカルボキシレートであり、
Ｘ2及びＸ3の一方は結合基であり、他方は水素である。
DTMRの構造が以下に示される。
【００８５】
【化６０】
【００８６】本明細書中DROXと称される、本発明に使用
し得る第四の特に好ましいアクセプター色素において、
Ｒ1及びＲ6は一緒にされて６員環を形成し、Ｒ2及びＲ5
は一緒にされて６員環を形成し、Ｒ3及びＲ7は一緒にさ
れて６員環を形成し、Ｒ4及びＲ8は一緒にされて６員環
を形成し、Ｒ5及びＲ6は水素であり、Ｘ1はカルボキシ
レートであり、Ｘ3及びＸ4の一方は結合基であり、他方
は水素である。DROXの構造が以下に示される。
【００８７】
【化６１】
【００８８】図３及び４は本発明のエネルギー転移色素
中に使用し得る４，７−ジクロロローダミン色素の幾つ
かの付加的な好ましい実施態様を示す。化合物3A-Aにお
いて、Ｒ1 及びＲ2 の一方はエチルであり、他方は水素
であり、Ｒ3 及びＲ4 は別々にされて水素であり、Ｒ6
はメチルであり、Ｒ5 及びＲ7〜Ｒ10は別々にされて水
素であり、Ｘ1 はカルボキシレートであり、Ｘ3 及びＸ
4 の一方は結合基であり、他方は水素である。化合物3A
-Bにおいて、Ｒ1 及びＲ2 の一方はエチルであり、他方
は水素であり、Ｒ3 及びＲ4 は別々にされてメチルであ
り、Ｒ6 はメチルであり、Ｒ5 及びＲ 7 〜Ｒ10は別々に
されて水素であり、Ｘ1 はカルボキシレートであり、Ｘ
3 及びＸ4 の一方は結合基であり、他方は水素である。
化合物3A-Cにおいて、Ｒ1 及びＲ2 は別々にされてメチ
ルであり、Ｒ3 及びＲ 9 は一緒にされて６員環を形成
し、Ｒ4 及びＲ8 は一緒にされて６員環を形成し、Ｒ
5 、Ｒ6 、Ｒ7 、及びＲ10は別々にされて水素であり、
Ｘ1 はカルボキシレートであり、Ｘ3 及びＸ4 の一方は
結合基であり、他方は水素である。化合物3B-Dにおい
て、Ｒ1 及びＲ2 は別々にされて水素であり、Ｒ3 及び
Ｒ9は一緒にされて６員環を形成し、Ｒ4 及びＲ8 は一
緒にされて６員環を形成し、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 、及びＲ
10は別々にされて水素であり、Ｘ1 はカルボキシレート
であり、Ｘ3 及びＸ4 の一方は結合基であり、他方は水
素である。化合物3B-Eにおいて、Ｒ1 及びＲ2 の一方は
エチルであり、他方は水素であり、Ｒ3 及びＲ9 は一緒
にされて６員環を形成し、Ｒ4 及びＲ8 は一緒にされて
６員環を形成し、Ｒ6 はメチルであり、Ｒ5 、Ｒ7 及び
Ｒ10は別々にされて水素であり、Ｘ1 はカルボキシレー
トであり、Ｘ3 及びＸ4 の一方は結合基であり、他方は
水素である。化合物3B-Fにおいて、Ｒ1 及びＲ2 は別々
にされて水素であり、Ｒ3 及びＲ4は別々にされてメチ
ルであり、Ｒ5 〜Ｒ10は別々にされて水素であり、Ｘ1
はカルボキシレートであり、Ｘ3 及びＸ4 の一方は結合
基であり、他方は水素である。
【００８９】図５及び６は本発明のエネルギー転移色素
中に使用される４，７−ジクロロローダミン色素の調製
の好ましい一般化された合成スキームを示す。夫々の図
に示された可変置換基は先に定義されたとおりである。
図５は置換基Ｘ1 がカルボキシレート以外であり得る一
般化された合成を示す。図中、Ｘ’はＸ1 の前駆体であ
る部分を示す。図５に示された方法において、２当量の
３−アミノフェノール誘導体4A-A／4A-B、例えば、３−
ジメチルアミノフェノールが１当量のジクロロベンゼン
誘導体4A-C、例えば、４−カルボキシ−３，６ジクロロ
−２−スルホ安息香酸環状酸無水物（即ち、４ｃのＸ1'
部分が一緒にされて−ＣＯ−Ｏ−ＳＯ2 −である）と反
応させられる。
【００９０】次いで反応体が強酸、例えば、ポリリン酸
または硫酸中で180 ℃で12時間加熱される。粗色素4A-D
が水への添加により沈殿され、遠心分離により単離され
る。対称生成物を生成するために、反応体4A-A及び4A-B
の置換基は同じであるが、非対称生成物を生成するため
に、置換基は異なる。図６は置換基Ｘ1 がカルボキシレ
ートである一般化された合成を示す。図６の方法におい
て、２当量の３−アミノフェノール誘導体4B-A／4B-B、
例えば、３−ジメチルアミノフェノールが１当量の無水
フタル酸誘導体4B-E、例えば、３，６−ジクロロ無水ト
リメリット酸と反応させられる。次いで反応体が強酸、
例えば、ポリリン酸または硫酸中で180 ℃で12時間加熱
される。粗色素4B-Dが水への添加により沈殿され、遠心
分離により単離される。対称生成物を生成するために、
反応体4B-A及び4B-Bの置換基は同じであるが、非対称生
成物を生成するために、置換基は異なる。 ２．アクセプターとしての４，７−ジクロロローダミン
を含むエネルギー転移色素 一般に、本発明のエネルギー転移色素は第一波長の光を
吸収し、応答して励起エネルギーを放出するドナー色
素、ドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収
し、応答して第二波長の蛍光を発することができる４，
７−ジクロロローダミンアクセプター色素、及びドナー
色素をアクセプター色素に形成するリンカーを含む。
４，７−ジクロロローダミン色素をアクセプター色素と
して使用する色素のこのクラスの好ましい例が表１に示
される。色素のこのクラス中に使用し得るアクセプター
色素の例として、先に説明されたようなDR110-2 、DR6G
-2、DTMR、DROX、並びに図３及び４に示された色素が挙
げられるが、これらに限定されない。これらのエネルギ
ー転移蛍光色素の一つのサブクラスは、アクセプター色
素が４，７−ジクロロローダミン色素である本発明の色
素の第一クラスの色素である。これらの色素の一般構造
式が以下に示される。
【００９１】
【化６２】
【００９２】表４は４，７−ジクロロローダミンがアク
セプター色素として使用される色素の第一クラスに属す
るエネルギー転移色素の例を示す。表４に示された色素
は５−カルボキシフルオレセインドナー色素及びアクセ
プター色素としての５または６カルボキシDTMRを含む
が、多種のその他のキサンテン色素がドナー色素として
容易に置換でき、多種のその他の４，７−ジクロロロー
ダミン色素がDTMRアクセプター色素に代えて容易に置換
し得ることが理解されるべきであることが注目され、ド
ナー色素及びアクセプター色素に関するこれらの変化の
全てが本発明の範囲内に入ることが意図されている。こ
れらのエネルギー転移蛍光色素の別のサブクラスは、ア
クセプター色素が４，７−ジクロロローダミン色素であ
る本発明の色素の第二クラスの色素である。ドナーキサ
ンテン色素及びアクセプター４，７−ジクロロローダミ
ン色素がドナー色素及びアクセプター色素の５環位また
は６環位で互いに結合されるこれらの色素の一般構造式
が以下に示される。
【００９３】
【化６３】
【００９４】上記のように、この実施態様において、ド
ナーをアクセプター色素に結合するリンカーは短く、か
つ／または硬質であることが好ましい。何となれば、こ
れがドナー色素とアクセプター色素の間のエネルギーの
転移を増進することがわかったからである。先に示され
た置換基ラベルは、その他の色素に関して特定された置
換基の同じグループに相当する。表５は４，７−ジクロ
ロローダミンがアクセプター色素として使用される本発
明のエネルギー転移色素の第二クラスの例を示す。表５
に示された色素は５−アミノメチルフルオレセインドナ
ー色素を含むが、多種のその他のキサンテン色素がドナ
ー色素として容易に置換し得ることが理解されるべきで
あることが注目される。また、多種のその他の４，７−
ジクロロローダミン色素が表５に示された色素に代えて
容易に置換し得ることが理解されるべきである。何とな
れば、上記されたように、ドナー色素及びアクセプター
色素に関するこれらの変化の全てが本発明の範囲内に入
ることが意図されているからである。 Ｄ．エネルギー転移色素の第四クラス 本発明はまたドナー色素が色素のキサンテンクラスの一
員であり、かつアクセプター色素が色素のキサンテンク
ラス、シアニンクラス、フタロシアニンクラスまたはス
クアラインクラスの一員であるエネルギー転移蛍光色素
の第四クラスに関する。エネルギー転移色素のこのクラ
ス中で、ドナーは色素のフルオレセインクラスの一員で
あり、かつアクセプター色素が約600nm より大きい発光
最大及び／またはドナー色素の吸光度最大よりも少なく
とも約100nm 大きい発光最大を有することが好ましい。
【００９５】本発明の色素の第四クラスは、ドナーの吸
光度とアクセプターの発光の差により測定して、大きい
ストークスシフトを通常示す。加えて、これらの色素
は、最小ドナー蛍光が観察される点で有効なエネルギー
転移を示す。重要なことに、アクセプター色素の吸収ス
ペクトルがドナー色素の発光スペクトルと重ならないと
しても、エネルギーはこのクラスに属する色素の幾つか
においてドナーからアクセプターに転移される。この実
施態様に使用し得るアクセプター色素の例として、５−
カルボキシ−Ｘ−ローダミン(ROX) 及びCy5 が挙げられ
るが、これらに限定されない。この実施態様のエネルギ
ー転移色素はまたドナーをアクセプターに結合するリン
カーを含む。ドナーをアクセプター色素に結合するのに
使用されるリンカーは色素の第一クラス及び第二クラス
のあらゆるリンカーであってもよい。しかしながら、別
のリンカーが色素のこのクラス中に使用されてもよいこ
とが予知される。
【００９６】色素のこのクラスの一実施態様において、
リンカーはドナー色素のキサンテン環構造の４’位に結
合される。リンカーは上記の一般構造式Ｒ21Ｚ1C(O)Ｒ
22Ｒ2 8（式中、Ｒ21はドナーキサンテン色素の４’環位
に結合されているC1-5アルキルであり、Ｚ1はＮＨ、硫
黄または酸素であり、C(O)はカルボニル基であり、Ｒ2 2
はアルケン、ジエン、アルキン、少なくとも一つの不飽
和結合を有する５員環及び６員環またはカルボニル炭素
に結合されている縮合環構造を含む置換基であり、かつ
Ｒ28はリンカーをアクセプター色素に結合する官能基で
ある）を有することが好ましい。アクセプター色素が色
素のキサンテンクラスの一員である場合、リンカーはキ
サンテン環構造の５位でアクセプターに結合されること
