JP4601427B2 - 細胞上および生物学的混合物中の抗原の検出のための組成物、方法およびキット - Google Patents
細胞上および生物学的混合物中の抗原の検出のための組成物、方法およびキット Download PDFInfo
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Description
本発明は、細胞上の抗原をもつ部分の存在の検出方法を包含する。該方法は、a)抗原をもつ部分と特異的に結合することが既知の抗体を発現するバクテリオファージと細胞を接触させること(バクテリオファージは核酸を含んでなりかつ核酸の配列は少なくとも部分的に既知である);b)細胞と特異的に結合するバクテリオファージを変性させて核酸を放出させること;およびc)核酸を検出し(核酸の検出は細胞上の抗原をもつ部分の存在を検出する)それにより細胞上の抗原をもつ部分の存在を検出することを含んでなる。
[発明の詳細な記述]
定義
本明細書で使用されるところの以下の用語のそれぞれは本節においてそれと関連する目的の範囲を有する。
記述
本発明は細胞上若しくは生物学的サンプル中の目的の分子の存在の検出方法に関する。典型的には、RBC表面上で発現される赤血球抗原が検出されるが、しかし、本発明は、限定されるものでないが赤血球および白血球、ならびに血小板、ならびに移植治療に使用される細胞を挙げることができる多数の細胞上の目的の多数の抗原の存在を検出すること、ならびにとりわけ法廷の目的上の細胞(例えば毛髪、皮膚、爪、精子、唾液および他の細胞)上の抗原の同定を包含する。
I.方法
A.抗原の検出方法
本発明は細胞上の抗原をもつ部分の存在の検出方法を包含する。該方法は、抗原をもつ部分が細胞上に存在する場合にそれと特異的に結合することが既知である抗体を発現するバクテリオファージと細胞を接触させることを含んでなる。こうしたファージに表示された抗体ならびにそれらの製造方法は当該技術分野で公知であり、そしてとりわけ全部Siegelへの米国特許第5,876,925号、同第5,985,543号および同第6,255,455号明細書に記述される。これらの抗体を表示するバクテリオファージは抗Rh(D)および抗B特異的抗体を表示するファージにより本明細書に例示される。しかしながら、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明がこれらの若しくは本明細書に開示される特定のバクテリオファージ上に表示されるいずれかの他の特定の抗体に制限されないことを理解するであろう。むしろ、該ファージにより表示される抗体はいずれの細胞成分にも特異的であり得、そして、目的の抗原に対するファージが表示する抗体の製造技術は当該技術分野で公知でありかつ本発明に包含される。
B.複数の抗原の検出
本発明は細胞上の最低2種の異なる抗原をもつ部分の存在の検出方法を包含する。該方法は、それぞれが1種の抗原を特異的に結合する1種の抗体をコードかつ発現する最低2種の異なるバクテリオファージを接触させることを含んでなり、該2種の抗体は同一抗原を結合しない。細胞と非特異的に結合するいかなるファージも(例えば細胞を洗浄することにより)除去し、そしていかなる結合したバクテリオファージの存在もファージ中に存在する核酸を検出することにより検出する。すなわち、本明細書の別の場所でより完全に記述されるとおり、ファージ粒子中に存在する核酸の配列若しくはその一部分が露出され、そして、核酸の存在(すなわちその既知の核酸配列の存在)を当該技術分野で公知の方法を使用して検出する。各バクテリオファージは、同一サンプル中に存在する他のバクテリオファージ中に存在する核酸配列と識別可能である核酸配列を含んでなるため、多様な抗原の存在を単一のサンプル混合物中で検出し得る。こうした「多重」アッセイは抗体に基づく検出方法を使用して可能でない。細胞と結合した抗体の存在を検出するのに使用される試薬は各抗体を容易に識別し得ないからである。さらに、慣習的血液型分類は細胞と結合した抗体の存在を検出する試薬を使用しない。多くの血液型分類試薬(典型的には十価のIgM)は細胞を直接凝集させるからである。それらのアッセイにおいては反応を多重化し得ず、どの試薬が凝集反応を引き起こしたかを決定することは可能でないとみられる。しかしながら、複数の独特の核酸配列を検出することに基づく方法は、本明細書に示されるとおり、ファージにより発現される抗体分子を介してそれらの抗原に結合(boundo to)/それらと連結(linked with)したファージ粒子内に存在する核酸配列を検出することにより多様な抗原についてアッセイすることを可能にする。
