ES2606012T3

ES2606012T3 - Hibridación in situ con sondas PolyTag

Info

Publication number: ES2606012T3
Application number: ES11748106.9T
Authority: ES
Inventors: Michael Farrell; Zeyu Jiang; Jr. William A. Day
Original assignee: Ventana Medical Systems Inc
Current assignee: Ventana Medical Systems Inc
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2011-02-25
Publication date: 2017-03-17
Anticipated expiration: 2031-02-25
Also published as: AU2011220578A1; JP2013520962A; EP2539355A4; DK2539355T3; JP5726917B2; AU2011220578B2; JP2015163072A; CA2787487C; CA2787487A1; WO2011106583A1; US20170029877A1; EP2539355B1; EP2539355A1; JP6149063B2; US20120301886A1

Abstract

Un método para detectar una primera secuencia de ácido nucleico diana celular in situ en una muestra tisular que comprende: poner en contacto dicha muestra tisular con una primera molécula de ácido nucleico que comprende una parte de sonda diana que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria de dicha primera secuencia de ácido nucleico diana celular y una parte de diana de detección que comprende una pluralidad de primeras secuencias diana de detección que son complementarias de al menos una secuencia de ácido de sonda de detección y no complementarias de dicha secuencia de ácido nucleico diana, en condiciones en las que dicha parte de sonda diana de dicha primera molécula de ácido nucleico hibrida directamente con dicha secuencia de ácido nucleico diana celular; poner en contacto dicha primera molécula de ácido nucleico con una pluralidad de segundas moléculas de ácido nucleico comprendiendo cada una, una parte de sonda de detección complementaria de dichas secuencias diana de detección de dicha primera molécula de ácido nucleico y una parte de resto detectable que comprende al menos un primer resto detectable bien 5' o bien 3' de dicha parte de sonda de detección, en el que dicho al menos un primer resto detectable se incorpora en la molécula de ácido nucleico, en condiciones tales que dicha parte de sonda de detección de dicha segunda molécula de ácido nucleico hibride con dichas primeras secuencias diana de detección de dicha primera molécula de ácido nucleico; y detectar dicho al menos un primer resto detectable.

Description

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específicas. Anticuerpos con diferentes especificidades (es decir diferentes sitios de combinación para diferentes antígenos) tienen diferentes CDR. Aunque son las CDR las que varían entre anticuerpos, solamente un número limitado de posiciones de aminoácidos dentro de las CDR están implicados directamente en la unión a antígeno. Estas posiciones dentro de las CDR se denominan restos determinantes de especificidad (SDR).

La “unión o unión estable” se refiere a la asociación entre dos sustancias o moléculas, tal como la hibridación de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una región de unión) con otra (o consigo misma) (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico diana). Una molécula de ácido nucleico se une o se une de forma estable con una molécula de ácido nucleico diana si una cantidad suficiente de la molécula de ácido nucleico forma pares de bases o se hibrida con su molécula de ácido nucleico diana para permitir la detección de esa unión.

Un “región de unión” es un segmento o parte de una molécula de ácido nucleico diana que es única de la molécula diana, y en algunos ejemplos está libre o sustancialmente libre de secuencias de ácido nucleico repetitivas (u otras indeseadas). La secuencia de ácido nucleico de una región de unión y su molécula de ácido nucleico diana correspondiente tienen suficiente complementariedad de secuencia de ácido nucleico de modo que cuando las dos se incuban en condiciones de hibridación apropiadas, las dos moléculas se hibridarán para formar un complejo detectable. Una molécula de ácido nucleico diana puede contener múltiples regiones de unión diferentes, tales como al menos 10, al menos 50, al menos 100 o al menos 1000 regiones de unión únicas. En ejemplos particulares, una región de unión es típicamente de varios cientos a varios miles de pares de bases de longitud. Sin embargo, en algunos ejemplos una región de unión es más corta, tal como de 50 a 200 pares de bases de longitud. Cuando se obtienen regiones de unión de una secuencia de ácido nucleico diana, la secuencia diana puede obtenerse en su forma nativa en una célula, tal como una célula de mamífero, o en una forma clonada (por ejemplo, en un vector).

Se dice que una molécula de ácido nucleico es “complementaria” con otra molécula de ácido nucleico si las dos moléculas comparten un número suficiente de nucleótidos complementarios para formar una doble cadena o triple cadena estable cuando las cadenas se unen (se hibridan) entre sí, por ejemplo formando pares de bases de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inverso. Se produce unión estable cuando una molécula de ácido nucleico permanece unida de forma detectable con una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico diana genómica) en las condiciones requeridas.

La complementariedad es el grado en el que bases en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, sonda de ácido nucleico diana) forman pares de bases con las bases en una segunda molécula de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico diana genómica). La complementariedad se describe convenientemente por el porcentaje, es decir, la proporción de nucleótidos que forman pares de bases entre dos moléculas o dentro de una región específica o dominio de dos moléculas.