が好ましい。表６は本発明の上記のエネルギー転移色素
の例を示す。表６に示された色素は５−カルボキシフル
オレセインドナー色素を含むが、多種のその他のキサン
テン色素がドナー色素として容易に置換し得ることが理
解されるべきであることが注目される。また、多種のそ
の他のキサンテン色素、並びにシアニン色素、フタロシ
アニン色素及びスクアライン色素が上記された５−カル
ボキシROX 及びCy5 アクセプター色素に代えて容易に置
換し得ることが理解されるべきである。ドナー色素及び
アクセプター色素に関するこれらの変化の全てが本発明
の範囲内に入る。この実施態様のエネルギー転移色素
は、これらの色素を４色素ＤＮＡ配列決定において小さ
いストークスシフトを有する色素との使用に特に良く適
しているようにする大きいストークスシフトを通常示
す。例えば、図７及び８は互いにスペクトル的に分解可
能である４色素の２組を示す。図７中、5ROX-CF は上記
色素の第四クラスの範囲内に入る色素である。一方、図
８は両方とも上記色素の第四クラスの範囲内に入る5ROX
-CF 及びCy5-CFを含む。
【００９７】図８に示された5ROX-CF 及びCy5-CFの発光
スペクトルからわかるように、ドナー色素（５−カルボ
キシフルオレセイン、520nm)からの非常に小さい蛍光が
これらの色素中で観察される。これはドナー色素（フル
オレセイン）の発光最大とアクセプター色素（ROX 、59
0nm 、Cy5 、640nm)の吸光度最大の大きな差に鑑みて予
期しない結果である。
【００９８】
【化６４】
【００９９】II. 本発明のエネルギー転移色素を含む試
薬 また、本発明は本発明のエネルギー転移蛍光色素を含む
蛍光試薬に関する。節III に詳しく記載されるように、
これらの試薬はサンプル中の成分の存在を検出するため
の多種の方法に使用し得る。本発明の蛍光試薬は、本発
明のエネルギー転移色素が結合されて、エネルギー転移
色素の蛍光に基いて試薬の存在を検出するのに使用し得
るあらゆる分子または物質を含む。本発明の色素が試薬
を生成するのに結合し得る分子及び物質の型として、タ
ンパク質、ポリペプチド、多糖、ヌクレオチド、ヌクレ
オシド、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類縁
体（例えば、ペプチド核酸）、脂質、固体担体、有機ポ
リマー及び無機ポリマー、並びにこれらの組み合わせ及
び群がり、例えば、染色体、核、生細胞、例えば、バク
テリア、その他の微生物、哺乳類細胞、及び組織が挙げ
られるが、これらに限定されない。本発明の試薬の好ま
しいクラスはヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌク
レオチド及びオリゴヌクレオチド類縁体（これらは本発
明のエネルギー転移色素を含むように修飾されていた）
である。ヌクレオチド試薬及びヌクレオシド試薬に関す
る用途の例として、酵素合成により生成されたオリゴヌ
クレオチド標識、例えば、PCR 増幅の状況で使用される
ヌクレオシドトリホスフェート、サンガー型オリゴヌク
レオチド配列決定、及びnick翻訳反応が挙げられるが、
これらに限定されない。オリゴヌクレオチド試薬に関す
る用途の例として、ＤＮＡ配列決定プライマー、PCR プ
ライマー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション
プローブ等としての使用が挙げられるが、これらに限定
されない。
【０１００】試薬の一つの特別な実施態様は標識された
ヌクレオシド(NTP) 、例えば、本発明のエネルギー転移
蛍光色素で標識された、シトシン、アデノシン、グアノ
シン、及びチミジンである。これらの試薬はオリゴヌク
レオチド合成を伴う多種の方法に使用し得る。別の関連
実施態様は標識されたヌクレオチド、例えば、モノ−、
ジ−及びトリホスフェートヌクレオシドホスフェートエ
ステルである。これらの試薬として、特に、本発明のエ
ネルギー転移蛍光色素で標識された、デオキシヌクレオ
シドトリホスフェート(dNTP)、例えば、デオキシシトシ
ントリホスフェート、デオキシアデノシントリホスフェ
ート、デオキシグアノシントリホスフェート、及びデオ
キシチミジントリホスフェートが挙げられる。これらの
試薬は、例えば、色素標識されたオリゴヌクレオチドの
調製においてポリメラーゼ基質として使用し得る。ま
た、これらの試薬として、本発明のエネルギー転移蛍光
色素で標識された、ジデオキシヌクレオシドトリホスフ
ェート(ddNTP) 、例えば、ジデオキシシトシントリホス
フェート、ジデオキシアデノシントリホスフェート、ジ
デオキシグアノシントリホスフェート、及びジデオキシ
チミジントリホスフェートが挙げられる。これらの試薬
は、例えば、色素終止配列決定に使用し得る。
【０１０１】試薬の別の実施態様は本発明のエネルギー
転移蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドである。これら
の試薬は、例えば、色素プライマー配列決定に使用し得
る。本明細書に使用される“ヌクレオシド" は、例え
ば、Kornberg及びBaker, DNAReplication,第二編(Freem
an, San Francisco, 1992)に記載されたような２’−デ
オキシ形態及び２’−ヒドロキシル形態を含む、１’位
でペントースに結合された、プリン、デアザプリン、ま
たはピリミジンヌクレオシド塩基、例えば、アデニン、
グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニ
ン、デアザグアノシン等からなる化合物を表す。本明細
書に使用される“ヌクレオチド”という用語はヌクレオ
チドのホスフェートエステル、例えば、モノ、ジ及びト
リホスフェートエステルを表し、エステル化の最も普通
の部位はペントースのC-5 位に結合されたヒドロキシル
基である。ヌクレオチドに関する“類縁体" として、例
えば、Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New
York, 1980) により一般に記載された、修飾塩基部分及
び／または修飾糖部分を有する合成ヌクレオシドが挙げ
られる。“標識されたヌクレオシド" 及び“標識された
ヌクレオチド" という用語は結合によりエネルギー転移
色素に共有結合されているヌクレオシド及びヌクレオチ
ドを表す。
【０１０２】本明細書に使用される“オリゴヌクレオチ
ド" という用語は、二本鎖及び一本鎖のデオキシリボヌ
クレオシド、リボヌクレオシド、これらのα−アノマー
形態等を含む、天然または修飾ヌクレオシドモノマーの
線状ポリマーを表す。通常、ヌクレオシドモノマーはホ
スホジエステル結合により結合されており、本明細書に
使用される場合、“ホスホジエステル結合”は、会合さ
れた対イオン、例えば、Ｈ、ＮＨ４ 、Na等を含む（こ
のような対イオンが存在する場合）、ホスホロチオエー
ト、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホ
スホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホ
スホルアニリデート、ホスホルアミデート等を含む、ホ
スホジエステル結合またはこれらの類縁体を表す。オリ
ゴヌクレオチドはサイズが少ないモノマー単位、例え
ば、8-40から数千のモノマー単位までの範囲である。オ
リゴヌクレオチドが文字の配列、例えば、“ATGCCTG"に
より表される時はいつも、特にことわらない限り、ヌク
レオチドが左から右に5'→3'の順序であり、“A"はデオ
キシアデノシンを表し、“C"はデオキシシチジンを表
し、“G"はデオキシグアノシンを表し、また“T"はチミ
ジンを表すことが理解されるであろう。ヌクレオシド標
識は、既知の結合、結合基、及び関連相補性官能基を使
用して多数の既知のヌクレオシド標識技術のいずれかを
使用して行い得る。色素及びヌクレオシドを結合する結
合は(i) オリゴヌクレオチド合成条件に安定であり、(i
i)オリゴヌクレオチド−標的ハイブリダイゼーションに
干渉せず、(iii) 関係する酵素、例えば、ポリメラー
ゼ、リガーゼ等と適合性であり、かつ(iv)色素の蛍光を
消光しないものであるべきである。
【０１０３】色素はピリミジン塩基の５−炭素及び７−
デアザプリン塩基の７−炭素に共有結合されることが好
ましい。本発明に使用し得る幾つかの好適な塩基標識操
作が、例えば、Gibsonら, Nucleic Acids Research, 15
6455-6467 (1987) 、Gebeyehuら, Nucleic Acids Rese
arch, 15 4513-4535 (1987) 、Haralambidisら, Nuclei
c Acids Research, 15 4856-4876 (1987) 、Nelsonら,
Nucleosides and Nucleotides, 5(3) 233-241 (1986)、
Bergstrom ら, JACS, 111 374-375 (1989)、米国特許第
4,855,225 号、同第5,231,191 号、及び同第5,449,767
号に報告されており、これらの夫々が参考として本明細
書に含まれる。結合はアセチレンアミド結合またはアル
ケンアミド結合であることが好ましく、色素とヌクレオ
チド塩基の結合は色素の活性化Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド(NHS) エステルをヌクレオチドのアルキニルアミ
ノ−、アルキニルエトキシアミノ−またはアルケニルア
ミノ−誘導体化塩基と反応させることにより形成され
る。得られる結合はプロパルギル−１−エトキシアミド
（３−（アミノ）エトキシ−１−プロピニル）、３−
（カルボキシ）アミノ−１−プロピニルまたは３−アミ
ノ−１−プロピン−１−イルであることが更に好まし
い。本発明の色素をヌクレオシド塩基に結合するのに好
ましい幾つかの結合が以下に示される。
【０１０４】
【化６５】
【０１０５】（式中、Ｒ1及びＲ2は別々にされてＨ、ア
ルキル、保護基または蛍光色素である） アルキニルアミノ−誘導体化ヌクレオシドの合成がHobb
s らの欧州特許出願第87305844.0号、及びHobbs ら, J.
