JP2022552151A - 初代ヒト細胞における、同族t細胞及びエピトープ反応性をスクリーニングするハイスループット法 - Google Patents
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Abstract
個体自身の血液細胞が、HLAハプロタイプ特異的試薬を用いることなく、対象となる個別の抗原、例えばT細胞エピトープに対して機能的にスクリーニングされることができる、自己由来の初代免疫細胞アッセイについて記載する。抗原反応性は、オリゴヌクレオチドタグ細分化追跡システムを用いて個別のT細胞と結びつき、反応性はその後、シングルセル配列決定により逆畳み込みされる。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条(e)により、2019年10月3日に出願された、米国特許仮出願番号第62/910,379号の優先権を主張し、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本出願は、米国特許法第119条(e)により、2019年10月3日に出願された、米国特許仮出願番号第62/910,379号の優先権を主張し、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている。
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ファイル10669_ST25.txtに記載する配列表は5キロバイトであり、2020年10月2日に作製され、参照により本明細書に組み込まれる。
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ヒト疾患における抗原特異的T細胞活性への関心に一層焦点が当てられるようになっているため、エピトープ特異的TCR配列を、HLAの文脈で提示される同族エピトープと相関させることができることが必要とされている。しかし、どのエピトープが、生産的なT細胞の活性化、及び、応答するT細胞のTCR配列をもたらすかを識別することは、歴史的に、技術上問題のある課題となって現在まで続いている。
抗原特異的T細胞結合及び反応性を評価するために使用する従来の方法としては、T細胞が、サイトカインまたは細胞溶解応答により検出されるエピトープに再曝露される、多量体染色及び機能的T細胞アッセイ(例えばELISPOT、細胞殺傷アッセイ)が挙げられる。これらの方法は有用である一方で、ハイスループットで反応性の可能性を評価するために、高価な個別のHLAハプロタイプ特異的試薬(多量体)及び多量の血液量を必要とする可能性がある。加えて、HLAクラスII(CD4+ T細胞)多量体はほとんど存在しないため、多量体に基づく調査は、HLAクラスI(CD8+ T細胞)反応性に焦点が当てられる。
したがって、とりわけ、TCRの同族TCRα及びβポリペプチドを、TCRにより認識されるエピトープと相関させる情報をもたらすことが可能なハイスループット法が必要とされている。
対象となる複数のT細胞エピトープに対するCD8+及び/またはCD4+ T細胞が同時にアッセイ可能な、自己及び初代免疫細胞で使用可能な免疫細胞アッセイを本明細書に記載する。抗原の反応性は、ハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)追跡システムを用いて個別のT細胞と結びつけられ、この関連付けが、後で、シングルセル配列決定により逆畳み込みされ、(a)エピトープ特異性、(b)シングルセルの対形成したアルファ/ベータ鎖TCR配列、(c)内因性シングルセルRNAトランスクリプトーム情報、(d)細胞表面タンパク質発現(例えば、CITE-seq抗体を用いる)、(e)多量体染色(多量体が含まれる場合)、及びこれらの任意の組み合わせなどのシングルセルレベルの情報を提供することができる。したがって、免疫細胞アッセイ法、そのための組成物及びキット、ならびに、例えば、TCR治療薬を作製するための、その使用を本明細書で提供する。
一実施形態では、本明細書に記載する方法は、例えば、活性化誘発マーカー(AIM)の、活性化T細胞の発現に基づき、他の細胞、例えば自己抗原提示細胞(APC)を含む組成物から、活性化T細胞をソートすることであって、活性化T細胞がHTOコンジュゲート分子で標識される、上記ソートすることを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する(例えば、T細胞、ならびに任意選択的に、抗原に特異的に結合するT細胞受容体(TCR)の、TCRα鎖配列、及び/またはTCRβ鎖配列を活性化可能な前記抗原を識別するための)方法は、
(I)活性化誘発マーカー(AIM)の発現に基づき、活性化T細胞を、固有の生体サンプルを含む組成物からソートすることであって、固有の生体サンプルが、(a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記T細胞及びMHC、(b)固有の抗原、(c)固有の抗原を特異的に識別ために使用可能な(及び/または、特異的に識別する)固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、固有のHTOが、T細胞を固有のHTOで標識する分子にコンジュゲートした、上記固有のHTO、ならびに、任意選択的に、(d)T細胞の活性化を支持する培地を含む、上記ソートすることと、
(II)(I)でソートした活性化T細胞でシングルセル配列決定分析を行い、活性化T細胞を固有のHTOで標識した分子にコンジュゲートした固有のHTOを識別することであって、固有のHTOを識別することが、活性化T細胞を活性化可能な抗原を識別し、任意選択的に、シングルセル配列決定分析が、(i)活性化T細胞により発現する1つ以上の遺伝子、及び/または、(ii)活性化T細胞により発現されるTCRのTCRα及び/またはβ鎖配列もまた識別する、上記識別することと、
を含む。
(I)活性化誘発マーカー(AIM)の発現に基づき、活性化T細胞を、固有の生体サンプルを含む組成物からソートすることであって、固有の生体サンプルが、(a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記T細胞及びMHC、(b)固有の抗原、(c)固有の抗原を特異的に識別ために使用可能な(及び/または、特異的に識別する)固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、固有のHTOが、T細胞を固有のHTOで標識する分子にコンジュゲートした、上記固有のHTO、ならびに、任意選択的に、(d)T細胞の活性化を支持する培地を含む、上記ソートすることと、
(II)(I)でソートした活性化T細胞でシングルセル配列決定分析を行い、活性化T細胞を固有のHTOで標識した分子にコンジュゲートした固有のHTOを識別することであって、固有のHTOを識別することが、活性化T細胞を活性化可能な抗原を識別し、任意選択的に、シングルセル配列決定分析が、(i)活性化T細胞により発現する1つ以上の遺伝子、及び/または、(ii)活性化T細胞により発現されるTCRのTCRα及び/またはβ鎖配列もまた識別する、上記識別することと、
を含む。
本明細書に記載するいくつかの方法は、ソート工程の前に、複数の生体サンプル、例えば固有の生体サンプルを作製し、ソートした組成物が、複数の固有の生体サンプルを含むようにすることをさらに含む。いくつかの方法の実施形態は、ソートする前に、対象から単離したT細胞及び抗原提示細胞(APC)を含む細胞の集まりを、個別のサンプルに等しく分配することにより、複数の生体サンプルを作製する工程であって、各生体サンプルが任意選択的に、T細胞及び/またはAPC生存能、活性化及び/または活性を支持する培地及びサイトカインを含む、上記工程を含む。
いくつかの方法の実施形態は、ソートする前に、固有の抗原を特異的に識別するために使用可能な(及び/または、特異的に識別する)、複数の生体サンプル、単独の固有の抗原、及び/または単独の固有のHTOのそれぞれを送達することにより、複数の固有の生体サンプルを作製する工程であって、固有のHTOが、T細胞を固有のHTOで標識する分子にコンジュゲートし、複数の生体サンプルのそれぞれが、対象から単離したT細胞及びAPCを含む細胞の集まりを含み、固有の抗原及び/またはT細胞を固有のHTOで標識する分子にコンジュゲートした固有のHTOの送達後、複数の生体サンプルのそれぞれが、(a)対象から単離したT細胞及びAPCを含む細胞の集まり、(b)固有の抗原、(c)固有の抗原を特異的に識別し、T細胞をHTOで標識する分子にコンジュゲートした固有のHTO、ならびに任意選択的に、(d)T細胞及びAPCの生存能、活性、及び/または活性化を支持する培地を含む固有の生体サンプルになる、上記工程を含む。任意選択的に、複数の固有の生体サンプルは、本明細書に記載の方法でソートする前にプールし、(I)でソートされた組成物が複数の固有の生体サンプルを含むようにすることができる。本明細書のいくつかの方法の実施形態は、ソート工程の前に、複数の生体サンプルを作製し、(例えば、複数の生体サンプルから)複数の固有の生体サンプルを作製する工程と、任意選択的に、複数の固有の生体サンプルをプールして、本明細書に記載する方法に従いソート可能な組成物を作製する工程の両方を含む。
本明細書に記載するいくつかの方法では、ソートすることは、AIMの発現に基づく、活性化T細胞の蛍光活性化細胞ソーティングであって、蛍光活性化細胞ソーティングが、AIMを発現するT細胞を、AIMに特異的に結合する蛍光標識抗体により検出することに基づく、上記ソートすることを含む。このような方法は、固有の生体サンプル(または、1つまたは複数の固有の生体サンプルを含む組成物)を、AIMに特異的に結合する蛍光標識リガンド(例えば、蛍光標識抗体)でインキュベートすることをさらに含んでよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、シングルセル配列決定により分析した活性化T細胞で、機能分析及び/または表現型分析を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態では、機能分析及び/または表現型分析は、シングルセル配列決定分析の前に行われる。いくつかの実施形態では、機能分析及び/または表現型分析は、シングルセル配列決定分析と同時に行われる。いくつかの実施形態では、機能分析及び/または表現型分析は、シングルセル配列決定分析の後で行われる。いくつかの実施形態では、機能分析及び/または表現型分析は、シングルセル配列決定分析の前に、シングルセル配列決定分析と同時に、及び/または、シングルセル配列決定分析の後で行われる。いくつかの実施形態では、機能分析及び/または表現型分析はフローサイトメトリー分析を含む。いくつかの実施形態では、機能分析及び/または表現型分析はCITE-seq分析を含む。いくつかの実施形態では、機能分析及び/または表現型分析は多量体分析を含む。いくつかの実施形態では、機能分析及び/または表現型分析は、フローサイトメトリー分析、CITE-seq分析、及び多量体分析の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、さらなる機能分析及び/または表現型分析は、CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD62L、HLA DR、CD137/4-1BB、CD69、CD278、CD274、CD279、CD127、CD197、IFNγ、GZMH、GNLY、CD38、CCL3、及びLAG3のうちの1つ以上の、タンパク質及び/またはRNAの発現レベルを測定する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、抗原に特異的に結合するTCRのTCRα鎖配列及び/またはTCRβ鎖配列を識別することであって、好ましくは、TCRα鎖配列及び/またはTCRβ鎖配列が、それぞれ、TCRα鎖可変領域配列(Vα/Jα配列)及び/またはTCRβ鎖可変領域配列(Vβ/Jβ配列)である、上記識別することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、抗原に特異的に結合するTCRのTCRα鎖配列及び/またはTCRβ鎖配列を識別することを含み、方法は、治療薬、例えばヒト治療薬の作製において、TCRα鎖配列及び/またはTCRβ鎖配列を利用することをさらに含む。あるいは、方法は、TCRδ/TCRγ配列、例えば、TCRδ/TCRγ可変領域配列もまた含むことができる。
本明細書に記載の方法で使用可能な組成物もまた、本明細書で記載する。いくつかの実施形態では、組成物は、(a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記T細胞及びMHC、(b)抗原、(c)抗原を特異的に識別するハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、上記HTOが、T細胞をHTOで標識する分子にコンジュゲートした、上記HTO、ならびに、任意選択的に、(d)T細胞の活性化を支持する培地を含む固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、2つ以上の生体サンプル、例えば第1及び第2の生体サンプルを含み、第1の生体サンプルは、(a)第1のT細胞及び第1の表面結合MHCであって、第1のT細胞が、第1の表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能である、上記第1のT細胞及び第1の表面結合MHC、(b)第1の抗原、ならびに(c)第1の抗原を特異的に識別するために使用可能であり、好ましくは第1の抗原を特異的に識別する、第1のHTOを含み、第1のHTOは、第1のT細胞を第1のHTOで標識する第1の分子にコンジュゲートし、第2の生体サンプルは、(a)第2のT細胞及び第2の表面結合MHCであって、第2のT細胞が、第2の表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能である、上記第2のT細胞及び第2の表面結合MHC、(b)第2の抗原、ならびに(c)第2の抗原を特異的に識別する第2のHTOを含み、第2のHTOは、第2のT細胞を第2のHTOで標識する第2の分子にコンジュゲートし、(i)第1のT細胞及び第2のT細胞は同一の対象から単離され、(ii)第1の抗原及び第2の抗原は同一ではなく、(iii)第1のT細胞を第1のHTOで標識する第1の分子、及び、第2のT細胞を第2のHTOで標識する第2の分子は同一であり、第1のHTO及び第2のHTOは同一ではなく、任意選択的に、第1及び第2の生体サンプルのいずれかまたは両方が、第1及び第2のT細胞の活性化を支持する培地をさらに含む。
キットもまた、本明細書で記載する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するキットは、複数の固有の抗原、及び、複数の固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)を含み、複数の固有のHTOのそれぞれは、複数の固有の抗原のうちの1つのみを特異的に識別するために使用可能であり、好ましくは、特異的に識別する。いくつかのキットの実施形態では、複数の固有のHTOのそれぞれは、同一の分子にコンジュゲートし、キットが、固有のHTOがコンジュゲートした複数の分子を含む。本明細書に記載するいくつかのキットの実施形態では、複数の固有の抗原のそれぞれは、単一のタンパク質、例えば、病原性抗原、腫瘍関連抗原、または移植抗原からの、固有かつ重なり合うペプチド配列を含む。
本明細書におけるいくつかの実施形態では、表面結合MHCは、細胞膜結合MHCであり、例えば、表面結合MHCは、細胞、例えば抗原提示細胞(APC)の表面で発現する。いくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、APCは、単核細胞由来の樹状細胞である。いくつかの組成物、方法、キット、または使用の実施形態では、APCは樹状細胞である。いくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、APCは単球である。いくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、APCはマクロファージである。いくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、APCはB細胞である。いくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、表面結合MHCは、細胞の集団、例えばAPCの集団の表面に発現し、例えば、APCの集団は、単球由来の樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、B細胞、及びこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、T細胞及びAPC(複数可)は自己由来である。いくつかの実施形態では、T細胞及びAPC(複数可)はそれぞれ、ヒトドナーから単離される。いくつかの実施形態では、(例えば、ヒトドナーから単離した)末梢血単核球細胞は、T細胞及び表面結合MHC(例えば、APC(複数可)の表面に発現したMHC)を提供する。
本明細書に記載する方法、組成物、キット、及び使用は、体積の小さいサンプル、例えば体積の小さいヒトサンプルで有利に実施することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、細胞の集まりが、複数の個別の生体サンプルに等しく分配され得るように、対象、例えばヒト対象から単離した、十分な数の末梢血単核球細胞(PBMC)を含む。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のPBMCを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約1×105個のPBMC、少なくとも約5×105個のPBMC、または少なくとも約1×106個のPBMCを含む、少なくとも2つの個別の生物学的サンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約1mL、約3mL、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のPBMCを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約1×105個のPBMC、少なくとも約5×105個のPBMC、または少なくとも約1×106個のPBMCを含む、少なくとも3つの個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約1mL、約3mL、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のPBMCを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約1×105個のPBMC、少なくとも約5×105個のPBMC、または少なくとも約1×106個のPBMCを含む、少なくとも5つの個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約1mL、約3mL、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のPBMCを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約1×105個のPBMC、少なくとも約5×105個のPBMC、または少なくとも約1×106個のPBMCを含む、少なくとも10個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約1mL、約3mL、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のPBMCを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約1×105個のPBMC、少なくとも約5×105個のPBMC、または少なくとも約1×106個のPBMCを含む、少なくとも20個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約1mL、約3mL、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のPBMCを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約1×105個のPBMC、少なくとも約5×105個のPBMC、または少なくとも約1×106個のPBMCを含む、少なくとも30個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約1mL、約3mL、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のPBMCを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約1×105個のPBMC、少なくとも約5×105個のPBMC、または少なくとも約1×106個のPBMCを含む、少なくとも50個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約1mL、約3mL、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のT細胞及び抗原提示細胞(APC)(例えば、樹状細胞(DC))を含み、これにより、細胞の集まりが、複数の個別の生体サンプルに等しく分配され得る。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した十分な数のAPC及びT細胞を含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれが約1:1、約1:5、または約1:10のAPC:T細胞の比でAPC及びT細胞(例えば、DC及びT細胞)を含む、複数の個別の生体サンプルに等しく分配され得る。例えば、各サンプルは、少なくとも約5×103、5×104、または5×105個のDC、及び、約5×103、1×104、2.5×104、5×104、1×106、2.5×105、5×105、1×106、2.5×106、または5×106個のT細胞を含む。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。
本明細書に記載する方法で使用する、または、本明細書に記載する組成物もしくはキットの一部である抗原は、(I)(i)細菌抗原もしくはその一部、(ii)ウイルス性抗原もしくはその一部、(iii)アレルゲンもしくはその一部、(iv)腫瘍関連抗原もしくはその一部、及び(v)これらの組み合わせからなる群から選択される抗原であることができ、及び/または、(II)(i)アミノ酸配列、(ii)ヌクレオチド配列、(iii)溶解物、及び(iv)これらの組み合わせを含む。
本明細書に記載する方法、組成物、キット、及び使用はそれぞれ、分子にコンジュゲートしたハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)を含み、当該分子を使用して、細胞(例えばT細胞)をHTOで標識することができる。いくつかの実施形態では、細胞をHTOで標識するために使用した分子はリガンド、例えば抗体を含むことができる。いくつかの実施形態では、HTOコンジュゲートリガンド、例えばHTOコンジュゲート抗体は、細胞表面分子に結合する。いくつかの実施形態では、細胞表面分子は、大部分の細胞により遍在的に発現される。いくつかの実施形態では、細胞表面分子はβ2マイクログロブリンであるか、β2マイクログロブリンを含む。いくつかの実施形態では、細胞表面分子はCD298であるか、またはCD298を含む。いくつかの実施形態では、細胞表面分子はT細胞により選択的に発現されることができる。いくつかの実施形態では、細胞表面分子は、CD2、CD3、CD4、CD8、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるT細胞表面分子であるか、またはこれを含む。いくつかの実施形態では、細胞表面分子はCD2であるか、またはCD2を含む。いくつかの実施形態では、細胞表面分子はCD3であるか、またはCD3を含む。いくつかの実施形態では、細胞表面分子はCD4であるか、またはCD4を含む。いくつかの実施形態では、細胞表面分子はCD8であるか、またはCD8を含む。いくつかの実施形態では、細胞をHTOで標識するために使用した分子は、例えば、好ましくは自身を細胞膜、例えば分裂細胞の細胞膜に組み込む脂質を含むことができる。いくつかの実施形態では、HTOコンジュゲート分子は、HTOコンジュゲート脂質、例えば脂質修飾オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞をHTOで標識するために使用した分子はコレステロールであるか、またはコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するHTOコンジュゲート分子は、HTOコンジュゲートコレステロール、例えばコレステロール修飾オリゴヌクレオチドを含む。
本明細書に記載の方法は、活性化誘発マーカー(AIM)の発現に基づき、活性化T細胞をソートすることを含む。したがって、本明細書に記載するいくつかの方法、組成物、キット、及び使用の実施形態は、このようなソート工程で有用な剤を含む。いくつかの実施形態では、剤は、AIMに特異的に結合する蛍光標識したリガンド、例えば、AIMに特異的に結合する蛍光標識した抗体を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、またはキットの実施形態では、AIMは、T細胞の活性化の際に、T細胞により上方制御される任意のマーカーであるか、またはこれを含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、AIMは、CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3、TIGIT、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるAIMであるか、またはこれを含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、AIMは、CD137/4-1BBであるか、またはCD137/4-1BBを含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、AIMは、CD107であるか、またはCD107を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、AIMは、IFNγであるか、またはIFNγを含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、AIMは、PD-1であるか、またはPD-1を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、AIMは、CD40Lであるか、またはCD40Lを含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、AIMは、OX40であるか、またはOX40を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、AIMは、CD25であるか、またはCD25を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、AIMは、CD69であるか、またはCD69を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、AIMは、CD28であるか、またはCD28を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、AIMは、HLA-DRであるか、またはHLA-DRを含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、AIMは、CX3CR1であるか、またはCX3CR1を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、AIMは、TIM3であるか、またはTIM3を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、AIMは、LAG3であるか、またはLAG3を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、AIMは、TIGITであるか、またはTIGITを含む。
