ES2291857T3 - Uso de un virus que expresa un fragmento de union para medir analitos en una muestra. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para determinar la cantidad de un analito en una muestra, dicho procedimiento comprendiendo poner en contacto dicha muestra con una superficie que tiene inmovilizado sobre ella un reactivo de unión que bien (a) se une a dicho analito, o (b) comprende dicho analito o un análogo del mismo, y un virus que ha sido transformado de moda que expresa y muestra un fragmento de unión que se enlaza a dicho reactivo de unión en competición con dicho analito, separar dicha superficie de la muestra, y llevar a cabo una reacción de la polimerasa en cadena cuantitativa para detectar la cantidad de secuencia de ácido nucleico presente en dicho virus sobre dicha superficie, donde al menos uno de los reactivos de unión o el fragmento de unión es específico para el analito.

Description

Uso de un virus que expresa un fragmento de unión para medir analitos en una muestra.
La presente invención proporciona un nuevo método de ensayo así como kits útiles en dicho ensayo.
La inmuno-PCR, que data de 1992, utiliza anticuerpos etiquetados con ácido nucleico para proporcionar un indicador muy sensible al ensayo. Generalmente, el anticuerpo se etiqueta con estreptavidina y el ácido nucleico al anticuerpo a través de la estreptavidina. El ADN biotinilado normalmente se añade al final del inmunoensayo.
Los virus pueden comprender esencialmente ADN o ARN, y atacar células hospedadoras, integrando sus ácidos nucleicos en el sistema hospedador. En términos estructurales, los virus generalmente expresan proteínas que forman un "recubrimiento" alrededor de los ácidos nucleicos.
La visualización de fagos ("fage display") es una técnica que se desarrolló para permitir la selección de proteínas, como por ejemplo los anticuerpos, y su producción in vitro. Se han constituido librerías de fagos que contienen un gran número de proteínas diferentes, tales como los scFv (fragmentos variables de cadena simple de anticuerpos). El fago tiene insertado en su genoma el ADN para la proteína scFv y la expresa como proteína de fusión para la proteína de cubierta, generalmente unida a su cabeza.
La mejor proteína, tal como scFv, para un propósito en particular se selecciona entre la mezcla de la librería mediante cribado para dar con el fago que se enlaza con el analito de interés bajo estrictas condiciones de selección. A continuación el fago puede multiplicarse mediante el cultivo en su bacteria hospedadora y el ADN puede escindirse e insertarse en un vector de expresión. A continuación la proteína de unión puede obtenerse como scFv o incorporada de nuevo en la estructura de un anticuerpo para, por ejemplo, crear anticuerpos humanizados para uso terapéutico.
Para la producción de anticuerpos in vitro se utiliza la técnica de visualización de fagos como una técnica intermedia. Sin embargo, los fagos en sí mismos nunca han sido propuestos para su uso como reactivos de ensayo en un inmunoensayo competitivo utilizando PCR cuantitativa. El documento US 6.265.169 describe su uso en un inmunoensayo de tipo sándwich utilizando PCR normal.
Los solicitantes han desarrollado un procedimiento particular como se define en las reivindicaciones en el que un virus, que expresa y muestra un fragmento de unión se utiliza como fragmento detectable en un ensayo para la detección de la presencia o para la medición de la concentración de un analito en una muestra.
Tal como se usa en el presente documento, por la expresión "fragmento detestable" se entiende que el propio virus se detecta para proporcionar una señal indicativa de la presencia o ausencia de un analito.
Además, la expresión "fragmento de unión" se refiere a cualquier fragmento que se una a una diana, especialmente a un polipéptido o proteína, que por ejemplo puede ser un analito polipeptídico o proteico, pero que también puede ser otro polipéptido o proteína, que se utiliza en un inmunoensayo como parte del sistema de detección.
El ácido nucleico del virus actúa como marcador, el cual puede detectarse utilizando cualquiera de los métodos conocidos de detección de ácidos nucleicos, en particular mediante el uso de reacciones de amplificación como la reacción de la polimerasa en cadena. Sin embargo, la ventaja de utilizar un virus en comparación con cualquier otra técnica de etiquetado es que se puede incluir una amplia variedad de fragmentos de unión de manera relativamente sencilla utilizando técnicas conocidas para, por ejemplo, la producción de virus recombinantes, tales como librerías de visualización de fagos, y sin la necesidad de etapas de unión adicionales.
Tal como se describe a continuación, en el contexto de la invención puede utilizarse cualquier tipo de virus, de manera que puede ser un virus de ADN, y en particular un bacteriófago (fago), que es un virus que ataca células bacterianas, pero también se pueden emplear otros virus de ADN o virus de ARN. Se transforma el virus para expresar y mostrar un fragmento de unión tal como se describe en las reivindicaciones. Así, generalmente el virus será un fago, y en particular un fago recombinante.
En particular, los virus comprenderán un fago recombinante, que ha sido transformado para expresar y mostrar un fragmento de unión específico como por ejemplo una inmunoglobulina, un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión. Sin embargo, el virus puede ser transformado para expresar cualquier proteína que pueda tener un uso en inmunoensayo, incluyendo analitos diana o un análogo de los mismos, incluso cuando estos no son de la superfamilia de las inmunoglobulinas.