Org.Chem., 54 3420 (1989) により教示されており、こ
れが参考として本明細書に含まれる。簡単に言えば、ア
ルキニルアミノ−誘導体化ヌクレオチドが、適当なハロ
ジデオキシヌクレオシド（通常、Hobbsら（先に引用し
た）により教示されたような５−ヨードピリミジン及び
７−ヨード−７−デアザプリンジデオキシヌクレオシ
ド）及びCu(I) をフラスコに入れ、アルゴンでフラッシ
して空気を除去し、乾燥DMF を添加し、続いてアルキニ
ルアミン、トリエチルアミン及びPd(0) を添加すること
により生成される。その反応混合物は数時間にわたっ
て、または薄層クロマトグラフィーがハロジデオキシヌ
クレオシドの消費を示すまで、攪拌し得る。保護されて
いないアルキニルアミンが使用される場合、アルキニル
アミノ−ヌクレオシドは、反応混合物を濃縮し、カップ
リング反応で生じたヒドロハライドを中和するために水
酸化アンモニウムを含む溶離溶媒を使用してシリカゲル
によるクロマトグラフィーにかけることにより単離し得
る。保護されたアルキニルアミンが使用される場合、メ
タノール／塩化メチレンが反応混合物に添加でき、続い
て強塩基性陰イオン交換樹脂の重炭酸塩形態が添加し得
る。次いでスラリーが約45分間にわたって攪拌され、濾
過され、樹脂が追加のメタノール／塩化メチレンですす
がれる。合わせた濾液が濃縮され、メタノール−塩化メ
チレン勾配を使用してシリカゲルによるフラッシュクロ
マトグラフィーにより精製し得る。トリホスフェートが
通常の技術により得られる。
【０１０６】本発明のエネルギー転移色素で標識された
オリゴヌクレオチドの合成は、既知の結合、結合基、及
び関連相補性官能基を使用する多数の既知のオリゴヌク
レオチド標識技術のいずれかを使用して行い得る。例え
ば、標識されたオリゴヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ
ポリメラーゼまたはリガーゼを使用して酵素合成でき
（例えば、Stryer, Biochemistry, 24章, W.H.Freeman
and Company (1981)) 、または化学合成、例えば、ホス
ホルアミジト方法、ホスファイト−トリエステル方法等
（例えば、Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Pre
ss (1990))により合成し得る。標識は酵素合成中に標識
されたヌクレオシドトリホスフェートモノマーを使用し
て導入されてもよく、または化学合成中に標識された非
ヌクレオチドまたはヌクレオチドホスホルアミジトを使
用して導入されてもよく、または合成後に導入されても
よい。一般に、標識されたオリゴヌクレオチドが酵素合
成を使用してつくられる場合、下記の操作が使用し得
る。鋳型ＤＮＡが変性され、オリゴヌクレオチドプライ
マーが鋳型ＤＮＡにアニールされる。デオキシヌクレオ
シドトリホスフェートの混合物がdGTP、dATP、dCTP、及
びdTTPを含む反応液に添加され、デオキシヌクレオチド
の一種の少なくとも一部が上記の本発明の色素化合物で
標識される。次に、ポリメラーゼ酵素がポリメラーゼ酵
素が活性である条件下で添加される。標識されたポリヌ
クレオチドがポリメラーゼストランド合成中に標識され
たデオキシヌクレオチドのとり込みにより生成される。
別の酵素合成方法において、２種のプライマー、即ち、
＋ストランドに相補性の一種のプライマー及び標的の−
ストランドに相補性の別のプライマーが一種に代えて使
用され、ポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼであり、
反応温度が変性温度と延長温度の間でサイクルされ、そ
れによりPCR 、例えば、PCR Protocols, Innisら編集,
Academic Press (1990) により標的配列の標識された補
体を指数的に合成する。
【０１０７】一般に、標識されたオリゴヌクレオチドが
化学合成を使用してつくられる場合、ホスホルアミジト
方法が使用されることが好ましい。ホスホルアミジト化
合物及びポリヌクレオチド合成のホスホルアミジト方法
は、有効かつ迅速なカップリング並びに出発物質の安定
性のためにオリゴヌクレオチドを合成するのに好まし
い。その合成は固体担体に結合された成長するオリゴヌ
クレオチド鎖で行われ、その結果、液相中にある過剰の
試薬が濾過により容易に除去でき、それによりサイクル
間の精製工程の必要をなくす。ヌクレオシド及びオリゴ
ヌクレオチドを標識する際のホスホルアミジト試薬の実
用性に鑑みて、本発明はまた本発明のエネルギー転移色
素を含むホスホルアミジト化合物に関する。ホスホルア
ミジト方法によりオリゴヌクレオチドを生成するのに使
用される化学の詳細な説明がCaruthers らの米国特許第
4,458,066 号、Caruthers らの米国特許第4,415,732
号、Caruthers ら, Genetic Engineering, 4 1-17 (198
2)、Users Manual Model 392及び394 Polynucleotide S
ynthesizers, 6-1〜6-22頁、Applied Biosystems, Part
No.901237 (1991) に示されており、これらの夫々が参
考としてそのまま含まれる。
【０１０８】以下に、ホスホルアミジト方法を使用する
典型的なオリゴヌクレオチド合成サイクルの工程を簡単
に記載する。まず、保護されたヌクレオチドモノマーを
含む固体担体を酸、例えば、トリクロロ酢酸で処理して
５’−ヒドロキシル保護基を除去し、その後のカップリ
ング反応のためにヒドロキシルを遊離する。次いで保護
されたホスホルアミジトヌクレオシドモノマー及び弱
酸、例えば、テトラゾールをその反応に同時に添加する
ことにより活性化中間体を生成する。弱酸はホスホルア
ミジトの窒素をプロトン化して反応性中間体を生成す
る。ヌクレオシド添加は30秒以内に完結する。次に、ヌ
クレオシド付加を受けなかったポリヌクレオチド鎖を終
端するキャッピング工程を行う。キャッピングは無水酢
酸及び１−メチルイミダゾールを用いて行われることが
好ましい。次いでヌクレオチド内結合を、好ましい酸化
剤としてヨウ素を使用し、酸素ドナーとして水を使用す
る酸化によりホスファイトから更に安定なホスホトリエ
ステルに変換する。酸化後、ヒドロキシル保護基をプロ
トン酸、例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸で
除去し、鎖伸長が完結するまでそのサイクルを繰り返
す。合成後、塩基、例えば、水酸化アンモニウムまたは
ｔ−ブチルアミンを使用してポリヌクレオチド鎖を担体
から開裂する。また、開裂反応はホスフェート保護基、
例えば、シアノエチルを除去する。最後に、塩基のエキ
ソ環アミンの保護基及び色素のヒドロキシル保護基を、
そのポリヌクレオチド溶液を高温、例えば、55℃で塩基
中で処理することにより除去する。
【０１０９】ホスホルアミジトヌクレオシドモノマーの
いずれかは色素標識されたホスホルアミジトであっても
よい。ヌクレオチドの5'- 末端位置が標識される場合、
本発明の標識された非ヌクレオチドホスホルアミジトが
最終縮合工程中に使用し得る。オリゴヌクレオチドの内
部位置が標識される場合、本発明の標識されたヌクレオ
チドホスホルアミジトが縮合工程のいずれか中に使用し
得る。それらの合成に続いて、オリゴヌクレオチドは5'
末端を含む幾つかの位置で標識し得る。Oligonucleotid
es and Analogs, Eckstein編集, 8 章, IRL Press (199
1)及びOrgel ら, Nucleic Acids Research 11(18) 6513
(1983) 、米国特許第5,118,800 号を参照のこと。これ
らの文献の夫々が参考として含まれる。オリゴヌクレオ
チドはまたそれらのホスホジエステル主鎖(Oligonucleo
tidesand Analogs, Eckstein 編集, 9 章) または3'末
端(Nelson, Nucleic Acids Research 20(23) 6253-625
9、及び米国特許第5,401,837 号及び同第5,141,813
号）で標識されてもよく、両方の特許が参考として本明
細書に含まれる。オリゴヌクレオチド標識操作の総説に
ついて、R.Haugland Excited States of Biopolymers,
Steiner 編集, Plenum Press, NY (1983) を参照のこ
と。一つの好ましい合成後の化学標識方法において、オ
リゴヌクレオチドは以下のようにして標識される。約１
当量の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド及び約
３当量のｎ−ヒドロキシスクシンイミドを乾燥酢酸エチ
ル中で室温で３時間反応させることにより、カルボキシ
結合基を含む色素をｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テルに変換する。反応混合物を５％のHCl で洗浄し、硫
酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、固体に濃縮し、こ
れをDMSO中に再度懸濁させる。次いでDMSO色素原液をpH
9.4 の0.25M の重炭酸塩／炭酸塩緩衝液中のアミノヘキ
シル誘導体化オリゴヌクレオチドに過剰(10-20x)に添加
し、６時間反応させる（例えば、米国特許第4,757,141
号）。色素標識されたオリゴヌクレオチドをサイズ排除
クロマトグラフィーカラム中の通過により未反応色素か
ら分離し、緩衝液、例えば、0.1 モルのトリエチルアミ
ンアセテート(TEAA)で溶離する。粗標識オリゴヌクレオ
チドを含むフラクションを勾配溶離を使用して逆相HPLC
