JP5038712B2 - 試料中の分析物を測定するための結合成分を発現するウイルスの使用 - Google Patents
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Description
1)プレート方式
滅菌蒸留水中のB.セレウス胞子(1×108/ml)の懸濁液を含む試料(50μl)を、ブロックしたELISAプレート(ImmulonマイクロタイターELISAプレート)の各々のウエルに加え、次にこれを37℃の炉に一晩入れて、胞子をプレート上で乾燥させた。
94℃、0秒間(融解)、
62℃、30秒間(アニーリング段階)、
72℃、30秒間(伸長段階)。
検出アッセイとして使用するために、試料を、ブロックした抗体被覆ELISAプレートに添加し、37℃で5−60分間インキュベートする。
この実施態様では、アッセイ標的の性質に依存して、液体試料を0.2又は0.45ミクロンのフィルターに通し、次にフィルターを洗浄する。標的分析物、例えば細菌胞子は、フィルター上に保持される。続いて、アッセイ標的に特異的なscFvを発現する繊維状ファージの懸濁液をフィルターに通し、再びフィルターを洗浄する。次いで、フィルター上の標的に結合したファージを、前述したようにPCRによって検出することができる。
107B.セレウス胞子/ml 50μlをdH2O中で10倍に希釈し、Immulon 2 ELISAプレートに添加して、胞子を37℃で一晩、プレート上で乾燥させた。これは、胞子に関するアッセイで起こり得る、分析物が固定された抗体に結合している状況を反映するように、胞子をプレート上に固定した。
Claims (27)
- 試料中の分析物を検出する方法であって、分析物を含むことが疑われる試料を、(a)分析物に結合する結合試薬か又は(b)前記分析物もしくはその類似体を含む結合試薬かのいずれかを表面上に固定して有する表面と、および前記分析物に競合して前記分析物か又は前記結合試薬かのいずれかに結合する結合成分を発現し提示するウイルスと接触させること、前記表面を前記試料から分離すること、ならびに前記表面上の前記ウイルス内に存在する核酸配列の存在を検出し、それを試料中の分析物の存在または不在と関連付けすることを含み、前記結合試薬又は前記結合成分の少なくとも1つが前記分析物に特異的であり、ここにおいて、
(A)前記固定された結合試薬および前記結合成分の両方が、前記結合試薬と前記分析物と前記ウイルスとを含む複合体が前記表面から前記試料を分離した後前記表面上に保持されるように、前記分析物に結合し、および前記表面上のウイルス核酸の存在を定量ポリメラーゼ連鎖反応を用いて検出し、それによって前記試料中の分析物の存在を指示する;または
(B)前記固定された結合試薬が、前記結合成分が前記分析物か又は前記結合試薬かのいずれかに結合して前記試料中の分析物の存在が前記結合成分の前記結合試薬への結合をブロックするように、前記分析物またはその類似体を含み、それによって結合試薬に結合できるウイルスの量の低下が試料中の分析物の存在を指示する;または
(C)前記結合試薬が、前記分析物および前記結合成分が前記表面上の利用可能な部位につき競合するように、前記分析物とおよびウイルス上の分析成分とにも結合し、それによって結合試薬に結合できるウイルスの量の低下が試料中の分析物の存在を指示するものであるか、
のいずれかである、試料中の分析物を検出する方法。 - 前記固定された結合試薬および前記結合成分の両方が、前記結合試薬と前記分析物と前記ウイルスとを含む複合体が前記表面から前記試料を分離した後前記表面上に保持されるように、前記分析物に結合し、それによって前記表面上のウイルス核酸の存在が前記試料中の分析物の存在を指示する、請求項1に記載の方法。
- 前記固定された結合試薬が、前記結合成分が前記分析物か又は前記結合試薬かのいずれかに結合して前記試料中の分析物の存在が前記結合成分の前記結合試薬への結合をブロックするように、前記分析物またはその類似体を含み、それによって結合試薬に結合できるウイルスの量の低下が試料中の分析物の存在を指示する、請求項1に記載の方法。
- 前記結合試薬が、前記分析物および前記結合成分が前記表面上の利用可能な部位につき競合するように、前記分析物とおよびウイルス上の分析成分とにも結合し、それによって結合試薬に結合できるウイルスの量の低下が試料中の分析物の存在を指示する、請求項1に記載の方法。