Los formatos de ensayo, que pueden utilizar estos reactivos, pueden ser cualquiera de los tipos de ensayos competitivos convencionales.
Así, la invención proporciona un procedimiento para determinar la cantidad de un analito en una muestra, dicho procedimiento comprendiendo poner en contacto dicha muestra con una superficie que tiene inmovilizado sobre ella un reactivo de unión que, o bien (a) se une a dicho analito, o (b) comprende dicho analito o un análogo del mismo, y un virus que ha sido transformado de modo que expresa y muestra un fragmento de unión que se une a dicho reactivo de unión en competición con el analito, separar dicha superficie de la muestra, y llevar a cabo una reacción de la polimerasa en cadena para detectar la cantidad de secuencia de ácido nucleico presente en dicho virus sobre dicha superficie, donde al menos uno de los reactivos de unión o el fragmento de unión es específico para el analito.
Preferiblemente, el virus se incuba en presencia de la superficie durante un periodo de tiempo suficiente para asegurar que se une a sitios de unión disponibles en la superficie, por ejemplo a cualquier reactivo de unión que no esté ocupado por analito de la muestra. Por ejemplo, la incubación puede realizarse durante un periodo de 5 a 60 minutos, a temperaturas apropiadas, como por ejemplo de 25-40°C, por ejemplo a aproximadamente 37°C.
Después de esta incubación, la superficie que incluye cualquier complejo inmovilizado se separa de la suspensión de virus, por ejemplo mediante la retirada de la suspensión de virus y el lavado de la superficie.
A continuación, se detecta en la superficie, utilizando la reacción de la polimerasa en cadena (PCR), una secuencia de ácido nucleico, y en particular un ácido nucleico, que puede ser ADN o ARN, que es característico del virus.
En un ensayo común de tipo competitivo se inmoviliza en una superficie un reactivo de unión por un analito, o el analito o un análogo del mismo.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "análogo" se refiere a un fragmento que se unirá a una pareja de unión que se une al analito, incluso aunque no tenga exactamente la misma secuencia o estructura que el analito. Por ejemplo, este puede comprender una región epitópica particular para un analito, que se une mediante un anticuerpo monoclonal específico, que actúa por lo tanto como pareja de unión. Así, un análogo imitará un analito en el contexto de un inmunoensayo que utiliza una pareja de unión común.
En una realización, se pone en contacto con la superficie una muestra a la que se le añade un virus que expresa y muestra un fragmento de unión para el analito o análogo. Cuando hay analito presente en la muestra, competirá con el analito inmovilizado o el análogo para unirse al virus. Así, se retendrán menos virus en la superficie que si no hubiera analito en la muestra. Según la invención, esta disminución en la cantidad de virus retenidos puede detectarse mediante el análisis de la presencia en la superficie de un ácido nucleico presente en el virus.
En un ensayo alternativo de tipo competitivo se inmoviliza en una superficie un reactivo de unión para un analito. En este caso, el fragmento de unión que se visualiza en el virus es una pareja de unión específica que se selecciona de manera que compita con el analito por la unión con el reactivo de unión inmovilizado. Cuanto menos ADN de virus se detecte en la superficie después de retirarlo de la muestra, más analito habrá presente. Ejemplos concretos de analitos de este tipo son las inmunoglobulinas, como por ejemplo anticuerpos, que pueden ser útiles en el diagnóstico de una enfermedad.
Sin embargo, en todos los casos, el ácido nucleico del virus actúa como marcador detectable específico para el fragmento de unión, y puede detectarse utilizando una reacción en cadena de la polime rasa o reacción PCR, que puede ser específica para un ácido nucleico concreto del virus. La cuantificación del analito en la muestra se realiza utilizando procedimientos PCR cuantitativos, conocidos en el estado de la técnica.
En una realización de la invención, el reactivo de unión inmovilizado es un análogo del analito, que imita al analito de manera clue se une al fragmento de unión del virus en competición con el analito. Así, el fragmento de unión se unirá bien al analito o al reactivo de unión pero no a ambos. En este caso, la muestra preferiblemente se incuba con el virus antes de ponerla en contacto con la superficie. Durante esta etapa, cualquier analito presente formará un complejo con el fragmento de unión en el virus, bloqueando la unión del virus al reactivo de unión inmovilizado en la superficie. Como resultado, el complejo no quedará retenido en la superficie después del lavado y por lo tanto disminuye la cantidad de ácido nucleico de virus detectable. En ausencia del analito, el fragmento de unión del virus estará libre para unirse al reactivo de unión, resultando en una señal intensa de ácido nucleico de virus retenido sobre la superficie.
En algunos casos, el reactivo de unión inmovilizado se une al analito, y también al fragmento de unión del virus. En tales casos, en los que el analito está presente en la muestra, tanto el analito como el fragmento de unión competirán por los sitios disponibles en la superficie. Como resultado, la cantidad de virus/fragmentos de unión inmovilizados en la superficie disminuye en una cantidad relacionada con la concentración de analito en la muestra. De nuevo, en este caso, la presencia de una señal inferior a la esperada de ácido nucleico de virus es suficiente para ser indicativa de la presencia de analito en la muestra.