C.血清中の抗体の検出
本発明は血清中の自己抗体若しくは同種抗体の存在の検出方法、より具体的にはヒト血清中に存在する抗赤血球抗体の検出方法(間接的抗グロブリン検査)を包含する。該方法は、最低1種の赤血球抗原を発現するヒト赤血球を、アッセイされるべき血清サンプルと接触させることを含んでなる。細胞を洗浄して非特異的に結合した抗体を除去し、そして細胞をその後、その表面上に抗グロブリン試験を表示するバクテリオファージと接触させる。細胞と結合されるヒト抗体(IgG、IgMなど)が存在する場合、該バクテリオファージは該ファージにより表示される抗グロブリン試験を介して結合することができる。その後、(細胞上のヒト抗体との結合を介して)細胞と特異的に結合するファージの存在を、バクテリオファージ中に存在する既知の核酸配列の検出に基づいて本明細書に開示されるとおり検出し得る。こうして、細胞の一団の抗原組成が既知である場合に、細胞のこの参照一団を使用してその表面上の抗グロブリンを表示するバクテリオファージの核酸を単純かつ迅速に検出することによりいかなるサンプル中のこれらの抗原に対する抗体の存在についてもアッセイし得、その結果、「遺伝子型分類による表現型分類」を使用して効率および感受性を増大させ得ならびに以前は抗体に基づく検出方法を使用して実施されたアッセイを自動化し得る。
D.赤血球上の抗体若しくは補体フラグメントの検出
本発明は、赤血球の表面に結合される自己抗体、同種抗体若しくは補体フラグメントの存在の検出方法、より具体的には、自己免疫性溶血性貧血の診断方法若しくは輸血された赤血球の同種免疫破壊の測定方法(直接抗グロブリン検査)を包含する。該方法は、赤血球のサンプルを洗浄して非特異的に結合した抗体を除去すること、およびその後その表面上に抗グロブリン試薬を表示するバクテリオファージと該細胞を接触させることを含んでなる。細胞と結合したヒト抗体若しくは補体が存在する場合、バクテリオファージは該ファージにより表示される抗グロブリン試薬を介して結合することができる。その後、(細胞上のヒト抗体若しくは補体との結合を介して)細胞と特異的に結合したファージの存在を、バクテリオファージ中に存在する既知の核酸配列の検出に基づいて本明細書に開示されるとおり検出し得る。こうして、「遺伝子型分類による表現型分類」を使用して効率および感受性を増大させ得、ならびに以前は抗体に基づく検出方法を使用して実施されたアッセイを自動化し得る。
E.ドナー/レシピエント適合性検査の実施
本発明は患者血清中の抗体と輸血に意図された血液一単位から抜き出した赤血球のアリコートとの間の適合性すなわち非反応性の確認方法(交差適合試験)を包含する。該方法は、特徴付けされたドナー赤血球のサンプルを試験されるべき患者血清サンプルと接触させることを含んでなる。細胞を洗浄して非特異的に結合した抗体を除去し、そしてその後、その表面上に抗グロブリン試薬を表示するバクテリオファージと該細胞を接触させる。不適合の交差適合を伴う場合でそうであろうように細胞と結合するヒト抗体が存在する場合は、バクテリオファージが該ファージにより表示される抗グロブリン試薬を介して結合することができる。その後、(細胞上のヒト抗体との結合を介して)細胞と特異的に結合したファージの存在を、バクテリオファージ中に存在する既知の核酸配列の検出に基づいて本明細書に開示されるとおり検出し得る。こうして、「遺伝子型分類による表現型分類」を使用して、効率および感受性を増大させ得、ならびに以前は抗体に基づく検出方法を使用して実施されたアッセイを自動化し得る。
II.キット
本発明は、目的の抗原に対する既知の特異性をもつ抗体を表示するバクテリオファージ、該ファージ中に存在する既知の核酸配列を増幅するためのプライマー対、バクテリオファージ中に含有される核酸中に存在する既知配列を検出するための分子ビーコン、IDAT反応での使用のための試薬(例えばT7 RNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、dNTPなど)のような化合物、ならびに/若しくは本発明の組成物、アプリケーター、および本発明の方法を実施するための化合物の使用を記述する説明資料、ならびに先行する成分のいずれかの組合せを含んでなる多様なキットを包含する。例示的キットを下述するとは言え、他の有用なキットの内容が本開示に照らして当業者に明らかであろう。これらのキットのそれぞれが本発明内に包含される。
ファージディスプレイ技術