En la presente divulgación, “complementariedad suficiente” significa que existe un número suficiente de pares de bases entre una molécula de ácido nucleico o región de la misma y una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico diana genómica) para conseguir unión detectable. Se proporciona un tratamiento exhaustivo de las consideraciones cualitativas y cuantitativas en el establecimiento de condiciones de unión en Beltz et al. Methods Enzymol. 100: 266-285, 1983, y en Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Un “algoritmo implementado por ordenador” es un algoritmo o programa (conjunto de código ejecutable en un medio leíble por ordenador) que se realiza o se ejecuta por un dispositivo informático a la orden de un usuario. En el contexto de la presente divulgación, pueden usarse algoritmos implementados por ordenador para facilitar (por ejemplo, “automatizar”) la selección de secuencias polinucleotídicas con características particulares, tales como identificación de secuencias de ácido nucleico repetitivas (u otras indeseadas, por ejemplo, productoras de fondo) o regiones de unión únicas de una secuencia de ácido nucleico diana. Típicamente, un usuario inicia la ejecución del algoritmo introduciendo un comando, y ajustando uno o más criterios de selección, en un ordenador, que es capaz de acceder a una base de datos de secuencias. La base de datos de secuencias puede estar incluida dentro del medio de almacenamiento del ordenador o puede almacenarse de forma remota y accederse a ella mediante una conexión entre el ordenador y un medio de almacenamiento en una localización cercana o remota mediante una intranet o Internet. Después del inicio del algoritmo, el algoritmo o programa se ejecuta por el ordenador, por ejemplo, para seleccionar una o más secuencias polinucleotídicas que satisfagan los criterios de selección. Más habitualmente, las secuencias polinucleotídicas seleccionadas se presentan después (por ejemplo, en una pantalla)

o se producen (por ejemplo, en formato impreso o en un medio leíble por ordenador).

Los términos “conjugar, unir, enlazar o ligar” se refieren a ligar covalentemente una molécula con otra molécula para realizar una molécula mayor. Por ejemplo, formando con dos polipéptidos una molécula polipeptídica contigua, o uniendo covalentemente un hapteno u otra molécula con un polipéptido, tal como un anticuerpo scFv. En el contexto específico, los términos incluyen la referencia a unión con una molécula de unión específica tal como un anticuerpo con un resto generador de señal, tal como un punto cuántico. El enlace puede ser por medio químico o recombinante. “Medio químico” se refiere a una reacción entre el resto de anticuerpo y la molécula efectora de modo que se forme un enlace covalente entre las dos moléculas para formar una molécula.

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de la sonda de detección con las secuencias diana de detección sustancialmente en las mismas condiciones, por ejemplo, temperatura, tiempo, tampón y concentraciones salinas.

Las sondas de ácido nucleico diana pueden sintetizarse por cualquier método conocido. En algunas realizaciones, las secuencias que codifican las sondas de ácido nucleico diana se clonan en un vector de expresión plasmídico. La sonda nucleica diana se transcribe preferentemente del vector con una ARN polimerasa para proporcionar una molécula de ARN que codifica la sonda de ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, la sonda de ácido nucleico diana se sintetiza químicamente, por ejemplo, usando análogos de fosforamidita. En algunas realizaciones, se sintetizan sondas de ADN por propagación, purificación y digestión de restricción de ADN plasmídico para proporcionar una molécula de ADN que codifica la sonda de ácido nucleico diana. El ADN bicatenario puede fundirse posteriormente en cadenas individuales para su uso en protocolos de hibridación. En algunas realizaciones, las sondas de ácido nucleico diana se sintetizan por PCR asimétrica. En algunas realizaciones, un cebador podría, por ejemplo, ser un análogo de ácido nucleico (por ejemplo, LNA). Este proceso genera una sonda con la parte específica diana que contiene nucleótidos bloqueados y la parte diana de detección que se preparan a partir de dNTP convencionales. En algunas realizaciones, el cebador que contienen LNA contiene una biotina para facilitar la purificación de la cadena deseada.

2. Sondas de detección y agentes de unión específicos

Se desvela en el presente documento una sonda de detección. En algunas realizaciones, la sonda de detección es una molécula de ácido nucleico que comprende una parte de sonda de detección y una parte de resto detectable. En algunas realizaciones, la parte de resto detectable de la sonda de detección comprende una pluralidad de restos detectables que son detectables con un agente de unión específico.

En algunas realizaciones, la parte de sonda de detección comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria de la secuencia diana de detección como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de la parte de sonda de detección hibrida con una secuencia diana de detección en condiciones adecuadas para hibridación, tales como condiciones adecuadas para hibridación in situ, transferencia de Southern o transferencia de Northern. Preferentemente, la parte de sonda de detección comprende cualquier ácido nucleico adecuado, tal como ARN, ADN, LNA, PNA o combinaciones de los mismos, y puede comprender nucleótidos convencionales tales como un ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, así como análogos de nucleótidos. El LNA y PNA son dos ejemplos de análogos de ácidos nucleicos que forman complejos de hibridación que son más estables (es decir, tienen una Tm aumentada) que los formados entre ADN y ADN o ADN y ARN. Los análogos de LNA y PNA pueden combinarse con nucleósidos de ADN y ARN tradicionales durante la síntesis química para proporcionar moléculas de ácido nucleico híbridas que pueden usarse como sondas. El uso de los análogos de LNA y PNA permite la modificación de parámetros de hibridación tales como la Tm del complejo de hibridación. Esto permite el diseño de sondas de detección que hibridan con las secuencias diana de detección de las sondas de ácido nucleico diana en condiciones que son iguales o similares a las condiciones requeridas para hibridación de la parte de sonda diana con la secuencia de ácido nucleico diana.