Este ensayo puede ser extremadamente sensible, y pueden reducirse las señales de fondo asociadas a los métodos convencionales de inmunoensayo. El análisis en sí es más fácilmente controlable, de manera que el virus puede diseñarse para que comprenda cualquier secuencia conveniente. La detección es totalmente independiente de la naturaleza del analito.
Los analitos son generalmente proteínas o polipéptidos. Ejemplos típicos son polipéptidos o proteínas que están asociados con un organismo patógeno o parte de él, tal como un virus, bacteria o espora bacteriana tal como ántrax o esporas de ántrax, o una proteína que es indicativa de un estado patológico particular o de la exposición a una enfermedad determinada, tal como una inmunoglobulina, por ejemplo un anticuerpo.
Preferiblemente, el lugar donde el reactivo de unión se une con el analito es específico para el analito diana. Sin embargo, puede ser relativamente inespecífico, por ejemplo la Proteína A, donde el analito diana se supone una inmunoglobulina tal como IgG, suponiendo que el fragmento de unión fusionado al virus es específico para el analito diana.
Los reactivos de unión específicos apropiados incluyen anticuerpos o sus fragmentos de unión, así como lectinas. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales, aunque preferiblemente monoclonales.
El reactivo de unión se inmoviliza sobre la superficie utilizando métodos conocidos. Por ejemplo, la Proteína A puede utilizarse para unir anticuerpos o fragmentos de unión que incluyen su región Fc.
La superficie puede ser cualquier superficie apropiada, tal como la superficie de un pocillo o placa de reacción, por ejemplo una placa o pocillo ELISA, además de perlas como por ejemplo perlas magnéticas, o membranas tales como membranas de celulosa que, por ejemplo, se utilizan en pruebas de ensayo con tiras reactivas, como se conoce en el estado de la técnica. Donde sea apropiado, los lugares que no están ocupados con el reactivo de unión pueden bloquearse, por ejemplo, con proteína, como por ejemplo, albúmina de suero bovino o proteína de leche, o con alcohol polivinílico o etanolamina, o sus mezclas, como es conocico en el estado de la técnica.
En particular, el virus utilizado en el procedimiento es un fago recombinante que expresa un fragmento de unión para el analito o el reactivo de unión que, de manera apropiada, es una pareja de unión específica. En particular, la pareja de unión específica comprenderá un fragmento variable de cadena sencilla de un anticuerpo (scFV).
Los fagos recombinantes que expresan fragmentos de unión pueden prepararse utilizando métodos convencionales, como es bien conocido en la producción de librerías de fagos para la visualización de fagos (Fage Display) como se discute arriba (ver, por ejemplo, Antibody Engineering, R. Konterman & S. Dubel (eds) Springer Lab Manuals, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 2001). Sin embargo, pueden utilizarse técnicas similares para producir otros tipos de virus recombinantes.
Los virus, como por ejemplo los fagos, pueden añadirse por separado o como mezclas multi-específicas, cuando se busca más de un analito. En este último caso, la detección de las múltiples secuencias de ácido nucleico, cada una característica de un virus concreto, se realizan sucesivamente.
La secuencia de ácido nucleico del virus se detecta utilizando una reacción de la polimerasa en cadena cuantitativa (PCR). En este caso, los reactivos, incluyendo los cebadores, polimerasas, nucleótidos, y tampones conocidos, se añaden a la superficie, y a después se someten a los ciclos térmicos convencionales, con el objetivo de amplificar cualquier secuencia de ácido nucleico diana que esté presente.
A continuación, el producto de la amplificación puede detectarse utilizando técnicas convencionales como por ejemplo la electroforesis en gel, seguida de visualización mediante colorantes.
Preferiblemente, la reacción de amplificación se realiza de tal manera que el producto de amplificación genera una señal detectable, y en particular una señal visible, por ejemplo una señal fluorescente, a medida que ésta progresa. En el estado de la técnica se conocen muchos formatos de ensayo que generan estas señales. Éstos pueden utilizar reactivos como por ejemplo agentes de unión a ADN, como por ejemplo colorantes intercalantes que emiten radiación, en particular radiación fluorescente, con una intensidad mayor cuando están intercalados en una cadena doble de ADN, así como sondas y cebadores que incluyen marcas fluorescentes, preparadas para experimentar una transferencia de energía de fluorescencia (FET), y en particular una transferencia de energía de fluorescencia par resonancia (FRET).
Existen dos tipos de sondas FET o FRET utilizadas comúnmente, aquellas que separan el dador del aceptor mediante la hidrólisis de sondas de ácido nucleico, y aquellas que alteran la relación espacial de las moléculas dadoras y aceptoras mediante la hibridación.
Las sondas de hidrólisis se comercializan con el nombre de sondas TagMan^{TM}. Éstas consisten en oligonucleótidos de ADN que están etiquetadas con moléculas aceptoras y dadoras. Las sondas se diseñan para unirse a una región específica de una cadena de un producto PCR. Después de la hibridación del cebador PCR a esta cadena, el enzima Taq extiende el ADN con una actividad polimerasa 5' a 3'. El enzima Taq también muestra actividad exonucleasa 5' a 3'. Las sondas TagMan^{TM} están protegidas en su extremo 3' mediante fosforilación para prevenir que ceben la extensión Taq. Si la sonda TagMan^{TM} se hibrida a la cadena producto, una molécula de extensión Taq también podrá hidrolizar la sonda, utilizándose la liberación del dador y el aceptor como base para la detección. En este caso la señal es acumulativa, la concentración de las moléculas libres de aceptor y de dador se incrementa con cada ciclo de la reacción de amplificación.
