CN100504394C - 使用表达结合部分的病毒测量样品中的分析物 - Google Patents

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Abstract

一种病毒作为检测样品中是否存在分析物或测量分析物浓度的手段的用途，所述病毒表达和展示结合部分。该病毒，其典型地是表达结合部分的噬菌体，用作免疫测定中的结合试剂，并且可通过检测病毒的核酸序列很容易地并准确地检测。

Description

使用表达结合部分的病毒测量样品中的分析物
本发明提供一种新的试验方法以及在所述试验中有用的试剂盒和试剂.
免疫-PCR，其始于1992年，使用核酸标记的抗体用于提供非常灵敏的试验终点.通常用链霉抗生物素标记抗体并且核酸通过链霉抗生物素结合到抗体上.通常在免疫测定的最后加入生物素化的DNA.
病毒可能基本上包括DNA或RNA，并且攻击宿主细胞，将它们的核酸整合到宿主系统中.在结构方面，病毒通常表达在核酸周围形成“衣壳”的蛋白。
噬菌体展示是一种开发的允许体外选择和生产蛋白如抗体的技术.制备含有非常高数量的不同蛋白，如scFv(抗体的单链可变片段)的噬菌体文库.噬菌体具有插入到其基因组中的蛋白scFv的DNA，并且其表达为一种附着到衣壳蛋白上的融合蛋白，通常在其头部附着.
通过在严紧选择条件下“淘选”结合感兴趣的分析物的噬菌体，从文库混合物中选择用于特殊目的的最好的蛋白如scFv。然后噬菌体可通过在其宿主细菌中生长进行繁殖并且可将DNA切掉并插入到表达载体中.然后结合蛋白可以scFv形式产生或者整合回到抗体构架中制备，例如，用于治疗用途的人源化抗体。
噬菌体展示技术因此用作体外抗体生产的中间技术.然而，以前从来没有人建议将噬菌体本身用作试验试剂.
因此根据本发明提供一种病毒在检测样品中是否存在分析物或者测量分析物浓度的试验中作为可检测的部分的用途所述病毒表达和展示结合部分.
如这里所使用的，措辞“可检测的部分”意思是检测病毒本身以提供表示存在或缺乏分析物的信号.
另外，措辞“结合部分”涉及将结合靶，尤其是多肽或蛋白的任何部分，其例如可能是分析物多肽或蛋白，但是也可能是另一种多肽或蛋白，其在免疫测定中用作检测系统的一部分.
病毒的核酸作为一种标记，其可使用已知核酸检测方法中的任何一种，特别是通过使用扩增反应如聚合酶链反应进行检测。然而，与任何其它标记技术相比，使用病毒的优点是使用例如用于生产重组病毒的已知技术，可相对简单地包括种类繁多的结合部分，如噬菌体展示文库，并且不需要另外的结合步骤。
可在本发明的情况下使用任何类型的病毒，因此其可能是DNA病毒，特别是噬菌体，其是一种攻击细菌细胞的病毒，但是也可使用其它DNA病毒或RNA病毒.因此，通常该病毒是噬菌体，特别是重组噬菌体.
特别地，病毒将包括重组噬菌体，其已被转化以至于表达和展示特异性结合部分如免疫球蛋白例如，抗体，或其结合片段.然而，可转化病毒以表达可在免疫测定中使用的任何蛋白，包括靶分析物或它们的类似物，即使它们不属于免疫球蛋白超家族.
可使用这些试剂的试验形式，可以是免疫学中已知的常规试验方式中的任何一种.例如，它们可在夹层和竞争型试验中使用。
因此，本发明提供一种检测样品中的分析物的方法，所述方法包括将所述样品与表达并展示结合部分的病毒接触，这样病毒与分析物或其类似物，或者分析物的结合配偶体形成复合物，复合物结合或者不结合表面取决于样品中存在或缺乏分析物，检测表面上存在或缺乏核酸，以及将这与样品中是否存在或缺乏分析物联系起来.
检测的核酸合适地是病毒的特征性核酸，但可能存在一些试验形式，其中任何核酸的存在将表示病毒仍然留在表面上.在这些情况中，例如可使用染料，如结合DNA的溴化乙锭检测核酸.
合适地，在存在表面时将病毒孵育足够长的时间以确保其结合到表面上可利用的结合位点，例如结合表面上存在的任何分析物以形成结合的分析物/病毒复合物，或者结合不被样品的分析物占据的任何结合试剂.例如，可在适当的温度，如从25到40℃，例如在约37℃孵育5到60分钟.