本明細書に記載する方法は、シングルセル配列決定により分析した活性化T細胞で、機能分析及び/または表現型分析を行うことを含むことができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法、組成物、キット、または使用は、追加の試薬、例えば抗体及び/またはMHC多量体を含むことができ、これらのいずれかまたは両方は、フローサイトメトリー分析、及び/またはCITE-seq分析に有用であることができる。
本明細書に記載するいくつかの方法、組成物、キット、及び使用の実施形態は、存在するT細胞(及び任意選択的に、他の細胞、例えば、抗原提示細胞、例えば樹状細胞)の生存能、活性化、及び/または活性を支持する培地を含む。いくつかの実施形態では、培地は1種以上のサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、培地はIL-2を含む。いくつかの実施形態では、培地はIL-4を含む。いくつかの実施形態では、培地はIL-7を含む。いくつかの実施形態では、培地はIL-15を含む。いくつかの実施形態では、培地はIL-21を含む。いくつかの実施形態では、培地はGM-CSFを含む。いくつかの実施形態では、培地はFLT3Lを含む。いくつかの実施形態では、培地はIL-2、IL-4、IL-7、IL-15、GM-CSF、及びFLT3Lの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、培地はIL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、IL-4、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを含む。
T細胞が媒介する、ワクチンに対する患者の免疫応答を分析するための、本明細書に記載する方法、組成物、及び/またはキットの使用もまた、本明細書で記載する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法、組成物、及び/またはキットは、T細胞が媒介する、免疫療法に対する患者の免疫応答を分析するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法、組成物、及び/またはキットは、患者の免疫療法の間に、患者における、T細胞が媒介する免疫応答を分析するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法、組成物、及び/またはキットは、自己抗原に対する患者のT細胞応答を分析するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法、組成物、及び/またはキットは、移植抗原に対する患者のT細胞応答を分析するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法、組成物、及びキットを使用して、活性化T細胞の、1つ以上のTCR可変領域配列(例えば、TCRα鎖のCDR3配列、及び/またはTCRβ鎖のCDR3配列)を識別することができる。いくつかの実施形態では、このように識別した1つ以上のTCR可変領域配列を使用して、ヒト治療薬、例えば、本明細書に記載する方法、組成物、及びキットを用いて識別した1つ以上のTCR可変領域配列を含むT細胞を作製することができる。
従来のフローサイトメトリー分析をバイパスするための方法として、オリゴヌクレオチド(オリゴ)タグ抗体を開発した。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、WO2018144813を参照されたい。このようなオリゴタグ抗体を、生きた細胞の表面でタンパク質を結合させるためのツールとして使用し、シングルセルRNA配列決定(scRNA SEQ)実験に対するシングルセル追跡を補助することができる。Stoeckius(2017) bioRxivに記載されている((2018) Genome Biology 19:224でもまた出版されている)方法は、全ての標的細胞で発現する単一タンパク質特異性、加えて、サンプル当たりで固有の配列を有する固有のオリゴヌクレオチドタグ(ハッシュタグオリゴヌクレオチドまたはHTOとも呼ばれる)を有するオリゴタグ抗体を用い、配列決定ライブラリー調製のために最終的にプールした個別のサンプルを追跡する。本方法では、各細胞を、細胞が由来するサンプルを識別する独自のオリゴヌクレオチド配列でタグ付けすることができる。このオリゴヌクレオチド配列を検出し、配列決定ライブラリーに含めることで、サンプルの同一性を、得られる配列決定情報から測定することができる。従来、細分化抗体を使用して複数のサンプルを、1個のシングルセル配列決定(scSEQ)ライブラリー調製にプールする、例えば、サンプルを多重化し、データを正規化して効率を改善する。
例えば、特性決定特異的なT細胞応答のために、機能アッセイでHTOを用いることが以前に記載されており、ここでは、HTOが、主要組織適合複合体(MHC)の多量体にコンジュゲートされる(例えば、Bentzen et al.(2016) Nature Biotechnology 34:1037-45を参照されたい)。MHCは抗原提示細胞(APC)により発現され、ペプチドを認識するT細胞に対してペプチドを提示する。独断的には、CD8+ T細胞はMHC Iと対形成する一方で、CD4+ T細胞はMHC IIと対形成する。また、MHCの極度の多型により、どの対立遺伝子が、T細胞自身で認識されるのかを知るのに重要となり、これにより、あらゆる応答が、ペプチド自身の提示によるものであり、外来のMHCの提示によるものではないと言うことができるようになる。したがって、抗原特異的T細胞を効果的に刺激し、ペプチド特異的なT細胞応答を特性決定することを可能にするために、ペプチドは、対応するT細胞に対して、クラス及びハプロタイプが一致するMHCにおいて提示されなければならない。
以前は、ペプチド特異的なT細胞応答は、増殖アッセイ、クロムベースの細胞毒性アッセイ、Ca2+フラックスアッセイなどの機能アッセイ、ならびに、より一般的には、ELISPOT及び細胞内サイトカインフローサイトメトリー染色などのサイトカイン検出アッセイにより特性決定されていた。このようなアッセイの多重化については、Klinger et al.(2015) PLoS One DOI:10.1371/journal.pone.0141561で記載されている。しかし、これらの機能アッセイは、抗原特異性を詳述することができるわけでも、シングルセルレベルで応答を特性決定することができるわけでもないという点で制限されていた。これらの制限のいくつかは、フローサイトメトリーMHC四量体染色により克服された。フローサイトメトリーMHC四量体染色を用いると、特異的T細胞応答を、対象となるペプチドでロードした、フルオロフォアコンジュゲートMHC多量体で評価することができる。対象となるペプチドでロードしたMHC多量体に、特異的に結合し、これによって活性化される可能性が高い、T細胞の識別は、蛍光性MHC多量体、及び場合によっては他の抗体に結合した、これらの細胞をソートすることにより実現した。蛍光標識MHC多量体から、HTOコンジュゲートMHC多量体への遷移により、活性化T細胞を特性決定するのに利用可能な、少数の蛍光タグの限定因子が取り除かれる。加えて、細分化抗体と同様に、細分化MHC多量体は、配列分析のためにプールした個別のサンプルを追跡するのに有用であり、これにより、HTO配列が検出されて配列決定ライブラリーに含まれ、分析されているT細胞に結合したMHC/ペプチドの組み合わせが識別される。しかし、上述した、Stoeckius(2017) bioRxivに記載されている((2018) Genome Biology 19:224でもまた出版されている)方法とは異なり、HTOコンジュゲートMHC多量体を用いることにより、このような使用が、機能分析、例えば、特異的T細胞に結合可能なMHC/ペプチドの組み合わせの識別もまたもたらすという点で、サンプルの追跡を超えるものがもたらされる。
シングルセルレベルで抗原特異的T細胞応答を追跡するための機能アッセイを、本明細書で記載するが、当該機能アッセイは、MHC多量体の使用を必要としない(ただし、その使用を禁止するものでもない)。一般に、本明細書に記載の方法は、細分化分子を用いて、個別のアッセイウェルから、活性化T細胞を追跡する。全てのウェルの細胞が、例えば、それぞれ、細胞膜(例えば、1つ以上のオリゴタグ脂質)に組み込まれ得る、及び/または、1つ以上の遍在する細胞表面マーカー(例えば、1つ以上のオリゴタグ抗原結合タンパク質)に結合する、1つ以上のオリゴタグ分子で標識された後にのみ、異なる固有の培養液がプールされる。細胞がハッシュタグ化されると、その源及び同族抗原を決定することができ、サンプルを別個のまま維持する必要はない。プールした後、活性化誘発マーカー(AIM)に対するフローサイトメトリー分析の機能アッセイを用いて、活性化されていないプールにおいて、これらの細胞から活性化された細胞をソートすることができる。
本明細書に記載する方法の、非限定的な例示的図解を、図1に図示する。この非限定的実施例に示すように、工程(1)において、固有の抗原、例えば固有のT細胞エピトープ(例えば、「1」、「2」、「3」)(タンパク質、ペプチド、RNA、細胞、細胞溶解物などであってよい)、及び/または、単独の刺激、または刺激のプールを、複数の生体サンプルのうちの1個を含む個別ウェルのそれぞれに添加し、ここで、複数の生体サンプルのそれぞれは、T細胞、及び、当該T細胞により認識されるMHCを含み、例えば、複数のサンプルのそれぞれは、自己由来の末梢血単核球細胞(PBMC)を含む。生体サンプルを、活性化T細胞により、活性化誘発マーカーを上方制御するのに十分な時間(例えば、6~72時間)、固有の抗原で培養する。いくつかの非限定的な例示的実施形態では、抗原による、生体サンプルの一晩のみの培養(例えば、約18~24時間)が、例えば、活性化T細胞の再刺激の間に、活性化T細胞によるAIMの上方制御のために必要である。いくつかの非限定的実施形態では、生体サンプルをまず、例えば約1または2週間、例えば、約7~14日間、抗原でプライミングして、一晩の再刺激培養の前に、反応性T細胞の予増殖を可能にする。再刺激に続き、工程(2)では、各個別の細胞を、細胞膜に組み込まれ、及び/または、活性化状態に関係なく、T細胞により発現される細胞表面マーカー(例えば、β2マイクログロブリン、CD2、CD298、CD3、CD4、及び/またはCD8など)に特異的に結合する分子(例えば脂質、抗体など)にコンジュゲートした、固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)でインキュベートし、ここで、各固有のHTO(例えば、「1」、「2」、「3」は、各個別のウェルで固有の抗原を識別する。工程(3)では、固有の生体サンプル全てを多重化、例えばプールし、プールした後で、工程(4)では、固有の生体サンプルのプールを含む組成物を、活性化T細胞(例えばCD137/4-1BB)、ならびに、所望により、CITE-seq抗体、蛍光タグ抗体、及びオリゴヌクレオチドタグ多量体を含むがこれらに限定されない、他のシングルセル配列決定及びフローサイトメトリー試薬により発現される、活性化誘発マーカーを検出するのに有用な剤でインキュベートした。図1で示す非限定的実施形態は、プールした後に、これらの追加の試薬を添加することを示すが、他の非限定的実施形態では、これらの追加の試薬は、プールする前に添加してよい。工程(5)では、活性化誘発マーカーを検出するのに有用な剤で標識した細胞、例えば、活性化誘発マーカーに特異的に結合する蛍光標識抗体、及び、別のT細胞マーカー(例えば、CD137/4-1BB+CD3+ T細胞)が、AIM蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)により機能的に濃縮される。工程(6)では、濃縮細胞のそれぞれのトランスクリプトームを次に分析し、例えば、ソートした細胞の集団を、10Xゲノム解析シングルセルGel Bead-In Emulsions(GEMS)に封入して、細胞をシングルセルに分画し、RNA配列決定を各細胞で行う。図1に示す非限定的実施形態では、HTO用の5’配列決定ライブラリー、トランスクリプトーム(5’mRNA)、TCR-seq、CITE-seq、及び/またはオリゴ多量体を、工程(6)でのハイスループットシングルセル配列決定のために生成する。工程(7)では、個別のHTOクラスターを、生命情報科学的に逆多重化し、どの抗原に、個別の細胞が曝露されたのかを明らかにした。
記載した機能アッセイは、多くのベネフィットをもたらす。例えば、本明細書に記載の方法は、例えば、自己由来のT細胞及びMHCを用いることにより、完全にパーソナライズすることができる。加えて、本明細書に記載の方法により、試験される生体サンプルが制限される場合であっても、多くの反応性の同時調査が可能となる。同族抗原/T細胞反応性は、シングルセルに対して、または、プールした細胞レベルで識別することができる。MHC特異的でない試薬を用いることにより、患者サンプルにまたがる方法の柔軟な適用が可能になり、加えて、MHC非限定的方法における情報、例えば、CD4+及びCD8+ T細胞情報の両方の補足能力を、同時に捕捉することが可能となり、機能的表現型(例えば、活性化誘発マーカー)を用いることにより、活性化T細胞のみを識別し評価するのに役立つ。加えて、本明細書に記載の方法は、パーソナライズした治療法の開発及び/または決定を知らせ得る、迅速かつコストパフォーマンスの高い方法で、活性化T細胞の表現型及びトランスクリプトームを評価する、次の開発段階にある方法と適合性がある。この方法では、治療法(ワクチン、免疫療法など)に対する免疫応答、例えば、ワクチンコード抗原、ウイルス性抗原、及び/または腫瘍抗原に対するT細胞反応性を評価することができる。同様に、自己免疫反応性、例えば、自己抗原に対するT細胞反応性の免疫監視もまた、アッセイすることができる。本明細書に記載の方法は、例えば、対象となる多数の抗原にまたがる対象となるTCR、及び/または、TCR:エピトープの結合発見及びアルゴリズム生成をスクリーニングするための、TCRの発見、及び治療法の開発のために、有用であることができる。例えば、本明細書に記載の方法により提供される、エピトープ:TCR配列データの複雑性は、特異的HLA-ペプチド結合と関連する、TCR配列(複数可)及び/または構造的特徴に関する、ハプロタイプ特異的な規則を発見するのに有用であり得る。
したがって、以下の工程の1つ以上:
T細胞及びMHCを含む生体サンプルを細分化すること、例えば、生体サンプルを固有の抗原(例えば、T細胞エピトープ)及び固有のバーコード(例えば、ハッシュタグオリゴヌクレオチド)でインキュベートして、固有の生体サンプルを形成する工程と、
複数の固有の生体サンプルをプールする工程と、
機能アッセイに基づき、活性化T細胞のために濃縮する工程(例えば、蛍光標識抗体で、活性化誘発マーカー、例えば、CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3、及び/またはTIGITに対して、AIMをソートすること)と、
配列決定方法、ならびに任意選択的に、他の周知の方法(例えば、CITE-seq分析、フローサイトメトリー分析、及び/または多量体染色)を、活性化細胞、例えばシングルセルベースで行い、(a)活性化T細胞の固有のバーコード、及び故に、T細胞を活性化した抗原、ならびに、任意選択的に、(b)例えば、治療開発のための、例えば、活性化T細胞のTCRα及びβ配列を識別するのに有用であり得る、他の配列を識別する工程と、
を含む方法を本明細書で記載する。
T細胞及びMHCを含む生体サンプルを細分化すること、例えば、生体サンプルを固有の抗原(例えば、T細胞エピトープ)及び固有のバーコード(例えば、ハッシュタグオリゴヌクレオチド)でインキュベートして、固有の生体サンプルを形成する工程と、
複数の固有の生体サンプルをプールする工程と、
機能アッセイに基づき、活性化T細胞のために濃縮する工程(例えば、蛍光標識抗体で、活性化誘発マーカー、例えば、CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3、及び/またはTIGITに対して、AIMをソートすること)と、
配列決定方法、ならびに任意選択的に、他の周知の方法(例えば、CITE-seq分析、フローサイトメトリー分析、及び/または多量体染色)を、活性化細胞、例えばシングルセルベースで行い、(a)活性化T細胞の固有のバーコード、及び故に、T細胞を活性化した抗原、ならびに、任意選択的に、(b)例えば、治療開発のための、例えば、活性化T細胞のTCRα及びβ配列を識別するのに有用であり得る、他の配列を識別する工程と、
を含む方法を本明細書で記載する。
定義
別段定めがない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
別段定めがない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
文脈で明確に別様が示されない限り、単数形「a」、「an」、及び「the」は複数形を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、1つ以上の方法、及び/または本明細書に記載する種類の工程を含み、及び/または、本開示を読解するにあたり、当業者に明らかとなろう。
用語「約」または「およそ」は、ある値の有意義な範囲内にあることを含む。用語「約」または「およそ」により包含される、許容可能なバリエーションは、研究されている特定のシステムに応じて変化し、当業者により速やかに理解されることができる。
T細胞は、主要組織適合複合体(MHC)と関連する抗原提示細胞の表面の小抗原決定基でエピトープに結合する。T細胞は、T細胞の表面で、T細胞受容体(TCR)複合体を通してこれらのエピトープに結合する。T細胞受容体は、2種類の鎖:α(アルファ)及びβ(ベータ)鎖、またはγ(ガンマ)及びδ(デルタ)で構成されるヘテロ二量体構造である。α鎖は、ヒト染色体14のα座位内に位置する核酸配列によりコードされ、当該染色体は、全δ座位もまた含み、β鎖は、ヒト染色体7のβ座位内に位置する核酸配列によりコードされる。大多数のT細胞は、αβTCRを有する一方で、少数のT細胞は、γδTCRを有する。α及びβ鎖は共通して本明細書で言及されるものの、本明細書に記載する方法、組成物、及び/またはキットは、γδTCR鎖にも同様に適用され得る。
T細胞受容体α及びβポリペプチド(ならびに、同様にγ及びδポリペプチド)は、ジスルフィド結合を介して互いに結合する。TCRを作製する2つのポリペプチドはそれぞれ、定常領域及び可変領域を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに、細胞質テールを含有する(膜貫通ドメイン及び細胞質テールは、定常領域の一部でもある)。TCRの可変領域は、その抗原特異性を決定し、免疫グロブリンと同様に、3つの相補性決定領域(CDR)、例えばCDR1、CDR2、及びCDR3を含む。また、免疫グロブリン遺伝子と同様に、T細胞受容体可変遺伝子座位(例えば、TCRα及びTCRβ座位)は、多数の非再配列V(D)Jセグメント(可変(V)、結合(J)、ならびに、TCRβ及びδ、多様性(D)セグメント)を含有する。胸腺でのT細胞成長の間に、TCRα可変遺伝子座位は、得られるTCRα可変ドメインが、VJセグメントの特定の組み合わせ(Vα/Jα配列)によりコードされるように転位を受け、TCRβ可変遺伝子座位は、得られるTCRβ可変ドメインが、VDJセグメントの特定の組み合わせ(Vβ/Dβ/Jβ配列)によりコードされるように転位を受ける。TCRα及びβ可変ドメイン、特に、CDR1、CDR2、及びCDR3、より具体的にはCDR3は、TCRがMHCに結合する特異性をもたらす。
用語「主要組織適合性複合体」及び「MHC」は、用語「ヒト白血球抗原」または「HLA」(一般に、後者2つが、ヒトMHCに対して保存される)、自然に存在するMHC、MHCの個別鎖(例えば、MHCクラスIα(重)鎖、β2マイクログロブリン、MHCクラスII α鎖、及びMHCクラスII β鎖)、MHCのこのような鎖の個別のサブユニット(例えば、MHCクラスI α差のα1、α2、及び/またはα3サブユニット、MHCクラスII α鎖のα1~α2サブユニット、MHCクラスII β鎖のβ1~β2サブユニット)、加えて、部分(例えば、ペプチド結合部分、例えばペプチド結合溝)、これらの変異体及び様々な誘導体(融合タンパク質を含む)を包含し、このような部分、変異体、及び誘導体は、T細胞受容体(TCR)、例えば抗原特異的TCRによる認識に対して、抗原ペプチドを提示する能力を保持する。MHC Iは、約8~10個のアミノ酸のペプチドを収容可能なα重鎖の、α1及びα2ドメインにより形成されるペプチド結合溝を含む。両方のクラスのMHCが、ペプチド内の約9個のアミノ酸(例えば、約5~17個のアミノ酸)のコアに結合するという事実にもかかわらず、MHCクラスIIペプチド結合溝(クラスII MHCβポリペプチドのβ1ドメインと関連した、クラスII MHCαポリペプチドのα1ドメイン)のオープンエンドの性質により、広範囲のペプチド長が可能になる。13~17アミノ酸長で、ペプチド結合MHCクラスIIは通常変化するものの、より短い、または長い長さは、珍しいわけではない。結果的に、ペプチドは、MHCクラスIIペプチド結合溝内で移動し得、任意の所与の時間において、溝内で9量体が直接存在する場所が変化する。
用語「抗原」は、導入されたときに、免疫応答性宿主が宿主の免疫系により認識され、宿主により免疫応答が誘発される、任意の剤(例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、ヌクレオチド、これらの一部、またはこれらの組み合わせ)を包含する。T細胞受容体(TCR)は、免疫シナプスの一部として、主要組織適合複合体(MHC)の文脈で提示されるペプチドを認識する。ペプチド-MHC(pMHC)複合体は、相互作用の特異性を伴う、ペプチド(抗原決定基)及びTCRイディオタイプにより、TCRにより認識される。したがって、用語「抗原」は、MHC、例えばペプチド-MHC複合体、例えばpMHC複合体の文脈で提示されるペプチドを包含する。MHCに提示されるペプチドは、「エピトープ」、または「抗原決定基」ともまた呼ばれることができる。用語「ペプチド」、「抗原決定基」、「エピトープ」などが包含するのは、抗原提示細胞(APC)により自然に提示されるものだけではなく、T細胞に適切に提示されるときに、T細胞により認識されるのであれば、任意の所望のペプチドであってよい。例えば、人工的に調製したアミノ酸配列を有するペプチドもまた、エピトープとして使用してよい。
同族pMHCとのTCRエンゲージメントは一般に、期間が短いが、この相互作用は、単一の骨格、例えば表面で、複数のpMHCを組み込むこと、例えば、多量体、例えば四量体、デキストラマーなどを用いることにより得られる「結合活性効果」により安定され得る。様々なpMHC多量体化プラットホームが利用されてきており、これらの多くは市販されている。例えば、Wooldridge et al.(2009) Immunol.126:147-64を参照されたい。このような結合活性効果に適応するために、いくつかの実施形態では、本明細書のMHCは、好ましくは、表面に結合し、これにより、MHCの適切な密度が実現され得る。
MHCが、本明細書にて開示した非限定的な実施形態で結合し得る、非限定的な例示的表面としては、
a 例えば、MHCが抗原提示細胞(例えば、樹状細胞、単核細胞、マクロファージ、及びB細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞)の表面、リポソームの表面、ウイルスベクターのエンベロープ膜などで発現する、細胞膜、
b ビーズ、
c 細胞培養皿、例えばマルチウェルプレートのウェル、ならびに、
d 多量体、例えば四量体、デキストラマーなど
が挙げられる。
a 例えば、MHCが抗原提示細胞(例えば、樹状細胞、単核細胞、マクロファージ、及びB細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞)の表面、リポソームの表面、ウイルスベクターのエンベロープ膜などで発現する、細胞膜、
b ビーズ、
c 細胞培養皿、例えばマルチウェルプレートのウェル、ならびに、
d 多量体、例えば四量体、デキストラマーなど
が挙げられる。
抗原は、合成ペプチド、タンパク質、mRNA、ウイルス、ウイルスベクター、DNA、生細胞、細胞溶解物などを含み得る。いくつかの非限定的実施形態では、抗原は腫瘍関連抗原であり、そのペプチド部分を含む。このような実施形態では、腫瘍関連抗原は、ALK、BAGEタンパク質、BIRC5(スルビビン)、BIRC7、CA9、CALR、CCR5、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD27、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD52、CD56、CD79、CDK4、CEACAM3、CEACAM5、CLEC12A、EGFR、EGFRバリアントIII、ERBB2(HER2)、ERBB3、ERBB4、EPCAM、EPHA2、EPHA3、FCRL5、FLT3、FOLR1、GAGEタンパク質、GD2、GD3、GPNMB、GM3、GPR112、IL3RA、KIT、KRAS、LGR5、EBV-由来のLMP2、L1CAM、MAGEタンパク質、MLANA、MSLN、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUC16、MUM1、ANKRD30A、NY-ESO1(CTAG1B)、OX40、PAP、PAX3、PAX5、PLAC1、PRLR、PMEL、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGEタンパク質、RET、RGS5、ROR1、SART1、SART3、SLAMF7、SLC39A6(LIV1)、STEAP1、STEAP2、TERT、TMPRSS2、トンプソン-ヌーベル抗原、TNFRSF17、TYR、UPK3A、VTCN1、WT1からなる群から選択することができる。