La longitud de la parte de sonda de detección puede variar, pero se diseña para complementariedad con una secuencia diana de detección de una sonda de ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, las secuencias diana de detección son mayores de aproximadamente 10, 20, 50 o 75 nucleótidos hasta aproximadamente 100 o 200 nucleótidos de longitud. La parte de sonda detección se diseña preferentemente usando las consideraciones tales como las descritas para el diseño de la parte de sonda diana. En algunas realizaciones, la parte de sonda de detección se diseña para hibridar eficaz y/o específicamente con una secuencia diana de detección. En algunas realizaciones, la composición de base de la parte de sonda detección (y secuencias diana de detección correspondientes) se selecciona de modo que la hibridación de la sonda de ácido nucleico diana con la secuencia de ácido nucleico diana y la hibridación de la sonda de detección con las secuencias diana de detección se produzca sustancialmente en las mismas condiciones, por ejemplo, temperatura, tiempo, tampón y concentraciones salinas.

En algunas realizaciones la parte de resto detectable comprende uno o más restos detectables. En algunas realizaciones, los restos detectables son detectables directamente, mientras que en otras realizaciones, los restos detectables son detectables indirectamente. En algunas realizaciones, los restos detectables se incorporan en la sonda de detección. En algunas realizaciones, los restos detectables son restos generadores de señal que producen una señal detectable. En algunas realizaciones, el resto detectable se conjuga con nucleótidos o análogos de nucleótidos usados en la síntesis de la sonda de detección. Por ejemplo, se usan nucleósido fosforamiditas que se conjugan con un resto detectable deseado para sintetizar una sonda de detección mediante síntesis química como se conoce en la técnica. En algunas realizaciones, la parte del resto detectable comprende una pluralidad de restos detectables. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la parte de resto detectable comprende de aproximadamente 5 a aproximadamente 50, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20, de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 o de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 restos detectables. Se reconocerá que la combinación de múltiples secuencias diana de detección en la sonda de ácido nucleico diana permite la hibridación de múltiples sondas de detección con cada sonda de ácido nucleico diana. Cuando cada sonda de detección comprende una pluralidad de restos detectables, se produce amplificación de la señal de detección.

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En algunas realizaciones, el resto detectable se detecta indirectamente. En algunas realizaciones, el resto detectable es un primer miembro de un par de moléculas de unión que incluye primer y segundo miembros. En estas realizaciones, se incorporan nucleótidos conjugados con un primer miembro de un par de unión en la sonda de detección, preferentemente mediante el uso de nucleósido fosforamiditas conjugadas con el primer miembro del par de unión. Un agente de unión específico que comprende el segundo miembro del par de unión (es decir, un resto de unión específico) conjugado con un resto generador de señal se usa después para detectar la sonda de detección mediante unión con el primer miembro del par de unión. Los ejemplos de pares de moléculas de unión adecuados incluyen, pero sin limitación, avidina y biotina y hapteno y anticuerpos anti-hapteno. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la parte de resto detectable de la sonda de detección comprende una pluralidad de nucleótidos biotinilados. Estos nucleótidos biotinilados se detectan mediante el uso de compuestos que comprenden avidina conjugada con un resto detectable directamente. En otras realizaciones, la parte de resto detectable de la sonda de detección comprende una pluralidad de nucleótidos haptenilados. Estos nucleótidos haptenilados se detectan mediante el uso de compuestos que comprenden anticuerpos anti-hapteno conjugados con un resto detectable directamente.

En consecuencia, en algunas realizaciones, se desvelan en el presente documento sondas de detección que comprenden uno o más nucleótidos que se conjugan con el primer miembro de un par de moléculas de unión. En algunas realizaciones, el primer miembro del par de moléculas de unión es un hapteno. En algunas realizaciones, la parte de resto detectable de la sonda de detección es una molécula de ácido nucleico que incorpora dNTP unidos covalentemente con moléculas de hapteno (tales como compuesto nitro-aromático (por ejemplo, dinitrofelino (DNP)), biotina, fluoresceína, digoxigenina, etc.). Se conocen bien en la técnica métodos para conjugar haptenos y otros marcadores con dNTP (por ejemplo, para facilitar la incorporación en sondas marcadas). Para ejemplos de procedimientos, véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.º 5.258.507, 4.772.691, 5.328.824 y 4.711.955. De hecho, están disponibles en el mercado numerosos dNTP marcados, por ejemplo de Invitrogen Detection Technologies (Molecular Probes, Eugene, Oreg.). Un marcador puede unirse directa o indirectamente con un dNTP en cualquier localización del dNTP, tal como un fosfato (por ejemplo, ,  o  fosfato) o un azúcar.