这种孵育后，将包括任何固定的复合物的表面与病毒悬浮液分离，例如通过除去病毒悬浮液并洗涤表面。
其后，在表面检测病毒特征的核酸序列，特别是核酸，其可能是DNA或RNA.
在夹层型试验中，选择病毒如噬菌体以便其将结合样品内的分析物形成复合物.在表面上固定分析物的另一种结合试剂.当存在病毒时将样品与表面接触，分析物和病毒的复合物便结合到表面上.这然后可从剩余样品中分离.检测到留在表面上的病毒核酸表示样品内存在分析物.
在典型的竞争型试验中，将分析物的结合剂，或者分析物或其类似物固定到表面上.
如这里所使用的，措辞“类似物”指将结合到结合分析物的结合配偶体的部分，即使其可能与分析物的序列或结构不是精确相同.其可能，例如，包括分析物的特殊表位区，该表位区被特殊单克隆抗体结合，其因此作为结合配偶体.因此类似物将在使用通常的结合配偶体的免疫测定的情况中“模拟”分析物.
将添加表达和展示分析物或类似物的结合部分的样品，与表面接触.当在样品中存在分析物时，其将与固定的分析物或类似物竞争结合病毒。因此，留在表面上的病毒将少于如果样品中不存在分析物的情况.可根据本发明，通过分析表面是否存在病毒中存在的核酸，检测这种残留病毒数量的减少。
在可选择的竞争型试验中，将分析物的结合试剂固定到表面上.在这种情况中，在病毒上展示的结合部分是特异性结合配偶体，对其进行选择以便其能与分析物竞争结合固定的结合试剂.从样品中分离后在表面上检测到的病毒DNA越少，存在的分析物就越多.在这种情况中分析物的特定实例是免疫球蛋白如抗体，其可能在疾病的诊断中有用.
然而在所有情况中，病毒的核酸作为结合部分的可检测的和特异性“标记”，例如可使用扩增反应如聚合酶链反应或PCR反应进行检测，其可能对特定的病毒核酸是特异的.可使用例如，定量PCR方法定量样品中的分析物，这在本领域中是公知的.
在一个特定的实施方案中，本发明提供一种检测样品中分析物的方法，所述方法包括将怀疑含有所述分析物的样品与在其上固定结合试剂的表面接触，所述结合试剂(a)结合所述分析物，或(b)包括所述分析物或其类似物，以及表达和展示结合所述分析物或者与所述分析物竞争的所述结合试剂的结合部分的病毒，从样品中分离所述表面，以及在所述表面上检测是否存在所述病毒内存在的核酸序列，其中结合试剂或结合部分中的至少一种对分析物是特异的.
特别地，如上所讨论的，固定的结合试剂和结合部分两者都结合分析物.如果在样品中存在分析物，那么其将在样品中形成复合物。分析物也会结合到表面上的结合试剂.当从样品中移走表面时，结合的分析物/病毒复合物将仍然留在其上，并且当分析病毒核酸时产生阳性结果.相反，如果样品不含有靶分析物，结合该靶分析物的病毒/结合部分将不与表面缔合，因此将不能被检测到.
可选择地，固定的结合试剂是分析物的类似物，其模拟分析物，即其将结合于与分析物竞争的病毒的结合部分.因此结合部分将结合分析物或者结合试剂，但不是两者都结合.在这种情况中，优选在与表面接触前将样品与病毒一起孵育.在这个步骤期间，存在的任何分析物将与病毒上的结合部分形成复合物，阻断病毒与表面上固定的结合试剂的结合.结果，洗涤后复合物将不留在表面上，因此可检测到的病毒核酸的量减少.在缺乏分析物时，病毒的结合部分将是游离的以结合结合试剂，导致在表面上保留大量病毒核酸“信号”。
在一些情况中，固定的结合试剂结合分析物，以及也结合病毒上的结合部分.在这种情况中，如果样品中存在分析物，那么分析物和结合部分将竞争表面上的可利用的位点.结果，固定在表面上的病毒/结合部分的量减少与样品中分析物的浓度有关的量.此外，在这种情况中，只有存在比预期的病毒核酸“信号”低的信号表示样品中存在分析物.
这种试验可能非常灵敏，可减少与常规免疫测定方法相关的背景信号.该分析本身更容易控制，因为工程改造病毒使其包括无论什么样的序列都是方便的.检测完全不依赖分析物的性质.