繊維状バクテリオファージ粒子の表面上に表示されるRBC抗原特異的モノクローナル抗体が、提案される技術の中核にある(Siegel、2001、Transfusion Med.Rev.15:35−52に総説される)。Bリンパ球からのモノクローナル抗体の高価かつ時間のかかる慣習的な細胞的生成方法と対照的に、抗体ファージディスプレイは、免疫グロブリン遺伝子が由来する細胞ではなく、その遺伝子を不死化することによりはたらく。細胞形質転換の代わりに分子的方法を使用することにより、B細胞の集団からファージ粒子の「ライブラリー」を製造し、それぞれの粒子は外側に特定の抗体特異性を表示しかつ内側に該抗体の独特のDNA配列を含有する。
ポリメラーゼ連鎖反応を使用するファージDNAの増幅:
一局面において、RBC特異的なファージに表示される抗体、例えば抗Rh(D)を発現するファージ粒子の結合を、例えば結合されたファージ粒子を加熱してファージコートを変性させる場合に露出される抗Rh(D)の核酸配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの添加により検出した。一方のプライマーは(抗体特異性に関係なく)ファージDNA中に含有される包括的配列に相補的であり得、そして他方のプライマーは例えば限定されるものでないが抗体のH鎖のCDR3超可変領域を挙げることができるそのファージに特異的な配列(すなわち所定の抗体に独特である配列)に相補的であり得る。結果として生じる増幅された抗体DNAの測定は、検査されている細胞の表面上のその抗体のコグネイトの抗原の存在を示し得る。いずれかの特定の論理により束縛されることを願わずに、多数の異なるファージに表示される血液型抗体を赤血球の同一のサンプルに同時に接触させ得、そして、抗体ヌクレオチド配列中の差異を活用して、異なるファージ上に表示される抗Bおよび抗Rh(D)抗体を使用して本明細書で示されるとおり、どのものが結合しかつどのものがしなかったかを決定し得る。こうした「多重化」は、どの抗体(1種若しくは複数)が凝集反応を引き起こしたかを判別し得なかったところの凝集反応法により可能でない。
転写媒介性の増幅を使用するファージDNAの増幅
ファージDNA増幅段階(図1中の段階B)にPCRを使用することに加え、その増幅の代わりにファージ抗体DNAの転写の検出に基づく方法を本発明の方法で使用し得る。より具体的には、本方法による免疫検出を使用して、T7 RNAポリメラーゼプロモーター部位を含有するオリゴヌクレオチドがZhangら(2001、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:5497−5502)に記述されるとおりグルタールアルデヒドで化学的に結合されている抗体の結合を検出した。ファージ粒子中のその物理的会合に基づき抗体にin vivoで結合されているDNAの転写のためのこの技術をPCRおよび他の増幅技術の一代替として使用し得る。この技術はIDATと命名されており、これはT7 RNAにより増幅される免疫検出(immuno−detection amplified by T7 RNA)を表す(Zhangら、2001、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:5497−5502)。ファージミドDNA中で自由裁量の配列標識から上流にT7 RNAポリメラーゼプロモーター部位を置くことにより、T7 RNAポリメラーゼおよびNTPの添加がそれらのプロモーターへのT7酵素の連続的かつ漸進的な結合により迅速に(1秒あたり100塩基)標識転写物を産生する。
分子ビーコンを使用するファージDNAの検出:
分子ビーコンは5’端に蛍光標識および3’端に普遍的クエンチャーをもつステム・ループ構造のオリゴヌクレオチドである(例えばTyagiとKramer、1996、Nature Biotech.14:303−308;Brounde、2002、Trends in Biotechnology 20:249−256を参照されたい)。ステムが閉鎖される(相補核酸の非存在下で)場合、フルオロフォアおよびクエンチャーが密接な近位にあり、そして蛍光エネルギーがクエンチャーにより吸収されかつ蛍光が消光されかつ検出可能でない。相補核酸の存在下では、ビーコンのループがハイブリダイズし、そして消光が起こらないようにフルオロフォアおよびクエンチャーが分離する。その後光量子がフルオロフォアから発射され、そのフルオロフォアに特異的な波長でクエンチ解除されそして蛍光がその後検出可能となる。それぞれそれらの5’端に異なるフルオロフォアをもつ多数のビーコンを1本のチューブ中で組合せることにより、複数のDNA(Tyagiら、1998、Nature Biotech.16:49−53)若しくはRNA(de Baarら、2001、J.Clin.Microbiol.39:1895−1902)標的を、反応容器から発射される色のスペクトルを測定することにより同時に検出し得る。
オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用するファージDNAの検出:
分子ビーコンに加え、相補的オリゴヌクレオチドプローブのアレイへの蛍光RBCファージ抗体アンプリコン(PCRから)若しくは転写物(IDATを使用して製造される)のハイブリダイゼーションを使用して、サンプル中の結合した抗体の量(あれば)を間接的に定量し得る。さらに、こうしたマイクロアレイへの慣習的ハイブリダイゼーション方法の使用は拡散に制限され(diffusion limited)かつ十分な蛍光シグナルを得るのに数時間を必要としうるとは言え、この過程は、Suら(2002、Electrophoresis 23:1551−1557)に記述されるところの安価なインジウムスズ酸化物被覆したスライドガラスの表面を横切る電場の適用により2〜3桁だけ加速し得る。「オリゴヌクレオチドマイクロアレイへの電場加速型ハイブリダイゼーション」として当該技術分野で既知のこの過程は迅速な結果を提供し、例えばDNA(若しくはRNA)の適用から読み出しまでの時間が約10分未満である。従って、電場加速型ハイブリダイゼーションを使用して、細胞(例えば赤血球、血小板など)上に存在する目的の抗原の迅速な検出をさらに高め得る。
ファージDNA分析を使用する抗血液型Bおよび抗Rh(D)型分類
本明細書に開示されるデータは、本発明の新規方法を使用するRBC上の抗血液型Bおよび抗Rh(D)抗原の検出を示す。すなわち、双方とも免疫した個体から構築したファージディスプレイライブラリーのパニングから以前に単離された(ChangとSiegel、2001、Transfusion.41:6−12;Siegelら、1997、J.Immunol.Meth.206:73−85)2種のファージに表示されるヒトモノクローナル抗体すなわち抗血液型Bおよび抗Rh(D)を使用して、これら2種の抗原の多重化検出を示した。
ファージに表示される抗RBC型分類試薬の開発
ファージに表示される抗RBCモノクローナル抗体をクローン化、製造およびその性能特徴を検証するために利用される方法は、多数の刊行物(例えば、Siegel、2002、Methods in Molecular Biology:Antibody Phage Display:Methods and Protocols、vol.178、pp.219−226、AitkemとO’Brien編、Humana Press、ニュージャージー州トトワ中;Sigel、2000、Phage Display of Proteins and Peptides:A Laboratory Manual、vol.23、pp.23.21−23.32、Cold Spring Harbor Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー中;SigelとChang、1997、Antibody Engineering:New Technologies,Applications,& Commuercialization,IBC、マサチューセッツ州ボストン中)ならびにいくつかの発行された米国特許(上記を参照されたい)の焦点であった。B、Rh(D)、MおよびN以外のRBC抗原特異性が単離された試料(残余の末梢血、脾組織、骨髄など)は、残余の診断的患者物質を使用して既に達成された。
迅速かつ拡大可能なファージ抗体検出の方法論
PCRにより増幅若しくはT7 RNAポリメラーゼにより転写し得そしてその後独特の分子ビーコンの対応する対若しくはマイクロアレイ化オリゴヌクレオチドにより検出し得る独特な標識をファージ抗体がそれぞれ含有するように抗RBC血液型、例えば抗Bおよび抗Rh(D)抗体のファージミドDNAを改変する。該標識は、抗体発現を破壊せずかつファージコート上に表示されないようにファージミドDNA中に抗B若しくは抗Rh(D)コーディング領域の外側に挿入する(例えば図4を参照されたい)。迅速な多重化されたRBCの表現型分類の効率を最大化するために性能特徴を評価するための改変された一組の抗RBCファージに表示される抗体を使用して、選択された数の核酸増幅/検出スキームを実施する。