別の実施形態では、抗原は、感染症と関連し得る。このような実施形態では、例えば、生体サンプルは、病原菌、またはこれに由来するエピトープを添加することで、固有の生体サンプルになることができる。このような一実施形態では、感染症関連抗原はウイルス性抗原であり得、ウイルス性抗原は、HIV、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、ヘルペスウイルス(例えばHSV-1、HSV-2、CMV、HAV-6、VZV、エプスタインバーウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス((例えば、SARS-CoV-2)、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、HTLV、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、JCウイルス、エボラウイルス、及び、アルボウイルス脳炎ウイルス抗原からなる群から選択される。このような別の実施形態では、感染症と関連する抗原は、細菌抗原であり得、細菌抗原は、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス、炭疽、ペスト、レプトスピラ、及び、ライム病細菌抗原からなる群から選択される。
本明細書に記載の方法で使用する用語「生体サンプル」とは、生物学的に活性な細胞、生物学的に活性な細胞の活性化因子、ならびに任意選択的に、細胞の生存能、及び/または生物学的活性化、例えば細胞の活性を支持する培地を含む培養物を意味する。生物学的に活性な細胞は、細胞、例えば、特定の種類の単離細胞(例えばT細胞)の均質な集団、または、異なる細胞型の混合物(例えば、末梢血単核球細胞(PBMC)、抗原提示細胞(APC)とT細胞の共培養物、樹状細胞(DC)とT細胞の共培養物など)であってよく、これらは、対象、例えばヒトまたは哺乳類または他の種の対象から単離した、生物学的流体または組織から単離することができるか、または、これを含むことができる。生物学的流体または組織としては、非限定例として、血清、血漿、全血、末梢血、唾液、尿、膣もしくは頸部分泌液、羊水、胎盤液、脳脊髄液、漿液流体、または粘膜分泌物(例えば頬、膣、もしくは直腸)を挙げることができる。さらに他のサンプルとしては、血液由来または生検由来の生体サンプルまたは組織、例えば、腫瘍浸潤リンパ球を含む組織(例えば腫瘍)、硬結などが挙げられる。
本明細書で開示するいくつかの非限定的生体サンプルは、T細胞、及び、抗原を提示する表面結合MHC(例えば、T細胞エピトープ)を含み、例えば、生物学的に活性な細胞はT細胞であり、活性化因子は、抗原を提示する表面結合MHC(例えば、T細胞エピトープ)である。本明細書で開示するいくつかの非限定的生体サンプルは、T細胞、抗原を提示する表面結合MHC(例えば、T細胞エピトープ)、ならびに、T細胞の生存能、活性化、及び/または活性を支持する1種以上のサイトカインを含み、例えば、生物学的に活性な細胞はT細胞であり、活性化因子は、抗原を提示する表面結合MHC(例えば、T細胞エピトープ)であり、培地は、T細胞の生存能、活性化、及び/または活性を支持する1種以上のサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、T細胞の生存能、活性化、及び/または活性を支持するサイトカインは、IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、IL-21、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるインターロイキンを含む。本明細書で開示するいくつかの非限定的生体サンプルは、T細胞、及び、抗原を提示する表面結合MHCを含み、MHCは、抗原提示細胞、例えば体細胞の表面で発現し、抗原提示細胞は任意選択的に、単球由来の樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、及びB細胞からなる群から選択されるプロフェッショナル抗原提示細胞であってよい。T細胞、及び、抗原を提示する表面結合MHCを含み、MHCが抗原提示細胞の表面で発現する、これらの非限定的な生体サンプルは、任意選択的に、T細胞の生存能、活性化、及び/または活性を支持するサイトカイン(例えば、IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、及び/またはIL-21)、及び/または、抗原提示細胞の生存能、活性化、及び/または活性を支持するサイトカイン(例えば、GM-CSF、FLT3L、及び/またはIL-4)をさらに含むことができる。T細胞及び/または抗原提示細胞の生存能、活性化、及び/または活性を支持するのに有用な、さらなるサイトカイン、またはサイトカインの組み合わせ(ならびに、T細胞及び/または抗原提示細胞の生存能、活性化、及び/または活性を支持するための、当該細胞の量)は、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、APCを活性化するさらなる因子、例えば、IFNα、LPS、ポリ-IC、TNF、IL-1β、IL-6、PGE2などが、細胞の生存能を支持する培地に含まれる。
生体サンプルは多くの場合、特定の源、対象、または患者から入手されるか、またはこれらに由来する。
「個体」または「対象」または「動物」とは、ヒト、獣医学動物(例えばネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなど)、及び、疾患の実験動物モデル(例えばマウス、ラット)を意味する。一実施形態では、対象はヒトである。
本明細書の非限定的な実施形態では、生体サンプルは、対象に由来する末梢血単核球細胞(PBMC)を含む。本明細書に記載する生体サンプルは、新規に単離したPBMC、凍結保存した、新しく解凍したPBMC、または、抗原の存在下で約1週間プライミング、例えば培養し、記憶反応性が拡大し、アッセイシグナルが増加したPBMCを含むことができる。
一般に、本明細書に記載する生体サンプル(例えば、固有の生体サンプル)は、抗原に応答して、T細胞の活性化を支持するのに十分な数のT細胞及び表面結合MHC、例えば、少なくとも1×105、5×105、1×106個、またはそれ以上の全末梢血単核球細胞を含む。1mLの全(ヒト)血液が、どの箇所においても、5×105~3×106個の末梢血単核球細胞(PBMC)を含み得、及び/または、どの箇所においても5×103~5×105個のAPC(例えば樹状細胞)、及び、どの箇所においても5×103~5×106個のT細胞を単離するために使用され得るため、細分化と多重化の組み合わせにより、少ない血液量サンプル、例えば、少量のヒト血液サンプルで実施される、本明細書に記載の方法が有利にもたらされる。非限定的実施例として、対象から単離した10mLの全血に由来する細胞の集まりは、どの箇所においても、5×106~3×107個のPBMCを含み得、これにより、細胞の集まりが、複数の個別の生体サンプル、例えば、それぞれが、約1×105~1×106個のPBMC、及び/または、1×105~5×105個のDC、及び1×105~5×106個のT細胞などを含む、少なくとも20個の生体サンプルに等しく分配され得、これを次に(それぞれに、固有の抗原及び/または固有のHTOを添加した後で)プールし、本明細書に記載する方法に従ってアッセイすることができる。したがって、いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数の末梢血単核球細胞(PBMC)を含み、細胞の集まりが複数の生体サンプルに等しく分配され得るいくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のPBMCを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約1×105個のPBMC、少なくとも約5×105個のPBMC、または少なくとも約1×106個のPBMCを含む、少なくとも2つの個別の生物学的サンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約1mL、約3mL、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のPBMCを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約1×105個のPBMC、少なくとも約5×105個のPBMC、または少なくとも約1×106個のPBMCを含む、少なくとも3つの個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約1mL、約3mL、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のPBMCを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約1×105個のPBMC、少なくとも約5×105個のPBMC、または少なくとも約1×106個のPBMCを含む、少なくとも5つの個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約1mL、約3mL、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のPBMCを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約1×105個のPBMC、少なくとも約5×105個のPBMC、または少なくとも約1×106個のPBMCを含む、少なくとも10個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約1mL、約3mL、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のPBMCを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約1×105個のPBMC、少なくとも約5×105個のPBMC、または少なくとも約1×106個のPBMCを含む、少なくとも20個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約1mL、約3mL、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のPBMCを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約1×105個のPBMC、少なくとも約5×105個のPBMC、または少なくとも約1×106個のPBMCを含む、少なくとも30個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約1mL、約3mL、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のPBMCを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約1×105個のPBMC、少なくとも約5×105個のPBMC、または少なくとも約1×106個のPBMCを含む、少なくとも50個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約1mL、約3mL、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のT細胞及び抗原提示細胞(APC)(例えば、樹状細胞(DC))を含み、これにより、細胞の集まりが、複数の個別の生体サンプルに等しく分配され得る。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のT細胞及び抗原提示細胞(APC)(例えば、樹状細胞(DC))を含み、これにより、細胞の集まりが、複数の個別の生体サンプルに等しく分配され得る。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した十分な数のAPC及びT細胞を含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれが約1:1、約1:5、または約1:10のAPC:T細胞の比でAPC及びT細胞(例えば、DC及びT細胞)を含む、複数の個別の生体サンプルに等しく分配され得る。例えば、各サンプルは、少なくとも約5×103、5×104、または5×105個のDC、及び、約5×103、1×104、2.5×104、5×104、1×106、2.5×105、5×105、1×106、2.5×106、または5×106個のT細胞を含む。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約5mL、約10mL、約15mL、約20mL、または約50mLの全血に由来することができる。
対象から単離した生体サンプルを、生理食塩水、緩衝液、または、生理学的に許容できる希釈剤でさらに希釈してよい。あるいは、対象由来の生体サンプルを、従来の方法により濃縮することができる。対象から単離した生体サンプルは、2つ以上のアリコートに分割して、「複数の生体サンプル」を形成することもまた可能であり、複数の生体サンプルのそれぞれは、およそ同じ数の、生物学的に活性な細胞(例えばT細胞)、及び、およそ同じ量の支持試薬を含む。したがって、別途記載のない限り本明細書で使用する場合、「複数の生体サンプル」とは、生物学的に活性な細胞の複数の異なる集団を意味し、生物学的に活性な細胞の各集団は、同一の対象から単離され、およそ同じ数の生物学的に活性な細胞を含み、類似する培養条件、例えば、生物学的に活性な細胞の生存能、活性化、及び/または活性を支持する支持試薬と共に、維持される。
本発明のいくつかの実施形態では、生体サンプルは、約1週間(例えば、約7~10日)、抗原でインキュベーションすることにより、エクスビボでプライミング、例えば予増殖され、その後、約1~3日(例えば、6~72時間、例えば18~24時間)、抗原でインビトロにて再刺激された後、固有の生体サンプルの細分化、濃縮、及び/または分析が行われる。本発明のいくつかの実施形態では、生体サンプルは、抗原でのインビトロ再刺激の前に、エクスビボでプライミングされず、その後、生体サンプルの細分化、固有の生体サンプルの濃縮、及び/または分析が行われる。エクスビボでのプライミングは一般に、インビボでの間に抗原に出くわし得ない生体サンプルには必要ない。生体サンプルに対するタイミング(例えば、プライミングは7~10日間、及び、再刺激は6~72時間、例えば18~24時間)、T細胞を含む生体サンプルに対するタイミングを含む、プライミング及び再刺激手順は、当該技術分野において周知である。
いくつかの非限定的実施形態では、自身の固有の刺激、もしくは固有の刺激の組み合わせ(例えば、抗原、もしくは抗原のプール(例えばT細胞エピトープ))、及び/または、多重化、及び任意選択的な多重化のための、自身の固有のバーコード、例えば(ハッシュタグオリゴヌクレオチド)でインキュベートされることにより、複数の生体サンプルのそれぞれが、固有の生体サンプルとなる。
本明細書で使用する場合、「ハッシュタグ化」、「細分化」、「タグ化」などは、固有の生体サンプルの生物学的に活性な細胞を、固有のバーコードにコンジュゲートした分子、例えば固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)と接触させることを含み、固有のバーコードが、固有の生体サンプル、例えば固有の抗原(例えば、固有のT細胞エピトープ)の固有の特徴、または固有の抗原の欠落を識別し、生物学的に活性な細胞の活性化状態に関係なく、分子が、生物学的に活性な細胞により発現した細胞表面マーカーの細胞膜に組み込まれ、及び/または、当該細胞表面マーカーに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、HTO分子は、あらゆる細胞、例えば、あらゆる分裂細胞に組み込まれ得、及び/または、大部分、もしくはあらゆる細胞により発現される細胞表面マーカー(例えば、βマイクログロブリン、CD298)に結合する。いくつかの実施形態では、選択される細胞マーカーは、活性化状態に関係なく、T細胞(例えば、CD2、CD3、CD4、及び/またはCD8など)により発現される。細胞をHTOで、2つ以上の異なる方法で標識する2つ以上の分子(例えば、一方の分子は、自身を細胞膜に組み込み得る一方で、他方はマーカーに結合し、2つ以上の分子が2つ以上の異なるマーカーに結合し得る)が、それぞれHTOにコンジュゲートされ、それぞれがハッシュタグ化法で用いられ、同一の固有の生体サンプルをタグ化する、いくつかの実施形態では、2つ以上の分子は、同一のバーコードを含み得る。いくつかの実施形態では、固有の生体サンプルをハッシュタグ化するために使用する2つ以上のマーカーは、同一の、または異なるマーカーであってよい。いくつかの実施形態では、第1の固有の生体マーカーを、第1の固有のバーコード(例えば第1のHTO)にコンジュゲートした第1の分子でタグ化してよく、第2の固有の生体サンプルを、第2の固有のバーコード(例えば第2のHTO)でコンジュゲートした第2の分子でタグ化し、第3の生体サンプルを、第3のバーコード(例えば第3のバーコード)にコンジュゲートした第3の分子でタグ化し、第1、第2、及び第3の分子はそれぞれ同一であり、例えば、それぞれが自身を細胞膜に組み込むか、または、それぞれが同一のマーカーに特異的に結合するものの、第1、第2、及び第3の分子のそれぞれは、第1、第2、及び第3の分子のそれぞれが区別され得るほど十分に異なる固有のバーコードを含む。ハッシュタグ化により、同一のサンプルに由来するサンプル及び試薬のそれぞれの、後での検出、追跡、及び/または定量化が可能となるため、未結合の分子を洗浄した後、固有に細分化した固有の生体サンプルをプールし、抗原特異的活性化T細胞のさらなる機能及び表現型分析(例えば、フローサイトメトリー分析、及び/または、蛍光細胞活性化ソーティング、シングルセル配列分析など)のために、任意選択的に、さらなる試薬でインキュベートしてよい。
いくつかの非限定的な実施形態はさらに、本明細書に記載する方法の感度及び/またはロバスト性を向上させることができる。例えば、いくつかの非限定的な実施形態では、scSEQサンプル当たりで、20個の潜在的な反応性オリゴ細分化アッセイサンプルをプールすることにより、典型的には十分な濃縮が得られる。いくつかの実施形態では、コンビナトリアル細分化アプローチを用いることで、アッセイの感度が増加し得る。例えば、細胞をその反応性HTOで、2つ以上の異なる方法でそれぞれ標識する2つ以上の分子(例えば、一方の分子は、自身を細胞膜に組み込み得る一方で、他方はマーカーに結合し、2つ以上の分子が2つ以上の異なるマーカー(例えば、β2マイクログロブリン及びCD2)に結合し得る)が、それぞれ同一のバーコード、例えば、同一の配列を含むHTOにコンジュゲートされ、それぞれがハッシュタグ化法で用いられ、同一の固有の生体サンプルをタグ化する。
例えば、活性化誘発マーカーに、任意選択的に、及び、いくつかの非限定的な実施形態では好ましくは、結合する分子(例えば、抗体または他の巨大分子、例えば脂質)への、ハッシュタグオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションを含む、「ハッシュタグオリゴヌクレオチド」、「HTO」などの生成及び使用は、周知である。例えば、それぞれの参考文献が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、WO2018144813;Stoeckius et al.(2018)Genome Biol.19:224;van Buggenum JAGL et al.を参照されたい。一般に、HTOは、固有のバーコード、例えば、標準的なポリメラーゼ連鎖反応、例えば、細胞トランスクリプトームを配列決定するシングルセルRNA配列決定手順(例えば、Stoeckius et al.(2017)Nat.Method 9:2579-10を参照されたい。)によって測定可能な固有の配列を含む核酸を含み、当該固有の配列は、本明細書に記載する実施形態では、例えば、生体サンプルに、活性化誘発マーカーを発現させる、単独の刺激、または刺激の組み合わせを識別する。生体サンプルを活性化するコンジュゲーションケミストリー、例えば、iEDDAクリックケミストリーを使用して、ハッシュタグオリゴヌクレオチドを分子、例えば、細胞表面マーカー(例えば、構造的に発現した細胞表面マーカー)に結合する配位子にコンジュゲートさせる、例えば共有的に付着させることができる。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、T細胞(例えば、β2マイクログロブリン、CD298)を含む、大部分の、またはあらゆる細胞により発現される。いくつかの実施形態では、選択される細胞マーカーは、活性化状態に関係なく、T細胞(例えば、CD2、CD3、CD4、及び/またはCD8など)により発現される。オリゴタグ抗体は本明細書に記載するものの、特に、シングルセル配列決定分析に基づくさらなる機能的及び/または表現型特性決定のために、脂質及び細胞透過核酸を組み込む、オリゴタグ細胞膜などの、抗体以外の他のオリゴタグ追跡分子を使用することができる。
これらの組成物及び方法で用いるハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)を、あらゆる自然に存在する、または合成生体または化学分子にコンジュゲートすることができ、これを用いて、細胞、例えば、細胞膜に組み込まれる脂質、及び/または、識別された単独のマーカーに特異的に結合するリガンドを標識することができる。結合は共有または非共有であってよい、即ち、コンジュゲートされるか、または、リガンド、及びその対応する標的の性質を考慮に入れ、任意の既知の手段によるものであってよい。用語「第1のHTO-コンジュゲート分子」、及び「さらなるHTO-コンジュゲート分子」、または「第2のHTO-コンジュゲート分子」などは、異なる方法で細胞を標識するHTO-コンジュゲート分子を意味し、例えば、ある分子は、自身を細胞膜に組み込むことができる一方で、第2の分子はマーカーに結合し、2つ以上の分子は、異なる標的、または標的の異なる部分に結合することができる。例えば、複数の「第1のHTO-コンジュゲート分子」は、同一部位で、細胞膜に組み込まれるか、または同一のマーカーに結合する。複数のさらなるHTO-コンジュゲート分子は、第1のHTO-コンジュゲート分子とは異なり、あらゆるさらなるHTO-コンジュゲート分子とは異なるマーカーに結合する。HTO-コンジュゲート分子(例えば、第1のHTO-コンジュゲート分子、ならびに、さらなるHTO-コンジュゲート分子、例えば、第2、第3、第4、及び第5のHTO-コンジュゲート分子など)は、ペプチド、タンパク質、抗体もしくは抗体断片(例えば、抗体の抗原結合部)、抗体模倣物、アフィボディ、リボもしくはデオキシリボ核酸配列、アプタマー、脂質、コレステロール、多糖類、レクチン、または、複数の同一の、もしくは異なる分子で形成されるキメラ分子から独立して選択することができる。HTO-コンジュゲート分子のさらなる非限定例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv断片、一本鎖Fv(scFv)、ダイアボディ(Dab)、シンボディ、ナノボディ、BiTE、SMIP、DARPin、DNL、ドゥオカリン、アドネクチン、フィノマー、Kunitz Domains Albu-dabs、DARTs、DVD-IG、Covxボディ、ペプチボディ、scFv-Ig、SVD-Ig、dAb-Ig、ノブ-イン-ホール、トリオームAbなど、またはこれらの組み合わせを含むものが挙げられる。いくつかの実施形態では、HTOにコンジュゲートした分子は、組み換え、または自然に存在するタンパク質である。特定の実施形態では、HTOにコンジュゲートした分子は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはその断片である。一実施形態では、HTOがコンジュゲートする分子は、自身が、周知の方法に従い、バーコード(例えばHTO)を測定または検出する方法とは無関係な方法で測定可能なフルオロフォアなどの1つ以上の検出可能な標識で直接標識されることもまた可能である。
いくつかの実施形態では、HTO-コンジュゲート分子は、自身が細胞膜に組み込まれる脂質を含む。いくつかの実施形態では、HTO-コンジュゲート分子は、自身が細胞膜に組み込まれるコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、HTO-コンジュゲート分子は、脂質及びコレステロール修飾オリゴヌクレオチド(LMO及びCMO)を含む。例えば、その全体が参照により組み込まれているMcGinnis et al.(2019)Nature Methods 16:619-26を参照されたい。
抗原特異的活性化T細胞集団をさらに機能及び表現型分析するためのアッセイは、当該技術分野において周知であり、蛍光標識結合タンパク質(例えば抗体)またはMHC多量体を用いる蛍光細胞活性化ソーティング、及び/またはフローサイトメトリー分析、シングルセルRNA配列決定(scRNA-seq)、及び/または、配列決定によるトランスクリプトーム及びエピトープの細胞指数(CITE-seq)分析などが挙げられるが、これらに限定されない。「フローサイトメトリー」とは、流体に細胞または粒子を懸濁し、懸濁液をフローサイトメーターに注入することを含む方法包含し、これにより、サンプルを、レーザービームを通して一度に1個の細胞に理想的に流し、光散乱が、細胞及びその構成成分の特徴となる。蛍光標識で標識した細胞は、レーザー光線を吸収し、細胞を区別するために使用可能な波長のバンドで放出される。好ましい実施形態では、細分化及びプールの後、固有の生体サンプルを活性化T細胞に対して濃縮する、例えば、活性化誘発マーカーを発現する細胞に対してソートする。一実施形態では、細胞のあらゆるさらなる機能及び表現型分析の前に、または、これらと同時に、例えば、あらゆるさらなるフローサイトメトリー分析及び/またはシングルセル配列分析(ソートの前後に生体サンプルに添加された、あらゆるCITE-seq試薬のCITE-seq分析を含み得る。)の前に、またはこれらと同時に、活性化誘発マーカーに対する蛍光標識抗体、及び、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)を用いて、細胞を活性化T細胞に対して濃縮する、例えばソートする。「CITE-seq」とは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Stoeckius et al.(20017) Nat.Methods 14:865-868に記載されているように、例えば、シングルセル配列決定アプローチの間に、オリゴヌクレオチド標識分子、例えばオリゴヌクレオチド標識分子を用いて、サンプルのタンパク質発現レベルを測定する方法を包含する。いくつかの非限定的実施形態では、細胞のさらなる機能及び表現型分析は、細胞表面マーカー、例えば、活性化マーカー、または細胞内タンパク質、例えば細胞内サイトカインのタンパク質発現レベルを指示する、蛍光標識抗体によるフローサイトメトリー分析を含む。いくつかの非限定的実施形態では、細胞のさらなる機能及び表現型分析は、各活性化細胞の、シングルセルRNA配列決定を含む。シングルセルRNA配列決定のための、非限定的な例示的プラットホームとしては、プレートベースのアプローチ、またはマイクロフルイディクス/ナノウェルアプローチ、例えば、Drop-seq(Macosko,et al.(2015)Cell 161:1202-14)、InDrop(Kein et al.(2015)Cell161:1187-1201)、10X Genomics(Zhen et al(2017)Nat.Commun.8:1-12)、及び、Illumina(登録商標)/BIO-RADシングルセル配列決定ソリューションなど(ただし、これらに限定されない)の、ドロップレットベースのマイクロフルイディクスアプローチが挙げられるが、これらに限定されない。mRNAの発現レベルは、細胞内でのタンパク質発現レベルと十分に相関しない場合があるため、いくつかの非限定的実施形態では、シングルセルRNA配列決定は、例えば、オリゴヌクレオチドタグ抗体、MHC多量体などを用いて、CITE-Seq分析と組み合わせて行う(例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれているWO2018144813を参照されたい)。