Las sondas de hibridación están disponibles en varias formas. Las sondas fluorescibles son oligonucleótidos que tienen secuencias complementarias 5' y 3' de manera que forman horquillas. Las etiquetas fluorescentes terminales están próximas para que se dé e efecto FRET cuando se forma la estructura de horquilla. Después de la hibridación de sondas fluorescibles a una secuencia complementaria, se separan los marcadores fluorescentes, de manera que no se dé efecto FRET, y así se forme la base de la detección.
También se pueden utilizar pares de oligonucleótidos etiquetados. Estos se hibridan en proximidad con un producto PCR que tiene unidas sus cadenas con moléculas aceptoras y dadoras a la vez, de manera que puede darse FRET. El FRET mejorado es la base de la detección. Las variantes de este tipo incluyen el uso de un cebador de amplificación marcado con una única sonda adyacente.
Sin embargo, se conocen otros procedimientos para la detección del progreso de reacciones de amplificación, y puede utilizarse cualquiera de ellos. Ejemplos particulares de tales procedimientos se describen en los documentos WO 99/28500, la patente británica No. 2.338.301, WO 99/28501 y WO 99/42611.
El documento WO 99/28500 describe un ensayo muy exitoso para la detección de la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra. En este procedimiento, se le añade a la muestra un agente de unión de ADN bicatenario y una sonda específica para dicha secuencia diana. La sonda comprende una molécula reactiva capaz de absorber fluorescencia de dicho agente de unión de ADN bicatenario o de donarle energía fluorescente. Esta mezcla se somete a continuación a una reacción de amplificación en la que se amplifica el ácido nucleico diana, y tanto durante como después del procedimiento de amplificación se proporcionan las condiciones en las que la sonda se hibrida a la secuencia diana. Se monitoriza la fluorescencia de dicha muestra.
En una realización alternativa de este ensayo, que utiliza un agente de unión de ADN bicatenario que puede absorber energía fluorescente de la marca fluorescente de la sonda pero que no emite luz visible, se describe en la solicitud de patente británica n° 223563.8. Cualquiera de estos ensayos puede utilizarse en el contexto del método de ensayo de la invención con el objetivo de detectar la secuencia de ácido nucleico diana.
Como ya es conocido en el estado de la técnica, estos ensayos se llevan a cabo de manera cuantitativa, por ejemplo mediante la monitorización de la señal de la mezcla de amplificación al menos una vez en cada ciclo de la reacción de amplificación. Al llevar a cabo la reacción de esta manera, se puede determinar la cantidad de virus presente en la superficie, y esta puede relacionarse con la cantidad de analito presente en la muestra original.
La secuencia concreta del virus detectada puede ser cualquier secuencia característica que se encuentre en él. Cuando se utilizan virus de especificidad única, esta puede ser cualquier secuencia que se encuentre en el fago en sí, así como también la secuencia que codifica la región determinante de complementariedad (RDC) del scFv, el "scaffolding" del RDC de cualquier virus recombinante, u otras secuencias que se introducen en el virus recombinante durante su preparación como por ejemplo genes de resistencia a antibióticos.
Si se desea, pueden incluirse en el virus secuencias marcadoras específicas además de las que codifican el fragmento de unión. Éstas pueden introducirse en el virus a la vez que el fragmento de unión, por ejemplo fusionadas con la secuencia que codifica el fragmento de unión, o pueden añadirse en una operación de transformación a parte.
Cuando en el ensayo se utilizan mezclas multi-específicas de virus, es necesario detectar las secuencias que son características de cada virus en particular, para determinar cuáles son los analitos específicos que están presentes en la muestra. Por lo tanto, en este caso es necesario detectar secuencias como por ejemplo las secuencias que codifican el propio scFv, o una secuencia marcadora introducida específicamente, tal como se describe arriba.
En este caso, también se pueden detectar las secuencias comunes a virus o a virus recombinantes, tales como fagos ADN o ARN, o genes de resistencia a antibióticos. Generalmente, siempre hay cierta sobrecarga de ácido nucleico del virus, que puede utilizarse como secuencias de referencia interna asegurando que la reacción PCR se ha desarrollado apropiadamente.
En este caso, pueden utilizarse reacciones PCR múltiples usando diferentes reactivos o sistemas de señalización con el fin de detectar las diferentes secuencias que se han generado. Esto puede conseguirse, por ejemplo mediante sondas marcadas o cebadores utilizados en la reacción de amplificación usando diferentes marcas, por ejemplo, marcas que muestran fluorescencia a distinta longitud de onda. A continuación se realiza el examen de la señal de cada marca, por ejemplo a cada una de las diferentes longitudes de onda, si es necesario con la resolución de señal apropiada donde se solapan las longitudes de onda.