血清中の自己および同種抗体の検出
本アッセイは、慣習的抗グロブリン試薬についての抗グロブリンを発現するファージ粒子の置換、および該バクテリオファージ中に存在する既知の核酸配列の検出に基づき本明細書に開示されるところの結合されたファージ試薬の検出を伴い、標準的な間接的抗グロブリン検査(例えばMollison、1997、Blood Transfusion in Clinical Medicine、第10版、Blackwell Scientific Publications、英国オックスフォード中を参照されたい)に類似の様式で実施する。簡潔には、既知の抗原組成の試薬赤血球の一団のメンバーをそれぞれ患者血清のアリコートともにインキュベートする。細胞を洗浄して非特異的に結合した抗体を除去し、そしてその後、抗グロブリン試薬を表示するバクテリオファージと該細胞を接触させる。抗グロブリン試薬は、所望の場合は全部のヒト免疫グロブリンアイソタイプに特異的、またはIgM若しくはIgGのような1クラスのみに特異的であり得る。免疫血液学の分野で公知のアルゴリズムを使用して、一団の赤血球との血清の反応性のパターンに基づき、患者血清中に存在する抗赤血球抗体の特異性(1種若しくは複数)を決定する。
赤血球上の抗体若しくは補体フラグメントの検出
本アッセイは、慣習的抗グロブリン試薬についての抗グロブリンを発現するファージ粒子の置換、および該バクテリオファージ中に存在する既知の核酸配列の検出に基づき本明細書に開示されるところの結合されたファージ試薬の検出を伴い、標準的な直接抗グロブリン検査(例えばMollison、1997、Blood Transfusion in Clinical Medicine、第10版、Blackwell Scientific Publications、英国オックスフォードを参照されたい)に類似の様式で実施する。簡潔には、赤血球のサンプルを洗浄して非特異的に結合した抗体を除去し、そしてその後、その表面上に抗グロブリン試薬を表示するバクテリオファージと接触させる。抗グロブリン試薬調製物はIgG、補体C3d若しくは双方に特異的な分子(例えば抗IgG抗体、抗C3d抗体、双方、など)を含み得る。細胞と結合されるヒト抗体若しくは補体が存在する場合、バクテリオファージは該ファージにより表示される抗グロブリン試薬を介して結合する。その後、(細胞上のヒト抗体若しくは補体との結合を介して)細胞と特異的に結合するファージの存在を、該バクテリオファージ中に存在する既知の核酸配列の検出に基づき本明細書に開示されるとおり検出する。
ドナー/レシピエント適合性検査の実施
本アッセイは、慣習的抗グロブリン試薬についての抗グロブリンを発現するファージ粒子の置換、および該バクテリオファージ中に存在する既知の核酸配列の検出に基づき本明細書に開示されるところの結合されたファージ試薬の検出を伴い、標準的なクームス交差適合試験(例えばMollison、1997、Blood Transfusion in Clinical Medicine、第10版、Blackwell Scientific Publications、英国オックスフォード中を参照されたい)に類似の様式で実施する。簡潔には、該方法はドナー赤血球のサンプルを患者血清サンプルと接触させることを含んでなる。細胞を洗浄して非特異的に結合した抗体を除去し、そしてその後、その表面上に抗グロブリン試薬(例えば抗IgM若しくは抗IgG)を表示するバクテリオファージと細胞を接触させる。不適合性の交差適合で真実であろうように、細胞と結合したヒト抗体が存在する場合は、該バクテリオファージは該ファージにより表示される抗グロブリン試薬を介して結合する。(細胞上のヒト抗体との結合を介して)細胞と特異的に結合されるファージの存在は、バクテリオファージ中に存在する既知の核酸配列の検出に基づき本明細書に開示されるとおり検出される。
Claims (34)
- 細胞上の抗原をもつ部分の存在を検出する方法において、
a)前記抗原をもつ部分と特異的に結合することが既知の抗体を発現するバクテリオファージであって、核酸を含んでなりかつ前記核酸の配列が少なくとも部分的に既知である前記バクテリオファージと細胞を接触させる工程、
b)前記細胞と特異的に結合する前記バクテリオファージを変性させて前記核酸を放出させる工程、および
c)前記核酸を検出する工程であって、かつ、前記核酸の検出が前記細胞上の前記抗原をもつ部分の存在を検出するものである工程