「活性化誘発マーカー」(AIM)は、T細胞の活性化の後で、発現するマーカー、または、発現が上方制御されるマーカーである。T細胞用の周知の活性化誘発マーカーとしては、CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3、TIGITなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、T細胞活性化マーカー、例えば活性化誘発マーカーは、CD40Lを含む。CD40Lは、CD154とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、T細胞活性化マーカー、例えば活性化誘発マーカーは、CD137を含む。CD137は、本明細書では4-1BBとも呼ばれる。したがって、CD137/4-1BBは、CD137、4-1BBなどの、当該技術分野において公知の分子を指し、語句「CD137」、「4-1BB」、及び「CD137/4-1BB」は、同じ意味で用いることができる。CD137/4-1BBは、抗原特異的TCRエンゲージメントの際に速やかに上方制御される、一過性のT細胞活性化マーカーであり、およそ72時間、細胞で発現したままとなる。本明細書に記載する方法では、抗原への曝露後、20~36時間が、CD137/4-1BB発現及び検出の機能的濃縮の、最適な時点のようである。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、CD107を含む。CD107は、CD107aまたはLAMP1とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、インターフェロンガンマ(IFNγ)を含み、これは、ガンマインターフェロン、IFNG、IFGなどともまた呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーはPD-1を含み、これは、プログラム細胞死1、CD279、及びHPD-1とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、TNF受容体スーパーファミリーメンバー4を含み、これは、OX40及び/またはCD134ともまた呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、インターロイキン-2受容体αを含み、これは、IL-2R、IL-2Rα、及び/またはCD25とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、CD69を含み、これは、白血球表面抗原Leu-23及び/またはMLR3とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、CD28を含み、これは、Tp44及び/またはT細胞特異的表面糖タンパク質とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、主要組織適合性複合体クラスII DRを含み、これは、HLA-DRとも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、CXCモチーフケモカイン受容体(CX3CR1)を含み、これは、IL-8受容体、IL-8Rα、及び/またはCDw128aとも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、TIM3を含み、これは、A型肝炎ウイルス細胞受容体2、T細胞膜タンパク質3、及び/またはCD366とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)を含み、これは、CD223とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、Ig及びITIMドメインを含むT細胞免疫受容体(TIGIT)を含み、これは、V-set及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質9(VSIG9)、及び/または、V-set及び/または膜貫通ドメイン含有3(VSTM3)とも呼ぶことができる。
用語「免疫グロブリン」、「抗体(antibody)」、「抗体(antibodies)」、「結合タンパク質」などは、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fvs(scFv)、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab’)断片、ジスルフィド結合Fvs(sdFV)、イントラボディ、ミニボディ、ダイアボディ及び抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、抗原特異的TCRに対する、抗Id抗体を含む)、ならびに、上述のいずれかのエピトープ結合断片を意味する。用語「抗体(antibody)」及び「抗体(antibodies)」は、その全体が本明細書に参照により組み込まれている、米国特許出願公開第20070004909号に開示されているものなどの共有ダイアボディ、及び、その全体が本明細書に参照により組み込まれている同第20090060910号に開示されているものなどのIg-DARTSもまた意味する。
本明細書で使用する場合、用語「検出可能な標識」とは、用いるアッセイフォーマットに応じて、検出可能なシグナルを提供可能な試薬、部分、または化合物を意味する。標識は、分子のみと、及び/または、固有のバーコード(例えば固有のHTO)、もしくはその機能的部分と関連し得る。あるいは、異なる標識を、HTOコンジュゲート分子の各構成成分に対して使用することができる。このような標識は、単独で、または、他の組成物もしくは化合物と組み合わせて、検出可能なシグナルを提供することができる。一実施形態では、標識は相互作用的し、検出可能なシグナルを提供することができる。特定の一実施形態では、標識は目視により、例えば、比色分析により検出可能である。様々な酵素系が、アッセイで比色分析シグナルを明らかにするために作動する。例えば、(グルコースを基質として用いる)グルコースオキシダーゼが、ペルオキシドを、ペルオキシダーゼ、及び、テトラメチルベンジジン(TMB)などの水素ドナーの存在下で、青色に見える酸化TMBを産生する生成物として放出する。他の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)またはアルカリホスファターゼ(AP)、ならびに、ATP、グルコース、及びNAD+と相互作用し、他の生成物の中でもとりわけ、340nmの波長で吸光度が増加して検出されるNADHを得る、グルコース-6リン酸デヒドロゲナーゼと組み合わせたヘキソキナーゼを含む。記載した方法及び分子で利用可能な、さらに他の標識系は、他の手段により検出可能である。例えば、染料が埋め込まれる有色ラテックス微小粒子(Bangs Laboratories,Indiana)を酵素の代わりに使用し、適用可能なアッセイにて、標識した分子の存在を示す視覚シグナルをもたらすことができる。さらに他の標識としては、蛍光性化合物、フルオロフォア、放射性化合物または元素が挙げられる。一実施形態では、蛍光検出可能な蛍光色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フィリコエリトリン(PE)、アロフィコシアニン(APC)、コリホスフィン-0(CPO)またはタンデム染料、PE-シアニン-5または7(PC5またはPC7)、PE-Texas Red(ECD)、PE-シアニン-5.5、ローダミン、PerCP、及びAlexa染料。とりわけ、Texas Redとローダミン、FITC+PE、FITC+PECy5、及びPE+PECy7などの、このような標識の組み合わせを、アッセイ法に応じて使用することができる。分子、及び/またはポリマー分子の任意の構成成分を標識するのに用いるための好適な標識の選択及び/または生成は、本明細書を考慮すると、当該技術分野の範囲内である。
用語「に特異的に結合する」、「特異的な様式で結合する」などは、特異的結合に関与する分子が、(1)生理的条件下で、安定的に結合する、例えば会合する、例えば分子間非共有結合を形成可能であり、かつ、(2)生理的条件下で、特定の結合ペア以外の他の分子に結合不可能であることを示す。
用語「タンパク質」とは、糖タンパク質、加えて、あらゆる他の種類の修飾タンパク質(例えば、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、グリコシル化、酸化、ホルミル化、アミド化、ポリグルタミル化、ADP-リボシル化、PEG化、ビオチン化などにより得られるタンパク質)を含むがこれらに限定されない、あらゆる長さのタンパク質断片、融合タンパク質、及び修飾タンパク質を含む、全ての種類の自然に存在する、及び合成タンパク質を包含する。
用語「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、及び「ヌクレオチド」は、特に明記しない限り、DNA、RNAの両方、修飾塩基、またはこれらの塩基の組み合わせを包含する。いくつかの実施形態では、ハッシュタグオリゴヌクレオチドはDNAを含む。いくつかの実施形態では、ハッシュタグオリゴヌクレオチドは、3~100、3~50、3~30、5~30、10~20、5~20、または5~15個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハッシュタグオリゴヌクレオチドは、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、80、91、92、93、94、95、96、97、98、99個、または最大100個のヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態では、ハッシュタグオリゴヌクレオチドはポリA配列を含み、当該配列は、10個以上(例えば10~40、10~30、または10~20個)の連続したアデノシンヌクレオチド、アデノシンヌクレオチドの誘導体またはバリアントを含むことができる。
用語「自己」とは、同一の源から単離した生物学的構成成分を意味し、同一の源から単離されてはいないが、生体構成成分が同一の源から単離されているかのような物理的(例えばアミノ酸配列)、及び機能的特徴を有する生体構成成分を含む。対照的に、「異種」とは、異なる源からの剤または構成要素を意味する。
本明細書における開示に従うと、当該技術範囲内で、従来の分子生物学、微生物学、及び組み換えDNA技術を用いてよい。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、出版物のそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition.Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989(本明細書では“Sambrook et al.,1989”);DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984);Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985)];Transcription And Translation[B.D.Hames & S.J.Higgins,eds.(1984)];Animal Cell Culture[R.I.Freshney,ed.(1986)];Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press,(1986)];B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);Ausubel,F.M.et al.(eds.).Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley & Sons,Inc.,1994を参照されたい。これらの技術は部分特異的突然変異誘発を含む。例えば、出版物のそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82: 488-492(1985)、米国特許第5,071,743号、Fukuoka et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.263:357-360(1999);Kim and Maas,BioTech.28:196-198(2000);Parikh and Guengerich,BioTech.24:4 28-431(1998);Ray and Nickoloff,BioTech.13:342-346(1992);Wang et al.,BioTech.19:556-559(1995);Wang and Malcolm,BioTech.26: 680-682(1999);Xu and Gong,BioTech.26:639-641(1999)、米国特許第5,789,166号及び同第5,932,419号、Hogrefe,Strategies 14.3:74-75(2001)、米国特許第5,702,931号、同第5,780,270号、及び同第6,242,222号、Angag and Schutz,Biotech.30:486-488(2001)、Wang and Wilkinson,Biotech.29:976-978(2000)、Kang et al.,Biotech.20:44-46(1996)、Ogel and McPherson,Protein Engineer.5:467-468(1992)、Kirsch and Joly,Nucl.Acids.Res.26:1848-1850(1998)、Rhem and Hancock,J.Bacteriol.178:3346-3,349(1996)、Boles and Miogsa,Curr.Genet.28:197-198(1995)、Barrenttino et al.,Nuc.Acids.Res.22:541-542(1993)、Tessier and Thomas,Meths.Molec.Biol.57:229-237、及びPons et al.,Meth.Molec.Biol.67:209-218を参照されたい。
方法及び組成物
本明細書に記載する組成物及び方法は、(a)対象、例えばヒト対象から単離した生体サンプル、例えば細胞の機能的活性化の有無を検出し、及び/または、(b)刺激、及び任意選択的に固有の同族TCR配列を識別するのに有用である。
本明細書に記載する組成物及び方法は、(a)対象、例えばヒト対象から単離した生体サンプル、例えば細胞の機能的活性化の有無を検出し、及び/または、(b)刺激、及び任意選択的に固有の同族TCR配列を識別するのに有用である。
一実施形態では、T細胞を活性化可能な抗原、例えばT細胞エピトープ、ならびに任意選択的に、本明細書に記載する抗原、例えばT細胞に特異的に結合するTCRの、T細胞受容体(TCR)α鎖配列及び/またはTCRβ鎖配列の識別方法は、
(I)活性化誘発マーカー(AIM)の発現に基づき、活性化T細胞を、固有の生体サンプルを含む組成物からソートすることであって、当該固有の生体サンプルが、
(a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記T細胞及びMHC、
(b)固有の抗原、
(c)固有の抗原を特異的に識別するために使用可能な、好ましくは特異的に識別する固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、固有のHTOが、T細胞を固有のHTOで標識する分子にコンジュゲートした、上記固有のHTO、ならびに、任意選択的に、
(d)T細胞の活性化を支持する培地
を含む、上記ソートすることと、
(II)(I)でソートした活性化T細胞でシングルセル配列決定分析を行い、活性化T細胞を固有のHTOで標識した分子にコンジュゲートした固有のHTOを識別することであって、固有のHTOを識別することが、活性化T細胞を活性化可能な抗原を識別し、任意選択的に、シングルセル配列決定分析が、以下のうちの1つ以上:
(i)活性化T細胞により発現した1つ以上の遺伝子、及び/または
(ii)活性化T細胞により発現したTCRのTCRα及び/またはβ鎖配列
もまた識別する、上記識別することと、を含む。
(I)活性化誘発マーカー(AIM)の発現に基づき、活性化T細胞を、固有の生体サンプルを含む組成物からソートすることであって、当該固有の生体サンプルが、
(a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記T細胞及びMHC、
(b)固有の抗原、
(c)固有の抗原を特異的に識別するために使用可能な、好ましくは特異的に識別する固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、固有のHTOが、T細胞を固有のHTOで標識する分子にコンジュゲートした、上記固有のHTO、ならびに、任意選択的に、
(d)T細胞の活性化を支持する培地
を含む、上記ソートすることと、
(II)(I)でソートした活性化T細胞でシングルセル配列決定分析を行い、活性化T細胞を固有のHTOで標識した分子にコンジュゲートした固有のHTOを識別することであって、固有のHTOを識別することが、活性化T細胞を活性化可能な抗原を識別し、任意選択的に、シングルセル配列決定分析が、以下のうちの1つ以上:
(i)活性化T細胞により発現した1つ以上の遺伝子、及び/または
(ii)活性化T細胞により発現したTCRのTCRα及び/またはβ鎖配列
もまた識別する、上記識別することと、を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、
(I)固有の生体サンプルのプールを含む組成物から、1つ以上の活性化T細胞(複数可)をソートすることと、
(II)(I)でソートした活性化T細胞でシングルセル配列決定分析を行い、活性化T細胞が反応性である抗原を識別することと、
を含む。
いくつかの実施形態では、(I)でソートされた固有の生体サンプルのそれぞれは、
(a)T細胞、及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能であり、各固有の生体サンプルの各T細胞が同一の対象から単離され、各固有の生体サンプルの各MHCが同一のハプロタイプを有し(任意選択的に、各固有の生体サンプルの各MHCが同一のサンプルに由来し、同一表面(例えば、抗原提示細胞の細胞膜)に結合するなど)、上記T細胞及びMHC、
(b)固有の抗原、例えばT細胞エピトープ、
(c)固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、固有のハッシュタグオリゴヌクレオチドが、T細胞をHTOで標識する分子にコンジュゲートし、固有のHTOが、固有の抗原、例えば、(b)のT細胞エピトープを特異的に識別する独自のヌクレオチド配列を含む、上記HTO、ならびに、任意選択的に、
(d)T細胞の活性化を支持する培地
を含み、
(II)のシングルセル配列決定分析が、構成要素にコンジュゲートした固有のHTOを識別し、固有のHTOの独自のヌクレオチド配列が、活性化T細胞を活性化可能な抗原、例えばT細胞エピトープを識別するようにいくつかの実施形態では、HTO-コンジュゲート分子は、自身を細胞膜に組み込む脂質を含む。いくつかの実施形態では、HTO-コンジュゲート分子は、T細胞により発現する細胞表面マーカーに特異的に結合したリガンドを含む。いくつかの実施形態では、T細胞により発現される細胞表面マーカーは、多くの細胞により遍在的に発現される。例えば、細胞表面マーカーはβ2マイクログロブリンであってよい。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、活性化状態に関係なく、全てのT細胞により選択的に発現されることができる。いくつかの実施形態では、細胞マーカーは、β2マイクログロブリン、CD298、CD2、CD3、CD4、CD8、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、シングルセル配列決定分析は、活性化T細胞により発現した1つ以上の遺伝子、及び/または、活性化T細胞により発現したTCRのTCRα及び/またはβ鎖配列もまた識別する。
(I)固有の生体サンプルのプールを含む組成物から、1つ以上の活性化T細胞(複数可)をソートすることと、
(II)(I)でソートした活性化T細胞でシングルセル配列決定分析を行い、活性化T細胞が反応性である抗原を識別することと、
を含む。
いくつかの実施形態では、(I)でソートされた固有の生体サンプルのそれぞれは、
(a)T細胞、及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能であり、各固有の生体サンプルの各T細胞が同一の対象から単離され、各固有の生体サンプルの各MHCが同一のハプロタイプを有し(任意選択的に、各固有の生体サンプルの各MHCが同一のサンプルに由来し、同一表面(例えば、抗原提示細胞の細胞膜)に結合するなど)、上記T細胞及びMHC、
(b)固有の抗原、例えばT細胞エピトープ、
(c)固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、固有のハッシュタグオリゴヌクレオチドが、T細胞をHTOで標識する分子にコンジュゲートし、固有のHTOが、固有の抗原、例えば、(b)のT細胞エピトープを特異的に識別する独自のヌクレオチド配列を含む、上記HTO、ならびに、任意選択的に、
(d)T細胞の活性化を支持する培地
を含み、
(II)のシングルセル配列決定分析が、構成要素にコンジュゲートした固有のHTOを識別し、固有のHTOの独自のヌクレオチド配列が、活性化T細胞を活性化可能な抗原、例えばT細胞エピトープを識別するようにいくつかの実施形態では、HTO-コンジュゲート分子は、自身を細胞膜に組み込む脂質を含む。いくつかの実施形態では、HTO-コンジュゲート分子は、T細胞により発現する細胞表面マーカーに特異的に結合したリガンドを含む。いくつかの実施形態では、T細胞により発現される細胞表面マーカーは、多くの細胞により遍在的に発現される。例えば、細胞表面マーカーはβ2マイクログロブリンであってよい。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、活性化状態に関係なく、全てのT細胞により選択的に発現されることができる。いくつかの実施形態では、細胞マーカーは、β2マイクログロブリン、CD298、CD2、CD3、CD4、CD8、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、シングルセル配列決定分析は、活性化T細胞により発現した1つ以上の遺伝子、及び/または、活性化T細胞により発現したTCRのTCRα及び/またはβ鎖配列もまた識別する。
いくつかの実施形態では、方法は、固有の生体サンプルのプールを形成することをさらに含む。固有の生体サンプルのプールを形成することは、例えば、対象から単離し、少なくともT細胞、ならびに好ましくはMHC(例えば末梢血単核球細胞(PBMC)、T細胞、及びAPCなど)を含む生体サンプルを個別のサンプルに等しく分配することにより、複数の生体サンプルを作製することと、生体サンプルを、T細胞の生存能、活性化、及び/または活性を支持する条件で維持することとを含むことができる(例えば、各生体サンプルは培地、ならびに、PBMC、例えばT細胞及びAPC、生存能、及び活性を支持するサイトカインを含む)。本明細書に記載するように、本明細書に記載の方法で使用するT細胞及びMHCは、任意の源に由来することができる。いくつかの実施形態では、MHCは抗原提示細胞で発現する。例えば、生体サンプルは、抗原提示細胞(APC)の表面で発現するT細胞及びMHCを含む。いくつかの実施形態では、T細胞及びAPCは自己由来である。APCの非限定的かつ例示的な源としては、全末梢血単核球細胞(PBMC)、単球由来の樹状細胞(DC)、B細胞、マクロファージ、正常組織または腫瘍細胞、APC細胞などが挙げられる。T細胞は、APCのT細胞との同時培養を用いて刺激することができる。いくつかの実施形態では、全PBMCは、APCとT細胞の両方をもたらす。
いくつかのこれらの、及び他の実施形態では、方法は、(i)固有の抗原、例えば固有のT細胞エピトープを、対象から単離し、少なくともT細胞、及び好ましくはMHCもまた含む生体サンプルに送達することで、及び/または、(ii)T細胞をHTOで標識する分子にコンジュゲートした固有のHTOに送達することで、固有の生体サンプルを作製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、固有の生体サンプルを、抗原と同時に再刺激する前に約7~10日間、固有の抗原でプライミングし、再刺激の後、サンプルを固有のHTOで細分化する。いくつかの実施形態では、固有の生体サンプルは、抗原で同時に再刺激されるにエクスビボでプライミングされず、固有のHTOで細分化される(例えば、サンプルはインビボでプライミングされている)。いくつかの実施形態では、サンプルは、細分化される前に少なくとも6時間、再刺激される。いくつかの実施形態では、サンプルは、細分化される前に少なくとも16時間、再刺激される。いくつかの実施形態では、サンプルは、細分化される前に少なくとも約18~24時間、再刺激される。いくつかの実施形態では、サンプルは、細分化される前に約48時間、再刺激される。いくつかの実施形態では、サンプルは、細分化される前に約72時間、再刺激される。いくつかの実施形態では、サンプルは、細分化される前に96時間以下で再刺激される。いくつかの実施形態では、方法は、固有の生体サンプルをプールして、固有の生体サンプルを含む組成物を作製することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、1つ以上の活性化T細胞(複数可)をソートすることは、活性化誘発マーカー(AIM)アッセイを含む。いくつかの実施形態では、AIMアッセイは、活性化誘発マーカーに特異的に結合する蛍光標識リガンドに結合した活性化T細胞の、蛍光活性化細胞ソーティングを含む。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、固有の生体サンプルのプールを含む組成物から活性化T細胞をソートする前に、固有の生体サンプルを、活性化誘発マーカーに特異的に結合する蛍光標識リガンドでインキュベートすることを含む。インキュベーション工程は、任意の細分化工程と同時に、及び/または、固有の生体サンプルのプール工程の後で生じることができる。