により更に精製する。
【０１１０】III.本発明の色素及び試薬を使用する方法 本発明のエネルギー転移色素及び試薬は、サンプル中の
成分を色素を含む試薬で標識することによりサンプル中
の成分を検出する多種の方法に使用し得る。特に、本発
明のエネルギー転移色素及び試薬は、分離技術及び蛍光
検出技術を組み合わせる方法、特に多種の空間上重なる
分析物の同時検出を必要とする方法における使用に良く
適している。例えば、色素及び試薬は生化学的分離操
作、例えば、電気泳動にかけられたオリゴヌクレオチド
のクラスを検出するのに特に良く適しており、この場
合、同様の物理化学的性質、例えば、サイズ、配座、電
荷、疎水性等を有する標的物質の一連のバンドまたはス
ポットが線形配列または平面配列で存在する。本明細書
に使用される“バンド”という用語は同様または同一の
物理化学的性質に基く分析物の空間上のグルーピングま
たは凝集を含む。通常バンドは電気泳動による色素−オ
リゴヌクレオチド接合体の分離において生じる。オリゴ
ヌクレオチドのクラスは種々の状況で生じ得る。本明細
書中“フラグメント分析”方法または“遺伝子分析”方
法と称される方法の好ましいカテゴリーにおいて、標識
されたオリゴヌクレオチドフラグメントは、例えば、結
合またはポリメラーゼ誘導プライマー延長により、標識
されたプライマーまたはヌクレオチドを使用する鋳型誘
導酵素合成により生成される。フラグメントはサイズ依
存性分離方法、例えば、電気泳動またはクロマトグラフ
ィーにかけられ、分離されたフラグメントが分離に続い
て、例えば、レーザー誘導蛍光により検出される。特に
好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドの多種
のクラスが同時に分離され、異なるクラスがスペクトル
的に分解可能な標識により区別される。
【０１１１】一つのこのようなフラグメント分析方法は
増幅されたフラグメント長さ多形性検出(AmpFLP)であ
り、増幅されたフラグメント長さ多形性、即ち、PCR に
より増幅される制限フラグメント長さ多形性に基いてい
る。種々のサイズのこれらの増幅されたフラグメントは
ファミリー中の変異体遺伝子を追跡するための結合され
たマーカーとして利用できる。増幅されたフラグメント
が染色体に関して変異体遺伝子に近似している程、連鎖
相関関係が高い。多くの遺伝子疾患の遺伝子は同定され
ていなかったので、これらの連鎖マーカーは疾患のリス
クまたは起源を評価することを助けるのに利用できる。
AmpFLP技術において、ポリヌクレオチドは標識されたオ
リゴヌクレオチドPCR プライマーを使用することによ
り、または標識されたヌクレオチドトリホスフェートを
PCR で使用することにより標識し得る。別のフラグメン
ト分析方法はnick翻訳である。nick翻訳は二本鎖ＤＮＡ
分子中の未標識ヌクレオチドトリホスフェートを標識さ
れたヌクレオチドトリホスフェートで置換する反応を伴
う。遊離3'- ヒドロキシル基がデオキシリボヌクレアー
ゼＩ(DNAaseI) 処理により生じた“nck"により未標識Ｄ
ＮＡ内に生成される。次いでＤＮＡポリメラーゼＩはni
ckの3'- ヒドロキシル末端への標識されたヌクレオチド
の付加を触媒する。同時に、この酵素の5'to3'- エキソ
ヌクレアーゼ活性がnickの5'- ホスホリル末端からヌク
レオチド単位を排除する。遊離3'-OH 基を有する新しい
ヌクレオチドが初期の切除されたヌクレオチドの位置に
とり込まれ、nickが3'方向に一つのヌクレオチド単位だ
けシフトされる。この3'シフトが既存の未標識ヌクレオ
チドの除去によりＤＮＡへの新しい標識されたヌクレオ
チドの連続的付加をもたらすであろう。次いでnick翻訳
されたポリヌクレオチドが分離方法、例えば、電気泳動
を使用して分析される。
【０１１２】別の例示のフラグメント分析方法は可変数
のタンデムリピート、またはVNTRに基いている。VNTRは
特別な配列の隣接多重コピーを含む二本鎖ＤＮＡの領域
であり、反復単位の数が可変である。VNTR遺伝子座の例
はpYNZ22、pMCT118 、及びApo B である。VNTR方法のサ
ブセットはミクロサテライトリピート、または短いタン
デムリピート(STR) 、即ち、短い（２−４塩基）反復配
列を特徴とするＤＮＡのタンデムリピートの検出に基く
方法である。ヒトにおける最も多い点在された反復ＤＮ
Ａファミリーの一つは(dC-dA)n-(dG-dT)n ジヌクレオチ
ドリピートファミリー（また(CA)n ジヌクレオチドリピ
ートファミリーと称される）である。これらはヒトゲノ
ム中の50,000〜100,000 程度の多い(CA)n リピート領域
であると考えられ、典型的にはブロック当たり15〜30の
リピートを有する。これらのリピートの多くは長さが多
形性であり、それ故、有益な遺伝子マーカーとして利用
できる。VNTR方法またはSTR 方法において、標識は色素
標識されたPCR プライマーを使用することによりポリヌ
クレオチドフラグメントに導入されることが好ましい。
別の例示のフラグメント分析方法はＤＮＡ配列決定であ
る。一般に、ＤＮＡ配列決定はオリゴヌクレオチドプラ
イマーの延長／終止反応を伴う。プライマーを延長する
のに使用されるデオキシヌクレオシドトリホスフェート
(dNTP)が反応混合物中に含まれる。また、延長されたプ
ライマーにとり込まれた時に、プライマーの更なる延長
を阻止する少なくとも一種のジデオキシヌクレオシドト
リホスフェート(ddNTP) が反応混合物中に含まれる。延
長反応が停止された後、異なるヌクレオシドの位置決め
を測定するために、生成される異なる終止生成物が分離
され、分析される。
【０１１３】蛍光ＤＮＡ配列決定は一般に二つのカテゴ
リー、“色素プライマー配列決定”と“色素ターミネー
ター配列決定”に分けられる。色素プライマー配列決定
において、蛍光色素は延長されるプライマーにとり込ま
れる。次いで４つの別々の延長／終止反応が平行して行
われ、夫々の延長反応は延長反応を終止するための異な
るジデオキシヌクレオシドトリホスフェート(ddNTP) を
含む。終止後に、反応生成物がゲル電気泳動により分離
され、分析される。例えば、Ansorge ら, Nucleic Acid
s Res. 15 4593-4602 (1987)を参照のこと。色素プライ
マー配列決定の一つの変化において、異なるプライマー
が４つの別々の延長／終止反応に使用され、夫々のプラ
イマーが異なるスペクトル的に分解可能な色素を含む。
終止後に、４つの延長／終止反応からの反応生成物が溜
められ、電気泳動により分離され、単一レーン中で検出
される。例えば、Smith ら,Nature 321 674-679 (1986)
を参照のこと。こうして、色素プライマー配列決定の
この変化において、スペクトル的に分解可能な色素の組
を含むプライマーを使用することにより、一つより多い
延長／終止反応からの生成物が同時に検出し得る。色素
ターミネーター配列決定において、蛍光色素はジデオキ
シヌクレオシドトリホスフェートの夫々に結合される。
次いで延長／終止反応が行われ、この場合、プライマー
は、標識されたジデオキシヌクレオシドトリホスフェー
トが延長されたプライマーにとり込まれてプライマーの
更なる延長を阻止するまで、デオキシヌクレオシドトリ
ホスフェートを使用して延長される。一旦終止される
と、夫々のジデオキシヌクレオシドトリホスフェートに
関する反応生成物が分離され、検出される。一実施態様
において、別々の延長／終止反応が４種のジデオキシヌ
クレオシドトリホスフェートの夫々について行われる。
別の実施態様において、単一の延長／終止反応が行わ
れ、これは４種のジデオキシヌクレオシドトリホスフェ
ートを含み、夫々が異なるスペクトル的に分解可能な蛍
光色素で標識されている。
【０１１４】こうして、本発明の一局面によれば、本発
明の一種以上のオリゴヌクレオチド試薬を使用して色素
プライマー配列決定を行う方法が提供される。この方法
によれば、延長された標識されたプライマーの混合物が
核酸配列をデオキシヌクレオシドトリホスフェート、少
なくとも一種のジデオキシヌクレオシドトリホスフェー
ト及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で蛍光標識されたオ
リゴヌクレオチドプライマーとハイブリッドを形成する
ことにより生成される。蛍光標識されたオリゴヌクレオ
チドプライマーは配列決定される核酸配列の一部に相補
性のオリゴヌクレオチド配列と、オリゴヌクレオチドに
結合されたエネルギー転移蛍光色素とを含む。その方法
によれば、ＤＮＡポリメラーゼは、ジデオキシヌクレオ
シドトリホスフェートがとり込まれて、これがプライマ
ーの延長を終止するまで、デオキシヌクレオシドトリホ
スフェートでプライマーを延長する。終止後、延長され
たプライマーの混合物が分離される。次いで核酸の配列
が、生成された延長されたプライマーの混合物を蛍光検
出することにより測定される。この方法の更に別の実施
態様において、４つの色素プライマー配列決定反応が行
われ、夫々のプライマー配列決定反応が異なる蛍光標識
されたオリゴヌクレオチドプライマーと異なるジデオキ
シヌクレオシドトリホスフェート(ddATP、ddCTP 、ddGT
P 及びddTTP)を含む。４つの色素プライマー配列決定反
応が行われた後、延長されたプライマーの得られる混合
物が溜められてもよい。次いで延長されたプライマーの
混合物が、例えば、電気泳動により分離され、核酸配列
の配列を決定するために４種の異なる蛍光標識されたオ
リゴヌクレオチドプライマーの夫々からの蛍光シグナル
が検出される。
【０１１５】本発明の更に別の局面によれば、本発明の
エネルギー転移色素で標識された一種以上のジデオキシ
ヌクレオシドトリホスフェートを使用して色素ターミネ
ーター配列決定を行う方法が提供される。この方法によ