Puede usarse una diversidad de haptenos en la parte de resto detectable de la sonda de detección. Dichos haptenos incluyen, pero sin limitación, pirazoles, particularmente nitropirazoles; compuestos de nitrofenilo; benzofurazanos; triterpenos; ureas y tioureas, particularmente fenil ureas, y aún más particularmente fenil tioureas; rotenona y derivados de rotenona, también denominados en el presente documento rotenoides; oxazol y tiazoles, particularmente oxazol y tiazol sulfonamidas; cumarina y derivados de cumarina; ciclolignanos, ejemplificados por Podofilotoxina y derivados de Podofilotoxina; y combinaciones de los mismos. Los ejemplos específicos de haptenos incluyen, pero sin limitación, 2,4-Dinitrofenilo (DNP), Biotina, derivados de Fluoresceína (FITC, TAMRA, Texas Red, etc.), Digoxigenina (DIG), 5-Nitro-3-pirozolocarbamida (nitropirazol, NP), 4,5,-Dimetoxi-2-nitrocinamida (nitrocinamida, NCA), 2-(3,4-Dimetoxifenil)-quinolina-4-carbamida (fenilquinolona, DPQ), 2,1,3-Benzoxadiazol-5carbamida (benzofurazano, BF), 3-Hidroxi-2-quinoxalincarbamida (hidroxiquinoxalina, HQ), 4(Dimetilamino)azobenceno-4’-sulfonamida (DABSYL), Rotenona isoxazolina (Rot), (E)-2-(2-(2-oxo-2,3-dihidro-1Hbenzo[b][1,4]diazepin-4-il)fenozi)acetamida (benzodiazepina, BD), ácido 7-(dietilamino)-2-oxo-2H-cromeno-3carboxílico (cumarina 343, CDO), 2-Acetamido-4-metil-5-tiazolsulfonamida (tiazolsulfonamida, TS) y p-Metoxifenilpirazopodofilamida (Podo). Estos haptenos y su uso en sondas se describen en más detalle en las solicitudes del mismo propietario que la presente Publicaciones de Patente de Estados Unidos n.º 20080305497, 20080268462 y 20080057513.

En realizaciones en las que la parte de resto detectable de la sonda de detección comprende haptenos, el segundo miembro del par de moléculas de unión es preferentemente una molécula que se une con el hapteno tal como una molécula de unión a antígeno. Los ejemplos de moléculas de unión a antígeno adecuadas incluyen, pero sin limitación, anticuerpos, inmunoglobulinas o moléculas de tipo inmunoglobulina (incluyendo como ejemplo y sin limitación, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM), fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fab’, fragmentos Fab’-SH y fragmentos Fab como se conocen en la técnica, fragmentos de anticuerpos recombinantes (tales como fragmentos sFv, fragmentos dsFv, fragmentos sFv biespecíficos, fragmentos dsFv, fragmentos F(ab’)2, proteínas Fv monocatenarias (“scFv”), proteínas Fv estabilizadas por disulfuro (“dsFv”), diacuerpos y triacuerpos (como se conoce en la técnica) y anticuerpos de camélidos (véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.º 6.015.695; 6.005.079-5.874.541; 5.840.526; 5.800.988; y 5.759.808). En realizaciones preferidas, un resto detectable que genera una señal detectable se une, de forma covalente o de otro modo, con la molécula de unión a antígeno. Los ejemplos de segundos miembros del par de unión adecuados incluyen, pero sin limitación, anticuerpos anti-DNP, anti-biotina, anti-FITC, anti-DIG, anti-NP, anti-NCA, anti-DPQ, anti-BF, anti-HQ, anti-DABSYL, anti-Rot, anti-BD, anti-CDO, anti-TS y anti-Podo que se conjugan con un resto detectable que genera una señal detectable. En realizaciones adicionales, el segundo miembro del par de moléculas de unión es un anticuerpo primario antihapteno que no comprende un resto detectable. En estas realizaciones, se utiliza un anti-anticuerpo secundario (tal como un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón) que comprende un resto detectable que genera una señal para generar una señal detectable.

Como se ha descrito anteriormente, la sonda de detección puede ser detectable directamente o detectable indirectamente. En algunas realizaciones de detección directa, la sonda de detección comprende restos detectables (por ejemplo, restos generadores de señal) que generan una señal detectable, mientras que en algunas

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realizaciones de detección indirecta, se utiliza un agente de unión específico que comprende un miembro de un par de moléculas de unión (tal como un anticuerpo secundario) que se conjuga con un resto generador de señal que genera una señal detectable. En estas realizaciones, puede incorporarse una diversidad de restos generadores de señal que generan una señal detectable en la sonda de detección o conjugarse con el miembro del par de unión.