いくつかの実施形態では、蛍光標識リガンドは蛍光標識抗体であり、及び/または、活性化誘発マーカーは、CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3、及び/またはTIGIT、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、CD137/4-1BBを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、活性化T細胞のさらなる機能分析及び/または表現型分析を行うことを含む。いくつかの実施形態では、さらなる機能分析及び/または表現型分析は、フローサイトメトリー分析、CITE-seq分析、多量体分析、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、さらなる機能分析及び/または表現型分析は、CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD62L、HLA-DR、CD137/4-1BB、CD69、CD278、CD274、CD279、CD127、CD197、IFNγ、GZMH、GNLY、CD38、CCL3、及びLAG3のうちの1つ以上のタンパク質及び/または発現レベルを測定する。
例えば、細胞が検出可能な機能を示す、生物学的に活性な細分化サンプルもまた本明細書で記載する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は、
(a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記T細胞及びMHC、
(b)抗原、例えばT細胞エピトープ、
(c)ハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、HTOが、T細胞をHTOで標識する分子にコンジュゲートし、HTOが、抗原、例えば、(b)のT細胞エピトープを特異的に識別するヌクレオチド配列を含む、上記HTO、ならびに、任意選択的に、
(d)T細胞の活性化を支持する培地
を含む生体サンプルを含む。
いくつかの実施形態では、T細胞をHTOで標識する分子は脂質である。いくつかの実施形態では、T細胞をHTOで標識する分子は、細胞マーカーに結合する抗体である。
(a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記T細胞及びMHC、
(b)抗原、例えばT細胞エピトープ、
(c)ハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、HTOが、T細胞をHTOで標識する分子にコンジュゲートし、HTOが、抗原、例えば、(b)のT細胞エピトープを特異的に識別するヌクレオチド配列を含む、上記HTO、ならびに、任意選択的に、
(d)T細胞の活性化を支持する培地
を含む生体サンプルを含む。
いくつかの実施形態では、T細胞をHTOで標識する分子は脂質である。いくつかの実施形態では、T細胞をHTOで標識する分子は、細胞マーカーに結合する抗体である。
本明細書に記載の方法で使用可能な組成物もまた、本明細書で記載する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は、
(a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記T細胞及びMHC、
(b)抗原、
(c)抗原を特異的に識別するハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、上記HTOが、T細胞をHTOで標識する分子にコンジュゲートした、上記HTO、
ならびに、任意選択的に、
(d)T細胞の活性化を支持する培地
を含む生体サンプルを含む。
(a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記T細胞及びMHC、
(b)抗原、
(c)抗原を特異的に識別するハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、上記HTOが、T細胞をHTOで標識する分子にコンジュゲートした、上記HTO、
ならびに、任意選択的に、
(d)T細胞の活性化を支持する培地
を含む生体サンプルを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、(例えば、少なくとも2つの)固有の生体サンプルのプール、例えば、第1及び第2の生体サンプル(ならびに、いくつかの実施形態では、さらなる生体サンプル)を含む組成物を含み、第1及び第2の生体サンプルのそれぞれは、
(a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記T細胞及びMHC、
(b)抗原、例えばT細胞エピトープ、
(c)ハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、HTOが、T細胞をHTOで標識する分子にコンジュゲートし、HTOが、(b)の抗原を特異的に識別するために使用可能な、及び好ましくは特異的に識別するヌクレオチド配列を含む、上記HTO、ならびに任意選択的に、
(d)T細胞の活性化を支持する培地
を含む。
いくつかの実施形態では、第2の生体サンプルは、
(a)第2のT細胞及び第2の表面結合MHCであって、第2のT細胞が、第2の表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能である、上記第2のT細胞及び第2の表面結合MHC、
(b)第2の抗原、例えば、第2のT細胞エピトープ、
(c)第2のHTOであって、ハッシュタグオリゴヌクレオチドが、T細胞をHTOで標識する第2の分子にコンジュゲートし、第2のHTOが、第2の抗原、例えば、(b)の第2のT細胞エピトープを特異的に識別する第2の配列を含む、上記第2のHTO、ならびに、任意選択的に、
(d)第2のT細胞の活性化を支持する第2の培地、を含み、
(i)第1のサンプルのT細胞、及び第2のT細胞は同一の対象から単離され、第1のサンプルのMHC、及び第2のMHCは同一表面に結合し、好ましくは同一のハプロタイプを有し(例えば、同一の源から単離され)、(ii)第1のサンプルの抗原、例えば、第1のT細胞エピトープ、及び第2の抗原、例えば第2のT細胞エピトープは同一ではなく、(iii)第1の分子及び第2の分子は同一であり、第1のHTOの第1のヌクレオチド配列、及び第2のHTOの第2のヌクレオチド配列は同一ではない。
(a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記T細胞及びMHC、
(b)抗原、例えばT細胞エピトープ、
(c)ハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、HTOが、T細胞をHTOで標識する分子にコンジュゲートし、HTOが、(b)の抗原を特異的に識別するために使用可能な、及び好ましくは特異的に識別するヌクレオチド配列を含む、上記HTO、ならびに任意選択的に、
(d)T細胞の活性化を支持する培地
を含む。
いくつかの実施形態では、第2の生体サンプルは、
(a)第2のT細胞及び第2の表面結合MHCであって、第2のT細胞が、第2の表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能である、上記第2のT細胞及び第2の表面結合MHC、
(b)第2の抗原、例えば、第2のT細胞エピトープ、
(c)第2のHTOであって、ハッシュタグオリゴヌクレオチドが、T細胞をHTOで標識する第2の分子にコンジュゲートし、第2のHTOが、第2の抗原、例えば、(b)の第2のT細胞エピトープを特異的に識別する第2の配列を含む、上記第2のHTO、ならびに、任意選択的に、
(d)第2のT細胞の活性化を支持する第2の培地、を含み、
(i)第1のサンプルのT細胞、及び第2のT細胞は同一の対象から単離され、第1のサンプルのMHC、及び第2のMHCは同一表面に結合し、好ましくは同一のハプロタイプを有し(例えば、同一の源から単離され)、(ii)第1のサンプルの抗原、例えば、第1のT細胞エピトープ、及び第2の抗原、例えば第2のT細胞エピトープは同一ではなく、(iii)第1の分子及び第2の分子は同一であり、第1のHTOの第1のヌクレオチド配列、及び第2のHTOの第2のヌクレオチド配列は同一ではない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも2つの固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも3つの固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも4つの固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも5つの固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも6つの固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも7つの固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも8個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも9個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも10個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも11個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも12個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも13個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも14個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも15個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも17個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも18個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも19個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも20個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも30個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも50個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも80個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも100個の固有の生体サンプルを含む。
本明細書に記載するいくつかの組成物の実施形態では、MHCは、抗原提示細胞(APC)、例えば樹状細胞の表面で発現する。いくつかの実施形態では、T細胞及びAPCは自己由来であり、T細胞及びAPCはそれぞれ、ヒトドナーから単離され、及び/または、APCは樹状細胞である。
本明細書に記載するいくつかの組成物の実施形態では、抗原、例えばT細胞エピトープは、(i)細菌抗原またはその一部、(ii)ウイルス性抗原またはその一部、(iii)アレルゲンまたはその一部、(iv)腫瘍関連抗原またはその一部、及び(v)これらの組み合わせからなる群からなる群から選択される。本明細書に記載するいくつかの組成物の実施形態では、抗原、例えばT細胞エピトープは、(i)アミノ酸配列、(ii)ヌクレオチド配列、(iii)細胞溶解物、及び(iv)これらの組み合わせを含む。
本明細書に記載するいくつかの組成物の実施形態では、HTOは、抗体である分子にコンジュゲートし、及び/または、分子は、β2マイクログロブリン、CD298、CD2、CD3、CD4、及び/またはCD8からなる群から選択される細胞表面マーカーに結合する。
いくつかの実施形態では、培地は、T細胞及び/またはAPCの生存能を支持するサイトカインを含み、任意選択的に、サイトカインは、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、GM-CSF、IL-4、FLT3L、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、培地は、T細胞及び/またはAPCの生存能を支持するサイトカイン(複数可)の代わりに、またはこれに加えて、抗CD28及び/または抗CD3抗体を含む。
いくつかの実施形態では、生体サンプルは、対象から単離した末梢血単核球細胞(PBMC)を含む。いくつかの実施形態では、PBMCは新しく単離したPBMCである。他の実施形態では、PBMCは、凍結保存された、新しく解凍したPBMCである。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、樹状細胞とT細胞、例えば、自己由来の樹状細胞とT細胞の、共培養物を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は、T細胞活性化マーカーに特異的に結合する蛍光標識抗体をさらに含み、任意選択的に、T細胞活性化マーカーは、CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3、及び/またはTIGIT、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は、フローサイトメトリー分析もしくは分析に有用なさらなる抗体、及び/またはMHC多量体(例えば、蛍光標識多量体及び/またはオリゴタグ多量体)をさらに含む。
キット
本明細書で提供する方法及び組成物は、免疫応答のハイスループット評価で有用であり得る。本明細書において提供する方法は、MHCハプロタイプに関係なく患者サンプルで用いられ得るため、このようなT細胞応答のシェルフ分析のためのキットもまた、本明細書で提供する。
本明細書で提供する方法及び組成物は、免疫応答のハイスループット評価で有用であり得る。本明細書において提供する方法は、MHCハプロタイプに関係なく患者サンプルで用いられ得るため、このようなT細胞応答のシェルフ分析のためのキットもまた、本明細書で提供する。
いくつかの実施形態では、キットは、複数の固有の抗原、例えば、複数の固有のT細胞エピトープ、及び、複数の固有のHTO-コンジュゲート分子を含み、複数の固有のHTO-コンジュゲート分子のそれぞれは、固有のHTO配列及び同一の分子を含む固有のHTOを含み、複数の固有のHTO配列のそれぞれは、複数の固有の抗原のうちの1つ(例えば、複数の固有のT細胞エピトープのうちの1つ)のみに割り当てられ、これにより、固有のHTO配列が、割り当てられた固有の抗原(例えば、T細胞エピトープ)を識別することができる。いくつかの実施形態では、複数の抗原のそれぞれは、同一の源に由来する。例えば、複数の抗原は、例えば、エピトープマッピングを補助するための、単一の抗原に由来する、重なり合うペプチドのパネルを含む。いくつかの実施形態では、単一の抗原は、病原性抗原、例えば細菌性またはウイルス性抗原であることができる。非限定的な実施形態では、このようなキットは、病原性抗原に由来する複数の抗原(例えば、T細胞エピトープ)を含み、これは、ワクチン開発、または、確立したワクチンに対する患者の免疫応答の監視に有用であり得る。いくつかの実施形態では、単一の抗原は、腫瘍関連抗原であってよい。非限定的な実施形態では、このようなキットは、腫瘍関連抗原抗原に由来する複数の抗原(例えば、T細胞エピトープ)を含み、これは、免疫療法開発、例えば、腫瘍細胞に対する、T細胞が媒介する細胞毒性と関連する、TCR可変(例えば、CDR3)配列の識別において有用であり得る。いくつかの実施形態では、単一の抗原は、自己抗原であってよい。非限定的な実施形態では、このようなキットは、自己抗原に由来する複数の抗原(例えば、T細胞エピトープ)を含み、これは、患者の自動免疫応答の監視に有用であり得る。いくつかの実施形態では、単一の抗原は、移植抗原であってよい。非限定的な実施形態では、このようなキットは、移植抗原に由来する複数の抗原(例えば、T細胞エピトープ)を含み、これは、対象により拒絶される可能性が低いドナー器官の識別、及び/または、移植片対宿主病の確立において有用であり得る。いくつかのキットの実施形態は、追加の成分、例えば、陰性及び/または陽性対照抗原、緩衝液、バイアル瓶、使用のための取扱説明書、マルチウェル培養皿などをさらに含むことができる。
このようなキットは、例えば、(1)ワクチン、免疫療法などの、可能性のある、もしくは進行中の治療法に対する、(2)自己免疫疾患もしくは移植拒絶反応の間の、(3)TCRベースの治療薬の開発のための、及び/または、(4)TCR:エピトープ結合アルゴリズムのための、T細胞応答のハイスループット分析において有用であり得る。したがって、免疫応答を評価する、及び/または、免疫応答に関与する活性化T細胞と関連する、TCR配列(例えば、TCR可変配列、例えば、TCRα及び/またはβ可変配列、例えば、TCRα及び/またはβ CDR1、CDR2、及び/またはCDR3配列)を識別するための、本明細書に記載するハイスループットスクリーニング法、組成物、及び/またはキットの使用方法もまた本明細書で提供する。
使用
本明細書で提供する方法及び組成物は、免疫応答の評価に有用であり得る。したがって、T細胞の活性化、免疫寛容などの文脈で免疫応答を研究するための、ハイスループットスクリーニング方法、関連する組成物、及び/または関連するキットの使用方法もまた本明細書に記載する。
本明細書で提供する方法及び組成物は、免疫応答の評価に有用であり得る。したがって、T細胞の活性化、免疫寛容などの文脈で免疫応答を研究するための、ハイスループットスクリーニング方法、関連する組成物、及び/または関連するキットの使用方法もまた本明細書に記載する。
本明細書に記載する方法は、単離時から、あらゆる事前刺激または再刺激培養を通して、細胞ソーティングの時間まで、サンプル(例えば、末梢血単核球細胞(PMBC)、吸引物)の、異なる細胞画分、特に、抗原特異的T細胞の画分の相対的な画分に影響を及ぼさないようである。したがって、サンプル内での、抗原特異的T細胞の相対的な集団サイズを評価するための、本明細書に記載するハイスループットスクリーニング法、組成物、及び/またはキットの使用方法を提供する。
ワクチン候補を試験するための、本明細書に記載するハイスループットスクリーニング法、組成物、及び/またはキットの使用方法もまた提供する。一実施形態では、ワクチンが、対象において免疫応答(例えば、T細胞増殖、サイトカイン放出など)を活性化し、エフェクター、加えてメモリーT細胞(例えば、中枢及びエフェクターメモリーT細胞)の生成をもたらすか否かの評価方法、及び/または、活性化された免疫学的免疫応答の分子表現型の識別方法を本明細書において提供する。
本発明は、養子T細胞療法のための、本明細書に記載するハイスループットスクリーニング法、関連する組成物、及び/またはキットの使用方法もまた提供する。したがって、対象(例えば哺乳動物対象、例えばヒト対象)において、疾患または病状(例えばがん)の治療または緩和方法を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、疾患または病状はがんである。その他の実施形態では、疾患または病状は、ウイルスまたは細菌により引き起こされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する養子T細胞療法は、本明細書に記載するハイスループットスクリーニング法、組成物、及び/またはキットを用いて、TCRα及び/またはβ可変ドメインをコードする核酸配列、例えば、抗原特異的T細胞のTCRα及び/またはβ可変ドメインの、CDR1、CDR2、及び/またはCDR3の配列(または、他の実施形態では、TCRγ及び/またはδ可変ドメインをコードする核酸配列)、ならびに同族抗原を識別することを含む。いくつかの実施形態では、TCRα及び/またはβ可変ドメインをコードする核酸配列、例えば、識別した、TCRα及び/またはβ可変ドメインの、CDR1、CDR2、及び/またはCDR3の配列(または、他の実施形態では、TCRγ及び/またはδ可変ドメインをコードする核酸配列)を、ヒト治療薬の創薬で用いる。
一実施形態では、ヒト治療薬は、T細胞が、対象となる抗原に対する親和性を有するTCRを発現するように、対象となる核酸配列を有する(例えば、トランスフェクションした、もしくは形質導入した、または、別の場合においては対象となる核酸が導入された)T細胞(例えば、ヒトT細胞、例えば、ヒト対象由来のT細胞)である。一態様では、治療薬が用いられる対象は、特定の疾患または病状に対する治療法が必要であり、抗原は疾患または病状と関連している。一態様では、T細胞は細胞傷害性T細胞であり、抗原は腫瘍関連抗原であり、疾患または病状はがんである。一態様では、T細胞は対象に由来する。したがって、核酸及び同族抗原の識別の際に、本明細書に記載する方法養子T細胞療法は、本明細書に記載する方法により識別したT細胞受容体の核酸配列またはその一部(例えば、TCR可変ドメインの核酸配列)を、発現ベクター(例えば、レトロウイルスベクター)にクローニングすることと、ベクターを、対象に由来するT細胞に導入し、T細胞が抗原特異的T細胞を発現することと、T細胞を対象に注入することと、をさらに含むことができる。
本明細書に記載する養子T細胞療法の他の実施形態では、TCRα及び/またはβ可変ドメインをコードする核酸配列(複数可)、例えば、抗原特異的T細胞のTCRα及び/またはβ可変ドメインの、CDR1、CDR2、及び/またはCDR3の配列(または、他の実施形態では、TCRγ及び/またはδ可変ドメインをコードする核酸配列)を、ヒトT細胞受容体治療薬の作製において用いる。一実施形態では、治療薬受容体は、可溶性T細胞受容体である。多くの努力が広がり、治療剤で用いるための、可溶性T細胞受容体またはTCR可変領域が生成されてきた。可溶性T細胞受容体の生成は、再配列したTCR可変領域を入手することに左右される。1つのアプローチは、TCRα及びTCRβを含む一本鎖TCRを設計し、同様にscFv免疫グロブリンフォーマットも設計し、これらをリンカーを介して互いに融合することである(例えば、国際出願第2011/044186号を参照されたい)。得られるscTvは、scFvに類似する場合、熱的に安定な、可溶性形態のTCRα/β結合タンパク質を提供する。代替のアプローチは、TCRβ定常ドメインを有する可溶性TCRを設計すること(例えば、Chung et al.,(1994)Functional three-domain single-chain T-cell receptors,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:12654-58を参照されたい);加えて、非自然のジスルフィド結合を組み換えて、TCR定常ドメイン間の界面に導入すること(Boulter and Jakobsen(2005)Stable,soluble,high-affinity,engineered T cell receptors:novel antibody-like proteins for specific targeting of peptide antigens,Clinical and Experimental Immunology 142:454-60で確認される;米国特許第7,569,664号も参照されたい)を含んだ。可溶性T細胞受容体の他のフォーマットは説明されている。本明細書に記載の方法を用いて、対象となる抗原に、高親和性を有して結合するT細胞受容体の配列を測定し、その後、配列に基づき可溶性T細胞受容体を設計することができる。
本明細書に記載するハイスループット法、組成物、及び/またはキットに従い識別した配列を含む可溶性T細胞受容体を用いて、対象となるタンパク質、例えば、ウイルス性、細菌性、または腫瘍関連タンパク質の機能を遮断することができる。あるいは、可溶性T細胞受容体は、感染細胞またはがん細胞を殺傷可能な部分、例えば細胞傷害性分子(例えば、化学治療薬)、毒素、放射性核種、プロドラッグ、抗体などに融合することができる。可溶性T細胞受容体はまた、免疫賦活性分子、例えばサイトカイン、ケモカインなどに融合することができる。可溶性T細胞受容体はまた、免疫阻害性分子、例えば、T細胞により認識される抗原を有する他の細胞を、T細胞が殺傷することを妨げる分子に融合することができる。免疫阻害性分子に融合した、このような可溶性T細胞受容体を、例えば自己免疫の遮断において用いることができる。可溶性T細胞受容体に融合可能な、様々な例示的な免疫阻害性分子は、参照により本明細書に組み込まれているRavetch and Lanier(2000)Immune Inhibitory Receptors,Science 290:84-89で確認されている。
非限定的かつ例示的な実施形態を以下に示す。
実施形態1。T細胞のプールから、オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体で標識したT細胞をソートすることを含む、対象となるエピトープを認識するTCRのT細胞受容体(TCR)α及び/またはβ鎖配列を識別する方法であって、オリゴヌクレオチドタグが、固有のエピトープ、抗原、または抗原プールと関連する配列を含む、上記方法。
実施形態2。ソート後に、上記オリゴヌクレオチドタグの配列を測定することで、オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体で標識したT細胞を活性化したエピトープ、抗原、または抗原プールを測定する工程を含む、実施形態1に記載の方法。
実施形態3。上記ソート工程の前に、以下の工程のうちの1つ以上:
例えば、マルチウェル培養プレートにて、複数の培養液から末梢血単核球細胞(PBMC)サンプルを作製することであって、各培養液が、抗原提示細胞(APC)及びT細胞機能及び増殖を支持する培地及びサイトカインを含む、上記作製する工程と、
複数の培養液のそれぞれ1つを、対象となる固有の抗原または抗原プールに送達することにより固有の培養液を作製すること、例えば、対象となる単一の抗原(または抗原プール)を、複数の培養液、例えば、培養プレートの1個のウェルに添加することであって、各培養液(ウェル)が、固有の抗原または抗原プールを含む、上記作製する工程と、
固有の培養液に、当該固有の培養液と関連する固有のオリゴヌクレオチドタグを添加する工程と、
任意選択的に、オリゴマータグ、例えばCITE-seq及びオリゴデキストラマー試薬もまた含み得る、他の表面染色抗体及び多量体を添加する工程と、
上記培養液をプールする工程と、
を含む、実施形態1または実施形態2に記載の方法。
例えば、マルチウェル培養プレートにて、複数の培養液から末梢血単核球細胞(PBMC)サンプルを作製することであって、各培養液が、抗原提示細胞(APC)及びT細胞機能及び増殖を支持する培地及びサイトカインを含む、上記作製する工程と、
複数の培養液のそれぞれ1つを、対象となる固有の抗原または抗原プールに送達することにより固有の培養液を作製すること、例えば、対象となる単一の抗原(または抗原プール)を、複数の培養液、例えば、培養プレートの1個のウェルに添加することであって、各培養液(ウェル)が、固有の抗原または抗原プールを含む、上記作製する工程と、
固有の培養液に、当該固有の培養液と関連する固有のオリゴヌクレオチドタグを添加する工程と、
任意選択的に、オリゴマータグ、例えばCITE-seq及びオリゴデキストラマー試薬もまた含み得る、他の表面染色抗体及び多量体を添加する工程と、
上記培養液をプールする工程と、
を含む、実施形態1または実施形態2に記載の方法。
実施形態4。例えば、マルチウェル培養プレートにて、複数の培養液から末梢血単核球細胞(PBMC)サンプルを作製することであって、各培養液が、抗原提示細胞(APC)及びT細胞機能及び増殖を支持する培地及びサイトカインを含む、上記作製することと、
複数の培養液のそれぞれ1つを、対象となる固有の抗原または抗原プールに送達することにより固有の培養液を作製すること、例えば、対象となる単一の抗原(または抗原プール)を、複数の培養液、例えば、培養プレートの1個のウェルに添加することであって、各培養液(ウェル)が、固有の抗原または抗原プールを含む、上記作製することと、
固有の培養液に、T細胞活性化マーカーに結合する抗体を、各ウェルに存在する細胞全てを標識するのに十分な量で、及び、上記固有の培養液と関連する固有のオリゴヌクレオチドタグでタグ化した分子を添加することと、
任意選択的に、オリゴマータグ、例えばCITE-seqオリゴデキストラマー試薬もまた含み得る、他の表面染色抗体及び多量体を添加することと、
上記培養液をプールすることと、
T細胞活性化マーカーに結合し、固有のオリゴヌクレオチドタグでタグ化される抗体で標識したこれらのT細胞をソートすることと、
上記固有のオリゴヌクレオチドタグの上記核酸配列を含む、工程(5)でソートしたT細胞から核酸配列を測定することと、
を含む、実施形態1~3のいずれか1つに記載の方法。
複数の培養液のそれぞれ1つを、対象となる固有の抗原または抗原プールに送達することにより固有の培養液を作製すること、例えば、対象となる単一の抗原(または抗原プール)を、複数の培養液、例えば、培養プレートの1個のウェルに添加することであって、各培養液(ウェル)が、固有の抗原または抗原プールを含む、上記作製することと、
固有の培養液に、T細胞活性化マーカーに結合する抗体を、各ウェルに存在する細胞全てを標識するのに十分な量で、及び、上記固有の培養液と関連する固有のオリゴヌクレオチドタグでタグ化した分子を添加することと、
任意選択的に、オリゴマータグ、例えばCITE-seqオリゴデキストラマー試薬もまた含み得る、他の表面染色抗体及び多量体を添加することと、
上記培養液をプールすることと、
T細胞活性化マーカーに結合し、固有のオリゴヌクレオチドタグでタグ化される抗体で標識したこれらのT細胞をソートすることと、
上記固有のオリゴヌクレオチドタグの上記核酸配列を含む、工程(5)でソートしたT細胞から核酸配列を測定することと、
を含む、実施形態1~3のいずれか1つに記載の方法。
実施形態5。上記T細胞活性化マーカーがCD137/4-1BBを含む、実施形態1~4のいずれか1つに記載の方法。
実施形態6。T細胞、ならびに任意選択的に、抗原に特異的に結合するT細胞受容体(TCR)の、TCRα鎖配列、及び/またはTCRβ鎖配列を活性化可能な前記抗原の識別方法であって、上記方法が、
(I)活性化誘発マーカー(AIM)の発現に基づき、活性化T細胞を、固有の生体サンプルを含む組成物からソートすることであって、当該固有の生体サンプルが、
(a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記T細胞及びMHC、
(b)固有の抗原、
(c)例えば、上記固有の抗原を特異的に識別する固有のHTOを特異的に識別可能である、及び/または識別するために使用される固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、上記固有のHTOが、上記T細胞を上記固有のHTOで標識する分子にコンジュゲートする、上記HTO、ならびに、任意選択的に、
(d)T細胞の活性化を支持する培地
を含む、上記ソートすることと、
(II)(I)でソートした活性化T細胞でシングルセル配列決定分析を行い、活性化T細胞を固有のHTOで標識した分子にコンジュゲートした固有のHTOを識別することであって、固有のHTOを識別することが、活性化T細胞を活性化可能な抗原を識別し、任意選択的に、シングルセル配列決定分析が、以下のうちの1つ以上:
(i)活性化T細胞により発現した1つ以上の遺伝子、及び/または
(ii)活性化T細胞により発現したTCRのTCRα及び/またはβ鎖配列
もまた識別する、上記識別することと、
を含む、上記方法。
(I)活性化誘発マーカー(AIM)の発現に基づき、活性化T細胞を、固有の生体サンプルを含む組成物からソートすることであって、当該固有の生体サンプルが、
(a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記T細胞及びMHC、
(b)固有の抗原、
(c)例えば、上記固有の抗原を特異的に識別する固有のHTOを特異的に識別可能である、及び/または識別するために使用される固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、上記固有のHTOが、上記T細胞を上記固有のHTOで標識する分子にコンジュゲートする、上記HTO、ならびに、任意選択的に、
(d)T細胞の活性化を支持する培地
を含む、上記ソートすることと、
(II)(I)でソートした活性化T細胞でシングルセル配列決定分析を行い、活性化T細胞を固有のHTOで標識した分子にコンジュゲートした固有のHTOを識別することであって、固有のHTOを識別することが、活性化T細胞を活性化可能な抗原を識別し、任意選択的に、シングルセル配列決定分析が、以下のうちの1つ以上:
(i)活性化T細胞により発現した1つ以上の遺伝子、及び/または
(ii)活性化T細胞により発現したTCRのTCRα及び/またはβ鎖配列
もまた識別する、上記識別することと、
を含む、上記方法。
実施形態7。ソートする前に、以下の工程(複数可)のうちの一方または両方:
対象から単離したT細胞及び抗原提示細胞(APC)を含む細胞の集まりを、個別のサンプルに等しく分配することにより、複数の生体サンプルを作製する工程であって、各生体サンプルが任意選択的に、T細胞及び/またはAPC生存能、活性化及び/または活性を支持する媒体及びサイトカインを含む、上記工程と、
固有の抗原、及び/または、例えば、上記固有の抗原を特異的に識別する固有のHTOを特異的に識別することができる、及び/または特異的に識別するために使用される、固有のHTOを、複数の生体サンプルのそれぞれに送達することにより、複数の固有の生体サンプルを作製する工程であって、上記固有のHTOが、T細胞を上記固有のHTOで標識する分子にコンジュゲートする工程、ならびに、任意選択的に、上記複数の固有の生体サンプルを、(I)でソートした上記組成物が、複数の固有の生体サンプルを含むように組み合わせる工程と、
を含み、
上記複数の生体サンプルのそれぞれが、対象から単離されたT細胞及びAPCを含み、任意選択的に、上記T細胞及びAPCの生存能、活性、及び/または活性化を支持する培地を含む、細胞の集まりを含み、
T細胞を固有のHTOで標識する分子にコンジュゲートした固有の抗原及び/または固有のHTOの送達後、複数の生体サンプルのそれぞれが、
(a)対象から単離したT細胞及びAPCを含む細胞の集まり、
(b)固有の抗原、
(c)固有の抗原を特異的に識別し、T細胞をHTOで標識する分子にコンジュゲートした固有のHTO、ならびに、任意選択的に、
(d)T細胞及びAPCの生存能、活性、及び/または活性化を支持する培地
を含む固有の生体サンプルになる、実施形態6に記載の方法。
対象から単離したT細胞及び抗原提示細胞(APC)を含む細胞の集まりを、個別のサンプルに等しく分配することにより、複数の生体サンプルを作製する工程であって、各生体サンプルが任意選択的に、T細胞及び/またはAPC生存能、活性化及び/または活性を支持する媒体及びサイトカインを含む、上記工程と、
固有の抗原、及び/または、例えば、上記固有の抗原を特異的に識別する固有のHTOを特異的に識別することができる、及び/または特異的に識別するために使用される、固有のHTOを、複数の生体サンプルのそれぞれに送達することにより、複数の固有の生体サンプルを作製する工程であって、上記固有のHTOが、T細胞を上記固有のHTOで標識する分子にコンジュゲートする工程、ならびに、任意選択的に、上記複数の固有の生体サンプルを、(I)でソートした上記組成物が、複数の固有の生体サンプルを含むように組み合わせる工程と、
を含み、
上記複数の生体サンプルのそれぞれが、対象から単離されたT細胞及びAPCを含み、任意選択的に、上記T細胞及びAPCの生存能、活性、及び/または活性化を支持する培地を含む、細胞の集まりを含み、
T細胞を固有のHTOで標識する分子にコンジュゲートした固有の抗原及び/または固有のHTOの送達後、複数の生体サンプルのそれぞれが、
(a)対象から単離したT細胞及びAPCを含む細胞の集まり、
(b)固有の抗原、
(c)固有の抗原を特異的に識別し、T細胞をHTOで標識する分子にコンジュゲートした固有のHTO、ならびに、任意選択的に、
(d)T細胞及びAPCの生存能、活性、及び/または活性化を支持する培地
を含む固有の生体サンプルになる、実施形態6に記載の方法。
実施形態8。上記APCが、単球由来の樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、B細胞、またはこれらの組み合わせを含む、実施形態7に記載の方法。
実施形態9。ソートすることが、活性化誘発マーカー(AIM)の発現に基づく、活性化T細胞の蛍光活性化細胞ソーティングを含む、実施形態6~8のいずれか1つに記載の方法。
実施形態10。上記AIMが、CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3、TIGIT、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態9に記載の方法。
実施形態11。蛍光活性化細胞ソーティングが、上記AIMに対する蛍光標識抗体を用いる検出に基づく、実施形態9または実施形態10に記載の方法。
実施形態12。IIで分析した活性化T細胞にて、機能分析及び/または表現型分析をさらに行うことを含み、任意選択的に、上記さらなる機能分析及び/または表現型分析が、フローサイトメトリー分析、CITE-seq、多量体分析、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態6~11のいずれか1つに記載の方法。
実施形態13。上記さらなる機能分析及び/または表現型分析が、CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD62L、HLA-DR、CD137/4-1BB、CD69、CD278、CD274、CD279、CD127、CD197、IFNγ、GZMH、GNLY、CD38、CCL3、及びLAG3のうちの1つ以上のタンパク質及び/またはRNA発現レベルを測定する、実施形態12に記載の方法。
実施形態14。末梢血単核球細胞がT細胞及び表面結合MHCをもたらす、実施形態6~13のいずれか1つに記載の方法。
実施形態15。上記T細胞を上記固有のHTOで標識する上記分子が、細胞表面分子に結合する抗体を含む、実施形態6~14のいずれか1つに記載の方法。
実施形態16。上記AIMがCD137/4-1BBであるか、またはこれを含む、実施形態6~15のいずれか1つに記載の方法。
実施形態17。上記方法が、上記抗原に特異的に結合するTCRのTCRα鎖配列及び/またはTCRβ鎖配列を識別することを含み、上記TCRα鎖配列及び/またはTCRβ鎖配列がそれぞれ、TCRα鎖可変領域配列及び/またはTCRβ鎖可変領域配列である、実施形態6~16のいずれか1つに記載の方法。
実施形態18。上記方法が、上記抗原に特異的に結合するTCRのTCRα鎖配列及び/またはTCRβ鎖配列を識別することを含み、上記方法が、治療薬の作製において、上記TCRα鎖配列及び/またはTCRβ鎖配列を利用することをさらに含む、実施形態6~17のいずれか1つに記載の方法。
実施形態19。(a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、T細胞が、表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記T細胞及びMHC、
(b)抗原、
(c)抗原を特異的に識別するハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、上記HTOが、T細胞をHTOで標識する分子にコンジュゲートした、上記HTO、
ならびに、任意選択的に、
(d)T細胞の活性化を支持する培地
を含む生体サンプルを含む、組成物。
(b)抗原、
(c)抗原を特異的に識別するハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、上記HTOが、T細胞をHTOで標識する分子にコンジュゲートした、上記HTO、
ならびに、任意選択的に、
(d)T細胞の活性化を支持する培地
を含む生体サンプルを含む、組成物。
実施形態20。(a)上記MHCが抗原提示細胞(APC)の表面で発現し、任意選択的に、
上記T細胞及びAPCが自己由来であり、
上記T細胞及び上記APCがそれぞれヒトドナーから単離され、及び/または、
上記APCが、単球由来の樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、B細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、
(b)上記抗原が、
(I)
(i)細菌抗原もしくはその部分、
(ii)ウイルス性抗原もしくはその部分、
(iii)アレルゲンもしくはその部分、
(iv)腫瘍関連抗原もしくはその部分、及び
(v)これらの組み合わせ
からなる群から選択され、及び/または、
(II)
(i)アミノ酸配列、
(ii)ヌクレオチド配列、
(iii)細胞溶解物、及び
(iv)これらの組み合わせ
を含み、
(c)上記HTOコンジュゲート分子が、
(I)細胞表面分子に結合する抗体、もしくは
(II)脂質
を含み、及び/または、
(d)上記培地が、上記T細胞及び/またはAPCの生存能を支持するサイトカインを含む、
実施形態19に記載の組成物。
上記T細胞及びAPCが自己由来であり、
上記T細胞及び上記APCがそれぞれヒトドナーから単離され、及び/または、
上記APCが、単球由来の樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、B細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、
(b)上記抗原が、
(I)
(i)細菌抗原もしくはその部分、
(ii)ウイルス性抗原もしくはその部分、
(iii)アレルゲンもしくはその部分、
(iv)腫瘍関連抗原もしくはその部分、及び
(v)これらの組み合わせ
からなる群から選択され、及び/または、
(II)
(i)アミノ酸配列、
(ii)ヌクレオチド配列、
(iii)細胞溶解物、及び
(iv)これらの組み合わせ
を含み、
(c)上記HTOコンジュゲート分子が、
(I)細胞表面分子に結合する抗体、もしくは
(II)脂質
を含み、及び/または、
(d)上記培地が、上記T細胞及び/またはAPCの生存能を支持するサイトカインを含む、
実施形態19に記載の組成物。
実施形態21。上記抗体が、β2マイクログロブリン、CD298、CD2、CD3、CD4、CD8、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞表面マーカーに結合するか、または、
上記脂質が細胞膜に組み込まれる、実施形態20に記載の組成物。
上記脂質が細胞膜に組み込まれる、実施形態20に記載の組成物。
実施形態22。上記T細胞及び/または上記APCの生存能を支持する上記サイトカインが、IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、IL-4、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態20または実施形態21に記載の組成物。
実施形態23。第2の生体サンプルをさらに含み、上記第2の生体サンプルが、
(a)第2のT細胞及び第2の表面結合MHCであって、第2のT細胞が、第2の表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能である、上記第2のT細胞及び第2の表面結合MHC、
(b)第2の抗原、
(c)第2の抗原を特異的に識別する第2のHTOであって、上記HTOが、上記第2のT細胞を上記第2のHTOで標識する第2の分子にコンジュゲートする、上記第2のHTO、
ならびに、任意選択的に、
(d)上記第2のT細胞の活性化を支持する培地
を含み、
(i)上記T細胞及び第2のT細胞が同一の対象から単離され、
(ii)上記抗原及び上記第2の抗原が同一ではなく、
(iii)上記T細胞を上記HTOで標識する上記分子、及び、上記第2のT細胞を上記第2のHTOで標識する上記第2の分子が同一であり、上記HTO及び上記第2のHTOが同一ではない、実施形態20~22のいずれか1つに記載の組成物。
(a)第2のT細胞及び第2の表面結合MHCであって、第2のT細胞が、第2の表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能である、上記第2のT細胞及び第2の表面結合MHC、
(b)第2の抗原、
(c)第2の抗原を特異的に識別する第2のHTOであって、上記HTOが、上記第2のT細胞を上記第2のHTOで標識する第2の分子にコンジュゲートする、上記第2のHTO、
ならびに、任意選択的に、
(d)上記第2のT細胞の活性化を支持する培地
を含み、
(i)上記T細胞及び第2のT細胞が同一の対象から単離され、
(ii)上記抗原及び上記第2の抗原が同一ではなく、
(iii)上記T細胞を上記HTOで標識する上記分子、及び、上記第2のT細胞を上記第2のHTOで標識する上記第2の分子が同一であり、上記HTO及び上記第2のHTOが同一ではない、実施形態20~22のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態24。上記組成物が、活性化誘発マーカー(AIM)の発現に基づき、活性化T細胞のソートを可能にする剤をさらに含む、実施形態19~23のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態25。AIMの発現に基づき活性化T細胞のソートを可能にする上記剤が、上記AIMに特異的に結合する蛍光標識抗体である、実施形態24に記載の組成物。
実施形態26。上記AIMがCD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3、及び/またはTIGITからなる群から選択される、実施形態24または実施形態25に記載の組成物。
実施形態27。上記組成物が、組成物のフローサイトメトリー分析またはCITE-seqに有用な抗体及び/またはMHC多量体を含む、実施形態19~26のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態28。複数の固有の抗原、及び、
複数の固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、それぞれが、上記複数の固有の抗原のうちの1つのみに特異的に結合する、上記HTO
を含むキット。
複数の固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、それぞれが、上記複数の固有の抗原のうちの1つのみに特異的に結合する、上記HTO
を含むキット。
実施形態29。上記キットが、活性化誘発マーカー(AIM)の発現に基づき、活性化T細胞のソートを可能にする剤をさらに含み、任意選択的に、AIMの発現に基づき活性化T細胞のソートを可能にする上記剤が、上記AIMに特異的に結合する蛍光標識抗体である、実施形態28に記載のキット。
実施形態30。上記複数の固有のHTOのそれぞれが、同一の分子にコンジュゲートし、上記キットが、固有のHTOがコンジュゲートした複数の分子を含む、実施形態28または29に記載のキット。
実施形態31。上記複数の固有の抗原のそれぞれが、単一のタンパク質からの、固有かつ重なり合うペプチド配列を含む、実施形態28~30のいずれか1つに記載のキット。
実施形態32。上記単一のタンパク質が、病原性抗原、腫瘍関連抗原、または移植抗原からなる群から選択される、実施形態31に記載のキット。
実施形態33。患者の、ワクチンに対する、T細胞が媒介する免疫応答を分析するための、実施形態1~18のいずれか1つに記載の方法、実施形態19~27のいずれか1つに記載の組成物、または、実施形態28~32のいずれか1つに記載のキットの使用。
実施形態34。患者の、免疫療法に対する、T細胞が媒介する免疫応答を分析するための、実施形態1~18のいずれか1つに記載の方法、実施形態19~27のいずれか1つに記載の組成物、または、実施形態28~32のいずれか1つに記載のキットの使用。
実施形態35。患者における、当該患者の免疫療法の間における、T細胞が媒介する免疫応答を分析するための、実施形態1~18のいずれか1つに記載の方法、実施形態19~27のいずれか1つに記載の組成物、または、実施形態28~32のいずれか1つに記載のキットの使用。
実施形態36。自己抗原に対する患者のT細胞応答を分析するための、実施形態1~18のいずれか1つに記載の方法、実施形態19~27のいずれか1つに記載の組成物、または、実施形態28~32のいずれか1つに記載のキットの使用。
実施形態37。移植抗原に対する患者のT細胞応答を分析するための、実施形態1~18のいずれか1つに記載の方法、実施形態19~27のいずれか1つに記載の組成物、または、実施形態28~32のいずれか1つに記載のキットの使用。
実施形態38。活性化T細胞の1つ以上のTCR可変領域配列を識別するための、実施形態1~18のいず れか1つに記載の方法、実施形態19~27のいずれか1つに記載の組成物、または、実施形態28~32のいずれか1つに記載のキットの使用。
実施形態39。上記1つ以上のTCR可変領域配列が、TCRα鎖のCDR3配列、及び/または、TCRβ鎖のCDR3配列を含む、実施形態38に記載の使用。
実施形態40。ヒト治療薬の作製における、実施形態38または39で識別した1つ以上のTCR可変領域配列の使用。
実施形態41。上記ヒト治療薬が、実施形態1~18のいずれか1つに記載の方法、実施形態19~27のいずれか1つに記載の組成物、または、実施形態28~32のいずれか1つに記載のキットを使用して識別した1つ以上のTCR可変領域配列を含むT細胞を含む、実施形態40に記載の使用。
本発明を、多数の実施形態を参照して具体的に図示及び説明してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書にて開示した様々な実施形態に対して、形態及び詳細の変化を加えることが可能であり、本明細書にて開示した様々な実施形態は、特許請求の範囲に限定を加えるものとは意図されないことが、当業者によって理解されよう。
本明細書に記載する方法の非限定的実施形態を、図1に示す。本明細書の実施例は、細分化技術を、機能アッセイ、例えば活性化誘発マーカー(AIM)の細胞濃縮、及びシングルセルトランスクリプトーム配列決定と組み合わせて使用し、同族T細胞及び抗原反応性、例えば、T細胞エピトープ反応性をスクリーニングすることが可能であり、このような方法が、初代ヒト細胞において特に有用であるというデータを提供する。
方法のより具体的かつ例示的な適用を説明する前に、一般的な方法をここで示す。
一般的な材料及び方法
ヒト末梢血単核細胞(PBMC):凍結保存したPBMCを、購入した(Precision for Medicine Frederick,Maryland)か、または、メーカーの指示に従い、Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare Life Sciences,45-001,749)試薬を用いる密度勾配遠心分離により単離したヒト対象由来の新鮮な血液から単離し、冷凍培地(90%ヒト血清(Millipore Sigma)、10%組織培養等級DMSO(Millipore Sigma,2438))で、後の分析のために凍結保存した。
ヒト末梢血単核細胞(PBMC):凍結保存したPBMCを、購入した(Precision for Medicine Frederick,Maryland)か、または、メーカーの指示に従い、Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare Life Sciences,45-001,749)試薬を用いる密度勾配遠心分離により単離したヒト対象由来の新鮮な血液から単離し、冷凍培地(90%ヒト血清(Millipore Sigma)、10%組織培養等級DMSO(Millipore Sigma,2438))で、後の分析のために凍結保存した。
ペプチド:ペプチドを、Genscript(Piscataway,NJ)にてカスタム合成した。凍結乾燥したペプチドを、原液に対して10~50mg/mLでDMSOに再構築させた後、使用のために、適切なアッセイ培地に10μg/mLで希釈した。メーカーの指示に従い、CEF Control Peptide Pool(Anaspec,AS-61036-003)を10ug/mLで使用し、Cell Stimulation Cocktail(ThermoFisher,00-4970-93)を使用した。