- 前記結合試薬が特異的結合試薬である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記表面がELISAプレート若しくはウエルの表面、磁気ビーズ又は膜である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 結合試薬で占められていない表面上の部位がブロックされる、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- i)存在する分析物が前記固定された結合試薬に結合することを確実にするのに十分な期間、試料を前記表面と共にインキュベートする段階、
ii)残存する試料を表面から除去し、次いで表面を洗浄して非結合分析物を除去する段階、
iii)前記表面をウイルスの懸濁液と接触させ、ウイルスが表面上の分析物と結合するのに十分な期間インキュベートする段階、
iv)ウイルス懸濁液を除去し、表面を洗浄する段階、及び
v)表面上のウイルスの核酸を検出する段階
を順次実施する、請求項2に記載の方法。 - 前記ウイルス核酸を工程(v)の前に前記表面から遊離させる、請求項8に記載の方法。
- 前記ウイルスが、前記分析物又は分析物についての特異的結合パートナーのいずれかに特異的に結合する特異的結合成分を発現するように形質転換された組換えファージである、請求項1に記載の方法。
- 前記特異的結合パートナーが、抗体の単鎖可変領域フラグメント(scFV)である、請求項10に記載の方法。
- 前記ウイルスが多重特異性混合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 各々が個々のウイルスに特有である、多数の核酸配列の検出を実施する、請求項12に記載の方法。
- 前記核酸配列の存在が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応を、増幅産物が検出可能なシグナルを生成するように実施する、請求項14に記載の方法。
- 前記シグナルが可視シグナルである、請求項15に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応を、DNA結合試薬、又は蛍光標識で標識したプライマー若しくはプローブの存在下に実施する、請求項15に記載の方法。
- 前記DNA結合試薬がインターカレート染料である、請求項17に記載の方法。
- 検出したウイルスの量を定量し、これを試料中の分析物の量に関連付ける、請求項1に記載の方法。
- ウイルス核酸を、前記方法において使用する特定ウイルスに特有の核酸配列を増幅することによって検出する、請求項1に記載の使用。
- 前記ウイルスがマーカー配列で形質転換された組換えウイルスであり、この配列が増幅される配列である、請求項20に記載の方法。
- 2つ以上のウイルスの特有配列を検出する、請求項20に記載の方法。
- 2つ以上のウイルスを前記方法において使用し、続く融点分析によりどのウイルスがアッセイの間に結合したかを判定する、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 試料中の複数分析物の検出方法であって、それぞれのウイルスが分析物又はその類似体若しくは分析物についての結合成分と複合体を形成するように、及びこの複合体が試料中の分析物の存在又は不在に依存して表面に結合するか又は結合しないように、前記試料を、それぞれが結合成分を発現して維持するウイルスの多重特異性混合物に接触させること、増幅反応を用いてこの表面上のそれぞれのウイルスの特徴的配列の存在又は不在を検出すること、及びこれを試料中のそれぞれの分析物の存在又は不在に関係付けること、及びこの表面上のウイルスまたは組換えウイルスに共通するウイルス性核酸の存在又は不在を検出することを含む、試料中の複数分析物を検出する方法。
- 固体表面上に固定された、(a)分析物に結合する結合試薬か又は(b)前記分析物もしくはその類似体を含む結合試薬かのいずれかを有する固体、前記分析物に競合して前記結合試薬に結合する特異的結合成分を発現するように形質転換されたウイルス、ならびに前記ウイルスの核酸を増幅し、および検出するための定量ポリメラーゼ連鎖反応を実施できる試薬を含む、試料中の分析物の存在を検出するためのキット。
- 2つ以上の種類の組換えウイルスを含む、請求項25に記載のキット。
- インターカレート染料をさらに含む、請求項25または26のいずれか一項に記載のキット。
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