れば、延長されたプライマーの混合物が、核酸配列をデ
オキシヌクレオシドトリホスフェート、少なくとも一種
の蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドトリホスフェ
ート及びＤＮＡポリメラーゼの存在下でオリゴヌクレオ
チドプライマーとハイブリッドを形成することにより生
成される。蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドトリ
ホスフェートは本発明のエネルギー転移蛍光色素で標識
されたジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを含
む。この方法によれば、ＤＮＡポリメラーゼは、標識さ
れたジデオキシヌクレオシドトリホスフェートが延長さ
れたプライマーにとり込まれるまでプライマーをデオキ
シヌクレオシドトリホスフェートで延長する。終止後、
延長されたプライマーの混合物が分離される。次いで核
酸配列の配列が延長されたプライマーに結合された蛍光
標識されたジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを
検出することにより決定される。この方法の更に別の実
施態様において、延長されたプライマーの混合物を生成
する工程が、核酸配列を４種の異なる蛍光標識されたジ
デオキシヌクレオシドトリホスフェート、即ち、蛍光標
識されたジデオキシシトシントリホスフェート、蛍光標
識されたジデオキシアデノシントリホスフェート、蛍光
標識されたジデオキシグアノシントリホスフェート、及
び蛍光標識されたジデオキシチミジントリホスフェート
とハイブリッドを形成することを含む。
【０１１６】上記フラグメント分析方法の夫々におい
て、標識されたオリゴヌクレオチドは電気泳動操作によ
り分離されることが好ましい。例えば、先に引用された
Gould及びMatthews、Rickwood及びHames,編集, Gel Ele
ctrophoresis of Nucleic Acids; A Practical Approac
h, (IRL Press Limitted, London, 1981)、またはOster
man, Methods of Protein and Nucleic Acid Research,
1 巻 Springer-Verlag, Berlin, 1984) を参照のこ
と。電気泳動マトリックスの型は約２〜20重量％の濃度
（重量対容積）を有する架橋または未架橋ポリアクリル
アミドである。ポリアクリルアミド濃度は約４〜８％で
あることが更に好ましい。好ましくは特にＤＮＡ配列決
定の状況下で、電気泳動マトリックスはストランド分離
剤または変性剤、例えば、尿素、ホルムアルデヒド等を
含む。このようなマトリックスをつくるための詳細な操
作がManiatisら, “98％のホルムアルデヒドまたは7M尿
素を含むポリアクリルアミドゲル中の低分子量ＤＮＡ及
びＲＮＡの分別", Methods inEnzymology, 65 299-305
(1980) 、Maniatisら, “ポリアクリルアミドゲル電気
泳動による小さい二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ分子の鎖長測
定", Biochemistry, 143787-3794 (1975)、Maniatisら,
分子クローニング：実験マニュアル(Cold Spring Harb
or Laboratory, New York, 1982), 179-185頁、及びABI
PRISM（登録商標） 377 DNA Sequencer User's Manua
l, Rev.A, 1995年１月, 2 章(p/n 903433, The Perkin-
Elmer Corporation, Foster City, CA) により示されて
おり、これらの夫々が参考として含まれる。特別な分離
に使用される最適のポリマー濃度、pH、温度、変性剤の
濃度等は、分離すべき核酸のサイズ範囲、それらの塩基
組成（それらが一本鎖または二本鎖であるかを問わな
い）、及び情報が電気泳動により探究されるクラスの性
質を含む、多くの因子に依存する。それ故、本発明の適
用は特別な分離の条件を最適化するために通常の予備試
験を必要とし得る。例えば、約20〜300 塩基の範囲のサ
イズを有するオリゴヌクレオチドが以下のマトリックス
中で本発明に従って分離され、検出された。トリス−ボ
レートEDTA緩衝液、pH8.3 中で生成された、19部対１部
のアクリルアミド対ビス−アクリルアミドからつくられ
た６％のポリアクリルアミド。
【０１１７】電気泳動分離後、色素−オリゴヌクレオチ
ド接合体が色素標識されたポリヌクレオチドからの蛍光
放出を測定することにより検出される。このような検出
を行うために、標識されたポリヌクレオチドが通常の手
段、例えば、強力水銀蒸気ランプ、レーザー等により照
射される。照射手段は488 〜550nm の波長の照射ビーム
を有するレーザーであることが好ましい。色素−ポリヌ
クレオチドはアルゴンイオンレーザーにより生じたレー
ザー光、特にアルゴンイオンレーザーの488 及び514nm
の放出線、またはネオジムソリッドステートYAG レーザ
ーの532 放出線により照射されることが更に好ましい。
これらの線で同時にレーザーとして使える幾つかのアル
ゴンイオンレーザーが市販されており、例えば、Cyonic
s,Ltd (Sunnyvale, Calif.) のモデル2001等が市販され
ている。次いで蛍光が感光性検出器、例えば、光電子増
倍管、充電されたカップリング装置等により検出され
る。
【０１１８】IV. エネルギー転移色素を含むキット また、本発明はエネルギー転移蛍光色素及び／または試
薬の組み合わせを有するキットに関する。一実施態様に
おいて、キットは本発明の少なくとも２種のスペクトル
的に分解可能なエネルギー転移色素を含む。このキット
において、エネルギー転移色素は、単一光源が色素を励
起するのに必要とされるように同じドナー色素を含むこ
とが好ましい。別の実施態様において、キットはジデオ
キシシトシントリホスフェート、ジデオキシアデノシン
トリホスフェート、ジデオキシグアノシントリホスフェ
ート、及びジデオキシチミジントリホスフェートを含
み、夫々のジデオキシヌクレオチドトリホスフェートが
本発明のエネルギー転移色素で標識される。一実施態様
において、夫々のエネルギー転移色素はその他のジデオ
キシヌクレオチドトリホスフェートに結合されたその他
のエネルギー転移色素からスペクトル的に分解可能であ
る。このキットにおいて、エネルギー転移色素は同じ第
一キサンテン色素を含むことが好ましい。更に別の実施
態様において、キットは少なくとも２種のオリゴヌクレ
オチドを含み、夫々のオリゴヌクレオチドが本発明のエ
ネルギー転移色素を含む。一実施態様において、夫々の
オリゴヌクレオチドはその他のオリゴヌクレオチドに結
合されたエネルギー転移色素からスペクトル的に分解可
能であるエネルギー転移色素を含む。別の実施態様にお
いて、キットは少なくとも４種のオリゴヌクレオチドを
含み、これらが夫々スペクトル的に分解可能であるエネ
ルギー転移色素を含む。エネルギー転移蛍光色素及びＤ
ＮＡ配列決定におけるそれらの使用が以下の実施例によ
り説明される。上記の目的及び利点以外の目的及び利点
がこれらの実施例から明らかになるであろう。
【０１１９】
【実施例】１．5TMR-B-CF の合成
【０１２０】
【化６６】
【０１２１】5-TMR NHS 及び４’−アミノメチル−５−
カルボキシフルオレセインから実施例1A-Cに記載された
反応順序に従って5TMR-B-CF を合成した。次いで5TMR-B
-CFを1Dに記載された反応順序に従って5TMR-B-CF-NHS
に変換し、その結果、色素をヌクレオシド、ヌクレオチ
ドまたはオリゴヌクレオチドプライマーにカップリング
することができた。 Ａ．5-TMR-B の合成
【０１２２】
【化６７】
【０１２３】４−アミノメチル安息香酸（３mg、19μモ
ル）、5-TMR NHS(5mg 、９μモル）及びトリエチルアミ
ン(20 μL)の混合物を1.5 mLのエッペンドルフ管中でジ
メチルホルムアミド(DMF、200 μL)中に懸濁させた。そ
の混合物を10分間にわたって60℃に加熱した。反応の進
行をジクロロメタン、メタノール及び酢酸の400/30/10
混合物で溶離してシリカゲルによる薄層クロマトグラフ
ィー(TLC) により監視した。不溶性４−アミノメチル安
息香酸を遠心分離により分離し、DMF 溶液を５％のHCl
(1mL) にデカントした。不溶性5TMR-Bを遠心分離により
分離し、５％のHCl (2x1mL) で洗浄し、真空遠心分離機
中で乾燥させた。生成物をDMF(200 μL)に溶解し、5TMR
-B-NHSを調製するのに使用した。 Ｂ．5-TMR-B-NHS の合成
【０１２４】
【化６８】
【０１２５】DMF(125 μL)中の5TMR-Bの溶液、ジイソプ
ロピルエチルアミン(10 μL)及びジスクシンイミジルカ
ーボネート(10mg)を1.5 mLのエッペンドルフ管中で合わ
せ、60℃に加熱した。反応の進行をジクロロメタン、メ
タノール及び酢酸の600/60/16 混合物で溶離してシリカ
ゲルによるTLC により監視した。５分後、反応は完結し
たことが明らかであった。その溶液を塩化メチレン（３
mL）中で希釈し、250mMの炭酸塩／重炭酸緩衝液（pH
９、4x1mL)で洗浄し、乾燥させ（Na2SO4）、真遠心分離
機で濃縮、乾燥させた。固体をDMF(100 μL)に溶解し
た。アリコートをpH9 の緩衝液中で希釈し、552nm にお
ける吸光度を測定することにより収率を測定した。50,0
00cm-1Ｍ-1の吸光率を使用して、5TMR-B-NHSの濃度は4.