Alternativamente, el ensayo se ha diseñado de tal manera que los amplicones producidos en las diferentes reacciones de PCR se hibridan para formar híbridos o se desestabilizan a diferentes temperaturas. El análisis del punto de fusión es una técnica conocida, por ejemplo mediante la utilización de colorantes intercalantes que muestren una fluorescencia mayor cuando se unen a especies de ADN bicatenario. Añadiendo dicho colorante al sistema de reacción, ya sea durante el transcurso del ensayo o después, y monitorizando la fluorescencia con un cambio controlado de temperatura, se puede determinar la temperatura a la cual la estructura bicatenaria del amplicón se rompe o se reestructura, y esto puede estar relacionado con la presencia del amplicón en particular y por lo tanto el virus en particular al que se ha unido.
El sistema de ensayo de la presente invención proporciona así un procedimiento de ensayo útil y fiable.
Los kits para la utilización en el procedimiento de ensayo descrito arriba son un aspecto adicional de la invención.
En particular, la invención proporciona un kit para la detección de la presencia de un analito en una muestra, dicho kit comprende un cuerpo sólido que tiene inmovilizado en una de sus superficies un reactivo de unión que o bien (a) se une al analito, o (b) comprende dicho analito o un análogo del mismo; un virus que ha sido transformado de manera que expresa un fragmento de unión específico para dicho reactivo de unión en competición con dicho analito, y reactivos capaces de realizar una reacción de la polimerasa en cadena para amplificar y detectar un ácido nucleico de dicho virus como se especifica en las reivindicaciones.
Por ejemplo, cuando la superficie tiene inmovilizada un reactivo de unión que se une a dicho analito, el virus expresa y muestra apropiadamente una pareja de unión que se une a dicho reactivo de unión en competición con dicho analito.
Alternativamente, cuando la superficie tiene inmovilizada un reactivo de unión que comprende bien el analito o un análogo del mismo, el virus será apropiadamente uno que exprese y muestre una pareja de unión para dicho analito.
Apropiadamente, el cuerpo sólido es un pocillo o una placa, por ejemplo una placa de múltiples pocillos, pero también pueden ser perlas como por ejemplo perlas magnéticas, o membranas, por ejemplo membranas de celulosa como las utilizadas en los ensayos convencionales con tiras reactivas.
El kit puede incluir más de un tipo de virus, en particular fagos recombinantes, para su utilización en ensayos multi-especificidad como se describe arriba.
Otros elementos adicionales del kit pueden comprender reactivos apropiados para su uso en la detección de las secuencias de ácido nucleico. En particular, el kit puede comprender colorantes intercalantes, cebadores o sondas para el uso en la detección de unas secuencias de ácidos nucleicos en particular como se describe arriba. Por ejemplo, el kit puede comprender cebadores que amplifican las secuencias, que codifican secuencias scFv específicas, o secuencias marcadoras que se han incorporado en el virus. Adicionalmente, o alternativamente en el caso de los ensayos de especifidad sencillos, los kits pueden incluir cebadores que son apropiados para la amplificación de secuencias de virus, secuencias que codifican el "scaffolding" de scFv o genes de resistencia a antibióticos que están presentes en los virus recombinantes.
Los cebadores pueden estar etiquetados apropiadamente de manera que la amplificación es detectable directamente. Por ejemplo, pueden incluir marcas fluorescentes u otras tales como las que se describen arriba.
El kit contiene sondas como se define en las reivindicaciones.
Los kits también pueden incluir colorantes intercalantes que ayuden al análisis del punto de fusión, cuando éste sea necesario para resolver los resultados de los ensayos multi-especificidad.
Los virus recombinantes y en particular los fagos recombinantes, que se transforman de manera que expresan un fragmento de unión y una secuencia marcadora, son nuevos y por sí mismos ya forman un aspecto adicional de la invención.
Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra en forma de diagrama un ensayo competitivo incluyendo la invención;
La Figura 2 es una gráfica de fluorescencia -d(F1)/dt versus la temperatura cuando se lleva a cabo una reacción PCR de tipo TAQMAN®;
La Figura 3 es una gráfica de fluorescencia (F1) frente el número de ciclos de series de muestras a diferentes diluciones utilizando el ensayo de la invención; y
La Figura 4 muestra los resultados de un ensayo ilustrativo descrito esporas de B. cereus incluyendo una PCR para la detección de ADN de fago.
En la realización ilustrada en la Figura 1A, se inmoviliza en la superficie (5) un analito o un análogo del mismo (7) capaz de unirse a la pareja de unión (3) del fago (1). Una muestra de ensayo a la que se le ha añadido el fago (1) se incuba en presencia de esta superficie. El analito (4) de la muestra se unirá a la pareja de unión (3) del fago (1). Cualquier fago que haya realizado dicha unión es incapaz de unirse al análogo inmovilizado del analito (7) (8), y por lo tanto será eliminado con la muestra en el lavado durante la siguiente etapa de separación. La detección del ADN del fago (2) en la superficie (5) que sigue dicha etapa de lavado revelará niveles inferiores de los esperados si no hubiera analito presente.
Como se desprende del estado de la técnica, se pueden utilizar otros formatos de ensayo competitivo.