结合试剂可以是结合分析物的任何试剂.
分析物通常是蛋白或多肽.典型的实例将会是与病原生物，如病毒、细菌或者细菌孢子如炭疽或炭疽孢子有关的多肽或蛋白或其部分，或者表示特定疾病状态或表示暴露于特定疾病的蛋白，如免疫球蛋白，例如抗体.
优选地，如果结合试剂结合分析物，那么其对靶分析物是特异的.然而，其可能是相对非特异的，例如蛋白A，其中靶分析物是免疫球蛋白如IgG，前提是融合到病毒上的结合部分对靶分析物特异。
合适的特异结合试剂包括抗体或其结合片段，以及凝集素。抗体可能是单克隆抗体或多克隆抗体，但是优选单克隆抗体.
使有常规方法将结合试剂固定在表面上.例如可使用蛋白A结合抗体或包括其Fc区的结合片段.
表面可以是任何方便的表面，如反应平板或孔的表面，例如ELISA平板或孔，除了珠如磁珠，或者膜例如在量油尺鉴定试验中使用的纤维素膜，这些在现有技术中是常规的.例如可用蛋白如牛血清白蛋白或乳蛋白，或者用聚乙烯醇或乙醇胺，或者这些的混合物“封闭”适当的，不被结合试剂占据的位点，这些在现有技术中是常规的.
在夹层型试验中，样品首先与表面一起孵育足够长的时间以确保存在的任何分析物结合到固定的结合试剂上.例如，可将样品与封闭抗体包被的ELISA平板一起，在适当的温度，如从25到40℃，例如在约37℃孵育5到60分钟.
可在孵育前、期间或者之后添加病毒.然而优选地在孵育后，从表面除去残余样品，然后在表面与病毒接触前冲洗表面除去任何未结合的分析物.
以悬浮液的形式适当加入病毒.将表面与病毒悬浮液一起孵育足够长的时间以允许病毒结合表面的分析物。这之后，除去过量的病毒悬浮液并且在检测表面上的病毒核酸前冲洗表面.如果必要的话，在进行检测反应前，可将病毒从表面上释放，例如通过煮沸方法.
特别地，在方法中所使用的病毒是重组噬菌体，其表达结合分析物的结合部分或者适当地是特异结合配偶体的结合试剂.特别地，特异结合配偶体将包括抗体的单链可变片段(scFV).
可使用常规方法生产表达结合部分的重组噬菌体，这在生产如上所讨论的用于噬菌体展示的噬菌体文库中是公知的(见，例如Antibody Engineering，R.Konterman & S.Dubel(编)SpringerLab Manuals，Springer-Verlag，Berlin Heidelberg，2001).然而可使用类似技术生产其它类型的重组病毒.
可单独地或者作为多特异性混合物加入病毒如噬菌体，其中寻找一种以上的分析物.在后面的情况中，随后检测多种核酸序列，每作为各种病毒的特征.
在一个实施方案中，使用扩增反应，例如聚合酶链反应(PCR)检测病毒的核酸序列.在这种情况中，为了扩增存在的任何靶核酸序列，向表面加入公知的试剂，包括引物、聚合酶、核苷酸和缓冲液，然后进行常规的热循环.
然后可使用常规方法如凝胶电泳，接着使用染料显色，检测扩增产物.
优选地扩增反应以这种方式进行，随着其进展，扩增产物产生可检测的信号，特别是可视信号，例如荧光信号.现有技术中已知许多产生这种信号的试验形式.它们可利用试剂如DNA结合试剂，如嵌入染料(当它们嵌入到双链DNA中时其发出辐射并且特别地在更大强度时发出荧光辐射)，以及包括荧光标记的探针和引物，排列起来进行荧光能量转移(FET)，特别是荧光共振能量转移(FRET).
存在两种常用类型的FET或FRET探针，使用核酸探针的水解作用分离供体和受体的那些探针，以及使用杂交作用改变供体和受体分子空间关系的那些探针.
水解探针可作为TaqManTM探针买到.这些由用供体和受体分子标记的DNA寡核苷酸构成.设计探针结合PCR产物的一条链上的特定区域.PCR引物退火到这条链上后，Taq酶用5′到3′聚合酶活性延伸DNA.Taq酶也显示5′到3′核酸外切酶活性.在3′端通过磷酸化保护TaqManTM探针以防止它们引发Taq延伸.如果TaqManTM探针与产物链杂交，那么延伸的Taq分子也可以水解探针，从受体上释放供体作为检测的基础.在这个例子中信号是累积的，游离供体和受体分子的浓度随着每个扩增反应循环而增加.