En realizaciones preferidas, el resto generador de señal puede detectarse por cualquier mecanismo conocido o aún no descubierto incluyendo absorción, emisión y/o dispersión de un fotón (incluyendo radiofrecuencia, frecuencia de microondas, frecuencia infrarroja, frecuencia visible y fotones de frecuencia ultravioleta). Los restos generadores de señal incluyen moléculas y materiales coloreados, fluorescentes, fosforescentes y luminiscentes, catalizadores (tales como como enzimas) que convierten una sustancia en otra sustancia para proporcionar una diferencia detectable (tal como convirtiendo una sustancia incolora en una sustancia coloreada o viceversa, o produciendo un precipitado

o aumentando la turbidez de la muestra) y moléculas o materiales paramagnéticos y magnéticos.

Los ejemplos particulares de restos generadores de señal incluyen moléculas fluorescentes (o fluorocromos). Se conocen por los expertos en la materia numerosos fluorocromos, y pueden seleccionarse, por ejemplo de Invitrogen, por ejemplo, véase, The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Invitrogen Detection Technologies, Molecular Probes, Eugene, Oreg.). Los ejemplos de fluoróforos particulares que pueden unirse (por ejemplo, conjugarse químicamente) con una molécula de ácido nucleico o proteína tal como una molécula de unión a antígeno incluyen, pero sin limitación, ácido 4-acetamido-4’-isotiocianatostilben-2,2’disulfónico, acridina y derivados tales como acridina e isotiocianato de acridina, ácido 5-(2’-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS), 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato (Lucifer Yellow VS), N-(4-anilino-1-naftil)maleimida, antranilamida, Brilliant Yellow, cumarina y derivados tales como cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120), 7-amino-4-trifluorometilcumarina (Coumaran 151); cianosina; 4’,6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5’,5’’dibromopirogalol-sulfoneftaleína (Bromopirogalol Red); 7-dietilamino-3-(4’-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; dietilentriamin pentaacetato; ácido 4,4’-diisotiocianatodihidro-estilben-2,2’-disulfónico; ácido 4,4’diisotiocianatostilben-2,2’-disulfónico; cloruro de 5-[dimetilamino]naftaleno-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo); ácido 4-(4’-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL); 4-dimetilaminofenilazofenil-4’-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados tales como eosina e isotiocianato de eosina; eritrosina y derivados tales como eritrosina B e isoticionato de eritrosina; etidio; fluoresceína y derivados tales como 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2il)aminofluoresceína (DTAF), 2’7’-dimetoxi-4’5’-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC) y QFITC (XRITC); 2’,7’-difluorofluoresceína (OREGON GREEN™); fluorescamina; IR144; IR1446; isoticianato de Malachite Green; 4-metilumbeliferona; orto cresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; Fenol Red; B-ficoeritrina; oftaldialdehído; pireno y derivados tales como pireno, butirato de pireno y butirato de succinimidil 1-pireno; Reactive Red 4 (Cibacron™ Brilliant Red 3B-A); rodamina y derivados tales como 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirrodamina (R6G), cloruro de lisamina rodamina B sulfonilo, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina X isotiocianato, verde rodamina, sulforrodamina B, sulforrodamina 101 y derivado de cloruro de sulfonilo de sulforrodamina 101 (Texas Red); N,N,N’,N’-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA); tetrametil rodamina; isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC); riboflavina; ácido rosólico y derivados de quelado de terbio.

Otros fluoróforos adecuados incluyen quelados de europio sensible a tiol que emiten a aproximadamente 617 nm (Heyduk y Heyduk, Analyt. Biochem. 248: 216-27, 1997; J. Biol. Chem. 274: 3315-22, 1999), así como GFP, Lissamine.TM., dietilaminocumarina, clorotriazinilo de fluoresceína, naftofluoresceína, 4,7-diclororrodamina y xanteno (como se describe en la Patente de Estados Unidos n.º 5.800.996 de Lee et al.) y derivados de los mismos. También pueden usarse otros fluoróforos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, los disponibles de Invitrogen Detection Technologies, Molecular Probes (Eugene, Oreg.) e incluyen la serie ALEXA FLUOR™ de colorantes (por ejemplo, como se describe en las Patentes de Estados Unidos n.º 5.696.157, 6.130.101 y 6.716.979), la serie BODIPY de colorantes (colorantes de difluoruro de dipirrometenoboro, por ejemplo, como se describe en las Patentes de Estados Unidos n.º 4.774.339, 5.187.288, 5.248.782, 5.274.113, 5.338.854, 5.451.663 y 5.433.896), Cascade Blue (un derivado sensible a amina del pireno sulfonado descrito en la Patente de Estados Unidos n.º 5.132.432) y Marina Blue (Patente de Estados Unidos n.º 5.830.912).