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Ilustración 1
Demostración de ensayo utilizando esporas de Bacillus cereus que muestra la detección de ácido nucleico de virus utilizando PCR 1) Formato de placa
Se añade una muestra (50 ml) que comprende una suspensión de esporas de B. cereus (1 x 10^{8} por ml) en agua destilada estéril a cada pocillo de una placa ELISA fija (Placa Inmulon microtitre ELISA) y a continuación se colocó en un horno a 37°C durante la noche para secar las esporas en las placas.
A continuación las placas se lavaron tres veces con una solución de lavado que comprendía 0,05% v/v de Tween 20 en una solución salina tamponada con sulfato (PBS) o PBST.
A cada pocillo se añadió el tampón de fijación (200 ml), que comprende 2% p/v de polvo de leche seca y 0,05% v/v de Tween 20 PBS. A continuación se selló la placa y se incubó a temperatura ambiente durante un mínimo de 1 hora. A continuación se volvió a lavar de nuevo tres veces en PBST.
En el tampón de fijación PBST se preparó una solución de un anticuerpo primario que expresa el fago M13 (1 x 10^{9} unidades de transformación por ml), donde el anticuerpo primario en un fragmento monocatenario variable específico de B. cereus (scFv), y se añadieron al menos 50 ml por pocillo. Como control negativo, se añadió tampón de fijación PBST a uno de los pocillos en vez del anticuerpo primario que expresa el fago.
La placa se incubó a 37°C durante 1 hora, a continuación se lavó 5 veces en PBST. Después del secado, se añadieron 50 ml de H_{2}O a cada pocillo. Para la PCR, la placa se hirvió durante 30 segundos para liberar el fago. Después de permitir que la placa se enfriara brevemente, y que los contenidos de los pocillos se transfirieran a un tubo de PCR, junto con una mezcla convencional de PCR (18 ml) incluyendo los cebadores específicos para el fago M13 y SybrGreen, utilizados según las instrucciones del fabricante.
La muestra se sometió a series de etapas de ciclos térmicos en el Roche LightCycler de la siguiente manera:
94°C durante 0 segundos (fusión)
62°C durante 30 segundos (Fase de hibridación)
72°C durante 30 segundos (Fase de extensión).
Se realizaron 40 ciclos. La señal fluorescente de las muestras se monitorizó una vez por ciclo al final de la fase de extensión. El proceso se repitió con una muestra cada vez más diluida y los resultados se muestran en la Figura 2.
Las muestras de control negativo sólo muestran un pequeño incremento en la señal al final del proceso cíclico. Mediante el análisis de la curva de fusión (Figura 3) se confirmó que la señal del control negativo se debía a productos no específicos tales como dímeros cebadores.
Sin embargo, los resultados muestran que utilizando este método la presencia de esporas bacterianas en las muestras fue detectable.
Ejemplo Ilustrativo 2
Detección de ADN de virus en una superficie
Para la utilización como ensayo de detección, se añade una muestra a una placa ELISA cubierta con anticuerpo bloqueado y se incuba a 37°C durante 5 a 60 minutos.
A continuación, la placa se lava de tres a cinco veces con líquido de lavado.
A la placa se le añade una suspensión de fago filamentoso que expresa un scFv específico para la diana del ensayo, y se incuba durante 5-60 minutos. Después de lavar de nuevo (3-5 veces), se añaden los reactivos normales de PCR, junto con un sistema de señalización apropiado tal como el colorante SybrGreen citado arriba. Sin embargo, pueden utilizarse otros sistemas de señalización, por ejemplo utilizando sondas de señalización fluorescentes, tales como TAQMAN® u otras sondas para monitorización in situ. La mezcla de reacción se somete a ciclos térmicos para provocar la amplificación de la manera convencional.
Se identifica el número del ciclo de PCR en el cual aparece el producto (umbral de cruce de fluorescencia) y se relaciona con la concentración de analito de la muestra original.
Es posible añadir más de un scFv con diferentes especificidades a la vez para determinar varias dianas. En tales casos, se pueden llevar a cabo perfiles de fusión para distinguir cual de los scFv está presente y por tanto se ha enlazado al analito. Si se desea, las secuencias de los fagos o las secuencias de resistencia a antibióticos que se encuentran en el fago transformado pueden utilizarse como referencia interna para la PCR.
Ejemplo Ilustrativo 3
Formato alternativo de ensayo de filtración
En esta realización, se pasa una muestra líquida a través de un filtro de 0,2 o 0,45 micras, dependiendo de la naturaleza de la diana ensayo, y a continuación se lava el filtro. El analito diana, por ejemplo esporas bacterianas, quedan retenidas en el filtro. A continuación también se pasa una suspensión de fago filamentoso que expresa un scFv específico para la diana del ensayo por el filtro, el cual se vuelve a lavar. A continuación, se puede detectar mediante la PCR descrita arriba cualquier lago que se enlace con la diana en el filtro.
Ejemplo Ilustrativo 4
Detección del fago que muestra anticuerpos monocatenarios dirigidos contra B. cereus en un formato de inmunoensayo
50 ml de 107 esporas de B. cereus/ml se diluyeron 10 veces en H_{2}O sobre una placa ELISA Immulon 2 y se secaron en la placa a 37°C durante la noche. Así se inmovilizaron las esporas en la placa de manera que mostraron la manera en que un analito estaba unido a un anticuerpo inmovilizado, de la misma manera que debería ocurrir en un ensayo con esporas.