8 mMであった。5TMR NHSからの収率は８％であった。 Ｃ．5-TMR-B-CFの合成
【０１２６】
【化６９】
【０１２７】5TMR-B-NHSの溶液（250 μL のDMF 中１μ
モル）を1.5 mLのエッペンドルフ管中で４’−アミノメ
チル−５−カルボキシフルオレセインの溶液(CF 、100
μLのDMSO中2.2 μモル）及びトリエチルアミン(20 μ
L)と合わせた。15％〜35％のアセトニトリル対0.1Mのト
リエチルアンモニウムアセテートの勾配溶離によりC8逆
相カラムを使用するHPLCにより反応を監視した。HPLC分
析は、5TMR-B-NHSが消費され、過剰の未反応のCFを残し
たことを示した。反応を５％のHCl (1mL) で希釈し、生
成物を遠心分離により分離し、未反応のCFを水相中に残
した。固体を５％のHCl (4x1mL) で洗浄し、真空遠心分
離機中で乾燥させ、DMF(300 μL)に吸収させた。収率は
定量的であった。 Ｄ．5-TMR-B-CF-NHSの合成
【０１２８】
【化７０】
【０１２９】5TMR-B-CF の溶液（100 μL のDMF 中0.6
μモル）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−
エチルカルボジイミド塩酸塩(DEC、2mg)及びＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド(4mg) を1.5 mLのエッペンドルフ管
中で合わせた。その混合物を素早く音波処理し、60℃に
加熱した。反応をジクロロメタン、メタノール及び酢酸
の600/60/16 混合物で溶離してシリカゲルによるTLC に
より監視した。反応は30分間で完結し、５％のHCl で希
釈した。生成物を遠心分離により分離し、真空遠心分離
機中で乾燥させた。活性化色素をDMF(20μL)に溶解し
た。 ２．5ROX-CF の合成
【０１３０】
【化７１】
【０１３１】5ROX NHSの溶液(100μL のDMSO中２μモ
ル）をCF(100μL のDMSO中２μモル）及びトリエチルア
ミン(10 μL)と混合した。20％〜40％のアセトニトリル
対0.1MのTEAAの勾配溶離によりC8逆相カラムによるHPLC
により反応を追跡した。反応液を５％のHCl (1mL) 中で
希釈し、生成物を遠心分離により回収し、５％のHCl (1
x1mL) で洗浄し、真空遠心分離機中で乾燥させた。生成
物をDMF(200 μL)に吸収させた。 ３．Cy5 の合成
【０１３２】
【化７２】
【０１３３】CFの溶液(20 μL のCMSO中0.4 μモル）及
びトリエチルアミン(2μL)をモノCy5 NHS(約0.3 μモ
ル）に添加した。10％〜30％のアセトニトリル対0.1Mの
TEAAの勾配溶離を使用してC8逆相カラムによるHPLCによ
り反応を追跡した。反応液を５％のHCl (1mL) 中で希釈
し、生成物を遠心分離により回収し、５％のHCl (1x1m
L) で洗浄し、真空遠心分離機中で乾燥させた。生成物
をDMF(100 μL)に吸収させた。 ４．エネルギー転移色素の蛍光強さの比較 以下の実施例は本発明の一連のエネルギー転移色素の蛍
光放出強さを比較する。5TMR、6TMR-CF 、5TMR-gly-CF
、5TMR-CF 、5TMR-B-CF 、5TMR-gly-5AMF 、5TMR-5AMF
及び5TMR-lys-5FAM の色素溶液を1xTBE/8M尿素中で測
定した。夫々の色素溶液は560nm で0.1 の光学密度を有
し、488nm で励起された。
【０１３４】
【化７３】
【０１３５】これらの色素の夫々の構造を表７に示す。
図２はこれらの色素の夫々の相対蛍光の棒グラフを示
す。図２からわかるように、リンカーが５環位でアクセ
プターに結合されているエネルギー転移色素（5TMR-CF
及び5TMR-B-CF)は、アクセプター色素それ自体またはア
クセプター色素が６環位で結合されている場合（6TMR-C
F)よりもかなり強い蛍光を示すことがわかった。また、
図２からわかるように、リンカーが式Ｒ1ＸC(O)Ｒ2（式
中、Ｒ2はベンゼンである）を有するエネルギー転移色
素（5TMR-B-CF)は、リンカーが式-CH2NHCO-(5TMR-CF)ま
たは-CH2NHCOCH2NHCO-(5TMR-gMF) を有する色素と比較
してかなり増強された蛍光を有することがわかった。ま
た、図２からわかるように、リンカーが５環位でドナー
及びアクセプターの両方に結合されているエネルギー転
移色素（5TMR-5AMF 及び5TMR-gly-5AMF)はかなりの蛍光
を有することがわかった。重要なことに、リシンリンカ
ーの使用はドナーとアクセプターの間の認められるエネ
ルギー転移をもたらさないことがわかった。
【０１３６】５．エネルギー転移色素を使用する色素プ
ライマー配列決定 この実施例において、5TMR-CF 標識されたオリゴヌクレ
オチド及び5TMR-B-CF標識されたオリゴヌクレオチドの
相対的明度を比較するために色素プライマー配列決定を
M13(配列番号１）について行った。この実施例におい
て、色素プライマー配列決定をABI PRISM （登録商標）
377 DNA Sequencer User's Manual, Rev.B, 1995年１
月, 2 章(p/n 402114, The Perkin-Elmer Corporation,
Foster City, CA) に従って行った。5TMR-CF 及び5TMR
-B-CF の夫々をM13-21プライマー（配列番号２）の5'末
端に結合した。夫々のプライマーの等モル溶液をM13(配
列番号１）と混合し、単一ジデオキシヌクレオチド混合
物(ddA/dNTP)及びTaq FSで配列決定した。5TMR-CF 標識
されたプライマー及び5TMR-B-CF 標識されたプライマー
を使用して検出されたオリゴヌクレオチドの得られる混
合物のプロットを図９に示す。図９からわかるように、
5TMR-B-CF で標識されたオリゴヌクレオチドは5TMR-CF
で標識されたオリゴヌクレオチドよりも明るい。また、
図９からわかるように、5TMR-B-CF で標識されたオリゴ
ヌクレオチドの移動度は5TMR-CF で標識されたオリゴヌ
クレオチドよりも約１ヌクレオチド遅かった。
【０１３７】６．４種の色素を使用する色素プライマー
配列決定 実施例５に記載されたM13-21プライマー（配列番号２）
に結合された４種の色素の組を使用して、色素プライマ
ー配列決定をM13(配列番号１）について行った。図１０
は配列決定から生成された色素標識されたオリゴヌクレ
オチドの４色プロットである。シトシンに関するピーク
は５−カルボキシ−R110の蛍光に相当する。アデノシン
に関するピークは５−カルボキシ−R6G の蛍光に相当す
る。グアノシンに関するピークはTMR-B-CFの蛍光に相当
する。チミジンに関するピークはROX-CFの蛍光に相当す
る。図１０からわかるように、色素標識されたオリゴヌ
クレオチドの夫々がかなりの蛍光強さを示す。加えて、
異なる色素標識されたオリゴヌクレオチドは、一連のピ
ークの良好な分解が得られる程に充分に同様の移動度を
示す。 ７．6-CFB-DTMR-2-NHSの合成
【０１３８】
【化７４】
【０１３９】実施例1A-Bに記載された反応順序に従って
6-CFB-DTMR-2をDTMR-2及び6-CFB から合成した。次いで
6-CFB-DTMR-2を1Cに記載された反応順序に従って6-CFB-
DTMR-2-NHSに変換し、その結果、色素をヌクレオシド、
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーにカ
ップリングすることができた。 Ａ．DTMR-2-NHSの合成
【０１４０】
【化７５】
【０１４１】DMF 中のDTMR-2の溶液、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミド及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）
−３−エチルカルボジイミド塩酸塩をエッペンドルフ管
中で合わせ、60℃に加熱した。反応の進行をシリカゲル
によるTLC により監視した。反応が完結したことが明ら
かになった後、その溶液を塩化メチレン中で希釈し、25
0 mMの炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（pH９、4x1 mL) で洗浄
し、次いでHCl 溶液（５％、1x1 mL) で洗浄し、乾燥さ
せ（Na2SO4）、真空遠心分離機で濃縮、乾燥せた。 Ｂ．6-CF-B-DTMR-2 の合成
【０１４２】
【化７６】
【０１４３】ジメチルスルホキシド中の6-CFB の溶液
（100 μL 、11mM) をジメチルホルムアミド中のDTMR-2
スクシドイミジルエステルの溶液（100 μL 、22mM) 及
びトリエチルアミン(20 μL)と合わせた。その反応液を
塩酸（５％、１mL) の溶液に添加し、固体を遠心分離に
より分離した。赤色固体を炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（25
0 mM、pH９、100 μL)に溶解し、希HCl で再度沈殿させ
た。固体を真空遠心分離機中で乾燥させ、ジメチルホル
ムアミド(200μL)に溶解した。色素溶液の濃度を、アリ
コートを40％のアセトニトリル／0.1Mのトリエチルアン
モニウムアセテート緩衝液（pH７）中で希釈することに
より測定した。フルオレセインについて80,000cm-1m -1
の吸光率を仮定して、6-CF-B-DTMR-2 溶液は４mM（収率
70％）であることがわかった。 Ｃ．6-CF-B-DTMR-NHS の合成
【０１４４】
【化７７】
【０１４５】ジメチルホルムアミド中の6-CF-B-DTMR-2
の溶液(200μL 、４mM）にＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド(10mg)及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３
−エチルカルボジイミド塩酸塩（５μg)を添加した。追
加のＮ−ヒドロキシスクシンイミド(10mg)を添加した。
反応の進行を600:60:16 の混合物中のジクロロメタン：
メタノール：酢酸で溶離してシリカゲルによる薄層クロ
マトグラフィーにより監視した。反応が完結した時、希
HCl （５％、１mL）を添加し、生成物を遠心分離により
分離した。固体を真空遠心分離機中で乾燥させ、ジメチ
ルホルムアミド(100μL)に溶解した。色素溶液の濃度
を、アリコートを40％のアセトニトリル／0.1Mのトリエ
チルアンモニウムアセテート緩衝液（pH７）中で希釈す
ることにより測定した。フルオレセインについて80,000
cm-1m -1の吸光率を仮定して、6-CF-B-DTMR-NHS 溶液は
5.4mM(収率68％）であることがわかった。
【０１４６】８．色素の蛍光強さの比較 以下の実施例は相当するアクセプター色素に対する本発
明の一連のエネルギー転移色素の蛍光放出強さを比較す
る。この実施例によれば、夫々の色素を5'末端でアミノ
ヘキシル結合により21プライマー配列(5'-TGTAAAACGACG
GCCAGT)(配列番号１）に結合した。180,000 cm-1Ｍ-1の
吸光率を仮定して、オリゴヌクレオチドを260nm におけ
る吸光度に基いて定量した。スペクトルを488nm 励起に
より8M尿素、1Xトリス／ボレート／EDTA(TBE) 緩衝液中
0.4 μM のプライマー濃度で得た。図11A は5-CFB-DR11
0-2 及びDR110-2 の重なったスペクトルを示す。図11B
は5-CFB-DR6G-2及びDR6G-2の重なったスペクトルを示