初代細胞培養物:凍結保存したPBMCを解凍し、5%ヒト血清AB(Millipore Sigma,H3667)及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(ThermoFisher Scientific,15140163)を含むCellGenix GMP DC無血清培地(CellGenix,20801-0500)でインキュベートした。培養液は、樹状細胞及びT細胞支持サイトカイン:T細胞培地(CellGenix樹状細胞培地、カタログ番号20801-0500 + 5%ヒト血清AB(Sigma、カタログ番号H3667))+1%ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン(ThermoFisher、カタログ番号10378-016)、5ng/mLのT細胞支持サイトカインIL-7及びIL-15(それぞれ、CellGenix、カタログ番号1410-050及び1413-050)、ならびに、10U/mLのIL-2(Peprotech、カタログ番号200-0)を含む補充液であった。
オリゴタグ細分化抗体の生成:全てのヒトT細胞において、細胞表面標的に対して非常に特異的なモノクローナル抗体(CD2,RPA-2.10;Biolegend、カタログ番号300202)を、公開されている方法を用いて、ポリAテールを含む固有の15塩基オリゴヌクレオチド配列の組み合わせに、カスタムでコンジュゲートした。上述のStoeckius 2017,bioRxivを参照されたい。
直接エクスビボIFNγ/グランザイムB ELISPOT:二重ヒトIFNγ/グランザイムB FluoroSpotアッセイキットをImmunoSpot(Cleveland,OH)から購入し、メーカーの手順に従い使用した。簡潔に述べると、PBMCを解凍して、ウェルあたり200,000個の細胞で、FluoroSpotプレートで200uLにて、ペプチド刺激をしながら48時間インキュベートした。ELISPOTの反応性を、メーカーの自動ソフトウェアを用いて、ImmunoSpot Analyzerで読み出した。
フローサイトメトリーによるT細胞の抗体及び表現型特性決定:蛍光標識抗体を商業ベンダーから購入した。表面タンパク質のフローサイトメトリー表現型特性決定を行うために、細胞を回収し、洗浄し、対象となる抗体を含有するフローサイトメトリーBD BSA染色緩衝液(BD Biosciences,#554657)に再懸濁した。細胞を30分間4℃でインキュベートし、その後2回洗浄してから、A3 Symphonyサイトメーター(BD Biosciences)でのフローサイトメトリー収集を行った。フローサイトメトリーデータを、FlowJo解析ソフトウェア(FlowJo,Ashland,OR)を用いて分析した。ゲートを、蛍光-1(FMO)対照に基づき設定した。
抗原特異的T細胞反応性アッセイ:ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll-Paque Plus勾配単離により単離した。PBMCを、T細胞培地(CellGenixGMP DC培地、カタログ番号20801-0500 + 5%ヒト血清AB(Sigma、カタログ番号H3667))+1%ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン(ThermoFisher、カタログ番号10378-016)、1000U/mLで因子GM-CSFを、及び、500U/mLで因子IL-4を支持する樹状細胞(それぞれ、CellGenix,#1412-050、及びCellGenix,#1403-050)、5ng/mLのT細胞支持サイトカインIL-7及びIL-15(それぞれ、CellGenix、#1410-050及び1413-050)、ならびに、10U/mLのIL-2(Peprotech、カタログ番号200-0)内の培養皿に播種、例えばアリコートした。個別の抗原、例えば、対象となるペプチドを、10ug/mL(Genscript)でアッセイウェルに添加し、固有の生体サンプルを形成した。
一晩培養液を、ペプチド刺激の24時間後に回収し、ソート及びシングルセル配列決定のために調製した。10日間の予増殖培養のために、最初のペプチド添加の後1週間、細胞に新鮮な培地及びサイトカインを1日おきに供給した。次に、対象となる個別のペプチドを、一晩の再刺激のためにT細胞増殖培養液に添加し、活性化誘発マーカー、例えばCD137/4-1BBの発現を情報制御し、抗原特異的AIMに基づく機能的T細胞ソーティングを可能にした。ペプチド再刺激の後、細胞を、フローサイトメトリー特性決定のために調製するか、またはさらに処理して、細分化、プール、及びシングルセル配列決定を可能にした。
機能的T細胞アッセイ性能後の細胞細分化:機能的刺激の後、個別のアッセイウェルからの細胞を96ウェルアッセイブロックに収集し、洗浄して、対象となる細分化試薬を含有する、フローサイトメトリーBD BSA染色緩衝液(BD Biosciences,#554657)に再懸濁した。細胞を、それぞれ1μg/106個の細胞で、1種類または2種類のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)抗体のいずれかで染色した。細胞を30分間4℃でインキュベートし、2回洗浄した後プールした。オリゴヌクレオチドタグデキストラマーを分析に含めたら、サンプルをデキストラマーで染色し、その後、以下のオリゴタグデキストラマー染色手順に従い、CITE-seq及びフローサイトメトリー抗体染色に進んだ。
CITE-seq抗体染色及び蛍光抗体染色:細分化染色手順の後、プールして細分化したサンプルを、CITE-seq抗体、加えて、蛍光タグフローサイトメトリー抗体の両方を含有するBD BSA染色緩衝液に、それぞれの最適濃度で再懸濁した。細胞を30分間4℃でインキュベートし、2回洗浄した後、シングルセル配列決定のためにソートした。
オリゴタグデキストラマー染色及びFACSソーティング:凍結保存した健常なドナーPBMCを、37℃の水浴にて簡潔に解凍した。CD8+ T細胞を、磁気ビーズ(Miltenyi Biotec)を用いて濃縮した。細胞を遠心分離により洗浄し、ベンゾナーゼ(Millipore,70664)及び50nMのダサチニブ(Axon Medchem,1392)を含有するPBS(Gibco,14190-250)を45分間37℃で処理した。細胞を96ウェルアッセイブロック(Corning,3960)に移し、遠心分離にかけ、上清を吸引した。適切なカスタムImmudex dCODE-PEデキストラマープール(Copenhagen,Denmark)を、暗室で30分間、室温で1uL/100uLにて添加した。次に、蛍光色素標識表面マーカーを添加し、細胞をさらに30分間4℃でインキュベートした。洗浄後、細胞を直ちにソートした。フローサイトメトリー抗体染色及び洗浄は、染色緩衝液(BD,554657)で行った。FACS用表面マーカーは、以下のマーカー及び蛍石を含んだ:ソーターにて添加した生/死-DAPI(Sigma,10236276001)、CD3 BUV737(BD Biosciences,612750)、CD4 BV510(BD Biosciences,563919)、CD8 BUV805(BD Biosciences,612889)、CCR7 AF647(BioLegend 353218)、及びCD45RO BV605(BioLegend 304238)。
CD137/4-1BB+ T細胞 FACSソーティング:再刺激の24時間後に、細胞を収集して、以下の表面抗体:CD3(BD Biosciences,カタログ番号612750)及びCD137/4-1BB(Biolegend,カタログ番号309828)を用いるAstriosセルソーター(Beckman Coulter)を使用して、FACS用の蛍光標識抗体で染色した。前散布図、横散布図、及び蛍光チャネルに対するゲートを、デブリ及びダブレットを排除しながら、生細胞を選択するように設定した。100μmノズルを使用して、さらなる処理のためにシングルCD3+CD137/4-1BB+細胞をソートした。
クロムシングルセル分配及びライブラリー調製:ソートした細胞を次に、Chromium Single Cell 5’ Chip(10x Genomics,1000287)にロードし、クロムコントローラーを通して処理し、GEM(エマルション中のゲルビーズ)を生成した。メーカーの手順に従い、Chromium Single Cell 5’ Chip(10x Genomics,1000287)を用いてRNA-Seqライブラリーを調製した。
バイオインフォマティクス法
トランスクリプトーム、TCR(VDJ)、細分化、CITE-seq、及びデキストラマーライブラリーを配列決定し、そのままの配列決定データを、10X CellRanger分析パイプラインを用いて処理した。CellRanger分析により、フィーチャー-バーコードUMI計数マトリックス、及びTCR(VDJ)アミノ酸配列が生成した。フィーチャーは、遺伝子発現、抗体の細分化、CITE-seq抗体、及びデキストラマー捕捉を含む。フィーチャー-バーコードマトリックスを入力として用いて、RパッケージSeurat v3.1.4(Butler et al 2018)を下流分析に用いた。遺伝子UMI計数の標準的なlog正規化を行い、続いて、1000個の最も変更可能な遺伝子を識別し、データのスケーリングと有心化を行った。次に、主成分分析(PCA)を行い、50個のPCを演算し、ソートした。次に、Seuratのグラフベースのクラスター化アプローチを用いて、クラスター化を行った。k近傍(KNN)グラフを、20次元PCA空間でのEuclidean距離に基づき演算し、続けて、様々な解像度でクラスター化した。各解像度において、トップマーカー遺伝子を識別して使用し、異なるクラスターにまたがる遺伝子発現のヒートマップを作成した。目視検査の際に、最適なクラスター化解像度を測定した。トップ遺伝子マーカーとしてのミトコンドリア遺伝子を含む、死細胞クラスターに属する細胞を全て、下流分析から取り除いた。検出した遺伝子の数が500以下であり、ミトコンドリア遺伝子発現の画分が0.25以上である細胞を、取り除いた。アッセイの主たる目標の1つは、TCR-抗原相互作用により駆動される、様々な抗原に対するT細胞の反応性を識別することであるため、一本TCR鎖、または非生産鎖、または、2つ以上のαもしくはβ鎖を含むあらゆる細胞もまた、取り除いた。検出された遺伝子が多数である、及び/または、検出されたUMIが多数である、あらゆるアウトライナー細胞もまた、取り除いた。残りの細胞に関しては、他のフィーチャー(CITE-seq、細分化、デキストラマー)からのデータを次に処理した。これらのフィーチャーに対応する計数マトリックスからのデータは、有心対数比変換を用いて正規化した後、基準化した。細分化データを用いて、MultiSeqDemuxアルゴリズムMcGinnis et al.(2019)Nature Methods 16:619-26;デフォルトパラメーター)を用いて細胞を脱多重化した。細分化スキームに従い、ハッシュタグに割り当てられなかったあらゆる細胞を、多重化の後で取り除いた。各細胞に関して、細胞の、固有の機能的クローン型を定義する対形成したTCRアミノ酸配列を入手した。脱多重化の後、ハッシュタグ化アッセイウェルと関連する全ての細胞における、各T細胞クローンのクローン型サイズを計算した。>20のサイズを有するあらゆるクローン型は、ハッシュタグ化ウェルにて、特異的抗原に対する潜在的な反応性を有するとみなされた。
トランスクリプトーム、TCR(VDJ)、細分化、CITE-seq、及びデキストラマーライブラリーを配列決定し、そのままの配列決定データを、10X CellRanger分析パイプラインを用いて処理した。CellRanger分析により、フィーチャー-バーコードUMI計数マトリックス、及びTCR(VDJ)アミノ酸配列が生成した。フィーチャーは、遺伝子発現、抗体の細分化、CITE-seq抗体、及びデキストラマー捕捉を含む。フィーチャー-バーコードマトリックスを入力として用いて、RパッケージSeurat v3.1.4(Butler et al 2018)を下流分析に用いた。遺伝子UMI計数の標準的なlog正規化を行い、続いて、1000個の最も変更可能な遺伝子を識別し、データのスケーリングと有心化を行った。次に、主成分分析(PCA)を行い、50個のPCを演算し、ソートした。次に、Seuratのグラフベースのクラスター化アプローチを用いて、クラスター化を行った。k近傍(KNN)グラフを、20次元PCA空間でのEuclidean距離に基づき演算し、続けて、様々な解像度でクラスター化した。各解像度において、トップマーカー遺伝子を識別して使用し、異なるクラスターにまたがる遺伝子発現のヒートマップを作成した。目視検査の際に、最適なクラスター化解像度を測定した。トップ遺伝子マーカーとしてのミトコンドリア遺伝子を含む、死細胞クラスターに属する細胞を全て、下流分析から取り除いた。検出した遺伝子の数が500以下であり、ミトコンドリア遺伝子発現の画分が0.25以上である細胞を、取り除いた。アッセイの主たる目標の1つは、TCR-抗原相互作用により駆動される、様々な抗原に対するT細胞の反応性を識別することであるため、一本TCR鎖、または非生産鎖、または、2つ以上のαもしくはβ鎖を含むあらゆる細胞もまた、取り除いた。検出された遺伝子が多数である、及び/または、検出されたUMIが多数である、あらゆるアウトライナー細胞もまた、取り除いた。残りの細胞に関しては、他のフィーチャー(CITE-seq、細分化、デキストラマー)からのデータを次に処理した。これらのフィーチャーに対応する計数マトリックスからのデータは、有心対数比変換を用いて正規化した後、基準化した。細分化データを用いて、MultiSeqDemuxアルゴリズムMcGinnis et al.(2019)Nature Methods 16:619-26;デフォルトパラメーター)を用いて細胞を脱多重化した。細分化スキームに従い、ハッシュタグに割り当てられなかったあらゆる細胞を、多重化の後で取り除いた。各細胞に関して、細胞の、固有の機能的クローン型を定義する対形成したTCRアミノ酸配列を入手した。脱多重化の後、ハッシュタグ化アッセイウェルと関連する全ての細胞における、各T細胞クローンのクローン型サイズを計算した。>20のサイズを有するあらゆるクローン型は、ハッシュタグ化ウェルにて、特異的抗原に対する潜在的な反応性を有するとみなされた。
実施例1:多量体染色に相当する抗原特異的T細胞集団を機能的に識別可能な、活性化誘発マーカー(AIM)としてのCD137/4-1BBの識別
材料及び方法
一般的に、本実施例に記載する方法では、健常なHLA-A*0201+ヒトドナー由来のT細胞を、本明細書に記載の方法に従い、同族合成ペプチドの存在下で予増殖させ、次に、蛍光標識抗体及びデキストラマー多量体で、フローサイトメトリー分析のために染色し、抗原特異的T細胞集団を識別した。
材料及び方法
一般的に、本実施例に記載する方法では、健常なHLA-A*0201+ヒトドナー由来のT細胞を、本明細書に記載の方法に従い、同族合成ペプチドの存在下で予増殖させ、次に、蛍光標識抗体及びデキストラマー多量体で、フローサイトメトリー分析のために染色し、抗原特異的T細胞集団を識別した。
結果
図2Aにおいて、樹状細胞(DC)は、健常なヒトドナー由来の全末梢血単核球細胞(PBMC)から誘導した。簡潔に述べると、CD14+単球を、抗CD14磁気ビーズ(Miltenyi)を用いる磁気選択によりPBMCから単離した。CD14+細胞を、IL-4及びGM-CSFを補充したCellGenix CellGro DC培地で5日間培養した。5日目に、DCを、HLA-A*0201に対して特異的な、CMV pp65(NLVPMVATV;配列番号16)、またはMART1(ELAGIGILTV;配列番号15)合成短鎖ペプチドで、2時間パルス処理した。次に、IFNαを細胞に添加し、活性化した。7日目に、自己由来のT細胞を培養液に添加し、培地を、5%ヒト血清+支持サイトカイン(IL7、IL-15、IL-2)を補充したCellGenix CellGro培地で交換した。これらの自己由来のDC及びT細胞を10日間培養し、関連する、以前から存在する抗原特異的T細胞集団を増殖させた。培養液での、10日間の予増殖の後、T細胞を、関連するペプチドまたはDMSO陰性対照で24時間再刺激した。対象となる細胞表面標的を、フローサイトメトリー特性決定(A3 Symphony分析器,BD)により、蛍光標識モノクローナル抗体及びデキストラマー多量体を用いて評価した。
図2Aにおいて、樹状細胞(DC)は、健常なヒトドナー由来の全末梢血単核球細胞(PBMC)から誘導した。簡潔に述べると、CD14+単球を、抗CD14磁気ビーズ(Miltenyi)を用いる磁気選択によりPBMCから単離した。CD14+細胞を、IL-4及びGM-CSFを補充したCellGenix CellGro DC培地で5日間培養した。5日目に、DCを、HLA-A*0201に対して特異的な、CMV pp65(NLVPMVATV;配列番号16)、またはMART1(ELAGIGILTV;配列番号15)合成短鎖ペプチドで、2時間パルス処理した。次に、IFNαを細胞に添加し、活性化した。7日目に、自己由来のT細胞を培養液に添加し、培地を、5%ヒト血清+支持サイトカイン(IL7、IL-15、IL-2)を補充したCellGenix CellGro培地で交換した。これらの自己由来のDC及びT細胞を10日間培養し、関連する、以前から存在する抗原特異的T細胞集団を増殖させた。培養液での、10日間の予増殖の後、T細胞を、関連するペプチドまたはDMSO陰性対照で24時間再刺激した。対象となる細胞表面標的を、フローサイトメトリー特性決定(A3 Symphony分析器,BD)により、蛍光標識モノクローナル抗体及びデキストラマー多量体を用いて評価した。
培養液由来のCD137/4-1BB+ CD8+ T細胞の画分は、刺激前は低い(x軸、左パネル)が、多量体は、対象となるCD8+ T細胞集団をロバストに染色する:25.5%CMV pp65 CD8+ T細胞、7.79% MART1+ T細胞(x軸、中央パネル)ことを、図2Aのフローサイトメトリードットプロットは示す。言い換えれば、この特定の実施例で用いた細胞培養条件は、以前から存在するメモリーT細胞を増殖させたが、新規のT細胞増殖は誘発しなかった。しかし、同族ペプチドによる、24時間の再刺激の後、CD137/4-1BB発現はCD8+ T細胞で上方制御され、CD137/4-1BB+集団(x軸)の総合サイズは、多量体+集団に類似する(右パネル)。
図2Bでは、本実施例に記載するのと同一の細胞培養液及び染色法を用いて、4個のHLA-A+0201+健常ドナー(HD1、HD2、HD3、及びHD27)から単離した細胞を、DMSOまたはCMV pp65合成ペプチドの存在下で10日間培養した。陰性対照多量体に対する、10日間の増殖の後での、CMVpp65多量体+ CD8+ T細胞の画分を、フローサイトメトリーにより評価した(図2B、上パネル)。DMSO対照に対する、CMV pp65合成ペプチドによる24時間の再刺激の後での、CD8+ T細胞でのCD137/4-1BBの発現もまた、フローサイトメトリーにより評価した(図2B、下パネル)。CMVに対して血清陽性である、4名のドナーのうちの3名は、測定可能なCMV pp65+ CD8+ T細胞(HC1、HD2、HD27)を有したが、CMV血清陰性のドナー(HD3)は、検出可能なCMV pp65+ T細胞を有しなかった(図2B)。一般に、多量体+ CD8+及びCD137/4-1BB+ CD8+ T細胞の集団サイズは一致する(図2B)。
図3A~3Bでは、健常なHLA-A*0201+ヒトドナー(HD3及びHD27)由来の、全末梢血単核球細胞(PBMC)を、支持サイトカイン(GM-CSF、IL-4、IL7、IL-15、IL-2)、及び、DMSOまたはMART1(ELAGIGILTV;配列番号15)合成短鎖ペプチドを含む培地で10日間培養し、それぞれ、ベースライン集団(DMSO)を提供するか、または、関連する、以前から存在するMART1特異的T細胞を増殖させる。培養液中での、10日間の予増殖の後、T細胞を、DMSO陰性対照またはMART1ペプチドで24時間再刺激した。健常なドナー27(HD27)由来の、MART1多量体+ CD8+ T細胞、及びCD137/4-1BB CD8+ T細胞を、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)でソートし、5’ RNA及びTCRシングルセル配列決定ライブラリー調製のために、10XGenomicsシングルセル分配器に封入し、続いて、ハイスループット次世代配列決定を行った。完全な対形成したα及びβ TCR情報を生み出した細胞のみを評価した。多量体+及びCD137/4-1BB+サンプルにまたがる重なり合いを評価した。
再刺激の前に、両方のドナーは、検出可能なMART1+ CD8+ T細胞を有した(図3A、上パネル)。同族ペプチドによる24時間の再刺激の後、両方のドナー(HD3及びHD27)は、細胞表面でCD137/4-1BBを上方制御した(図3A、下パネル)。しかし、あるドナー(HD27)は、多量体+ CD8+ T細胞よりもはるかに多いCD137/4-1BB+ T細胞を有した(図3A)。この不一致を試験するために、多量体及びCD137/4-1BB染色により識別した機能的T細胞クローンを、多量体+及びCD137/4-1BB+ サンプルにまたがる重なり合いを評価することにより、さらに評価した。多量体+と、CD137/4-1BB+ CD8+ T細胞との間で共有されるTCR配列には、著しい重なり合いがあった(図3B)。概して、CD137/4-1BB+画分は、MART1多量体+集団よりも多くの、クローン集団を含有した。最もクローン増殖したMART1多量体+ TCRは、CD137/4-1BB+ CD8+ T細胞で検出され、多くの、より量が少ないTCRもまた、両方の濃縮集団にまたがり検出可能であった。しかし、CD137/4-1BB+集団は、多量体+集団で検出されなかったTCRを捕捉した。加えて、多くの、MART1多量体+集団由来の、より少量のTCR配列は、CD137/4-1BB+集団でより大きなクローンサイズとして存在した。
図2A~B、及び3A~Bに示すデータは、活性化誘発マーカーCD137/4-1BBが、抗原特異的活性化の後でヒトT細胞にて上方制御され、本明細書に記載の方法に従うと、培養した、多量体+とCD137/4-1BB+ CD8+ T細胞との間の、シングルセル対形成したα/β鎖T細胞受容体(TCR)配列の間で、著しい重なり合いが存在することを示す。そのため、CD137/4-1BBは、例えば、抗原特異的T細胞用の機能的濃縮活性化誘発マーカー(AIM)として、機能アッセイで使用することができる。加えて、機能的マーカーとしてのCD137/4-1BBの使用は、従来の多量体染色と同様に効率的であり、これに類似する機能アッセイ結果をもたらす。
実施例2:ハッシュタグオリゴヌクレオチド、及び、活性化T細胞のCD137/4-1BB濃縮を用いる、初代ヒト細胞における同族T細胞及びエピトープ反応性の特性決定
実施可能な方法としての、細分化、AIMソーティング、及び/またはシングルセル配列決定分析をさらに検証して、同族抗原及びTCR反応性を評価し特性決定するために、PBMC及び固有のウイルスペプチドを含む固有の生体サンプルを、ハッシュタグオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗CD2抗体で細分化し、プールした。CD137/4-1BB染色により機能的活性化を識別し、機能アッセイにおけるCD137/4-1BBの使用を、ELISPOT/及びデキストラマー染色の、従来の機能アッセイと比較した。
実施可能な方法としての、細分化、AIMソーティング、及び/またはシングルセル配列決定分析をさらに検証して、同族抗原及びTCR反応性を評価し特性決定するために、PBMC及び固有のウイルスペプチドを含む固有の生体サンプルを、ハッシュタグオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗CD2抗体で細分化し、プールした。CD137/4-1BB染色により機能的活性化を識別し、機能アッセイにおけるCD137/4-1BBの使用を、ELISPOT/及びデキストラマー染色の、従来の機能アッセイと比較した。
材料及び方法
ELISPOT:CMV、EBV、及びインフルエンザに対して既知の血清陽性を有する、健常なHLA-A*0201+ヒトドナー由来のPBMCを、DMSO、または、個別のHLA-A*0201+制限ウイルスペプチド刺激(EBV YVL-9、CMV pp65、EBV LMP2A、EBV BMLF1、インフルエンザA)により、ウェルあたり2×105個の細胞の濃度で、Dual Human IFNγ/GranzymeB FluoroSpotアッセイプレート(ImmunoSpot,Cleveland,OH)に、48時間プレーティングした。インキュベーションの後、ELISPOT反応性が発生し、メーカーの指示及び自動ソフトウェアを用いて、ImmunoSpot分析器で読み取った。
ELISPOT:CMV、EBV、及びインフルエンザに対して既知の血清陽性を有する、健常なHLA-A*0201+ヒトドナー由来のPBMCを、DMSO、または、個別のHLA-A*0201+制限ウイルスペプチド刺激(EBV YVL-9、CMV pp65、EBV LMP2A、EBV BMLF1、インフルエンザA)により、ウェルあたり2×105個の細胞の濃度で、Dual Human IFNγ/GranzymeB FluoroSpotアッセイプレート(ImmunoSpot,Cleveland,OH)に、48時間プレーティングした。インキュベーションの後、ELISPOT反応性が発生し、メーカーの指示及び自動ソフトウェアを用いて、ImmunoSpot分析器で読み取った。
細分化及びAIM濃縮のためのPBMC培養:健常なHLA-A*0201+ヒトドナー由来の全末梢血単核球細胞(PBMC)を、培地、支持サイトカイン(GM-CSF、IL-4、IL7、IL-15、IL-2)、及び、個別のHLA-A*0201+制限ウイルスペプチド(EBV YVL-9、CMV pp65、EBV LMP2A、EBV BMLF1、インフルエンザA)で10日間培養し、関連する、以前から存在する抗原特異的T細胞を増殖させた。培養液での、10日間の予増殖の後、T細胞を、関連するペプチドまたはDMSO陰性対照で24時間再刺激した。対象となる細胞表面標的を、フローサイトメトリー特性決定(A3 Symphony分析器,BD)により、蛍光標識モノクローナル抗体を用いて評価した。ウイルスペプチド刺激にまたがる、CD137/4-1BB+ CD8+ T細胞の相対画分を、フローサイトメトリーにより評価した(ゲートを上回る全CD8+ T細胞の割合として提供した、CD8+ CD137/4-1BB+ T細胞画分)。
細分化。AIM濃縮、及びシングルセル配列決定。固有のハッシュタグオリゴヌクレオチドで標識したモノクローナルヒト抗CD2抗体を、本実験で記載するPBMC生体サンプルの各アッセイウェルに添加し、同一の細胞が受けた刺激で、所与のウェルからのT細胞を固有にバーコード化した。次に、全アッセイウェルサンプルをプールし、FACSソーティング用の蛍光タグ表面抗体、及び、scSEQフェノタイピング用のCITE-seq抗体で染色した。CD137/4-1BB+ CD8+ T細胞をソートし、脱多重化した、例えば、シングルセル配列決定(10X Genomics 5’RNA及びTCR)により分析した。発現は、全発現により各細胞の遺伝子発現を正規化するLogNormalize法を用いて正規化する。数学的には、正規化した発現は、log1p(UMI.Count*scaling.factor/(全UMI計数))に等しく、式中、scaling.factor=10,000であり、log1pはlogである。