可得到许多形式的杂交探针.分子信标(beacon)是具有互补的5′和3′序列的寡核苷酸以至于它们能形成发夹环.当形成发夹结构时，末端荧光标记紧密靠近以发生FRET.分子信标与互补序列杂交后分离荧光标记，因此不发生FRET，并且这形成检测的基础.
也可使用标记的寡核苷酸对.它们在使供体和受体分子连在一起的PCR产物链紧密邻近地杂交以至于可发生FRET.增强的FRET是检测的基础.这种类型的变化形式包括使用具有单个相邻探针的标记的扩增引物。
根据它们发生的反应，检测扩增反应的其它方法是已知的，然而，可使用这些方法中的任何一种。例如在WO 99/28500、英国专利No.2,338,301、WO 99/28501和WO 99/42611中描述了这些方法中的特殊实例.
WO 99/28500描述了一种检测样品中是否存在靶核酸序列的非常成功的试验.在这种方法中，向样品中添加DNA双螺旋结合剂和对所述靶序列特异的探针.探针包括能从所述DNA双螺旋结合试剂吸收荧光或者将荧光能量贡献给所述DNA双螺旋结合试剂的反应分子.然后使这种混合物进行扩增反应，其中扩增靶核酸，在扩增过程期间或之后诱导探针与靶序列杂交的条件。监测所述样品的荧光.
在共同未决的英国专利申请No.223563.8中描述了这种试验的一种可供选择的形式，其利用能从探针上的荧光标记中吸收荧光能量但不发射可见光的DNA双螺旋结合剂。为了检测靶核酸序列，可在本发明试验方法的情况中使用这些试验中的任何一种.
如在现有技术中公知的，这些试验中的许多能以定量方式进行，例如通过在扩增反应的每个循环期间至少一次监测扩增混合物的信号.通过以这种方式进行反应，可测定表面上存在的病毒量，这可能与最初样品中存在的分析物的量有关。
所检测病毒的特定序列可以是这里发现的任何特征序列。如果在试验中使用单特异性病毒，那么这可能是在噬菌体本身内发现的任何序列，以及编码scFv的互补决定区(CDR)的序列、任何重组病毒的CDR的“支架”、或者在其制备期间引入到重组病毒内的其它序列，如抗生素抗性基因.
如果期望的话，除了那些编码结合部分的序列外可在病毒中包括特异性标记序列.可将它们与结合部分同时引入到病毒中，例如融合到编码结合部分的序列上，或者可在分开的转化操作中加入.
如果在试验中使用病毒的多特异混合物，那么为了测定样品中是否存在特异性分析物，接着必需检测每种特定病毒的特征序列.在这种情况中，因此必需检测序列如编码scFv本身的序列，或者特定引入的标记序列，如上所讨论的。
在这种情况中，也可检测病毒或重组病毒的共有序列，如噬菌体DNA或RNA，或者抗生素抗性基因。通常，将总是有病毒核酸的一些遗留物，其可用作内参照序列，确保PCR反应适当地进行.
在这种情况中，为了检测所产生的各种序列，可采用使用不同信号传递试剂或系统的多重PCR反应。例如可通过使用不同标记物，例如在不同波长发射荧光的标记物标记在扩增反应中使用的探针或引物达到这种目的.然后检查每种标记物的信号，例如在每种不同波长，如果必要的话用适当的信号分解，其中波长重叠.
可选择地设计试验以便由不同PCR反应产生的扩增子杂交形成双螺旋或在不同温度去稳定.解链温度分析，例如使用当结合到双链DNA种类上时显示荧光增加的嵌入染料，是公知的技术.通过向反应系统中添加这种染料，在试验过程期间或之后，以及通过用可控制的温度改变监测荧光，可在扩增子双螺旋结构破坏或重新形成的温度进行检测，这可能与存在特定的扩增子有关，因此与结合的特定病毒有关.
本发明的试验系统因此提供一种有用的和可靠的试验方法.
在上述试验方法中使用的试剂盒形成本发明的另一个方面.
特别地，本发明提供用于检测样品中是否存在分析物的试剂盒，所述试剂盒包括在其表面固定结合试剂的固体，其(a)结合所述分析物，或者(b)包括所述分析物或其类似物，以及病毒，如重组噬菌体，其表达和展示结合所述分析物或与所述分析物竞争的所述结合试剂的结合部分.