す。図12C は6-CFB-DTMR-2及びDTMR-2の重なったスペク
トルを示す。図12Dは6-CFB-DROX-2及びDROX-2の重なっ
たスペクトルを示す。これらの色素の構造を表１に示
す。図11A 〜図12D からわかるように、エネルギー転移
色素はアクセプター色素それ自体よりもかなり強い蛍光
を示すことがわかった。図13は４種の色素標識されたオ
リゴヌクレオチドの基準化された蛍光放出スペクトルを
示す。スペクトルを488nm 励起により8M尿素、1Xトリス
／ボレート／EDTA(TBE) 緩衝液中0.4 μM のプライマー
濃度で得た。図13に示された色素は5-CFB-DR110-2 、5-
CFB-DR6G-2、6-CFB-DTMR-2、及び6-CFB-DROX-2を含む。
図13からわかるように、全ての４種のエネルギー転移色
素は互いに対し良く分解される。
【０１４７】９．エネルギー転移色素を使用する色素プ
ライマー配列決定 この実施例において、5-CF-TMR-2標識されたプライマ
ー、5-CF-B-TMR-2標識されたプライマー、6-CF-B-DTMR-
2 標識されたプライマー及びDTMR-2標識されたプライマ
ーを使用して、色素プライマー配列決定をM13(配列番号
２）について行った。この実施例において、色素プライ
マー配列決定をABI PRISM TM 377 DNA Sequencer Use
r's Manual, Rev.B, 1995年１月, 2 章(p/n 402114, Th
e Perkin-Elmer Corporation, Foster City, CA) に従
って行った。色素をM13-21プライマー（配列番号３）の
5'末端に結合した。夫々のプライマーの等モル溶液をM1
3(配列番号２）と混合し、単一ジデオキシヌクレオチド
混合(ddA/dNTP)及びTaq FSで配列決定した。5-CF-TMR-2
標識されたプライマー及び5-CF-B-TMR-2標識されたプラ
イマーを使用して検出されたオリゴヌクレオチドの得ら
れる混合物のプロットを図14に示す。この図からわかる
ように、5-CF-B-TMR-2は5-CF-TMR-2よりもかなり強いシ
グナルを示し、5-CF-B-TMR-2中に使用されたリンカーに
より与えられた蛍光増強を示す。6-CF-B-DTMR-2 標識さ
れたプライマー及びDTMR-2標識されたプライマーを使用
して検出されたオリゴヌクレオチドの得られる混合物の
プロットを図15に示す。この図からわかるように、6-CF
-B-DTMR-2 はDTMR-2よりもかなり強いシグナルを示し、
そのエネルギー転移色素により与えられた蛍光増強を示
す。
【０１４８】10. ４種の色素を使用する色素プライマー
配列決定 実施例５に記載されたM13-21プライマー（配列番号３）
に結合された４種の色素の組を使用して、色素プライマ
ー配列決定をM13(配列番号２）について行った。図16及
び17は配列決定から生成された色素標識されたオリゴヌ
クレオチドの４色プロットである。シトシンに関するピ
ークは5-CFB-DR110-2 の蛍光に相当する。アデノシンに
関するピークは6-CFB-DR6g-2の蛍光に相当する。グアノ
シンに関するピークは5-CFB-DTMR-2の蛍光に相当する。
チミジンに関するピークは5-CFB-DROX-2の蛍光に相当す
る。図16及び17からわかるように、色素標識されたオリ
ゴヌクレオチドの夫々がかなりの蛍光強さを示す。加え
て、異なる色素標識されたオリゴヌクレオチドは、一連
のピークの良好な分解が得られる程に充分に同様の移動
度を示す。本発明の好ましい実施態様の以上の記載は説
明及び記載の目的で示された。排他的であること、また
は本発明を開示された正確な形態に限定することは意図
されていない。明らかに、多くの改良及び変化が当業者
に明らかであり、本発明の範囲内に入ることが意図され
ている。
【０１４９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> PE Corporation <120> Eergy Transfer Dye <130> X1K0180 <150> US 08/642330 <151> 1996-05-03 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1217 <212> DNA <213> M13 <400> 1 gccaagcttg catgcctgca ggtcgactct agaggatccc cgggtaccga gctcgaattc 60 gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa 120 catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac 180 attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 240 ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc agggtggttt 300 ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg ccctgagaga 360 gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt ttgatggtgg 420 ttccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag cccgagatag ggttgagtgt 480 tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg 540 aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcacccaaat caagtttttt 600 ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc 660 ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg 720 cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct 780 taatgcgccg ctacagggcg cgtactatgg ttgctttgac gagcacgtat aacgtgcttt 840 cctcgttgga atcagagcgg gagctaaaca ggaggccgat taaagggatt ttagacagga 900 acggtacgcc agaatcttga gaagtgtttt tataatcagt gaggccaccg agtaaaagag 960 tctgtccatc acgcaaatta accgttgtag caatacttct ttgattagta ataacatcac 1020 ttgcctgagt agaagaactc aaactatcgg ccttgctggt aatatccaga acaatattac 1080 cgccagccat tgcaacagga aaaacgctca tggaaatacc tacattttga cgctcaatcg 1140 tctgaaatgg attatttaca ttggcagatt caccagtcac acgaccagta ataaaaggga 1200 cattctggcc aacagag 1217 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> die primer <400> 2 tgtaaaacga cggccagt 18
【図面の簡単な説明】
【図１】活性化されたＮ−ヒドロキシスクシンイミジル
(NHS) エステル（これは次いでアミノヘキシル−オリゴ
マーと反応させられて色素標識されたオリゴヌクレオチ
ドプライマーを生成する）へのエネルギー転移色素のカ
ルボキシ置換基の修飾を示す。
【図２】本発明の一連のエネルギー転移色素の蛍光放出
強さをその他のエネルギー転移色素及びアクセプター色
素単独と比較する。
【図３】本発明のエネルギー転移色素中に使用し得る
４，７−ジクロロローダミン色素化合物の幾つかの特に
好ましい実施態様を示す。
【図４】本発明のエネルギー転移色素中に使用し得る
４，７−ジクロロローダミン色素化合物の幾つかの特に
好ましい実施態様を示す。
【図５】本発明の４，７−ジクロロローダミン色素（置
換基Ｘ1 がカルボキシレート以外であり得る）の調製の
好ましい一般化された合成スキームを示す。
【図６】本発明の４，７−ジクロロローダミン色素（置
換基Ｘ1 がカルボキシレートである）の調製の好ましい
一般化された合成スキームを示す。
【図７】互いにスペクトル的に分解可能である４種の色
素（３−カルボキシ−R110、５−カルボキシ−R6G 、5T
MR-B-CF 及び5ROX-CF)の組を示す。
【図８】互いにスペクトル的に分解可能である４種の色
素（３−カルボキシ−R110、５−カルボキシ−R6G 、5R
OX-CF 及びCy5-CF) の組を示す。
【図９】5TMR-CF 標識されたプライマー及び5TMR-B-CF
標識されたプライマーを使用する色素プライマー配列決
定中に生成された標識されたオリゴヌクレオチドの混合
物のプロットである。
【図１０】３−カルボキシ−R110、５−カルボキシ−R6
G 、5TMR-CF 及び5TMR-B-CF を含む４色素の組を使用す
る色素プライマー配列決定の４色プロットである。
【図１１】6-CFB-DR110-2 及びDR110-2 の重なったスペ
クトル並びに5-CFB-DR6G-2及びDR6G-2の重なったスペク
トルを示す。
【図１２】6-CFB-DTMR-2及びDTMR-2の重なったスペクト
ル並びに6-CFB-DROX-2及びDROX-2の重なったスペクトル
を示す。
【図１３】互いにスペクトル的に分解可能である４種の
色素（5-CFB-DR110-2 、5CFB-DR6G-2 、6-CFB-DTMR-2、
及び6-CFB-DROX-2) の組を示す。
【図１４】6-CFB-DTMR-2標識されたプライマー及びDTMR
-2標識されたプライマーを使用する色素プライマー配列
決定中に生成された標識されたオリゴヌクレオチドの混
合物のプロットである。
【図１５】5-CF-TMR-2標識されたプライマー及び5-CF-B
-TMR-2標識されたプライマーを使用する色素プライマー
配列決定中に生成された標識されたオリゴヌクレオチド
の混合物のプロットである。
【図１６】5-CFB-DR110-2 、6-CFB-DR6g-2、5-CFB-DTMR
-2、及び5-CFB-DROX-2を含む４種の色素の組を使用する
色素プライマー配列決定の４色プロットである。
【図１７】5-CFB-DR110-2 、6-CFB-DR6g-2、5-CFB-DTMR
-2、及び5-CFB-DROX-2を含む４種の色素の組を使用する
色素プライマー配列決定の４色プロットである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ｃ０９Ｂ 11/28 Ｃ０９Ｂ 11/28 Ｋ 23/00 Ｌ 23/00 Ｃ０９Ｋ 11/06 Ｃ０９Ｋ 11/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 サンドラ エル スパージョン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94403 サン マテオ ロス プラドス ストリート 3361 (72)発明者 バーネット ローゼンブルーム アメリカ合衆国 カリフォルニア州 95118 サン ホセ エステール アベ ニュー 1521 (56)参考文献 特開 平６−66802（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−5170（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−313529（ＪＰ，Ａ) 特表 平８−505776（ＪＰ，Ａ) 特表 平８−503994（ＪＰ，Ａ) 特表 平９−508525（ＪＰ，Ａ) 特表 平10−511987（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98 C12Q 1/68