Además de los fluorocromos descritos anteriormente, un marcador fluorescente puede ser una nanopartícula fluorescente, tal como un nanocristal semiconductor, por ejemplo, un QUATUM DOT™ (obtenido, por ejemplo, de QuantumDot Corp, Invitrogen Nanocrystal Technologies, Eugene, Oreg.; véase también, Patentes de Estados Unidos n.º 6.815.064, 6.682.596 y 6.649.138). Los nanocristales semiconductores son partículas microscópicas que tienen propiedades ópticas y/o eléctricas dependientes del tamaño. Cuando se iluminan nanocristales semiconductores con una fuente de energía primaria, se produce una emisión secundaria de energía de una frecuencia que corresponde al intervalo de banda del material semiconductor usado en el nanocristal semiconductor. Esta emisión puede detectarse como luz coloreada de una longitud de onda o fluorescencia específica. Se describen nanocristales semiconductores con diferentes características espectrales, por ejemplo en la Patente de Estados Unidos n.º 6.602.671. Los nanocristales semiconductores que pueden acoplarse con una diversidad de moléculas biológicas (incluyen dNTP y/o ácidos nucleicos) o sustratos por técnicas descritas, por ejemplo, en Bruchez et al. (1998) Science 281: 2013-6, Chan et al. (1998) Science 281: 2016-8 y Patente de Estados Unidos n.º 6.274.323.

Se desvela la formación de nanocristales semiconductores de diversas composiciones, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos n.º 6.927.069; 6.914.256; 6.855.202; 6.709.929; 6.689.338; 6.500.622; 6.306.736; 6.225.198;

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Pueden emplearse numerosos reactivos y esquemas de detección junto con procedimientos de FISH, CISH y SISH para mejorar la sensibilidad, resolución u otras propiedades deseables. Como se ha analizado anteriormente, pueden detectarse ópticamente de forma directa sondas de detección marcadas con fluoróforos (incluyendo colorantes fluorescentes y QUANTUM DOTS™) cuando se realiza FISH. Como alternativa, la sonda de detección puede marcarse con una molécula no fluorescente, tal como un hapteno (tal como los siguientes ejemplos no limitantes: biotina, digoxigenina, DNP y diversos oxazoles, pirrazoles, tiazoles, nitroarilos, benzofurazanos, triterpenos, ureas, tioureas, rotenonas, cumarina, compuestos basados en cumarina, Podofilotoxina, compuestos basados en Podofilotoxina y combinaciones de los mismos), ligando u otro resto detectable de forma indirecta. Las sondas de detección marcadas con dichas moléculas no fluorescentes (y las secuencias de ácido nucleico diana con las que se unen) pueden después detectarse poniendo en contacto la muestra (por ejemplo, la muestra celular o tisular con la que se une la sonda) con un reactivo de detección marcado, tal como un anticuerpo (o receptor, u otro compañero de unión específico) específico para el hapteno o ligando elegido. El reactivo de detección puede marcarse con un fluoróforo (por ejemplo, QUANTUM DOT™) o con otro resto detectable de forma indirecta, o puede ponerse en contacto con uno o más agentes de unión específicos adicionales (por ejemplo, anticuerpos secundarios

o específicos), que a su vez pueden marcarse con un fluoróforo. Opcionalmente, el marcador detectable se une directamente con el anticuerpo, receptor (u otro agente de unión específico). Como alternativa, el marcador detectable se une con el agente de unión mediante un enlazador, tal como un enlazador de tiol de hidrazida, un enlazador de polietilenglicol o cualquier otro resto de unión flexible con reactividades comparables. Por ejemplo, un agente de unión específico, tal como un anticuerpo, un receptor (u otro anti-ligando), avidina o similares puede modificarse covalentemente con un fluoróforo (u otro marcador) mediante un enlazador de polialquilenglicol heterobifuncional tal como un enlazador de polietilenglicol (PEG) heterobifuncional. Un enlazador heterobifuncional combina dos grupos reactivos diferentes seleccionados, por ejemplo, de un grupo carbonil-reactivo, un grupo aminoreactivo, un grupo tiol-reactivo y un grupo fotorreactivo, el primero de los cuales se une con el marcador y el segundo de los cuales se une con el agente de unión específico.

En otros ejemplos, la sonda de detección, o agente de unión específico (tal como un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo primario, receptor u otro agente de unión) comprende una enzima que es capaz de convertir una composición fluorogénica o cromogénica en una señal detectable fluorescente, coloreada o detectable de otro modo (por ejemplo, como en deposición de partículas metálicas detectables en SISH). Como se ha indicado anteriormente, la enzima puede unirse directa o indirectamente mediante un enlazador con la sonda o el reactivo de detección relevante. Se describen reactivos (por ejemplo, reactivos de unión) y químicas (por ejemplo, químicas de enlazador y unión) adecuados en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos n.º 2006/0246524; 2006/0246523, y Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos número 2007011715.