例如，如果表面上固定结合所述分析物的结合试剂，那么病毒适当地表达和展示分析物的结合配偶体，或者结合与所述分析物竞争的所述结合试剂的结合配偶体.
可选择地，如果表面上固定包括分析物或其类似物的结合试剂，那么病毒适当地是一种表达和展示所述分析物的结合配偶体的病毒.
合适地，固体是平板，例如多孔平板中的孔，但其也可能是珠，如磁珠，或者膜，例如在常规量油尺型试验中发现的纤维素膜.
试剂盒可能包括一种类型以上的病毒，特别是重组噬菌体，用于如上所讨论的多特异性试验.
试剂盒可能的另外成分包括适于在检测核酸序列中使用的试剂.特别地，试剂盒可包括嵌入染料，用于检测如上所讨论的特定核酸序列的引物或探针.例如，试剂盒可包括扩增序列的引物，其编码特定scFv序列，或者掺入到病毒中的标记序列.另外，或者可选择地在单特异性试验的情况中，试剂盒可包括适于扩增病毒序列的引物，编码scFvs的支架或在重组病毒中存在的抗生素抗性基因的序列。
引物可以扩增产物可直接进行检测的方式适当地标记.例如，它们可包括荧光标记或如上所讨论的其它标记.
另外或者可选择地，试剂盒可包括探针，其对扩增产物特异并且被标记以帮助检测产物。它们可包括单或双标记的水解或杂交探针，也如上面所讨论的.如果适当的，它们可包括嵌入染料或其它DNA双螺旋结合试剂，其形成检测系统的成分.
试剂盒也可包括嵌入染料以帮助分析解链温度，其中为了分辨多特异性试验结果需要这种染料.
被转化以至于表达结合部分和标记序列的重组病毒以及特别是重组噬菌体，是新的并且同样形成本发明的另一个方面.
现在通过实施例并参考附图将特别地描述本发明，其中：
图1用图解方式举例说明包括本发明的夹层试验；
图2用图解方式举例说明包括本发明的竞争性试验；
图3是当进行
Figure C200480011982D00141
型的PCR反应时荧光-d(F1)/dt对温度的图；
图4是使用本发明的试验，荧光(F1)对一系列不同稀释度的样品循环数目的图；和
图5显示以下所描述的用于蜡状芽孢杆菌(B.Cereus)孢子的试验结果，包括用于检测噬菌体DNA的PCR。
在图1A举例说明的夹层试验中，使用噬菌体(1)，其包括外壳，围绕噬菌体DNA(2).通过噬菌体表达结合配偶体(3)如scFv并展示在噬菌体的头部的表面上.其作为一种试剂添加到可含有分析物(4)的试验反应混合物中，并且与表面如珠或孔(5)接触，其上固定也对分析物(4)特异的抗体(6).
一旦孵育(B)，噬菌体(1)和分析物(4)形成复合物，其通过分析物与抗体(6)的结合留在表面(5)上.此后，从样品的残余部分移走表面(5)并且冲洗.然而，可检测到一些噬菌体留在表面上.
在图2A举例说明的实施方案中，在表面(5)上固定能结合噬菌体(1)的结合配偶体(3)的分析物或其类似物(7).在存在这种表面时孵育试验中已添加噬菌体(1)的样品.样品中的分析物(4)将结合噬菌体(1)的结合配偶体(3).经历这种结合的任何噬菌体不能结合固定的分析物类似物(7)(B)，因此在随后的分离步骤期间将被从样品中冲洗下去。这种冲洗步骤后，表面(5)上噬菌体DNA(2)的检测将显示比如果不存在分析物时预测的水平更低.
本领域技术人员将可能理解其它试验形式。
实施例1
使用蜡状芽孢杆菌孢子试验的示范
1)平板形式
向封闭的ELISA平板(Immulon微量滴定ELISA平板)的每个孔中添加(50μl)包含溶于无菌蒸馏水的蜡状芽孢杆菌(B.cereus)孢子悬浮液(每毫升1 x 10a个孢子)的样品，然后将其置于烘箱中于37℃过夜以便将孢子干燥到平板上.
平板然后用包含磷酸缓冲盐水(PBS)或PBST中的0.05％ v/v吐温20的洗液冲洗3次.