Claims (29)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 鋳型核酸及びヌクレオチドトリホスフェ
    ートの存在下でオリゴヌクレオチドプライマーを酵素的
    に延長する工程を含む蛍光標識されたオリゴヌクレオチ
    ドの形成方法であって、オリゴヌクレオチドプライマー
    又は少なくとも一つのヌクレオチドトリホスフェートが
    以下を含む蛍光エネルギー転移色素を含む方法：第一波
    長の光を吸収し、応答して励起エネルギーを放出するこ
    とができるフルオレセイン又はローダミンドナー色素；
    ドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収し、
    応答して第二波長で蛍光を発することができるフルオレ
    セイン又はローダミンアクセプター色素；及びドナー色
    素の４'−、５−又は６−の環の位置をアクセプター色
    素の５−又は６−の環の位置に結合するリンカーであっ
    て、ドナー又はアクセプター色素の一方又は両方が４，
    ７−ジクロロローダミン色素であるリンカー。
  2. 【請求項２】 オリゴヌクレオチドプライマーがエネル
    ギー転移色素を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 少なくとも一つのヌクレオチドトリホス
    フェートがエネルギー転移色素を含む、請求項１に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】 酵素的な延長をポリメラーゼで行う、請
    求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 以下の工程を含む核酸の分析方法：複数
    のサイズが異なる蛍光標識され延長されたオリゴヌクレ
    オチドプライマーを形成する工程；蛍光標識され延長さ
    れたオリゴヌクレオチドプライマーをそのサイズに基づ
    いて分離する工程；及び蛍光標識され延長されたプライ
    マーをその蛍光に基づいて検出する工程、ここで少なく
    とも一つの蛍光標識され延長されたオリゴヌクレオチド
    プライマーの蛍光標識が以下を含むエネルギー転移色素
    である：第一波長の光を吸収し、応答して励起エネルギ
    ーを放出することができるフルオレセイン又はローダミ
    ンドナー色素；ドナー色素により放出された励起エネル
    ギーを吸収し、応答して第二波長で蛍光を発することが
    できるフルオレセイン又はローダミンアクセプター色
    素；及びドナー色素の４'−、５−又は６−の環の位置
    をアクセプター色素の５−又は６−の環の位置に結合す
    るリンカーであって、ドナー又はアクセプター色素の一
    方又は両方が４，７−ジクロロローダミン色素であるリ
    ンカー。
  6. 【請求項６】 複数のサイズが異なる蛍光標識され延長
    されたオリゴヌクレオチドプライマーを、鋳型核酸、ヌ
    クレオチドトリホスフェート及び少なくとも一つの終止
    ヌクレオチドの存在下でエネルギー転移色素を含むオリ
    ゴヌクレオチドプライマーを酵素的に延長することによ
    り形成する、請求項５に記載の方法であって、標識され
    延長されたプライマーに終止ヌクレオチドが取り込まれ
    るまで標識されたプライマーが延長される方法。
  7. 【請求項７】 複数のサイズが異なる蛍光標識され延長
    されたオリゴヌクレオチドプライマーを、鋳型核酸、ヌ
    クレオチドトリホスフェート及び少なくとも一つのエネ
    ルギー転移色素を含む終止ヌクレオチドの存在下でオリ
    ゴヌクレオチドプライマーを酵素的に延長することによ
    り形成する、請求項５に記載の方法であって、延長され
    たプライマーに標識された終止ヌクレオチドが取り込ま
    れるまでプライマーが延長される方法。
  8. 【請求項８】 それぞれ異なる鋳型ヌクレオチドにおい
    てプライマーの延長を終止する４種の異なる終止ヌクレ
    オチドの存在下で酵素的な延長を行う、請求項７に記載
    の方法であって、それぞれの異なる終止ヌクレオチドは
    異なる、スペクトル的に分解可能な蛍光色素を含み、そ
    のうちの少なくとも一つはエネルギー転移色素である方
    法。
  9. 【請求項９】 異なる終止ヌクレオチドがエネルギー転
    移色素、ターミネーター当たり一つの異なるスペクトル
    的に分解可能なエネルギー転移色素を含む、請求項８に
    記載の方法。
  10. 【請求項１０】 それぞれのエネルギー転移色素が同一
    のドナー色素を含む、請求項７又は８に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 酵素的な延長をポリメラーゼで行う、
    請求項５に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 ヌクレオチドトリホスフェートがｄＡ
    ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの混合物を含
    む、請求項１又は５に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 終止ヌクレオチドをｄｄＡＴＰ、ｄｄ
    ＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る群から選択
    する、請求項５の方法。
  14. 【請求項１４】 核酸の配列を決定する工程をさらに含
    む、請求項５に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ドナー色素とアクセプター色素を結合
    するリンカーがアルケン、ジエン、アルキン、少なくと
    も一つの不飽和結合を有する５員環又は６員環及び縮合
    環から成る群から選択する官能基を含む、請求項１〜１
    ４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 官能基が以下から成る群から選択する
    ５員環又は６員環である、請求項１ないし１４に記載の
    方法：シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタ
    ジエン、シクロヘキサジエン、フラン、チオフラン、ピ
    ロール、イソピロール、イソアゾール、ピラゾール、イ
    ソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジ
    ン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、オキサジン、
    インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドール及
    びナフタレン。
  17. 【請求項１７】 アクセプター色素の放出最大がドナー
    色素の吸収最大より少なくとも１００nm大きい、請求項
    １ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 アクセプター色素の放出最大が６００
    nmより大きい、請求項１ないし１４のいずれか１項に記
    載の方法。
  19. 【請求項１９】 ドナー色素を以下から成る群から選択
    する、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方
    法：カルボキシフルオレセイン色素、４，７−ジクロロ
    フルオレセイン色素、非対称ベンゾキサンテン色素、ロ
    ーダミン色素、４，７−ジクロロローダミン色素、カル
    ボキシローダミン色素、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメ
    チルカルボキシローダミン色素、カルボキシＲ１１０お
    よび及びカルボキシＲ６Ｇ。
  20. 【請求項２０】 アクセプター色素を以下から成る群か
    ら選択する、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載
    の方法：４，７−ジクロロフルオレセイン色素、非対称
    ベンゾキサンテン色素、ローダミン色素、４，７−ジク
    ロロローダミン色素、カルボキシローダミン色素、Ｎ，
    Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルカルボキシローダミン色
    素、カルボキシＲ１１０色素、カルボキシＲ６Ｇ色素お
    よびカルボキシ−Ｘ−ローダミン色素。
  21. 【請求項２１】 アクセプター色素が４，７−ジクロロ
    ローダミン色素である、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 ドナー色素をＤＲ１１０−２、ＤＲ６
    Ｇ−２、ＤＴＭＲおよびＤＲＯＸから成る群から選択す
    る、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 ドナー色素がフルオレセイン色素又は
    ４，７−ジクロロフルオレセイン色素である、請求項２
    １に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 ドナー色素の４'−の環の位置がアク
    セプター色素の５−または６−の環の位置に結合してい
    る、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 ドナー色素の５−または６−の環の位
    置がアクセプター色素の５−または６−の環の位置に結
    合している、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載
    の方法。
  26. 【請求項２６】 アクセプター色素が４，７−ジクロロ
    ローダミン色素である、請求項１または５に記載の方
    法。
  27. 【請求項２７】 ドナー色素をＤＲ１１０−２、ＤＲ６
    Ｇ−２、ＤＴＭＲおよびＤＲＯＸから成る群から選択す
    る、請求項１または５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 ドナー色素がフルオレセイン色素又は
    ４，７−ジクロロフルオレセイン色素である、請求項１
    または５に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 ドナー色素の５−または６−の環の位
    置がアクセプター色素の５−または６−の環の位置に結
    合している、請求項１または５に記載の方法。
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