Se apreciará por los expertos en la materia que seleccionando apropiadamente sondas de detección marcadas y/o pares de unión marcados, pueden producirse esquemas de detección múltiples para facilitar la detección de múltiples secuencias de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico diana genómicas) en un único ensayo (por ejemplo, en una única muestra celular o tisular o en más de una muestra celular o tisular). Por ejemplo, una primera sonda de detección que corresponde a una primera sonda de ácido nucleico diana puede marcarse con un primer hapteno, tal como biotina, mientras que una segunda sonda de detección que corresponde a una segunda secuencia de ácido nucleico diana puede marcarse con un segundo hapteno, tal como DNP. Después de exposición de la muestra a los conjuntos de sonda, las sondas unidas pueden detectarse poniendo en contacto la muestra con un primer agente de unión específico (en este caso avidina marcada con un primer fluoróforo, por ejemplo, un primer QUANTUM DOT™ espectralmente definido, por ejemplo, que emita a 585 nm) y un segundo agente de unión específico (en este caso un anticuerpo anti-DNP, o fragmento de anticuerpo, marcado con un segundo fluoróforo (por ejemplo, un segundo QUANTUM DOT™ espectralmente definido, por ejemplo, que emita a 705 nm). Pueden añadirse pares de agentes de unión/sondas adicionales al esquema de detección múltiple usando otros fluoróforos espectralmente definidos. Pueden preverse numerosas variaciones directas e indirectas (una etapa, dos etapas o más), todas las cuales son adecuadas en el contexto de las sondas y ensayos desvelados.

Los microscopios de fluorescencia convencionales son una herramienta económica para la detección de reactivos y sondas que incorporan compuestos fluorescentes, tales como bioconjugados de puntos cuánticos. Ya que los conjugados de puntos cuánticos son virtualmente fotoestables, puede tomarse tiempo con el microscopio para encontrar regiones de interés y centrar adecuadamente en las muestras. Los conjugados de puntos cuánticos son útiles siempre que se requiera emisión fotoestable brillante y son particularmente útiles en aplicaciones multicolor cuando solamente está disponible una fuente/un filtro de excitación y se requiere cruzamiento mínimo entre los colores.

D. Dianas

Una molécula de ácido nucleico diana puede ser cualquier ácido nucleico seleccionado, tal como ADN o ARN. En realizaciones particulares, la secuencia diana es una secuencia diana genómica o subsecuencia genómica, por ejemplo de un genoma eucariota, tal como un genoma humano. En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana es ARN citoplasmático. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico diana se selecciona de un patógeno, tal como un virus, bacteria o parásito intracelular, tal como de un genoma viral. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico diana es una secuencia genómica, tal como una secuencia eucariota (por ejemplo, de mamífero) o

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3.: SEQ ID NO: 9

4.: SEQ ID NO: 10

5.: SEQ ID NO: 11

6.: SEQ ID NO: 12

7.: SEQ ID NO: 13

8.: SEQ ID NO: 14

9.: SEQ ID NO: 15

10.: SEQ ID NO: 16

11.: SEQ ID NO: 17

12.: SEQ ID NO: 18

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Donde n = 56; es decir, 56 repeticiones del polytag. Sondas de ácido nucleico diana de ARN específicas para ARN ribosómico 18S humano:

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SEQ ID NO: 19

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SEQ ID NO: 20

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SEQ ID NO: 21

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Donde n = 40; es decir, 40 repeticiones del polytag.

15 Se sintetizaron oligonucleótidos de detección en un Sintetizador de Oligonucleótidos Mermade usando fosforamiditas convencionales y protocolos proporcionados por el fabricante. Los haptenos, indicados por R, se introdujeron en una fosforamidita abásica que contenía el hapteno deseado. La sonda de detección Sophia se marcó con DNP (Dinitrofenol) y se usó con un anticuerpo anti-DNP acoplado a Qdots que emitían a 585 nM. La sonda de detección Raquel se marcó con TS (Tiazol Sulfonamida) y se usó con un anticuerpo anti-TS acoplado a Qdots que

20 emitían a 655 nM. La sonda de detección Qingxia se marcó con DC (Dietil Cumarina) y se usó con un anticuerpo anti-DC acoplado a Qdots que emitían a 605 nM. La sonda de detección Eva se marcó con BF (Benzofurazano) y se usó con un anticuerpo anti-BZ acoplado a Qdots que emitían a 525 nM.

Sophie:

25 SEQ ID NO: 22 Sophie 5: RTATTTTRTATTTTRTATTTTRTATTTTRTAGAAGAGCACCTTCATGGTGGTCAGTGCGTCCTGCTGATG

30 SEQ ID NO: 23 Sophie 10:

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SEQ ID NO: 24 Sophie 15:

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40 Raquel:

SEQ ID NO: 25 Raquel 5:

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SEQ ID NO: 26 Raquel 10:

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25

Raquel 15:

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QingXia:

SEQ ID NO: 28 QingXia 5:

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SEQ ID NO: 29 QingXia 10:

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SEQ ID NO: 30 QingXia 15:

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Eva: SEQ ID NO: 31

25 Eva 5: RTATTTTRTATTTTRTATTTTRTATTTTRCCATGGGTGTCGTCTGGAGCGATTAAGCGTTACTGCGGA

SEQ ID NO: 32 Eva 10: 30

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SEQ ID NO: 33 Eva 15:

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Gina:

SEQ ID NO: 34 Gina 5:

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SEQ ID NO: 35 Gina 10:

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26

SEQ ID NO: 36 Gina

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5 Secuencias de polytag cortas adecuadas para su uso con sondas de detección de LNA o PNA:

SEQ ID NO: 37 R25_810: AGAAGTATCGTTCCGATCTAACGCG

10 SEQ ID NO: 38 R25_998: ACGCTATTACGATTACGACGTGCGA

SEQ ID NO: 39 R25_1486: TACGATCGCATCGAGTCGCAGATAT

SEQ ID NO: 40 R25_1426: CGCACGCATAGTTAGTCGGATATAC 15 SEQ ID NO: 41 R30_587: CTAGCTCCGATCCGTGATAACGTGC

SEQ ID NO: 42 R30_927: ATGTTACGACCGGCGATCTTATACG

20 SEQ ID NO: 43 R30_1: (GTACATCCTCCGGTTGCGAATATAGCGAAC)

Secuencias adecuadas para su uso en sondas de detección de LNA marcadas con hapteno:

SEQ ID NO: 44 SSophia 1 CTAGATCTCTCGAGACATGC 25 SEQ ID NO: 45 SSophia 2 TTCTAGATCTCTCGAGACATGCACA

EJEMPLO 5 DETECCIÓN CON UNA SONDA POLYTAG DE ADN MONOCATENARIO

30 A) Construcción de sonda PolyTag de ADN monocatenario

Este ejemplo describe la aplicación del sistema PolyTag para detectar diana de ácido nucleico en una célula o tejido. Se sintetizó químicamente una repetición directa de cinco copias de una secuencia única (secuencia KK5) que no tiene homología de secuencia significativa con el genoma humano. El PolyTag KK se clonó en el vector plasmídico

35 puc 19, y la secuencia del clon se verificó por secuenciación. Se construyó una versión de repetición directa de 10 copias (KK10) duplicando KK5 con técnicas de biología molecular convencionales.

El gen de PTEN humano se seleccionó como el gen de interés, y solamente se seleccionaron secuencias intrónicas para diseño de cebadores de PCR y amplificación. Se amplificaron treinta y seis fragmentos de ADN, todos de 40 aproximadamente 200 pares de base de longitud con cebadores diseñados (las secuencias de cebadores y secuencias de amplicón de PCR correspondientes se enumeran posteriormente). Se añadió un grupo fosfato al extremo 5’ de fragmentos de ADN con polinucleótido quinasa T4, y después se purificaron los fragmentos de ADN del gel de agarosa. Los fragmentos de PCR PTEN se ligaron con la secuencia de KK5 o KK10 linealizada con enzimas de restricción SmaI con ADN ligasa T4. La sonda de PolyTag de PTEN de ADN monocatenario se preparó

45 mediante: 1) con los productos de ligamiento como molde, amplificación de PCR de fragmentos de PTEN con secuencia de KK5 o KK10 unidos entre sí con cebador directo específico de PTEN (usado previamente para generar el fragmento de PCR de PTEN) más un cebador fosforilado 5’ común que es complementario de la secuencia de KK (KK5Rp); 2) tratamiento con exonucleasa Lambda de sonda PolyTag de ADN monocatenario generada por fragmentos de PCR para el PTEN, porque la enzima degrada preferentemente cadena de ADN con grupo fosfato 5’.

50 B) Ejemplos de uso de sonda de ADNmc PolyTag para detección de ácido nucleico diana de interés.

En este ejemplo, la sonda de ADNmc PolyTag de PTEN (la sonda) se usó para detectar su diana de célula humana en portaobjetos tisulares incluidos en parafina; se usaron 30 de 36 fragmentos de PCR de PTEN (número 1-30 en el 55 listado de secuencias de PCR de PTEN) en este ejemplo. El tejido se desparafinizó, se hidrató y se prehibridó. Se llevó a cabo hibridación en 45 ºC durante 6 horas y no se usó ADN de bloqueo. Se realizó lavado post-hibridación de sonda con SSC 2x a 72 ºC durante 8 minutos y se repitió un total de tres veces. Los procedimientos para detección de KK, hibridación de oligo y lavado son: 1) desnaturalizar a 55 ºC durante 8 minutos; 2) hibridación a 45 ºC durante 1 hora; 3) lavado con SSC 2x tres veces a 45 ºC. La señal de detección con SISH fue como se ha publicado. Las 60 sondas tanto PolyTag de cinco copias como PolyTag de diez copias proporcionaron señales claras y fuertes. Véase Figura 5a para resultados de cinco copias y Figura 5b para resultados de diez copias. El procedimiento de detección

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>PTEN-PCR18 (SEQ ID NO: 67)

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>PTEN-PCR19 (SEQ ID NO: 68)

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>PTEN-PCR20 (SEQ ID NO: 69)

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>PTEN-PCR21 (SEQ ID NO: 70)

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>PTEN-PCR22 (SEQ ID NO: 71)

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>PTEN-PCR23 (SEQ ID NO: 72)

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Claims

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