を含むことを特徴とする、上記方法。 - 工程(c)の前に前記核酸を増幅することをさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)と工程(b)との間で前記細胞を洗浄する工程をさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が赤血球でありかつ前記抗原をもつ部分が赤血球抗原である、請求項1に記載の方法。
- 前記赤血球抗原が、A、B、Rh(D)、Rh(C)、Rh(c)、Rh(E)、Rh(e)、K、Fya、Fyb、M、N、S、s、JkaおよびJkbよりなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞が白血球でありかつ前記抗原をもつ部分が白血球抗原、単球抗原および顆粒球抗原よりなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が血小板でありかつさらに前記抗原をもつ部分が血小板抗原である、請求項1に記載の方法。
- 前記血小板抗原が、HPA−1a、HPA−1b、HPA−2a、HPA−2b、HPA−3a、HPA−3b、HPA−4a、HPA−4b、HPA−5a、HPA−5b、HPA−6b、HPA−7b、HPA−8b、HPA−9b、HPA−10b、GovaおよびGovbよりなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記核酸が分子ビーコンプローブに相補的な配列を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記配列が、配列番号3の配列および配列番号4の配列よりなる群から選択される配列に相補的である、請求項9に記載の方法。
- 前記分子ビーコンプローブの配列が、配列番号7の配列、配列番号8の配列、配列番号9の配列および配列番号10の配列よりなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記分子ビーコンプローブがフルオロフォアを含んでなる、請求項9に記載の方法。
- 前記核酸がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して増幅される、請求項2に記載の方法。
- 前記PCRが、配列番号1の配列および配列番号2の配列よりなる群から選択されるプライマーを使用することを含んでなる、請求項13に記載の方法。
- 前記核酸が、T7 RNAにより増幅される免疫検出(IDAT)を使用する転写により増幅される、請求項2に記載の方法。
- 細胞上の最低二種の異なる抗原をもつ部分の存在を検出する方法において、
a)第一の抗原をもつ部分と特異的に結合することが既知の抗体を発現する第一のバクテリオファージであって、第一の核酸を含んでなりかつ前記第一の核酸の配列が少なくとも部分的に既知である前記第一のバクテリオファージと細胞を接触させる工程、
b)第二の抗原をもつ部分と特異的に結合することが既知の抗体を発現する第二のバクテリオファージであって、第二の核酸を含んでなりかつ第二の前記核酸の配列が少なくとも部分的に既知でありかつ前記第一の核酸の配列が前記第二の核酸の配列と検出可能に異なる前記第二のバクテリオファージと前記細胞を接触させる工程、
c)前記第一の核酸の存在を検出することにより前記抗原をもつ部分との前記第一のバクテリオファージの結合を検出する工程であって、かつ、前記第一の核酸の検出が前記細胞上の前記第一の抗原をもつ部分の存在を検出するものである工程、
d)前記第二の核酸の存在を検出することにより前記抗原をもつ部分との前記第二のバクテリオファージの結合を検出する工程であって、かつ、前記第二の核酸の検出が前記細胞上の前記第二の抗原をもつ部分の存在を検出するものである工程
を含むことを特徴とする、上記方法。 - ヒト血清中の抗赤血球抗体の存在の検出方法において、
a)ヒト赤血球の表面上に最低1種のヒト赤血球抗原を発現するヒト赤血球をヒト血清と接触させる工程、
b)前記細胞を洗浄して、前記細胞と非特異的に結合した抗体を除去する工程、
c)抗ヒトグロブリン試薬を発現するバクテリオファージであって、核酸を含んでなりかつ前記核酸の配列が少なくとも部分的に既知である前記バクテリオファージと前記細胞を接触させる工程、
d)前記細胞と特異的に結合した前記バクテリオファージを変性させて前記核酸を放出させる工程、および
e)前記核酸を検出する工程であって、かつ、前記核酸の検出が前記血清中の抗赤血球抗体の存在を検出するものである工程