オリゴタグデキストラマー活性化及び染色。CD8+ T細胞を、Miltenyi CD8+ T細胞陰性濃縮(Miltenyi)を用いて濃縮した。次に、細胞をベンゾナーゼ(Millipore)及びダサチニブ(Axon)で45分間インキュベートし、その後、30分間室温で、オリゴタグデキストラマープールで染色した。次に、細胞を、蛍光標識CD3(BD Biosciences,カタログ番号612750)、CD4(BD Biosciences,カタログ番号563919)、CD8(BD Biosciences,カタログ番号612889)、CCR7(Biolegend,カタログ番号353218)、ならびに、CD45RO(Biolegend,カタログ番号304238)及びCITE-seq抗体で、さらに30分間、氷上で染色した。Astriosセルソーター(Beckman Coulter)を利用して、前散布図、横散布図、及び蛍光チャネルにおける蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)ゲーティングを、デブリ及びダブレットを排除しながら、生細胞を選択するように設定した。さらなる処理のために、100μmのノズルを用いて、単一のCD3+ CD8+ デキストラマー+をソートした。
RNA配列決定クラスター化。RNA転写産物発現を、AIM濃縮からソートしたCD137/4-1BB+ T細胞で評価した。k近傍(KNN)グラフを用いるSeuratのグラフベースのクラスター化アプローチを用いて、クラスター化を行い、20次元PCA空間でのEuclidean距離に基づき演算し、続けて、様々な解像度でクラスター化した。
結果
図4A及び4Bに示すように、生体サンプル内の、抗原特異的細胞の割合は、細分化及びAIM濃縮により識別され(図4B)、これは、従来のELISPOT機能アッセイ(図4A)により識別した割合と相関する。したがって、本明細書に記載する予増殖及び再刺激手順は、抗原特異的T細胞集団の相対機能を維持するようである。
図4A及び4Bに示すように、生体サンプル内の、抗原特異的細胞の割合は、細分化及びAIM濃縮により識別され(図4B)、これは、従来のELISPOT機能アッセイ(図4A)により識別した割合と相関する。したがって、本明細書に記載する予増殖及び再刺激手順は、抗原特異的T細胞集団の相対機能を維持するようである。
本明細書で提供する方法論の確認を図6に示す。本明細書で開示される方法、図5に示す非限定的な実施形態により濃縮及び分析した、抗原特異的細胞のシングルセル配列分析は、さらなる確認をもたらす。図6A~Cに示すように、シングルセル配列分析は、大部分の細胞を個別のHTOに割り当てた(80%)が、約8%は「ダブレット」に分類され、「HOTなし」は、細胞の約12%で識別された。各HTO、及び故に、各反応性(EBV YVL-9、CMV pp65、EBV LMP2A、EBV BMLF1、インフルエンザM)に対応する細胞の相対数は、図4Aに示すELISPOT、及び、図4Bに示すフローサイトメトリー分析を含む、直交する機能アッセイで識別した細胞の相対数を反映した。生じた各刺激の、非現実的な等しい増殖を有する各細分化により識別した細胞の相対数を図6Bに示す。
CMV pp65、EBV BMLF1、またはインフルエンザMクローンに細分化したCD137/4-1BB+ T細胞の反応性は、並行したオリゴタグプールデキストラマーベースの実験により確認した。HTO-40、HTO-47、及びHTO-48細分化CD137/41BB増殖TCRが、ハッシュタグにより識別された抗原、即ち、インフルエンザM(HTO-40)、EBV-BMLF1(HTO-47)、及びpp65-CMV(HTO-48)に対する反応性を示すことを、図6Dは示す。このことは、これらの抗原に対応するハッシュタグウェルにおいて、≧20のクローンサイズを有するT細胞クローンの存在により観察される。固有のクローンの数は、全クローン(TC)により示される。これらの増殖クローンの反応性は、並行したオリゴタグプールデキストラマーベースの実験により確認される。≧10のクローンサイズを有する、デキストラマー実験におけるクローンに同一である、CD137/4-1BB増殖クローンの数は、OCにより示される。これらの重なり合うクローン(OC)は、細分化抗原に対応するデキストラマーの高い発現、及び、無関係な抗原に対応するデキストラマーの低い発現を示す。
さらなる確認を、scSEQデータの脱多重化において示す。7つの固有のクラスターを、個別の細胞の遺伝子発現パターン及びレベルに基づき、RNAトランスクリプトーム分析から解像した(図7A)。特に、scSEQデータの脱多重化により発見された各抗原特異的T細胞の集団サイズの比較(図7B)は、機能的フローサイトメトリーアッセイで発見された抗原特異的T細胞の集団サイズ(図4B)に一致する。データは、抗原特異的T細胞は、scSEQデータのHTO脱多重化により識別可能であり、各抗原特異的T細胞に対する相対的な集団サイズは、脱多重化の後で維持されたことを示している。さらに、CITE-seq試薬は、本明細書に記載する細分化、AIMソーティング、及びシングルセル配列分析と適合性がある。このようなCITE-seq試薬を用いることにより、重要な層の情報を追加して、細胞のサブセット識別及びフェノタイピングを改善することができる。非限定例として、CITE-seqデータは、各細胞の表面におけるタンパク質の量の測定をもたらすが、RNA-seqデータは、各細胞における転写物の量の測定をもたらす。タンパク質の量及びRNA-seqの発現は相関しない場合があり、故に、両方の測定が相補的な情報をもたらす。これは、図8Aに示すCD4 CITE-seqデータと、図8Bに示すCD4 RNA-seqデータとの比較により強調される。
実施例3:抗原特異的T細胞の機能及び表現型分析
例えば、7~10日間の予増殖を行うことなく、PBMCで直接実施する、抗原特異的T細胞の機能及び表現型分析のための、細分化、AIMソーティング、シングルセル配列決定、及びCITE-seq抗体染色の使用を、本明細書で記載する。
例えば、7~10日間の予増殖を行うことなく、PBMCで直接実施する、抗原特異的T細胞の機能及び表現型分析のための、細分化、AIMソーティング、シングルセル配列決定、及びCITE-seq抗体染色の使用を、本明細書で記載する。
材料及び方法
細胞表面抗体染色:細胞分配、ライブラリー調製、及び配列決定を伴う、5’ヒトTCRα/β
0.04%のBSAと共にPBSに懸濁したシングルセルを、Chromium Single Cell Instrument(10X Genomics)にロードした。RNAseq、V(D)J、及び、抗体由来のタグライブラリーを、抗体由来のタグプライマー付加により、Chromium Single Cell 5’ Library,Gel Beads & Multiplex Kit(10X Genomics)を用いて調製した。増幅の後、cDNAを小型(<300bp)、及び大型(>300bp)の断片画分に分けた。RNAseq及びV(D)Jライブラリーを、>300bp画分から調製した。細胞表面抗体由来のライブラリーを、<300bp画分から調製した。TCRα/βに対するV(D)Jライブラリーアリコートを濃縮するために、cDNAを2つの20ngアリコートに分け、プライマーを用いて2ラウンドで増幅した。
細胞表面抗体染色:細胞分配、ライブラリー調製、及び配列決定を伴う、5’ヒトTCRα/β
0.04%のBSAと共にPBSに懸濁したシングルセルを、Chromium Single Cell Instrument(10X Genomics)にロードした。RNAseq、V(D)J、及び、抗体由来のタグライブラリーを、抗体由来のタグプライマー付加により、Chromium Single Cell 5’ Library,Gel Beads & Multiplex Kit(10X Genomics)を用いて調製した。増幅の後、cDNAを小型(<300bp)、及び大型(>300bp)の断片画分に分けた。RNAseq及びV(D)Jライブラリーを、>300bp画分から調製した。細胞表面抗体由来のライブラリーを、<300bp画分から調製した。TCRα/βに対するV(D)Jライブラリーアリコートを濃縮するために、cDNAを2つの20ngアリコートに分け、プライマーを用いて2ラウンドで増幅した。
具体的には、第1ラウンドの増幅に関して、使用したプライマーは、短鎖R1に関してはMP147(ACACTCTTTCCCTACACGACGC;配列番号17)、ヒトTRACに関してはMP120(GCAGACAGACTTGTCACTGGA;配列番号18)、及び、ヒトTRBCに関してはMP121(CTCTGCTTCTGATGGCTCAAACA;配列番号19)であった。第2ラウンドの増幅に関して、第1ラウンドの20ngのアリコートを、MP147、MP128(GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAGGGTCAGGGTTCTGGATA;配列番号20)(ネストR2+ヒトTRAC)、及び、MP129(GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAGGGTCAGGGTTCTGGATA;配列番号21)(ネストR2+ヒトTRBC)を用いて増幅した。V(D)Jライブラリーを、25ngの各hTRAC及びhTRBC増幅cDNAから調製した。RNAseq及び抗体由来のタグライブラリー(UMI及び細胞バーコードに対して、リード1 26-bp、8-bp i7サンプルインデックス、及びリード2 55-bp転写物リード)、ならびに、V(D)Jライブラリー(リード1 150bp、8-bp i7サンプルインデックス、及びリード2-150-bpリード)に対して、対形成末端配列決定を、Illumina NextSeq500で行った。
結果
ドナーから単離したPBMCを、5つの固有のHPVペプチドのうちの1つでインキュベートした。CD137/4-1BB及びシングルセル配列分析に基づくAIMソーティングを用いるHTO配列に基づき、抗原特異的T細胞をクラスター化した(図9A)。HTOサンプルにまたがり(陽性シグナル閾値を超えて)共有されていないTCRクローンを示す細胞を識別し、これらのクローンのTCR配列を入手した(例えば、図9Bを参照されたい)。図9Bは、各細胞クローンが、グレースケールで異なる色で表される、例示的な図解を示し、クローンの各細胞を、グレースケールで同一色で示す。各クローンにおける、各ハッシュタグ及び細胞の数に対する、ハッシュタグ制限クローンの数、即ち、1個のみのHTOと関連するクローンの数を、下表1に示す。
ドナーから単離したPBMCを、5つの固有のHPVペプチドのうちの1つでインキュベートした。CD137/4-1BB及びシングルセル配列分析に基づくAIMソーティングを用いるHTO配列に基づき、抗原特異的T細胞をクラスター化した(図9A)。HTOサンプルにまたがり(陽性シグナル閾値を超えて)共有されていないTCRクローンを示す細胞を識別し、これらのクローンのTCR配列を入手した(例えば、図9Bを参照されたい)。図9Bは、各細胞クローンが、グレースケールで異なる色で表される、例示的な図解を示し、クローンの各細胞を、グレースケールで同一色で示す。各クローンにおける、各ハッシュタグ及び細胞の数に対する、ハッシュタグ制限クローンの数、即ち、1個のみのHTOと関連するクローンの数を、下表1に示す。
表1に示すように、HTO-3により識別した細胞は、同族抗原に対して特異的なTCRを発現する、最大数のTCRクローンを示し、この次に、HTO-5にクラスター化した細胞が続く。クローンはアミノ酸配列により識別され、いくつかのHTO-3制限TCRの、TCRα及びβ対の例示的なCDR3配列を下表2に示す。
細分化制限された、即ち、HTOサンプルにまたがり共有されていないこれらのT細胞クローンは、機能的T細胞応答と関連するマーカーを、より多く発現することを、シングルセル配列決定分析は示す。(図9C;図9Bもまた参照されたい)。
抗原に特異的に結合し、加えて、抗原特異的T細胞を発現する細胞の表現型特徴ももたらす、固有のT細胞受容体のアミノ酸配列を速やかに識別する固有の方法を、本明細書で示す。このハイスループット法を用いると、新規かつ潜在的にパーソナライズされた治療法を、速やかに識別して生成することができる。
等価物
当業者は、日常的な実験だけを用いて、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを目的としている。
当業者は、日常的な実験だけを用いて、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを目的としている。
本出願を通して引用される、全ての非特許文献、特許出願、及び特許の内容全体は、それら全体が本明細書に参照により組み込まれる。
Claims (36)
- T細胞、ならびに任意選択的に、抗原に特異的に結合するT細胞受容体(TCR)の、TCRα鎖配列、及び/またはTCRβ鎖配列を活性化可能な前記抗原の識別方法であって、前記方法が、
(I)活性化誘発マーカー(AIM)の発現に基づき、活性化T細胞を、固有の生体サンプルを含む組成物からソートすることであって、前記固有の生体サンプルが、
(a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、前記T細胞が、前記表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、前記T細胞及びMHC、
(b)固有の抗原、
(c)前記固有の抗原を特異的に識別するために使用される固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、前記固有のHTOが、前記T細胞を前記固有のHTOで標識する分子にコンジュゲートする、前記HTO、ならびに任意選択的に、
(d)前記T細胞の活性化を支持する培地
を含む、前記ソートすることと、
(II)(I)でソートした前記活性化T細胞でシングルセル配列決定分析を行い、前記活性化T細胞を前記固有のHTOで標識した前記分子にコンジュゲートした前記固有のHTOを識別することであって、前記固有のHTOを識別することが、前記活性化T細胞を活性化可能な前記抗原を識別し、任意選択的に、前記シングルセル配列決定分析が、以下のうちの1つ以上:
(i)前記活性化T細胞により発現した1つ以上の遺伝子、ならびに/または
(ii)前記活性化T細胞により発現したTCRのTCRα及び/もしくはβ鎖配列
もまた識別する、前記識別することと、を含む、前記方法。 - ソートする前に、以下の工程(複数可)のうちの一方または両方:
対象から単離したT細胞及び抗原提示細胞(APC)を含む細胞の集まりを、個別のサンプルに等しく分配することにより、複数の生体サンプルを作製する工程であって、各生体サンプルが任意選択的に、T細胞及び/またはAPC生存能、活性化及び/または活性を支持する媒体及びサイトカインを含む、前記工程と、
前記固有の抗原を特異的に識別するために使用する固有の抗原及び/または固有のHTOを、複数の生体サンプルのそれぞれに送達することにより、複数の固有の生体サンプルを作製する工程であって、前記固有のHTOが、T細胞を前記固有のHTOで標識する分子にコンジュゲートされる、前記工程と、
を含み、
前記複数の生体サンプルのそれぞれが、対象から単離されたT細胞及びAPCを含み、任意選択的に、前記T細胞及びAPCの生存能、活性、及び/または活性化を支持する培地を含む、細胞の集まりを含み、
前記固有の抗原及び/またはT細胞を前記固有のHTOで標識する分子にコンジュゲートした前記固有のHTOの送達後、前記複数の生体サンプルのそれぞれが、
(a)対象から単離したT細胞及びAPCを含む細胞の集まり、
(b)固有の抗原、
(c)前記固有の抗原を特異的に識別し、前記T細胞を前記HTOで標識する分子にコンジュゲートした固有のHTO、ならびに、任意選択的に、
(d)前記T細胞及びAPCの生存能、活性、及び/または活性化を支持する培地
を含む固有の生体サンプルになり、
(I)でソートされた前記組成物が複数の固有の生体サンプルを含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記APCが、単球由来の樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、B細胞、またはこれらの組み合わせを含む、請求項2に記載の方法。
- ソートすることが、前記活性化誘発マーカー(AIM)の発現に基づく、活性化T細胞の蛍光活性化細胞ソーティングを含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記AIMが、CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3、TIGIT、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 蛍光活性化細胞ソーティングが、前記AIMに対する蛍光標識抗体を用いる検出に基づく、請求項4または請求項5に記載の方法。
- IIで分析した前記活性化T細胞にて、さらなる機能分析及び/または表現型分析を行うことを含み、任意選択的に、前記さらなる機能分析及び/または表現型分析が、フローサイトメトリー分析、CITE-seq、多量体分析、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記さらなる機能分析及び/または表現型分析が、CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD62L、HLA-DR、CD137/4-1BB、CD69、CD278、CD274、CD279、CD127、CD197、IFNγ、GZMH、GNLY、CD38、CCL3、及びLAG3のうちの1つ以上のタンパク質及び/またはRNA発現レベルを測定する、請求項7に記載の方法。
- 末梢血単核球細胞が前記T細胞及び表面結合MHCをもたらす、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記T細胞を前記固有のHTOで標識する前記分子が、細胞表面分子に結合する抗体を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記AIMがCD137/4-1BBであるか、またはこれを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、前記抗原に特異的に結合するTCRのTCRα鎖配列及び/またはTCRβ鎖配列を識別することを含み、前記TCRα鎖配列及び/またはTCRβ鎖配列がそれぞれ、TCRα鎖可変領域配列及び/またはTCRβ鎖可変領域配列である、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、前記抗原に特異的に結合するTCRのTCRα鎖配列及び/またはTCRβ鎖配列を識別することを含み、前記方法が、治療薬の作製において、前記TCRα鎖配列及び/またはTCRβ鎖配列を利用することをさらに含む、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- (a)T細胞及び表面結合主要組織適合複合体(MHC)であって、前記T細胞が、前記表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、前記T細胞及びMHC、
(b)抗原、
(c)前記抗原を特異的に識別するハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、前記HTOが、前記T細胞を前記HTOで標識する分子にコンジュゲートした、前記HTO、
ならびに、任意選択的に、
(d)前記T細胞の活性化を支持する培地
を含む生体サンプルを含む、組成物。 - (a)前記MHCが抗原提示細胞(APC)の表面で発現し、任意選択的に、
前記T細胞及びAPCは自己由来であり、
前記T細胞及び前記APCがそれぞれヒトドナーから単離され、ならびに/または、
前記APCが、単球由来の樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、B細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、
(b)前記抗原が、
(I)
(i)細菌抗原もしくはその部分、
(ii)ウイルス性抗原もしくはその部分、
(iii)アレルゲンもしくはその部分、
(iv)腫瘍関連抗原もしくはその部分、及び
(v)これらの組み合わせ
からなる群から選択され、ならびに/または、
(II)
(i)アミノ酸配列、
(ii)ヌクレオチド配列、
(iii)細胞溶解物、及び
(iv)これらの組み合わせ
を含み、
(c)前記HTOコンジュゲート分子が、細胞表面分子または脂質に結合する抗体を含み、ならびに/または
(d)前記培地が、前記T細胞及び/またはAPCの生存能を支持するサイトカインを含む、
請求項14に記載の組成物。 - 前記抗体が、β2マイクログロブリン、CD298、CD2、CD3、CD4、CD8、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞表面マーカーに結合するか、または、
前記脂質が細胞膜に組み込まれる、
請求項15に記載の組成物。 - 前記T細胞及び/または前記APCの生存能を支持する前記サイトカインが、IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、IL-4、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項15または請求項16に記載の組成物。
- 第2の生体サンプルをさらに含み、前記第2の生体サンプルが、
(a)第2のT細胞及び第2の表面結合MHCであって、前記第2のT細胞が、前記第2の表面結合MHCの文脈で提示されるペプチドを認識可能である、前記第2のT細胞及び第2の表面結合MHC、
(b)第2の抗原、
(c)前記第2の抗原を特異的に識別する前記第2のHTOであって、前記HTOが、前記第2のT細胞を前記第2のHTOで標識する第2の分子にコンジュゲートする、前記第2のHTO、
ならびに、任意選択的に、
(d)前記第2のT細胞の活性化を支持する培地
を含み、
(i)前記T細胞及び第2のT細胞が同一の対象から単離され、
(ii)前記抗原及び前記第2の抗原が同一ではなく、
(iii)前記T細胞を前記HTOで標識する前記分子、及び、前記第2のT細胞を前記第2のHTOで標識する前記第2の分子が同一であり、前記HTO及び前記第2のHTOが同一ではない、
請求項15~17のいずれか1項に記載の組成物。 - 前記組成物が、活性化誘発マーカー(AIM)の発現に基づき、活性化T細胞のソートを可能にする剤をさらに含む、請求項14~18のいずれか1項に記載の組成物。
- AIMの発現に基づき活性化T細胞のソートを可能にする前記剤が、前記AIMに特異的に結合する蛍光標識抗体である、請求項19に記載の組成物。
- 前記AIMがCD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3、及び/またはTIGITからなる群から選択される、請求項19または請求項20に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記組成物のフローサイトメトリー分析またはCITE-seqに有用な抗体及び/またはMHC多量体を含む、請求項14~21のいずれか1項に記載の組成物。
- 複数の固有の抗原、及び、
複数の固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド(HTO)であって、それぞれが、前記複数の固有の抗原のうちの1つのみを特異的に識別する、前記HTO
を含むキット。 - 前記キットが、活性化T細胞の、その活性化誘発マーカー(AIM)の発現に基づくソートを可能にする剤をさらに含み、任意選択的に、AIMの発現に基づき活性化T細胞のソートを可能にする前記剤が、前記AIMに特異的に結合する蛍光標識抗体である、請求項23に記載のキット。
- 前記複数の固有のHTOのそれぞれが、同一の分子にコンジュゲートし、前記キットが、固有のHTOがコンジュゲートした複数の分子を含む、請求項23または24に記載のキット。
- 前記複数の固有の抗原のそれぞれが、単一のタンパク質からの、固有かつ重なり合うペプチド配列を含む、請求項23~25のいずれか1項に記載のキット。
- 前記単一のタンパク質が、病原性抗原、腫瘍関連抗原、または移植抗原からなる群から選択される、請求項26に記載のキット。
- 患者の、ワクチンに対する、T細胞が媒介する免疫応答を分析するための、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法、請求項14~22のいずれか1項に記載の組成物、または、請求項23~27のいずれか1項に記載のキットの使用。
- 患者の、免疫療法に対する、T細胞が媒介する免疫応答を分析するための、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法、請求項14~22のいずれか1項に記載の組成物、または、請求項23~27のいずれか1項に記載のキットの使用。
- 患者における、前記患者の免疫療法の間における、T細胞が媒介する免疫応答を分析するための、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法、請求項14~22のいずれか1項に記載の組成物、または、請求項23~27のいずれか1項に記載のキットの使用。
- 患者の、自己抗原に対するT細胞応答を分析するための、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法、請求項14~22のいずれか1項に記載の組成物、または、請求項23~27のいずれか1項に記載のキットの使用。
- 患者の、移植抗原に対するT細胞応答を分析するための、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法、請求項14~22のいずれか1項に記載の組成物、または、請求項23~27のいずれか1項に記載のキットの使用。
- 活性化T細胞の1つ以上のTCR可変領域配列を識別するための、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法、請求項14~22のいずれか1項に記載の組成物、または、請求項23~27のいずれか1項に記載のキットの使用。
- 前記1つ以上のTCR可変領域配列が、TCRα鎖のCDR3配列、及び/または、TCRβ鎖のCDR3配列を含む、請求項33に記載の使用。
- ヒト治療薬の作製における、請求項33または34で識別した1つ以上のTCR可変領域配列の使用。
- 前記ヒト治療薬が、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法、請求項14~22のいずれか1項に記載の組成物、または、請求項23~27のいずれか1項に記載のキットを使用して識別した1つ以上のTCR可変領域配列を含むT細胞を含む、請求項35に記載の使用。
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