A continuación, se lavó la placa en H_{2}O tres veces. Después se fijó cada pocillo con la adición de 150 ml de una solución salina tamponada al 1% de blotto/fosfato (PBS) y posteriormente se incubó la placa a 37°C durante 1 hora. A continuación, la placa se lavó tres veces en PBS-Tween. Se añadieron 50 ml de suspensión de fago en 1% de blotto/PBS en cada pocillo y a continuación se incubó la placa a 37°C durante una hora, de manera que el fago se uniera a las esporas de la placa. La placa se lavó 3 veces a continuación en PSBTween, seguido de tres lavados en H_{2}O para eliminar el fago no unido.
A continuación se añadieron 50 ml de H_{2}O a cada pocillo y la placa se calentó en agua hirviendo durante 30 segundos para eluir el fago.
A continuación se ensayó mediante PCR empleando 2 ml de cada pocillo y utilizando cebadores dirigidos al fago, amplificando el gen lacl encontrado en el fago derivado de M13. Se realizó una PCR a tiempo real utilizando un Corbett RotorGene. Cada reacción tamponada con tris contuvo 0,5 mM de cada uno de los cebadores Lacl sentido y antisentido, 0,3 mM de la sonda TaqMan específica para lacl, 4 mM MgCl_{2}. Los parámetros de ciclo fueron 95° durante 5 segundos y 60°C durante 1 minuto en 50 ciclos. Los cebadores, la sonda y la diana fueron los
siguientes:
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100 
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en la Figura 4. Los resultados muestran que fueron detectables por encima del nivel basal de 10^{6} a 10^{3} esporas por pocillo, a pesar de que en este caso el nivel basal fue alto Esto probablemente fue resultado de una contaminación cruzada. Entre los fagos derivados de M13 y los vectores de clonación M13 empleados normalmente en el laboratorio existen genes compartidos. La sensibilidad del ensayo puede mejorarse fácilmente ajustando la reacción de PCR del fago en un laboratorio libre de contaminación por M13 o seleccionando cebadores específicos para los fagos que muestran los anticuerpos de B. cereus.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.
Documentos de patentes citados en la descripción
\bullet US 6265169 B
\bullet WO 9928500 A
\bullet GB 2338301 A
\bullet WO 9928501 A
\bullet WO 9942611 A
\bullet GB 223563 A
Literatura diferente de patentes citadas en la descripción
\bullet Antibody Engineering. Springer Lab Manuals, Springer-Verlag, 2001.

Claims (20)

1. Procedimiento para determinar la cantidad de un analito en una muestra, dicho procedimiento comprendiendo poner en contacto dicha muestra con una superficie que tiene inmovilizado sobre ella un reactivo de unión que bien (a) se une a dicho analito, o (b) comprende dicho analito o un análogo del mismo, y un virus que ha sido transformado de moda que expresa y muestra un fragmento de unión que se enlaza a dicho reactivo de unión en competición con dicho analito, separar dicha superficie de la muestra, y llevar a cabo una reacción de la polimerasa en cadena cuantitativa para detectar la cantidad de secuencia de ácido nucleico presente en dicho virus sobre dicha superficie, donde al menos uno de los reactivos de unión o el fragmento de unión es específico para el analito.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que el reactivo de unión inmovilizado comprende el analito o un análogo del mismo, de manera que el fragmento de unión se une al analito o al reactivo de unión, y la presencia del analito en la muestra bloquea la unión del fragmento de unión al reactivo de unión, de manera que una disminución en la cantidad de virus capaz de unirse al reactivo de unión es indicativa de la presencia del analito en la muestra.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que el reactivo de unión se une al analito, y también al fragmento de unión del virus, de manera que el analito y el fragmento de unión competirán por los sitios disponibles en la superficie, de manera que una disminución en la cantidad de virus capaz de unirse al reactivo de unión es indicativa de la presencia de analito en la muestra.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la superficie es la superficie de una placa o pocillo ELISA, una perla magnética o una membrana.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que los sitios de la superficie que no están ocupados con reactivo de unión están bloqueados.
6. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que la pareja de unión específica del analito es un fragmento monocatenario variable de un anticuerpo (scFV).
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones, anteriores en el que el virus comprende una mezcla multi-específica.
8. Procedimiento según la reivindicación 7 en el que se lleva a cabo la detección de múltiples secuencias de ácido nucleico, cada una característica de un virus concreto.
9. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que la reacción de la polimerasa en cadena se lleva a cabo de tal manera que el producto de la amplificación genera una señal detectable en el transcurso de la reacción, y la señal de la mezcla de amplificación se monitoriza al menos una vez durante cada ciclo de la reacción de amplificación de manera que se determina la cantidad de virus presente en la superficie.
10. Procedimiento según la reivindicación 9 en el que la señal es una señal visible.
11. Procedimiento según la reivindicación 9 0 la reivindicación 10 en el que la reacción de la polimerasa en cadena se lleva a cabo en presencia de un reactivo de unión a ADN, o de un cebador o sonda que está marcado con un marcador fluorescente.