を含むことを特徴とする、上記方法。 - 前記抗ヒトグロブリン試薬が、抗ヒトIgG、抗ヒトIgM、抗ヒトκ/λ L鎖抗体、ブドウ球菌プロテインA、ブドウ球菌プロテインGおよびペプトストレプトコッカスのプロテインLよりなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 段階(e)の前に前記核酸を増幅することをさらに含んでなる、請求項17に記載の方法。
- 前記抗体が自己抗体および同種抗体よりなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- ヒトにおける抗赤血球自己抗体の存在の検出方法において、
a)ヒト由来の赤血球を用意する工程、
b)前記細胞を洗浄して、前記細胞と非特異的に結合した抗体を除去する工程、
c)抗ヒトグロブリン試薬を発現するバクテリオファージであって、核酸を含んでなりかつ前記核酸の配列が少なくとも部分的に既知である前記バクテリオファージと前記細胞を接触させる工程、
d)前記細胞と特異的に結合した前記バクテリオファージを変性させて前記核酸を放出させる工程、および
e)前記核酸を検出する工程であって、かつ、前記核酸の検出が前記ヒトにおける抗赤血球自己抗体の存在を検出するものである工程
を含むことを特徴とする、上記方法。 - 工程(e)の前に前記核酸を増幅することをさらに含んでなる、請求項21に記載の方法。
- サンプル中のリガンドの存在の検出方法において、
a)リガンドと特異的に結合することが既知の受容体を発現するバクテリオファージであって、核酸を含んでなりかつ前記核酸の配列が少なくとも部分的に既知である前記バクテリオファージと細胞を接触させる工程、
b)前記細胞と特異的に結合する前記バクテリオファージを変性させて前記核酸を放出させる工程、および
c)前記核酸を検出する工程であって、かつ、前記核酸の検出がサンプル中の前記リガンドの存在を検出するものである工程
を含むことを特徴とする、上記方法。 - 前記リガンドが細胞上に存在する、請求項23に記載の方法。
- 前記サンプルがヒトから得られた生物学的サンプルである、請求項23に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが細胞サンプルである、請求項25に記載の方法。
- 前記細胞サンプルが赤血球を含んでなりかつ前記リガンドが赤血球抗原でありかつさらに前記受容体が抗体である、請求項26に記載の方法。
- 工程(c)の検出の前に前記核酸を増幅することをさらに含んでなる、請求項23に記載の方法。
- 細胞上の抗原をもつ部分の存在を検出するためのキットにおいて、
前記細胞上の抗原をもつ部分と特異的に結合することが既知の抗体を発現するバクテリオファージであって、核酸を含んでなりかつ前記核酸の配列が少なくとも部分的に既知である前記バクテリオファージ、アプリケーター、およびさらにそれらの使用のための説明資料を含んでなり、かつ、該説明資料が、
a)抗原をもつ部分と特異的に結合することが既知の抗体を発現するバクテリオファージであって、核酸を含んでなりかつ前記核酸の配列が少なくとも部分的に既知であるバクテリオファージと細胞を接触せしめること、
b)前記細胞と特異的に結合した前記いずれかのバクテリオファージを変性して前記核酸を放出せしめること、次いで
c)前記細胞上の前記抗原をもつ部分の存在を検出するために前記核酸を検出せしめ、それにより、前記細胞上の抗原をもつ部分の存在を検出すること
を指示するものである、
上記キット。 - 前記抗原をもつ部分が、A、B、Rh(D)、Rh(C)、Rh(c)、Rh(E)、Rh(e)、K、Fya、Fyb、M、N、S、s、JkaおよびJkbよりなる群から選択される赤血球抗原である、請求項29に記載のキット。
- 分子ビーコンプローブをさらに含んでなり、前記プローブの核酸配列が配列番号3の配列および配列番号4の配列よりなる群から選択される配列に相補的な配列から選択される、請求項30に記載のキット。
- 前記分子ビーコンプローブの配列が、配列番号7の配列、配列番号8の配列、配列番号9の配列および配列番号10の配列よりなる群から選択される、請求項31に記載のキット。
- PCRプライマーをさらに含んでなる、請求項30に記載のキット。
- 前記プライマーの配列が配列番号1の配列および配列番号2の配列よりなる群から選択される、請求項33に記載のキット。
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