向每个孔中添加含有2％ w/v干奶粉和0.05％ v/v吐温20 PBS的封闭缓冲液(200ml).然后密封平板并且在室温下孵育最少1小时。然后再次在PBST中冲洗3次。
制备溶于PBST封闭缓冲液的表达M13噬菌体(每毫升1 x 109个转化单位)的一抗溶液，其中一抗是蜡状芽孢杆菌特异性单链可变片段(scFv)，每孔添加至少50μl.向表达噬菌体的一抗位置的孔之一添加PBST封闭缓冲液作为阴性对照。
将平板在37℃孵育1小时，然后在PBST中冲洗5次.干燥后，向每个孔中添加50μl dH2O.然后将平板煮沸30秒钟以释放噬菌体用于PCR。允许平板简单冷却后，将孔的内容物转移到PCR管内，连同根据生产商的使用说明使用的包括M13噬菌体特异的引物和SybrGreen的常规PCR混合物(18μl).
将样品在Roche LightCycler上进行如下的系列热循环步骤：
94℃  0秒(解链)；
62℃  30秒(退火阶段)；
72℃  30秒(延伸阶段).
进行40个循环.在每个循环的延伸阶段结束时监测一次样品的荧光信号。用逐渐稀释的样品重复这个过程，结果显示于图3中.
阴性对照样品在循环过程结束时仅显示信号少量增加.通过最终的解链曲线分析证实(图4)阴性对照的信号是由于非特异性产物如引物二聚体。
然而结果显示可使用这种方法可检测样品中是否存在细菌孢子。
实施例2
检测试验
对于用作检测试验，将样品添加到封闭的抗体包被的ELISA平板中并且在37℃孵育5到60分钟。
其后，用洗液冲洗平板3到5次.
向平板中添加表达对试验靶特异的scFv的丝状噬菌体悬浮液，孵育5到60分钟.进一步冲洗(3到5次)后，添加常规PCR试剂，连同适当的报道系统如上面所提到的SybrGreen染料。然而，可使用其它报道机制，例如使用荧光报道探针，如
Figure C200480011982D0016145903QIETU
或用于原位监测的其它探针.对反应混合物进行热循环以常规方式实现扩增。
记录产物出现的PCR循环数(荧光阈值交叉点)并且与最初样品中的分析物的浓度联系起来.
可在同一时间添加一个以上具有不同特异性的scFv，测定靶的范围。在这种情况中，可描绘解链分布图以区分存在哪一种scFv并且因此与分析物结合.如果期望的话，可使用噬菌体序列或者在转化的噬菌体中发现的抗生素抗性序列作为PCR的内参照.
实施例3
可选择的过滤试验形式
在这种实施方案中，液体样品通过0.2或0.45微米过滤器，取决于试验靶的性质，然后冲洗过滤器.靶分析物，例如细菌孢子，留在过滤器上.随后，将表达对试验靶特异的scFv的丝状噬菌体悬浮液也通过过滤器，再次冲洗过滤器.然后可通过上述PCR检测结合过滤器上靶的任何噬菌体.
实施例4
以免疫测定形式检测展示抗蜡状芽孢杆菌的单链抗体的噬菌体
将50μl 107个蜡状芽孢杆菌/毫升在dH2O中稀释10倍降低Immulon 2 ELISA平板中的孢子，并且在37℃过夜干燥到平板上。这样将孢子固定到平板上使得它们反映分析物结合固定抗体的状况，正如可能在孢子试验中发生一样.
然后将平板在dH2O中冲洗3次。然后通过添加150μl 1％ blotto/磷酸缓冲盐水(PBS)封闭每个孔，接着将平板在37℃孵育1小时。在PBS-吐温中冲洗平板3次。向每个孔中添加50μl溶于1％blotto/PBS的噬菌体悬浮液，接着将平板在37℃孵育1小时，使得噬菌体结合平板上的孢子.然后在PBS-吐温中冲洗平板3次，随后在dH2O中冲洗3次除去未结合的噬菌体.
然后向每个孔中添加50μl dH2O并且将平板在沸水中加热30秒以便洗脱噬菌体.