12. Procedimiento según la reivindicación 11 en el que el reactivo de unión al ADN es un colorante intercalante.
13. Procedimiento según la reivindicación 11 en el que la reacción se lleva a cabo en presencia de una sonda que comprende un oligonucleótido de ADN que está marcado con una molécula dadora de energía fluorescente y una molécula aceptora de energía fluorescente, y en el que la sonda unida a la secuencia diana se hidroliza durante la amplificación para liberar las moléculas dadoras y aceptoras.
14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el ácido nucleico del virus se detecta mediante la amplificación de una secuencia de ácido nucleico que es característica de un virus concreto utilizado en el procedimiento.
15. Procedimiento según la reivindicación 14 en el que el virus es un virus recombinante que ha sido transformado con una secuencia marcadora, y esta secuencia es la secuencia que se amplifica.
16. Procedimiento según la reivindicación 14 en el que se detectan las secuencias características de más de un virus.
17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que se utiliza más de un virus en el procedimiento, y a continuación se realiza un análisis de punto de fusión para determinar qué virus se ha unido durante el ensayo.
18. Kit para determinar la cantidad de un analito en una muestra, dicho kit comprendiendo un cuerpo sólido que tiene inmovilizado en una superficie del mismo un reactivo de unión que (a) se une al analito, o bien (b) comprende dicho analito o un análogo del mismo; un virus que ha sido transformado de manera que expresa un fragmento de unión especifico para dicho reactivo de unión en competición con dicho analito, y reactivos capaces de realizar una reacción de la polimerasa en cadena para amplificar y detectar un ácido nucleico de dicho virus, en donde los reactivos capaces de llevar a cabo la reacción de la polimerasa en cadena cuantitativa para amplificar y detectar un ácido nucleico de dicho virus, incluyen una sonda de ADN que comprende una molécula dadora de energía fluorescente y una molécula aceptora de energía fluorescente.
19. Kit según la reivindicación 18 que comprende más de un tipo de virus transformado.
20. Kit según la reivindicación 18 0 la reivindicación 19 que comprende un colorante intercalante.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1885853A2 (en) * 2005-05-27 2008-02-13 Guild Associates, Inc. Biological detection system and method
CN102431090B (zh) * 2011-10-25 2014-02-19 南开大学滨海学院 光纤光栅预制梁预应力智能张拉控制系统和实现方法
US9568431B2 (en) 2012-04-16 2017-02-14 Access Medical Systems, Ltd. Luminescent immunoassays for quantitating analytes having a wide concentration range
US20170284922A1 (en) * 2014-09-07 2017-10-05 Selexis S.A. Microfluidic methods and cartridges for cell separation
JP7347849B2 (ja) * 2018-04-19 2023-09-20 ファースト ライト ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 標的の検出

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6365368B1 (en) * 1985-05-10 2002-04-02 Igen International, Inc. Rapid method for the detection and quantification of microbes in water
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
IE64040B1 (en) * 1989-06-15 1995-06-28 Akzo Nv Method for determining nucleic acid
ES2044784B1 (es) * 1992-06-12 1994-09-01 Inia Procedimiento para la deteccion e identificacion de patogenos virales y subvirales.
ZA97248B (en) * 1996-01-18 1997-07-18 Rohm & Haas Method for identifying and quantifying polymers utilizing immunoassay techniques
AU3135097A (en) * 1996-05-22 1997-12-09 Johns Hopkins University, The Methods of detection utilizing modified bacteriophage
US5922537A (en) * 1996-11-08 1999-07-13 N.o slashed.AB Immunoassay, Inc. Nanoparticles biosensor
IT1291913B1 (it) * 1997-05-22 1999-01-21 Angeletti P Ist Richerche Bio Metodo che prevede l'uso di batteriofagi per la rivelazione della presenza di molecole di interesse in campioni biologici
GB9725197D0 (en) 1997-11-29 1998-01-28 Secr Defence Detection system
GB9725237D0 (en) 1997-11-29 1998-01-28 Secr Defence Amplification system
GB9803382D0 (en) 1998-02-19 1998-04-15 Secr Defence Detection system
CA2333463A1 (en) * 1998-06-04 1999-12-09 Microsens Biophage Limited Analytical method using multiple virus labelling
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
US6927024B2 (en) * 1998-11-30 2005-08-09 Genentech, Inc. PCR assay
EP1169473B1 (en) * 1999-04-14 2006-11-22 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES High sensitivity phage display biomolecule detection
GB9928787D0 (en) * 1999-12-03 2000-02-02 Medical Res Council Direct screening method
EP1122542A1 (en) * 2000-02-01 2001-08-08 Anda Biologicals S.A. Method for the rapid detection of whole microorganisms on retaining membranes by use of chaotropic agents
DE60319121T2 (de) * 2002-09-18 2009-02-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Zusammensetzungen, verfahren und kits zum nachweis eines antigens auf einer zelle und in einem biologischen gemisch

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DE602004008043D1 (de) 2007-09-20
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ATE515701T1 (de) 2011-07-15
WO2004079369A1 (en) 2004-09-16
TW200502399A (en) 2005-01-16

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