然后使用针对噬菌体的引物通过PCR分析每个孔的2μl噬菌体，扩增在M13衍生的噬菌体内发现的1acI基因.使用CorbettRotorGene进行实时PCR。每个三重缓冲的反应含有0.5μM每种正向和反向LacI引物、0.3μM 1acI特异性TaqMan探针、4mM MgCl2.循环参数是95℃ 5秒钟和60℃ 1分钟，进行50个循环.引物、探针和靶如下：
正向引物          5′-CGTGGTGGTGTCGATGGTAG
反向引物          5′-TGTGCACCGCTTT
探针序列          5′-ACGAAG CGGCGTCGAA GCCTG
扩增子            5′-CGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGA AGCGGC
                         GTCGAAGCCTGTAAGCGGCGGTGCACA
在图5中结果显示.结果显示可检测到高于背景水平的每孔106到103个孢子，即使在这种情况中背景水平相当高。这可能是交叉污染的结果.在M13衍生的噬菌体和在实验室中常规使用的M13衍生的克隆载体之间有共有的基因.通过在实验室中建立无M13污染的噬菌体PCR反应或者通过选择对展示蜡状芽孢杆菌抗体的噬菌体特异的引物，可以很容易地提高试验的灵敏度.

Claims (43)

1.一种检测样品中的分析物的量的方法，所述方法包括将所述样品与表达和展示特异结合部分的重组噬菌体接触，这样重组噬菌体与分析物或其类似物，或者分析物的结合部分形成复合物，该复合物结合或不结合表面，取决于样品中存在或缺乏分析物，使用定量核酸扩增反应检测表面上存在或缺乏重组噬菌体的核酸特征，以定量分析被检测的重组噬菌体的量，将该量与样品中分析物的量联系起来。
2.根据权利要求1的方法，其包括将怀疑含有分析物的样品与固定了结合试剂的表面接触，所述结合试剂(a)结合所述分析物，或者(b)包括所述分析物或其类似物，以及表达和展示结合所述分析物或结合与所述分析物竞争的所述结合试剂的结合部分的重组噬菌体，将所述表面与样品分离，以及检测在所述表面上是否存在所述重组噬菌体内存在的核酸序列，其中结合试剂或结合部分中的至少一种对分析物特异。
3.根据权利要求2的方法，其中固定的结合试剂和结合部分两者都结合分析物，以至于样品与表面分离后表面上留有包括结合试剂、分析物和重组噬菌体的复合物，并且表面上存在病毒核酸表示样品中存在分析物。
4.根据权利要求2的方法，其中固定的结合试剂包括分析物或其类似物，以至于结合部分将结合分析物或结合试剂，样品中分析物的存在阻断结合部分与结合试剂结合，因此能结合于结合试剂的重组噬菌体量的减少表示样品中存在分析物。
5.根据权利要求2的方法，其中结合试剂结合分析物，也结合重组噬菌体上的结合部分，以至于分析物和结合部分将竞争表面上可利用的位点，因此能结合于结合试剂的重组噬菌体量的减少表示样品中存在分析物。
6.根据权利要求2-5中任何一项的方法，其中结合试剂是特异性结合试剂。
7.根据权利要求1-5中任何一项的方法，其中表面是ELISA平板或孔、磁珠或膜的表面。
8.根据权利要求1-5中任何一项的方法，其中封闭没有用结合试剂占据的表面上的位点。
9.根据权利要求2的方法，其中按顺序进行下列步骤：
i)将样品与表面一起孵育足够长的时间以确保存在的任何分析物与固定的结合试剂结合，
ii)从表面上除去残余样品，然后冲洗表面以除去任何未结合的分析物，
iii)将表面与重组噬菌体悬浮液接触，并且孵育足够长的时间以允许重组噬菌体结合表面上的分析物；
iv)除去重组噬菌体悬浮液并且冲洗表面；和
v)用定量核酸扩增法检测表面上的重组噬菌体核酸的量。
10.根据权利要求9的方法，其中在步骤(v)前从表面释放重组噬菌体核酸。
11.根据权利要求1-5中任何一项的方法，其中重组噬菌体被转化以至于其表达特异性结合分析物或分析物的特异性结合配偶体的特异性结合部分。
12.根据权利要求11的方法，其中特异性结合配偶体是抗体的单链可变片段(scFV)。
13.根据权利要求1-5中任何一项的方法，其中重组噬菌体包括多特异性混合物。
14.根据权利要求13的方法，其中检测多种核酸序列，每种作为各种重组噬菌体的特征。
15.根据权利要求1-5中任何一项的方法，其中定量核酸扩增反应是定量聚合酶链反应(PCR)。
16.根据权利要求15的方法，其中以扩增产物产生可检测的可视信号的方式进行定量扩增反应。
17.根据权利要求16的方法，其中在存在DNA结合试剂、或者用荧光标记物标记的引物或探针时进行扩增反应。
18.根据权利要求17的方法，其中DNA结合试剂是嵌入染料。
19.根据权利要求1-5中任何一项的方法，其中重组噬菌体用标记序列转化，并且所述标记序列是扩增的序列。
20.根据权利要求1-5中任何一项的方法，其中检测多于重组噬菌体的特征序列。
21.根据权利要求1-5中任何一项的方法，其中在方法中使用一种以上的重组噬菌体，随后进行解链温度分析以测定试验期间哪种重组噬菌体结合。
22.一种定量分析样品中的分析物的方法，所述方法包括将所述样品与固定了结合试剂的表面接触，所述结合试剂(a)结合所述分析物，或者(b)包括所述分析物或其类似物，以及经过转化从而表达和展示结合与所述分析物竞争的所述结合试剂的结合部分的重组噬菌体，将所述表面与样品分离，以及进行定量聚合酶链反应以检测在所述表面上所述重组噬菌体内存在的核酸序列的量，其中结合试剂或结合部分中的至少一种对分析物特异。
23.权利要求22的方法，其中固定的结合试剂包括分析物或其类似物，以至于结合部分将结合分析物或结合试剂，样品中分析物的存在阻断结合部分与结合试剂结合，因此能结合于结合试剂的重组噬菌体量的减少表示样品中存在分析物。
24.权利要求22的方法，其中结合试剂结合分析物，也结合重组噬菌体上的结合部分，以至于分析物和结合部分将竞争表面上可利用的位点，因此能结合于结合试剂的重组噬菌体量的减少表示样品中存在分析物。
25.权利要求22-24中任何一项的方法，其中表面是ELISA平板或孔、磁珠或膜的表面。
26.权利要求22-24中任何一项的方法，其中封闭没有用结合试剂占据的表面上的位点。
27.权利要求22-24中任何一项的方法，其中结合部分是抗体的单链可变片段(scFV)。
28.权利要求22-24中任何一项的方法，其中重组噬菌体包括多特异性混合物。
29.权利要求28的方法，其中检测多种核酸序列，每种作为各种重组噬菌体的特征。
30.权利要求22的方法，其中进行聚合酶链反应，使得扩增产物随反应进程产生可检测信号，在扩增反应的每个循环期间至少一次监测扩增混合物的信号，以确定表面上存在的重组噬菌体的量。
31.权利要求30的方法，其中信号是可视信号。
32.权利要求30或31的方法，其中在存在DNA结合试剂、或者用荧光标记物标记的引物或探针时进行聚合酶链反应。
33.权利要求32的方法，其中DNA结合试剂是嵌入染料。
34.权利要求32的方法，其中反应在探针的存在下进行，其中所述探针包含用荧光能量供体和荧光能量受体分子标记的DNA寡核苷酸，在扩增过程中，与靶序列结合的探针被水解，释放出供体和受体分子。
35.权利要求22-24中任何一项的方法，其中通过扩增一段核酸序列来检测重组噬菌体核酸，所述核酸序列是该方法所用的特定重组噬菌体的特征。
36.权利要求35的方法，其中用标记物序列转化重组噬菌体，所述标记物序列是被扩增的序列。
37.权利要求35的方法，其中检测多于重组噬菌体的特征序列。
38.权利要求1-5和22-24中任何一项的方法，其中使用了一种以上重组噬菌体，随后进行解链温度分析，以确定在测试过程中结合了哪种重组噬菌体。
39.一种检测样品中是否存在分析物的试剂盒，所述试剂盒包括在其表面上固定了结合试剂的固体，所述结合试剂(a)结合所述分析物，或者(b)包括所述分析物或其类似物，表达结合所述分析物或结合与所述分析物竞争的所述结合试剂的特异性结合部分的重组噬菌体，以及能够进行用于扩增和检测所述重组噬菌体的核酸的定量聚合酶链反应的试剂。
40.根据权利要求39的试剂盒，其中重组噬菌体表达特异性结合部分，所述部分结合所述分析物或结合与所述分析物竞争的所述结合试剂。
41.根据权利要求39或权利要求40的试剂盒，其包括一种以上类型的重组噬菌体。
42.根据权利要求39或权利要求40的试剂盒，其中能够进行用于扩增和检测所述重组噬菌体的核酸的定量聚合酶链反应的试剂包括DNA探针，所述DNA探针包含荧光能量供体分子和荧光能量受体分子。
43.根据权利要求39或权利要求40的试剂盒，其包括嵌入染料。
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